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ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON ALLIUM CEPA L MEDIANTE LA EVALUACIN DE

LA INHIBICIN DEL CRECIMIENTO PROMEDIO DE RACES DE CEBOLLA

1.1 Principio
Cuando un bulbo de cebolla (Allium sp) se rehidrata, se produce una estimulacin del crecimiento
de las clulas, lo cual permite la elongacin de las races de la planta. Sin embargo, cuando la
hidratacin se lleva a cabo en presencia de sustancias txicas, la divisin celular de los
meristemas radiculares puede inhibirse, ya sea retardando el proceso de mitosis o destruyendo
las clulas. Este tipo de alteraciones generalmente impide el crecimiento normal de la raz y, por
tanto, su elongacin (Fiskesj, 1985, 1993, 1997).
El efecto puede determinarse en forma indirecta, mediante la comparacin de la elongacin de las
races de cebollas expuestas al txico con las de cebollas no expuestas, luego de un periodo de
72 h de prueba. La cuantificacin del efecto se realiza estableciendo el porcentaje de inhibicin del
crecimiento de las races respecto a la longitud promedio de las races del control.
1.2 Reactivos y materiales
Bulbos de Allium sp (cebolla amarilla)
Para la elaboracin de las pruebas se deben seleccionar bulbos de 1,5 cm de dimetro, secos y
sin formacin de hojas y/o raz. Pueden ser obtenidos del mercado local o adquiridos a travs de
algn proveedor.
Previo al montaje de la prueba, los bulbos deben limpiarse eliminando la epidermis seca y
removiendo, con un bistur o instrumento punzante, los restos de tejido y races del rea radicular
(figura 4.1.1). No se deben daar las races primordiales. Con el fin de eliminar los restos de
tejidos es conveniente colocar los bulbos en agua destilada por dos horas y secar.
Medio de crecimiento
El medio de crecimiento utilizado para el desarrollo del ensayo se indica en la tabla 4.1.1.
La solucin madre preparada de acuerdo con lo indicado se diluye diez veces con agua destilada,
y el pH se ajusta a siete antes de utilizar. Tambin se puede

Figura 4.1.1. Esquema grfico de los pasos a seguir en la prueba con Allium cepa. 1) limpieza y
pelado de bulbos, 2) ubicacin de bulbos en tubos para exposicin a las soluciones de ensayo, 3)
colocacin de tubos en soporte, 4) agregado de soluciones a tubos durante el ensayo, 5) medicin
de longitud de races al finalizar el tiempo de exposicin de los bulbos .

Tabla 4.1.1. Medio de crecimiento para Allium sp.

Masa de sal para disolver en un litro de agua
destilada
Reactivo
mg
Ca (NO3)24H2O
236,1
KNO3
202
MgSO47H2O
246
KH2PO4
136,1
Fe EDTA3H2O
67,6
Elementos traza
Reactivo
mg
MnSO4
0,55(*)
CuCl2
0,0645(*)
NaMnO4
0,001(*)
ZnSO4
0,0007(*)
H3BO3
0,23(*)
(*) Los componentes correspondientes a elementos traza deben ser adicionados a
partir de una solucin stock
Utilizar agua dura o agua de la llave como medio de crecimiento. En el caso de usar cualquiera de
estas opciones el control negativo y el agua utilizada para preparar las diluciones de los
compuestos qumicos o las muestras deber ser la misma.
Materiales
Tubos de ensayo de vidrio de 10 cm de largo y 1,5 cm de dimetro (o recipientes de mayor
tamao, dependiendo del tipo de bulbos a utilizar).
Gradillas o soportes para tubos bistur.
Reglilla para hacer mediciones en cm o mm.
Almacenamiento de los bulbos de cebolla
Se recomienda adquirir los bulbos en vsperas de la realizacin de pruebas o en su defecto,
almacenarlos en un lugar donde se puedan garantizar condiciones secas, y una temperatura entre
10 y 20 C. En algunas regiones, los bulbos pueden mantenerse almacenados hasta por un ao,
sin embargo, en zonas geogrficas donde la temperatura y humedad son altas, el almacenamiento
est limitado a unos pocos das.
1.3 Procedimiento de la prueba
Preparacin de diluciones
Generalmente se sugiere el empleo de una serie de cinco concentraciones, un control negativo y
uno o dos controles positivos. Para su preparacin se emplea el mtodo de dilucin en forma
secuencial aplicando un factor de 0,2 o 0,3.
Cuando se va a llevar a cabo una evaluacin presuntiva puede emplearse una serie de diluciones
logartmicas, por ejemplo: 100; 10; 1; 0,1; 0,01, etctera, lo cual permitir establecer el intervalo de
concentracin conveniente para la determinacin de la concentracin inhibitoria media (CI50).
Se recomienda igualmente utilizar agua dura para el control negativo, as como para la
preparacin de las diluciones de la muestra y la preparacin del control positivo con el txico de
referencia Cu(II).
Ensayo
Cuando se trabaja con bulbos de dimetro pequeo, las pruebas se realizan en tubos de ensayo
de 10 cm de longitud x 1,5 cm de ancho; en el caso de bulbos de mayor dimetro pueden
utilizarse tubos o recipientes de mayor volumen, dependiendo del tamao de los mismos. Es
importante destacar que la profundidad de los recipientes debe ser tal que, al trmino de la
prueba, la elongacin mxima no alcance el fondo del recipiente (Fiskesj, 1985).

