Genetic A Bacterian A

GENETICA BACTERIANA
Mutaciones
Transferencia de material gentico
de un microorganismo a otro
Procesos que producen cambios en la

informacin gentica de un microorganismo.
Estos pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo (cambios
morfolgicos, estructurales o funcionales)
y adaptacin a distintos ambientes.
Recombinacin gentica
Transposicin
Estos procesos permiten el anlisis de la

estructura gnica de un organismo y de su
funcionalidad y tienen importancia y uso
para la construccin de nuevos organismos
con aplicaciones prcticas.
Mutaciones
de un organismo a otro

informacin gentica de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptacin a
distintos ambientes.
Transposicin

estructura gnica de un organismo y de su
funcionalidad y tienen importancia y uso
para la construccin de nuevos organismos
con aplicaciones prcticas.
Mutacin en bacterias
Gen silvestre: secuencia de un gen en las bacterias aisladas en su hbitat natural

Mutacin: cambio heredable en la secuencia de bases del genoma de un organismo.
Mutante: la cepa que lleva ese tipo de cambio (proviene de una cepa silvestre). Se
denominan de acuerdo a si se hace referencia al gen mutado (genotipo) o al fenotipo alterado.
Genotipo: dado por la secuencia de nucletidos en el ADN

Gen: minscula e itlica, ej.: el gen hisC, genes exo (mutante hisC o cepa hisC-)
Fenotipo: dado por las propiedades observables o detectables del organismo

Protena o camino metablico: His (cepa His-, cepa Exo-, mutante His).
The role of Mesorhizobium loti surface polysaccharides on
the nodulation process is not yet fully understood. In this
article, we describe the nodulation phenotype of mutants
affected in the synthesis of lipopolysaccharide (LPS) and
(1,2) cyclic glucan. M. loti lps2 mutant produces LPS
with reduced amount of O-antigen, whereas M. loti lps1
mutant produces LPS totally devoid of O-antigen. Both
genes are clustered in the chromosome. Based on amino
acid sequence homology, LPS sugar composition, and enzymatic
activity, we concluded that lps 2 codes for an enzyme
involved in the transformation of dTDP-glucose into dTDPrhamnose,
the sugar donor of rhamnose for the synthesis of
O-antigen. On the other hand, lps1 codes for a glucosyltransferase
involved in the biosynthesis of the O-antigen.
Although LPS mutants elicited normal nodules, both show
reduced competitiveness compared with the wild type. M.
loti (1-2) cyclic glucan synthase (cgs) mutant induces
white, empty, ineffective pseudonodules in Lotus tenuis.
Cgs mutant induces normal root hair curling but is unable
to induce the formation of infection threads. M. loti cgs
mutant was more sensitive to deoxycholate and displayed
Cmo se producen las mutantes?
Bacteria sensible a antibitico
Se hace crecer en un medio con antibitico

Se aslan colonias que poseen una resistencia a la
droga (heredable).
Las mutaciones se indujeron a causa del antibitico?
Medio con antibitico

Colonia proveniente de
bacteria sensible a antibitico
Colonias resistentes a antibitico
En general la mutacin es un evento que ocurre al azar y no est

relacionado con una adaptacin especfica al medio ambiente.
Todas las
replicas en
medio selectivo
son iguales
Luria y Delbruck (1943): investigaron el origen de la mutacin que le confiere a E. coli

resistencia al fago T1
B
1
20
20 erlenmeyers(1ml/erlenmeyer)
conteniendo 103 clulas /ml
Cada uno se plaquea en una placa con fago T1

0,2 ml / placa
10 ml conteniendo
103 clulas/ml
Se crecen hasta alcanzar 109 clulas/ml
Se plaquean 20 placas que contienen el fago,

0,2 ml de cultivo / placa.
Tasa de mutacin para un determinado fenotipo: La probabilidad de que una clula mute a un
determinado fenotipo cada vez que la misma se divide.
a=
m
d
m
N2 N1
Si se hace en cultivo lquido hay que hacer

correcciones en base a clculos estadsticos
porque el nmero de eventos de mutacin
nmero de mutantes
a= tasa de mutacin
m= nmero de mutaciones surgidas en el cultivo
en el tiempo t
d= nmero de divisiones ocurridas en ese tiempo t
N= nmero de clulas
Se aplica esta aproximacin
M/N
Pendiente= a
tiempo
Se debe trabajar con cultivos densos en fermentador
La tasa de mutacin se saca experimentalmente

y depende del tamao del gen, secuencia del gen,
secuencia de aa y estructura tridimensional del
producto del gen que se est mutando y si el fenotipo
depende de un solo gen o de varios.
Tasa de mutacin espontnea para cada gen: 10-6-10-10
Auxotrofa aa
resist Ab
Puntuales: Sustitucin de pares de bases: transiciones Pu:Py

transversiones Pu:Py
Pu:Py
Py:Pu
Microinserciones
Mutaciones
Microdeleciones
Mutaciones debidas a cambio de muchos pares de bases (genes enteros): inserciones

deleciones
inversiones
Translocaciones
duplicaciones
Pu: A y G
Py: T y C
Consecuencias de las mutaciones puntuales

