Apontamentos Microbiologia Aplicada para Exame

Introduo
BREVE REVISO SOBRE MICROBIOLOGIA
Diversidade microbiana: estimativas e relevncia
Diversidade microbiana: metabolismo e fisiologia
MICRORGANISMOS DE RELEVNCIA BIOTECNOLGICA
Eucariontes: Fungos (+ algas)
Procariontes: eubactrias (Gram+/Gram-) (+ arquebact.)
Exemplos de metabolitos de origem bacteriana e fngica

ETAPAS DUM PROCESSO BIOTECNOLGICO MICR

Biodiversidade:
1) Diversidade de seres vivos e ecossistemas que pode ser apreciada a nvel:
a. subcelular (gentico),
b. da espcie (taxonmico)
c. da comunidade (ecolgico)

Biotecnologia: Explorao das actividades de seres vivos ou dos seus produtos para
benefcio humano em processos tecnolgicos
Biotecnologia microbiana (Biotecnologia
industrial, White Biotechnology)
Microrganismos:
grande diversidade metablica e fisiolgica
consequncia da diversidade
filogentica/ecolgica que resulta da
evoluo/adaptao
CARACTERSTICAS RELEVANTES:
Unicelulares ou baixo grau de diferenciao
No sazonais (em comparao com os animais e plantas)
Clulas de pequena dimenso:
elevada rea especfica elevada taxa de transferncia de nutrientes /
metabolismo / multiplicao
Grande versatilidade metablica e fisiolgica:
Utilizao de diferentes substratos (incluindo subprodutos industriais)
H produtos decertos microrganismos que so substratos para outros
Produo de diferentes metabolitos cuja sntese qumica seria difcil/impossvel
(vitaminas; antibiticos; enantimeros)
Possibilidade de cultura em grandes volumes (fermentadores)
Possibilidade/facilidade de manipulao gentica
Vantagens econmicas e ecolgicas: reduo custos energticos e com matriasprimas, reduo uso de solventes e produo resduos,

Problema!!! Existe um elevado nmero de

espcies no cultivveis pelo que no se podero aproveitar as suas capacidades
metablicas e fisiolgicas

Avaliao da diversidade microbiana

1965: Comparao de sequncias nucleotdicas de genes homlogos para determinar
distncias evolutivas entre organismos
1977: Anlise filogentica de sequncias nucleotdicas rRNA/rDNA (ou outros genes
conservados) - Filogenias moleculares

1986: Identificao e determinao de posio filogentica de microrganismos no

cultivveis (culture-independent methods):
Extraco de DNA
Amplificao por PCR
Clonagem
Sequenciao
Pesquisa contra bases de dados (BLAST) e/ou anlise filogentica

Diversidade Microbiana - Fisiolgica

Temperatura:

1. Termofilia (moderada ou extrema):

Arquebactria - Crenarch. (Ecitos); algumas Metanognicas
Eubacteria - Fototrficas (alg. Cianobactrias, Cloroflexceas, Clorobiceas e
Cromaticeas); Litoquimiotrficas (Aquifex, Hydrogenobacter, Thiobacillus,
Thermothrix); Organoquimiotrficas (Thermotoga, Thermus, alg. espcies de Bacillus,
Clostridium)
Algas - Cyanidium caldarium
2. Psicrofilia:
Eubactrias Psychromonas; algumas espcies de Flavobacterium, Micrococcus
Algas Chlamydomonas nivalis

PH
1. Acidofilia: Thiobacillus, Acidianus, Sulfolobus, Ferroplasma; Cyanidium (alga)
2. Alcalifilia: Bacillus, Micrococcus, Exiguobacterium, algumas cianobactrias

Actividade da gua
1. Osmofilia/halofilia moderada: Staphylococcus, algumas bactrias Gram+ e proteobactrias
de ambientes marinhos; algumas algas; alguns fungos e leveduras
2. Halofilia extrema: Halobactrias; algumas algas (p.e. Dunaliella)

Relaes com o oxignio

1. Anaerobiose obrigatria:
Bactrias Fototrficas: Sulfobactrias Verdes e Roxas, Heliobactrias
Bactrias LQT: Eubactrias Redutoras de Sulfato e Acetognicas, Arquebactrias.
Metanognicas e Oxidantes de H2 (dependentes de S0 - Ecitos)
Bactrias OQT: Eubactrias e Arquebcterias Redutoras de Sulfato e de Enxofre;
Algumas Bactrias Fermentativas (p.e. Clostridium)
2. Microaerobiose:
Algumas Eubactrias Sulfuricantes (p.e. Beggiatoa) e outras de ambientes aquticos
Algumas Bactrias Patognicas: espiroquetas (p.e. Treponema), proteob. (p.e.
Campylobacter, Helicobacter)

Presso
1. Barofilia (Piezofilia): Bactrias isoladas de fundos ocenicos: p.e. Colwellia hadaliensis,
Shewanella benthica (proteobactria) Fossas abissais: >5000 m, >50 MPa ~ 500 atm

Radiaes
Resistncia a Radiaes Ionizantes e UV: p.e. Deinococcus radiodurans, (tb. Micrococcus,
Streptococcus spp.)

Gram Gram +

APLICAES BIOTECNOLGICAS DE FUNGOS (FILAMENTOSOS E LEVEDURAS)

Produtos qumicos e farmacuticos
Metabolitos primrios (produzidos durante o crescimento):
Etanol: leveduras ascomicetas (Saccharomyces) a partir de cana-de- acar, milho,
resduos vegetais
cidos orgnicos (ex. c. ctrico): Aspergillus spp.
Poliis (ex. glicerol): leved. ascom. osmotolerantes
Vitaminas (ex. riboflavina): Eremothecium spp.
Carotenides (ex. b-caroteno): Blakeslea sp.
Polissacridos (ex. pululano): Aureobasidium sp.

Metabolitos secundrios (produzidos aps o crescimento):

Antibiticos (ex. penicilinas, cefalosporinas): Penicillium spp.
Hormonas de crescimento (ex. giberelina): Giberella sp.
Alcalides: Claviceps purpurea

Imunossupressores importante nos transplantes para a no rejeio dos rgos

Enzimas de origem fngica

Protenas heterlogas: S. cerevisiae e outras leveduras (estirpes modificadas

geneticamente)
Bioinsecticidas e Controlo biolgico
Controlo de pragas (mico-insecticidas)
Bio-controlo de plantas invasivas (mico-herbicidas)
Bio-controlo de doenas fngicas (mico-fungicidas)
Aplicaes dos Fungos na Indstria Alimentar

Produo de bebidas alcolicas: cerveja, vinho, etc.

