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Facultad de Qumico Farmacobiologa UMSNH.

Laboratorio
de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.

PRLOGO.

El presente manual incluye ejercicios de laboratorio tendientes a proporcionar una visin


panormica acerca del mundo microscpico.
En virtud de la diversidad de los microorganismos sobre el planeta, resulta difcil para el
hombre comprender la naturaleza ntima de stos, sin una nocin previa de la
Microbiologa; por esta razn, el propsito fundamental de este manual, es introducir al
estudiante en el conocimiento de la Microbiologa a travs de la experimentacin, que lo
llevar hacia la observacin y comprensin de las caractersticas bsicas de los
microorganismos, de su interaccin con los vegetales, animales y el hombre, as como
de la vida en general.
En la actualidad es necesario familiarizarse con todos los grupos de microorganismos,
no solo desde el punto de vista terico, sino tambin desde el prctico. Con la seguridad
de que un estudiante que domine el conjunto de tcnicas contenidas en el citado
documento, podr desarrollarse con xito en la fase siguiente de su formacin
acadmica.
Al final de cada ejercicio se incluye un cuestionario que contiene preguntas relacionadas
con el experimento, las cuales en algunos casos requieren de un mejor razonamiento e
investigacin. Deben de contestarse recurriendo a la consulta de las principales obras de
Microbiologa o de otros textos complementarios. Su resolucin hablar del inicio en el
dominio de una de las ramas ms importantes de la Biologa moderna.

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REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA.

1. El estudiante debe ingresar al laboratorio con bata puesta, limpia y debidamente


abotonada.
2. Presentarse con las uas cortas y sin pintar, tambin con el cabello recogido.
3. No se permitir el paso a quienes se presenten con short, falda, pantalones rotos,
piercing y zapatos que no sean cerrados.
4. No est permitido el uso de telfonos celulares durante las sesiones de laboratorio, de
igual forma no se permite el ingreso de alimentos.
5. Dirigirse en todo momento con respeto hacia los profesores, instructores y compaeros,
evitar el uso de palabras antisonantes.
6. El estudiante deber encontrarse en el rea de trabajo cinco minutos antes del inicio de
la sesin.
7. Se deber limpiar la superficie de la mesa de trabajo en una solucin germicida, al inicio
y al final de cada prctica.
8. Antes de ingresar al laboratorio, leer el texto de prctica que va a realizar y organizar
su plan de trabajo con todo cuidado. Entender cmo debe efectuar cada paso analizado
a su vez, los principales fundamentos que se ponen en el relieve.
9. Cada sesin de laboratorio deber iniciarse con una corta explicacin y periodo de
instrucciones. No inicie su trabajo hasta que haya recibido las indicaciones. Pregunte
cuando no entienda el procedimiento o la finalidad de algn experimento; la buena
tcnica de laboratorio depende fundamentalmente de que conozca que es lo que se va a
realizar.
10. Debido a que algunos microorganismos con los que va a trabajar son patgenos en
potencia, es necesario desarrollar tcnicas de asepsia al manejarlos y transferirlos. Evite
el contacto de la boca con las manos y las operaciones como fumar, comer o humedecer
las etiquetas con la lengua.
11. No guarde material de laboratorio ni cultivos microbianos en las bolsas de la bata.
12. El estudiante debe estar provisto del material de trabajo, de lo contrario no podr
permanecer en el laboratorio.
13. Deber concentrarse en su actividad evitando charlas y comunicacin o voces con los
vecinos de las otras mesas.
14. El material usado no contaminado como: algodn, cerillos, papel, etc., se depositar en
los recipientes para basura diseados ex profeso, no arrojar basura al piso, ni colocarla
en los gabinetes, cajones del rea de trabajo o vertederos.
15. Cuando de manera accidental se derrame material contaminado, deber tratarse con un
germicida adecuado (fenol, benzal, etc.), dejando que acte el tiempo necesario antes
de proceder a limpiar el rea contaminada.
16. El asa debe de esterilizarse en la flama del mechero, antes y despus de su uso.

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17. Al concluir la prctica, el estudiante debe separar el material contaminado, para


trasladarlo al rea de esterilizacin y lavado. Cerrar y colocar los reactivos debidamente
ordenados en el almacn.
18. Comprobar que las llaves de gas y agua estn cerradas antes de salir del laboratorio.
19. Anote cuidadosamente todas las observaciones en el momento en que se lleven a cabo.
El examen de laboratorio se referir no solo a la informacin proporcionada en este
manual, sino tambin a sus propias observaciones y deducciones.
20. Conteste las preguntas que estn al final de cada ejercicio utilizando las hojas para
resultados.
21. Informe inmediatamente al instructor de cualquier accidente, tales como: cortaduras,
quemaduras, derrames de sustancias, cultivos o medios.
22. Tome todas las precauciones posibles para evitar accidentes.

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Primer bloque de evaluacin.


Prctica No. 1. Revisin de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.
Prctica No. 2. Preparacin y desinfeccin del material de laboratorio.
Prctica No. 3. Preparacin de medios de cultivo.
Prctica No. 4. Contaminacin ambiental y morfologa colonial.
Prctica No. 5. Siembra y desarrollo en diferentes medios de cultivo.

Segundo bloque de evaluacin.


Prctica No. 6. Microscopia.
Prctica No. 7. Forma y tamao.
Prctica No. 8. Tincin simple.
Prctica No. 9. Tincin diferencial Gram.
Prctica No. 10. Tincin diferencial de Zielh Neelsen.
Prctica No. 11. Tincin selectiva de cpsula.
Prctica No. 12. Tincin selectiva de esporas.
Tercer bloque de evaluacin.
Prctica No. 13. Metabolismo microbiano del nitrgeno.
Prctica No. 14. Metabolismo microbiano del carbono.
Prctica No. 15. Accin de los antibiticos sobre el crecimiento bacteriano.

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Primer bloque de evaluacin


Prctica No. 1. Revisin de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.
Prctica No. 2. Preparacin y desinfeccin del material de laboratorio.
Prctica No. 3. Preparacin de medios de cultivo.
Prctica No. 4. Contaminacin ambiental y morfologa colonial.
Prctica No.. 5 Siembra y desarrollo en diferentes medios de cultivo.

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PRCTICA No. 1
Revisin de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Proteccin ambiental
Proteccin Salud - Residuos peligrosos biolgico-infecciosos - Manejo y
especificaciones.

OBJETIVO.
Comprender los fundamentos y particularidades de la NOM-087-SEMARMAT-SSA12002, para conocer la importancia de su cumplimiento en el laboratorio.

INTRODUCCIN.
En la antigua Grecia, concretamente en los escritos de Hipcrates, ya se haca patente
la importancia de la salud como representacin de la unidad del ser humano con su
entorno, es decir; que para alcanzar y conservar la salud se tendra que respetar y
conservar el medio ambiente.
Cumplir con tal propsito ha representado un verdadero reto y ha significado la
aplicacin de las ms diversas tcnicas y estrategias para dar solucin a esta
problemtica.
En Mxico durante la poca de la Colonia, ya se aplicaban medidas para evitar la
propagacin de la viruela durante la epidemia que ocurri en esos aos. Para evitar la
transmisin de la infeccin, se orden poner cal viva adentro de los atades de los
cadveres de los enfermos y posteriormente enterrarlos.
En 1847, el mdico Ignaz Semmelweis concluy que la principal causa de las fiebres
puerperales era la exploracin de las pacientes realizada por estudiantes de medicina
cuyas manos estaban impregnadas de los restos de las autopsias de las fallecidas, la
mayora por la misma enfermedad. Con estas observaciones se instituy que los
mdicos deban incorporar a su prctica la obligacin del lavado de manos a fin de
eliminar los residuos infecciosos.
Entre 1980 y 1990 se da el surgimiento de la epidemia del SIDA a nivel mundial, suceso
con el que se pone de manifiesto que deban emprenderse acciones en materia de los
desechos slidos de los hospitales como riesgos potenciales para la salud. El factor
detonante de tal necesidad surge tras el hallazgo de jeringas en playas tursticas de la
Costa este de Estados Unidos, los medios de comunicacin publicaron la noticia
suponiendo que los desechos provenan de hospitales y solicitaron se tomaran medidas
preventivas ante el grave problema de riesgo de contagio de SIDA, hepatitis y otras
infecciones originadas en los centros de atencin mdica.

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El Congreso de Estados Unidos elabor y aprob un acta donde se establecieron


restricciones y precauciones severas para el manejo de la basura hospitalaria. Dicha
legislacin se caracteriz por ser compleja y costosa.
En Mxico, tambin se tomaron acciones en ste mismo sentido y, fue a travs de los
Institutos Nacionales de Salud que se dio inicio a un programa formal de vigilancia y
control, editando en 1989 el Manual de control de infecciones nosocomiales para
hospitales generales y de especialidad.
Poco despus en 1991, la Direccin General de Salud Ambiental de la Secretara de
Salud da inicio a los trabajos destinados a elaborar una norma de Residuos Peligrosos
Biolgico-Infecciosos (RPBI), que finalmente es emitida por la Secretara de Medio
Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT).
Fue en 1995 que se public en el Diario Oficial de la Federacin la primera norma para
regular el manejo y tratamiento de los RPBI, la NOM-087-ECOL-1995. El objetivo
fundamental de sta fue proteger al personal de salud de los riesgos relacionados con el
manejo de estos residuos, as como proteger el medio ambiente y a la poblacin que
pudiera estar en contacto con estos residuos dentro y fuera de las instituciones de
atencin mdica.
Esta primera Norma catalogaba como RPBI a una enorme cantidad de residuos que en
realidad no representaban ningn riesgo, lo que se tradujo en una importante produccin
de RPBI y en consecuencia, signific un enorme gasto para su manejo.
Tras una revisin exhaustiva y con la inclusin de varias mejoras, se public en el Diario
Oficial de la Federacin, el 17 de febrero del 2003 la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002,
Proteccin ambiental Salud ambiental Residuos peligrosos biolgico-infecciosos
Clasificacin y especificaciones de manejo; en la que se replantean los criterios para la
identificacin de RPBI, sin perder el objetivo inicial de la proteccin a la salud y al
ambiente. Por lo tanto, residuos que en el pasado fueron considerados RPBI, ahora no
se consideran como peligrosos por lo que nicamente habran de disponerse en sitios
autorizados por el municipio, de conformidad con la NOM-083-SEMARNAT-2003, dicha
accin repercute en una disminucin de los costos por su disposicin final, pudiendo
utilizar mejor los recursos para la adquisicin de otros materiales y equipos necesarios
para la atencin mdica de estos establecimientos.
Otro de los cambios significativos que observa la nueva Norma, es la inclusin de la
Secretara de Salud como rgano regulador.
Existen dos tipos de normas: Las Normas Mexicanas (NMX), y las Normas Oficiales
Mexicanas (NOM), siendo la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 de ste ltimo tipo. La
diferencia radica en que las Normas Mexicanas, slo son lineamientos de carcter
recomendatorio, pero una vez adoptadas son obligatorias, por su parte; las Normas
Oficiales Mexicanas se caracterizan por tener carcter obligatorio.

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El 14 de septiembre de 2005 se publicaron en el Diario Oficial de la Federacin, las


Bases de Colaboracin que celebran la Secretara de Medio Ambiente y Recursos
Naturales, con la participacin de la Procuradura Federal de Proteccin al Ambiente
(PROFEPA), y la Secretara de Salud (SALUD), con la participacin de la Comisin
Federal para la Proteccin contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS), para coordinar
esfuerzos y vigilar el cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNATSSA1-2002. Proteccin ambiental Salud ambiental Residuos peligrosos biolgico
infecciosos Clasificacin y especificaciones de manejo.
MATERIALES.
1. Bolsas para RPBI.
3. Jeringas.
5. Capuchones para Vacutainer.

2. Contenedores de RPBI.
4. Agujas de Vacutainer.
6. Algodn.

METODOLOGA.
1. Realizar dibujos de los diversos contenedores y bolsas empleadas en el envasado de los
RPBI.
CUESTIONARIO.
1. Cul es el nombre completo de la Norma Oficial Mexicana en vigencia, que se revis
durante la prctica?
2. En qu radica la importancia de sta Norma Oficial Mexicana, y por qu el personal del
rea de la salud debe conocerla y cumplirla?
3. Qu significan las siglas RPBI?
4. Mencionar de acuerdo a sta NOM, la clasificacin general de los RPBI y el tipo de
envasado para cada uno de ellos.
5. Cules son las Secretaras y a su vez, las instancias de gobierno responsables de
vigilar el cumplimiento de sta NOM por parte de los establecimientos generadores y
terceros implicados?
6. Segn la NOM, cules son los niveles en que se clasifican los establecimientos
generadores de RPBI y, cul es el periodo de almacenamiento sealado para cada uno
de ellos?
7. Considerando el impacto ambiental, por qu se debe hacer un correcto manejo de los
RPBI?
8. Menciona tres ejemplos de contenedores de RPBI.
9. Describe 3 medidas de seguridad para realizar el manejo de RPBI dentro del
laboratorio.
10. Dibuja el Smbolo Universal de los RPBI.

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Lectura recomendada:
NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 Link:
http://www.cmic.org/comisiones/Sectoriales/medioambiente/Varios/Leyes_y
_Normas_SEMARNAT/NOM/Residuos%20Peligrosos/8.2003.pdf
Gua para el manejo de los residuos peligrosos biolgico infecciosos en unidades
de salud. Link:
http://www.promocion.salud.gob.mx/dgps/descargas1/influenza/mat/Guia_m
anejo_de_residuos_biologicos.pdf

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PRCTICA No. 2
Preparacin y desinfeccin del material de laboratorio.

OBJETIVO.
Conocer el material empleado en el laboratorio de Microbiologa y los procedimientos
necesarios de preparacin, limpieza y esterilizacin para su uso en el momento en que
requiera.

INTRODUCCIN.
El laboratorio de Microbiologa es un sitio habituado para el manejo y el estudio de los
microorganismos. El trabajo dentro del mismo ha de realizarse de acuerdo a estndares
tcnicos y de seguridad propios de un laboratorio de Microbiologa Clnica.
Es importante recordar que la finalidad del laboratorio de Microbiologa es determinar los
microorganismos presentes en la muestra, por lo que es preciso extremar precauciones
para evitar contaminaciones que den lugar a resultados errneos.
Cada uno de los materiales que se utilizan dentro del laboratorio de Microbiologa tiene
una funcin y uso que debe ser acorde a la tarea a realizar. Para el trabajo rutinario se
debe de disponer de aparatos e instrumental necesario para el correcto desarrollo de su
actividad. Es primordial que todos los recipientes, medios de cultivo y dispositivos de
siembra que se requieren en el estudio de los microorganismos sean estriles, es decir,
libres de vida microbiana. El instrumental empleado en el laboratorio es de diversos
materiales y pueden ser reciclables o de un solo uso. Los materiales que con ms
frecuencia se utiliza en el trabajo rutinario son: cajas, tubos de ensaye, matraces,
pipetas, etc.
El material a esterilizar debe estar perfectamente limpio para garantizar la reduccin de
la carga microbiana y, as contribuir a la efectividad del proceso de esterilizacin.
Los procedimientos de limpieza, desinfeccin y la posterior esterilizacin, son
indispensables para el correcto funcionamiento de zonas de trabajo donde se requiere
tener controlada la carga microbiana presente. Estos procesos son utilizados en los
diferentes establecimientos relacionados al rea de la salud tales como laboratorios,
consultorios, hospitales, quirfanos y clnicas.
Es fundamental contar con una tcnica apropiada para proteger el material que se ha
esterilizado a fin de evitar su contaminacin.
Los procedimientos comunes de esterilizacin incluyen el uso de calor, la filtracin y la
irradiacin.

