Pontificia Universidad Catlica de Chile

Facultad de Ciencias Biolgicas

Departamento de Gentica Molecular y Microbiologa
BIO151E-1 - Biologa de Microorganismos

Informe n1:
Informe prctico de procedimientos bsicos
en el laboratorio, morfologa bacteriana y
microbiota ambiental y patgena.

Gabriel Sotelo Salas

Profesora Susan Bueno
Instructora: Loreani Noguera
Ayudante en jefe: Omar Vallejos
Seccin 1, Mesn 3, Grupo 2
Fecha de entrega: 24/10/2016

Introduccin.

El trabajo en laboratorio referente al estudio de la microbiologa es esencial para la formacin de

conocimiento en esta rea de la Biologa. Las buenas prcticas en el laboratorio garantizan la
obtencin de resultados confiables, especialmente en este campo, el cual requiere una rigurosa
ejecucin de los procedimientos. Para asegurar una buena prctica en el laboratorio, la
esterilizacin de materiales y el ambiente, es esencial. Esta abarca varios mtodos de eliminacin
total de todo tipo de organismos. Una esterilizacin deficiente o manipulacin incorrecta de
materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones, resultados errneos o prdida del
material biolgico [2].
El mantenimiento de los microorganismos que se desean estudiar e identificar en el laboratorio se
realiza mediante distintos tipos de instrumentos y tcnicas. Los microorganismos para crecer
requieren una gran variedad de nutrientes orgnicos e inorgnicos, los cuales se suministran
mediante distintos medios de cultivo [3]. Existen varios tipos de medios de cultivo segn el
microorganismo que se quiera cultivar y sus demandas nutricionales, medios que estn hechos con
los requerimientos nutricionales generales para el crecimiento de microorganismos llamados
medios para fines generales. Tambin, hay medios que favorecen el crecimiento de
microorganismos con requerimientos nutricionales particulares, estos son llamados medios
enriquecidos y un ejemplo de estos es el agar Sangre. Los medios llamados selectivos son aquellos
que favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos, inhibiendo el crecimiento de otros. Un
ejemplo de estos medios es el agar Mc Conkey, el cual favorece el crecimiento de bacterias Gram
negativas e inhibe el crecimiento de Gram positivas. Los medios diferenciales son los cultivos que
diferencian entre grupos de microorganismos, y adems, permite hacer una identificacin tentativa
segn las caractersticas biolgicas de este. Un ejemplo de este es el ya mencionado agar sangre,
que permite diferenciar bacterias hemolticas de las no hemolticas [4], siendo las hemolticas
microorganismos que producen hemolisinas, las cuales lisan los hemates en este medio. El tipo de
hemlisis se puede clasificar segn el halo presente alrededor de las colonias, puede ser alfa si se
observa un halo verdoso, beta si se observa un halo claro alrededor de la colonia, o gamma si es que
no existe hemlisis [11].
El mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio tiene como fin su estudio e
identificacin, tanto a nivel individual o microscpico como a nivel colonial. Es posible identificar a
qu especie corresponde cierta colonia debido a su forma y aspecto caracterstico en un cultivo,
esto es, su forma, su elevacin o el margen que tienen en el agar [5]. Para identificar las
caractersticas microscpicas de los microorganismos es necesario usar diversas tcnicas de tincin
y observar las muestras bajo el microscopio. Existen gran variedad de colorantes, los cuales son
sustancias capaces de dar color a clulas, tejidos fibras, etc. Adems, estos permiten hacer visibles
a los objetos microscpicos o transparentes, revelar la forma o tamao de lo observado y producir
ciertas reacciones qumicas especficas [6]. Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando
toda la muestra se tie de un mismo color con un solo colorante, o diferencial, cuando se utiliza ms
de un colorante en la muestra [6]. Una de las tinciones ms utilizadas es la tincin Gram, la que

