UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA

APOSTILA DE AULAS PRTICAS

DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA
CURSO: NUTRIO

FLORIANPOLIS, SC
SEMESTRE 01/2016

SUMRIO
AULA PRTICA 1: Introduo ao Laboratrio de Microbiologia e Normas de Segurana .... 3
AULA PRTICA 2: Microbiologia do ar.................................................................................. 4
AULA PRTICA 3: Meios de Cultura ...................................................................................... 7
AULA PRTICA 4: Microbiologia do ambiente .................................................................... 10
AULA PRTICA 5: Tcnicas de Semeadura .......................................................................... 12
AULA PRTICA 6: Preparaes microscpicas .................................................................... 16
AULA PRTICA 7: Esterilizao e Desinfeco ................................................................... 19
AULA PRTICA 8: Colorao de Gram: Cocos e Bacilos .................................................... 27
AULA PRTICA 9: Colorao de Gram (amostras: oral, culturais, ar) ................................. 30
AULA PRTICA 10: Microbiologia industrial (leite fermentado, iogurte, fermento biol.) ... 32
AULA PRTICA 11: Contagem em placa .............................................................................. 34
AULA PRTICA 12: Anlise bacteriolgica da gua ............................................................ 36
AULA PRTICA 13: Identificao bacteriana ....................................................................... 40

AULA PRTICA 1: Introduo ao Laboratrio de Microbiologia e Normas de

Segurana

Objetivo
Discutir sobre biossegurana em Laboratrio de Microbiologia e normas de trabalho.
1.

Deixar os materiais como bolsas, pastas, livros e cadernos na estante, na entrada do

laboratrio, e nunca sobre as bancadas de trabalho.

2.

Usar guarda-p adequado e limpo.

3.

Lavar as mos com detergente antes e depois da aula prtica. Se for portador de algum
ferimento nas mos, avisar ao professor para no participar das atividades prticas.

4.

Antes de iniciar os procedimentos, identificar os materiais que sero utilizados nas

anlises.

5.

NUNCA pipetar nada com a boca.

6.

No comer, beber ou fumar no laboratrio.

7.

Evitar colocar a mo na boca, olhos e ouvidos durante a aula.

8.

Prender cabelos longos para evitar exposio a chama do bico de Bunsen.

9.

Nunca aplicar maquiagem e cosmticos ou retirar lentes de contato no laboratrio.

10. Avisar o professor em caso de contaminao acidental, ferimentos ou cortes ocorridos

durante a aula.
11. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a
bancada.
12. Flambar as alas, agulhas e pinas antes e aps o uso.
13. Limpar a bancada aps finalizar as anlises.
14. Quando necessrio, trabalhar na zona de segurana, que compreende a rea mais prxima
possvel do bico de Bunsen.
15. Transportar e manter os tubos de cultura em uma estande adequada para evitar acidentes
e contaminaes de pessoas e ambientes.
16. Em caso de quebra ou derramamento de culturas, necessrio avisar ao professor
responsvel, cobrir toda a rea com toalhas de papel e derramar sobre elas o lquido
desinfetante disponvel no laboratrio. Aps 15 minutos, remover as tolhas e descart-las
corretamente.
17. Manter ateno constante nas aes executadas, evitando movimentao e conversas
desnecessrias que possam causar distraes e provocar acidentes.

AULA PRTICA 2: Microbiologia do ar

Objetivo
Observar a diversidade de bactrias e fungos no ar.
Introduo
A diversidade de bactrias e fungos encontrados em diversos ambientes (gua, solo, animais,
seres humanos) possvel devido a caractersticas especiais, tais como: a) Tamanho reduzido:
grande capacidade de disperso; b) Variabilidade e flexibilidade metablica: adaptao e
tolerncia a condies ambientais adversas; c) Gentica: capacidade de transferncia
horizontal de genes, recombina caracteres positivos para persistir em longo tempo, adaptandose as condies adversas instveis.
Os micro-organismos em condies adequadas, multiplicam-se originando colnias. As
caractersticas que apresentam ao crescer em meios de cultura so expresses fenotpicas do
material gentico e portanto so teis na sua identificao.
A morfologia das colnias auxilia na classificao das bactrias. Podem ser classificadas
conforme o aspecto, pigmentao, superfcie e bordas.
1. Tamanho: mm
2. Aspecto (textura)
Bactrias e leveduras: cremosa, mucide e butirosa (brilhante e translcida).
Fungos: cotonoso, aveludado, granular e pulverulento (arenoso).
3. Formas: puntiforme, circular, filamentosa, irregular...
4. Pigmentao (cor): verso e reverso
5. Superfcie (elevao): plana, elevada, convexa, ondulada...
6 Bordas (margens): liso, ondulado, filamentoso...

Figura 1. Morfologia das colnias (Silva-Filho e Oliveira, 2007).

Procedimento
- Distribuir 2 placas de meio de cultura agar Nutriente (pH 7,4) e 2 placas de meio de cultura
agar Saboraud (pH 5,6) para cada dupla ou grupo formado.
- Identificar o fundo da placa com o nome do grupo, curso, data, nmero do laboratrio,
tempo de exposio do ar (5 ou 15 minutos) e local da coleta.
- O local da coleta deve ser diferente entre as equipes. Pode ser no interior do laboratrio ou
fora dele, como em cozinha, lanchonete, refeitrio, banheiro, corredor/escada ou outros locais
prximo ao laboratrio de origem.
- Abrir as placas e deixar a superfcie do meio de cultura exposta no ambiente pelo tempo
determinado de 5 (1 placa) ou 15 (1 placa) minutos para cada meio de cultura (simples e
saboraud).
- Aps o tempo, fechar as placas e incub-las. O meio de cultura agar simples deve ser
incubado a 37C por 24 a 48 horas, j o meio de cultura agar saboraud ser incubado a
temperatura ambiente por cerca de 1 semana (ou 25C de 5 a 7 dias).
- Aps o tempo de incubao, realizar a leitura.
Leitura
- Observar a presena de colnias na superfcie dos meios de cultura e avaliar o nmero e as
caractersticas morfolgicas das mesmas.
- Anotar o nmero de colnias obtidas em cada placa.
- Descrever as colnias quanto ao tamanho, aspecto, formas, pigmentao, superfcie
(elevao) e bordas.
- Comparar os resultados com aqueles obtidos pelos outros grupos.

AULA PRTICA 3: Meios de Cultura

Objetivo
Conhecer os diferentes meios de cultura disponveis no Laboratrio de Microbiologia para o
cultivo dos micro-organismos.
Introduo
Meios

de

Cultura:

so

substratos

adequados

ao

crescimento,

multiplicao

desenvolvimento dos micro-organismos fora de seu hbitat natural.

Servem para: crescimento bacteriano, isolamento bacteriano, estudo da morfologia das
colnias, pesquisa da patogenicidade e pesquisa das caractersticas bioqumicas.
O cultivo dos micro-organismos exige que determinadas condies sejam atendidas. As
exigncias nutritivas e ambientais so variveis com o tipo de micro-organismo, tornando
impossvel a produo de um nico tipo de meio que satisfaa todas as condies de todos os
tipos de micro-organismos. Por outro lado, difcil e impraticvel a formulao de um meio
de cultura ideal para cada tipo de micro-organismo.
No preparo de um meio de cultura necessrio conhecer as exigncias nutricionais dos
micro-organismos. So considerados componentes essenciais do meio de cultura:
- Fonte de energia (ex: glicose)
- Fonte de carbono (ex: protenas, carboidratos e lipdeos)
- Fonte de nitrognio (ex: peptonas, nitrato, amnio)
- Fatores de crescimento (ex: vitaminas)
- Fonte de minerais (ex: P, K, S, Ca, Fe, Mg, Mn, Zn)
- gua
Ainda, alm dos nutrientes, o meio de cultura deve suprir algumas condies ambientais:
- pH: cada micro-organismo exige um pH adequado para o seu crescimento.
- Atmosfera: condies para o crescimento de micro-organismos aerbios, anaerbios,
anaerbios facultativos e microaerfilos.

