OBJETIVO:

Manejar en el laboratorio el mtodo de Biuret para determinar protenas.

Observar y determinar experimentalmente el efecto del pH sobre las
protenas de la leche.

GENERALIDADES:
La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, cido
pantotico y vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fsforo y
metales en pequeas cantidades), protenas (incluyendo todos los aminocidos
esenciales), carbohidratos (lactosa) y lpidos. Los nicos elementos importantes
de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C. Las protenas se
pueden clasificar de manera general en protenas globulares y fibrosas. Las
protenas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas
esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los
puentes de hidrgeno (caractersticos de las protenas fibrosas) siendo
solubilizadas en suspensiones coloidales. En la leche hay tres clases de
protenas: casena, lacto albminas y lacto globulinas (todas globulares). La
casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se
separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las
fosfoproteinas son un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a
una sustancia que contiene cido fosfrico. En la casena la mayora de los
grupos fosfato estn unidos por los grupos hidroxilo de los aminocidos serina
y treonina. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica
(caseinato clcico). La casena representa cerca del 77% al 82% de las
protenas presentes en la leche y el 2,7% en composicin de la leche lquida. La
casena est formada por alpha(s1), alpha(s2)-casena, -casena, y kappacasena formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta casena son
solubles en la leche, solas o combinadas. Si se aade la kappa casena a las
dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de
casena que es solubilizado en forma de micela. Esta micela est estabilizada
por la kappa casena mientras que las alfa y beta son fosfoprotenas que
precipitan en presencia de iones calcio

La kappa casena, sin embargo, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido
de carbohidratos unidos a ella. Tambin tiene todos sus residuos de serina y
treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo, as como los carbohidratos
dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es
fcilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra
parte de su superficie se une fcilmente al alfa y la beta casena insoluble, lo
que da lugar a la formacin de la micela.

La propiedad caracterstica de la casena es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH

de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena cargada
negativamente y solubilizada como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la
carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza ( los grupos fosfato se
protonan) y la protena neutra precipita.

La conformacin de la casena es similar a las protenas desnaturalizadas

globulares. El alto numero de residuos de prolina en la casena causa un
especial plegamiento en la cadena de protena e inhibe la formacin de una
fuerte y ordenada estructura secundaria. La casena no contiene puentes di
sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la
estabilidad de la casena frente a la desnaturalizacin por calor. La carencia de
estructura terciaria facilita la situacin al exterior de los residuos hidrofbicos
lo que facilita la unin entre unidades proteicas y la convierte en prcticamente
insoluble en agua. En cambio es fcilmente dispersable en lcalis diluidas y en
soluciones salinas tales como oxalato sdico y acetato sdico.
La funcin biolgica de las micelas de caseina es transportar grandes
cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma liquida a los lactantes y
formar un coagulo en el estomago para favorecer una nutricin eficiente.
Adems de casena, Ca y P la micela formada tambin contiene citrato, iones,
lipasa, enzimas plasmticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del
volumen total de la leche.

