Decisiones

Deteccin

Diagnstico

Investigacin
Terapia

TECNICAS DE ESTUDIO MOLECULAR

PCR
Mg. Luis Carlos Lizrraga Vargas

Que es genotipificacion?
Genoma: es la totalidad de la informacin gentica que posee un

organismo en particular y que codifica para l.. En humanos, el genoma

consiste de 23 pares de cromosomas
Alelo: Diferentes formas o variantes de una gen
Genotipo: Conjunto particular de alelos para todos los genes portados por
un individuo

Genotipificacin

Determinacin del genotipo de una persona

PCR
REACCIN EN CADENA DE LA
POLIMERASA

Replicacin de ADN
SIMILAR

Amplificacin enzimtica de un fragmento de DNA

(simulando una replicacin natural del DNA in vitro)

Eventos en la Replicacin del DNA:

Apertura de las cadenas (origen de replicacin)

Colocacin de los iniciadores (primers de RNA)

( La cadena lder utilizar un solo iniciador mientras que las
cadenas rezagadas utilizarn varios iniciadores de RNA.)

Sntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)

Eliminacin de los iniciadores de RNA.

Unin de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA

ligasa)

Reaccin en cadena de la polimerasa

(PCR)
Componentes
Desoxinucleotidos (dNTPs) dATP, dTTP, dGTP,
dCTP

Enzima Taq (Thermus aquaticus)

Iniciadores (Primers) Complementarios a la cadena
de ADN
ADN molde Concentracion de 20ng

PCR: Ciclador trmico

Desoxinucleotidos (dNTPs)

Bases Nitrogenadas del ADN

Union por puentes de hidrogeno
Adenina-Timina
Guanina-Citocina

ADN polimerasa

Estable a altas
temperaturas
Thermus
aquaticus

Thermococcus
litoralis

Enzima de 95kd.
Actividad
Exonucleasa: 53

Actuaaltas temperaturas

PRIMERS
(Iniciadores, Cebadores)
Dos oligonucletidos que
son complementarios a
cada una de las dos hebras
del ADN.

nicos: Asegura alta especificidad:

5
3

3
5

3
CARACTERSTICAS
IMPORTANTES

nicos
Tamao
Dimeros de primers

5
La secuencia del extremo 3 es critica para el
funcionamiento

Tamao
Efectos en:
Carcter de nico
Mas tamao (15pb)
Temperaturas (Tm)
La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son
doble cadena (dc) y la mitad cadena sencilla (cs)

Par deprimers
especficos

ADN templado
Buffer p/ ADN Pol.

MgCl2

dCTP
dATP

dTTP
dGTP

dH2O
estril

PCR
Mezcla de Reaccin

Desoxinucletidos

Etapas de la PCR
1. Desnaturalizacin: Apertura de la doble cadena
2. Alineamiento: Anillaje de primers
3. Extensin: Generacin de la nueva cadena

Temperatura

25-30 ciclos
100

Desnaturacin

Desnaturacin
94 oC

Extension
72 oC

50

50-60oC
Anillaje

Tiempo

94 oC

Temperatura

100

Desnaturacin

PCR

94 oC

50

Tiempo

DNA de
cadena doble

Temperatura

100

Desnaturacin

PCR

94 oC

50

Tiempo
3

DNA de
cadena simple

Calor

Temperatura

100

Desnaturacin

94 oC

50

PCR

Desnaturacin

Annealing Extension
72 oC
Primers
50 oC

94 oC

Tiempo
3

5
5

Hibridacin
de primers

5
5

Temperatura

PCR
100

Desnaturacin

94 oC

50

Annealing Extension
oC
72
Primers
50 oC

94 oC

Tiempo
3

Calor
5

Calor
5
5

30 ciclos

Temperatura

PCR
100

Desnaturacin

94 oC

50

Annealing Extension
72 oC
Primers
50 oC

94 oC

Tiempo
3

5
5

30ciclos

Temperatura

PCR
100

50

Desnaturacin

94 oC

Annealing Extension
72 oC
Primers
50 oC

0
3

Tiempo
5

5
5

Calor
5

Calor
5

94 oC

30ciclos

Temperatura

100

50

PCR
94 oC

Desnaturacin

Annealing Extension
72 oC
Primers
50 oC

0
3

5
5

Tiempo
5

94 oC

30ciclos

Temperatura

PCR
100

Desnaturacin

94 oC

50

Annealing Extension
72 oC
Primers
50 oC

0
3

5
5

Tiempo
5

Fragmentos de
tamao definido

94 oC

30ciclos

El numero de copias del DNA delimitado por los primers

se duplica en cada ciclo de PCR.
Numero de copias
1
2
4

0
1
# ciclos

16

32

64

PCR animation

Eectroforesis de productos de PCR

Electroforesis
Revelado
Separacin de molculas en un campo elctrico
Electrodo (+)

Cmara de electroforesis
Camas para preparacin del gel
de agarosa
Fuente de poder

Electrodo (-)

Agarosa y su preparacin
Gel acta como filtro molecular, controlando la migracin en
funcin del peso molecular

Agarosa

Mezclar agarosa con una solucin

tampn como el TAE (tris-ac.
Acetico-EDTA)

Calentar

Tincin con Bromuro de etidio

Agente intercalante Bromuro
de Etidio
Molcula fluorescente que se
intercala entre la s bases de la
molcula de DNA
Absorcin a 330 nm
(UV)emisin en luz visible

Factores que afectan la velocidad de migracin

1. TAMAO DEL FRAGMENTO
la velocidad de migracin del fragmento es
inversamente proporcional al log del n de
pares de bases