- Presso osmtica: regulada pelos constituintes do meio. Para organismos marinhos e

haloflicos, h necessidade da adio de uma certa quantidade de sal, de modo a obter a
concentrao adequada para o seu crescimento.
Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com a origem, composio, estado
fsico e finalidade.
1. Quanto origem:
a) Naturais: se esto prontos na natureza. Ex: leite, sangue.
b) Artificiais: aqueles que so elaborados. Ex: gar nutriente.
2. Quanto composio:
a) Complexos: no apresentam composio qumica definida. Ex: agar sangue, agar
chocolate.
b) Sintticos: tem composio qumica definida. Ex: agar nutriente, agar mueller-hinton.
3. Quanto ao estado fsico:
a) Lquido: nutrientes so dissolvidos em uma soluo aquosa.
b) Semi-slido: possuem na sua composio, alm de nutrientes, uma pequena porcentagem
de agar (0,5 a 0,75%).
c) Slido: possuem uma porcentagem maior de agar (1,5%), alm dos nutrientes.
4. Quanto finalidade:
a) Meios Bsicos: possuem os componentes essenciais para o crescimento de microorganismos pouco exigentes. Ex: agar nutriente.

b) Meios Seletivos: favorecem o desenvolvimento de determinados micro-organismos, em

detrimento de outros, pela adio de substncias inibidoras. Ex: agar SS (SalmonellaShigella).
c) Meios Diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de micro-organismos com
caractersticas relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espcie.
Ex: agar MacConkey.
d) Meios Enriquecidos: permitem o desenvolvimento de micro-organismos fastidiosos, pois
so adicionados ao meio simples substncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato
de leveduras. Ex: agar sangue.
e) Meios de Manuteno: destinados a manter a viabilidade de uma cultura. Ex: meio BHI
com glicerol.
f) Meios de Transporte: meio isento de nutrientes, que contm agentes redutores, tais como
tioglicolato ou cistena. Geralmente mantm um pH favorvel que previne a desidratao de
secrees durante o transporte e evita a oxidao enzimtica dos patgenos presentes. Ex:
meio de Stuart, meio de Cary Blair, caldo tioglicolato.

AULA PRTICA 4: Microbiologia do ambiente

Objetivo
Observar a diversidade de bactrias e fungos no ambiente e realizar a contagem de microorganismos presentes.
Introduo
Os micro-organismos desempenham papis importantes, dependendo do tipo de interao
existente com o alimento e seus nutrientes. No entanto, quando patgenos esto presentes em
unidades de alimentao, podem ser responsveis por graves enfermidades. A qualidade do
alimento est intimamente relacionado a higiene de ambientes, manipuladores e superfcies
durante seu processamento e armazenamento. J o tipo de alimento e as condies ambientais
regulam a multiplicao dos micro-organismos. As unidades de alimentao e nutrio
acabam de tornando ambientes favorveis para o aparecimento destes micro-organismos, uma
vez que possuem fatores que colaboram com o seu crescimento, tais como: gua, nutrientes,
pH, oxignio e temperatura.
A contaminao nestes locais pode ser ainda mais critica quando so encontradas bactrias do
grupo coliforme, que indica condies inadequadas de higiene de manipuladores. Neste caso,
o risco de doenas transmitidas por alimentos ainda maior.
Procedimento
- Distribuir 1 placa de meio de cultura agar nutriente para cada dupla ou equipe formada.
- Realizar a coleta dos micro-organismos em diversos ambientes: maanetas, ar condicionado,
celular, bancada, dinheiro, mos. Cada equipe ir escolher um local diferente para a coleta.
- Identificar o fundo da placa com o nome do grupo, curso, data, nmero do laboratrio e
local da coleta.
- Umedecer o swab em salina estril prximo ao bico de Bunsen e levar ao local de coleta.
- Delimitar um espao com dimenses de 10 cm x 10 cm para a coleta com o swab.
- Para a coleta das mos, o algodo deve ser friccionado em direo a cada um dos dedos a
partir do punho. Em seguida, a partir do punho, friccionar o algodo do mesmo swab entre os
dedos, retornando novamente ao punho.

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- Para a coleta de superfcies, o swab deve ser friccionado com presso, formando um ngulo
de 30, vinte vezes na forma zigue-zague, no espao delimitado. Deve-se rodar
continuamente o swab, para que toda a superfcie do algodo entre em contato com a amostra.
- Levar o swab prximo ao bico de Bunsen e transferi-lo para um tubo de ensaio contendo 10
mL de soluo salina 0,9% estril.
- Agitar o swab na soluo salina para transferir os possveis micro-organismos coletados.
- Aps, fazer somente uma diluio (10-1), retirando com auxlio de uma pipeta esterilizada, 1
mL da soluo salina e transferir para um tubo contendo 9 mL de soluo salina estril.
- Agitar este tubo e transferir 0,1 mL, utilizando uma pipeta esterilizada, para uma placa de
meio de cultura agar nutriente ou Mueller-hinton.
- Espalhar o lquido por toda a superfcie da placa de agar, com auxlio de uma ala de
drigalski, at que este seja absorvido pelo meio.
- Identificar as placas com nome do grupo, data, turma, nmero do laboratrio e local da
coleta.
- Incubar as placas a temperatura de 37C por 24 a 48 horas.
Leitura
- Proceder a contagem das colnias.
- Calcular o nmero de bactrias em Unidade Formadora de Colnia por mL (UFC/mL), da
seguinte maneira:
Nmero de bactrias (UFC/mL) = mdia do n de colnias x diluio utilizada (101) x 10*
* fator de correo.

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AULA PRTICA 5: Tcnicas de Semeadura

Objetivo
Cultivar os micro-organismos de forma eficiente, utilizando as tcnicas de semeadura.
Introduo
A escolha da tcnica varia com o tipo de meio de cultura e a finalidade de cultivo. A
inoculao dos micro-organismos pode ser realizada em meio lquido (tubo), meio slido
(tubo e placa de Petri) e meio semi-slido (tubo).
Procedimento
1. Meio lquido
- Realizar o trabalho prximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que evitem a
contaminao.
- Esterilizar a ala bacteriolgica na chama do bico de Bunsen e esfri-la prximo chama
(ou no prprio meio de cultura lquido estril).
- Retirar a tampa do tubo do meio de cultura lquido contendo micro-organismos, segurando-o
com o dedo mnimo.
- Flambar a boca do tubo e mant-la prxima ao bico de Bunsen.
- Introduzir e agitar a ala bacteriolgica neste tubo e aps fech-lo.
- Retirar a tampa do tubo com meio de cultura lquido BHI estril, segurando-o com o dedo
mnimo.
- Flambar a boca do tubo e mant-la prxima ao bico de Bunsen.
- Introduzir e agitar a ala bacteriolgica carregada de micro-organismos no meio de cultura
lquido estril.
- Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa.
- Esterilizar a ala bacteriolgica e recoloc-la no suporte.
- Identificar o tubo com o nome do grupo, curso, data, nmero do laboratrio e nome da
bactria.
- Incubar a 37 C por 24 a 48 horas.
- Aps o tempo de incubao, realizar a leitura.

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Leitura
- Observar a turbidez evidenciada no tubo com o meio lquido devido ao crescimento
bacteriano.

Figura 1. Cultivo de micro-organismos em meio de cultura lquido.

2. Meio semi-slido
- Realizar o trabalho prximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que evitem a
contaminao.
- Esterilizar a agulha bacteriolgica na chama do bico de Bunsen e esfri-la prximo chama.
- Retirar a tampa do tubo com meio de cultura lquido contendo micro-organismos,
segurando-o com o dedo mnimo.
- Flambar a boca do tubo e mant-la prxima ao bico de Bunsen.
- Introduzir e agitar a agulha neste tubo e aps fech-lo.
- Retirar a tampa do tubo com meio de cultura SIM semi-slido estril, segurando-o com o
dedo mnimo.
- Flambar a boca do tubo e mant-la prxima ao bico de Bunsen.
- Introduzir a agulha carregada de micro-organismos no meio de cultura semi-slido, fazendo
uma injeo (em linha reta).
- Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa.
- Esterilizar a agulha e recoloc-la no suporte.
- Identificar o tubo com o nome do grupo, curso, data, nmero do laboratrio e nome da
bactria.
- Incubar a 37 C por 24 a 48 horas.
- Aps o tempo de incubao, realizar a leitura.
Leitura

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- Observar a crescimento na linha de picada e verificar a mobilidade da bactria. Classificar a

bactria como mvel ou imvel.

