Estudios estructurales de la enzima Fenilalaninahidroxilasa humana va Mtodos Computacionales

Dayana Carolina Cazco-Ordonez a; Diana Sofa Mollocana Yneza

a Laboratorio

de Procesos Metablicos, Prctica 1. Universidad San Francisco de Quito

Abstract
El presente documento es un estudio exploratorio computacional de la oxidoreductasa
Fenilalanina-hidroxilasa humana a partir de las estructuras ms conocidas y recientes
obtenidas por Cristalografa de Rayox X. Con esto, se pretende conocer de manera ms
profunda las caractersticas moleculares que la predisponen para su funcin metablica. La
exploracin se realiza a partir de dos elementos principales: Protein Data Bank y el Software
libre VMD. Se reportan dominios catalticos y de regulacin, estructuras homlogas en
mamferos con mayor similitud, interaccin con elementos inorgnicos para la correcta
funcin y el rol de cada uno de estos.
Palabras Clave: Fenilalanina-Hidroxilasa, 2PHM, Resolucin, tomo de Hierro, Estructura
Molecular

Introduccin
La fenilalanina junto con la tirosina-OH forman parte de la familia de protenas C4-F. Esta
protena pertenece a las monoxigenasas, oxidoreductasas, pues oxida fenilalanina a
tirosina. La coenzima utilizada para esta reaccin es la tetrahidropterina[1]. La actividad
completamente ausente de la fenilalanina hidroxilasa produce fenilcetonuria, lo cual es una
grave enfermedad del metabolismo, donde se produce acumulacin del aminocido
fenilalanina a niveles txicos. La fenilcetonuria es una enfermedad hereditaria recesiva, la
causa ocurre en el defecto de un gen codificante de la fenilalanina hidroxilasa [1]. Este
aminocido no puede ser transformado a tirosina, por lo que la acumulacin puede derivar
en retraso mental, orina de color oscuro y malestar general [2].
Esta enzima consta de 430 aminocidos y tiene que ir acompaada de un proceso de
sustitucin de ligandos, un OH- por COO- . El dominio regulador se da en el residuo 1-110
desde el extremo amino-terminal, el dominio cataltico se encuentra en el residuo 111-410,
aqu se halla el centro activo de la enzima con el tomo de hierro, sitios de unin del sustrato
y el cofactor BH4 [2]. Otro dominio es el de oligomerizacin, y para el funcionamiento o
actividad la enzima debe ensamblarse en forma de tetrmero y esto se da gracias a la
presencia de BH4 [3] En esta enzima existe una triada cataltica formada por histidinahistidina-glutamato, lo cual coordina un tomo de hierro junto a dos molculas de agua, y
segn varios estudios existen cuatro residuos que ayudan a que el sustrato se ubique al
segundo tomo de hierro, junto con un puente de hidrogeno entre los residuos ser349 y
arg270, leu278, y el empaquetamiento del anillo por la his285 [3].
Se conocen ms de 450 mutaciones en el gen de la fenilalanina hidroxilasa, normalmente se
da por la elevacin de los niveles de esta enzima cataltica por enzima de 2mg/d, es decir
una sobreproduccin de este enzima; y una de esas mutaciones causa fenilcetonuria, que
ser explicada ms adelante y hiperfenilalaninemia [4] Esta enfermedad ocurre cuando las
tasas de fenilalanina en la sangre estn entre 2,5 y 6 mg/dl [5] Si la fenilalaninemia es
superior a 10mg/dl se produce un dao cerebral y apoptosis neuronal, que es mayor
mientras la concentracin de fenilamina aumenta [6]. Por este motivo, es clave comprender
el funcionamiento de la enzima clave para su metabolismo: la fenilalanina hidroxilasa
humana.