En zona codificante:
UAC
Codn de tirosina
Sustitucin de pares de bases: El

cambio fenotpico depende de que
cambio de nucletido tuvo lugar y
donde exactamente ocurre la mutacin
en el gen.
CAC
Codn de
Histidina
UAG
codn de
terminacin
UAU
codn de
tirosina
Protena defectuosa
Protena incompleta Protena normal
Mutacin de contrasentido Mutacin sin sentido Mutacin silenciosa
Mutaciones por desfase: Por insercin

o delecin (que no sea mltiplo de 3)
se origina un desfase en el marco de
lectura. La traduccin resulta alterada.
En zona no codificante:
En zona promotora: inactivacin o conversin de un promotor inducible en promotor constitutivo.
10
Por errores en la replicacin: los errores ocurren

Espontneas
con alta frecuencia pero

existen mecanismos de
correccin muy eficientes
Por alteracin espontnea de ciertos nucletidos

que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, prdida de amino.
Mutaciones
Mutgenos qumicos y fsicos

Provocadas
Para aislar una mutante:
Mutgenos biolgicos: mutagnesis por transposn
Mutagnesis dirigida: Tecnologa de ADN

recombinante.
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutacin

Hay que buscar un mtodo eficiente de seleccin
11
Tautomerismo
T- - - A
T- - - G
TA
CG
forma
enol
Forma tautomrica
Se comporta como
A* (imino)
G* (enol)
C* (imino)
T* (enol)
12
Prdida de NH2
5% de las citosinas estn metiladas
C - - -G
MeC - - -G
Tanto C como MeC pueden perder el NH2
C
MeC
U
T- - -A
MeCG
TA
Hot Spots
13
Por errores en la replicacin: ocurre con alta frecuencia

Ocurrir
naturalmente
Existen mecanismos de
correccin

Tautomerismo, Hot Spots.
Mutaciones

Provocadas

recombinante.

14
15

Ocurrir
naturalmente
correccin

Mutaciones

Provocadas

recombinante.

16
Hipoxantina (APAREA CON CITOCINA)

Uracilo (APAREA CON ADENINA)
(la transforma en comp.
que se aparea con A)
y deleciones
In vivo e in vitro
salvo NTG que
actua solo in vivo
mutaciones puntuales por errores en apareamiento
Bloqueo de emparejamiento de bases
aflatoxina
distorcin, error por reparacin
Anlogo de base
T(forma enol) (aparea con G)
BU
BU (forma enol)
BU - - - G
Ms frecuentemente
AT
GC
17
Sistemas de reparacin
Mecanismos de reparacin general
Actividad correctora de la ADN polimerasa III durante la replicacin (mutD)
(exo 3 5). Frecuencia baja pero no nula. Innovaciones presin selectiva
evolucin
Reparacin de mismatch dependiente de metilo:

Reconocen cambios en la estructura del ADN debido a un apareo indebido
(pequeas distorsiones en la hlice). Participan los genes mutS, mut L y
mut H.
El gen dam (codifica para una enzima que metila Adenina dentro de determinada
secuencia despus de la replicacin, la nueva hebra esta temporalmente
no metilada). Entonces cuando el dao y la formacin de mismatch ocurre
durante la replicacin puede ser corregido correctamente porque el sistema
reconoce cual es la hebra nueva.
Genes mut: genes mutadores
18
Mecanismos que reconocen distorsiones grandes en la hlice. Principalmente daos por UV, NTG,
especies reactivas de oxgeno
Reparacin por escisin

Reparacin recombinatoria
Reparacin por mecanismo de SOS (mutagnico)
Reparacin por escisin-resntesis
Reparacin recombinatoria
1) Helicasa (uvrA y uvrB)

2) Se une uvrC y se forma
la endonucleasa
3) Corta x nmero de nt a
izquierda y derecha del
dmero
4) DNA polimerasa I rellena sobre
molde
5) ligasa
1) DNA polimerasa III salta y

deja hueco
2) Se produce recombinacin
entre cadenas por accin
de RecA
Intervienes los productos de los genes uvrA, uvrB, uvrC, uvrD y