Figura 2. Cultivo de micro-organismos em meio de cultura semi-slido.

3. Meio slido (em tubo)
- Realizar o trabalho prximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que evitem a
contaminao.
- Esterilizar a ala bacteriolgica na chama do bico de Bunsen e esfri-la prximo chama.
- Retirar a tampa do tubo com meio de cultura lquido contendo micro-organismos,
segurando-o com o dedo mnimo.
- Flambar a boca do tubo e mant-la prxima ao bico de Bunsen.
- Introduzir e agitar a ala bacteriolgica neste tubo e aps fech-lo.
- Retirar a tampa do tubo com meio de cultura nutriente slido inclinado, segurando-o com o
dedo mnimo.
- Flambar a boca do tubo e mant-la prxima ao bico de Bunsen.
- Encostar levemente a ala na parte mais baixa do plano inclinado e subir fazendo estrias na
superfcie do agar.
- Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa.
- Esterilizar a ala bacteriolgica e recoloc-la no suporte.
- Identificar o tubo com o nome do grupo, curso, data, nmero do laboratrio e nome da
bactria.
- Incubar a 37 C por 24 a 48 horas.
Leitura
- Aps o tempo de incubao, realizar a leitura.
- Observar o crescimento bacteriano nas estrias realizadas com a ala.

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Figura 3. Cultivo de micro-organismos em meio de cultura slido inclinado.

4. Meio slido (em placa)
- Realizar o trabalho prximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que evitem a
contaminao.
- Esterilizar a ala bacteriolgica na chama do bico de Bunsen e esfri-la prximo chama.
- Retirar a tampa do tubo com meio de cultura lquido contendo micro-organismos,
segurando-o com o dedo mnimo.
- Flambar a boca do tubo e mant-la prxima ao bico de Bunsen.
- Introduzir e agitar a ala bacteriolgica neste tubo e aps fech-lo.
- Retirar a tampa da placa com meio de cultura slido e inocular corretamente os microorganismos com a ala, fazendo estrias isoladas na superfcie do meio (tcnica de
esgotamento), conforme Figura 4.
- Fechar a placa.
- Esterilizar a ala bacteriolgica e recoloc-la no suporte.
- Identificar a placa com nome do grupo, curso, data, nmero do laboratrio e nome da
bactria.
- Incubar a 37 C por 24 a 48 horas.
Leitura
- Aps o tempo de incubao, realizar a leitura.
- Observar o isolamento das colnias pela tcnica de esgotamento.

Figura 4. Cultivo de micro-organismos em meio de cultura slido para isolamento de

colnias.

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AULA PRTICA 6: Preparaes microscpicas

Objetivo
Observao dos micro-organismos em microscpio ptico por meio de preparaes
microscpicas a fresco.
Introduo
Duas tcnicas em geral so empregadas em preparaes microscpicas: preparaes a fresco e
preparaes fixadas e coradas. A preparao a fresco permite o exame de micro-organismos
nas condies normais de vida e so preferencialmente utilizadas:
Quando a morfologia da clula pode estar danificada em preparaes fixadas e coradas.
Durante a verificao da mobilidade.
Observaes de processos fisiolgicos.
Observao de corpsculos (vacolos e material graxo).
Ainda, as preparaes a fresco podem ser realizadas com ou sem colorao, de acordo com as
seguintes tcnicas:
Entre lmina e lamnula: uma tcnica bastante utilizada na visualizao de diferentes tipos
de micro-organismos.
Gota Pendente: mtodo mais seguro que leva diminuio no tempo de observao e a
concluses errneas, particularmente em relao mobilidade bacteriana. A gota fica
suspensa ou pendente por tenso superficial.
Microcultivo: muito utilizado em micologia, j que permite a visualizao da morfologia
fngica no seu arranjo natural, sem a destruio das estruturas de crescimento.
Procedimento
Entre lmina e lamnula
- Flambar a ala e esfri-la prximo ao bico de Bunsen.
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- Abrir o tubo contendo a cultura lquida de leveduras, removendo a tampa com o dedo
mnimo.
- Passar rapidamente a boca do tubo no bico de Bunsen e transferir uma gotcula da cultura
lquida com a ala para o centro de uma lmina.
- Em seguida, colocar a lamnula em cima da lmina.
- Flambar novamente a ala e guard-la.
- Levar a lmina ao microscpio no aumento de 400x para a visualizao.
Gota pendente
- Untar a borda de uma lmina escavada com vaselina.
- Transferir uma gotcula da cultura lquida contendo os micro-organismos para o centro de
uma lamnula, e em seguida unir a lmina e a lamnula.
- Examinar ao microscpio ptico no aumento de 400x para observar o movimento prprio ou
direcional, alm do movimento brawniano dos micro-organismos, sem esquecer de diminuir a
intensidade de luz.

Figura 1. Lmina escavada para tcnica da gota pendente.

Microcultivo
- Receber o microcultivo pronto* contendo o crescimento fngico.
- Remover a lmina dentro da placa de microcultivo e lev-la ao microscpio.
- Observar as estruturas dos fungos crescidos (hifas e esporos) em microcultivo por meio do
microscpio em aumento de 400x.
- Observar tambm lminas prontas contendo os fungos crescidos em microcultivo.
* Preparao do microcultivo realizado anteriormente a aula prtica

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- Esterilizar placas contendo no seu interior um disco de papel-filtro, um suporte de lmina,

uma lmina e uma lamnula.
- Colocar sobre a lmina 0,1 mL do meio de cultura apropriado para o crescimento do fungo a
ser estudado (ex: PDA, Saboraud).
- Deixar o meio solidificar.
- Inocular o meio com um palito estril contendo pores (hifas e esporos) do fungo j
crescido.
- Cobrir o meio de cultura inoculado com lamnula.
- Umedecer o papel filtro do interior da placa com gua destilada esterilizada.
- Incubar a placa em temperatura de 25C a 30C, at o surgimento das estruturas a serem
observadas (de 2 a 5 dias).

Figura 2. Placa de microcultivo pronta para ser inoculada.

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AULA PRTICA 7: Esterilizao e Desinfeco

Objetivo
Avaliar a eficincia da esterilizao por calor mido (autoclave) e a ao de antisspticos
frente a micro-organismos patognicos.
Introduo
Termos utilizados para o controle microbiano:
Esterilizao: Destruio e remoo de todas as formas de vida microbiana, incluindo os
endosporos.
Esterilizao comercial: Tratamento de calor suficiente para matar endosporos de
Clostridium botulinum em alimentos enlatados.
Desinfeco: Destruio de patgenos na forma vegetativa.
Antissepsia: Destruio de patgenos na forma vegetativa em tecidos vivos.
Degerminao: Remoo de micro-organismos de uma rea limitada, como a pele ao redor
do local de aplicao de uma injeo.
Sanitizao: Tratamento que reduz as contagens microbianas nos utenslios alimentares.
Como os agentes antimicrobianos podem matar ou inibir os micro-organismos?
Podem causar alteraes na permeabilidade da membrana plasmtica: a membrana regula
a passagem de nutrientes. Danos aos lipdeos e protenas da membrana causam o
extravasamento do contedo celular e interferem no crescimento da clula.
Tambm causam danos as protenas e cidos nucleicos: os agentes antimicrobianos podem
romper as ligaes de hidrognio que unem a cadeia de aminocidos (forma a protena). Isso
causa a desnaturao da protena e perda de sua funo. Danos ao DNA e RNA podem ser
letais para a clula, pois perdem a capacidade de se replicar e realizar funes metablicas
normais como a sntese de enzimas.
1. Esterilizao
o ato ou processo de destruir ou eliminar todas as formas vivas de um material, ambiente ou
objeto. Este processo inclui os endsporos, que so formas de resistncia ao meio. Esta pode

19

ser feita atravs de diferentes processos, empregando-se agentes fsicos (calor, radiao,
filtrao, gases) e agentes qumicos. Os mtodos mais utilizados so:
1.1. Esterilizao por calor mido
1.1.1. Autoclave
- Causa desnaturao de protenas.
- Leva em considerao a presso, temperatura, umidade e tempo de exposio (Ex: 1,2 atm,
121C, 15 a 30 min).

Figura 1. Autoclave.
1.2. Esterilizao por calor seco
1.2.1. Estufa
- Mata os micro-organismos por efeito de oxidao.
- Leva em considerao a temperatura e o tempo (Ex: 170C por 2 horas).