Las protenas que aparecern en el sobrenadante cuando precipitemos la

casena en medio cido son protenas globulares, hidrofilicas y fcilmente
solubles en agua as como susceptibles de desnaturalizacin por calor. Las
principales son -lacto globulina, alphalactalbumina, bovine serum albumin
(BSA), y inmunoglobulinas (Ig).
La casena se emplea en la industria para la fabricacin de pinturas especiales
y en el apresto de tejidos, la clarificacin de vinos, la elaboracin de
preparados farmacuticos y la fabricacin de plsticos.
En la casena todas las protenas englobadas tienen una caracterstica comn
que precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4.6 por ello a la casena
tambin se le suele denominar protena insoluble de la leche.
A este pH (4,6), la casena precipita, debido a la reduccin de repulsiones
intermoleculares. A diferencia de muchas otras protenas, la casena no
precipita al calor. Precipita bajo la accin de la renina (enzima proteoltica
presente en el estmago de terneros) para formar la paracasena. Al precipitar
por accin de cidos se le llama casena cida. Este precipitado blanco forma la
base para la elaboracin de todo tipo de quesos. La secuencia peptdica de la
casena contiene un nmero inusual de residuos de prolina (Ca. 15%). Como
resultado, es relativamente hidrofbica (poco soluble en agua) y carece de
estructura secundaria o terciaria definidas. En la leche se encuentra como
suspensin de partculas que asemeja a las micelas de surfactantes (pequeas
esferas hidroflicas en el exterior e hidrofbicas en el interior). Estas micelas de
casena se estabilizan por iones de calcio e interacciones hidrofbicas.
La casena es una protena de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de
la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las fosfoprotenas son un
grupo de protenas que estn qumicamente unidas a una sustancia que
contiene cido fosfrico, por lo tanto su molcula contiene un elemento fsforo.
La casena representa cerca del 77 al 82 por ciento de las protenas presentes
en la leche y el 2.7 por ciento en la composicin de la leche lquida.
Cuando coagula con renina, es llamada paracasena, y cuando coagula a travs
de la reduccin del pH es llamada casena cida. Cuando no est coagulada se
le llama caseingeno.
La casena es un slido blanco-amarillento, sin sabor ni olor, insoluble en agua.
Se dispersa bien en un medio alcalino, como una solucin acuosa de hidrxido
de sodio: NaOH, formando caseinatos de sodio.
La reaccin de Biuret es un procedimiento utilizado para identificar la presencia
de protenas en una mezcla. La reaccin debe su nombre al biuret, una
molcula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la ms
sencilla que da positiva esta reaccin. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en
solucin acuosa alcalina de NaOH o KOH. La reaccin se basa en la formacin
de un compuesto de color violeta (cuya intensidad de color depende de la
concentracin de protenas), debido a la formacin de un complejo de

coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del
nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.
Punto isoelctrico
Todas las macromolculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se
dispersan en agua. Una caracterstica de las protenas y otros biopolmeros es
que la carga total que adquieren depende del pH del medio.
As, todas las protenas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio
en el que se encuentren y de los aminocidos que la componen, as como de
las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la protena de forma
covalente (irreversible). Debido a la composicin en aminocidos de la
protena, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH
del medio: catinicos, neutros y aninicos.
Cualquier protena tendra una carga neta positiva si se encuentra en un medio
lo suficientemente cido debido a que los grupos COOH de los aminocidos
asprtico y glutmico estaran en su forma neutra pero los grupos amino de
Arginina y lysina estaran protonados (-NH3+).
De igual forma si la protena se encuentra en un medio con un pH muy alto
estara cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo
estaran desprotonados (COO-) y los grupos amino estaran en su forma neutra
(NH2). De lo anterior se deduce que las protenas tienen un pH caracterstico al
cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoelctrico (pI). En
el punto isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y
negativas por lo que la protena presenta su mxima posibilidad para ser
precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregacin.

MATERIAL POR EQUIPO:

1 probeta de 50 ml
2 gradillas
2 pipetas de 10 ml
3 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 1 ml
Tubos de 15 x 100 12 piezas
1 vaso de precipitados de 100 ml

12 tubos de 16 x 150
1 balanza granataria
Papel parafilm para 10 tubos
Si es necesario, 1 embudo y papel filtro.

REACTIVOS POR EQUIPO:

Agua destilada.
Solucin de cido actico 0.1 N
Solucin de acetato de sodio 0.1 N
Solucin de casena (concentracin 4 mg/ml)
Reactivo de Biuret 50 ml.

APARATOS POR EQUIPO:

1
1
2
4

centrfuga clnica
balanza granataria
espectrofotmetros
celdas

LOS ALUMNOS DEBERAN TRAER POR EQUIPO:

6 gr. Aproximadamente de leche en polvo descremada

1 plumn indeleble
Masking tape.
Jabn y franela para limpiar.

DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO.

Enumera 6 tubos de ensayo de 15 x 100 del 1-6, en el tubo 1 coloca 5 mL de
cido actico, en el segundo 4 mL de cido actico y 1 mL de acetato de
Sodio. En el tubo nmero tres agrega 3 mL de cido y 2 mL del acetato, en el
nmero cuatro 2 mL de cido y 3 mL de acetato de sodio, en el tubo con el
nmero 5 aade 1mL de cido y 2mL de acetato de sodio y finalmente el
ultimo tubo agrega 5 mL de Acetato de Sodio. Teniendo los 6 tubos con 5 mL.

PREPARACIN DE LA LECHE
En un vaso de precipitados de 100 mL disuelve 6 gr. De leche en polvo
descremada, con 50 mL de agua destilada. Aadiendo el agua poco a poco
para evitar que se formen grumos.

En un tubo de ensaye de 16 x 150 mm mide 2 mL de la leche rehidratada,

agrega 8 mL de agua destilada, agita cuidadosamente por inversin.
Obteniendo leche diluida (1:5)

PUNTO ISOELCTRICO.
Aade 1 mL de la leche diluida (1:5) a cada tubo de solucin amortiguadora
que preparaste, es decir, a los tubos de ensaye que contienen cido actico y
acetato de sodio.
Mezcla cuidadosamente por inversin todos los tubos y deja reposar por
espacio de 10 minutos. Observa el aspecto de las mezclas preparadas. En el
tubo donde observes grumos de leche suspendidos en la solucin te indicar
que las protenas de la leche se han insolubilizado debido al pH de la solucin
este pH es denominado PUNTO ISOELCTRICO.
Centrifuga los tubos a 2500 r.p.m. durante 10 minutos
Separa el sobrenadante y transfiere a tubos limpios de 15 x 100 con el nmero
de tubo que les corresponde.

DETERMINACIN DE PROTENAS CON EL METODO DE BIURET .

Coloca en una gradilla 11 tubos de 16 x 150 mm, rotula uno de ellos como
nmero cero, el cual llevar los reactivos para calibrar el espectofotmetro, los
siguientes tubos llevarn nmeros del I al V.
Los dems se enumeraran del 1-6 que corresponde a cada tubo que se
centrifugo.

Para los tubos con numeracin en romano:

Tubo
Agua

0
1 ml

Solucin Patrn 4
mg/ml
Reactivo de Biuret

0 ml
4 mL

I
0.8
ml
0.2
ml
4 mL

II
0.6
ml
0.4
mL
4 mL

Para los tubos con numeracin en arbiga:

III
0.4
ml
0.6
ml
4 mL

IV
0.2
ml
0.8
ml
4 mL

V
0 ml
1 ml
4 mL

Tubo
Agua

Sobren
adante

Reactiv
o de
Biuret

1
2
3
4
5
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
del
del
del
del
del
Sobrenad Sobrenad Sobrenad Sobrenad Sobrenad
ante del
ante del
ante del
ante del
ante del
tubo1
tubo2
tubo3
tubo 4
tubo 5
(centrifu
(centrifu
(centrifu
(centrifu (centrifu
gado)
gado)
gado)
gado)
gado)
4 mL

4 mL

4 mL

4 mL

4 mL

6
0.5 ml
0.5 ml
del
Sobrenad
ante del
tubo 6
(centrifu
gado)
4 mL

Mezcla cuidadosamente cada reactivo y deja en reposo 30 minutos para

favorecer el desarrollo de color. Antes de iniciar tus lecturas en el
espectofotmetro, antes de ocupar el espectrofotmetro calintalo 15 minutos,
es necesario calibrarlo con el blanco de reactivos a una absorbancia de cero,
con una longitud de onda de 570 mm.

