Tcnica de Cultivo LEB

La muestra utilizada para los cultivos es mdula sea o sangre perifrica

anticoagulada con heparina. En el caso de que la muestra sea una biopsia de ganglio u
otro material biolgico siempre debe ser remitido en un recipiente con solucin fisiolgica
estril.
Para las muestras de sangre perifrica y mdula sea se realizan dos cultivos, 24hs y
ON para la mayora de las patologas, excepto las Leucemias Agudas que requieren
adems de un cultivo Directo. Para Linfoma del Manto, Leucemia Linfoctica Crnica
(LLC) y Mieloma Mltiple se requieren cultivos de 96 hs estimulados con Pokeweed (PW),
y los Sndromes Linfoproliferativos T se estimulan con Phytohemaglutinina (PHA) y se
cultivan durante 72 hs. Las muestras de ganglios se cultivan por 24 y 48 hs. En estos tres
ltimos casos se recomienda el agregado de antibiticos (penicilina + anfotericina), lo
cual siempre es una opcin si se considera que la muestra est contaminada, pero se trata
de evitarlo ya que inhibe el crecimiento y la proliferacin celular.
REACTIVOS Y MATERIALES
Solucin hipotnica: disolver 2,76 g de cloruro de potasio en 500 ml de agua
destilada. Mantener en un recipiente con tapa hermtica en la estufa a 37 C. Para su uso
colocar en una piseta mantenida en la estufa a 37 C.
Fijador: mezcla de metanol y cido actico (3:1) colocado en un frasco hermtico. Es
importante que el fijador sea fresco y est bien fro al momento de utilizarlo. Colocar en el
freezer al menos 30 minutos.
Medio de cultivo:
RPMI Medium 1640 con L-glutamina sin bicarbonato de sodio.
GIBCO (Invitrogen Corporation) Cat No. 31800-014
Para su preparacin colocar el medio en polvo en una probeta de 1 L y agregar 500
ml de agua destilada. A eso se le agrega 26,2 ml de bicarbonato de sodio lquido (8,4 g%).
Llevar a pH 7.0 con cico clorhdrico 0,2 N y completa 1 L con agua destilada. Filtrar y
fraccionar en frascos estriles de 100 ml, con tapones de gomas estriles, tapas metlicas
selladas y cubiertos los picos con papel de aluminio. Dejar durante la noche bajo luz UV,
colocar 24 hs en estufa a 37C, y comprobar que ninguno de los frascos est contaminado.
Mantener en heladera hasta el momento de usarlos. Para su utilizacin se atraviesa la
tapa con una aguja estril y se extrae el medio con una jeringa de 10 ml.
Suero Fetal Bovino:
NATOCOR irradiado
Filtrar y fraccionar en frascos estriles de 100 ml, con tapones de gomas estriles,
tapas metlicas selladas y cubiertos los picos con papel de aluminio. Dejar durante la
noche bajo luz UV, colocar 24 hs en estufa a 37C, y comprobar que ninguno de los frascos
est contaminado. Mantener en heladera hasta el momento de usarlos. Para su utilizacin
se atraviesa la tapa con una aguja estril y se extrae el medio con una jeringa de 5 ml.