Figura 2. Estufa de secagem.

1.3. Outros mtodos de esterilizao
1.3.1. Filtrao

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- Serve para esterilizar materiais sensveis ao calor. Ex. Filtros de membrana, uso industrial e
laboratorial. Os poros do filtro so pequenos para no passar bactrias (0,22m e 0,45m) e
at os vrus (0,01m).

Figura 3. Processo de filtrao para esterilizao de lquidos (Tortora,

Funke, Case, 2012).
1.3.2. Baixas temperaturas
Na temperatura de refrigerador (0 a 7C) a taxa metablica reduzida. A temperatura de
congelamento tende a tornar o micro-organismo dormente, mas no necessariamente ir matlo. Embora o ciclo congelamento/descongelamento pode romper estruturas celulares.
1.3.3. Alta presso
As estruturas moleculares das protenas e dos carboidratos sero alterados, resultando na
inativao das clulas. No entanto, os endosporos so resistentes. Vantagens: mantm o sabor,
colorao e valor nutricional dos alimentos. Ex: suco de frutas.
1.3.4. Presso osmtica
Altas concentraes de sais e acares (ambiente hipertnico). Os fungos conseguem se
desenvolver melhor neste ambiente do que as bactrias.
1.3.5. Radiao
- Radiao ionizante: raios gama, raios-X e feixe de eltrons. Causam mutaes nos microorganismos.
- Radiao no-ionizante: ultra-violeta (UV). Causam danos ao DNA das clulas expostas,
tem que ser aplicada diretamente no micro-organismo.

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Tabela 1. Tabela de alguns alimentos autorizados para tratamentos por irradiao no Brasil e
doses permitidas em kGy.
Produto

Dose (kGy)

Arroz

1,0

Batata

0,18

Cebola

0,18

Feijo

1,0

Milho

1,0

Trigo

1,0

Farinha de Trigo 1,0

Especiarias

10,0

Mamo

1,0

Morango

3,0

Peixe

1,0 - 2,2

Frango

7,0

ANVISA, 1997, 2001

Resoluo - RDC n 21, de 26 de Janeiro de 2001
2. Desinfeco
definida como a eliminao dos micro-organismos presentes, capazes de transmitir
infeces, patgenos, portanto, em um determinado meio e/ou ambiente, atravs de um agente
desinfetante, reduzindo ou inibindo o crescimento. Estes podem ser divididos em 3 grupos:
agentes qumicos, fsicos ou quimioterpicos. Para que possamos atingir uma desinfeco
correta, deve ser observado a concentrao do produto, as condies do ambiente e o tempo
de exposio do mesmo. Este processo pode ser classificado como desinfeco de alto,
intermedirio ou de baixo nvel, dependendo da quantidade de micro-organismos inativados.
Desinfeco de alto nvel: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV
e Mycobacterium tuberculosis. Este tipo de desinfeco indicado para itens classificados
como semi-crticos, ou seja, que entram em contato com mucosas ntegras e pele no
ntegra (p. ex. abridor de boca, condensadores de amlgama, esptulas para insero de
resinas, etc.).

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Desinfeco de nvel intermedirio: aquela que inativa bactrias na forma vegetativa (M.
tuberculosis), fungos e a maioria dos vrus. indicada para uso em itens classificados como
no-crticos, ou seja, aqueles materiais que entram em contato apenas com a pele ntegra.
(p. ex. estetoscpios, termmetros, esfigmomanmetros, gorro, mscara, refletor, etc.)
Desinfeco de baixo nvel: inativa a maioria das bactrias na forma vegetativa, exceto M.
tuberculosis, alguns fungos e vrus. indicada tambm para itens de uso no-crtico.
2.1. Desinfeco por agentes fsicos
2.1.1. Pasteurilizao
o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as clulas
vegetativas de micro-organismos, mas no os esporos, portanto, um mtodo de
desinfeco de alto nvel. indicado o uso de temperatura de 77C por 30 minutos,
aquecimento suficiente para matar os micro-organismos, sem alterar o sabor do produto. Ex.
Leite, sorvete, iogurte, cerveja. Tem tempos e temperaturas diferentes. Ex: LTLT (long
temperature long time), HTST (high-temperature, short-time) e UHT (ultra-high
temperature).

Figura 4. Pasteurilizao por LTLT.

2.2. Desinfeco por agentes qumicos
2.2.1. Mtodo de desinfeco de alto nvel

23

Glutaraldedo: indicado para qualquer objeto sensvel ao calor, e para rpida

desinfeco de itens reutilizados. utilizado em soluo a 2% com pH alcalino (7,5-8,5)
por 30 minutos.
Formaldedo: Pode ser encontrado na forma slida (pastilhas formalina) ou como soluo
aquosa 37-40% (diludo em lcool ou gua). A soluo deve ser usada por 30 minutos sendo
a concentrao de 8% em soluo alcolica e 10% em soluo aquosa.
Perxido de Hidrognio: Age em presena de matria orgnica e deve-se fazer a imerso
do material em soluo com concentrao de 3-6% por 15-30 minutos.
cido Peractico: A concentrao de uso varivel para a desinfeco, sendo que o tempo
de exposio deve ser no mnimo de 20 minutos.
2.2.2. Mtodo de desinfeco de nvel intermedirio
lcoois (Etlicos e Isoproplicos): Seu mecanismo de ao atravs da desnaturao de
protenas. So usados em concentrao de 70% por 10 minutos, para a desinfeco de
superfcies. O uso destas substncias contra-indicado para materiais mdico-cirrgicos,
borracha, plsticos e acrlico.
Halognios: Iodo e cloro. Iodo: impede a sntese de algumas protenas e causa alteraes nas
membranas celulares microbianas. Utilizado para desinfeco de pele e no tratamento de
feridas. Cloro: sua ao germicida causada pelo cido hipocloroso (HOCl) que se forma
quando o cloro adicionado gua. Impedem o funcionamento do sistema enzimtico
celular. Vrios compostos so eficazes para desinfetar equipamentos de fbricas de laticnios
e utenslios de restaurantes. Ex: hipoclorito de sdio, de clcio, dixido de cloro (no deixa
odores e sabores residuais).
Fenlicos: Seu mecanismo de ao atravs do rompimento da parede celular, precipitando
protenas, quando usado em alta concentrao, e alterao dos sistemas enzimticos
fundamentais, quando utilizado em baixa concentrao. Sua concentrao para uso de 0,45% sendo que o tempo de exposio deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso
indicado para descontaminao de ambiente hospitalar, itens cirrgicos e mdicos nocrticos, sendo que devem ser consideradas as limitaes devido a toxicidade e ao residual
em materiais porosos.
24

Iodforos: Sua ao atravs de seu alto poder de penetrao na parede celular, levando a
ruptura de protenas. So utilizados em concentrao de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou
igual a 10 minutos.
2.2.3. Mtodo de desinfeco de baixo nvel
Alcois
Compostos clorados
Fenlicos: em concentrao menor que 5%.
Iodforos: em concentrao menor que 30 ppm.
Compostos de Amnio Quaternrio: Age atravs da

inativao de enzimas,

desnaturao de protenas essenciais e ruptura da membrana celular. Sua concentrao para

uso de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mnimo 10 minutos. indicado para a limpeza de
ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfcies).
Detergentes:

So

emulsionante.

Podem

Amnio),

Aninicos

agentes

tensioativos,

com

ao

detergente,

umectante

ser classificados como Catinicos (p. ex. Quaternrios de

(p.

ex.

sabes,

detergentes sulfatados

ou

sulfonados),

Enzimticos. Este ltimo tem como princpio ativo enzimas proteinases, amilase

lpases, e, portanto, causam transformaes em protenas, polissacardeos e gorduras.

Procedimento
Avaliao da ao da autoclave
- Abrir o tubo contendo meio de cultura lquido com crescimento de micro-organismos,
removendo e segurando a tampa com o dedo mnimo, prximo ao bico de Bunsen. Passar
rapidamente a boca do tubo no bico de Bunsen.
- Transferir 100 l da cultura bacteriana (com auxlio de uma micropipeta com ponteira estril),
para dois tubos contendo caldo nutriente estril, separadamente e de forma assptica.
- Identificar os tubos, destinando um para a autoclave (A) e o outro para a estufa (E). Alm
disso, acrescentar nome da equipe, data, turma, nmero do laboratrio e nome da bactria
utilizada.
- O tubo identificado com a letra E deve ser levado imediatamente para a incubao a 37C
por 24 a 48 horas.