Mtodos
Para el anlisis de la estructura molecular de esta enzima se tom como referencia la base
de datos RCSB Protein Data Bank, de la cual se obtuvo principalmente el listado de las
estructuras reportadas por Cristalografa de Rayos X ms importantes para el
entendimiento de la funcionalidad. Esta pgina provey no solo la secuencia y coordenadas
de los residuos individuales por medio de los formatos .pdb de cada estructura, sino
tambin informacin importante sobre las caractersticas de obtencin del mapa de
distribucin como lo son la resolucin y el valor R. Informacin complementaria fue
tambin de gran utilidad en el proceso, tal como nmero de residuos, cadenas y
subunidades, organismo fuente, sistema de expresin, estructura secundaria, dominios,
ligandos, validacin de datos experimentales y literatura de origen, todos estos datos
disponibles en RCSB-PDB.
Para visualizar de mejor manera las molculas presentadas se recurri al Visualizador VMD,
el cual es un software libre que permiti mediante la importacin de los archivos.pdb
correspondientes representar, animar y analizar las estructuras de la enzima como largos
sistemas biomoleculares, generando grficos 3D y scripts incorporados. La ventaja de VMD
es que tambin permite leer las secuencias de aminocidos y clasificarlos por su naturaleza
polar o apolar, as como observar las interacciones moleculares con confactores y ligandos.
Es posible adems construir grficos de Ramachandran, el cual es una representacin de los
ngulos Phi versus Psi en una molcula [7].
Para tener informacin ms amplia sobre las propiedades moleculares de la enzima as
como de su funcionalidad y potencial variabilidad, se listaron once diferentes tipos de
estructuras asociadas a la fenilalanina hidroxilasa, tomado en cuenta su nombre, nmero de
residuos y cadenas, resolucin y referencia, as como la secuencia, la cual fue analizada con
ayuda del visualizador molecular VMD. Esto ltimo fue especialmente importante para
conocer si la estructura proteica se trat de un Wilde type o de una versin mutada. A pesar
de lo anterior, se consider que para determinar informacin ms precisa sobre la
naturaleza enzimtica, especialmente en lo que se refiere a dominios regulatorios,
catalticos, residuos del sitio activo y geometra de ligandos del tomo de hierro, se
requerira una estructura completa en cuanto a nmero de residuos, con una resolucin que
admitiera pocos errores y que por s misma explicara la funcionalidad.
Como estructura de referencia se tom a la forma defosforilada de la fenilalaninahidroxilasa humana bajo el nombre 2PHM, esta fue obtenida a partir de Rattus norvegicus
pero debido a la elevada homologa reportada en la literatura entre este mamfero y los
seres humanos se consider que funcionara como un buen template para apreciar como la
fosforilacin y defosforilacin juegan un papel importante en la regulacin [8].

Resultados
La plataforma RCSB PDB indica que es una estructura de 429 aminocidos o residuos con
una cadena nica A, sin embargo mediante la extensin Sequence Viewer de VMD, se
reportan hasta 427 residuos.
La molcula presenta un ligando que es el tomo de Hierro en su forma reducida Fe (III).
Esto se pudo observar de dos maneras: mediante Ligand Explorer de RCSB y en VMD,
mediante la representacin Quick Surf para el tomo de Hierro, como se muestra en la figura
1. La Cadena A ha sido representada en el mismo software mediante la representacin
Ribbons y el Material Edgy Shiny, lo cual permite visualizar el tomo de hierro y la
estructura proteica como dos elementos separados pero dependientes.
Dominios Catalticos y Regulatorios