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La esterilizacin es el proceso mediante el cual se logra la muerte de todas las formas


de vida microbiana incluyendo esporas, hongos y virus. Hay que recalcar que por muerte
se entiende como la prdida irreversible de la capacidad reproductiva del
microorganismo.

Esterilizacin por calor


Procedimientos por calor seco:
Horno.
Flama directa o calor directo.
Aire caliente.
Procedimientos por calor hmedo:

Ebullicin.
Calor efluente.
Pasteurizacin.
Ultrapasteurizacin.
Autoclave.

La esterilizacin sirve para objetos y productos inanimados, ya que su procedimiento es


capaz de acabar con la vida de los microorganismos y, por lo tanto, tambin puede
daar a las clulas de un organismo en cuestin.
Para el material, como las pipetas y placas Petri de vidrio, se usa la esterilizacin con
calor seco. Se mantiene la temperatura a 170 C durante una hora mientras el material
est dentro del esterilizador de aire caliente (horno). Para el material que se destruye
con el calor seco o por calor hmedo a elevadas temperaturas, se usa la esterilizacin
intermitente (tindalizacin). Se calienta el material durante 30 minutos a vapor fluyente
(100C), durante tres das sucesivos, dejndole a la temperatura ambiente en los
intervalos entre tratamientos. Debido a que es tedioso, este mtodo de esterilizacin no
resulta satisfactorio en la mayora de los casos.
Para la mayor parte de los medios, gomas y otros tipos materiales que se destruirn con
el calor seco se utiliza la esterilizacin con vapor a presin o tambin conocida como
calor hmedo. Estos materiales se esterilizan en el autoclave a 121C, durante 15 a 30
minutos, usando vapor a 15 libras de presin.
Varios materiales, por ejemplo; ciertos azcares y los sueros sanguneos, se destruyen
al calentarlos a temperaturas utilizadas normalmente para la esterilizacin. Para
materiales que son termolbiles, como son lquidos o substancias en solucin, puede
usarse la filtracin.
Los filtros en ste procedimiento eliminan las bacterias por dos caminos: mediante la
accin mecnica de calor, ejercida por los pequesimos poros, y por la adsorcin de los
microbios al filtro debido a la diferencia entre sus cargas elctricas.

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Un filtro, ampliamente utilizado en Microbiologa es el filtro de membrana. Consta de una


membrana de celulosa o de plstico con un tamao de poro suficientemente pequeo
(generalmente 0,45
.
Los filtros son de diferentes materiales:

De porcelana; el Chamberlain Pasteur.


De tierra de diatomea; Berkefeld y el Mantner.
Asbesto; Seitz.
De vidrio
Ester de celulosa, como Millipore y Polipore.

El xido de etileno y otros vapores se estn haciendo cada vez ms importantes como
agentes esterilizantes. Aunque muchos laboratorios no poseen el equipo especializado
que se necesita para demostrar ste procedimiento de esterilizacin gaseosa.
La desinfeccin ser la destruccin de microorganismos patgenos por agentes
qumicos que van desde el jabn, diferentes alcoholes, soluciones de yodo, soluciones
de sales orgnicas como el merthiolate, entre otros.
Existen varios mtodos por los cuales se puede hacer la validacin del procedimiento de
esterilizacin, estos son:
Mtodos de validacin de la esterilizacin.
Controles fsicos:
Se realiza a travs del control de los parmetros
del equipo en las distintas etapas del proceso,
por ejemplo; temperatura, presin y vaco.
Controles qumicos:

Se utilizan sustancias qumicas que viran de color


en contacto con el agente esterilizante.
Se colocan por fuera del paquete y distingue de
un material procesado de uno que no ha sido
procesado, Ejemplo: cinta testigo.

Externos:

Internos:

Detectan la correcta penetracin del agente


esterilizante.

Controles biolgicos:

Son dispositivos inoculados con bacterias, por


ejemplo esporas de Bacillus stearothermophylus.

MATERIAL:
1. Cajas de Petri.
2. Tubos de ensaye.
3. Matraces de Erlenmeyer de diferente capacidad.

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4. Pipetas volumtricas.
5. Pipetas Pasteur.
6. Papel de envoltura cortado de acuerdo al objeto para envolver.
7. Gasa cortada en cuadros pequeos.
8. Algodn.
9. Cinta masking.
10. Cinta testigo.
11. Mecheros Bunsen.
12. Mechero Fisher.
13. Gradilla.

METODOLOGA.
1. Mostrar el material comnmente utilizado en el laboratorio de Microbiologa.
2. Explicar los procedimientos de limpieza, preparacin y envoltura de cristalera para su
esterilizacin.
3. Exponer los utensilios para el manejo directo de los microorganismos, su conservacin y
su uso.

ACTIVIDADES
1.
2.
3.
4.

Los alumnos de cada equipo deben elaborar tapones para tubos y matraces.
Realizar el etiquetado del material para su almacenamiento o esterilizacin.
Realizar la envoltura de cajas de Petri, de pipetas y su rotulado.
Hacer diagramas y esquemas de las actividades realizadas en el laboratorio.
CUESTIONARIO.

1.

2.

Describir la definicin de los siguientes conceptos:


Limpieza
Esterilizacin.
Desinfeccin.
Asepsia.
Antisepsia.
Agentes antimicrobianos
Desinfectante.
Antisptico.
Menciona los factores que influyen en la velocidad de destruccin de
microorganismos.

los

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3. Cul es el fundamento de esterilizacin por calor seco?


4. Cul es el fundamento de la esterilizacin por calor hmedo?
5. Cul es la temperatura, presin y tiempo a la que se lleva a cabo la esterilizacin en
autoclave por calor hmedo?
6. Mencionar de qu manera se puede asegurar el control del proceso de esterilizacin.
7. Describa la tcnica de lavado de manos y su importancia.

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFA.

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PRACTICA

No. 3

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.

OBJETIVOS.

Identificar los componentes esenciales de los medios de cultivo (carbohidratos, lpidos,


protenas, vitaminas, minerales, etc.), as como el papel de estos en el metabolismo de
los microorganismos.

Comprender porque no todos los microorganismos tienen la capacidad para metabolizar


cualquier sustancia nutritiva.

Conocer que es un medio de cultivo, sus usos, sus variedades, as como aprender a
preparar algunos de ellos.

INTRODUCCIN:
Para que un microorganismo (M.O.) se pueda desarrollar, debe tomar del
ambiente, las sustancias necesarias, para la obtencin de energa que ser empleada
para la biosntesis y como consecuencia particular la reproduccin celular. A estas
sustancias se les llama Nutrientes.
Un medio de cultivo debe contener todos los nutrientes necesarios en cantidades
adecuadas para los microorganismos (M.O.). Muchos microorganismos son incapaces
de utilizar protenas como tales, y deben de proveerse de protenas degradadas
(pptido, proteasas, peptonas, aminocidos).
Extractos de carnes o carne parcialmente digerida son los nutrientes bsicos de
muchos medios. A algunos se les aaden: Carbohidratos y sales minerales. Estos
medios Basales pueden ser suplementados o enriquecidos con sangre, suero, plasma,
vitaminas o bien determinados aminocidos.
Los medios de cultivo varan ampliamente, de acuerdo con las necesidades particulares
de los organismos estudiados. A veces, se hace una distincin entre medios complejos y
definidos.
Medios complejos. Contienen lo necesario para el crecimiento, en forma cruda,
es decir que no se conocen todos los componentes de los medios ni se sabe las
cantidades exactas en que estn presentes. Muchos de los diversos tejidos de los
vegetales, carnes casena y clulas de levadura segn la sustancia de que se trate,
proporcionan fuentes ricas en polipptidos, aminocidos, vitaminas o sales minerales.
Ejemplos especficos de tales componentes de los medios son peptonas o triptonas, que
son hidrolizados enzimticos de protenas animales y el extracto de levadura, que es
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autolisado de levadura, rico en vitaminas del complejo B. en estos digeridos crudos


suelen estar presentes algunos carbohidratos, aunque muchos de los medios complejos
se suplementan luego con un azcar adicional, generalmente glucosa.
Medios definidos. Son aquellos que ofrecen lo que se requiere para el
crecimiento, en forma de productos qumicos relativamente puros y a una concentracin
conocida. Varan de acuerdo con las necesidades nutricionales de cada organismo en
particular. Los componentes esenciales de un medio para el crecimiento de hetertrofos
que no sean muy exigentes tales como Escherichia coli, son sales orgnicas y fuentes
de carbono y de nitrgeno, un medio definido adecuado para E. coli podra contener
NH4Cl, MgSO4, H2KPO4, HNa2PO4 y glucosa. Otros elementos esenciales, tales como el
hierro, manganeso y cobre, en general estn presentes en cantidades suficientes para el
crecimiento, como contaminantes de los productos qumicos. La glucosa proporciona
energa y una fuente de carbono y el cloruro de amnico sirve como fuente de nitrgeno.
Un hetertrofo ms exigente, carente de las posibilidades sintticas de E. coli, podra
requerir la adicin de varias vitaminas, aminocidos, purinas y pirimidinas.
Los medios de cultivo deben de estar ajustados a un pH adecuado. Esto se suele
hacer antes de la esterilizacin, aunque a veces debe realizarse a continuacin de la
esterilizacin.
Los medios de cultivo slidos incluyen algn agente solidificante. Roberto Koch
(1843-1910), introdujo el uso del agar, este se obtiene de las algas marianas de la
familia Rhodophyceae. El agar tiene la propiedad de ser soluble en agua, presentar
resistencia a la actividad de la mayora de los microorganismos, tiene un punto de fusin
a los 98C y solidifica entre los 42 a 45C.
La concentracin de agar en los medios de cultivo slidos es del 1.5% y en los
medios semislidos del 0.3 al 0.5%. Estos medios pueden disponerse en tubos o cajas
petri aunque comnmente los medios semislidos los tubos se colocan en tubos.
Segn el propsito para lo que son fabricados los medios de cultivo, se pueden clasificar
en:
1. Medios Basales. Bsicos o Generales:
Son medios simples que contienen en general los nutrientes esenciales para promover
el desarrollo a microorganismos poco exigentes nutricionalmente in vitro algunos
ejemplos son: Agar Nutritivo (A.N.), Caldo Nutritivo (C.N), Agar Soya Triptosa (T.S.A.),
Caldo Soya Tripticasa (T.S.C), Caldo Cerebro Corazn (B.H.I.), etc.
2. Medios Enriquecidos:
Son medios que han sido complementados con otros nutrientes, que proporcionan
Factores de crecimiento y cuya finalidad es promover el desarrollo de microorganismos
de requerimientos nutricionales ms exigentes (tal es el caso de aquellos medios de
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cultivo destinados para el aislamiento de microorganismos patgenos del hombre y


animales). En esta clasificacin se encuentran: Gelosa Sangre (G.S.) que es medio
basal; Agar Soya Tripticasa o Agar base para Sangre, adicionado de sangre de ovino u
otra especie. Gelosa Chocolate (G.Ch.) al igual que el medio anterior ocupa sangre en
su elaboracin a diferencia de que esta se adiciona cuando el medio tiene una
temperatura de 80C, con lo que se logra la liberacin de ciertas sustancias contenidas
en los eritrocitos, que son lisados debido a la accin del calor.
3. Medios Selectivos o Inhibitorios:
Cuando una muestra contiene una contiene gran cantidad de M.O., su crecimiento
puede ser excesivo, por lo que es necesario suprimir su desarrollo y al mismo tiempo
promover y/o seleccionar el crecimiento de los M.O. patgenos que pudieran
encontrarse en dicha muestra. Ejemplo: Agar Verde Brillante (A.V.B.), Agar SalmonellaShigella (S.S), selectivos para Salmonella y Shigella. El Agar Staphylococcus 110 (S110), Agar Sal y Manitol (M.S.A.), Agar Baird-Parker (B-P.A) y el Agar Chapman sirven
para Staphylococcus aureus fundamentalmente.
Se logra un medio selectivo variando la temperatura, atmsfera, pH, o adicionando
antibiticos al medio cumpliendo con el mismo propsito anteriormente mencionado.
4. Medios diferenciales:
Contienen sustancias qumicas o indicadores que permiten identificar con facilidad
algunos gneros o especies bacterianas por el aspecto caracterstico de las colonias y
su capacidad bioqumica. Ejemplo: Las Pruebas Bioqumicas.
5. Medios de Enriquecimiento:
Son muy utilizados en bacteriologa del tracto intestinal. Son generalmente caldos que
poseen un efecto inhibitorio sobre gneros bacterianos favoreciendo al mismo tiempo el
desarrollo de otro que interesa ms. Ejemplo: Caldo Selenito, Caldo Tetrationato, Caldos
selectivos para Salmonella. Caldo Steptocel para recuperacin de Streptococcus.
6. Medios de Transporte:
Sirven para mantener viables a los M.O. por un lapso corto de tiempo y que
posteriormente deseamos recuperar. Este tipo de medios contienen una capacidad
amortiguadora que facilita dicha viabilidad del M.O. sin que se multiplique, pero que
permanezca latente. Ejemplo: Cary-Blair (para Vibrio cholerae), Stuart (para muchos
M.O. de vas respiratorias), etc.

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7. Medios para Conservacin:


Son medios de cultivo por lo general medios basales, destinados para el mantenimiento
de bacterias, por ejemplo: Agar Base Sangre, pero sin sangre, para no hacerlo
enriquecido (B.A.B.), Agar Soya Tripticasa (T.S.A.), Agar Casoy, etc., estos medios
deben estar desprovistos de carbohidratos, esto es con el propsito de que el medio no
se acidifique y las bacterias no mueran; as como cuando tambin se desea ensayar
pruebas posteriores que de alguna manera afectaran por la presencia de esos
azcares. Para ciertas bacterias ms exigentes algunos de estos medios llevan como
complementos nutricionales para que el M.O. sea viable. Cuando se tiene perfectamente
bien aislada e identificada una bacteria y se desea conservar empleando uno de estos
medios y dependiendo del M.O. duraran en conservacin de varias semanas, o uno y
hasta seis meses.
MATERIAL:
1. Agar base para sangre.
2. Agar nutritivo.
3. Caldo nutritivo.
4. SIM MIO (semislido)
5. Bolsa de sangre.
6. Balanza granataria.
7. Matraces Erlenmeyer de 250 ml.
8. Probeta de 100 ml.
9. Tubos de ensaye.
10. Cajas de Petri.
11. Mechero de Bunsen.
12. Agua destilada.
MTODOLOGA.