Colchicina:
SIGMA C3915-1G
Aproximadamente 95% (para reconstituir).
Preparacin: 1 mg/10 ml de agua destilada estril.
Filtrar y fraccionar en un frasco estriles de 100 ml, con tapn de goma estril, tapa
metlica sellada y cubierto con papel de aluminio. Dejar durante la noche bajo luz UV,
colocar 24 hs en estufa a 37C, y comprobar que no est contaminado. Mantener en
heladera hasta el momento de usarla, envuelto completamente en papel de aluminio. Para
su utilizacin se atraviesa la tapa con una aguja estril y se extrae el medio con una jeringa
de insulina.
Glutamina:
Solucin madre: 1,46 g en 50 ml de agua destilada.
Solucin de trabajo: tomar 1 ml de solucin madre y llevarlo a 100 ml con agua
destilada. Filtrar y fraccionar en tubos eppendorf estriles, que sern guardados en el
freezer hasta ser utilizados. La glutamina no se puede recongelar, por lo cual es
conveniente retirar del freezer slo la cantidad necesaria.
Estimulantes:
PW: SIGMA L9379-5MG
Se resuspende en 5 ml de solucin fisiolgica estril y se fracciona de a 20 ul.
Guardar a -20C.
Pha: GIBCO Cat No. 10576-015
Se resuspende en 5 ml de agua destilada estril y se fracciona de a 50 ul. Guardar a
-20C.
PROCEDIMIENTO
Siembra:
I. Sacar el medio de cultivo, el suero, la glutamina y la colchicina de la
heladera y dejarlos tomar temperatura ambiente.
II. Limpiar la superficie de la cmara de flujo con alcohol al 70% y dejar 10
minutos con luz UV.
III. Encender el mechero y colocarse los guantes. Rociarse las manos con
alcohol luego de colocados los guantes.
IV. En cada tubo colocar: 5 ml de medio, 1 ml de suero fetal bovino y 100 ul
de glutamina. Adems agregar: para los ON una gota de punta de aguja de colchicina;
para los ganglios cuatro gotas de la mezcla de los antibiticos; estimulante en los casos en
que sea necesario (PW: 20 ul por cultivo; Pha 50ul por cultivo).
V. Sembrar la muestras.
Siempre que sea posible, en mdula sea y sangre perifrica, se separan los
leucocitos por el proceso de buffy coat. Esto no es posible cuando la muestra es muy
escasa o est muy diluida en el anticoagulante. Para ello la muestra, colocada en un tubo
estril con tapa hermtica, se centrifuga 10 minutos a baja velocidad. Luego se toma de la
capa de leucocitos (entre los glbulos rojos y el plasma) con una pipeta Pasteur estril al
momento de sembrar la muestra.

La cantidad de clulas que se siembran es de aproximadamente 10-15 millones por

cada cultivo, lo cual se puede estimar al sembrar la muestra entera. Si se realiza buffy
coat se siembran tres o cuatro gotas (de pipeta Pasteur) de la capa de leucocitos por tubo.
VI. Colocarlos en la estufa a 37 C. Controlar la temperatura de la estufa.
Cosecha:
I. Sacar la colchicina de la heladera para que tome temperatura ambiente.
II. Sacar los tubos de la estufa, y agregarles 100 ul de colchicina a cada uno,
excepto a los cultivos ON.
III. Colocar los tubos en la estufa a 37C durante 25 minutos.
IV. Centrifugar los tubos durante 10 minutos a baja velocidad.
V. Rotular una pipeta Pasteur por cada paciente cultivado y organizar una
gradilla donde los tubos de cada paciente ocupen una fila, colocando la pipeta en el
primer lugar.
VI. Ubicar los tubos en los lugares correspondientes de la gradilla y abrirlos
ordenadamente cuidando de no mezclar las tapas.
VII. Con la pipeta Pasteur correspondiente extraer el medio sobrenadante de
los tubos sin perder clulas.
VIII. Colocar 8 ml de solucin hipotnica en cada tubo y resuspender las
clulas con la pipeta Pasteur aspirando unas quince veces.
IX. Tapar los tubos con su tapa correspondiente y colocarlos en la estufa a 37
C durante 25 minutos.
A partir de este paso debe evitarse que los tubos estn abiertos para que el
fijador no se hidrate. Por lo tanto, abrirlos uno a uno y cerrarlos lo ms
rpidamente posible.
X. Agregar 1 ml de fijador a cada tubo abrindolos el menor tiempo posible.
Mezclar por inversin.
XI. Centrifugar 10 minutos a baja velocidad.
XII. Colocar nuevamente y de forma ordenada los tubos en la gradilla.
XIII. Abrir uno a uno, extraer el sobrenadante con pipeta Pasteur y agregar 8
ml de fijador. Agitar con la pipeta aspirando unas quince veces y cerrar nuevamente el
tubo.
XIV. Una vez realizado el procedimiento en todos los tubos colocarlos en el
freezer.
Extendido:
Los tubos se dejan en la heladera con el primer fijador hasta el momento de
extenderlos, entonces se lavan dos o tres veces con fijador hasta obtener un pellet blanco.
Para ello se centrifugan 10 minutos a baja velocidad, luego se extrae el sobrenadante con
pipeta Pasteur y se resuspende el pellet con fijador fresco.
Los vidrios para extender deben dejase hasta el momento de extender sumergidos en
alcohol-ter (4:1), y se secan con un pao de algodn o un papel tissue cuidando de no
dejar partculas sobre el vidrio.
Una vez rotulados los vidrios se extienden dos o tres gotas con el vidrio en un ngulo
de 45 de forma homognea y se dejan secar inclinados.
NOTA: realizar un lavado con fijador fresco antes de reextender si los tubos han
permanecido ms de un da en el freezer.