25

- O tubo identificado com a letra A deve ser encaminhado para a autoclave. Neste caso, a
equipe de tcnicos do departamento ir realizar a autoclavao e aps este processo, o tubo
ser incubado a 37 por 24 a 48 horas.
Leitura

Verificar a turbidez de cada tubo incubado e discutir sobre a eficincia da autoclave e sua
ao frente aos patgenos.
Avaliao da ao dos antisspticos
- Abrir o tubo contendo meio de cultura lquido com crescimento de micro-organismos,
removendo e segurando a tampa com o dedo mnimo, prximo ao bico de Bunsen. Passar
rapidamente a boca do tubo no bico de Bunsen.
- Umedecer o swab estril neste tubo, removendo o excesso, pressionando levemente o swab
na parede interna do tubo.
- Semear a suspenso retida no swab sobre a superfcie do meio de cultura agar nutriente em
at trs direes para obter um inculo uniforme, evitando que qualquer superfcie do gar
fique isenta do crescimento bacteriano.
- Identificar os poos na parte de baixo da placa de Petri com caneta de retroprojetor,
nomeando-os com os seguintes ttulos: AI e A70%. Alm disso, acrescentar nome da equipe,
data, turma, nmero do laboratrio e nome da bactria utilizada.
- No poo AI, adicionar 50 l de lcool-iodado e no poo A70% o mesmo volume de lcool
70% (com auxlio de uma micropipeta com ponteira estril).
- Esperar evaporar o lquido antes de virar a placa para incubao.
- Incubar a placa a 37C por 24 a 48 horas.
Leitura

- Verificar o halo de inibio formado e discutir sobre a eficincia dos antisspticos e sua ao
frente aos patgenos.

26

AULA PRTICA 8: Colorao de Gram: Cocos e Bacilos

Objetivo
Diferenciar as bactrias em gram-positivas e gram-negativas por meio da colorao de Gram.
Introduo
As bactrias coradas pela tcnica de Gram pertencem a duas categorias distintas: grampositivas e gram-negativas. As diferenas entre os dois grupos resultado da estrutura de suas
paredes celulares, visto que as paredes das clulas gram-negativas possuem um contedo
lipdico mais elevado que das gram-positivas.
A parede celular da bactria composta por uma rede macromolecular denominada
peptideoglicano.

peptiodeoglicano

consiste

em

dissacardeos

repetitivos

(N-

acetilglicosamina e cido N-acetilmurmico) ligados por polipeptdeos. O peptideoglicano

auxilia na diferenciao das bactrias gram-positivas e gram-negativas, j que as grampositivas apresentam uma camada espessa de peptideoglicano, enquanto que nas gramnegativos, a camada mais fina. No entanto, as gram-negativas possuem uma membrana
externa contendo lipossacardeos, lipoprotenas e fosfolipdeos.
Colorao de Gram
A colorao foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarqus Hans Christian
Gram, que classifica as bactrias em dois grandes grupos: gram positivas e gram-negativas. A
reao de Gram de uma bactria pode fornecer informaes valiosas para o tratamento da
doena. As bactrias gram-positivas tendem a ser mortas mais facilmente por penicilinas e
cefalosporinas. J as bactrias gram-negativas geralmente so mais resistentes pois os
antibiticos no podem penetrar a camada de lipopolissacardeo.
Procedimento
Esfregao da cultura bacteriana lquida

Cultura padro, meio lquido com crescimento bacteriano.

27

- Flambar uma ala e deix-la esfriar, mantendo-a prximo a chama do bico de Bunsen.
- Abrir o tubo contendo a cultura bacteriana, removendo a tampa com o dedo mnimo.
- Passar rapidamente a boca do tubo no bico de Bunsen e retirar uma amostra da cultura com a
ala bacteriolgica.
- Depositar esta gota contida na ala no centro da lmina.
- Espalhar o material com a ala em movimento circular, obtendo um esfregao de forma
oval, uniforme e fino.
- Fixar o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, cortando a chama
rapidamente e repetindo este procedimento em at 3 vezes, para que o material fique bem
aderido.
Colorao
- Colocar a lmina sobre o suporte que est localizado na pia.
- Pingar sobre o esfregao a soluo GRAM I (cristal violeta) cobrindo-o completamente,
deixando durante 1 minuto. Retirar o excesso com um filete de gua corrente. Os microorganismos adquirem tonalidade azul escura ou prpura.
- Recolocar a lmina sobre o suporte. Cobrir o esfregao com soluo GRAM II (iodoiodetada) por 1 minuto. Esta soluo mordente fixa o cristal violeta produzindo um complexo
violeta-iodo. Retirar o excesso com um filete de gua corrente.
- Aplicar a soluo GRAM III (lcool etlico a 95% juntamente com acetona - 700 mL de
lcool + 300 mL de acetona) por gotejamento at que no aja mais desprendimento do
corante. As bactrias gram(+) sofrem desidratao dos carboidratos das paredes celulares
promovendo a reteno dos corantes. As gram(-) pela dissoluo dos lipdeos, tem a
porosidade ou a permeabilidade da parede celular aumentada no retendo o corante. Retirar o
excesso com um filete de gua corrente.
- Por fim, aplicar a soluo GRAM IV (fucsina ou safranina), que o corante secundrio.
Aplicar sobre o esfregao por um perodo de 30 segundos. Aps, retirar o excesso com um
filete de gua corrente. Se as clulas permitem o descoramento pelo lcool, elas fixam a
fucsina nesta etapa e parecem vermelhas (gram-negativas), caso contrrio, permanecem com a
cor azul escura (gram-positivas).
- Secar a lmina prximo a chama do bico de Bunsen e observ-la no microscpio ptico com
a objetiva de imerso.

28

Figura 1. Etapas da colorao de Gram (Tortora, Funke, Case, 2012).

Leitura
- Visualizar colorao: as Gram-positivas coram de violeta e as Gram-negativas coram de
vermelho.
- Visualizar morfologia: Cocos (Staphylococcus, Streptococcus, diplococos...), Bacilos
(bacilos isolados, diplobacilos...).

29

AULA PRTICA 9: Colorao de Gram (amostras: oral, culturais, ar)

Objetivo
Diferenciar as bactrias encontradas em diferentes ambientes em gram-positivas e gramnegativas por meio da colorao de Gram.
Introduo
Os micro-organismos podem ser encontrados nos mais diversos ambientes. As espcies
podem ser benficas (incuas) ou patognicas ao ser humano, animais e plantas. Atravs de
tcnicas simples, possvel demonstrar a presena de micro-organismos em diversos locais
do ambiente. Alm disso, por meio da colorao de Gram, realizada conforme a aula anterior,
poderemos diferenciar os micro-organismos presentes e discutir a sua presena nos diversos
locais onde so encontrados.
Procedimento
Esfregao da cultura bacteriana lquida

Amostra oral

- Flambar uma ala e deix-la esfriar, mantendo-a prximo a chama do bico de Bunsen.
- Retirar uma poro da amostra oral da cavidade bucal (depositada em um pote estril) com a
ala bacteriolgica e transferi-la para o centro da lmina.
- Espalhar o material com a ala em movimento circular, obtendo um esfregao de forma
oval, uniforme e fino.
- Fixar o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, cortando a chama
rapidamente e repetindo este procedimento em at 3 vezes, para que o material fique bem
aderido.
Esfregao da cultura bacteriana slida

Cultura padro e de amostras ambientais coletadas em aulas prticas anteriores:

microbiologia do ar e ambientes.

30

- Flambar uma ala e deix-la esfriar, mantendo-a prximo a chama do bico de Bunsen.
- Abrir o tubo contendo a gua estril, removendo a tampa com o dedo mnimo.
- Passar rapidamente a boca do tubo no bico de Bunsen e retirar a suspenso com a ala.
- Depositar esta gota contida na ala no centro da lmina.
- Flambar novamente a ala, esperar esfriar e transferir uma colnia da cultura slida para a
gota de gua depositada sobre a lmina.
- Homogeneizar com movimentos circulares, para obter um esfregao de forma oval,
uniforme e fino.
- Fixar o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, cortando a chama
rapidamente e repetindo este procedimento em at 3 vezes, para que o material fique bem
aderido.
Colorao e Leitura: realizadas conforme aula anterior (Colorao de Gram).