Agar Sangre.
Preparar 50 ml de Agar Base de sangre, segn especificaciones del frasco. Esterilizar a
121C por 15 min a 1 lb de presin. Una vez estril enfriar el medio y cuando tenga una
temperatura aproximada de 45C agregar sangre de cordero o humana de modo que
quede al 5%. Agitar suavemente y vaciar en cajas de Petri estriles, dejar solidificar y
almacenar de 4 a 8 C.
Agar Chocolate.
Preparar 50 ml de Agar Base de sangre, segn especificaciones del frasco. Esterilizar a
121C por 15 min a 1 lb de presin. Una vez estril enfriar un poco el medio a una
temperatura aproximada de 85C y agregar sangre de cordero o humana de modo que
quede al 5%. Agitar para lisar los eritrocitos y liberar los componentes, posteriormente
vaciar en cajas de Petri estriles. dejar solidificar y almacenar de 4 a 8 C.
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Agar nutritivo.
Preparar 65 ml de Agar Nutritivo como lo indica el frasco. Calentar hasta disolver
completamente y esterilizar a 121C por 15 min a 1 lb de presin. Vaciar el medio en
cajas de Petri estriles. Dejar solidificar. dejar solidificar y almacenar de 4 a 8 C.
Caldo nutritivo.
Preparar 20 ml de caldo nutritivo como lo indica el frasco. Calentar hasta disolver
completamente. Verter aproximadamente 5 ml del medio a 3 tubos de ensaye, colocar
tapn y esterilizar a 121C por 15 min a 1 lb de presin. Dejar enfriar y almacenar de 4
a 8C.
Medio MIO.
Preparar 20 ml de caldo MIO como lo indica el frasco. Calentar hasta disolver
completamente. Verter aproximadamente 5 ml del medio a 3 tubos de ensaye, colocar
tapn y esterilizar a 121C por 15 min a 1 lb de presin. Dejar enfriar y almacenar de 4
a 8C.
ACTIVIDADES.
Realizar una secuencia esquematizada de todos los pasos que hiciste para la
preparacin de cada uno de los medios de cultivo, el inicio de la secuencia comienza
desde que lees las instrucciones del frasco y realizas las ecuaciones para el pasaje, y
finaliza en el transporte para almacenar los medios de cultivo. (Puedes ir colocando
observaciones que sean importantes al ir preparando los medios).

1.
2.
3.
4.
5.
6.

CUESTIONARIO.
Defina, Qu es un medio de cultivo?
Menciona los diferentes tipos de medios de cultivo y escribe dos ejemplos de cada uno.
A qu temperatura solidifica el Agar?
Qu sucede si se tapa la caja de Petri inmediatamente de vaciar el medio de cultivo?
Podra sembrarse rpidamente?
Qu sucede si el medio est muy fro y se desea vaciar?
Diferencie los trminos: Desarrollo y Crecimiento.

CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFA.

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PRACTICA No. 4
CONTAMINACIN AMBIENTAL Y MORFOLOGIA COLONIAL.

OBJETIVOS.

Comprobar la existencia de microorganismos en el ambiente los cuales contaminan los


medios de cultivo si no se trabaja de manera adecuada al momento de prepararlos y
manejarlos.

Observar, familiarizarse y aprender a distinguir las formas de crecimiento de las


bacterias y otros microorganismos, segn el medio en el que se desarrollan.

Identificar los componentes del medio que proporcionan las caractersticas de desarrollo
de un microorganismo.

INTRODUCCIN.
Al manejar microorganismos en el laboratorio de Microbiologa, debe considerarse la
existencia en el medio ambiente de diversas formas microscpicas de vida, que se
pueden instalar rpidamente en aquellas reas que las provean de sustancias nutritivas
para lograr su desarrollo.
De lo anterior, se desprende que los medios de cultivo preparados en el laboratorio
cumplen con un propsito en particular. Siempre debe tenerse en cuenta que en el
medio ambiente se encuentran microorganismos que pueden contaminar los medios de
cultivo si no se trabaja en forma adecuada en el laboratorio.
Los factores que pueden provocar dicha contaminacin pueden ser:
a)
b)
c)
d)
e)

Corrientes de aire.
Hablar en el rea de trabajo.
Trabajar fuera de la zona estril.
Manipular incorrectamente los utensilios de trabajo.
Esterilizacin inadecuada de medios de cultivo, etc.
En la naturaleza no encontramos aislado un solo tipo de microorganismos, por ello
cuando se examinan los microorganismos asociados o presentes en un animal, planta,
suelo, agua o alimento se encuentran una gran variedad. Solo raramente se encontrarn
un solo tipo de microorganismos. Si se quiere trabajar con un cultivo puro, deben
obtenerse colonias aisladas o separadas.
La observacin cuidadosa de las colonias muestra que estas varan en apariencia.

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Una colonia microbiana est constituida por individuos de la misma especie provenientes
de una clula o de un grupo de ellas.
Por definicin un buen aislamiento en placa es aquel que nos da colonias aisladas, con
una distancia que permita distinguir y describir la morfologa colonial que incluyen:
1. Tamao. Se describe en milmetros del dimetro y puede variar desde colonias
extremadamente pequeas que miden apenas una fraccin de milmetros hasta aquellas
que llegan a medir 10 mm o ms. Algunas especies bacterianas pueden extenderse en
toda la superficie de la caja.
2. Color. Las colonias pueden tener varios colores, debido a pigmentos propios o
absorcin de algunas sustancias del medio.
3. Forma. Pueden ser circulares, filamentosas, regulares, puntiformes, entre otras. Las
colonias puntiformes se caracterizan por ser muy pequeas por lo que no se pueden
distinguir el resto de sus caractersticas y otras en las que se pueden definir.
4. Bordes. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lbulos, filamentos,
proyecciones como dientes de sierra o enrollados.
5. Elevacin. La colonia puede ser plana o elevada, esta ltima a su vez puede ser
convexa, pulvinada, umbonada, crateriforme o umbilicada.
6. Superficie. Puede ser lisa, rugosa o granular.
7. Aspecto. Puede ser hmedo o seco.
8. Luz reflejada. Puede ser brillante o mate.
9. Luz transmitida. Puede ser transparente, traslcida u opaca.
10. Produccin de pigmento. Algunas bacterias producen pigmento soluble en agua, que
puede difundir el medio de cultivo.
11. Consistencia. Dura o suave, esta ultima puede ser butirosa, mucoide o friable. Esta
caracterstica se determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto debe ser la ltima
en describirse.
12. Otras. En ciertos medios de cultivo el crecimiento bacteriano ocasiona cambios visibles
alrededor de la colonia, como la hemlisis en gelosa sangre. Acidificacin que se
manifieste con indicador de pH incorporado al medio de cultivo y otros efectos similares.
Con la experiencia en la observacin de cultivos, las caractersticas de morfologa
colonial vienen a constituir una gua muy til en el reconocimiento de los principales
grupos de microorganismos, y tambin permite en muchos casos corroborar la pureza
de un cultivo o alertar sobre posible contaminacin.

MATERIAL.
Medios de cultivo preparados en la prctica anterior (cajas con G.CH, G.S y G.N).

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METODOLOGA.
Sesin 1.
1.

o
o
o
o
o
o
o

Tomar las cajas de G.CH, de G.S y de G.N, posteriormente contaminar.


Ejemplos:
Tosa sobre una de las cajas.
Dejar 20 min destapada en algn espacio del laboratorio.
Hablar cerca de una caja.
Llevar al rea de los baos.
Llevar a la cafetera.
Presionar ligeramente con los dedos una placa.
Tomar un pedazo de kleenex o cualquier objeto que haya tenido de su casa y colquelos
sobre el medio.

2. Rotular placas e incubar todas las cajas a 35C/ 24 h y reportar resultados.

Sesin 2 (Reporte).

MORFOLOGIA COLONIAL.

OBJETIVO.
Conocer las diferentes morfologas coloniales que presentan las colonias bacterianas y
aprender que cada una de ellas tiene caractersticas peculiares.

INTRODUCCION.
La evaluacin inicial de la morfologa colonia en las placas de cultivo primarias es muy
importante. Los laboratorios pueden proporcionar a los mdicos informacin preliminar
con respecto a los resultados del cultivo del paciente, Esta informacin tambin es
significativa para determinar los pasos posteriores para la identificacin y caracterizacin
definitivas del microorganismo. De acuerdo a los distintos medios de cultivo cada grupo
de microorganismos presenta una morfologa colonial caracterstica.
En el siguiente esquema se muestra algunas propiedades de crecimiento de las
colonias:

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FORMA

ELEVACIN

BORDE

Figura 4.1 Morfologa colonial macroscpica.

ACTIVIDADES.
1. Comprobar el crecimiento en los medios de cultivo.
2. Seleccionar dos colonias de cada medio de cultivo.
3. Identificar las caractersticas macroscpicas de las colonias seleccionadas y reportar en
la tabla 4.1.
4. Realizar esquemas de las placas que muestran crecimiento bacteriano.

TABLA.4.1. Caractersticas macroscpicas.

Cultivos.
Propiedades.
Forma.
Tamao.
Color.
Pigmento.
Borde.
Elevacin.
Superficie.
Aspecto.

Agar:
1

Agar:
2

Agar:
1

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Luz reflejada.
Luz transmitida.
Consistencia.
Hemolisis.

ESQUEMAS. Dibuja cada una de las placas contaminadas, despus de la


icubacin.
AGAR:_____________________

AGAR:_____________________

AGAR:_____________________

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CUESTIONARIO.
1. De qu naturaleza biolgica son los principales microorganismos contaminantes, que
pueden contaminar un medio de cultivo.?
2. Qu otros factores considera usted que pueden ser causa de la contaminacin de tipo
ambiental que afecten los medios de cultivo?
3. Podra existir el riesgo de contaminacin cuando no se lleve a cabo una buena
esterilizacin?
4. De los medios de cultivo que preparo, cual considera que es el que ms riesgo de
contaminacin se expondra?

CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.

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PRCTICA No. 5
SIEMBRA Y DESARROLLO EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO.

OBJETIVO: Conocer los mtodos de inoculacin empleados en los medios de cultivos


lquidos, semislidos y slidos, as como las condiciones necesarias para la obtencin
de cultivos puros.

INTRODUCCIN.
En la naturaleza, los microorganismos generalmente no se encuentran aislados sino
integrados en poblaciones mixtas, tal como se encuentran en una muestra biolgica.
Cuando estas mezclas de microorganismos se siembran en los medios de cultivos
adecuados, se obtienen cultivos mixtos. Para llevar a cabo el estudio de estos
microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar
con especies aisladas, obteniendo cultivos puros o axnicos. El primer problema en la
identificacin de una bacteria resulta ser su aislamiento del resto de microorganismos
presentes en la muestra. Una vez que se ha logrado el aislamiento es posible obtener la
bacteria de inters en cultivo puro.
En la preparacin de cultivos puros o axnicos a partir de una poblacin microbiana
mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas
durante el siglo XIX.
Para efectuar el estudio de los microorganismos una vez aislados, se han diseado
diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es
posible obtenerlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de
microorganismo.
Siembra y aislamiento.
Sembrar es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio
adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicacin,
de forma que se logre la separacin de un determinado microorganismo (patgeno) del
resto que lo acompaa (microbiota) para obtener un cultivo puro. Una vez sembrado, el
medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. Ningn
proceso en el diagnstico microbiolgico y sanitario es tan importante como el utilizado
para obtener cultivos puros de los microorganismos.
El procedimiento para el aislamiento ms utilizado es la siembra por estra sobre un
medio slido adecuado, para ello se toma una pequea cantidad de inculo con ayuda
del asa bacteriolgica y se reparte sobre la superficie del medio de cultivo. En el medio
quedan separadas e inmovilizadas las clulas bacterianas. El resultado de la siembra
por lo tanto se denomina cultivo.
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Las bacterias necesitan para su crecimiento de los nutrientes esenciales que se proveen
en un medio de cultivo, adems requieren de condiciones adecuadas de acidez (pH),
presin osmtica y atmsfera; entre algunos.
Despus del periodo de incubacin en condiciones adecuadas, cada clula viable ha de
dar lugar a una colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia
bacteriana posee caractersticas particulares en su forma, borde, elevacin, tamao,
consistencia, entre otras.
Para efectuar la siembra o aislamiento, se requiere trabajar aspticamente a fin de evitar
la incorporacin de microorganismos contaminantes. Se precisa que todo el material de
vidrio, los medios de cultivo y los dispositivos de inoculacin como las asas
bacteriolgicas sean estriles.
Los diversos tipos de bacterias presentes en la muestra original es visualizan como
colonias diferentes en el medio de cultivo y es posible obtener un cultivo puro de cada
uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. A partir de un cultivo puro
se procede a realizar los estudios bioqumicos y serolgicos pertinentes para hacer la
identificacin de gnero y especie.
Las siembras pueden ser:

Primarias, cuando el material biolgico es inoculado en los medios por primera vez.

Secundarias. El inculo proviene de una siembra primaria.


Esterilizacin del asa bacteriolgica
Las asas bacteriolgicas bsicamente son alambres unidos a un mango que permite
manipularlas y pueden ser de diferentes materiales como fierro, nicrn, platino, etc.
Varan tambin en su forma, pudiendo ser de punta o de aro; y se utilizan dependiendo
de las caractersticas de los medios de cultivo y del tipo de estudio a realizar. Las asas
bacteriolgicas se esterilizan por calor seco con la flama del mechero antes y despus
de realizar la siembra con el objetivo de destruir a los microorganismos de la superficie.
Para efectuar la esterilizacin del asa se siguen las siguientes indicaciones:

Encender el mechero, ajustar la flama del mechero a que quede completamente azul.

Tomar el asa bacteriolgica por el mango y colocarla en posicin diagonal a la flama del
mechero en la zona de oxidacin en un ngulo de 45 aproximadamente; se inicia el
calentamiento por la base del mango y se termina en la punta. Para asegurar la
esterilizacin del asa, el alambre de debe calentarse hasta que quede al rojo vivo.
Posteriormente se deja enfriar cerca del mechero, en la zona estril, antes de tomar el
inoculo.

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Figura 5.1 Representacin de las zonas de calor en la flama de mechero.

Medidas generales para la inoculacin de medios de cultivo.

Para realizar el procedimiento de inoculacin de medios en tubo, se deber tomar los


tubos con la mano izquierda (derecha, en caso de ser zurdo). Manipular de la misma
forma en el caso de placas de Petri con gelosa.

Quitar los tapones con la mano derecha utilizando los dedos meique y anular, con esta
misma mano habr de sostener el asa durante la inoculacin.

Nunca dejar los tapones sobre la mesa.

Flamear con el mechero la boca de los tubos y matraces una vez que se han abierto y
antes de colocarles su tapn nuevamente para evitar contaminaciones.

Trabajar en condiciones aspticas cerca del mechero, independientemente del tipo de


medio y del mtodo de siembra. El calor emitido por la flama reduce el nmero de
microorganismos presentes en las inmediaciones.

No hablar ni toser al ejecutar el procedimiento.


MTODOS DE SIEMBRA.
El mtodo de siembra a emplear depender de los objetivos que se pretendan alcanzar
con el cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo de los microorganismos
se produzca en forma masiva, mientras que en otras resulta indispensable que las
colonias queden aisladas o que las manifestaciones del metabolismo tengan lugar con
tensiones reducidas o privadas de oxgeno.
Para el aislamiento de microorganismos se cuenta con varios procedimientos, entre los
que figuran:

Siembra por estras: Aqu se incluyen los mtodos de estra cruzada, estra simple y
estra en costilla (para recuentos semicuantitativos).
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Vaciado en placa (Pour plate).