RESULTADOS
Anota los valores del espectofotmetro en la siguiente tabla.
Tubo
D.O.
mg. De Protena

I
0.004
0.8

II
0.011
1.6

III
0.02
2.4

IV
0.066
3.2

Calcula el contenido proteico de los tubos I a IV de acuerdo al volumen

empleado de la solucin en estndar de 0 y colcalos en el eje X. Coloca los
valores de O.D. obtenidos para cada uno de estos tubos en el eje Y y traza
la curva correspondiente.

GRAFICA PATRN
Mililitros casena
0
0.2
0.4
0.6

D.O
0
0.004
0.011
0.020

0.8

0.066

EXTRAPOLACIN DE LA MUESTRA PROBLEMA

Mililitro
s
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0.805
0.808
0.822
0.839
0.869

D.O
0
0.004
0.011
0.020
0.066
0.060
0.061
0.065
0.070
0.080

Calcular los mg/ml de protena debes multiplicar el valor de mg interpolado

de la curva de calibracin por el factor de dilucin de la leche.

ANOTA LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA SIGUIENTE TABLA:

Protena
Sobrenadante1
Sobrenadante2
Sobrenadante3
Sobrenadante4
Sobrenadante5
Sobrenadante6

mg/ml
3.219
3.474
3.356
3.233
3.290
3.219

mg/100 ml
321.9
347.4
335.6
323.3
329.0
321.9

Haciendo uso de la ecuacin de Heenderson Haselbach calcula el pH del

tubo donde observaste la mayor precipitacin de casena.

pH= pK +log

[ Acido ]
[Base]

pH=4.7 +log

[0.1 N ]
[0.1 N ]

pH=4.7

. Describa brevemente la Ley de Rambert y Beer y cules son sus

limitaciones.

Dentro de un fotmetro se utiliza un haz de luz enfocado de manera

precisa para penetrar el elemento del procesado. Una clula
fotoelctrica de silicio mide la intensidad resultante de luz. La alteracin
de la intensidad de la luz, causada por la absorcin y/o difusin est
explicada
en
la
Ley
Lambert-Beer.
La Ley Lambert Beer es un medio matemtico de expresar cmo la
materia absorbe la luz. Esta ley afirma que la cantidad de luz que sale
de una muestra es disminuida por tres fenmenos fsicos:
La cantidad de material de absorcin en su trayectoria
(concentracin)
La distancia que la luz debe atravesar a travs de la muestra
(distancia de la trayectoria ptica)
La probabilidad de que el fotn de esa amplitud particular de onda

sea absorbido por el material (absorbencia o coeficiente de extincin)

Esta relacin puede ser expresada como:
A = dc
Donde
A=
Absorbencia
=
Coeficiente molar de extincin
d=
Distancia en cm
c=
Concentracin molar
Transmitancia
A medida que un haz de luz atraviesa un medio absorbente, la cantidad
de luz absorbida en cualquier volumen es proporcional a la intensidad de
luz incidente multiplicado por el coeficiente de absorcin.
Consecuentemente, la intensidad de un haz incidente decae
exponencialmente a medida que pasa a travs del absorbente. Esta
relacin cuando se expresa como Ley de Lambert es:
T = 10-cd or T = 10-A
Donde
T=
=
c=
d=

Transmitancia
Coeficiente molar de extincin
Concentracin molar del absorbente
Distancia en cm

Absorcin
La transmitancia puede ser trazada en relacin a la concentracin, pero
la relacin no es lineal. El logaritmo negativo en base 10 de la
transmitancia s es, sin embargo, lineal con la concentracin.
De esta manera, la absorcin es medida como:
A = -log10 (I/Io) or A = -log10 (T)

BIBLIOGRAFA
1. D.D. MILLER. Qumica de Alimentos. Manual de laboratorio. Limusa-Wiley.
Mxico D.F., 2001.

2. Skoog, Douglas A. y Holler, James. "Anlisis Instrumental". Quinta Edicin.

Editorial Mc Graw-Hill. Ao 2001.