Produo de levedura de panificao: Saccharomyces cerevisiae (levedura
ascomiceta)
Produo de queijos curados com fungos: Penicillium spp.
Produo de cogumelos comestveis
Produo de protena fngica (alim. animal e humana)
Produtos fermentados orientais:
- Sake (vinho de arroz): Aspergillus e Saccharomyces
- Alimentos fermentados: molho de soja e miso (Aspergillus oryzae),tempeh (Rhizopus)
- Grande variedade de cogumelos comestveis
- Produtos usados na medicina tradicional
APLICAES BIOTECNOLGICAS DE EUBACTRIAS

Metabolitos primrios (produzidos durante o crescimento):

Aminocidos (monoglutamato de sdio e lisina): Corynebacterium, Brevibaterium
(Gram+)
cidos orgnicos (lactato, cetogluconato): Lactobacillus spp. (Gram+); Gluconobacter
spp. (proteobactria)
Cetonas e alcois: Clostridium spp., Bacillus spp. (Gram+)
Vitaminas (B12): Propionibacterium spp. (Gram+)

Polissacridos (xantano): Xanthomonas campestris (proteobactria)

Bioplsticos (poli-hidroxialcanoatos; ex. PHB): Bacillus spp.
Aplicaes: indstria alimentar, qumica, farmacutica, etc.
Metabolitos secundrios (indstria farmacutica) e enzimas:

Antibacterianos: estreptomicina, tetraciclina, vancomicina, etc. (Streptomyces spp.);

bacitracina, polimixina (Bacillus spp.) (Gram+)
Antifngicos: nistatina, anfotericina B (Streptomyces spp.)
Proteases e amilases (ind. detergentes, alim., papel, farmac.): Bacillus spp. (Gram+)
DNA polimerases termostveis: Thermus spp.
Bioinsecticidas: Bacillus spp.
Protenas heterlogas: E. coli (estirpes modificadas geneticamente)

Aplicaes das eubactrias na Indstria alimentar

Produo de lacticnios:
iogurtes e outros leites fermentados*,
queijos (frescos, pasta mole, pasta dura, etc.);
bactrias homolcticas: Lactobacillus e Streptococcus spp. (Gram+)
Alimentos fermentados:
pickles, chucrute, azeitonas, salsichas e outros produtos crneos curados;
bactrias homo- e heterolcticas: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e
Streptococcus spp. (Gram+)
Vinagres:
converso de etanol (fermentao de frutos) em cido actico;
Acetobacter e Gluconobacter spp. (proteobactria)

*NOTA: A Organizao Mundial de Sade define probiticos como organismos vivos que,
quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefcio sade do
hospedeiro (FAO/WHO, 2001).
Como funo funcional benfica no organismo, os probiticos tem efeito sobre o equilbrio
bacteriano intestinal: controle do colesterol e de diarrias e reduo do risco de cncer.
Os probiticos podem ser componentes de alimentos industrializados presentes no mercado,
como leites fermentados, iogurte, ou podem ser encontrados na forma de p ou cpsulas.
Aplicaes Recentes:
Biolixiviao: extraco de metais (ex. Cu) de minrios pobres (ex. pirites e calcopirites);
Thiobacillus spp. (proteob.)
Tratamento de resduos/efluentes (consrcios microbianos):
- Slidos: Aterros sanitrios; Compostagem
- Efluentes domsticos: lamas activadas; leitos percoladores
- Efluentes/Resduos industriais: biorremediao (hidrocarbonetos, compostos aromticos,
organoclorados, etc.)
Digestores anaerbios: produo de biogs (CH4+CO2) (arquebactrias metanognicas)
Bio-plsticos (biodegradveis)
Biorremediao
Bio-energia/bio-combustveis
ARCHAEA: RELEVNCIA BIOTECNOLGICA

Halobactrias: prod. molho peixe (Nam-Pla; activ. proteolt.); prod. solutos compat.,
prod. pigm. bacteriorrodopsina, prod. poli-hidroxialcanoatos; biorremed.

Produo de extremozimas: amilases, celulases, proteases, DNA pol. termostveis

(arq. hipertermfilas); enzimas alcalistveis (arq. alcalfilas); enzimas estveis a baixas
temperaturas (arq. psicrfilas)

Dificuldades/limitaes:

 condies de cultura (anerobiose, elevadas temperaturas...)

escassez de ferramentas manipulao gentica

MICROALGAS: RELEVNCIA BIOTECNOLGICA

Produo
Produo
Produo
Produo

de
de
de
de

carotenides: Dunaliella
nutriceuticos (nutraceuticals) e biofrmacos
biomassa para aquacultura
lpidos e biocombustveis: Botryococcus, Chlorella,

Vantagens: baixo custo substrato; neutralidade em relao ao C

Dificuldades/limitaes: Scale-up; necessidade de grandes reas (fotobioreactores)

IMPORTNCIA DOS CONHECIMENTOS SOBRE MICROBIOLOGIA

1. Microbiologia geral: seleco e manuteno de estirpes
2. Metabolismo: seleco do substrato (meio de cultura)
3. Fisiologia: seleco das condies de operao
4. Biologia Molecular/Gentica: melhoramento das estirpes industriais
5. Cintica/energtica do crescimento: seleco condies cultura e fermentadores

Leveduras Saccharomyces

um fungo unicelular

Reproduz-se por gemulao diviso assimtrica,

clula filha mais pqeuena que a me -> levedura
Vacolo muito grande
Os acares (glucose e frutose) so as fontes de
energia e carbono mais utilizadas organismo
organoquimioheterotrfico
A amnia e o glutamato so as fontes de azoto
preferencialmente consumidas
Saccharomyces tem vindo a ser utilizada na
Curva diuxica duas fontes
biotecnologia alimentar para a produo de po,
de carbono aps trmino
vinho e cerveja por causa da sua capacidade de
da primeira fonte, inicia-se
uma nova curva
fermentar acares, mesmo na presena de
representante
da segunda
oxignio, e de sobreviver na presena de etanol
fonte
Dependendo das espcies, a temperatura de
crescimento mximo est compreendida entre os 34C e os 41C

NOTA: Ainda no so utilizadas estirpes geneticamente modificadas para a produo de

alimentos

Crescimento das leveduras Saccharomyces:

Crescimento diuxico utilizao de outra fonte de C

e energia aps o esgotamento da glucose
Na presena de misturas de fontes de C, estas
experimentam uma remodelao dramtica da
expresso gnica e do tipo de metabolismo a partir da
exausto de acar
Produtos da fermentao: CO2 e etanol (o etanol
elimina outros microrganismos mais sensveis e
inibe o crescimento de novos microrganismos)
Represso catablica represso por parte da glucose
A glucose ser usada sempre antes de qualquer outra fonte de carbono
A glucose ser fermentada mesmo na presena de oxignio Efeito de Crabtree
Aco simultnea de vria de sinalizao para:
Inactivao dos genes para a respirao aerbia
Inibio das enzimas para a respirao aerbia
Represso da utilizao de outras fontes de carbono

Acares utilizados pela famlia Saccharomyces:

1. Glucose/Frutose:
a. So transportados por difuso facilitada (no requer gasto de ATP)
b. Transportadores da famlia Hxts
c. Transportadores com diferente capacidade e afinidade maior afinidade para a
glucose
2. Maltose (Glucose + Glucose):
a. Transportador Mal3 (em duplicao no genoma)
b. Entra para a clula atravs de simporte com o proto (este proto tem de ser
exportado para o espao extracelular atravs da ATPase, que hidrolisa ATP e exporta
o proto)
c. hidrolisada pela glucosidase (G-G G+G)
3. Sacarose (Glucose + Frutose):
a. hidrolisada no exterior da clula (espao periplasmtico) pela Suc2 (invertase) (GF G+F)
b. transportada para o interior da clula atravs da famlia Hxts
4. Galactose:
a. Transportador Gal2 (tambm pode transportar glucose e frutose) Galactose-1P
Glucose-1P Glucose-6P Gliclise
Saccharomyces cerevisiae pertence a um complexo de espcies previamente
conhecido como Saccharomyces sensu stricto (gnero Saccharomyces)

O aumento da temperatura aumenta a toxicidade do etanol e se combinarmos o efeito

da temperatura e do etanol,
algumas
leveduras
j
no
crescem.

