Universidad del Cauca

Dpto. de Biologa
Estudio de la mitosis
Introduccin.
La divisin celular es un proceso por el cual a partir de una clula madre se producen dos
clulas hijas que gentica, estructural y funcionalmente son iguales entre s e iguales a la
propia clula madre. Ello se debe a que han recibido, excepto en el caso de procesos
anormales, la misma informacin gentica de la clula madre y, por lo general en la
mayora de los organismos la misma cantidad de citoplasma y orgnulos.
Este fenmeno se produce tanto en procariotas como en eucariotas. En los procariotas y
eucariotas unicelulares o de vida libre la divisin celular es el proceso por el cual se
propaga la informacin gentica y aumenta el nmero de individuos de la poblacin,
mientras que en los organismos pluricelulares la divisin celular es esencial para el
desarrollo del organismo a partir del zigoto y para la reparacin de las clulas que han
muerto por desgaste o por lesiones ocurridas en los tejidos.
Existen diferencias entre la divisin celular de procariotas y eucariotas derivadas de la
distinta estructura y de la diferente cantidad de ADN que poseen estos tipos de clulas. En
las clulas eucariotas el proceso de divisin es ms complejo debido a la existencia de un
ncleo en el que se almacena la cromatina condensada en forma de cromosomas que, en
algunos casos, pueden ser muy numerosos.
El mecanismo utilizado para la divisin celular se denomina mitosis, aunque es el
mecanismo que afecta al material gentico. Normalmente este mecanismo se contina
con la divisin del citoplasma denominada citocinesis.
El objeto de la presente prctica es identificar las clulas que se encuentran en mitosis y
las distintas fases de sta mediante la tincin y observacin de meristemos de raz de
cebolla. Una vez identificadas las fases de la mitosis, se puede calcular el ndice mittico y
la distribucin porcentual de cada una de las fases mitticas de meristemos de raz de
cebolla crecidos en diferentes condiciones. Con estos datos realizaremos un informe a
modo de trabajo de investigacin explicando la metodologa utilizada, los objetivos,
resultados y comentarios al respecto.
Ciclo celular.
El ciclo celular es una secuencia regular y repetitiva de crecimiento y divisin celulares
que sufren todas las clulas. La duracin de este ciclo es variable y depende
del tipo celular, del organismo y de factores externos como la temperatura, factores de
crecimiento, nutrientes y toxinas.
El ciclo celular consta de cinco fases: G1, S, G2, mitosis y citocinesis (Figura 1). Las tres
primeras fases se agrupan en lo que se denomina interfase durante la
cual la clula se prepara para realizar la divisin celular formada por las dos ltimas fases.
La funcin de las fases de la interfase quedan resumidas de la siguiente forma:

Fase G1.- Durante esta fase se desarrolla una alta actividad bioqumica cumpliendo con
las distintas funciones que la clula presente en el organismo. Normalmente, en un
organismo pluricelular, las clulas, que no se dividen normalmente salvo en presencia de
ciertos factores de crecimiento, se enquistan en una subfase denominada G0. La fase G0
indica nicamente que las clulas no se encuentran en un ciclo contnuo de crecimiento y
duplicacin. En un organismo diploide, la cantidad de ADN en el ncleo es de 2n.
Fase S.- Cuando las clulas se encuentran en un ciclo continuo de crecimiento y divisin
celular o reciben una seal extracelular adecuada, pasan a duplicar la cantidad de ADN y
sintetizar una serie de protenas encargadas de la compactacin del ADN. Por lo tanto, al
final de la fase S, una clula de un organismo diploide ha pasado a tener una dotacin
doble de ADN. No se puede decir que sea tetraploide (4n) sino que sigue siendo diploide
pero con cada uno de los cromosomas duplicados, las indicaremos como 4c.
Fase G2.- Las clulas han terminado la sntesis de ADN (4c) y se preparan para sufrir el
complejo proceso de la divisin celular. En esta fase se sintetizan las protenas necesarias
para llevar a cabo la mitosis y se concluye la duplicacin y separacin del centriolo en
clulas animales.

Figura 1. Fases de la mitosis

Los cromosomas inicialmente fueron observados por C. Ngeli en 1842 y el nombre
acuado por W. Waldeyer. Posteriormente Walter Flemming estudi y document el
comportamiento de los cromosomas durante la divisin celular, proceso que el denomin
mitosis. La divisin celular es rpida en puntas de raz en crecimiento de semillas en
germinacin. Los cromosomas en puntas de raz en divisin pueden visualizarse
fcilmente colectando las puntas de raz una vez germine la semilla o bulbo y luego
procediendo a fijar, realizar una digestin cida, tincin, aplastamiento y observacin al
microscopio.
I.