Con la representacin por estructura secundaria de la figura 2, se puede ver que el tomo
de hierro se encuentra entre hojas plegadas Beta, hlices diversas y puentes de unin, sin
embargo, no se pueden bajo este mecanismo, apreciar directamente dominios regulatorios
o catalticos, por lo que se requiere hacer uso de otra estrategia.
Gracias al Protein Feature View, se puede observar que del residuo 36 al residuo 114 existe
un dominio ACT, con funcin reguladora, como lo muestra la Figura 3. Este facilita la
formacin de tetrmeros enzimticos. Otros dominios importantes asociados a la
regulacin de la actividad proteica son el dominio Biopterina-H-Biopterina que se
encuentra en la regin N-terminal como lo muestra la figura 4. Son tambin importantes
para la regulacin y activacin el residuo N-acetilalanina modificado cerca de la metionina
de inicio y el residuo Fosfoserina modificado por PKA en la posicin 15.
Otras porciones de la molcula con funcin reguladora corresponden a los Fosfositios S16P, K50-ac y K96-ac.
Sitio Activo
Las figuras 6, 7 y 8 muestran a tres de los residuos ms importantes que forman parte del
sitio cataltico, siendo estos de acuerdo a las imgenes y a la literatura asociada a las
estructuras los residuos en las posiciones 325, 285 y 290. El primero corresponde a una
tirosina y los dos siguientes a Histidinas. Se entiende que estos son de vital importancia para
la funcionalidad, como ya se discutir ms adelante.
Coordinacin y Unin al tomo de Hierro. Geometra Molecular de Fe (III)
De acuerdo a los diagramas, los residuos catalticos coinciden en posiciones con los
esperados para la coordinacin, como se muestra en las figuras 9, 10 y 11. Como se muestra
en el listado de informacin de RCSB Protein Data Bank, la geometra del tomo de hierro
permite la unin a residuos con angulos , , de 90 [9].
Al tener un listado amplio de estructuras de fenilalanina-hidroxilasa, fue posible revisar sus
caractersticas ms importantes, como se listan en la Tabla 1. La informacin que estas
proveen es bastante importante pero es necesario interpretar a partir de la misma la
utilidad verdadera que ofrecen para comprender la funcionalidad de la molcula. Algo que
todas presentan en comn, incluso en cuanto a estructuras truncadas, es la asociacin con
el tomo de hierro en sitios de regulacin alostrica, lo cual tiene sentido pues el tomo de
hierro debe unirse a las subunidades para facilitar la catlisis, y esa es su principal funcin.

Discusin
Para comprender de mejor manera la calidad y cantidad de informacin provista por las
estructuras mostradas, es necesario discutir sobre un parmetro asociado a las mismas que
indica la sensibilidad de la metodologa usada para su obtencin y descripcin, como lo es
la resolucin. Esta es fundamental ya que informa sobre el nivel de detalle en el mapa
calculado de densidad electrnica utilizado para la diagramacin [10]. La resolucin
describe la conexin entre la calidad de visualizacin en el mapa de microscopa electrnica
y las seales de emisin de la molcula detectadas en los dispositivos analticos. En anlisis
de estructura molecular de protenas, existen intervalos estndar que permiten inferir la
calidad del modelo de trabajo escogido [10].
As por ejemplo, para resoluciones de 0.5 a 1.5 , se espera en general que la estructura no
tenga errores y que los tomos individuales puedan ser resueltos [10]. Las libreras de
rotmeros y los estudios de geometra molecular se realizan con estructuras de este tipo.
Con una resolucin de 1.5 a 2.0 , se espera que existan muy pocos residuos con rotmeros
equivocados y errores pequeos que pueden ser detectados fcilmente [10]. Los
plegamientos son raramente incorrectos, incluso en loops de superficie. Cuando la
resolucin es de 2.0 a 2.5 existen igualmente pequeos errores que pueden ser