O fenmeno de Whole Genome Duplication ocorreu cerca de 100 milhes de anos

nas linhagens ancestrais da famlia Saccharomyces (esta famlia possui genes em
duplicados, por exemplo, genes glicolticos explicao para a grande capacidade
glicoltica do gnero Saccharomyces)

De gerao em gerao a clula muda o seu mating type instveis

Para estabilizar as estirpes necessrio deletar o gene HO (estirpes laboratoriais
haplides )
Os dois mating type diferentes diferem apenas no tipo de receptor e ferormona que
expressam
HO endonuclease expressa em clulas haplides no G1 (apenas em clulas-me) e
promove o mating type switch (a )

locus MAT cromossoma III

Locus de silenciamento regio sub-telomrica do cromossoma III
MAT: Codifica factores de transcrio especficos para cada mating type

O mating type switch mediado por converso gnica, usando como modelo um dos dois
loci MAT silenciados (consoante a mudana desejada) presentes perto das extremidades do
cromossoma III

Estratgias para o melhoramento das estirpes de leveduras industriais

Mtodos usados antes de recorrer engenharia gentica:
Seleco dos melhores fentipos entre mutantes espontneos ou induzidos (mutaes
pontuais)
Problema: Dificuldade em isolar mutantes recessivos de estirpes industriais devido
poliploidia (vrias cpias do genoma) Geralmente as mutaes so dominantes
Hibridao sexual ou parassexual: hibridao de esporos de espcies iguais ou hibridao
de protoplastos (hbridos interespcie)
Problema: as estirpes industriais possuem uma esporulao pobre

Engenharia Metablica:
" Atravs do uso da tecnologia de DNA recombinante possvel levar melhoria da formao
do produto ou de propriedades celulares por manipulao de funes enzimticas, de
transporte ou de regulao da clula.
Implica a manipulao especfica e dirigida da informao gentica para melhorar
certas caractersticas. Hoje visto como um processo interactivo, com vrias etapas de
engenharia e avaliao dos resultados, muitas vezes envolvendo diferentes mtodos.

Modificaes Genticas:
Deleces, duplicaes, inverses, translocaes
Knock-out de determinados genes atravs da recombinao com uma marca de
seleco (ex: gene que permita resistncia a um antibitico)
Sobre-expresso de genes endgenos
Expresso de verses mutantes de genes
endgenos
Expresso de genes heterlogos
Utilizao de vectores vai-vem (plasmdeos
com marcas para a sua utilizao em mais
que um microrganismo)

1. Engenharia Metablica Racional - Visa a modificao de enzimas, transportadores

ou protenas reguladoras com base no conhecimento existente anteriormente.

Exemplos: introduo de genes heterlogos para construir uma via metablica que no existia
anteriormente (por exemplo, o metabolismo das pentoses em S. cerevisiae)
Saccharomyces assimila hexoses mas no pentoses como a xilose e a arabinose, presentes
na natureza)
Esta estratgia acabou por ser menos bem sucedida do que o inicialmente previsto, porque
era baseada numa viso mais simplificada do metabolismo.
A introduo de genes vai interferir com mais do que um via de sinalizao.
Dificuldades:
- efeitos colaterais indesejados no previstos
- transferncia para a linhagens industriais

Biologia Sistmica
O sucesso moderado de Engenharia Metablica
Racional criou uma fora motriz para o aparecimento
de uma nova disciplina cientfica chamada Biologia
Sistmica, visando apreciar a clula como um sistema
complexo que interage a diferentes nveis.

Estudo das interaces entre os componentes de

um sistema biolgico, e como essas interaces fazem emergir a funo e comportamento
no sistema. Exemplos de componentes que interagem dinamicamente incluem: genes,
enzimas e metabolitos numa via metablica
Permite fazer a previso dos efeitos mediante as alteraes genticas
Inclui:
Recolha de dados experimentais das vrias reas "micas":
Transcriptmica
Protemica
Metabolmica conjunto de metabolitos
Fluxmica fluxo metablico (vias metablicas em determinadas condies)
Construo de modelos in silico

2. Engenharia Evolutiva - Refere-se a mtodos na qual uma estirpe com melhores

propriedades

obtida
atravs de uma cultura prolongada em condies especficas para a seleco do fentipo
desejado.

Exemplo 1: Obteno de estirpes para fermentao anaerbica de xilose

As que se
desenvolv
em mais
rpido so
selecciona
das
Exemplo 2: Melhoramento da taxa de consumo de xilose

(Transforma
o)

Se a engenharia evolutiva realizada directamente com estirpes industriais, os clones

seleccionados podem ser usados sem caracterizao gentica adicional.
Se as estirpes laboratoriais forem utilizadas, as modificaes genticas dos clones
seleccionados
devem ser identificadas (ou caracterizadas na medida do possvel) e estes podero ser

usados
engenharia metablica inversa.

para

a) Bibliotecas de Sobre-expresso - Explora a possibilidade de melhorar uma

caracterstica atravs da sobre-expresso de um gene previamente desconhecido por
afectar um fentipo particular; tais genes no foram, muito provavelmente, includos na
estratgia da Engenharia Metablica Racional.
Normalmente utilizado um promotor mais forte (mega-promotor) e/ou vrias cpias de
um vector
As estirpes so identificadas por sequenciamento da insero do plasmdeo, isolado
dos clones seleccionados

b) Engenharia dos factores de transcrio (gTME)- Obteno de fentipos com

alguma relevncia atravs da alterao da expresso de muitos genes - mutagnese
aleatria de protenas da maquinaria basal de transcrio.
Em levedura, esta estratgia (dirigida ao factor de ligao TATAbox e a um dos TAFs)
tem sido usada para melhorar a tolerncia s elevadas concentraes de acar e de
etanol.

3. Engenharia Metablica Inversa parte de um fentipo e no de um gene (no parte

com previses)
1) Identificar o fentipo desejado
O ponto de partida a comparao de diferentes manifestaes do mesmo fentipo, por
exemplo:
-uma variante da estirpe de interesse que passou por mudanas (evoluo).
-investigar um organismo diferente que possui a caracterstica desejada.
2) Determinar o factor gentico que confere tal fentipo
Geralmente depende da interpretao dos dados provenientes das vrias "micas" (difcil!)
3) Transferir o fentipo desejado para outra estirpe
Verificar a eficcia dos genes-alvo pela engenharia gentica de produo de estirpes
Esquema:
Descobrir o fenmeno gentico que causa a diferena fenotpica
Comparao entre 2 fentipos (estirpe evoluda e selvagem)
Transpor essa modificao para a estirpe selvagem para ver se resulta
Exemplo: Comparao entre leveduras frutoflicas e glucoflicas qual a base gentica para
estes fentipos diferentes? ser que existem genes nicos para cada fentipo?

4. Controlo da expresso gnica e actividade proteica

O nvel de protena pode ser modulado por mudana de uma srie de factores:
1) o nmero de genes
-nmero de cpias do plasmdeo (no muito prtico)
2) a fora e regulao do promotor
- fraco vs forte, promotores constitutivos vs indutvel
3) eficincia da traduo e da estabilidade do mRNA
utilizao de determinado codo especfico para cada organismo dependente da
concentrao de tRNAs para determinado codo (Codon BIOS)
correspondncia de aminocidos de uma protena atravs da utilizao de codes
especficos para Saccharomyces
4) regulao da degradao de protenas

exemplo: Put4 (permease de prolina)- reduo de resduos de lisina; com mutagnese da

permease obteve-se uma menor degradao desta e maior consumo de prolina

Melao - mistura complexa de acares (maltose, galactose, fructose, glucose e

oligossacridos) onde a glucose est presente em concentrao suficiente para prevenir a
utilizao simultnea de outras fontes de carbono

Na presena de glucose,
Mig 1 permanece
desfosforilado e migra para
o ncleo onde, juntamente
com o complexo Tup1/Ssn6,
inibe os genes
responsveis do

Diminuir a represso catablica por parte da glucose um melhoramento de

grande importncia
Estratgias:

Engenharia Metablica dirigida:

A deleco do Mig1 nas estirpes industriais foi efectivo para a utilizao de
sacarose mas no teve o mesmo resultado para a utilizao da maltose e da
galactose.
Mutantes com um menor fluxo glicoltico no tinham represso catablica por
parte da glucose mutantes no transportador Hxk2

Engenharia Metablica Inversa

Um mutante foi isolado de uma estirpe industrial,
pela seleco de mutantes capazes de usar
maltose na presena de altas concentraes de
anlogos de glucose que no podem ser
metabolizados, apenas fosforilados (2-DOG-P)
No h diminuio no fluxo glicoltico ou
capacidade de transporte de glucose
Desrepresso da utilizao de outras
fontes de carbono, incluindo maltose
A sua caracterizao gentica est em
andamento (transcriptmica)

Melhoramento da utilizao da galactose requer a deleco do gene MIG1 e a

deleco adicional de GAL80 que um repressor especfico dos genes GAL, na
ausncia de galactose.
Sobre-expresso da fosfoglutamase (GAL5, identificado pela engenharia
metablica inversa) melhora em grande escala a taxa de utilizao da galactose.