31

AULA PRTICA 10: Microbiologia industrial (leite fermentado, iogurte, fermento

biolgico)
Objetivo
Identificar os micro-organismos presentes em alimentos fermentados.
Introduo
Um dos processos mais utilizados na microbiologia industrial a fermentao. A fermentao
um processo anaerbio em que ocorre a produo de ATP a partir de compostos orgnicos,
numa srie de reaes redox, que no envolvem uma cadeia transportadora de eletrns. A
fermentao envolve menores ganhos energticos j que apenas se formam 2 molculas de
ATP por molcula de glicose, enquanto que na respirao aerbia se formam 36 ATP.
Existem vrios tipos de fermentao, o que depende da molcula orgnica que aceptora do
hidrognio na fase de reduo do cido pirvico.
A fermentao alcolica realizada por leveduras (ex. Saccharomyces cerevisiae), o cido
pirvico convertido em etanol e CO2 em duas etapas: a) cido pirvico descarboxilado e
forma-se acetaldedo e b) acetaldedo reduzido pelo NADH a etanol.

Exemplos de

alimentos produzidos: vinho, cerveja, po.

J na fermentao ltica, o cido pirvico diretamente reduzido a cido ltico pelo NADH,
realizado por espcies de micro-organismos, tais como Lactobacillus lactis, L. thermophilus,
L. bulgaricus. A fermentao homoltica produz grandes quantidades de cido ltico e a
fermentao heteroltica leva produo de outras substncias alm do cido ltico, como
CO2, etanol e cido actico. Exemplos de alimentos produzidos: queijo, iogurte.
Por fim, a fermentao actica chamada desta forma devido as caractersticas do produto
obtido, no entanto, no uma fermentao, mas uma oxidao. A sua produo compreende
duas etapas: a) Fermentao do acar que convertido em etanol: processo anaerbio
realizado por leveduras. b) Oxidao do etanol a cido actico: reao aerbia realizada por
bactrias acticas dos gneros Acetobacter e Glucanobacter. Exemplo de alimento produzido:
vinagre.
Procedimento

32

- Preparar lminas a fresco e coradas pelo mtodo de Gram, a partir de fermento de po,
iogurte, leite fermentado, queijos.
- Visualizar no microscpio ptico.
- Identificar os micro-organismos presentes nos alimentos, diferenciando-os conforme
morfologia e colorao.
Observao
A preparao de lminas a fresco e a Colorao de Gram sero realizadas conforme descrito
nas aulas anteriores.

33

AULA PRTICA 11: Contagem em placa

Objetivo
Avaliar a qualidade do leite em funo do nmero de micro-organismos presentes.
Introduo
O leite pode ser um meio de cultura para o crescimento de micro-organismos devido aos
vrios nutrientes que possui. Ele pode conter uma microbiota normal proveniente do prprio
animal que o produz e algumas vezes pode conter micro-organismos patognicos, tais como
Salmonella, Mycobacterium bovis, M. tuberculosis. Estes micro-organismos podem ser
originados do prprio animal e pode continuar durante a ordenha, transporte e
armazenamento. Alm disso, estes patgenos podem ser transferidos durante a manipulao
do produto, sendo que condies inadequadas de conservao, transporte e armazenamento
tambm contribuem significativamente para sua multiplicao. Assim, a qualidade do leite
pode ser avaliada em funo da sua microbiota, fornecendo informaes que refletem as
condies higinico-sanitrias deste alimento.
Procedimento
- Abrir o frasco contendo o leite prximo a chama do bico de Bunsen.
- Abrir o tubo contendo 9 mL de soluo salina, removendo a tampa com o dedo mnimo e
passar a boca do tubo rapidamente na chama do bico de Bunsen.
- Transferir 1 mL da amostra de leite para 9 mL de soluo salina estril, com auxlio de uma
pipeta estril. Desta forma, a diluio 10-1 ser realizada.
- Agitar o tubo contendo 10 mL (10-1) e transferir 1 mL deste tubo para o prximo tubo
contendo 9 mL de soluo salina estril (10-2).
- Agitar o tubo contendo 10 mL (10-2) e transferir 1 mL deste tubo para o prximo tubo
contendo 9 mL de soluo salina estril (10-3).
- Agitar o tubo contendo 10 mL (10-3) e transferir 1 mL deste tubo para o prximo tubo
contendo 9 mL de soluo salina estril (10-4).
- Agitar o tubo contendo 10 mL (10-4) e transferir 1 mL deste tubo para o prximo tubo
contendo 9 mL de soluo salina estril (10-5).
- Aps finalizar as diluies, transferir 0,1 mL das diluies (10-3, 10-4, 10-5) para as placas
contendo meio de cultura nutriente slido (em duplicata), com auxlio de uma pipeta estril.

34

- Espalhar por toda a superfcie da placa de meio de cultura, com auxlio de uma ala de
drigalski de vidro estril.
- Identificar as placas com nome da equipe, data, turma, nmero do laboratrio e a diluio
realizada.
- Incubar as placas a 37C por 24 a 48 horas.

Figura 1. Procedimento para contagem de bactrias no leite.

Leitura
- Aps incubao, escolher as placas que tenham 30 a 300 colnias e realizar o seguinte
clculo.

N de UFC/mL = mdia das contagens das placas x diluio escolhida

35

AULA PRTICA 12: Anlise bacteriolgica da gua

Objetivo
Avaliar a qualidade da gua pela pesquisa de coliformes totais e termotolerantes.
Introduo
No que diz respeito potabilidade, o aspecto mais importante o carter qualitativo da
populao. A maioria das doenas veiculadas pelas guas tem sua origem na contaminao
fecal, como o caso da shigelose, hepatite A, rotavrus, giardase, entre outras. Como a
liberao dos micro-organismos algumas vezes pode ser em pequenas quantidades ou de
forma descontnua, seria impossvel avaliar a presena de todos eles em uma amostra de gua.
Por isso, para a anlise da gua utiliza-se um micro-organismo indicador, ou seja, com
suspeita de ser patognico por indicar a contaminao da gua com fezes. Neste caso, o
microrganismo escolhido a Escherichia coli. Ela constante no intestino humano e dos
animais de sangue quente, abundante nas fezes, cresce facilmente em meios de cultura e
vive bastante tempo na gua. No entanto, apresenta baixa resistncia clorao e menor
viabilidade na gua do mar. A E. coli faz parte do grupo de micro-organismos denominados
coliformes, constituindo 95% dos coliformes nas fezes.
Alm da potabilidade, a qualidade microbiolgica da gua que vai decidir sobre seus
possveis usos. Para avaliar a qualidade da gua, realizada a pesquisa de coliformes totais e
termotolerantes. Pode-se utilizar vrios mtodos, entre eles, a tcnica de tubos mltiplos e o
filtro de membrana.
No teste de tubos mltiplos, os coliformes totais e termotolerantes sero pesquisados atravs
do crescimento, evidenciado por meio da produo de gs nos tubos, em meios de cultura
lquidos, tais como, caldo lactosado, caldo verde brilhante e caldo EC (Escherichia coli).
Procedimento
Anlise bacteriolgica da gua I
1. Coliformes totais: a pesquisa de coliformes totais baseada nas caractersticas do grupo
bastonete Gram-negativo, que produz cido e gs atravs da lactose.