Diluciones (extensin con varilla).
Procedimiento de Petrifilm.
Inoculacin de placas Petri con gelosa con siembra por estra.
Ofrece un mtodo prctico para obtener cultivos puros. Pueden prepararse las cajas con
anterioridad y mantener en el refrigerador hasta que se utilicen. La superficie de la
agarosa debe estar libre de agua de condensacin antes de sembrarse esto puede
lograr invirtiendo la caja y destapndola.
Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido, el
resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se
denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una clula bacteriana viva y aislada que
si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la
produccin de una colonia en un breve lapso de tiempo.
Estra cruzada. La superficie de los medios de agarosa en placas de Petri puede
inocularse con la muestra por medio de varios mtodos. La inoculacin primaria puede
hacerse con un asa, hisopo u otros dispositivos. El procedimiento de estra cruzada
consiste en depositar en un rea de la placa de gelosa, una asada de la muestra o
cultivo mixto que sirve de inculo, se extiende el inculo con el asa haciendo varios
trazos en forma de zigzag de la orilla hacia el centro pero solamente a una distancia de 1
a 2 cm de la orilla. Se esteriliza el asa, se deja enfriar o se introduce en el medio en un
lugar que no interfiera con las siguientes estras. Se gira la caja de Petri 1/5 de vuelta y
con el asa esterilizada se hace una serie de estras que deben extender una pequea
porcin de la primera serie en forma similar con trazos que vayan de la orilla hacia el
centro. La operacin se repite dos veces ms y en la quinta se hace una serie de estra
abiertas que terminen en o cerca del centro, cuidando que no se toquen las estras
anteriores.
Estra simple. En ste procedimiento se toma la muestra con el asa previamente
esterilizada y se extiende sobre la superficie de la placa de gelosa haciendo
movimientos rectos en zigzag.
Estra en costilla. El procedimiento se aplica cuando se requiere hacer un estudio de
tipo semicuantitativo; para ello se requiere tomar muestra con un asa calibrada para
contener 0,001ml de muestra de orina no centrifugada. Se toma una asada de la
muestra y esta de inocula en la superficie de la placa con gelosa haciendo una lnea
recta, posteriormente se hace la diseminacin del inculo haciendo un primeramente un
giro de 90 y luego se hace sobre la lnea primaria de inoculacin una estra simple
hasta cubrir toda la superficie de la gelosa. Patrones de estras para inocular placas para
aislamiento de colonias bacterianas.

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Estra masiva. Puede realizarse con hisopo cuando se trata de cultivos primarios. Se
coloca en inculo en un punto de la periferia de la superficie del agar y se procede a
realizar la diseminacin del inculo con el asa haciendo estras con escasa separacin
entre ellas, se gira la placa de Petri 90 y se realiza el mismo procedimiento.

Figura 5.2 Formas de estriar.

Inoculacin de tubos con medio de cultivo.


Inoculacin de tubos con medio de cultivo en plano inclinado. Los tubos de ensaye
en plano inclinados o pico de flauta se inoculan utilizando el asa en punta, se toma
muestra de colonia y se atraviesa el fondo de la gelosa sin llegar al fondo del tubo, se
retira el asa procurando sacarla del medio por el mismo sitio de inoculacin. Se termina
la inoculacin del medio con una estra simple en el pico de flauta iniciando del fondo
hacia arriba, algunos medios no requieren de la estra en la superficie.

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Pasos para la inoculacin de tubos con medio en plano inclinado.

Inoculacin de tubos con medio semislido.


Cuando se siembra un medio semislido en un tubo para pruebas de motilidad, es
importante que el alambre de inoculacin sea retirado a largo de la lnea de la picadura
inicial, ya que un movimiento en abanico dar lugar a un patrn de crecimiento en la
lnea de picadura que pueda interpretarse como motilidad bacteriana. Importante es que
el asa no se inserte hasta el fondo del tubo.

Inoculacin de tubos con medio lquido. Se toma el asa y se inserta en el medio


lquido, se disemina el inculo rotando el asa de izquierda a derecha sobre el eje del
asa. Tcnica de inoculacin con asa suspendida.

Vaciado en placa. Este mtodo proporciona por lo general placas con un nmero
apropiadode colonias y se basa en la dilucin semicuantitativa de la muestra original en
un medio slido.

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Diluciones. Este mtodo consiste en realizar dilucioes seriadas sucesivas de la muestra


con el objetivo de sembrar despus cantidades conocidas de estas diluciones en placas
de Petri. Este mtodo permite conocer el nmero de microorganismos viables. La
viabilidad en microbiologa se define como la capacidad del microorganismo para
multiplicarse en un medio de cultivo.

Caractersticas de crecimiento de los medios semislidos. (MIO, SIM)

NOTA: El crecimiento que se muestra en la figuras es el que se espera observar en la lnea de picadura.

1.
2.
3.
4.
5.

Caractersticas de crecimiento en medios lquidos (CBHI, CN, otros).

Sin crecimiento.
Turbio.
Floculante.
Membrana o velo.
Membrana con anillo.

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1.
2.
3.
4.
5.

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Caractersticas de crecimiento en presencia de oxgeno.

Aerobio estricto.
Anaerobio estricto.
Facultativo.
Microaerfilo.
Aerotolerante (anaerobio).
MATERIAL.

1. Cepa problema 1: Escherichia coli.


2. Cepa problema 2: Staphylococcus aureus.
3. Cepa problema 3: Bacillus subtilis.
4. 1 caja de Petri con Gelosa Nutritiva (G.N.).
5. 1 caja de Petri con Gelosa Base Sangre (G.S.).
6. 1 caja de Petri con Gelosa Chocolate (G.Ch.).
7. 2 tubos de ensaye con medio semislido Movilidad-Indol-Ornitina (M.I.O.) o medios SIM.
8. 3 tubos de ensaye con caldo nutritivo (C.N.) o de caldo infusin-cerebro-corazn. (B.H.I).
9. 3 tubos con gelosa nutritiva en plano inclinado.
10. Asa bacteriolgica de punta.
11. Asa bacteriolgica de aro.
12. Mechero Bunsen.
13. Tapones de algodn.
14. Cinta masking.
15. Encendedor.
16. Marcador.

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MTODOLOGA.
Medidas generales:

En todos los casos para la inoculacin, esterilizar previamente el asa bacteriolgica en el


mechero, y dejarla enfriar antes de tomar muestra.
Trabajar cerca del rea asptica del mechero.
Las formas de inoculacin que se utilizarn en la prctica se describen claramente en la
introduccin.
Flamear la boca de los tubos antes y despus de inocularlos, tapar inmediatamente.
De las placas con cepas problema tomar colonias aisladas para inocularlas en los
medios.
En el caso de las placas de Petri, colocarlas con las tapas hacia abajo.
Rotular tubos y placas antes de entregarlos.
Incubar a 35C por 24 horas y reportar resultados.
Realizar una secuencia esquematizada de todos y cada uno de los pasos anotando
tambin las observaciones de los procedimientos realizados.

Inoculacin de placas con gelosa nutritiva.


1. Tomar la placa de G.N. e inocularla con la cepa problema 1 mediante estra masiva,
usar el asa bacteriolgica de aro previamente esterilizada, realizar el procedimiento de
acuerdo a las indicaciones anteriormente descritas.
2. Enseguida inocular la placa de G.S. utilizando el mtodo de estra cruzada con el asa
de aro empleando muestra de la cepa problema 2.
3. Por ltimo, inocular la placa con gelosa chocolate con la cepa problema 3 utilizando el
mtodo de estra simple.
4. Identificar claramente todas placas escribiendo en la base de cada una el nombre del
M.O. con que lo inocul, la seccin, fecha y procedimiento a realizar en este caso,
incubacin.
5. Entregar las placas para su incubacin a 35C por 24 horas y reportar resultados.
Inoculacin de tubos con medio semislidos.
1. Rotular dos tubos de medio MIO o SIM y enumerndolos de manera consecutiva.
2. Utilizando el asa bacteriolgica de punta previamente esterilizada, tomar muestra de la
placa con la cepa problema 1.
3. Destapar el tubo marcado como 1.
4. Flamear la boca del mismo en el mechero.
5. Inocular la muestra en el tubo por la tcnica de picadura introduciendo el asa de forma
verticalmente sin llegar hasta el fondo del tubo (introducir aproximadamente hasta
partes del medio), y retirar el asa de tal forma que salga por el mismo camino de la
picadura inicial.
6. Flamear el tubo nuevamente.
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7. Colocar el tapn.
8. Esterilizar el asa.
9. Tomar el tubo 2 e inocularlo con la cepa problema 2 siguiendo los pasos del 4 al 8.
10. Al terminar, identificar cada uno de los tubos escribiendo en su etiqueta el nombre del
M.O. con que lo inocul, la seccin, fecha y procedimiento a realizar en este caso,
incubacin a 35C por 24 horas y reportar resultados.
Inoculacin de tubos con medios lquidos.
1. Tomar 3 tubos de caldo nutritivo o caldo BHI y enumerarlos de manera consecutiva.
2. Utilizando el asa bacteriolgica de aro previamente esterilizada, tomar muestra de la
placa con la cepa problema 1.
3. Destapar el tubo marcado como 1.
4. Flamear la boca del mismo en el mechero.
5. Inocular la muestra en el tubo por la tcnica de inoculacin con asa suspendida
introduciendo el asa de forma verticalmente y una vez en el centro rotar el asa de
izquierda a derecha hasta que se suspenda el inculo en el medio.
6. Flamear el tubo nuevamente.
7. Colocar el tapn.
8. Esterilizar el asa.
9. Tomar el tubo 2 e inocularlo con la cepa problema 2 siguiendo los pasos del 4 al 8.
10. Inocular el tubo 3 con la cepa problema 3, seguir metodologa de los pasos 4 al 8.
11. Al terminar, identificar cada uno de los tubos escribiendo en su etiqueta el nombre del
M.O. con que lo inocul, la seccin, fecha y procedimiento a realizar en este caso,
incubacin a 35C por 24 horas y reportar resultados.

1.
2.
3.
4.
5.

6.
7.
8.
9.

Inoculacin de tubos con medio slido en pico de flauta.


Rotular cada uno de los tres tubos con gelosa nutritiva, enumerndolos
consecutivamente.
Utilizando el asa bacteriolgica de punta previamente esterilizada, tomar muestra de la
placa con la cepa problema 1.
Destapar el tubo marcado como 1.
Flamear la boca del mismo en el mechero.
Inocular la muestra en el tubo primeramente por la tcnica de picadura introduciendo
el asa de forma verticalmente sin llegar hasta el fondo del tubo (introducir
aproximadamente hasta partes del medio), y retirar el asa de tal forma que salga por
el mismo camino de la picadura inicial.
Sin esterilizar el asa, realizar una estra simple sobre la superficie del pico de flauta
iniciando por la base del pico y terminado en el extremo cercano a la boca del tubo.
Flamear el tubo nuevamente.
Colocar el tapn.
Esterilizar el asa.
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10. Tomar el tubo 2 e inocularlo con la cepa problema 2 siguiendo los pasos del 4 al 9.
11. Inocular el tubo 3 con la cepa problema 3, seguir metodologa de los pasos 4 al 9.
12. Al terminar, identificar cada uno de los tubos escribiendo en su etiqueta el nombre del
M.O. con que lo inocul, la seccin, fecha y procedimiento a realizar en este caso,
incubacin a 35C por 24 horas y reportar resultados.

REPORTE DE RESULTADOS.
1. Dibujar al crecimiento observado en las cajas de Petri, despus de la incubacin.

Estra cruzada.
M.O:___________________

Estra simple.
___________________

Estra masiva.
_________________

2. Seleccionar una colonia aislada de cada uno de los microorganismos que se sembraron
en la prctica y realizar la evaluacin de la morfologa colonial.
Caractersticas a evaluar en la
morfologa colonial:

E. coli

Microorganismo:
S. aureus

B. subtillis

Forma.
Tamao.
Color.
Pigmento.
Borde.
Elevacin.
Superficie.
Aspecto
Luz reflejada.
Luz transmitida.
Consistencia.
Otros.
Hemlisis.
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Crecimiento en tubos de medios semislidos. (reporte despus de la incubacin)

Medios MIO o SIM.

Caractersticas a evaluar en
los medios semislidos:
Movilidad.
Medio
MIO
Lnea de picadura.
SIM.
Pigmento.

E. coli

Microorganismo:
S. aureus

B. subtillis

Crecimiento en tubos con medios lquidos.

Tubos con caldo B.H.I. o caldo nutritivo.


Caractersticas a evaluar en
los medios lquidos:
Pelcula.
Turbidez.
Sedimento.
Pigmento.
Otros.

E. coli

Microorganismo:
S. aureus

B. subtillis

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Crecimiento en tubos con gelosa en plano inclinado.

Tubos con medio B.A.B en plano inclinado.

Caractersticas a evaluar en
los medios lquidos:
Cantidad de crecimiento.
Pigmento.
Forma del crecimiento.
Consistencia.
Otros.

E. coli

Microorganismo:
S. aureus

B. subtillis

CUESTIONARIO.
1.

2.

Mencione la utilidad de los siguiente mtodos de aislamiento:


Estra.
Dilucin por vaciado en placa.
Dilucin por extensin por varilla.
Por qu es importante el mtodo de la estra cruzada para verificar la pureza de un
cultivo?
3. Por qu las cajas de Petri con un medio de cultivo slido deben incubarse con la tapa
hacia abajo?
4. Por qu es importante lograr un buen aislamiento de las colonias?
5. Menciona cul es el rea de esterilidad que proporciona el mechero Bunsen.
OBSERVACIONES.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFA.

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Segundo bloque de evaluacin.

Prctica No. 6. Microscopia.


Prctica No. 7. Tincin simple. (Forma y tamao).
Prctica No. 8. Tincin diferencial Gram.
Prctica No. 9. Tincin diferencial de Zielh Neelsen.
Prctica No. 10. Tincin selectiva. (Cpsula y esporas).
.

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PRCTICA No. 6.
MICROSCOPA.

OBJETIVO.
Conocer los principios bsicos y la importancia de la microscopia como herramienta
fundamental en el campo de la Microbiologa.

INTRODUCCIN.
La Microbiologa es una disciplina que se ocupa de organismos tan pequeos que el ojo
humano no puede observarlos a simple vista, por esta razn dentro de la prctica de los
procesos microbiolgicos se hace indispensable el uso y manejo del microscopio. Para
los qumicos del rea de microbiologa es fundamental conocer y comprender el
funcionamiento del microscopio.
La microscopa se define como el empleo de un microscopio para aumentar de tamao
(agrandamiento visual) objetos demasiado pequeos.
La microscopia ocupa un lugar central en el laboratorio. Los microscopios y mtodos de
observacin por microscopio son varios, los tipos de microorganismos a detectar,
identificar y caracterizar determinan los tipos de microscopia ms apropiados a ampliar.
A continuacin de describen algunas
diagnstico microbiolgico.

de las aplicaciones de la microscopia en el

Identificacin preliminar rpida de los microorganismos por la visualizacin directa en


muestras del paciente.
Identificacin final rpida de ciertos microorganismos por visualizacin directa en las
muestras del paciente.
Deteccin de diferentes microorganismos presentes en la misma muestra
Deteccin de microorganismos no cultivables con facilidad en el laboratorio.
Evaluacin de muestras del paciente para la presencia de clulas indicadoras de
inflamacin o contaminacin.
Determinacin de la importancia clnica de un microorganismo.
Proporciona informacin previa a los cultivos acerca de qu tipos de microorganismos
podran esperarse en los cultivos de modo tal que sean utilizadas las tcnicas de cultivo
apropiadas.
Determina qu pruebas y mtodos deberan utilizarse para identificar y caracterizar los
microorganismos cultivados.
Proporciona un mtodo para la investigacin no habitual o resultados de pruebas de
laboratorio no esperados.
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Las dimensiones de las bacterias patgenas son aproximadamente de 0.4 a 4.0 m. El


examen por microscpico ocular, la luz blanca, necesita de dispositivos que den un
aumento de 1000 a 2000 veces.