DNA polimerasa. Son inducibles por dao al ADN
prereplicativo
posreplicativo
19
Reparacin por mecanismo de emergencia (SOS) (propenso a error)

Por accin de mutgenos
o por stress ambiental
Dao al ADN
grande
Se induce el sistema de SOS

(normalmente reprimido por LexA)
Clula normal: nivel basal de LexA (represor de lexA, y de recA, uvrA, B, C, y umuDC (reguln SOS).
La represin no es total entonces hay niveles basales de estas enzimas y por lo tanto hay reparacin
por recombinacin y por escisin.
Clula daada: muy afectada la replicacin. Muchas zonas del cromosoma como simple cadena sin
reparar. RecA reconoce estas zonas y se activa a una forma que induce la autoprotelisis de LexA.
Deja de haber represor, aumenta reparacin por mayor cantidad de RecA y de UvrA, B y C pero
aumenta expresin de umuDC. UmuDC permite la replicacin sobre DNA daado (bypass replicativo)
pero metiendo errores. La clula sigue viable pero adquiere mltiples mutaciones.
20
Mecanismos de reparacin especficos para determinado tipo de mutacin

Dao por Deaminacin:
Actan DNA glicosilasas especficas reconocen (hipoxantina, uracilo).

Rompen entre el azcar y la base alterada. Luego actan las AP endonucleasas que
cortan en el esqueleto azcar-fosfato y finalmente acta la ADN polimerasa I rellenando.
(Deaminacin espontnea de C)
Deaminacin por cido nitroso)
Desaminacin de citocinas metiladas
C
MeC
Uracil-glicosilasa
T- - -A
MeCG
No se saca con una glicosilasa
Hot spot
TA
(sobre las T en mismatch con G en el contexto de determinada

secuencia acta otro sistema reparacin llamado VSP (very
short patch. Repara en favor de la hebra que tiene la G
Dao por alquilacin: (metil guanina por metanosulfonato de etilo)
glicosilasas especficas,
AP endonucleasas y la ADN pol I
Dao por especies reactivas de oxgeno: Formacin de 8-oxo G. Aparea con A en lugar de C
Paricipan los genes mutM, mut T y mutY.
mut M codifica para una glicosilasa especfica para 8-oxo G.
mutY codifica para una glicosilasa especfica para A.
mutT inhibe la formacin de 8-oxo G.
Tambin en dao al ADN por especies reactivas de oxgeno
acta el sistema de reparacin por escisin (mecanismo general)
Dao por Radiacin UV (formacin de dmeros de timina). Fotoreactivacin: ocurre en presencia de

la luz. Acta una Fotoliasa que separa las bases unidas
Tambin hay N-glicosilasas especficas para dmeros de timina
21

correccin
Ocurrir
naturalmente

Mutaciones

Provocadas
Mutgenos biolgicos: mutagnesis

por transposn
Genes
mutadores

recombinante.

22
Mutacin adaptativa ?
Existen algunos ejemplos
Mutacin adaptativa o de fase estacionaria: se forma durante la exposicin a las condiciones selectivas y no est presente de antes.
Ocurre por hipermutacin (induccin de SOS sin reparacin de errores)
Mutantes lacZ (no pueden crecer en lactosa porque est mutada la -galactosidasa, mutacin por desfase).
Despus de un tiempo en medio mnimo con lactosa empiezan a aparecer colonias de revertantes
Mecanismo:
Tasa de mutacin general regulada por el ambiente
Stress
(ambiente adverso o ayuno exhaustivo)
Amplificacin adaptativa
Hipermutacin por induccin del sistema SOS
El ambiente provoca la hipermutacin y el aumento de probabilidad de adaptarse a ese ambiente adverso
23
Reversiones
Una revertante es una cepa en la que se restaur el fenotipo silvestre que se haba perdido.
Se vuelve a la secuencia original: revertante verdadera
Revertante de un mismo sitio
Secuencia que al traducir da el mismo aa
Mutacin en el mismo gen: corrigen el marco

de lectura.
Mutacin en otro gen que restaura el fenotipo
silvestre produciendo la misma protena.
Ej. : mutacin en genes de tRNA. Supresora informacional
Revertantes
Tambin pueden
ocurrir naturalmente
o ser provocadas
Revertantes de segundo sitio o

mutaciones supresoras
Supresoras por sobrexpresin

Supresoras por interaccin
Mutacin que produce una va metablica

alternativa que permite el mismo fenotipo. Supresora
por bypass
24
Supresora informacional
Tambin supresora informacional de desfase
25