En la prueba se utilizan cinco concentraciones de la muestra, un control negativo, y uno o dos

controles positivos (ver captulo 6 "Aseguramiento y control de calidad de bioensayos"), cada una
con doce rplicas. El ensayo se inicia con el llenado de los tubos con cada una de las diluciones y
controles; este llenado deber hacerse hasta el borde del tubo. A continuacin se colocan los
bulbos limpios sobre la boca del tubo, cuidando que la zona radicular quede inmersa en el lquido
(figura 4.1.1 [2]).

Figura 4.1.2. Ensayo de toxicidad con Allium cepa L.

Los tubos se colocan en una gradilla, la cual se localiza sobre una mesa que no presente
vibraciones y se mantienen a temperatura ambiente (20 C) por un periodo de 72 horas. Debe
evitarse la iluminacin directa.
Dos veces al da durante el periodo de prueba se debe restablecer el volumen perdido por
evaporacin o absorcin. Para restablecer este volumen se utiliza la muestra o dilucin
correspondiente. Se recomienda inclinar el bulbo sin sacar las races del tubo, adicionando
cuidadosamente el volumen con ayuda de una pipeta Pasteur (figura 4.1.1 [3 y 4]).
En las figuras 4.1.1 y 4.1.2, y en la tabla 4.1.2 se resumen las condiciones de prueba.
1.4 Expresin de resultados
Medicin
Al trmino del periodo de exposicin se registra la longitud promedio de las races, la cual se lleva
a cabo con ayuda de una regla comn con escala en milmetros (figura 4.1.3). La medicin se
lleva a cabo colocando la escala en el margen del tubo; se ubica el valor de longitud mnimo y
mximo donde incide la mayora de las races y el punto medio se define como el promedio. Se
efecta la estimacin en cada tubo y se obtiene el promedio matemtico de diez rplicas (los dos
valores ms extremos se descartan). Para obtener el porcentaje de efecto de inhibicin se debe
realizar la siguiente operacin:
(longitud del controllongitud de la muestra) x 100/longitud del control
Con estos valores se construye una grfica de concentracin en funcin del porcentaje de
inhibicin y se calcula la CI50 mediante cualquiera de los siguientes mtodos: Probit, promedios
mviles o Sperman & Karber (ver captulo 5 "Mtodos estadsticos para el anlisis de resultados
de toxicidad").

Figura 4.1.3. Elongacin de las races de bulbos de cebolla despus de un proceso de hidratacin.

Tabla 4.1.2. Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad con
Allium cepa L.
1 Tipo de ensayo
Esttico
2 Temperatura
20 C; ambiente
3 Calidad de luz
Fluorescente, blanco-frio
4 Iluminacin
Indirecta
5 Recipientes
Tubos de ensayo de 10 1,5 cm de dimetro
6 Nmero de rplicas
12
7 Material biolgico
Bulbos de aproximadamente 1,5 cm de dimetro
8 Condicin de los bulbos
Pelar los bulbos y la base, evitar daar el anillo radicular
9 Agua de dilucin
Agua de la Ilave O canilla O medio de crecimiento
10 Nmero de concentraciones
Cinco
11 Duracin de la prueba
72 h
12 Efecto medido
Inhibicin de crecimiento de las races
13 Control negativo
Agua de la Ilave o medio de crecimiento
14 Control positivo
Cobre(II) a partir de una solucin de CuSO4
15 Resultado final
CI50

REFERENCIAS
Fiskesj, G, 1985, The Allium Test as Standard in Environmental Monitoring, Hereditas, 102: 9912.
Fiskesj, G., 1993, "The Allium Test in Wastewater Monitoring". Env. Toxicol. Wat. Qual., 8: 291298
Fiskesj, G., 1997, "Allium Test for Screening Chemicals; Evaluation of Cytological Parameters",
in: Plants for Environmental Studies, Wancheng, W.; J. W. Gorsuch, J. S. Hughes eds., CRC
Press, Florida, pp. 308-329.