El microscopio.
El microscopio se compone de una parte mecnica y una ptica:
Parte mecnica.
La base del microscopio, suficientemente pesada para ser estable, soporta la platina fija,
sobre la que se coloca la preparacin a observar. La preparacin se mantiene por un
carro, con desplazamientos rectangulares, con un vernier. En algunos aparatos la platina
puede tener desplazamientos verticales gracias a una cremallera (tornillos macro y
micromtricos) que regulan la puesta a punto. En otros casos la platina solo se desplaza
horizontalmente.
El brazo, es una parte rgida que soporta el dispositivo porta-ocular y el revlver o portaobjetivos. En el microscopio monocular los dos dispositivos estn separados por un tubo,
de manera que la distancia entre el ocular y el objetivo sea de 170 mm. En los
binoculares, un sistema de prismas reemplaza al tubo.
El dispositivo porta-ocular es un tubo simple en el monocular o en el binocular, es donde
se encuentran los prismas. Los dos oculares se pueden desplazar de acuerdo a la
distancia entre ambas pupilas del observador, y adems uno de los oculares es mvil
sobre su eje para corregir las diferencias de convergencia entre los dos ojos.
El porta-objetivo o revlver, permite su desplazamiento por rotacin y permite
sustituirlos. Bajo la platina se encuentra el porta-condensador mvil, conteniendo el
diafragma. Debajo de l, un espejo permite regular la fuente luminosa.
Parte ptica.
La fuente luminosa, es de filamento de Tngsteno. El espejo, que tiene una cara plana y
la otra cncava, debe, a partir de una fuente luminosa, enviar un haz de rayos paralelos
al eje ptico del microscopio.
El condensador, es una lente que enfoca la luz en el preparado permitiendo la formacin
de un cono con el vrtice en el preparado y la base en el lente frontal del objetivo. La
entrada de luz se regula con el diafragma iris. El dimetro de abertura del diafragma
depende del campo y debe coincidir con l.
La abertura de luz debe ser menor a la abertura del objetivo usado. Se regula por medio
de diafragmas anulares.

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Los objetivos, sus caractersticas son:


a) Apertura Numrica (AN). Seno del semi-ngulo mximo formado por los rayos que
pueden penetrar en el lente frontal del objetivo.

n= ndice de refraccin del medio a travs del cual pasa la luz desde el porta al objetivo.

b) Aumento. Agrandamiento de la imagen introducida por el objetivo. El objetivo produce


una imagen real del preparado, dentro del microscopio. El aumento se mide en
dimetros (x). hay objetivos de 10x, 25x, 40, y 100x (inmersin).
c) Correccin de aberraciones. Para formar una imagen clara, el lente debe enfocar cada
rayo de luz desde un punto del preparado dando un punto de la imagen. Cuando esto
falla, se llama aberracin.
Las dos principales aberraciones son:
La aberracin cromtica, que separa los componentes del espectro.

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La aberracin esfrica, que separa los puntos de la imagen en su distancia de la lente.

Para corregirlas se han desarrollado objetivos especiales:

Objetivos acromticos, que corrigen las aberraciones cromticas para las longitudes
de onda de mxima sensibilidad visual.
Objetivos apocromticos, que no presentan aberracin cromtica en toda la escala del
espectro visible, siempre que haya una distancia ptima entre el objeto y la lente del
objetivo. Son designados por esa distancia en mm o en fracciones de mm.
Objetivos a campo plano, que corrigen la aberracin esfrica.

d) Objetivo de inmersin. El objetivo a seco tienen separado el lente frontal de la


preparacin por aire, cuyo ndice de refraccin (n)= 1.000.
El ndice de refraccin del vidrio es (n)=1.510 como resultado de ello los rayos de luz
sufren una reflexin al pasar del vidrio al aire, y algunos caen fuera del campo visual del
objetivo.
Si se interpone entre el portaobjetos y el objetivo un lquido con el (n) semejante al
vidrio, como por ejemplo el aceite de cedro cuyo (n) es de 1.514, los rayos no sufren es
reflexin.
Si todos los rayos que pasan por el objeto penetran en el objetivo la luminosidad es
mayor, y el poder resolutivo mayor.
Los objetivos acromticos a inmersin llevan como indicacin su distancia focal
expresada en mm y su aumento.

El ocular, est formado por dos lentes simples o compuestas montadas en las dos
extremidades de un tubo. La lente inferior se llama colectora o vidrio de campo y se
encarga de aplanar y aclarar la imagen real obtenida por el objetivo y completa por lo

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tanto la accin del objetivo. La lente superior agranda esa imagen dando una imagen
virtual.
Si el aumento del ocular es de 10x y la del objetivo de 40x, el aumento total de 400x.
Poder resolvente del microscopio (d), es la capacidad de ver dos puntos como
objetos separados. Cuanto menos es la distancia entre esos dos puntos, mayor es el
poder resolvente del microscopio.

Frmula de Abbe:

= longitud de onda
AN= apertura numrica =n sen
k= constante
Cuanto menor es la longitud de onda y mayor la AN, mejor es el poder resolvente, o sea,
menos la distancia mnima entre dos puntos para que se aprecien como tales.
Aumentando el ndice de refraccin del material, intermedio entre el preparado, (d)
mejora.

Longitud de onda:

Teric
ament
e (d)
es
mejor
con
luz azul que verde, pero la agudeza visual del ojo humano es mayor con luz verde.

Resumen.
El objetivo produce una imagen del preparado dentro del microscopio. El observador
mira esa imagen a travs de un ocular. As, si el objetivo aumenta la imagen 100
dimetros (100x) y el ocular otros 5x (dimetros), el aumento total es de 500x.
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El poder resolvente del microscopio es la capacidad de ver como objetos separados dos
puntos. Cuanto ms cercanos estn esos puntos, mejor es el poder resolvente. El ojo
humano a 25 cm puede distinguir la separacin de 0.1 mm (100mu). El microscopio
ocular 0.2 mm= 200mu.
Para formar una imagen clara el lente debe enfocar cada rayo de luz desde un punto del
preparado dando un punto de la imagen. Cuando falla se llama aberracin. Si es
cromtica separa los componentes del espectro, si es esfrica separa los puntos de la
imagen en su distancia de la lente.

MICROSCOPIO ELECTRNICO
El microscopio, depende de la longitud de onda de la luz visible (0.4 a 0.7). Sea cual
sea el sistema de lentes utilizado, no puede emplearse la luz para distinguir netamente
la estructura de objetos que no estn separados entre s por distancia mayor de la mitad
de la longitud de onda (pongamos 0.2).
Como el ojo a simple vista puede distinguir lneas finas separadas en aproximadamente
0.2 mm, no interesa mucho emplear una amplificacin mayor de 1000 veces con el
microscopio del luz, porque el ojo humano con esta amplificacin puede distinguir lo que
revela la luz de la misma longitud de onda (0.2 x 1000 = 0.2 mm). Amplificaciones
mayores de 1000 brindan imgenes de mayores dimensiones, pero no muestran ms
detalles.
El desarrollo revolucionario del microscopio que aumento su poder de resolucin ms de
cien veces, solo se logr despus que los fsicos, contrariados por las limitaciones que
les imponan las longitudes de onda luminosa se dirigieron a los electrones. La longitud
de onda de estos es muy corta, tanto que hasta hoy este factor no ha limitado el poder
de resolucin del nuevo instrumento.
Para obtener una imagen ampliada con el microscopio de luz, se aprovecha el hecho de
que, en general, los rayos de luz se desvan cuando pasan de un medio a otro con
diferente ndice de refraccin. Utilizando vidrios con superficies curvas (lentes), la luz
proveniente de un objeto pequeo puede desviarse de manera que produzca una
imagen voluminosa. En el microscopio electrnico se recurre al hecho de que las vas
seguidas por los electrones pueden influirse de manera similar por campos magnticos:
la fuerza de estos puede variarse segn la intensidad de corriente que pasa a travs de
las bobinas que excitan dichos campos.
Para describir el microscopio electrnico conviene comparar su sistema de lentes con
los que tienen el microscopio de luz.
En el microscopio ordinario, la luz de una fuente adecuada se enfoca mediante una
fuente condensadora. La lente del condensador dirige un haz poderoso de luz a travs
de la abertura de la platina y a travs de la muestra, por ejemplo, un corte teido situado
en dicha platina: la muestra recibe el nombre de objeto. La luz que ha atravesado la
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muestra se enfoca luego por el objetivo. Tal objetivo proporciona una imagen del objeto
en el foco, a cierta distancia entre el objetivo y la lente de proyeccin. La lente de
proyeccin, una de las que hay en el ocular del microscopio ordinario, puede ampliar
ms la imagen todava, hasta 10 a 15 veces, y utilizarse para enfocar la imagen
agrandada sobre una pantalla.
La ptica de un microscopio electrnico es sencilla: el instrumento es esencia es un tubo
de rayos catdicos desmontable, en el cual debe mantenerse el vaco por bombeo
constante. Desde el ctodo, un filamento de tungsteno en forma de V que puede
calentarse elctricamente, se emiten electrones que son atrados hacia el nodo (por
una diferencia de potencial de 50,000 a 100,000voltios). El nodo tiene una abertura, de
manera que es atravesado por un haz divergente de electrones. El haz divergente es
enfocado por la lente condensadora (un campo magntico) y dirigido hacia el objeto,
cuando los electrones atraviesan la preparacin unos son desviados ms que otros. El
haz de electrones que sale del objetivo es enfocado primeramente por la lente objetiva y
se obtienen una imagen aumentada del objeto. Esta imagen se agranda ms todava por
la lente de proyeccin.
Al igual que la luz ultravioleta y los rayos X, los electrones no afectan el ojo como lo hace
la luz. Sin embargo, al igual que aquellos producen fluorescencia en determinadas
substancias y tambin afectan pelculas fotogrficas. As pues, (como en el caso del
microscopio ultravioleta) debe utilizarse una pantalla fluorescente para enfocar la imagen
obtenida con el microscopio electrnico, y dicha imagen puede fotografiarse.
Las partes de la imagen final correspondientes a zonas del objeto donde los electrones
han sido muy desviados no resultaran muy intensas en la pantalla fluorescente, sern
ligeras en el negativo fotogrfico y de color obscuro en el positivo. Inversamente, las
partes de la imagen del objeto correspondientes a porciones que no desvan mucho los
electrones darn imagen brillante sobre la pantalla fluorescente, sern negras en el
negativo y claras en el positivo.
Los electrones atraviesan tan poco la materia que no pueden franquear ni los objetos
ms finos utilizados con el microscopio de luz. Para el microscopio electrnico los
objetos deben tener menos de 1/10 de micra de espesor de preferencia 1/40 de micra
(casi exactamente la millonsima parte de una pulgada) para obtener los mejores
resultados.
Como el microscopio electrnico resuelve detalles tan finos, tiene gran inters que el
objeto a observar sea fijado de la manera ms perfecta posible. Hace un tiempo se
comprob por Strangeways y Candi que la mayor parte de fijadores causan precipitacin
macroscpica de la protena en las clulas, y grados variables de formacin de los
componentes celulares. De todos los fijadores ensayados comprobaron que el que
menos alteraba la clula era el tetraxido de osmio. Estos resultados fueron confirmados
plenamente en los primeros estudios del microscopio electrnico; desde entonces se
han utilizado soluciones tampn de tetraxido de osmio como fijador de eleccin.

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Aunque el tcnico que emplea el microscopio electrnico no goza de la ventaja que


tienen quien emplea el microscopio de luz, dependiendo del empleo de colorantes que
tien los diversos preparados en forma selectiva, se puede realizar el contraste entre los
diferentes componentes observados con el microscopio electrnico utilizando productos
qumicos que son densamente electrnicos y que se fijan en grado diverso a los
componentes observados.
El tetraxido de osmio acta en esta forma porque el osmio, que dispersa los electrones
fuertemente, es captado con intensidad diferente por los diversos componentes del
objeto observado. Otras sales de metales pesados actan en forma similar y se utilizan
para aumentar el contraste tales soluciones se denominan colorantes electrnicos. Uno
que ha alcanzado amplia aplicacin es el hidrxido de plomo.
Otro perfeccionamiento reciente es el de la tincin negativa. Esa tcnica incluye el uso
de una solucin qumica densa en electrones (suele utilizarse para este fin el cido
fosfotngstico) en el cual se sumerge el preparado; este en lugar de combinarse
especficamente con ingredientes orgnicos determinados del material, llena todos los
intersticios que hay entre las diferentes partes del material y lo deja relativamente
intacto. Por lo tanto, en una micrografa electrnica de material preparado en esta forma
se obtiene una imagen negativa en lugar de una imagen positiva del material. Este
mtodo tiene particular valor para demostrar el contorno superficial de cuerpos de ndole
delicada, pues ellos por si mismos no captaran suficiente colorante electrnico para
quedar netamente dibujados; pero si sus espacios se llenan de electrones por tincin
negativa, sus siluetas quedan netamente delimitadas.

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas substancias (fluorocromos)
de poder absorber energa lumnica de una determinada longitud de onda y emitir
energa lumnica de onda de mayor longitud. Por lo tanto, pueden utilizarse substancias
fluorescentes para descubrir los rayos ultravioletas y los rayos X invisibles, porque
substancias fluorescentes adecuadas expuestas a las ondas relativamente cortas de la
luz ultravioleta, o a las ms cortas de los rayos X, las absorben y emiten ondas ms
largas de luz visible. Ejemplo: Auramina recibe luz azul (400-490mu) y emite verdeamarillo (560-590mu).
Hay varios colorantes como el anaranjado de acridina que presentan fluorescencia y
pueden utilizarse para teir componentes celulares y tisulares que de ordinario no tienen
fluorescencia, de manera que estos ltimos pueden despus ser demostrados. Otros
colorantes fluorescentes utilizados con fines determinados son la tioflavina S, la
tioflavina T, la rodamina B y la primulina.
Para localizar zonas de fluorescencia con el microscopio, no se requieren tipos
especiales de objetivos y oculares de cuarzo de otros material que transmitan la luz
ultravioleta, pues el observador que busca la fluorescencia descubre la luz visible
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emitida por diversos puntos del corte y, claro est, esta luz visible es perfectamente
transmitida por objetivos y oculares corrientes. Sin embargo, si estos puntos del objeto
deben hacerse fluorescentes, hay que iluminarlos desde abajo con luz de longitud de
onda menor que la que ellos emiten. En consecuencia, la fuente de luz que se utiliza ha
de emitir luz ultravioleta.
Toda la luz ultravioleta emitida debe filtrarse; de hecho, mediante filtros especiales,
pueden seleccionarse luces en varias partes de las longitudes de ondas ms breves. Las
longitudes de onda del espectro ultravioleta que se utilizan en el microscopio de
fluorescencia suelen ser suficientemente grandes para pasar en cantidades
considerables a travs de un condensador ordinario y uno del tipo de campo obscuro
como los generalmente utilizados, de manera que los puntos fluorescentes puedan verse
fcilmente sobre fondo negro. Como utilizamos luz ultravioleta para iluminar el objeto,
parte de la misma despus de atravesar las pociones no fluorescentes del objeto pueden
seguir a travs de objetivos y oculares. En consecuencia, para evitar la lesin de los ojos
por esta luz invisible, hay que insertar en el ocular filtros que impida el paso de los rayos
ultravioletas permitan el paso de luz del espectro visible (filtro amarillo).
MANEJO DEL MICROSCOPIO
Debe ajustarse a las siguientes normas:
1. La preparacin u objeto a examinar, debe colocarse en el centro de la laminilla portaobjetos y debe ser lo suficiente delgada para permitir a su travs el paso de la luz.
2. La generalidad de las preparaciones deben cubrirse con agua (unas gotas) sobre la cual
a su vez se deposita un cubre-objetos, procurando que no se formen burbujas de aire.
3. La laminilla porta-objetos, ya lista, debe colocarse en la platina procurando que la
preparacin quede en el centro del orificio de la misma platina, con ellos se conseguir
quede en el centro la preparacin, en el centro de la lente objetiva.
4. La observacin inicial debe hacerse, rutinariamente, con el objetivo de menor aumento
(10x) as cuidara que este objetivo se halle en el eje ptico del microscopio.
5. Enseguida se bajar el tubo del microscopio, accionando los tornillos o botones
macromtricos o rpidos, lo ms bajo posible, hasta poner el objetivo casi en contacto
con la preparacin. Con el fin de evitar el bajar demasiado, hasta el punto de que toque
el objetivo con la preparacin, es necesario que la maniobra anterior, se realice
observando por un lado (no se debe bajar el tubo estando mirando por el ocular). Este
tiempo es importante.
6. Se procede a iluminar el campo. Procurar que el campo quede bien uniformemente
iluminado, para ellos es necesario recordar que exista el condensador y exista el
diafragma; se subir el condensador, procurando obtener una luz de intensidad media;
se abrir y se cerrara el diafragma con el mismo propsito.
7. Acto seguido asomndose al microscopio, mediante los botones se subir lentamente el
tubo del microscopio hasta encontrar la imagen deseada.