constituye la base para separar los principales grupos de bacterias, es decir, Gram positivas y Gram
negativas [7]. Esta tcnica depende de la capacidad de ciertas bacterias para retener un complejo
de cristales violeta y de yodo con los peptidoglucanos presentes en la pared celular despus de un
breve lavado con alcohol o acetona. Las bacterias Gram positivas retienen este complejo y las Gram
negativas no, las cuales se vuelven a teir con safranina (colorante de color rojo). As, las bacterias
Gram positivas adquieren un color violceo y las Gram negativas un color rojizo [8].
Las tinciones son tcnicas altamente efectivas en la identificacin de microorganismos en un cultivo,
pero estas presentan ciertas limitaciones que se presentan de manera especfica y ms evidente en
ciertos microorganismos. Los test bioqumicos permiten ampliar el espectro de identificacin de
microorganismos, no slo basndose en rasgos fenotpicos, sino en los aspectos moleculares del
microorganismo [9]. Algunas pruebas de identificacin son el test de la catalasa, la cual reconoce
bacterias que sintetizan la enzima catalasa. Esta prueba se realiza aadiendo perxido de hidrgeno
a la muestra, lo cual se hidroliza en agua y Oxgeno molecular, liberando ciertas burbujas de la
muestra [10]. Otro test bioqumico de gran importancia, es el test de la coagulasa, el cual permite
diferenciar S. aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus, por su capacidad de coagular el
plasma por la accin de la enzima coagulasa.
Las actividades en el laboratorio tienen como objetivo conocer e identificar los materiales de
presente en ste, adems de aprender a manipularlos cuidando su esterilidad. Tambin
familiarizarse con cultivos bacterianos de diversas procedencias y describirlos como tambin
diferenciarlos mediante criterios macroscpicos y microscpicos por medio de tinciones y pruebas
bioqumicas.

Materiales y mtodos.

-Materiales:
-Utensilios de laboratorio: Microscopio ptico, Aceite de inmersin, Asa metlica, Asa Pasteur,
Rastrillo, Placa de Petri, Mechero Bunsen, Hisopos, Kit test Catalasa, Cubreobjetos y Portaobjetos,
Tubos de ensayo.
-Medios de cultivo: Placa de agar corriente, Placa de agar McConkey, Placa de agar Sangre.
-Cepas bacterianas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus
-Muestras: Corporal, Nasofarngea y Ambiental.
-Compuestos qumicos: Safranina, Cristal Violeta, Lugol, Alcohol-acetona, Fucsina, Verde Malaquita,
Tinta china, Alcohol 70%.

Mtodos:
Los mtodos aplicados se especifican en la gua de trabajos prcticos [1]

Resultados

Los resultados presentados en la tabla I se obtuvieron a travs de la observacin en placas de agar

(Staphylococcus aureus y Bacilus cereus en agar corriente y Escherichia coli en agar Mc Conkey) y la
posterior preparacin de un frotis de cada muestra para realizar una tincin Gram, de las cuales se
desprenden las caractersticas microscpicas de las muestras al observarlas en el microscopio.

Tabla I. Observaciones mediante anlisis de las colonias en cultivo de los microorganismos S. aureus, B. cereus y E. coli y
mediante tincin Gram y posterior observacin al microscopio.

Microorganismo
Afinidad tintorial
(Gram positiva o Gram
negativa)
Morfologa
Agrupacin

Staphylococcus
aureus

Bacilus cereus

Escherichia coli

Gram +

Gram +

Gram -

Coco

Bacilo

Coco

Staphylococcus

Streptococcus

Streptococcus

Hemlisis en Agar
Sangre
Crecimiento en agar
Mc Conkey
Lac+ o Lac-

Alfa

Beta

Gamma

No

No

Lac +

Forma de la colonia

Puntiforme

Irregular

Color de la colonia

Blanco

Blanco

Elevacin de la colonia

Plano

Plano

Simbologa: - ; negativo, + ; positivo, / ; no aplica para esa categora

Puntiforme
Rosado
Convexo

Los resultados mostrados en la tabla II se obtuvieron a travs de las observaciones de placas de agar
de una muestra Nasofarngea, corporal y ambiental. Luego de realizar un anlisis macroscpico a
los cultivos, se realiz un frotis con cada muestra y se realiz tincin Gram, la que fue analizada al
microscopio.

Tabla II. Observaciones mediante el anlisis de colonias en cultivo de muestras Nasofarngea, Corporal (ombligo) y
ambiental (zapatilla) y mediante tincin Gram y posterior anlisis al microscopio.