normalmente detectados. Hay variaciones en los loops de superficie pero son menores, as
mismo, las molculas de agua y los ligandos pequeos se vuelven visibles [10].
Si la resolucin llega a 3.0 existen algunos loops de superficie que pueden estar mal
representados. Algunas cadenas largas y pequeas cadenas laterales son muy probables de
tener rotmeros equivocados. Por su parte, con una resolucin de 3.0 a 4.0 , se asume que
los plegamientos representados estn correctos pero los errores son muy comunes. Varias
cadenas laterales tienden a tener rotameros equivocados. Si una estructura llegase a tener
una resolucin mayor a 4.0 , las coordenadas individuales de los residuos son
insginificantes y slo se puede acceder a informacin a nivel de estructura secundaria [10].
Puesto que los rangos de resolucin de las diez estructuras listadas como coincidencias en
el buscador de Protein Data Bank se encontraron entre 1.5 y 3.1 , puede afirmarse que
existe informacin importante que se puede extraer de las mismas para efectuar estudios
computacionales informativos en torno a la fenilalanina hidroxilasa humana. Aquella
estructura con mayor sensibilidad es la 1J8U, que corresponde al sitio cataltico de la enzima
unida a tetrahidro biopteridina, por lo cual, no abarca la estructura completa pero es
interesante por la visualizacin de unin a Sustrato. La de mayor resolucin es la estrutura
2PAH, que representa a la enzima en su forma tetramrica, lo cual es razonable puesto que
al ser una estructura ms compleja, la cristalizacin es por ende complicada.
Por ello, es importante tambin considerar el mtodo de obtencin de la estructura. En este
caso, todas fueron conseguidas mediante Difraccin de Rayos X. La tcnica consiste en llevar
a las molculas de inters a un estado cristalino, tras lo cual se somete la sustancia a rayos
X, los cuales van a ser difractados por electrones en torno a los tomos cristalizados [11].
Esto sucede porque las longitudes de onda de ambos haces poseen el mismo orden de
magnitud. Los rayos X emergen de esta manera con informacin sobre la naturaleza y
ubicacin del tomo en cuestin y transmiten la misma a un detector de seal [11].
De este procedimiento se deriva otro de los parmetros moleculares reportados en el
Protein Data Bank. Estos son los R-Value Free y R-Value Work.
Los R-value o valores R son una medida ms minuciosa de la calidad del modelo obtenido a
partir de datos cristalogrficos [12]. Al resolver una estructura proteica, se comienza con la
construccin del modelo atmico y posteriormente se calcula un patrn de difraccin
simulado basado en dicho modelo [12]. De esta forma, el R-value indica que tan bien el
patrn de difraccin simulado se une al patrn de difraccin observado. Un conjunto
totalmente aleatorio de tomos brindar un R-value de hasta 0.63, mientras que una
coincidencia perfecta otorgar un valor 0 [12]. Sin embargo, los valores tpicos de las
estructuras poseen valores de alrededor de 0.20 [12]. Algunas de las razones para la
ausencia de coincidencias tienen que ver con la presencia de grandes canales de agua en los
cristales de protenas y cidos nucleicos. Puesto que el agua no posee una estructura
definida y no se incluye en el modelo atmico, es un factor perturbador. Otras razones
tienen que ver con vibraciones y desorden no esperados dentro del modelo. Por lo tanto,
tambin existen desventajas en el uso de valores R para determinar la calidad de
estructuras. Por ejemplo, el proceso de refinamiento se usa usualmente para mejorar el
modelo pero desafortunadamente esto parcializa los datos experimentales con el nico fin
de mejorar el R. Esto es especialmente peligroso en cuanto a prdida de informacin porque
el modelo atmico es usado con el patrn de difraccin para calcular la densidad electrnica
[12]. Para reducir riesgos de este tipo, es conveniente la consideracin del R-free value que
de alguna manera evita la parcializacin. Este implica que antes de que comience el
refinamiento molecular, cerca del 10% de las observaciones experimentales se remueven
del conjunto de datos [12]. Posteriormente, se realiza el refinamiento con los residuos
restantes y se observa que tan bien el modelo predice el 10% de los residuos que no se
usaron en el refinamiento. Para un modelo ideal, sin sobre interpretaciones, el R-libre
debera ser muy similar al valor R. Tpicamente, los valores de este tipo se encuentran en
promedio en 0.26 [12], como sucedi con todas las estructuras enzimticas reportadas en
la Tabla 1, las cuales adems fueron de origen humano pero obtenidas a partir de
Escherichia coli, que ha sido usado como sistema de expresin. Con esto, se infiere que la