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8. Se afinar entonces el enfoque mediante el tornillo micromtrico lentamente y se


ajustara nuevamente la iluminacin, subiendo o bajando el condensador y abriendo o
cerrando el diafragma. Se tendr en cuenta tambin, la presencia del filtro, la
interposicin o evitando su uso. Igualmente se tendr mucho cuidado de utilizar la luz
adecuada del espejo (la cncava para la luz difusa de la una ventana o para la luz
prxima de una lmpara, en ausencia del condensador).
9. Obtenida una buena visin, (buen enfoque y buena iluminacin) se proceder a echar
una ojeada a toda la preparacin en busca del campo de mayor inters (especies
animales o vegetales buscadas, estructuras, zonas delgadas, etc.). para ello se mover
la laminilla porta-objetos con los dedos de ambas manos, tenindose cuidado de
accionar el tornillo micromtrico para conservar siempre un buen enfoque.
10. Encontrando el objeto, si es pequeo, se procurar centrarlo en el campo y se rectificara
el enfoque y la iluminacin. Conseguido ellos, se observan con detencin sus detalles
(forma, aspecto, color, brillo, estructura, movimiento, etc.) haciendo un verdadero
anlisis del objeto, estudindolo ordenadamente y por todas partes. Conforme se hace le
examen es conveniente ir anotando en una hoja especial las observaciones practicadas
y hacer los dibujos correspondientes.
11. Practicada la observacin anterior y colocando el objeto en el centro del campo, puede
hacerse necesario un examen con mayor aumento, para lo cual bastara dar vuelta al
revolver y colocar en el eje ptico del microscopio el objetivo requerido. La preparacin
quedara casi en el foco y bastara una media vuelta al tornillo lento para hacer la
afinacin necesaria. Se volver entonces a rectificar la iluminacin y se har un nuevo
examen de la preparacin. Todas las observaciones que se hagan debern,
invariablemente ser anotadas en la hoja especial, para ello.
Para el uso del objetivo de inmersin, se colocara encima del cubreobjetos una gota de
aceite de cedro.
12. El instructor le proporcionara preparaciones fijas para que aprenda a utilizar
correctamente el microscopio.

CUIDADOS BSICOS DEL MICROSCOPIO

1)
2)
3)
4)

Si no lo usa djelo dentro de su caja, o en su cubierta plstica protegido del polvo.


No deben haber cerca del microscopio ni reactivos qumicos, ni gases corrosivos.
No deben quedar restos de aceite de inmersin en la platina.
Se cuidara que los objetivos a seco no estn en contacto con el aceite de inmersin, si
ellos ocurriera, limpiarlos bien inmediatamente.

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5) Cuando se limpie el objetivo de inmersin usar papel especial (papel seda) para lentes o
un trozo de algodn suave ligeramente impregnado de xilol (xilene) y dejarlo secar.
6) El microscopio no debe desmontarse. Si falla, llame al tcnico.
7) Al final de la jornada las partes pticas del microscopio deben limpiarse
cuidadosamente, en especial el objetivo de inmersin.

MATERIAL.
1. Microscopio ptico.
2. Frotes teidos.
3. Aceite de inmersin.

METODOLOGA.
1. Hacer la observacin de laminillas, siguiendo las instrucciones descritas anteriormente.
2. Dibujar los objetivos y escribir la informacin que se encuentra detallada en cada uno de
los objetivos.
3. Anotar observaciones.

ACTIVIDADES.
1. Dibuja un microscopio e identifica cada una de sus partes.

CUESTIONARIO.
1. Describir cada una de las caractersticas de los diferentes objetivos y su aplicacin.
2. Investigar las diferentes variedades de los aceites de inmersin.
3. Cuntos aumentos (x), totales se tienen si se hace la observacin con el ocular de 10x
y objetivo de 40x?
4. Describe la secuencia para la hacer la observacin al microscopio de una laminilla con
una preparacin bacteriana.

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PRCTICA No. 7
TINCIN SIMPLE. (FORMA Y TAMAO)

OBJETIVO.

Realizar las tcnicas de preparaciones de frotis y de tincin simple para la observacin


de algunas formas y agrupaciones de los microorganismos.

INTRODUCCION
Las tcnicas de tincin que se usan en Microbiologa se desarrollaron como una
necesidad para poner de manifiesto a las bacterias y sus estructuras, como ya se haba
hecho en la observacin de las clulas y tejidos diversos desde mucho tiempo antes.
Los colorantes fueron usados para mejorar el contraste de los objetos que se observan
al microscopio y el medio que los rodeaba. De tal modo que se desarrollaron
procedimientos de fijacin que favorecan la unin de los colorantes con las estructuras
celulares y procedimientos adicionales con el mismo propsito para el cual se aplicaban
ciertas sustancias, como los taninos, a los que se denomin mordentes, las cuales
favorecan a la tincin. Se desarrollaron tcnicas muy variadas, que tuvieron un fuerte
impacto en las observaciones microscpicas, pues se utilizaron con gran xito en las
tinciones de la clula, que tomaban las sustancias colorantes permitiendo distinguir no
solo las clulas sino, a muchas de las estructuras intracitoplsmicas en numerosos
tejidos animales, vegetales y organismos microscpicos, lo que propicio un gran avance
en las ramas del saber cmo la histologa, patologa, botnica, zoologa y protozoologa.
Tomando en cuenta que las bacterias son clulas pequeas y casi transparentes, que
escapan a la observacin microscpica, su tincin es indispensable para conocer su
forma, tamao y agrupacin.
Los colorantes son sustancias que originalmente se derivaron de anilina o del alquitrn;
qumicamente estn constituidos por uno o ms anillos aromticos. Los cuales tienen
sustituyentes diversos llamados cromforos, que dan la cualidad del color; a estos
compuestos se les llama cromgenos; adems tienen un grupo funcional ionizable,
llamado auxcromo, que permite su unin a componentes de carga contraria presentes
en las estructuras celulares y tejidos que se desea observar. Algunos ejemplos de
colorantes usados en las tcnicas microbiolgicas son los siguientes: cristal violeta, azul
metileno, verde de malaquita, safranina, fucsina, azul de algodn y algunos que no se
usan para visualizar directamente bacterias pero se utilizan para contrastar estructuras
en otros tipos de clulas son el cido pcrico, el rojo neutro, y la eosina. Se utilizan
preferentemente algunos colorantes porque son bsicos, es decir, al ionizarse la porcin
de la molcula que tiene color est cargada positivamente, lo cual le da afinidad por las
estructuras celulares de carga negativa; las bacterias en superficie tienen una carga neta
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negativa en medio neutro o alcalino, por lo cual los colorantes cidos no son adecuados
para teirlas.
La tincin simple es aquella en la que se aplica un solo colorante. Las soluciones
empleadas para teir las bacterias son generalmente acuosas. En ocasiones se prepara
una solucin concentrada en alcohol para favorecer la rpida disolucin del colorante y
despus se diluye con agua. La concentracin final del colorante vara de 0.5 hasta el
5%, segn sea la intensidad del color. Se obtienen mejores resultados de coloracin si
se utilizan soluciones de baja concentracin por un tiempo largo en vez de soluciones
concentradas por un tiempo corto.

MATERIAL.
1.
2.
3.
4.

I.
1.
2.
3.
4.
5.

II.

Soluciones de cristal violeta, safranina, azul metileno y fucsina bsica.


Portaobjetos.
Puentes de coloracin.
Cepas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
METODOLOGA.
Frotis a partir de un medio slido.
Marcar un extremo del portaobjetos limpio y desengrasado.
Colocar con el asa una pequea gota de solucin salina (SS) y depositar en el centro del
portaobjetos.
Tomar en el asa estril una porcin muy pequea del crecimiento y hacer una
suspensin homognea en la gota de (SS), extender para formar una pelcula fina.
Dejar secar al aire.
Fijar el frotis con calor, para lo cual se calienta suavemente pasando rpidamente la
parte posterior del portaobjetos dos o tres veces por la flama del mechero, hasta
alcanzar una temperatura que sea soportable en el dorso de la mano.

3.
4.

Frotis a partir de un cultivo en medio lquido.


Marcar un extremo del portaobjetos limpio y desengrasado.
Sin poner SS, tomar con el asa estril dos o tres gotas de cultivo y colocarlas en el
centro del portaobjetos, extender para formar una pelcula delgada y uniforme.
Dejar secar al aire.
Fijar al calor, como se indic arriba.

1.
2.
3.
4.
5.

Tincin simple de los frotis.


Colocar los portaobjetos con los frotis sobre el puente de coloracin.
Cubrir el frotis con unas gotas de colorante y dejar actuar durante un minuto.
Con las pinzas de diseccin tomar el portaobjetos por un extremo y escurrir el colorante.
Lavar el exceso de colorante con un chorro suave de agua.
Dejar secar al aire.

1.
2.

III.

52

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IV.

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Observacin microscpica de los frotis.


1. Examinar las preparaciones con el objetivo de inmersin.
Tabla 5.1
Diversidad de formas y agrupaciones de organismos procariticos.
Forma

Agrupacin

Ejemplo

Pares (diplococos)

Neisseria

Racimos (estafilococos)

Staphylococcus

Cadenas (estreptococos)

Streptococcus

Ttradas

Pediococcus

Cubos de 8 (sarcinas)

Micrococcus

Lminas

Lampropedia

Bacilos cortos aislados

Escherichia

Bacilos largos en pares

Bacillus

Bacilos largos en cadenas

Bacillus, Lactobacillus

Bacilos largos en empalizada

Corynebacterium

Bacilos fusiformes aislados

Caulobacter

Helicoidal

Aislado

Treponema

Curva

Aislado

Vibrio

Espiral

Aislado

Beggiatoa

Plana

Mosaicos cuadrados

Haloarcula

Aislado

Stella

Esfricas (cocos)

Cilndrica

Estrella

Figura 8.1 Agrupacin de las bacterias.

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ACTIVIDADES
1. De acuerdo con sus observaciones, indique en la siguiente tabla la morfologa
microscpica de cada microorganismo.
Morfologa microscpica.
Forma
Agrupacin
Esporas

Microorganismo
Escherichia coli
Staphylococcus aureus

2. Hacer esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas e indique el


microorganismo y el colorante utilizado.

CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Cul es el propsito de fijar los frotis con calor?


Qu otros procedimientos de fijacin se pueden emplear?
Mencione tres caractersticas que debe de tener un frotis bacteriano de buena calidad.
En qu casos se aplica la tcnica de tincin simple?
Desde el punto de vista molecular, a qu debe un colorante su color?
Definicin de tinte o colorante
A qu se le llama colorante cido y a qu colorante bsico?
De 2 ejemplos de colorantes cidos y 2 de colorantes bsicos
Qu diferencia existe entre un tinte y un cromgeno?

CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFAS.

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PRCTICA No. 8
TINCIONES DIFERENCIALES.
TINCION GRAM.
Objetivo.

Conocer el fundamento de la tincin Gram.


Realizar el procedimiento de coloracin de Gram con especies bacterianas conocidas.

Introduccin.
La observacin microscpica de las bacterias es ms fcil cuando se tien. Sin
embargo, es fcil confundir un punto o bastn teido sobre un fondo del mismo color con
algn artefacto. Este problema apareci cuando las muestras de tejido infectados se
tean con azul de metileno incluidas las bacterias. El primer intento para resolver el
problema fue decolorar los cortes despus de la coloracin. En los tejidos que tenan el
bacilo tuberculoso, esto fue efectivo pero en otros las bacterias se decoloraban igual que
los tejidos y no se ganaba nada. El problema fue resuelto por Hans Christian Gram,
patlogo dans que en 1884 introdujo un colorante de contraste despus de la
decoloracin. En esta tincin diferencial las bacterias se tean de color prpura obscuro
usando la llamada solucin de Ehrlich, violeta de genciana con anilina y los tejidos
circundantes con caf de Bismarck o vesuvina. Originalmente la coloracin Gram se
desarroll para visualizar las bacterias en los tejidos animales pero pronto se advirti
que era til para la diferenciacin de bacterias teidas por esta coloracin y se dividen
en dos grupos: las que requieren el violeta de genciana o cristal violeta o Gram positivas
y las que se decoloran y se tien con el colorante de contraste (generalmente) de color
rojo como la safranina o la fucsina bsica aunque puede usarse verde de malaquita para
los observadores daltnicos o Gram negativas.
La afinidad tintorial seguramente se debe a numerosas diferencias en la
estructura y composicin qumica de muchos componentes celulares entre los que
destaca la pared celular. Las bacterias Gram positivas tienen una pared compuesta
principalmente de una capa de peptidoglicano relativamente gruesa (20-80 nm). En
cambio, las Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano delgada (5-10 nm)
adems de una membrana externa constituida de fosfolpidos y lipolisacrido.
En general, las bacterias Gram positivas son susceptibles a la penicilina y varios
agentes qumicos y son ms resistentes a la desintegracin por tratamiento mecnico
que las Gram negativas, que como grupo, son ms susceptibles a otros antibiticos
como la estreptomicina. Las diferencias bsicas en las estructuras superficiales de las
bacterias Gram positivas y las Gram negativas contribuyen a aclarar la diferencia en la
respuesta de la coloracin de Gram. Durante la tincin Gram, ambos grupos de
bacterias se tien con el colorante primario (Cristal violeta) y mordente (yodo). El
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complejo formado colorante-mordente, es atrapado por la clula Gram positiva, por la


deshidratacin y la porosidad reducida de la gruesa pared celular, posterior a ello se
realiza un lavado diferencial con etanol al 95% y la clula Gram positiva tiene la
capacidad de retener el complejo y las Gram negativas por la delgada capa se
decoloran. Al adicionar el colorante secundario (safranina), las clulas decoloradas
ahora se tien fcilmente con el colorante de contraste, Gram negativas.

MATERIAL.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Solucin de cristal violeta.


Solucin de lugol.
Solucin de alcohol acetona.
Solucin de safranina.
Portaobjetos.
Microscopio.
Asa.
Puentes de coloracin.
Cepas: Escherichia coli, bacillus subtilis y Staphylococcus epidermidis.

METODOLOGA.
I.
1.
2.
3.
4.

5.
6.