Muestra

Nasofarngea

Afinidad
tintorial
(Gram positiva o Gram
negativa
Morfologa
Agrupacin
Hemlisis en sangre

Corporal (ombligo)

Ambiental (zapatilla)

Gram +

Gram -

Gram -

Cocos

Cocos

Bacilos

Staphylococcus

Staphylococcus

Streptococcus

Alfa, Beta, Gamma

Gamma

Crecimiento en Agar
Mc Cokey
Lac + o LacForma de la colonia

Puntiforme

Irregular

Puntiforme

Color de la colonia

Amarillo

Blanca

Crema

Elevacin de la colonia

Convexa

Convexa

Convexa

Pureza de la muestra

Impura

Impura

Impura

Simbologa: + ; positivo, - ; negativo, / ; no aplica para esa categora.

En la tabla III se muestran los resultados obtenidos al realizar los test bioqumicos de la catalasa y
coagulasa a la muestra Nasofarngea mencionada anteriormente.

Tabla III. Anlisis de muestra Nasofarngea con los test Bioqumicos de Coagulasa y Catalasa.

Muestra Nasofarngea
Simbologa: + ; positivo , - ; negativo.

Coagulasa
-

Catalasa
+

Discusin
Las observaciones macroscpicas realizadas a las diversas muestras (tabla I y tabla II) se hicieron con
un anlisis simple a cada cultivo disponible [4], por lo que la forma, elevacin y color de la muestra
son observaciones que estn ligadas a la percepcin del sujeto que estn estudiando la muestra.
Esto cambia al estudiar los microorganismos con tcnicas de tincin o test bioqumicos, debido a
que los resultados presentados por estas tcnicas son ms evidentes y menos sujetos a la
percepcin del individuo que las estudia.
En los resultados se observa en uno de los recuadros un indicador lactosa positivo y lactosa negativo
(tabla I y tabla II), esto se refiere a la capacidad de ciertas bacterias, en un cultivo de agar Mc Conkey,
a fermentar la lactosa en el medio en el cual se encuentra, ya que este proceso llevado a cabo por
las bacterias produce colonias de tonos rojizos, a diferencia de las que no lo hacen, que forman
colonias incoloras [11]. A modo de resumen, las bacterias capaces de fermentar lactosa son Lac
positivo y las que no son Lac negativo, lo que destaca el carcter del agar Mc Conkey como medio
de cultivo diferencial [11].
En la tabla I se aprecia que en los resultados correspondientes a la afinidad tintorial, morfologa y
agrupacin (tabla I) de las bacterias analizadas (S. aureus, B. cereus, E. coli), existe una gran
correspondencia con los datos observados en la literatura cientfica en estas categoras [12] [13]
[14]. Esto quiere decir, que los procedimientos realizados para obtener estos resultados fueron
correctamente llevados a cabo.
En la tabla II se observa un recuadro que categoriza la pureza de cada muestra (tabla II), esto se
refiere a que si el cultivo presenta un solo microorganismo se tiene una muestra pura, o si el cultivo
contiene varias colonias de microorganismos distintos se tiene una muestra impura [15]. Se puede
observar en los resultados referentes a la pureza de cada cultivo (tabla II) que todas las muestras
son impuras, debido a que existe gran diversidad de microorganismos en la microbiota ambiental y
corporal [18]. Adems, como se aprecia en los resultados de la muestra nasofarngea (tabla II),
existen 3 tipos de hemlisis (alfa, beta, gamma) en distintos sectores del cultivo [11], esto se debe
a la impureza de la muestra, que explica la existencia de una poblacin mixta con distintos patrones
de hemlisis. Cabe destacar, que si es deseado obtener un cultivo puro es necesario asegurarse de
la esterilidad de los materiales y realizar sucesivos aislamientos de la muestra [15].
Los test bioqumicos (catalasa y coagulasa) realizados en el prctico de laboratorio fueron
ejecutados con el fin de diferenciar e identificar los microorganismos presentes en la muestra
nasofarngea. En primer lugar, se realiz el test catalasa que permite diferenciar microorganismos
Staphylococcus de Streptococcus, siendo el resultado positivo para Staphylococcus y el negativo para
Streptococcus. Si el test resultaba positivo, significaba que exista Staphylococcus en la muestra, lo
que permita realizar posteriormente el test de coagulasa, que diferencia Staphylococcus aureus
(resultado positivo) de otros tipos de Staphylococcus (resultado negativo) [16]. En los resultados
obtenidos (tabla III) se observa que el test de la coagulasa aplicado a la muestra nasofarngea, da un
resultado negativo, lo cual indica que los microorganismos presentes en la muestra no estn
asociados a cierto grado de patogenicidad que les confiere esta enzima a los microorganismos
coagulasa positivos. Esto se debe a que esta enzima coagula el fibringeno en el plasma, lo que
protege al agente patgeno frente a la fagocitosis, aislndolos de otras defensas del husped [17].
Cabe destacar que microorganismos coagulasa negativos son parte de la microbiota normal de la
cavidad nasofarngea [18], aunque es importante recordar que los cultivos estudiados eran impuros,
por lo que es posible que slo cierta parte de la muestra haya tenido las caractersticas mencionadas
y otro sector de la muestra no.