2. CONFORMACION DE LA
MOLECULA
ADN circular

ADN Lineal

3. VOLTAJE APLICADO
La velocidad de migracin es
proporcional al voltaje aplicado

4. CONCENTRACIN
AGAROSA
Inversamente proporcional a
velocidad de corrido
2% 1.5%

1% 0.5%

Interpretacin de electroforesis
Marcador de peso molecular
1.Permite identificar tamao de fragmentos

25pb

50pb

100pb

Ejemplos de corridos de electroforesis

Con marcador de 100pb
Con marcador de 50pb
M

300pb 400pb
250pb

150pb
100pb
400pb
350pb 300pb
250pb

Bandas Inespecficas

Corrido de electroforesis con bandas

inespecficas

Bandas definidas con diferentes

pesos moleculares

Interpretacin de electroforesis
Calidad del ADN
BUENA CALIDAD DE ADN
1

CP: Control Positivo

CN: Control Negativo
1-6: Pacientes

CP CN

DIFERENTES CALIDADES DE ADN

1

CP

CN

CP: Control Positivo

CN: Control Negativo
Pozo 2 No ADN
Pozos 3 y 4 Bajas concentraciones

PCR Multiplex
Amplificacin de varias
secuencias de forma
simultanea
Diferentes set de primers
Ojo Tamao del
amplicon

APLICACIONES
Ensayos de deleciones
Amplifica exones
Ensayos forenses
Biomarcadores polimrficos
Ensayos microbiolgicos
Cepas y especies

PCR en tiempo real (RT-PCR)

La tcnica RT-PCR combina la amplificacin del DNA con la deteccin de
los productos en un solo tubo.
Tiempo Real: Deteccin de productos de PCR en la medida que se van
generando
Monitoreando la amplificacin de una secuencia especifica en tiempo
real utilizando tecnologas fluorescentes
UTILIDADES
- Genotipificacin
- Cuantificacin de carga viral
- Cuantificacin del numero de copias
de un gen
- Expresin gnica (RNA)
Retrotranscripcin

Componentes RT-PCR
Target
DNA Polimerasa

Primer

Nucletidos
Solucin Buffer
Sonda
Termociclador

Segmento de ADN que se ha seleccionado para

amplificar. Es el molde (Muestra).
Enzima capaz de copiar el ADN usado como molde
una hebra simple de ADN (produce una hebra
complementaria).
Segmentos cortos de ADN de cadena simple
especfico para un segmento de DNA. Los primers
son usados como punto inicial de la actividad de la
DNA polimerasa.
Pequeas unidades de ADN; letras del alfabeto
biolgico (A, T, C, G).
Solucin que rene las condiciones necesarias para
que la reaccin de amplificacin se de.
Segmento corto de ADN complementario al target
(marcadores fluorescentes)
Equipo que produce ciclos trmicos (Capacidad de
detectar sondas)

PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real

PCR
tradicional
Preparacin de la
Muestra

Amplificacin

Deteccin

PCR en
Tiempo Real

Preparacin de la
Muestra

Amplificacin y Deteccin

Sistemas de Deteccin
Uso de molculas fluorescentes
No-Especfico
SYBR Green I
Molecular fluorescente que se unen
a ADN
Emisin a 520nm

DESVENTAJAS

Inespecfico

Sistema de Deteccin Especfico

TaqMan
Uso de secuencia especifica
de oligonucleotidos
- Reportero 5: Emite
fluorescencia
- Quencher 3: Bloquea emisin
de fluorescencia

Actividad 5 nucleasa
Separacin reportero-quencher

Sistema de Deteccin Especfico

Molecular Beacon Probes

Secuencia de la
sonda

Stem

Quencher
Fluoroforo

Molecular Beacon Probes

Cintica de
la PCR
Exponencial: Duplicacin
exacta del producto se
acumula en cada ciclo.
Lineal: Componentes
consumidos, productos
empiezan a degradarse.
Plateau: Reaccin se

consume y no se generan
ms productos.

Fluorescencia

Plateau

Fase
logartmica

UMBRAL

CT (CP)

Nmero de ciclos

Umbral: Fluorescencia basal de las muestras debido al SYBR

Green y Sondas de Hibridacin (determinado automticamente
por el instrumento).

CT (CP): Nmero de ciclo en donde la fluorescencia supera el

umbral.

El CT depende de la concentracin inicial de ADN!

1.
2.
3.
4.
5.

10 ng = CT 18
1 ng = CT 21
100 pg = CT 25
10 pg = CT 28
Blanco

1
2

3
4
5

RT-PCR (Retro-transcripcin)
Deteccin de la expresin de un gen por presencia de mRNA

mRNA
Enzima mRNAcDNA : Retro-transcriptasa
Primers: - Hexameros al azar
- Oligo dT

cDNA

PCR

Enzima Taq polimerasa

Mtodos moleculares PCR

Ventajas

Mtodo Gold standard

Alta sensibilidad y especificidad
Se pueden utilizar sondas
Se puede utilizar en muestras no invasivas

Desventajas:
Se necesita cierta informacin de la secuencia en
estudio para poder disear los primers.

Limitaciones del tamao del fragmento a amplificar

Errores de la replicacin.
Contaminacin (se reduce considerablemente tomando
las
precauciones
necesarias
y
en
manos
experimentadas).

Conclusiones
Aunque en biologa molecular existen muchas
tcnicas para deteccin de cambios tanto a nivel
del ADN como a nivel cromosmico, el secreto esta
en seleccionar la mas adecuada dependiendo de
los requerimientos y la disponibilidad