Tincin Gram.
Hacer frotis de cada bacteria y fijarlos con calor.
Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto. Escurrir el
colorante y lavar con un chorro suave de agua.
Cubrir los frotis con solucin de Lugol y dejarlo actuar durante un minuto.
Escurrir el reactivo y lavar con un chorro suave de agua.
Colocar el frotis en forma vertical y usando un fondo blanco, decolorar aadiendo gota a
gota el alcohol-acetona durante 5 a 15 segundos. El momento exacto para terminar la
decoloracin con agua es cuando de fluir hilos de colorante por el frotis. Este es el
paso crtico de la tincin. Lavar inmediatamente con un chorro suave de agua.
Cubrir los frotis con safranina y dejarla actuar durante un minuto. Escurrir el colorante y
lavar con un chorro suave de agua. Dejar secar al, aire.
Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

ACTIVIDADES.
1.- Despus de aplicar la tcnica de Gram a las cepas proporcionadas y de acuerdo con
sus observaciones, indique en la tabla siguiente:

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Microorganismo.
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Staphylococcus epidermidis.

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Morfologa microscpica.
Forma.
Agrupacin.

Gram.

2.- Elabore esquemas de cada una de las preparaciones realizadas.

Escherichia coli

Bacillus subtilis

Staphylococcus epidermidis.

3.- Elabore esquemas a colores de una preparacin con una mezcla de bacterias Gram
negativos y positivos en cada uno de los pasos de la tincin Gram

Paso 1
Cristal violeta.

Paso 3
Cristal violeta + Lugol + decoloracin

Paso 2
Gram violeta + lugol.

Paso 4
Gram completo.

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CUESTIONARIO.
1.- Podras sustituir el colorante primario por algn otro colorante si no? Por qu?
2.- Cul es la composicin de la pared celular en bacteria Gram positiva y como es en
una Gram negativa, adems menciona sus componentes principales de cada una?
3.- Cul es la funcin del Lugol en la tincin Gram?
4.- Qu otros colorantes se pueden emplear en lugar de safranina?
5.- Qu sucedera si agregara el colorante secundario ms concentrado o por un
tiempo ms prolongado?
6.- Qu inconveniente encontrara si agregase primero la safranina en la tcnica?
7.- Qu es una coloracin supravital?

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFA.

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Prctica No. 9
TINCIN ZIEHL- NEELSEN.

OBJETIVOS.

Conocer el fundamento de la tincin Ziehl-Neelsen.

Realizar el procedimiento de coloracin de Ziehl-Neelsen para la diferenciacin de


bacterias cido-alcohol resistentes.
INTRODUCCIN.
La tincin de Ziehl-Neelsen es un tipo de coloracin diferencial que fue
desarrollado inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los
bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clnicas de pacientes. Roberto Koch
usaba tejidos previamente fijados en soluciones diversas. Ehrlich modific este
procedimiento para observar bacilos en preparaciones de esputo las cuales fijaba por
medio de calentamiento en horno de 100 a 110C directamente a la flama del mechero
y los tea de 15 a 30 minutos en una solucin saturada de anilina a la que aada
fucsina o violeta de metilo. La decoloracin con vesuvina era muy lenta, por lo que
recurri al uso de soluciones concentradas de cido ntrico. Como era difcil observar a
las bacterias teidas por su escasez y por todo el material incoloro que lo rodeaba,
procedi a contrastar el fondo, es decir si la tincin inicial era de color violeta lo
contrastaba con un colorante amarillo si la tincin inicial era de color rojo, el colorante
de contraste es azul. La tcnica de Ziehl-Neelsen usada actualmente es una ligera
modificacin de la original de Ehrlich.
La tcnica de tincin de Ziehl-Neelsen aprovecha las cualidades peculiares de las
bacterias de los gneros Mycobacterium y Nocardia que son decoloradas por soluciones
de alcohol cido, pero que se pueden teir con muy diversos colorantes si stos se
aplican en soluciones alcalinas con una pequea cantidad de fenol y calentando
suavemente por unos pocos minutos.
Los gneros mencionados presentan en su estructura un alto contenido de cidos
grasos de cadena muy larga constituidos en ceras y cidos miclicos y nocrdicos,
respectivamente. Estas ceras parecen jugar un papel importante en la respuesta de las
bacterias a la coloracin. Se ha postulado que el alto contenido de cidos grasos
interviene decisivamente en la coloracin ya que al calentar la preparacin con el
colorante primario hasta emisin de vapores se favorece la fusin de ceras y se aumenta
la energa cintica de las molculas, ambos fenmenos facilitan la penetracin del
colorante a la clula; al suspender el calentamiento y lavar con agua fra se provoca la
solidificacin de las ceras, de modo que el colorante ya no puede salir. Tambin se ha
postulado que la mezcla de colorante con fenol es ms soluble en lpidos bacterianos
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que en el agente decolorante, lo cual contribuye a su permanencia en el interior de las


clulas. Puesto que el proceso de decoloracin es muy enrgico, cualquier bacteria que
no contenga abundantes lpidos como los de Mycobacterium y Nocardia perder el
colorante primario durante la decoloracin y tomar el colorante de contraste que es el
azul de metileno.
Las bacterias que resisten la decoloracin por alcohol cido, se denominan bacilos
cido-alcohol resistentes (BAAR).
Actualmente la tincin de Ziehl-Neelsen tiene gran importancia como una de las pruebas
en el diagnstico de Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis,
enfermedad cuya incidencia est aumentando recientemente.

MATERIAL.
1. Muestra problema.
2. Fucsina fenicada.
3. Alcohol-cido.
4. Azul de metileno.
5. Portaobjetos.
6. Papel filtro.
7. Aplicador de madera.
8. Mechero de Bunsen.
9. Solucin desinfectante.
10. Charola para la tincin.
11. Puente de tincin.

METODOLOGA.
1. Hacer un frotis de la muestra problema. Dejar secar al aire y fijar al calor.
2. Colocar portaobjetos en charola de tincin y colocar el papel filtro sobre el frotis de
muestra.
3. Agregar la fucsina fenicada hasta cubrir totalmente el papel filtro.
4. Con el mechero calentar hasta la emisin de vapores, mantenindose as durante 5 a 10
minutos, agregar varias veces colorante de fucsina fenicada sobre la laminilla para evitar
que se deseque.
5. Lavar con chorro de agua suavemente.
6. Decolorar con alcohol-cido por 30 segundos.
7. Lavar abundantemente.
8. Agregar azul de metileno y dejar actuar entre 30 segundos y un minuto.
9. Lavar con chorro de agua suave.
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10. Secar al ambiente.


11. Observar en el microscopio.
ACTIVIDADES.
Realizar la secuencia esquematizada de la tincin realizada y un dibujo de lo observado
en el microscopio.

Observacin a:______x

1. Elabore un esquema que represente la pared celular de los BAAR destacando las partes
que lo constituyen.
CUESTIONARIO.
1. Qu es una coloracin diferencial?
2. La tincin de Gram, es una sustitucin adecuada para teir bacilos cido-alcohol
resistente?. Si no, por qu?
3. Qu coloracin toma el BAAR y cul el resto del campo?
4. A qu se le atribuye la facultad del cido-alcohol resistencia?
5. Cul es el mordente en la tcnica de Ziehl-Neelsen y por qu se le considera as?
6. En el Mycobacterium tuberculosis encontramos lpidos estructurales, mencinelos:
7. Adems de los lpidos, Qu otros componentes se han encontrado en el mismo
microorganismo?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFA.

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Prctica No. 10
TINCIONES SELECTIVAS.
(CPSULA Y ESPORAS).
OBJETIVOS.

Conocer el fundamento de algunas coloraciones selectivas que le permitan observar


estructuras bacterianas.
Efectuar varios procesos de coloraciones selectivas que le permitan observar las
estructuras bacterianas.

INTRODUCCIN.
Algunas estructuras bacterianas superficiales como: la cpsula o los flagelos y los
componentes interiores como: esporas, grnulos, grnulos metacromticos. Pueden
tener un valor taxonmico y ayudar a la identificacin de los microorganismos conforme
a la presencia de estas estructuras.
Para poder observarse se utilizan tcnicas de coloracin especiales.
A) ESPORAS (METODO DE SHAFFER FULTON).
Algunos gneros bacterianos entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en
su interior formas de resistencia denominadas esporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas
extremas, compuestos txicos, etc.), estas bacterias pueden pasar de un estado
vegetativo a un estado latente o espora.
Las esporas poseen unas cubiertas exclusivas y la localizacin en el interior de la clula
constituye una caracterstica de cada bacteria, las esporas aparecen en el microscopio
ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin.
Ciertas bacterias responden a los cambios desfavorables del medio ambiente. El grupo
de bacterias que presentan tal capacidad son: bacilos gram positivos aerobios y
anaerobios facultativos del gnero Bacillus entre los se encuentran: B. subtilis, B.
cereus, B. anthracis; y los bacilos gram positivos anaerobios estrictos del gnero
Clostridium: C. perfringens, C. botulinum, C. difficile.
Las esporas de estos grupos pueden encontrarse situadas a diferentes distancias dentro
del bacilo: para poder distinguirlas se acude a diversas tcnicas de coloracin. La forma
ms simple de observar a las esporas es como cuerpos refringentes intracelulares, en
suspensiones de bacterias sin teir o como reas incoloras dentro de las clulas

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bacterianas, teidas con los mtodos habituales. La pared de la espora es relativamente


impermeable, no obstante los colorantes pueden penetrar si se calienta la preparacin.
La tincin especfica de esporas, requiere dos colorantes:
Verde de malaquita: capaz de teir las esporas en caliente y en fro por un tiempo ms
prolongado.
Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.
Las esporas, tras la primera tincin no perdern el colorante en el lavado con agua y si
lo harn las formas vegetativas, las cuales quedarn teidas con el segundo colorante.

B) TINCIN NEGATIVA. (CAPSULA).


La cpsula de las bacterias que la presentan, sirve como mecanismo de defensa contra
algunas clulas fagocitarias por lo que constituye un importante factor de virulencia y
adherencia para las bacterias que la poseen. Esta estructura superficial es una
secrecin mucilaginosa generalmente formada por polisacridos. No tiene la misma
afinidad por los colorantes que otros componentes somticos, por ellos algunas tcnicas
tien la clula bacteriana y el campo, pero no la cpsula, y se observa por contraste, ya
que realmente se tie el fondo sobre el que est el microorganismo y pero no se van a
teir. Se puede emplear para ver la cpsula de S. pneumoniae y Cryptococcus
neoformans en el LCR.
La mejor tcnica para visualizar cpsulas se basa en realizar una tincin negativa
utilizando tinta china o nigrosina, colorante que no penetra la clula sino que ennegrece
el medio (efecto cielo estrellado) y los microorganismos aparecen refringentes sobre el
fondo negro. Es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de los microorganismos
en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de
cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.

MATERIAL PARA TINCIN DE ESPORAS.


1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Cepas de Bacillus subtilis.


Solucin de Verde de Malaquita al 5%
Eosina al 2.5%
Safranina al 0.5%
Portaobjetos
Asa
Mechero
Microscopio ptico

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METODOLOGA.
1. Hacer un frotis, dejar secar y fijar al calor.
2. Cubrir el frotis completamente con la solucin de Verde de Malaquita al 5%; Hervir por
20 segundos, cubriendo de colorante la preparacin para no dejar secar. Seguir por 30
segundos ms, hasta completar 3 minutos.
3. Dejar enfriar. (Evita que se rompa el portaojetos)
4. Lavar con agua corriente por 30 segundos.
5. Se cubre con Safranina al 0.5% por 30 segundos.
6. Se lava y se deja secar al ambiente.
7. Observar al microscopio.

1.
2.
3.
4.
5.
6.

MATERIAL PARA TINCIN DE CAPSULA.


Cultivo de 24 horas de cepa capsulada problema.
Tinta china negra.
Portaobjetos.
Asa.
Mechero.
Microscopio.

1.
2.
3.
4.

METODOLOGA:
Colocar en un portaobjetos una gota de tinta china
Tomar muestra de la cepa problema e inocular directamente sobre la tinta china.
Colocar un cubreobjetos.
Observar a 40x.

ACTIVIDADES.
Esquematizar los pasos de la tincin de esporas y la tincin negativa.
Dibujar e identificar la forma y posicin de la espora en la tincin realizada.
Dibujar lo que se observo en la tincin negativa.
CUESTIONARIO.
1.Qu es una tincin especial?
2.Qu funcin desempea la cpsula en la infertilidad de un organismo?
3-Se puede correlacionar siempre la presencia de cpsula en una especie patgena
con la virulencia?
4.Qu tipo de monosacridos se encuentran formando la cpsula?

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5. Hacer una lista de varias especies patgenas aerobias y anaerobias que formen
esporas as como enfermedades que ocasionan:
6. Cul es la funcin de las esporas?
7. El primer organismo que era agente etiolgico de una enfermedad fue formador de
esporas, De cul se trata?Cmo y quin lo descubri?

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFIA.

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PRCTICA No. 11
METABOLISMO DEL CARBONO.

OBJETIVO.

Realizar las pruebas bioqumicas para poner de manifiesto las actividades metablicas
que llevan a cabo los microorganismos sobre algunos azucares y cidos orgnicos, que
son tiles en la identificacin.

INTRODUCCIN.
El estudio de los microorganismos con base en la descripcin colonial y microscpica no
es suficiente para hacer una identificacin satisfactoria, es por ello que se tiene que
recurrir al estudio de su comportamiento fisiolgico, es decir, cmo se utilizan los
nutrimentos y qu sustancias producen. Para lograr esto existe un gran nmero de
pruebas metablicas que nos permiten llegar a la caracterizacin de un microorganismo
dado. El metabolismo es la suma de todos los procesos qumicos que ocurren dentro de
un individuo, es decir las reacciones qumicas que se producen en la clula y tiene tres
funciones, obtener energa del entorno, convertir nutrientes exgenos en precursores de
los componentes macromoleculares de las bacterias y degradar molculas necesarias
para cumplir funciones especficas. Para su estudio se divide en anabolismo y
catabolismo, el primero se refiere a las reacciones bioqumicas que suceden en la clula
para formar macromolculas y el segundo representa las reacciones que estn
involucradas en la conversin de los sustratos a formas ms simples y generalmente
ms oxidadas con el que se obtiene la energa requerida por el anabolismo.
Los tres principales procesos que conducen a la obtencin de energa y su conversin
en ATP, son la fermentacin, en el cual se obtiene ATP por fosforilacin oxidativa a nivel
de sustrato; la respiracin, en la que se obtiene ATP por fosforilacin oxidativa con el
oxgeno como aceptor final exgeno; y la fotosntesis que forma ATP mediante foto
fosforilacin.
La fermentacin es un proceso anaerbico en el cual tanto donadores como los
aceptores de electrones son compuestos orgnicos. Estos compuestos incluyen
carbohidratos, cidos orgnicos, aminocidos y otros ms. Existen varios tipos de
fermentaciones efectuadas por microorganismos. Los productos de fermentacin de
carbohidratos son principalmente cidos orgnicos, alcoholes, cetonas, y CO2. (Tabla
11.1)

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Tabla 11.1
Ejemplos de algunos tipos de fermentacin y microorganismos que las realizan.
Tipo de
Productos principales.
Ejemplos.
fermentacin.
Alcohlica
Etanol y CO2
Algunas levaduras y Zymomonas.
Lactobacillus, Streptococcus
Homolactica
cido lctico
Lactobacillus.
Heterolctica
cido lctico, etanol y CO2
Enterobacterias: Shigella sp,
2,3-Butanodiol, butanol,
Salmonella sp, Klebsiella sp,
cido mixta
succinato, lactato, acetato,
Escherichia coli
formiato, H2 y CO2
Clostridium butyricum
Butrica
Butirato, acetato, H2 y CO2
Propionibacterium, Clostridium
Propionica
Propionato, acetato, CO2
propionicum.
Clostridium aceticum, Acetobacterium.
Actica
Acetato.
Por otro lado se tiene la oxidacin, en este proceso hay un aceptor final exgeno que es
el oxgeno y se denomina respiracin aerobia y cuando es un compuesto inorgnico es
respiracin anaerobia. Algunas bacterias denominadas aerobias estrictas, solo pueden
crecer en presencia de oxgeno porque las vas fermentativas no producen suficiente
energa para su crecimiento. Otras, solo poseen la va fermentativa anaerobia y adems
la presencia de oxgeno es letal para ellas, estas bacterias denominadas anaerobias
estrictas, deben mantenerse y cultivarse en una atmsfera carente de oxgeno.
Por ltimo algunas bacterias denominadas microaerfilas activan su metabolismo a
concentraciones bajas de oxgeno, pero no crecen en la concentracin atmosfrica y lo
hacen muy lentamente en anaerobiosis estricta. Esta caracterstica referente a la
necesidad de oxgeno de una bacteria para desarrollar su catabolismo se denomina tipo
respiratorio.
MATERIALES.
1.
2.
3.
4.