Conclusin

Mediante las actividades realizadas en las diversas actividades en el laboratorio, se aprendi a

reconocer y a manipular diversos instrumentos presentes en este, teniendo en cuenta que la
esterilizacin de estos es esencial para la obtencin de resultados confiables y reproducibles.
Adems, es importante destacar el aprendizaje obtenido relacionado a los distintos tipos de cultivos,
sus propiedades y cmo aparte de mantener a los microorganismos que se quieren estudiar en
condiciones favorables para su crecimiento, estos entregan informacin relevante acerca de la
naturaleza de la muestra, como por ejemplo, si el microorganismo es capaz de degradar lactosa o
de lisar glbulos rojos. Tambin, es importante mencionar el conocimiento adquirido acerca de
diferentes tcnicas de tincin y como llevarlas a cabo, lo relevante que son al entregarnos
informacin que no se puede obtener mediante un anlisis a simple vista de los cultivos, y como a
travs del tiempo han sido una de las herramientas ms tiles al momento de clasificar organismos.
Finalmente, se destaca la utilidad de los test bioqumicos aplicados a las muestras y como estos
entregan informacin molecular de los microorganismos que se desean estudiar.

Bibliografa.

[1] Gua de trabajos prcticos BIO151E- Biologa de Microorganismos, Vallejos O., Bueno S., Pardo
C., Pontificia Universidad Catlica de Chile, 2016, pg. 34-35, 48, 57.
[2] Manual de prcticas de laboratorio Microbiologa general, Aquihuatl M., Volke T., Prado L.,
Universidad Autnoma Metropolitana, 2012, pg. 11.
[3] Brock Biology of microorganism, Madigan, M.T., Martink, J.M., 12 edicin, Pearson, 2006, pg.
121.
[4] Microbiologa de Prescott, Harley y Klein, Willey, J.M., Sherwood, L.M., Woolverton, C.J., 7
edicin, Mc Graw-Hill, 2008, pg. 111.
[5]Referencia 4, pg. 114.
[6] Las tinciones bsicas en el laboratorio de microbiologa, Lpez L., Hernndez M., Revista de
investigacin en discapacidad, vol.3, 2014, pgs. 10-11.
[7] Microbiologa mdica, Murray P., Rosenthal K., Pfaller M., 7ma edicin, Elsevier, 2013, pg. 21.
[8] Jawetz, Melnick, & Adelbergs Medical Microbiology, Brooks G., Morse S., Carroll K., 25
edicin, Mc Graw Hill, 2010, pg. 21.
[9] Mtodos de identificacin bacteriana en el laboratorio de microbiologa, Fernndez A., Garca
C., Saz J., SEIMC, 2010, pg. 3.
[10] Referencia 9, pg. 6.
[11] Referencia 4, pg. 900.
[12] Staphylococcus aureus: Microbiologa y aspectos moleculares de la resistencia a meticilina,
Gil M., Revista Chilena de Infectologa, 2010, pg. 145.
[13] Bacillus Cereus y su papel en las intoxicaciones alimentarias, Prez I., Revista Cubana de salud
pblica, 2012, pg. 98.
[14] The versatile strategies of Escherichia coli: a mini review, Sousa C.P., J. Venom. Anim. Toxins
incl. Trop. Dis, 2006, pg. 365.
[15] Microbiologa, Stanier R., Villanueva J., Revert, 1996, pg, 18.
[16] Referencia 1, pg. 56- 57.
[17] Referencia 4, pg. 856.
[18] Referencia 4, pg. 755.