36

Teste presuntivo: neste teste, presume-se que os micro-organismos que crescem produzindo
gs a partir de lactose sejam coliformes.
- Prximo ao bico de Bunsen, abrir a amostra e o tubo contendo meio de cultura lquido,
removendo a tampa com o dedo mnimo e no esquecendo de passar a boca de cada tubo
rapidamente na chama do bico de Bunsen antes da inoculao.
- Inocular com 10 mL da amostra, 3 tubos contendo 10 mL de caldo lactose concentrado e
tubos de Durham invertidos.
- Inocular com 1 mL da amostra, 3 tubos contendo 10 mL de caldo lactose e tubos de Durham
invertidos.
- Inocular com 0,1 mL da amostra, 3 tubos contendo 10 mL de caldo lactose e tubos de
Durham invertidos.
- Anotar nos tubos a quantidade que est sendo inoculada. No misturar os tubos.
- Alm disso, anotar nome do grupo, data, turma, nmero do laboratrio e quantidade de mL
que est sendo inoculada.
- Incubar os tubos a temperatura de 37 C por 24 horas.
Leitura
- Fazer a leitura considerando positivos os tubos com presena de gs.
- Reincubar os tubos negativos por mais 24 horas.
- Fazer nova leitura.
- Usar a tabela para verificar o nmero mais provvel (NMP) de coliformes por 100 mL.
Anlise bacteriolgica da gua II
Teste confirmativo: os sais de bile deste meio tem a funo de inibir o crescimento de
bactrias no entricas, j o verde brilhante de inibir as bactrias gram-positivas, selecionando
o crescimento de coliformes.
- Aps o teste presuntivo, transferir atravs de uma ala bacteriolgica uma alquota de cada
tubo positivo de caldo lactose para tubos contendo caldo lactosado bile verde brilhante e tubos
de Durham invertidos, de forma assptica e prximo ao bico de Bunsen.
- Identificar os tubos com nome do grupo, data, turma, nmero do laboratrio e quantidade de
mL dos tubos em que foram anteriormente inoculados.
- Incubar a temperatura de 37 C por at 48 horas.
Leitura

37

- Fazer a leitura. Os positivos apresentam gs.

- Usar a tabela para verificar o NMP de coliformes por 100 mL.
Anlise bacteriolgica da gua III
2. Coliformes termotolerantes: a pesquisa de coliformes termotolerantes possvel atravs
do seu crescimento em meio EC (Escherichia coli) inoculado a partir do teste presuntivo.
Estes coliformes tem em seu ambiente natural temperaturas mais elevadas e por isso, so
capazes de crescer a 44,5C, possibilitando assim serem avaliados separados dos demais
coliformes.
- Aps a leitura do teste presuntivo, transferir com a ala bacteriolgica uma poro de cada
tubo positivo do caldo lactose para tubos contendo caldo EC com tubos de Durham
invertidos.
- Identificar os tubos com nome do grupo, data, turma, nmero do laboratrio e quantidade de
mL dos tubos em que foram anteriormente inoculados.
- Incubar a temperatura de 44,5C por 24 horas.
Leitura
- Fazer a leitura dos tubos de EC. Os tubos com presena de gs so positivos.
- Usar a tabela para verificar o NMP de coliformes por 100 mL.

38

Tabela 1. Nmero mais provvel por 100 mL de amostra, usando trs tubos de diluio.
Nmero de tubos positivos
Nmero de tubos positivos
NMP
NMP
/100
mL
/100
mL
10 mL
1 mL
0,1 mL
10 mL
1 mL
0,1 mL
0
0
0
0
2
0
0
9,1
0
1
0
3
2
0
1
14
0
0
2
6
2
0
2
20
0
0
3
9
2
0
3
26
0
1
0
3
2
1
0
15
0
1
1
6,1
2
1
1
20
0
1
2
9,2
2
1
2
27
0
1
3
12
2
1
3
34
0
2
0
6,2
2
2
0
21
0
2
1
9,3
2
2
1
28
0
2
2
12
2
2
2
35
0
2
3
16
2
2
3
42
0
3
0
9,4
2
3
0
29
0
3
1
13
2
3
1
36
0
3
2
16
2
3
2
44
0
3
3
19
2
3
3
53
1
0
0
3,6
3
0
0
23
1
0
1
7,2
3
0
1
39
1
0
2
11
3
0
2
64
1
0
3
15
3
0
3
95
1
1
0
7,3
3
1
0
43
1
1
1
11
3
1
1
75
1
1
2
15
3
1
2
120
1
1
3
19
3
1
3
160
1
2
0
11
3
2
0
93
1
2
1
15
3
2
1
150
1
2
2
20
3
2
2
210
1
2
3
24
3
2
3
290
1
3
0
16
3
3
0
240
1
3
1
20
3
3
1
460
1
3
2
24
3
3
2
1100
1
3
3
29
Fonte: Seeley, H.R. Jr., Vandemark, P.J., Lee, J.J. (1991). Microbes in Action. 4th ed., W.H.
Freeman &Company, New York: 450pp.

39

AULA PRTICA 13: Identificao bacteriana

Objetivo
Identificar as enterobactrias por meio de provas bioqumicas.
Introduo
A famlia Enterobacteriaceae compreende cerca de 80% de todos os bacilos gram-negativos
isolados no laboratrio clnico, sendo que os demais bacilos Gram-negativos isolados
constituem o grupo das chamadas bactrias no-fermentadoras.
Enterobactrias so bacilos gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no
esporulados, de crescimento rpido que formam colnias distintas em meio seletivo indicador,
dependendo da sua capacidade metablica e dos componentes do meio.
Tem como hbitat o intestino grosso, mas tambm so encontradas causando infeces no
trato urinrio, pulmes, ouvidos, etc. Todas fermentam glicose, reduzem o nitrato a nitrito e
so citocromo oxidase negativas. Alguns gneros so sempre patognicos, outros fazem parte
da flora normal intestinal, porm se inoculadas em outros locais, tais como: lquor, peritnio e
pulmes de imunodeprimidos, podem causar doenas.
Procedimento
Identificao bacteriana I
- Distribuir as placas de meios de cultura SS (Salmonella-Shigella), MC (MacConkey) e
Teague com crescimento de diferentes enterobactrias (as placas estaro numeradas, sendo
cada nmero correspondente a uma enterobactria).
- Observar as colnias nos meios de cultura SS, MC e Teague, realizando a identificao
conforme quadro abaixo:

40

Tabela 1. Interpretao do crescimento bacteriano nos meios de cultura.

Meios
MC
SS
Teague

Agentes Inibidores
- Cristal violeta
- Sais biliares
- Verde brilhante
- Sais biliares
- Eosina
- Azul de metileno

Agentes Indicadores

Caractersticas culturais

- Vermelho neutro

Rosa

Incolor

- Vermelho neutro

Rosa

Incolor (com ou sem

pigmentos pretos)

- Azul de metileno

Vinho

Incolor

1. Meio Salmonella-Shigella (SS): meio diferencial empregado para isolar Salmonella e

Shigella a partir de fezes, urina e alimentos frescos ou enlatados.
- As bactrias Gram-positivas so inibidas por uma mistura de sais biliares.
- Shigella e a maioria das enterobactrias formam colnias claras e incolores ou transparentes.
- E. coli formam colnias pequenas, que vo de rosa a vermelho.
- Algumas espcies de Salmonella formam colnias incolores e transparentes com centro
negro (H2S).
2. Meio MacConkey (MC): meio amplamente utilizado para isolar e identificar seletivamente
enterobactrias em amostras biolgicas, gua, esgoto e alimentos.
- A mistura de sais biliares inibe Gram-positivas.
- E. coli - colnias vermelhas ou rosadas, devido a fermentao da lactose

a diminuio do

pH pode fazer com que os meios fiquem rodeados por um precipitado de sais biliares.
- Salmonella colnias incolores, do transparente ao mbar.
- Shigella colnias incolores, transparentes ou levemente rosadas.
3. Meio Teague (EAM): eosina azul de metileno: meio utilizado para isolamento e
diferenciao de enterobactrias. Promove uma distinta diferenciao entre as colnias de
micro-organismos fermentadores de lactose e os que no fermentam lactose.
- O meio ligeiramente inibidor para Gram-positivas.
- E. coli colnias elevadas de 2 a 3 mm de dimetro. Apresentam um centro azul-negro com
borda estreita e clara, e brilho azul metlico azul esverdeado luz refletida (algumas
linhagens podem no ter brilho).
- Salmonella e Shigella colnias ligeiramente elevadas de 1 a 2 mm de dimetro,
transparentes, desde incolor at mbar.