Ocurrir
naturalmente
correccin

Mutaciones

Provocadas


recombinante.
26
Aislamiento de mutantes
1) Deteccin por Rastreo o Screening
Observacin cambios en fenotipo
Ej.: mucosas y no mucosas
a) Directo
mutagnesis
plaqueo
b) Por replica en placa
mutagnesis
plaqueo
Repique y
ordenamiento
Replica
Ej.: mutante sensible a antibitico

c/Ab
mutante en motilidad
Medio con menor % de agar
27
2) Seleccin
a) Seleccin positiva: La mutacin proporciona una ventaja para el crecimiento

bajo ciertas condiciones ambientales.
Ej.: resistencia a un antibitico.
mutagnesis
s/Ab
c/Ab
b) Seleccin negativa: La mutacin causa una desventaja:

Ej.: mutante auxotr
Enriquecimiento (penicilina, incorporacin de precursor metablico radioactivo)
Se repite el proceso
varias veces
Agrego al medio
penicilina
mutagnesis
Medio completo
Medio en el que no puede

crecer la mutante buscada
Ej.: sin aminocido
Las bacterias no mutadas, que

pueden crecer, se lisan
Medio completo
Repique y
ordenamiento
Replica
Aumenta la cantidad de
mutantes obtenidas,
por eso se llama
seleccin
Medio sin aminocido
Mutantes leaky
Mutantes letales
Mutantes condicionales
28
Mutagnesis y carcinognesis: Test de Ames

Uso de cepas bacterianas mutantes para identificar sustancias potencialmente
carcinognicas.
Se usa mutantes auxotrficas, puntuales (S. typhimurium, auxtrofa para histidina;,
E. coli, auxtrofa para triptofano).
La mutante auxtrofa no puede crecer en un medio carente del nutriente para el cual
es auxotrfica, si revierte entonces crece.
Una sustancia con capacidad mutagnica incrementa la frecuencia de reversin en la
mutante puntual.
Control
Disco de papel
Placa con bacterias

auxotrficas para
histidina
Medio con concentracin muy baja de histidina
Disco de papel
Con sustancia a ensayar
activada
29
Mutaciones

Transposicin

estructura gnica de un organismo y tienen
importancia y uso para la construccin de
nuevos organismos con aplicaciones
prcticas.
30
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
Exogenote: Replicacin, dilucin, degradacin o recombinacin
31
Mutaciones

Transposicin

prcticas.
32
Recombinacin: proceso por el que, en parte o por completo, las

molculas de ADN de dos fuentes distintas se intercambian o juntan
en una unidad. La informacin gentica se ve redistribuida
RECOMBINACION GENERAL
U HOMOLOGA
RECOMBINACION SITIO ESPECIFICA

O NO HOMLOGA
-Recombinacin sitio especfica ilegitima

-Recombinacin sitio especfica legtima
Entre fragmentos iguales o muy similares
RecA
Resolvasas
Transposasas
Integrasas
Invertasas y ms..
33
RECOMBINACION GENERAL U HOMOLOGA
Intercambio de
cadenas homlogas
Modelo de
Holliday o de
invasion de
doble cadena
Isomerizacin
Dos cortes en cs
En el mismo lugar
Entrecruzamiento de
Extremos libres
Apareamiento con
Secuencia complementaria
Y formacin de heteroduplex
Resolucin
Secuencias homlogas (95-100%, 100pb mnimo)

RecA
Sinapsis
Heteroduplex
Estructura de Holliday
Endonucleasas, ligasas, polimerasas
Migracion de ramificacion
Parches
Empalmes
(recombinacin verdadera)
34
Las dos cadenas de

una de las molculas
de ADN se cortan y los
extremos 5se degradan
Uno de los extremos 3

invade la otra molcula
de ADN y encuentra su
secuencia complementaria
La ADN polimerasa
Desplaza y rellena
Ligacin
Modelo de reparacin de ruptura de

doble cadena
35
Enzimas que participan en la recombinacin homloga:

RecBCD: nucleasa se une a extremos de doble cadena.
Reconoce una secuencia determinada que determina

donde se va a formar un extremo 3 que va a constitur la hebra invasora. Helicasa
RecA: Se une al extremo 3de la cadena invasora, lo fuerza a adoptar la conformacin de una hlice y permite que se meta
en la doble hlice de la otra molcula de ADN formando una hlice triple en la cual tiene lugar el apareamiento de
la hebra invasora con su complementaria.
RuvA, RuvB: involucradas en la migracin de la ramificacin.