Ampliar a gama de utilizao de vrios substratos relevante tanto para a produo de

biomassa de levedura como para a produo de bioetanol.
Eliminar o efeito Crabtree para a produo de biomassa suficiente, sem a necessidade de
fermentaes fed-batch (particularmente importante para a produo de protenas
heterlogas; foi alcanado num mutante expressando um transportador quimrico).

Levedura de Padeiro
Aspectos importantes para o melhoramento:

Saccharomyces cerevisaie no tem capacidade de metabolizar o amido, porque no

possuir amilases So amilases presentes no processamento do cereal que levam
degradao do amido em maltose+glucose
Tolerncia ao stress osmtico resistncia secagem e ao congelamento
Deleco do canal de transporte do glicerol FPS1 (aumenta 80% da tolerncia ao
congelamento)

Expresso heterloga de protenas anti-congelamento

Manipulao da composio lipdica da membrana plasmtica

Todas as questes relacionadas com a propagao so muito importantes ( a levedura

mais amplamente distribuda)
Factores relacionados com a qualidade da massa, fermentao e sabor do po.
Utilizao da Maltose (desrepresso)
Produo de compostos que do o aroma ainda no foram identificados os
compostos que do o sabor ao po

NOTA: No po de forma adicionado cido propinico para preservar o po

Levedura do Vinho

Caractersticas do mosto da uva:

Elevadas concentraes de glucose e frutose, normalmente, em quantidades semelhantes

Baixas concentraes de fontes de azoto

1. Fermentao Alcolica

No inicio at ao 3 dia h uma gama variada de leveduras fermentativas a partir dai o

teor elevado de alcool faz com que apenas a sacaromyces c. consiga sobreviver. Ao fim
de 15 dias a fermentao entra na fase stuck e ao fim de um ms deixa de acontecer.

No

Stucke
Complete

Melhoramento da fermentao alcolica (1 fermentao):

Extraco dos aromas das uvas - compostos aromticos ligados aos acares e podem
ser libertados por -glucosidases
Melhorar a tolerncia ao etanol -inibio do crescimento a partir de 5% de etanol
pode ser parcialmente obtido pela expresso de genes que melhoram a tolerncia ao
stress
Reduo da concentrao de etanol til em regies quentes, onde a concentrao de
aucares na uva mais elevada
Soluo possvel:
Aumentar a produo de glicerol (desvio do fluxo de carbono do etanol para a
produo de glicerol) torna o vinho mais denso

Co-inocular estirpes que no produzam etanol, eventualmente, de diferentes espcies

Diminuir a concentrao de compostos prejudiciais sade

Carbamato de etilo derivado do metabolismo da arginina, formado na reaco
entre a ureia e o etanol difcil de resolver sem afetar a assimilao de
arginina, que uma importante fonte de azoto no mosto do vinho
Aminas biognicas podem ser produzidas por bactrias durante a fermentao
do vinho
Controlar a acidez voltil (devido ao cido actico) diminuir a sntese de acetato e
aumentar a concentrao de glicerol, succinato, butanediol e etanol

A concentrao de cido actico no vinho normalmente de 0,5g/L e no deve

exceder os 0,8g/L
NOTA: Acidez no voltil devido ao cido mlico
Melhorar o metabolismo da frutose : prevenir paragens na fermentao fermentaes
amuadas
Durante a fermentao o consumo de frutose mais lento do que o de glucose pois os
transportadores de hexoses tem maior afinidade para a glucose do que para a frutose, que
tende a acumular-se (a acumulao pode ser causada pela baixa temperatura, desequilbrio
entre concentraes glucose / frutose no suco de uva ou diminuio de azoto, entre outros
factores) O objetivo seria produzir uma estirpe que seja capaz de facilmente reiniciar as
fermentaes ou re-inoculao de outras leveduras, neste caso, frutolticas
Possveis solues para melhorar o metabolismo da frutose:
Melhorar o transporte de frutose atravs da expresso de um transportador de frutose
especfico na Saccharomyces
Fsy1 (Gonalves et al, 2000)
Ffz1 (Pina et al 2004)
Variante allica Hxt3 com melhor transporte de frutose (Guillaume et al 2007)

2. Fermentao Malolctica
O teor em cido mlico frequentemente muito elevados no mosto este d um sabor cido
rigoroso ao vinho deve ser convertido por bactrias lcticas em cido lctico que tem um
sabor mais suave
Este considerado um passo essencial para a produo de vinho
SO2 (sulfito) adicionado no incio da fermentao para inibir o crescimento de bactrias
indesejveis e evitar a oxidao No entanto, pode inibir o crescimento de bactrias
lcticas e por isso seria importante que a levedura fosse capaz de realizar a fermentao
malolctica em si.
Melhoramento da fermentao malolctica:
Levedura transgnica: Expresso de um sistema de transporte activo de malato de
Schizosaccharomyces pombe e uma enzima malolctica de Oenococcus oenii na
levedura (Status GRAS Generally Regarded As Safe nos EUA- primeira estirpe
geneticamente melhorada a ser aprovada para utilizao na produo de vinho)

3. Melhoramento da Filtrao e Clarificao

A degradao de -glucana, pectina e xilana necessria para aumentar o rendimento do

suco, extraco de aroma e clarificao (evitar entupimento dos filtros, turbidez e
viscosidade)
Glucanases, pectinases e xilanases podem ser adicionadas ao mosto, mas estas enzimas
so caras
Desenvolver estirpes de vinho que segregam estas enzimas heterlogas (de fungos ou
bactrias)

4. Floculao

A floculao um processo de agregao reversvel das leveduras par a formao de flocos

quando as lectinas das paredes celulares se ligam aos resduos de acares das paredes
celulares das leveduras vizinhas. Deste modo, permitisa uma fcil e eficiente remoo das
leveduras, aps sedimentao. Contudo nem todas as estirpes possuem um comportamento
de floculao adequado. Uma floculao adequada importante para a remoo da levedura
do frasco aps a segunda fermentao de vinhos espumantes quando o mtodo tradicional
"Champagne"

usado.
FLO1 gene foi transferido para uma estirpe de vinho, mas o momento da floculao, que um
ponto fulcral porque ocorre num momento especfico associado fase estacionria, ainda
difcil de controlar (o promotor HSP30 pode ser uma soluo)

5. Autlise
Durante a maturao dos vinhos espumantes, a autlise das clulas de levedura promove
importantes propriedades para o vinho. Este processo pode ser acelerado pelo melhoramento
das propriedades de autlise da levedura usada na segunda fermentao (est a ser
experimentada a supresso da subunidade reguladora da PKA).