tcnica de cristalografa es clave para el modelo, y deben tomarse en cuenta los parmetros
numricos obtenidos a partir del proceso de modelacin para elegir una estructura a
investigar.
La aplicacin principal potencial para elegir estructuras es el estudio de las mutaciones
causa de Fenilcetonuria, usualmente causadas por mutaciones puntuales, es decir, cambios
identitarios de un residuo a otro. Las ms importantes se han reportado en las regiones
catalticas y regulatorias, pero han sucedido a lo largo de toda la estructura primaria. A
pesar de lo anterior, interfieren tambin las mutaciones en las zonas cercanas a las regiones
regulatorias como en los residuos 300 a 310 y 241 a 269 [13], pues disminuyen la actividad.
Por ejemplo, la mutacin P-> S en el residuo 314 no afecta la oligomerizacin, pero la
reduccin de la actividad se da por la induccin a un cambio conformacional que afecta en
cadena a los sitios de regulacin alostrica [13]. Del listado de estructuras reportadas, es
notorio que no es posible la comparacin de mutaciones residuo por residuo entre ellas
porque no presentan nmeros uniformes de residuos en su cadena. Esto es debido a que la
tcnica de cristalografa de rayos X requiere a menudo cristales grandes, estables y dentro
de las cuales cada unidad de protena se encuentre alineada de forma regular. Sin embargo,
muchas veces este tipo de estructuras no clarificaban completamente la distribucin de
tomos y la funcin porque los mapas electrnicos se determinaban en funcin de millones
de unidades idnticas, lo que derivaba en partes estructurales perdidas [14]. Estas
usualmente fallan en ser resueltas, dejando estructuras de protenas incompletas. La buena
noticia es que esto se ha resuelto con el aparecimiento de las tcnicas de resonancia
magntica nuclear, donde se emplean soluciones de protena en lugar de cristales, lo que
preserva de mejor manera los loops flexibles y los dominios estructurales para su
resolucin exitosa [14].
De todas estas la nica estructura con una mutacin intencional clara es la 1TG2 con
mutacin en el residuo 313 Alanina por Tirosina, que como ya se vio anteriormente
interfiere con la afinidad de unin a ligandos, pues se encuentra cercana al sitio de unin de
hierro. Esta mutacin corresponde al tipo de residuos estructurales. Por su parte, si se
presentaran mutaciones en la triada de unin al tomo de hierro en las estructuras 2PAH O
2DMW, se produciran mutaciones relacionadas con la interfase dmero-tetrmero. Por su
parte, si las mutaciones se reportaran en las estructuras que representan a los sitios
catalticos 4PAH, 4ANP, 1J8T, 1J8U p 6PAH, las mutaciones ms crticas podran ser de dos
tipos: de interfase de dmero o tetrmero o de interaccin con secuencias de
autoregulacin.
De todo esto se puede concluir que la enzima Fenilalanina hidroxilasa es una
oxidoreductasa compleja cuya funcionalidad para el metabolismo tiene como base la unin
con el tomo de hierro, cuya coordinacin tiene como residuos clave a tres muy similares a
los del sitio cataltico y cuya coordinacin est asistida por agua. Existen tres sitios
reguladores que abarcan cerca de 115 residuos y muchas de las mutaciones asociadas al
mal funcionamiento ocurren en estas regiones, aunque pueden ocurrir tambin mutaciones
en residuos estructurales o de interaccin dmeros tetrmeros. Es importante conocer los
parmetros ms importantes de las estructuras moleculares con las que se trabaja para
poder escogerlas con fines investigativos.

Referencias
[1] Muller, W. (2008). Bioqumica. Fundamentos para Medicina y Ciencias de la Vida. Reverte.
[2] Devlin, T. (2004). Bioqumica: libro de texto con aplicaciones clnicas. Reverte.
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[4] Kumar, V. (2008). Patologa Humana. Elsevier Health Sciences
[5] Garca, C. (2000). Tratado de pediatra social. Ediciones Das de Santos.

[6] Martinez, M., & Belanger, A. (2009). Protocolo de diagno stico, tratamiento y seguimiento de las
hiperfenilalaninemias. 1Unidad de Enfermedades Metabo licas. Servicio de Pediatria.
Hospital Ramo n y Cajal. Madrid, Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa.
[7]Theoretical and Computational Biophysics Group (2016). VMD Visual Molecular Dynamics. NIH
Center of Biomodelling and Bioinformatics: University of Illinois at Urbana-Champaing
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hydroxylase. Nat.Struct.Biol. 6: 442-448
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http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=2PHM
[10] Huang, Yu-Feng (2007). Study of Mining Protein Structural Properties and its Application (pdf)
(Ph.D.). National Taiwan University
[11]Buehler, Lucas. (2016). Structure Determination Techniques: What is Life
[12] Brunger, A. (1992). Free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of
crystal structures. Nature. 355 (6359): 472475.
[13] UniProt KB (2016). P00439 (PH4H_HUMAN). Disponible en Lnea en:<
http://www.uniprot.org/uniprot/P00439
[14] Blow D (2002). Outline of Crystallography for Biologists. Oxford: Oxford University Press.