RuvC: resuelve la estructura de Holliday
36
37
Consecuencias de la recombinacin homloga

Mutacin complementacin
Para que aparezca un nuevo fenotipo a
raz de la recombinacin homloga, las
dos cadenas que se intercambian deben
tener alguna diferencia
Integracin al cromosoma
La recombinacin entre dos regiones de una

misma molcula de ADN que presentan
similitud puede ser la causa de:
Deleciones
Inversiones
empalme
38
Mutaciones

Transposicin

prcticas.
39
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
40
PLASMIDOS
Elementos genticos, doble cadena, generalmente circulares,
que se replican en forma independiente del cromosoma del
hospedador
No llevan genes que codifiquen para funciones esenciales. Estn relacionados con la capacidad
evolutiva o adaptativa de las bacterias
Se conocen miles de tipos diferentes
Se encuentran en la mayora de las bacterias
Tamao entre 1000- 106 pb
Plsmido tpico: circular, bicatenario, 0,2-0,4% del ADN cromosmico
41
Forma superenrollada. Con rotura en una cadena da crculo abierto. Con rotura en las dos
cadenas da forma lineal.
Los plsmidos se replican a partir de un origen de replicacin.
En forma similar al
cromosoma bacteriano.
Replicacin theta
En crculo rodante
42
Los genes necesarios para la replicacin pertenecen en su mayora al hospedador (DNA

Polimerasas, ligasas, helicasas, primasas) pero el plsmido lleva informacin:
Para algunas de las enzimas necesarias para la iniciacin de la replicacin (esto determinar si
es de amplio o estrecho rango de husped y que tipo de replicacin sigue).
Para el control temporal de la iniciacin de la replicacin determinando el nmero de copias
por clula. Plsmidos de alto y bajo nmero de copias.
Para la regulacin de la particin de los plsmidos entre las clulas hijas en la divisin celular
Puede determinar su capacidad de compartir la clula con otros tipos de plsmidos:
incompatibilidad.
43
Nmero de copias:
Es caracterstico del plsmido
Bajo nmero de copias (1-3)
Alto nmero de copias (10-100)
RepA, RNA
Curacin:
Los plsmidos se pueden eliminar de la clula hospedadora por distintos tratamientos:
colorantes de acridina, detergentes, elevada temperatura, electroporacin. Ocurre una dilucin
del plsmido en la divisin celular.
Particin:
La segregacin de los plsmidos en las dos clulas hijas, para plsmidos de bajo
nmero de copias est regulada (sitios par).
Incompatibilidad:
Plsmidos distintos pero estrechamente relacionados no pueden permanecer juntos en forma
estable en una misma clula. Los plsmidos que no pueden coexistir forman parte del mismo
grupos de incompatibilidad. Los plsmidos que pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad comparten el mecanismo de regulacin de nmero de copias o el mecanismo de particin.
Hay numerosos grupos de incompatibilidad
44
Incompatibilidad
Diferente grupo de
incompatibilidad
Mismo grupo de
incompatibilidad
45
Hay distintos tipos de plsmidos en cuanto a genes extra que contienen y que le confieren al
hospedador un cierto fenotipo o una cierta capacidad.
46
Naturales
PLASMIDOS
Obtenidos por tecnologa de ADN recombinante
Replicativos
Amplio o estrecho
rango de husped
PLASMIDOS
Suicidas
47
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
48
Transformacin
Lisis bacteriana
Extruccin de ADN por T4SS
Proceso por el cual el ADN libre

se incorpora en una clula
receptora y lleva a cabo un cambio
gentico heredable.
Porque?
Nutricin
Adaptacin
reparacin
No todas las bacterias son transformables naturalmente.

Ejemplos de bacterias transformables naturalmente o naturalmente competentes: Bacillus,
Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Azotobacter, Pseudomonas
Clula competente: clula capaz de tomar

una molcula de ADN y ser
transformada.
La competencia natural depende de la especie, de la fase de crecimiento, del pH, etc.
Algunas especies presentan el 100% de las clulas en una cultivo competentes al final
de la fase exponencial (10-15) (Streptococcus pneumoniae) y otras un 1-20 % de
clulas competentes y solo en fase Estacionaria (Bacillus subtilis)
En el proceso de transformacin natural intervienen protenas de membrana que
asocian ADN, autolisinas de pared celular, nucleasas.
49
Desarrollo de la competencia
Observado para Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis (G+)
A medida que la clula crece, secreta al medio un pptido. Existen protenas sensoras en la membrana celular
que sensan la concentracin del pptido. Cuando el pptido llega a determinada concentracin, esto es sensado
por las protenas sensoras (mecanismo de quorum sensing) que transmiten la seal a una protena reguladora
(sistema de regulacin de dos componentes) que a su vez activa la transcripcin de varios genes entre los que
se encuentran aquellos que codifican para la maquinaria necesaria para la captacin del ADN exgeno, su
entrada y recombinacin (protenas unidoras del ADN cd, endonucleasas, exonucleasas, autolisinas de la pared,
canales de membrana, protenas protectoras contra la degradacin de la cadena simple que entra, protenas
necesarias para la recombinacin.
Slo se puede transformar naturalmente con ADN doble cadena lineal.