Levedura da Cerveja
Processo da cerveja
1 Maltagem:
Preparao do cereal germinao controlada da semente da cevada (a germinao
parada pela fonte de calor); secagem
Activao de enzimas no interior da semente para a degradao de compostos, levando
produo de acares simples (principalmente maltose e maltotriose)

2 Empastagem cevada maltada (germinada em gua) + outros cereais (centeio de milho,

trigo, cevada no maltada, arroz)
- So libertados os nutrientes das sementes, principalmente a maltose e a maltriose
- A mistura resultante o substrato da fermentao
3 Pasteurizao
Diminuio da carga microbiana e inactivao das enzimas termolbeis
- As dextrinas no so fermentadas e do corpo cerveja (no so doces) e por isso no so
desejveis e a inactivao das enzimas permite evitar a sua existncia
Substrato para a fermentao: Produto resultante da empastagem + Lpulo
(adicionado, antes ou depois da pasteurizao, para a preservao e sabor ajuda na
preservao do mosto, evitando a deteriorao e confere diferentes aromas)

Fermentao Alta Cerveja Ale no final a levedura fica em suspenso 15-24C

Fermentao baixa Cerveja Laga no final a levedura fica no fundo (floculao) ~8C
Freshly prepared cells (late exponential phase in wort not logarithmical!) are used to
inoculate.

As leveduras da cerveja laga so S. pastorianus (hbridos entre S. bayanus e S.

cerevisiae), tipicamente alopoliplide (ser poliplide com cromossomas provenientes de
espcies diferentes, e resultante de uma duplicao cromossmica) e, portanto, no
muito receptivo gentica manipulao.
As leveduras da cerveja Ale pertencem espcie S. cerevisiae.

Principais pontos de melhoramento das estirpes para a produo de cerveja:

Gerais:
Floculao, reduo do etanol, expresso da glucanase para a degradao
polissacridos

de

Especficos:
Melhoramento do metabolismo da maltose e maltotriose
Melhoramento do transporte de maltotriose pela expresso de transportadores
especficos para o seu melhor aproveitamento
Assimilao de dextrinas (para produzir uma cerveja de baixo teor calrico)
Enzimas para a assimilao dos acares e das dextrinas tentar remover do
produto final
Por exemplo as amilases dotar a levedura para a produo destas enzimas
Diminuir a formao de diacetil para acelerar a maturao (tempo normal de 2-3 semanas).
Diacetil um produto secundrio do metabolismo da valina, que d um sabor
amanteigado cerveja
Diacetil atravessa facilmente a membrana e por isso pode estar presente no final
tem de ser eliminado
Durante a maturao (fermentao lagering ou secundria), o diacetil convertido em
acetona e depois para 2,3-butanodiol No entanto uma reaco que leva muito
tempo Desvantagem para a indstria

-acetolactato acetoina (sem

passar por diacetil)
A
sobre-expresso
de
uma
descarboxilase acetolctica bacteriana
(ALDC) diminui a sntese de diacetil
extracelular,
no
entanto,
estirpes
transformadas so auxotrficas em
relao valina, leucina e isoleucina.
Soluo: enzima foi adicionada uma
sequncia peptdica sinal para levar ao
seu transporte para o exterior da
levedura onde ir apenas processar o -acetolactato extracelular e no o intracelular
continua, desta forma, a existir a sntese de valina no interior da levedura
NOTA: Esta estirpe transgnica no aceite para a produo de cerveja

Optimizao da formao do sulfito

um intermedirio do metabolismo da metionina e da cistena (possuem enxofre)
Quantidades moderadas de sulfito na cerveja so importantes para a estabilizao do
sabor e o sulfito actua como um anti-oxidante

O sulfito sintetizado a partir do sulfato

presente no mosto
O sulfito importado para o interior da levedura
atravs das permeases SUL 1 e 2
Parte do sulfito transportado para o meio
extracelular mas necessria uma maior
concentrao extracelular:
Sobre-expresso do gene MET14 e
gene no funcional met5
Preveno da reduo do sulfito
atravs da deleco do gene MET10
MET2 aumentava as quantidades
de
sulfito
mas
havia
maior
concentrao de sulfureto, por isso foi
abandonada

A permease SUL2 o transportador mais eficiente para a existncia de sulfito

extracelular seleco da mutao do gene que produz a SUL1 truncada (inactiva)

Produo de bio-etanol

O esgotamento dos combustveis fsseis e as questes ambientais tm conduzido

utilizao do etanol como combustvel para transporte em todo o mundo.
Bio-etanol (1 gerao) tem uma contribuio significativa para combustveis destinados
ao
transporte
no Brasil (a partir da cana do acar) e nos EUA (cereais) competio da produo de
alimentos VS produo de bio-etanol

A 2 gerao do bioetanol ser produzido a partir de resduos florestais e agrcolas

(desperdcios), o que implica a utilizao da celulose e hemicelulose como fontes de
carbono.
A celulose um polmero linear de glucose
A hemicelulose um polmero de composio diversa - hexoses (glucose, manose e
galactose) e pentoses (xilose e arabinose).

1. Pr-tratamento do material:
- Calor
- Enzimtico (muito caro)
- Qumico (cidos)
NOTA: Tratamento qumico com calor muito agressivo produo de compostos inibidores
da fermentao
2. SHF Separate Hydrolysis and Fermentation Condies ptimas para as duas
reaces
ou SSF Simultaneous Hydrolysis and Fermentation Levedura e enzimas a
funcionarem ao mesmo tempo (diminui o problema da represso catablica os acares
so sintetizados e consumidos logo
3. Destilao gasto de muita energia
Problema!! ---> Rendimento final da produo do bio-etanol
O microrganismo ideal para a produo de etanol deveria:
Ser capaz de converter todas as fontes de carbono disponveis em etanol com grande
produtividade
Ser resistente a subprodutos txicos do pr-tratamento da biomassa.

Bactrias e fungos
utilizam diferentes
vias para obter Dxilulose 5P

Alvos para o melhoramento de estirpes que sejam capazes de fermentar

hidrolisados de hemi-celuloses:
(obtido por expresso heterloga das enzimas XR e XDH de Pichia stipitis)
1) Enfrentar o desequilbrio redox devido utilizao de diferentes co-factores das duas
primeiras enzimas do metabolismo da xilose (XR e XDH) Na reaco normal no existiria a
regenerao dos co-factores

2) Melhorar o transporte da xilose(GXF1)

As protenas transporatdoras Hxt transportam xilose com muito pouca afinidade
(Km>100mM)
Um facilitador glucose/xilose da levedura Candida intermdia, que assimila xilose, foi
clonado por complementao funcional de uma Saccharomyces cerevisiae mutante
desprovida de protenas Hxt.

A expresso de GXF1 melhorou consideravelmente o desempenho de S. cerevisiae em

concentraes de xilose baixas.