Tincin de Feulgen

1. Fijacin. Corte 10 puntas de raz (6 mm) y transfiera al fijador Carnoy cido

actico-etanol (HOAc+EtOH 1:3) al menos 24 horas en tubos ependorf de 2 ml.
2. Retire el fijador utilizando una pipeta Pasteur y lave en agua destilada.
3. Hidrlisis. Coloque las puntas de raz en 1 a 2 ml de HCL 1 N a 60 oC durante 12
minutos.

4. Elimine el cido clorhdrico con una Pipeta Pasteur y descrguelo en el recipiente de

residuos y lave con agua corriente.
5. Tincin. Agregue a las puntas de raz 1 ml de tincin de Feulgen (esta tincin es
incolora pero tie fuertemente, evite el contacto con la ropa, manos u otros
materiales) fuchsina leuco-bsica y mantngala durante 10 minutos a temperatura
ambiente hasta cuando las puntas de raz muestren un color magenta.
6. Aplastamiento (squashing). Transfiera cada punta de raz a unportaobjetos y
cbrala con una gota de cido actico al 45%, elimine el excedente de colorante
con una pipeta Pasteur y descargue en el recipiente de residuos. Corte la punta de
raz y descarte el otro tejido. Coloque un cubreobjetos sobre la punta y aplquele
una presin uniforme para obtener una buena preparacin.
7. Observacin. La preparacin se puede sellar con parafina para observacin.
8. Preparacin permanente. Invierta el porta objetos en un recipiente cerrado que
contenga cido actico glacial-etanol (3:1). Despus de que caiga el cubreobjetos,
pase la preparacin completa (portaobjetos y cubreobjetos en una mezcla de cido
actico-etanol (1:1, 1:3), etanol puro, etanol xilol (1:1) y xilol I y II, manteniendo 5
minutos en cada uno. Monte en blsamo del Canad.

II.
Tincin orcena-cido actico
1. Corte los ltimos 10mm de cada raz (entre 10:00 a.m. y 12:00 m.d.) y colquelos
en la fijador de tejido Carnoy durante 24 horas).
2. Enjuague los pices de cebolla (fijados) en agua destilada por 30 segundos.
3. Coloque las races en un tubo Ependorf que contenga unos 2mL de HCl 1% por 10
min. (esto se hace para romper la pared celular).
4. Mientras transcurre el tiempo anterior, corte y conserve la porcin del pice de raz
que posea un tejido blanquecino (casi 2-3 mm del extremo de la raz) y deseche el
resto.
5. Transferir los pices a agua destilada y dejarlos all 30 segundos (enjuague).
6. Coloque el tejido sobre un portaobjetos e inmediatamente agregue dos gotas de
aceto-orcena* sobre ste.
7. Coloque un cubreobjetos sobre el tejido y caliente la muestra suavemente por 1
minuto, por medio de toques intermitentes sobre la superficie de una plancha de
calentamiento o (durante este tiempo vigile que el tejido permanece humedecido
con el colorante, no permita que hierva ni que se seque; agregue ms colorante si
es necesario). Esta etapa es opcional (el calentamiento intensifica la tincin).
8. Coloque un trozo de papel toalla sobre el cubreobjetos; presione fuerte y
cuidadosamente por medio de un borrador de lpiz (esta tcnica se llama
"extendido por aplastamiento" o "squash" ). Recuerde que mientras est ms
aplastado, las clulas se separarn ms unas de las otras y se encontrarn en el
mismo plano, distinguindose mejor las distintas etapas de mitosis.

9. Despus del aplastamiento, si es necesario, levante el cubreobjetos con la ayuda de

una aguja de diseccin y agregue una gota adicional de aceto-orcena; coloque
nuevamente el cubreobjetos sobre la muestra.
10.Observe al microscopio (primero con el objetivo 10x localice el rea adecuada,
luego pase a 40x para observar con detalles).
11.Encuentre las cuatro etapas de la mitosis, adems observe la apariencia de las
clulas que se encuentran en interfase (aquellas que no estn en mitosis).
Preparacin permanente.
Invierta el porta objetos en un recipiente cerrado que contenga cido actico glacialetanol (3:1). Despus de que caiga el cubreobjetos, pase la preparacin completa
(portaobjetos y cubreobjetos en una mezcla de cido actico-etanol (1:1, 1:3), etanol puro,
etanol xilol (1:1) y xilol I y II, manteniendo 5 minutos en cada uno. Monte en blsamo del
Canad o permount.
Preparacin de fucshina leuco-bsica (Tincin de Feulgen)*
1. Coloque 1 g de fucshina en un Erlenmeyer de 500 ml.
2. Ponga 200 ml de agua hirviendo en un frasco, agite bien.
3. Enfre a 50 oC verificando frecuentemente la temperatura con un termmetro (si se
enfra demasiado puede producir precipitacin).
4. En un embudo Buchner, filtre al vaco a travs de 2 capas de papel filtro.
5. Aada 30 ml de HCl.
3 g de metabisulfito de potasio (K 2S2O5)
1. Agite bien, coloque en una botella bien tapada, almacene en la oscuridad a
temperatura ambiente durante 24 a 48 horas.
2. Aada 1 g de carbn activado pulverizado, agite bien. Filtre al vaco en un Filtro
Buchner a travs de dos capas de papel filtro No. 1 Si la solucin est muy coloreada,
se puede aadir 1 g de carbn activado y filtre nuevamente.
3. Almacene en una botella mbar bien tapada o bien sellada en el refrigerador.
Permita que la tincin madure durante 1 a 2 das antes de usarse.
Preparacin de la aceto - orcena