Transformacin natural es poco eficiente con plsmidos
El ADN se une como doble cadena
pero al citoplasma solo entra como
simple cadena
La captacin de ADN es inespecfica

salvo para Neisseria y Haemophilus en
los que se reconoce una secuencia de
11 pb.
50
Gram (+)
En la transformacin natural, entre el ADN simple cadena

(exogenote) y el cromosoma bacteriano ocurre una recombinacin
homloga no recproca
51
Se puede inducir el estado de competencia: mecanismo de transformacin distinto al que

ocurre en clulas naturalmente competentes.
Ej.: Tratamiento con Cl2Ca y shock trmico (E. coli).
Electroporacin (distintas bacterias)
En el caso de competencia inducida se puede transformar con

plsmidos
Plsmidio replicable
Transformacin
con plsmidos
Complementacin o introduccin de un gen nuevo

Complementacin
Plsmido no replicable (suicida)
recombinacin
mutacin
Retomar al hablar de conjugacin
52
Se debe tener un mtodo de

seleccin
-
Eficiencia de
= nmero de colonias
Transformacin
g ADN
53
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
54
Transduccin
Infeccin ltica y lisognica
55
Generalizada
Transduccin
Especializada
56
Formacin de fago transductor para transduccin generalizada

Fagos transductores:
Fago P1 y P22
Fago
transductor
57
Transduccin generalizada
Seleccin en
Determinado
medio
Recombinacin
Homloga
(RecA)
58
Transduccin especializada
Formacin de fago transductor con fago atemperado
Fago lambda
Clula
lisognica
Recombinacin sitio
especfica legtima
59
Transduccin especializada
60
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
61
Conjugacin
62
Plsmidos conjugativos (F en E. coli)

Conjugacin en G (-)
4 etapas:
1) formacin del par receptor-donor
2)Preparacin para la transferencia
del ADN.
3)Transferencia del ADN.
4) Formacin de una rplica funcional
en el aceptor.
Transconjugante
Conjugacin en G(+): produccin por parte de clulas

aceptoras de feromonas que inducen en la superficie de las
clulas donadoras la acumulacin de sustancias de agregacin que
median la unin entre los dos tipos celulares (Enterococcus)
63
(60 genes, 100kb)
Plsmido autotransferible o conjugativo (F):

llevan genes que permiten el contacto efectivo
y lleva la informacin necesaria para la
transferencia
Plsmido movilizable o transferible:
lleva parte de la informacin necesaria para la
transferencia y necesita de la ayuda de un
plsmido autotransferible para transferirse
(indispensable: origen de transferencia oriT).
Plsmido no transferible: no tiene los
genes necesarios para el efectivo
contacto ni para la transferencia del
ADN.
64
PLASMIDOS
Conjugacin
Cl2Ca
Transformacin
inducida
Electroporacin
Autotransferibles (conjugativos y transferibles)
PLASMIDOS
Transferibles o movilizables
(necesito la presencia de otro autotransferible)
Conjugacn biparental y
triparental
Donacin
65
Conjugacin triparental
66
Conjugacin
(como en transformacin
con plsmidos)
Plsmido replicable
Complementacin o introduccin de gen nuevo

Complementacin
Plsmido no replicable
(suicida)
recombinacin
mutacin
Tecnologa de ADN recombinante
67
Conjugacin
Medio de contraseleccin apropiado para seleccionar clulas
aceptoras (con la nueva informacin) y no las dadoras
Complementacin
A-
Cm r
Cepa Aceptora
A
A
Vector Amp r
Replicativo
Vector de expresin
Cepa dadora con funciones

de conjugacin
Conjugacin biparental
68
Conjugacin
Medio de contraseleccin apropiado para seleccionar clulas
aceptoras (con la nueva informacin) y no las dadoras
Complementacin
A-
Cm r
Aceptora
A
A
Vector Amp r
Replicativo
Medio c/Amp y c/ Cm
Crece aceptora con plsmido

de conjugacin
69
Mutacin
E. coli (no crece en sacarosa)
Rhizobium
+
Crece en medio
Mnimo (MM)
con sacarosa
A-
Gm
de conjugacin
Vector suicida en cepa aceptora
Ampr
70
Mutacin
E. coli (no crece en sacarosa)
Rhizobium
+
Crece en medio
Mnimo (MM)
con sacarosa
A-
Gm

de conjugacin
Vector suicida en cepa aceptora
Ampr
MM sacarosa
c/ Gm
Gmr Ampr
Un evento de recombinacin
Gmr Amps
2 eventos de recombinacin
Si en lugar de conjugacin, introduzco el plsmido por transformacin,

no se requiere usar un medio que no permita crecer E. coli
71
Integracin
delecin
Un evento de recombinacin
Gmr Ampr
Doble evento de recombinacin
Gms Amps
Gmr Amps
72
Movilizacin del cromosoma