Principais desafios futuros:

Elucidar melhor os prs e contras das vias utilizando XI ou XR / XDH
- XI tem maior rendimento de etanol
- XR / XDH tem maior produtividade

Combinar o metabolismo da xilose e da arabinose na mesma estirpe

Seleco de estirpes e substratos industriais em biotecnologia

microbiana
Seleco de estirpes industriais:
Pesquisa bibliogrfica
Isolamentos a partir de substratos naturais ou de ambientes antrpicos originalidade
Recurso a coleces de culturas microrganismos j identificados pelas instituies
Rastreio de actividades
Ambientes Antrpicos
(onde existe a interveno humana actividade microbiana relacionada com o impacto
humano)
VS
Ambientes Naturais
Tipos de isolamentos Depende do produto/actividade pretendido
Aleatrio: obteno de elevado n estirpes a partir de amostras variadas e rastreio
posterior de propriedades desejadas
Selectivo: isolamento usando condies selectivas para grupo de microrganismo ou
para actividade desejada, ou partindo de amostras c/ caractersticas particulares

Exemplos: Isolamento selectivo do ambiente escolhe-se o ambiente onde se

pretende escolher os microrganismos
Procura de enzimas degradativas o substrato da enzima tem de estar presente
no meio de cultura e escolha dos parmetros fisiolgicos adequados sua aco
Factores de selectividade (enriquecimento) Isolamentos selectivos:
Desenho meio de cultura (nutrientes, suplementos)
Manipulao de parmetros fisiolgicos (pH, temperatura)
Mtodos de cultura (contnua, descontnua, semi-contnua)
Exemplos de substratos industriais:
Matrias primas tradicionais
Matrias primas renovveis/alternativas
Rastreio de actividade desejada:
1. Rastreio primrio: caracterizao qualitativa e seleco de isolados quanto
actividade desejada (triagem)
2. Rastreio secundrio: caracterizao qualitativa e quantitativa de estirpe
seleccionadas
Caracterizao da estirpe seleccionada:
produo de actividade/metabolito com elevado rendimento;
bom crescimento em meio laboratorial e em substratos industriais;
estabilidade fenotpica/gentica;
possibilidade de manipulao gentica (melhoramento);
segurana biolgica (patogenicidade, produo de substncias txicas)
facilidade de recolha de clulas e/ou produto

Isolamento e Rastreio
Isolamento:
Equipa de microbilogos c/ conhecimentos de
ecologia e sistemtica;
Dispor de tcnicas de identificao e tcnicas
analticas
simples
(deteco
de
actividade/produtos): colorimetria resultados
fceis de detectar
Seleco

Rastreio:
Equipa multidisciplinar (microb., bioquim., quim.
analticos, farmacol., etc.)
Dispor de tcnicas analticas + sofisticadas
da actividade/ident. prod.): espectroscopia,
cromatografia

(quantificao

Rastreios dirigidos (rational/targeted screening): com base no mecanismo de aco dos

agentes teraputicos procurados (empresas farmacuticas ou start-ups de biotecnologia)

Coleces de Culturas Preservao, fornecimento e depsito de culturas microbianas

(ou linhagens celulares)
Especializao em tipos de clulas microbianas (ou vegetais, animais)
Caracterizao taxonmica, bioqumica, fisiolgica base de dados
Sites na Internet e catlogos online exemplos:
American Type Culture Collection (ATCC): http://www.lgcstandards-atcc.org/
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ):
http://www.dsmz.de/
Japan Collection of Microorganisms (JCM): http://www.jcm.riken.go.jp/
entre outros
Algumas coleces disponibilizam pesquisas de caractersticas online e/ou
fornecem servios rastreio

Meios de cultura constituintes:

gua (purificao e/ou esterilizao)
Nutrientes principais:
Fontes de C, N, P, (biossntese)
Fonte de energia para microrganismos quimiotrficos
Aminocidos (para auxotrofismos)
Outros componentes:
factores de crescimento (p.ex. vitaminas, hormonas);
precursores metablicos;
tampes
anti-espumaos fermentadores industriais tm uma agitao forte e h
formao de espumas que resultam de componentes das membranas celulares
sulfatos)
Substratos industriais (fermentadores):
maioria processos usa microrganismos OQH: fonte de C = fonte de E
baseados em matrias primas baratas/acessveis*
composio complexa; subprodutos industriais, agrcolas, etc.
*Ingredientes dos meios de cultura podem representar 60-80% custos do processo

Meios de cultura diferentes ingredientes nos meios laboratoriais e industriais devido

aos custos monetrios associados ao processo

Substratos para fermentaes industriais

Substratos industriais critrios de seleco:
Volume do fermentador/valor comercial do produto:
Fermentador de laboratrio ou piloto/produto de grande preo e pequeno
valor meios composio definida;
Fermentador Industrial/produto de baixo preo e grande valor substratos
complexos
Custo/acessibilidade (espacial/temporal)
Facilidade de transporte, armazenamento e esterilizao
Composio constante (reprodutibilidade)
Caractersticas fisico-quimicas, reolgicas, etc. (agitao, arejamento, )
Concentrao de nutrientes limitantes; rendimento metabolito
Presena de impurezas, inibidores crescimento...
Facilidade de purificao do metabolito; efluentes (downstream proc.)
Segurana
Composio:
1. Fontes de C (e E): hidratos carbono (acares/polissacridos); lcoois, hidrocarbonetos,
lpidos
Melaos (cana/beterraba): subproduto da refinao de acar
50-60% acares (sacarose), 2% compostos azotados (vitaminas/sais)
Extracto Malte (cevada): subproduto da indstria cervejeira
55% dissacridos (maltose), 20% hexoses (glucose);
10% maltotriose, 15% dextrinas, 5% compostos azotados (vitaminas/sais)
Amidos (milho, batata) amilose + amilopectina
- usado directamente (MOs amilolticos possuem amilases que hidrolisam ligaes -1,4)
- ou aps hidrlise Sacarificao transformao de um polmero nos seus monmeros
(glucose, maltose, maltotriose)
- hidrlise cida ou hidrlise enzimtica
Celulose (vegetal) glucose + celobiose
- usado directamente (MOs celulolticos - possuem celulases que hidrolisam ligaes - 1,4)
- ou aps hidrlise hidrlise cida ou hidrlise enzimtica

 Lenhocelulose (vegetal) mistura de pentoses e hexoses

- geralmente necessita hidrlise hidrlise cida ou hidrlise enzimtica
Soro de leite: subproduto da indstria de lacticnios
- Lactose, cido lctico (+ protenas)
Outras: hidrocarbonetos (subproduto da indstria petrolfera); lpidos (animal/vegetal)
2. Fontes de N: sais de amnio, amnia, nitrato; aminocidos, protenas (ou hidrolisados
proteicos), ureia
gua de macerao de milho: subproduto da produo de amido
concentrao N (aminocidos) 4%(p/v); vitaminas e sais; aucares + cido lctico
Extracto de Levedura: subproduto da indstria cervejeira ou panificao
>70% Polipptidos+aminocidos, vitaminas, hidratos de carbono
Peptonas: hidrolisados proteicos hidrlise cida ou hidrlise enzimtica
- Origem animal: leite, carne; Origem vegetal: soja
- Deficiente em certos aminocidos e de custo elevado
Farinha de soja: subproduto da indstria de leos e derivados de soja
ca.50% protena; hidratos de carbono
Farinha de peixe: subproduto da indstria da conserva de peixe
- elevado teor em protena; gorduras, vitaminas e sais
- custo elevado
3. Outros componentes dos meios de cultura:
gua: grandes quantidades necessidade de tratamentos (filtrao, desmineralizao
e esterilizao) e reciclagem
Fontes P, S, Ca, Mg, K..: sais
Outros minerais (oligoelementos): gua, impurezas de outros ingredientes ou sais
Vitaminas e outros factores de crescimento: extracto de levedura ou outros
componentes de origem biolgica
Precursores e/ou indutores de metabolitos ou actividades enzimticas
Inibidores de subprodutos metablicos indesejados
Anti-espuma: leos naturais ou sintticos (silicone); poliis
Tampes (ou adio de cido e/ou base): controlo do pH

Evoluo da biotecnologia microbiana

At sc. XIX: Utilizao emprica dos microrganismos (alimentos)