Tablas
TABLA 1. Listado de Estructuras Reportadas de la Enzima Fenilalanina Hidroxilasa con
inters molecular
Estructura o
Forma
Truncada
hPhe-OH
Tetramrica
[335aa, Ch
A,B]

Resolucin
(Angstroms)

Cdigo
PDB

Referencia

3.1

2PAH

Fusetti, et al.,
(1998).

hPhe-OH
Bitruncada
unida a 7,82[OH]-LBiopterina
[307 aa ChA}
hPhe-OH
Catalitico
con BH2
[325aa,ChA]

2.0

1DMW

Erlandsen, et
al., 2000

2.1

1LRM

Andersen,
2002

hPhe-OH en
complejo
Chaperona
[324aa, ChA]

2.11

4ANP

Torreblanca et
al., 2012

Dominio
Cataltico
hPhe-OH
Fe(II) [325 aa
ChA]

1.7

1J8T

Andersen, et
al., 2002

hPhe-OH
catalytic
domain
dimer-non
adrenaline
inhibitor
[308 aa, ChA]
hPhe-OH
Fe(II)
tetrahidrobio
-pteridinathienilalanina
[325 aa, ChA]

2.0

4PAH

Erlandsen, et.
Al., 1999

2.0

1MMK

Andersen et al.,
2003

Protena

10

11

hPhe-OH
Dmero de
Domino
Cataltico
unido a
inhibidor de
dopamina
[308aa, ChA]
hPheOH
Dmero de
Dominio
Cataltico con
inhibidor LDOPA (3,4-2Phe-OH) [308
aa ChA]
Dominio
Cataltico
hPhe-OH
Fe(II) en
complejo con
Tetrahidrobi
o-pterina
[325aa, ChA]
hPhe-OH
A313T
mutante con
7,8dihidrobiopterina [308
aa, ChA]

2.1

5PAH

Erlandsen et
al., 1998

2.15

6PAH

Erlandsen et
al., 1998

1.5

1J8U

Andersen et al.,
2001

2.2

1TG2

Erlandsen et
al., 2004

Figuras

Figura 1. Representacin de la Enzima Fenilalanina Hidroxilasa 2PHM y el ligando Fe(III).

Coloracin por Cadena

Figura 2. Representacin de la Enzima Fenilalanina Hidroxilasa 2PHM y el ligando Fe(III).

Coloracin por Estructura Secundaria. En Color Naranja se encuentran los turns o giros, en
color amarillo los puentes Beta, en Blanco platinado se representan las hojas Beta
extendidas, en cian las hlices 3,10 y en azul claro las Hlices Alfa.

Figura 3. Dominio Regulador ACT en la enzima Fenilalanina Hidroxilasa -2PHM

Figura 4. Protein Feature View de la estructura 2PHM. Dentro de cuadro rojo se encuentran
los residuos que coinciden dentro del sitio cataltico por plegamiento de la molcula. Se
muestran tambin los dominios reguladores y la estructura secundaria por grupo de
aminocidos.

Figura 5. Estructura de fenilalanina-hidroxilasa en VMD coloreada por la naturaleza de los

residuos

10

Figura 6. Fenilalanina Hidroxilasa. Residuo 285 destacado en color rojo bajo el tomo de
hierro. En las zonas aledaas se encuentran los residuos susceptibles a mutaciones que
pueden derivar en disminucin de afinidad.

Figura 7. Residuo 325- 2 fenilalanina hidroxilasa resaltado en color rosado. En las zonas
aledaas se encuentran los residuos susceptibles a mutaciones que pueden derivar en
disminucin de afinidad.

11

Figura 8. Residuo 290 2 fenilalanina-hidroxilasa en color verde. En las zonas aledaas se

encuentran los residuos susceptibles a mutaciones que pueden derivar en disminucin de
afinidad.

Figura 9. Coordinacin del tomo de hierro. Junto a este se observa la molcula de agua
que contribuye con el proceso

Figura 10. Acercamiento -Coordinacin del tomo de Hierro

Figura 11. Residuos de unin al ligando- Fenilalanina Hidroxilasa.

12

13

14