El plsmido F se puede integrar al cromosoma (episoma) y es capaz de transferir una
porcin del cromosoma a una clula aceptora: Conduccin y sexduccin
F+: plsmido F no integrado (donadora)
F-: no tiene plsmido F (receptora)
Hfr: clulas que tienen el plsmido F integrado al cromosoma (conduccin)
F: Ocasionalmente el plsmido F integrado se puede escindir del cromosoma y existe la posibilidad de que se incorporen
al mismo genes cromosmicos adyacentes (donador si no perdi ninguno de los genes necesarios para el proceso)
(Sexduccin)
73
La integracin del plsmido F al

cromosoma es a travs de las
Secuencias de Insercin, IS,
que se encuentran tanto en el
plsmido como en determinados
lugares del cromosoma.
Recombinacin homloga
74
75
Existen diferentes secuencias de insercin y para cada tipo existen distintos sitios
en el cromosoma donde se pueden integrar, o sea se pueden tener diferentes cepas Hfr.
Como se detecta si hubo o

no transferencia de ADN
cromosmico y
recombinacin
76
Mediante el uso de una variedad de cepas Hfr se pudo determinar en E. coli la disposicin (ubicacin relativa
y orientacin de un gran nmero de genes cromosmicos
Conjugacin de:
Hfr a+ b+ c+ d+ e+ Strs
X
F- a- b- c- d- e- Strr
Producto de conjugacin
(Se corta la conjugacion a distintos tiempos
por agitacin)
Plaqueo en medio con estreptomicina

y todos los aa menos:
Tambin se puede utilizar

la transduccin generalizada
Para mapear el genoma de E. coli
77
78
Mutaciones

Transposicin

prcticas.
79
Recombinacin: proceso por el que, en parte o por completo, las

molculas de ADN de dos fuentes distintas se intercambian o juntan
en una unidad. La informacin gentica se ve redistribuida
RECOMBINACION GENERAL
U HOMOLOGA
RECOMBINACION SITIO ESPECIFICA

O NO HOMLOGA
-Recombinacin sitio especfica ilegitima

-Recombinacin sitio especfica legtima
Entre fragmentos iguales o muy similares
RecA
Resolvasas
Integrasas
Transposasas
Invertasas y ms..
80
RECOMBINACION NO HOMLOGA
Recombinacin sitio especfica legtima
Recombinacin sitio especfica ilegtima
81
Integrasas (Integracin de fago)
Recombinacin sitio especfico

legtima
Resolvasa (una etapa de la transposicin replicativa )

Invertasas (inversin)
Integrasas
Invertasas
82
Mutaciones

Transposicin

prcticas.
83
Recombinacin sitio especfico ilegtima

Transposasas
Transposicin
El ADN de bacterias, virus y clulas eucariotas contienen elementos que se pueden
mover de un lugar a otro del mismo
El movimiento se llama transposicin.
Secuencias de insercin
Transposones compuestos
Transposones no compuestos
Fago Mu
84
IR
Secuencias de insercin
Transposones compuestos
Tn5, Tn9, Tn10
IR
Transposasa
E.coli contiene distintos IS,

algunos estan repetidos.
se los encuentra tanto en cromosoma
como en los plsmidos
Transposones no compuestos
Tn3
85
8-38 pb
Reconocimiento del
blanco:
Transposasa
Target: 3-12 pb
No es especfica respecto de la
secuencia del husped. Es caracterstico
el nmero de bases duplicadas para
cada transposn.
Algunos transposones saltan
preferentemente a regiones con
determinado enrollamiento o grado
de metilacin.
Conservativo (Tn5 y IS)
Mecanismo de transposicin
compuesto
Replicativo (Tn3, Fago Mu) (hay un intermediario)

No compuesto
86
Transposicin replicativa
Transposicin conservativa
Transposicin
(Transposasas)
Recombinacin sitio
especfica ilegtima
Recombinacin
sitio especfica
legtima
(Resolvasas)
IS y transposones compuestos
Tn3 y fago Mu
87
Consecuencias de la transposicin
Mutagnesis: Se utilizan transposones para mutagenizar. La resistencia a antibiticos
para la cual codifican es til para seleccionar las mutantes. Se utilizan como portadores
del transposn, plsmidos suicidas. Se utilizan transposones modificados: miniTn5 (no
codifica para la transposasa).
Induccin de la expresin: por secuencias promotoras que contiene y que quedan

rio arriba de algn gen.
Rearreglos: por insercin de transposones compuestos

(deleciones e inversiones, nuevos transposones)
88
Mutagenesis generalizada por transposicin