2 metade sc. XIX: Melhoramento dos processos biotecnolgicos tradicionais
(fermentaes microbianas, pasteurizaes, culturas puras, etc.)
Sc. XX (at 2GG): Produo industrial de solventes e outros produtos quimcos, enzimas
Sc. XX (aps 2GG): Biotecnologia industrial produo de antibiticos (condies de
asspsia, maior controlo, uniformizao do produto)
Final sc. XX: Tecnologia do DNA recombinante, eng gentica (renovao e inovao da
biotecnologia industrial)
Sc. XXI: novos agentes teraputicos (biofrmacos - maior desenvolvimento);
alimentos/suplementos; bioplsticos; biocombustveis/bio-energia; biorremediao

SUSTENTABILIDADE! Melhorar a eficincia energtica

Minorar o impacto ambiental
Reduzir dependncia dos combusveis fsseis

Metabolito primrio: produzido durante a fase exponencial do crescimento (trofofase)

Produtos de metabolismo energtico
Intermedirios do metabolismo energtico ou biossinttico
Exemplos: lcoois, aminocidos, cidos orgnicos, vitaminas, certas enzimas

Metabolito secundrio: produzido aps o crescimento- incio da fase estacionria

(idiofase)
No essencial para o crescimento do microrganismo produtor
Exemplos: antibiticos, alcalides, bioinsecticidas, factores de crescimento, toxinas
Funes: inibio do crescimento de outros microrganismos; ionforos; regulao da
diferenciao, comunicao com as outras clulas;

METABOLITOS PRIMRIOS
AMINOCIDOS (A):
Condimentos (glutamato de Na) ou suplementos (lisina, )
Mutantes sobreprodutores (desregulao das vias biossintticas sujeitas a inibio
retroactiva): Corynebacterium, Brevibacterium spp. (G+); estirpes E. coli modificadas
geneticamente
Fermentao de melaos; produz apenas enantimeros L (concentrao at >100 g/L)
Aspartame (Aspartato): L-Phe+L-Asp; fermentao+sntesequmica usado como
adoante
NUCLETIDOS (A):
cido guanlico (5-GMP) e inosnico (5-IMP): condimentos (sais de Na); Bacillus,
Brevibacterium spp. (G+)
VITAMINAS (A,F):
Vitamina B12: Propionibacterium (G+), Pseudomonas (G-); sntese exclusiva por
bactrias (adio Co)
Riboflavina (B2): Eremothecium (fungo)
Biotina: fermentao (prod.ribose)+sintese quimca ou apenas fermentao.
Vitamina C (cido ascrbico): sintese quimca e/ou fermentao
ETANOL (Q,C):
Levedura Ascomiceta (S.cerevisaie) a partir de cana-de-acar, milho, resduos
vegetais, etc.
CIDOS ORGNICOS (A,F):
cido Ctrico: Asperg. niger (fungo) a partir de melaos ou amido hidrolisado (Fe/Mn
limit.; pH_)
cido Lctico: bactrias Lcticas, Rhizopus (fungo)
cido Glucnico: Aspergillus niger
POLISSACRIDOS (A,F):
Xantano por Xanthomonas (G-) baixar a viscosidade do sangue
Dextrano por bact. Lcticas (G+)
BIO-CORANTES (A):
-caroteno por Blakeslea (fungo) anti-oxidante
Astaxantina por Phaffia (leved.basid.)

BIOPLSTICOS (BIODEGRADVEIS) polmeros naturais destrudos em

compostagem
poli-hidroxialcanoatos (PHB, Bacillus spp.; E. coli recombinante);
poli-cido lctico PLA (fermentao+sntese quimica); substrato glucose (milho)

Produo de enzimas:
Enzimas extracelulares (exoenzimas); bactrias manipuladas geneticamente
Exemplos: Amilases (-amilase, glucoamilase) bacterianas ou fngicas
Elevada especificidade cataltica til em bioconverses Exemplo: sntese de Laminocidos
Enzimas de bactrias extremfilas (extremozimas) permanecem funcionais em
condies adversas (meios cidos/alcalinos, elevada/baixa temperatura, elevada
salinidade)
Indstria de Detergentes (e Indstria Txtil): amilases, proteases, lipases,
celulases, de Bacillus spp. (condies ptimas pH 9-10)
Taq polimerase: DNA polimerase termostvel (95C) de Thermus aquaticus
(eubactria) usada no PCR
Invertase: hidrolisa a sacarose (produo de xaropes); produzida por leveduras
Glucose isomerase: xaropes de frutose para refrigerantes (a partir de amido de
milho, trigo, batata); produzida por Bacillus, Streptomyces a frutose mais doce e
mais interessante do ponto de vista diettico
Imobilizao de enzimas solveis permite processar grandes
volumes em cultura contnua

Metabolitos secundrios de origem fngica (F, ):

Antibiticos: penicilinas, cefalosporinas (Penicillium, Acremonium)

Hormonas de crescimento: giberelina (Gibberella sp.)
Alcalides: Claviceps purpurea
Imunossupressores: ciclosporina (Trichoderma sp.)
Hipocolestermicos: lovastatina (Aspergillus sp.)
Antitumorais: taxol (fungos endfitos)

Metabolitos secundrios e enzimas de origem bacteriana (F, ):

Antibacterianos: estreptomicina, tetraciclina, vancomicina, etc. (Streptomyces spp.);
bacitracina, polimixina (Bacillus spp.) (G+)
Antifngicos: nistatina, anfotericina B (Streptomyces spp.)
Antiparasitas: avermectina (anti-helmntico; Streptomyces spp.)
Bioinsecticidas: Bacillus spp. (ex. B. thuringiensis; plantas transgnicas)
Proteases e amilases (indstria de detergentes, alimentos, papel, farmcia): Bacillus
spp. (Gram+)
DNA polimerases termostveis: Thermus spp.
Protenas heterlogas (indstria farmacutica.): E. coli (estirpes modificadas
geneticamente)

Biocombustveis
Combustveis lquidos ou gasosos produzidos a partir
de biomassa (geralmente de origem vegetal)
Vantagens:
Substituio de combustveis fsseis
Sustentabilidade (fonte de energia renovvel,
menor gerao de GEEs)
Biodegradabilidade
Segurana energtica
Primeira gerao:
bio-etanol (S. cerev.) a partir de substratos de
origem vegetal (melaos, milho) Brasil e
EUA
biodiesel de origem vegetal (oleaginosas)
Europa
Segunda gerao:
bio-combustvel microbiano por fermentao de substratos vegetais (no-alimentares)
bio-hidrognio
biodiesel a partir de algas (a partir dos lpidos e necessita de reactores especficos)
biogs
Desafios:
custo (economia & ecologia) das matrias primas
neutralidade relativamente ao C
no-competio com alimentos
rendimento: custo da purificao/refinao
Bio-combustvel Conceito de Biorefinaria: matrias-primas renovveis: biomassa;
purificao de combustvel a partir de produtos de fermentao (p.ex. destilao do etanol
produz. por ferm. alcolica, etc.); sntese outros produtos qumicos; analogia c/ refinarias
de petrleo

Antibiticos Droga anti-microbiana

Antibitico: composto qumico produzido por um microrganismo que mata ou inibe o

crescimento de outro microrganismo
Droga anti-microbiana: composto qumico que mata ou inibe o crescimento de outro
organismo mas no necessariamente produzido por microrganismo
O antibitico sempre uma droga anti-microbiana mas este ltimo no
necessariamente um antibitico
1% da totalidade dos antibiticos conhecidos comercializado Problema da
no-comercializao da maior parte dos antibiticos: so inactivos ou txicos para os
seres vivos ou meio ambiente