Aadir 2 g de orcena a 45 ml de cido actico caliente (80 a 90 C) y agitar

rpidamente.
Aadir gradualmente a esta solucin, 55 ml de agua destilada a temperatura
ambiente.
Dejar enfriar.
Filtrar dos (2) veces.
Guardar en botella oscura.

Bibliografa

Skorupska, H. and R. G. Palmer. Monosomics from synaptic KS mutant. Soybean Genet.

News1. 1987:174-178.
Palmer, R. G. and H. Heer. 1973. A root-tip squash technique for soybean chromosomes.
Crop Sci. 389-391.

Taller No. 3 mitosis

Fecha de entrega 11/03/2016
Complemente:

a. En el ciclo celular la sntesis de ADN ocurre durante la ______________________. Al

comienzo de la profase la ______________________ se condensa y los cromosomas se
harn visibles. El final de la profase se caracteriza por el rompimiento
de___________________________ . Los cromosomas se adhieren al
_____________________ en la zona ecuatorial durante la __________________. En la anafase
los cromosomas se dividen en el centrmero y una copia se dirige al polo a travs del
huso. En la fase final denominada ____________________se forman dos ncleos
separados. En clulas animales esta fase continua mediante el proceso denominado
____________________.
b. Explique por qu las puntas de raz son particularmente adecuadas para preparar
placas para el estudio de la mitosis.
c. De una razn para llevar a cabo los siguientes pasos en la preparacin de las placas
para estudiar la mitosis:
El tejido debe teirse.
El material teido y presionado el porta objetos durante el montaje de la placa.
d. En la metafase de la mitosis las dos molculas hijas de ADN estn separadamente
plegadas formando las ______________________________ las cuales se mantienen unidas
al centrmero.
e. Una pequea fraccin del ADN de clulas eucariticas superiores est en una forma
condensada, conocida como _________________________, la cual permanece
inusualmente compacta durante la interfase y es trasncripcionalmente inactiva.
f. Utilizando las fotomicrografas tomadas durante la prctica de laboratorio elabore
una composicin fotogrfica editada e identifique las fases de la mitosis y describa los
aspectos celulares y moleculares de
cada una de ellas.

g. Cul de las siguientes caractersticas de la divisin celular son muy diferentes en

clulas animales y vegetales? Ample su respuesta.
1. profase 2. Metafase c. anafase d. citocinesis
h. Cul de las siguientes afirmaciones no es verdad de la mitosis ?
1. Un ncleo sencillo da origen a dos ncleos hijos idnticos
2. Los ncleos hijos son genticamente idnticos a los ncleos paternos
3. Los centrmeros se dividen en el inicio de la anafase.
4. Sinapsis de los cromosomas homlogos en la profase

h. La citocinesis en las clulas de las plantas se

caracteriza por:
1. La divisin equitativa de los cromosomas
homlogos.
2. Una construccin de la membrana para dividir la
clula
3. La formacin de una placa celular en el
citoplasma
4. El movimiento de los cromosomas hacia la placa
ecuatorial
i.Cul de las secuencias del ciclo celular es comn
a eucariotes?
1.
2.
3.
4.

G1,
G1,
G1,
G1,

G2, S, M y citocinesis
M, G2, S y citocinesis
S,, M, G2 y citocinesis
S, G2,M y citocinesis

j. Las protenas que forman complejos con el ADN o nucleosomas se llaman :

1. Kinasas
2. Proteasas
3. Fibras del huso
4. Histonas.
k. Antes de la divisin celular , cada cromosoma se replica o duplica su material gentico .
Los productos estn conectados por un centrmero y se denominan :
1.
2.
3.
4.

Cromosomas hermanos
cromosomas homlogos
comosomasa sexuales
cromtidas hermanas