Rhizobium
E. Coli (no crece en sacarosa)
+
Crece en
MM sacarosa
Vector (suicida en rhizobium) AmpR
con Tn5 (Kmr)
Medio selectivo c/ Km
(MM Sac Km)
Plsmido suicida, selecciono
Evento de transposicin
La transposasa del transposn es inactiva y va otra copia intacta en el plsmido fuera del transposn
89
Consecuencias de la transposicin
Mutagnesis: Se utilizan transposones para mutagenizar. La resistencia a antibiticos
para la cual codifican es til para seleccionar las mutantes. Se utilizan como portadores
del transposn, plsmidos suicidas. Se utilizan transposones modificados: miniTn5 (no
codifica para la transposasa).
Induccin de la expresin: por secuencias promotoras que contiene y que quedan

rio arriba de algn gen.
Rearreglos: por insercin de transposones compuestos

(deleciones e inversiones, nuevos transposones)
90
Rearreglos
Delecin
Creacin de un nuevo transposn
Inversin
Out-side end transposition

(transposicin externa)
In-side end transposition
(transposicin interna)
91
Thomas D. Brock and Michael T. Madigan. Biologa de los

Microorganismos
Prescot, Harley and Klein. Microbiology
Snyder and Champness. Molecular genetics of bacteria
92

Genetic A Bacterian A

Uploaded by

Document Information

Original Description:

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Genetic A Bacterian A

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

GENETICA BACTERIANA

Procesos que producen cambios en la

Estos procesos permiten el anlisis de la

Procesos que producen cambios en la

Estos procesos permiten el anlisis de la

Gen silvestre: secuencia de un gen en las bacterias aisladas en su hbitat natural

Genotipo: dado por la secuencia de nucletidos en el ADN

Fenotipo: dado por las propiedades observables o detectables del organismo

Cmo se producen las mutantes?

Bacteria sensible a antibitico

Se hace crecer en un medio con antibitico

Medio con antibitico

Colonias resistentes a antibitico

En general la mutacin es un evento que ocurre al azar y no est

Luria y Delbruck (1943): investigaron el origen de la mutacin que le confiere a E. coli

Cada uno se plaquea en una placa con fago T1

Se crecen hasta alcanzar 109 clulas/ml

Se plaquean 20 placas que contienen el fago,

Si se hace en cultivo lquido hay que hacer

Se aplica esta aproximacin

La tasa de mutacin se saca experimentalmente

Puntuales: Sustitucin de pares de bases: transiciones Pu:Py

Mutaciones debidas a cambio de muchos pares de bases (genes enteros): inserciones

Consecuencias de las mutaciones puntuales

Sustitucin de pares de bases: El

Mutaciones por desfase: Por insercin

Por errores en la replicacin: los errores ocurren

con alta frecuencia pero

Por alteracin espontnea de ciertos nucletidos

Mutgenos qumicos y fsicos

Para aislar una mutante:

Mutgenos biolgicos: mutagnesis por transposn

Mutagnesis dirigida: Tecnologa de ADN

Hay que tratar de aumentar la tasa de mutacin

5% de las citosinas estn metiladas

Por errores en la replicacin: ocurre con alta frecuencia

Por alteracin espontnea de ciertos nucletidos

Mutgenos qumicos y fsicos

Para aislar una mutante:

Mutgenos biolgicos: mutagnesis por transposn

Mutagnesis dirigida: Tecnologa de ADN

Hay que tratar de aumentar la tasa de mutacin

Por errores en la replicacin: ocurre con alta frecuencia

Por alteracin espontnea de ciertos nucletidos

Mutgenos qumicos y fsicos

Para aislar una mutante:

Mutgenos biolgicos: mutagnesis por transposn

Mutagnesis dirigida: Tecnologa de ADN

Hay que tratar de aumentar la tasa de mutacin

Hipoxantina (APAREA CON CITOCINA)

mutaciones puntuales por errores en apareamiento

Bloqueo de emparejamiento de bases

distorcin, error por reparacin

T(forma enol) (aparea con G)

Reparacin de mismatch dependiente de metilo:

Genes mut: genes mutadores

Reparacin por escisin

Reparacin por escisin-resntesis

1) Helicasa (uvrA y uvrB)

1) DNA polimerasa III salta y

Intervienes los productos de los genes uvrA, uvrB, uvrC, uvrD y

Reparacin por mecanismo de emergencia (SOS) (propenso a error)