1908 Ehrichs magic bullets combate sfilis agente anti-microbiano

1928 Fleming e a produo de penicilina (por acaso) Penicillium chrysogenum antibitico
contra bactrias Gram +
1943 - Dr. Waskman e estreptomicina (Streptomyces griseus) combate tuberculose antibitico contra bactrias Gram + e Gram

Quimioterapia O uso de drogas para tratamento de doenas

Toxicidade selectiva Uma droga que mata micrbios prejudiciais sem afectar o
hospedeiro

Os microrganismos que produzem os antibiticos so resistentes ao antibitico que eles

prprios produzem
No existem antibiticos/drogas que sejam efectivas para todos os micrbios
Os antibiticos de largo espectro no so comuns

Mecanismo de aco dos antibiticos

Devem ser dirigidos para uma funo ou estrutura celular que essencial para a
sobrevivncia e/ou crescimento do micrbio
O alvo tem de ser especfico para os micrbios e no afectar as clulas do hospedeiro
Razo pela qual existem mais anti-bacterianos, visto serem seres procariontes

As bactrias tm as suas prprias enzimas para:

Formao da parede celular
Sntese proteica
Replicao do DNA
Sntese do RNA
Sntese dos metabolitos essenciais
Os vrus usam as enzimas das clulas hospedeiras
Os fungos e os protozorios so eucariontes e tm as suas prprias enzimas

Quando mais similares forem as clulas dos micrbios e as clulas hospedeiras,

mais difcil ser a descoberta de um agente anti-microbiano especfico e casos
esses existam, maiores sero os efeitos adversos da aco dos antibiticos!!

Antibiticos anti-bacterianos: Inibidores da Sntese da Parede Celular

No tem membrana externa

 Tem
mais
camadas
de
peptidoglicano ~1000camadas
cidos lipoteicicos
Muito sensivos a detergentes e
outros agentes hidrofbicos
No tem periplasma
Muitas protenas esto ancoradas
na
membrana
externa
da
membrana plasmtica
____________________________________________________________________________________
Duas membranas que afectam a
permeabilidade
Membrana
interna

permeabilidade para pequenas

molculas
Membrana externa exclui todas
as
molculas
hidrofbicas
e
polares com tamanho superior a
1kDa
Porinas
aumentam
a
permeabilidade para pequenas
molculas polares (<1kDa)
A membrana externa possui lpidos atpicos e lipoprotenas (LPS)
Camada de peptidoglicano - resistncia osmtica
Possui periplasma
Antibiticos para Gram + >>>> Antibiticos para Gram
Membrana externa das bactrias Gram impermevel aos antibiticos a menos que
possuam uma baixa massa molecular
Exemplos de inibidores da sntese da parede
celular:

1. Penicilina

Mais de 50 compostos
Partilham 4 anis -lactmicos
Os vrios tipos de penicilina diferem entre si
de acordo com as cadeias laterais
Susceptveis penicillinase ou -lactamase
inactivao
Algumas penicilinas tm um espectro de aco mais alargado, mas so, geralmente, de
espectro estreito

1.1. Penicilinas semi-sintticas

Resistentes penicillinase:
Carbapenema: largo espectro de aco
Monobactama: para bactrias Gram
Penicilinas de largo espectro
Penicilinas + inibidores de -lactamase
2.

Cefalosporina
4 vaga de produo melhoramento das
Contra bactrias Gram
Tambm possuem um anel em comum

propriedades

3. Antibiticos polipptidicos
3.1. Bacitracina
Aplicao tpica
Contra bactrias Gram +

3.2. Vancomicina

Glicopptido
O surgimento de resistncia vancomicina, um dos ltimos recursos para tratar
Staphylococcus multi-resistentes, redundou em estirpes de Staphyloccocus que so
resistentes a todos antibiticos em uso actualmente.

Antibiticos anti-bacterianos Inibidores da Sntese Proteica

Largo espectro
Problemas de toxicidade
Exemplos:
Cloramfenicol (medula ssea)
Aminoglicosdeos: estreptomicina, neomicina, gentamicina (orelhas e rins)
Tetraciclinas (Rickettsias e Chlamydia; tracto gastro-intestinal)
Macroldeo: eritromicina (Gram +, usado em crianas)

Antibiticos anti-bacterianos que afectam a membrana plasmtica

Polimixina B
Aplicao tpica
Contra bactrias Gram Combinado com a bacitracina e neomicina (largo espectro)

Antibiticos anti-bacterianos Inibidores da Sntese de cidos Nucleicos

Rifamicina
Inibe a sntese de RNA
Anti-tuberculose

Quinolonas e fluoroquinolonas
Exemplo: Ciprofloxacina
Inibe a DNA girase
Para infeces do tracto urinrio
Efeito citoesttico: alguns antibiticos so usados como anti-tumorais (inibem a diviso
celular a nvel da replicao nvel localizado)

Antibiticos anti-bacterianos
Inibidores da sntese de
metabolitos
Sulfonamida (Sulfas)

Inibe a sntese de cido flico

Largo espectro
Inibidor competitivo
As sulfonamidas so inibidoras competitivas da enzima bacteriana sintetase de
dihidroperoato (so anlogos do seu substracto o cido para-aminobenzico (PABA)). A
enzima catalisa uma reaco necessria sntese de cido flico (o cido flico
necessrio para a sntese de precursores de DNA e RNA) nas bactrias.

Drogas Anti-fngicas
Fungos so seres eucariontes
Na sua parede celular tm esteris nicos e caractersticos dos fungos
Fungos patognicos esto normalmente na parte externa do corpo e por isso no existe
problema de ingesto feita a aplicao atpica
Como a anfotericina B e natamicina, a nistatina inibe a sntese do ergosterol, um
componente da membrana plasmtica fngica

Drogas Anti-virais
Os vrus so compostos por cidos nucleicos, cpside proteica e membrana com protenas
virais
Os vrus vivem dentro de clulas hospedeiras e usam muitas das enzimas do hospedeiro
Alguns vrus necessitam de enzimas especficas para a sntese de DNA/RNA ou para o
corte proteoltico na formao do vrus

Medio da sensibilidade anti-microbiana

E Test
MIC: Minimal inhibitory concentration concentrao mnima necessria para a aco
anti-microbiana

Resistncia ao antibitico
No existncia ou incompleto efeito do antibitico
contra um determinado micrbio que anteriormente
era susceptvel
Necessrio aumentar a concentrao MIC

Mecanismos de Resistncia aos Antibiticos

Principal Causa: transferncia horizontal de genes
1. Destruio enzimtica da droga (ex: -lactamase)
2. Preveno da entrada da droga
3. Alterao do alvo da droga
4. Rpida ejeco da droga bombas de efluxo que no permitem alcanar a
concentrao necessria para a sua aco

Quais so os factores que promovem a

resistncia aos antibiticos?
Exposio a nveis sub-ptimos do antimicrobiano
Exposio a micrbios portadores de genes
de resistncia

Produo de Antibiticos

Manipulao gentica atravs de

mutaes aumentam a produo de
antibiticos de forma a ser
economicamente rentvel

Penicilinas:

Naturais (Penicilina G)
Semi-sintticas
(derivadas
das
penicilinas
naturais
seguida
da
reaco qumica ou enzimtica
adio de cadeias laterais)
Penicilina G 6-APA
Biossintticas
(sntese
biolgica
atravs da adio de molculas
percursoras)

Cefalosporina C 7ACA
(Produo de
cefalosporinas semisintticas)

Sistema de cultura contnua

- Feed-Batch (adio de fonte de C
e N) visto que um metabolito
secundrio e s produzido no
final da fase exponencial
- Sistema no fechado
- Assim que comea a produo de
penicilina de interesse prolongla adio de glucose