41

Identificao bacteriana II
Semeadura no TSI e provas bioqumicas
- A partir de colnias caractersticas e isoladas dos meios de cultura acima, inocular no meio
TSI (Trplice Sugar Iron) com agulha de nquel cromo, por estria de esgotamento e em
profundidade (escolher as colnias de um dos meios utilizados).
- Identificar o tubo com data, nome da equipe, turma, nmero do laboratrio e nmero da
bactria.
- Incubar o tubo de TSI a temperatura de 37C por 24 a 48 horas.
- Aps a inoculao do meio TSI, inocular as colnias bacterianas crescidas nas placas de
meio de cultura em tubos contendo as provas bioqumicas.
- Identificar os tubos com data, nome da equipe, turma, nmero do laboratrio e nmero da
bactria.
- Incubar os tubos a temperatura de 37C por 24 a 48 horas.
Identificao bacteriana III
Leitura do TSI
- Proceder a identificao do possvel grupo de micro-organismos por meio do TSI, que um
meio de triagem.
Meio TSI (gar ferro trplice acar glicose, sacarose e lactose): um meio diferencial,
recomendado para identificao de bacilos entricos, baseado na fermentao da glicose,
lactose e sacarose e na produo de sulfeto hidrognio (H2S).
Tabela 2. Interpretao das cores no meio de cultura TSI.
Local

pice e/ou base

Cor
Vermelho forte
Vermelho claro
Amarelo
Amarelo e bolhas
Preta

Significado
Reao alcalina
Reao neutra
Reao cida
Reao cida e gs
Produo H2S

Interpretao
pice e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (+).
pice vermelho e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (-).

42

pice e base vermelho = glicose, sacarose e lactose (-).

Tabela 3. Identificao de bactrias por meio do TSI (Salmonella, Shigella e E.coli).

TSI
Lactose
Sacarose
Glicose
Gs
H2S

Salmonella
+
+
+

Shigella
+
-

E.coli
+
+
+
+
-

Tabela 4. Identificao de bactrias por meio do TSI (outros micro-organismos).

Leitura

Interpretao

Base amarela
Superfcie amarela
Gs

Fermentao de glicose
Fermentao de lactose e/ou sacarose
Produo de gs

Base amarela
Superfcie rosa
Gs
Pigmento negro

Fermentao de glicose
Ausncia de fermentao de lactose e
sacarose
Produo de gs
Produo de H2S

Base amarela
Superfcie rosa

Fermentao de glicose
Ausncia de fermentao de lactose e
sacarose

Base amarela
Superfcie amarela
Gs
Pigmento negro

Fermentao de glicose
Fermentao de lactose e/ou sacarose
Produo de gs
Produo de H2S

Meio sem alterao ou Ausncia de fermentao dos trs

Rosa
carboidratos

Diagnstico presuntivo
Escherichia
Klebsiella
Enterobacter
Providencia
Salmonella
Arizona
Citrobacter
Edwardsiella
Proteus
Shigella
Providencia
Escherichia
Salmonella
Proteus
Serratia
Arizona
Citrobacter
Proteus
Bactria no
fermentadora

Leitura das provas bioqumicas

- Proceder a identificao por meio de comparao das caractersticas dos micro-organismos
em estudo.

43

Indol: verificar se a bactria tem ou no a enzima triptofanase.

Triptofanase
Caldo triptofano -----------------------------------> indol + amnia + cido pirvico
Interpretao: reativo de Erlich (na parede do tubo) em presena do indol forma um complexo
de cor vermelha.
vermelho (+)
sem alterao na cor (-)
Nitrato: verificar a presena da enzima nitrito redutase.
Nitrito redutase.
Nitrato (NO3) -------------------------------------------> Nitrito (NO2)
Reativo de Gries Ilosvay

Reativo A: cido Sulfanlico

Reativo B: cido Naftilamina

Interpretao: teste positivo - precipitado vermelho-tijolo

teste negativo - sem alterao de cor
Citrato: verificar se o citrato utilizado como nica fonte de carbono
Interpretao: teste positivo - azul
teste negativo - verde
Malonato: verificar se o malonato utilizado como nica fonte de carbono
Interpretao: teste positivo - azul
teste negativo - verde
Fenilalanina desaminase (FM): catalisa a desaminao do aminocido fenilalanina
formando cido fenilpirvico.
Para evidenciar acrescentar HCL 0,1N --------->

pH --------> cor amarela

Aps adiciona-se cloreto frrico 10% + cido --------> volta a ficar verde

44

Fenilalanina desaminase
Fenilalanina -----------------> cido fenilpirvico
Interpretao: teste positivo - verde
teste negativo - amarelo
Uria: verificar a presena da enzima urase
Urease
uria -----------------------------> amnia
Interpretao: teste positivo - vermelho ou rosa
teste negativo - amarelo
Fermentao de Carboidratos: determina a capacidade de um microrganismo de fermentar
a glicose incorporada a um meio base, produzindo cido ou cido com gs.
Glicose
Lactose
Sacarose

cidos ou cidos com gs

Maltose
Manitol
Lisina: verificar a presena da enzima lisina carboxilase
enzimas
Glicose --------------------> cidos (baixa do pH colorao amarela (-))
enzimas
Lisina ---------------------> cadaverina (diamina) + CO2 (aumenta pH colorao roxa(+))
Vermelho de Metila: testa a capacidade de um micro-organismo em produzir cidos
orgnicos relativamente estveis, a partir da fermentao da glicose.
enzimas

cido lctico

Glicose ----------------------------> cido actico

cido frmico

45

Reagente: soluo hidroalcolica de vermelho de metila (5 gotas)

Interpretao: teste positivo - vermelho
teste negativo - amarelo
Vogues Proskauer: determina a capacidade de um micro-organismo em produzir um
composto nitrogenado neutro, o acetilmetilcarbinol (acetona), a partir da fermentao da
glicose.
Glicose

2 cido pirvico

Acetilmetilcarbinol (acetona)
0,6 mL de alfa-naftol + 0,2 mL de KOH40%
Diacetil + guanidina da peptona

Composto vermelho
Interpretao: teste positivo - rosa a vermelho
teste negativo - cobre
Produo de gs sulfdrico (SIM)
H2S - gs sulfdrico (sulfeto de hidrognio): evidenciado nas culturas por reagir com metais
pesados, formando sulfetos.
A bactria degrada compostos orgnicos contendo enxofre, como o tiossulfato de sdio
(Na2S2O3) e libera H2S -------> reage com Fe.
Interpretao: teste positivo - precipitado negro
teste negativo - incolor

46

Tabela 5. Identificao das enterobactrias atravs das provas bioqumicas.

Espcies
Testes
Glicose gs
Glicose cido
Lactose
Maltose
Manitol
Sacarose
Citrato
Malonato
Hidrlise do amido
VM
VP
Hidrlise de gelatina
H2 S
Indol
Motilidade
Lisina
Fenilalanina
Nitrato
Urease
Catalase/Peroxidase

Escherichia
coli

Salmonella

Shigella
dysenteriae

Shigella
sonnei

Klebsiella
pneumoniae

Enterobacter
aerogenes

+
+
+
+
+
d
+
+
+/+
+
+

+
+
D
+
+
+
D
+
D
+
+
+
+
+

+
+/+
d
+
+

+
(+)
+/+
(+)
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
(d)
d
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
(*)
+
+
+
(d)
+

D= diferentes reaes em diferentes espcies de um gnero

d= diferentes reaes em diferentes isolados
(d)= diferentes reaes em diferentes isolados tardiamente
(+)= reaes tardias, mas sempre positivas
(*)= liquefao muito lenta

Hafnia spp.

Serratia
marcescens

Proteus
vulgaris

Proteus
mirabilis

+
d
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
(+)
+
+
+/(+)
+/+
+
+
D
d
d
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
d
d
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
(Fonte: Manual BERGEY, 8 edio)

Referncias Bibliogrficas
MURRAY, P.R.; ROSENTHAL, K.S.; PFALLER, M.A. Microbiologia mdica. 6 edio.
Rio de Janeiro: Elsevier, 2009. 948 p.
KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; JANDA, W.M.; SCHRECKENBERGER, P.C.; WINN Jr.,
W.C. Dignstico microbiolgico. 5 edio. Rio de Janeiro: editora mdica e cientfica
Ltda.2001. 1465 p.
SILVA FILHO, G.N.; OLIVEIRA, V.L. Microbiologia: manual de aulas prticas. 2 edio,
Florianpolis: Editora da UFSC, 2007. 157p.
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. 10 edio. Porto Alegre:
Artmed, 2012. 934 p.
TRABULSI, L.R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 5 edio. So Paulo: Atheneu, 2008.
760 p.