Cepas problema.
Juego de bioqumicas (TSI, RM-VP, Malonato, Citrato)
Reactivo Rojo de metilo.
Asa, mechero.

METODOLOGA.
1. Ordenar las pruebas bioqumicas para inocular.
2. Seleccionar una colonia aislada de la cepa problema.
3. Tomar la colonia aislada con el asa.
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4. Con la misma colonia, sin volver a tomar, inocular toda la batera de las pruebas
bioqumicas proporcionadas.
5. Incubar 24 horas 37C.
No todas las pruebas bioqumicas se incuban durante 24 horas se necesita conocer los
fundamentos, detalles bioqumicos, de incubacin, forma de interpretacin, etc. Hay que
considerar que hay microorganismos de crecimiento lento que requieren incubaciones
ms prolongadas y que hay algunos incapaces de crecer en los medios de cultivo de las
pruebas.

Notas: Forma correcta para inocular las bacterias en las pruebas bioqumicas.

1.
2.
3.
4.

Picadura y estra.
Estra.
Picadura.
Suspensin.

Asa en punta.

Asa en aro.

ACTIVIDADES.
1.- Dibuja toda la batera original de tubos de las pruebas bioqumicas proporcionadas.
2.- Pasadas las 24 horas de incubacin dibuja la batera de pruebas bioqumicas con los
resultados obtenidos.
Importante: Algunas pruebas bioqumicas para poder interpretar su resultado es
necesario agregar reactivos: al tubo de Rojo de metilo se necesita adicionar dos a tres
gotas del reactivo rojo de metilo.
3.- Complementar la tabla de reporte de resultados del metabolismo del carbono.

Tabla.

Reporte de resultados de metabolismo del carbono.


TSI
CIT
MAL
Resultado

Tubo

Resultado

Tubo

Resultado

Tubo

RM-VP
Resultado

Tubo

K.
pneumoniae

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Escherichia
coli

Shigella

Salmonella

CUESTIONARIO.
1.- Cul es el fundamento de las 4 pruebas bioqumicas utilizadas en la prctica?
2.- Escriba cada una de las reacciones que se presentan en cada una de las pruebas.
3.-Realiza un esquema de un tubo de TSI e indica en que parte del tubo se lee la
fermentacin de la glucosa, la lactosa y sacarosa.
4.- Dibuja e interpreta todos los resultados posibles de una prueba de TSI.

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFA.

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PRCTICA No. 12
METABOLISMO DEL NITROGENO.

OBJETIVOS.

Aprender a leer e interpretar las diferentes pruebas bioqumicas por medio de la


capacidad que tienen las bacterias de utilizar o degradar aminocidos y otros
compuestos nitrogenados por su metabolismo aerobio y anaerobio.

INTRODUCCIN.
Los microorganismos adems de requerir de una fuente de carbono y una de energa,
necesitan de una fuente de nitrgeno para construir su propio material celular. Esta
fuente de nitrgeno puede ser orgnica (protenas, aminocidos y bases nitrogenadas).
Dentro del metabolismo de los aminocidos existen algunas enzimas capaces de
descarboxilar, desaminar o desulfurar completamente y la presencia o ausencia de
dichas enzimas son criterios de identificacin.
La Descarboxilacin se lleva a cabo por enzimas como las descarboxilasas de los
aminocidos bsicos como: lisina, ornitina y Arginina. Este es un proceso anaerbico
irreversible y requiere de la coenzima fosfato de piridoxal. Como productos de la
descarboxilacin de la lisina se produce cadaverina y CO2 y de la ornitina se produce
putrescina y CO2. La accin microbiana sobre la Arginina puede llegar a producir
putrescina despus de varias reacciones, por un lado por la descarboxilasa se produce
agmatina, la cual se puede seguir hacia putrescina con agmatina ureohidrolasa (o
agmatinasa), o bien con agmatina dihidrolasa forma amonio por desaminacin y
monocarbamil putrescina y esta a su vez se descarbamila para dar putrescina, CO 2 y
amoniaco.
Los aminocidos pueden sufrir tambin desaminacin. En el caso de la Arginina la
separacin hidroltica de un grupo amino produce citrulina y amonio, despus la citrulina
se descompone para producir ornitina y carbamil fosfato, este ltimo por accin
enzimtica produce NH3, CO2 y ATP. El amoniaco proviene tambin de la
descomposicin enzimtica de la urea por ureasa que tiene algunos microorganismos.
La Descarboxilacin subsecuente de la ornitina producida por esta va tambin puede
dar lugar a putrescina.
Algunas bacterias son capaces de liberar cido sulfhdrico como producto de la
degradacin de los aminocidos que contiene azufre (cistena y metionina) o de otros
azufrados como el tiosulfato. La enzima que libera el grupo sulfhdrilo de los
aminocidos es la cisteinasa y del tiosulfato la tiosulfato reductasa.
El Indol es uno de los productos del metabolismo del aminocido triptfano. Las
bacterias que posee la enzima triptofanasa son capaces de degradar tal aminocido, con
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produccin de indol, cido pirvico y amoniaco. El indol se puede detectar en un medio


apropiado y observar el desarrollo del color rojo, luego de aadir un reactivo que
contiene p-dimetilaminobenzaldehido (reactivo de Ehrlich o de Kovacs).
Utilizacin de un sustrato individual. La capacidad de un microorganismo de crecer en
presencia de un nico nutriente o fuente de carbono constituye un parmetro til para su
identificacin. Estas pruebas implican la inoculacin de microorganismos en un medio
que contenga una sola fuente de nutricin (ejemplo, citrato, malonato o acetato) y,
despus de la incubacin, la observacin del crecimiento en el medio. ste ltimo se
determina por la presencia o ausencia de colonias bacterianas o mediante el empleo de
un indicador de pH para detectar los productos finales de la actividad metablica.
Todas las pruebas bioqumicas para ser validadas necesitan tener testigos apropiados
que son: a) un medio sin inocular e incubado bajo las mismas condiciones que los
problemas, b) un testigo positivo, que es el mismo medio inoculado con una cepa de
referencia que de antemano se sabe que da la prueba positiva y c) un testigo negativo
que es el mismo medio inoculado con una cepa de referencia que de antemano se sabe
que da la prueba negativa.

1.
2.
3.
4.
5.
1.
2.
3.
4.
5.

MATERIALES.
Cepas problema.
Juego de bioqumicas (LIA, FEN, MIO, gelatina, Urea).
Reactivo de Kovacs.
Reactivo de cloruro frrico.
Asa, mechero.
METODOLOGA.
Ordenar las pruebas bioqumicas para inocular.
Seleccionar una colonia aislada de la cepa problema.
Tomar la colonia aislada con el asa.
Con la misma colonia, sin volver a tomar, inocular toda la batera de las pruebas
bioqumicas proporcionadas.
Incubar 24 horas 37C.
Notas: Forma correcta para inocular las bacterias en las pruebas bioqumicas.
Picadura y estra.
Estra.
Picadura.
Suspensin.

Asa en punta.

Asa en aro.

ACTIVIDADES.
1.- Dibuja toda la batera original de tubos de las pruebas bioqumicas proporcionadas.

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2.- Pasadas las 24 horas de incubacin dibuja la batera de pruebas bioqumicas.


Importante: Algunas pruebas bioqumicas para poder interpretar su resultado es
necesario agregar reactivos: al tubo de Fenilalanina se adiciona 2 a 3 gotas de cloruro frrico, y
el tubo MIO y SIM se adiciona 2 gotas de reactivo de Kovacs para interpretar el indol.

3.- Complementar la tabla de reporte de resultados del metabolismo del nitrgeno.

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CUESTIONARIO.
1.- Diga cul es el fundamento de las pruebas bioqumicas con formulas y reacciones de
las siguientes: LIA, MIO, UREA, gelatina, Fenilalanina.
2.- Defina los siguientes conceptos: enzima, sustrato, metabolito primario y metabolito
secundario.
3.- Escriba los nombres de dos especies bacterianas que produzcan alguna algunas
de las siguientes enzimas a) Ureasa, b) Catalasa, c) Gelatinasa, d) Fenilalanina
desaminasa, e) Lisina-descarboxilasa, f) Lisina-desaminasa g) Triptofanasa.

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFIA.

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PRCTICA No. 13
ACCIN DE LOS ANTIBITICOS SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO

OBJETIVO
Conocer los fundamentos y la metodologa para la realizacin de las pruebas de
sensibilidad a los antibiticos (antibiograma) sobre determinadas cepas de laboratorio.

INTRODUCCIN
Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por ciertos microorganismos que en
bajas concentraciones tienen la capacidad de inhibir el crecimiento o matar otros
microorganismos. Son metabolitos secundarios no esenciales que sintetizan cuando el
microorganismo productor se encuentre en la fase estacionaria. La mayora de los
antibiticos son producidos por bacterias del suelo, principalmente actinobacterias del
gnero Streptomyces y algunas especies de Bacillus, entre los organismos eucariticos
se pueden mencionar a diversos hongos de los gneros Penicillium, Cephalosporium y
Aspergillus. Los antibiticos constituyen una clase especial de agentes
quimioteraputicos naturales, aunque actualmente existen antibiticos semisintticos,
que tienen modificaciones en la molcula original, y antibiticos sintticos, obtenidos
mediante procedimientos qumicos aunque originalmente fueran producidos por
microorganismos.
Existe una gran cantidad de antibiticos, sin embargo, menos del 1% han tenido alguna
utilidad prctica en la medicina, zootecnia, agricultura o ingeniera gentica. Los
antibiticos se producen a escala industrial a travs de procesos de fermentacin con
cepas sobre-productoras mejoradas genticamente. Por otra parte, la modificacin
qumica o por ingeniera gentica y la bsqueda de nuevos antibiticos ms eficientes
continua, debido a que siguen apareciendo cepas de microorganismos con resistencia
inherente o adquirida a los antibiticos de uso corriente en agricultura, alimentacin
animal y medicina, ya que prevalece la utilizacin indiscriminada e irresponsable de
muchos de ellos. El problema se ha vuelto tan grave que algunos cientficos creen que la
era de los antibiticos est cercana a su desaparicin.
Al conjunto de grupos de bacterias que un antibitico en partculas afecta se le conoce
como espectro de accin. En general, las bacterias Gram positivas son ms sensibles
que las Gram negativas. Aun as, existen antibiticos de amplio espectro que actan
sobre ambos grupos.
Los antibiticos suelen agruparse con base en su estructura qumica o en su forma de
accin.

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Figura 13.1 Sitios de accin de los antibiticos sobre las bacterias.

Los microorganismos pueden presentar resistencia a un antibitico debido a que:


a) La estructura blanco sobre la que el antibitico acta se encuentra modificada o no
existe.
b) Poseen una barrera de permeabilidad al antibitico.
c) Modifican enzimticamente al antibitico inactivndolo.
d) Han desarrollado mutaciones genticas que alteran la va metablica sobre la que acta
el antibitico.
El papel ecolgico que parecen tener los antibiticos es el de conferir una ventaja
competitiva a los microorganismos que los producen en microambientales muy
competitivos. Sin embargo es tema de discusin el papel fisiolgico que tienen estas
molculas de biosntesis altamente especializada, compleja y energticamente costosa.
La determinacin de la sensibilidad de los aislamientos bacterianos hacia agentes
antimicrobianos es una de las tareas ms importantes de la microbiologa clnica. La
sensibilidad de un cultivo puede ser determinada en forma fcil por el mtodo de difusin
en agar. El procedimiento recomendado por la Food and Drug Administration (FDA) de
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los Estados Unidos, es el de Kirby-Bauer, en que se colocan discos de papel filtro con
concentraciones conocidas de diferentes antibiticos sobre una placa sembrada con el
microorganismo en estudio. Despus de incubar se ponen de manifiesto halos de
inhibicin para los antimicrobianos hacia los cuales son susceptibles los
microorganismos. Tambin se emplean los mtodos de diluciones en tubo, en
microplaca y en agar. Estas tcnicas permiten determinar la concentracin mnima
inhibitoria (CMI) que es la ms baja concentracin de una cantidad determinada de
bacterias. Permite asignar a un organismo en las categoras de sensible, resistente o
intermedio y brinda al mdico la posibilidad de elegir el antibitico ms apropiado para
cada caso en particular.

Lectura interpretada del antibiograma.


La lectura interpretada del antibiograma no debe confundirse con el proceso de simple
interpretacin de los resultados de las pruebas de sensibilidad.
Los criterios utilizados son establecidos por diferentes grupos y comits de expertos
internacionales (Clinical Laboratory Estndars Institute, European Commitee on
Antimicrobial Susceptibility Testing, etc.), y se crean en funcin del conocimiento
microbiolgico, los datos farmacolgicos y la respuesta teraputica o correlacin entre el
antibiograma y el xito teraputico. En la lectura interpretada se efecta un anlisis
fenotpico de los resultados de las pruebas de sensibilidad, en base al conocimiento de
los mecanismos de resistencia y en su expresin, ste procedimiento tiene como
principal objetivo la deteccin de la resistencia y la prediccin del fracaso teraputico.
Lectura interpretada del antibiograma: deteccin fenotpica de los mecanismos de
resistencia. Se requiere realizar una combinacin de antibiticos marcadores e
inhibidores de los mecanismos de resistencia. Entre ellos destacan los inhibidores de
betalactamasas, como el cido clavulnico, que asociado a ceftazidima o cefotaxima
permite deducir la presencia de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en
enterobacterias; otro ejemplo es la combinacin de cefoxitina con oxacilina para predecir
la resistencia a los antibiticos beta lactmicos en Staphylococcus aureus.

MATERIAL

Placas de Petri con gelosa Mueller Hinton.


Tubos de caldo Mueller Hinton.
Tubo 0.5 de la escala de Mac Farland.
Tubo de caldo Mueller Hinton.
Asa bacteriolgica.
Hisopos estriles.
Pinzas.

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Mechero de Bunsen.
Sensidiscos para bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Cepa de Staphylococcus aureus,
Cepa de Escherichia coli.

METODOLOGA.
Procedimiento de difusin del antibitico en agar empleando sensidiscos.
(procedimiento de Kirby Bauer)
1. Realizar la preparacin del inculo de la siguiente forma: tomar con el asa bacteriolgica
una colonia aislada de la cepa pura.
2. Hacer una suspensin de la colonia, utilizando para ello un tubo con caldo Mueller
Hinton. En caso de que se trate de una suspensin de microorganismos Gram
negativos, se lleva el tubo a incubacin por un lapso de 1 a 2 horas a 37C para su
posterior utilizacin. En caso de tratarse de una cepa de microorganismos Gram
positivos la suspensin no requerir de incubacin.
3. La suspensin bacteriana se debe ajustar la turbidez del tubo 0.5 de la escala de Mc
Farland.
4. Posteriormente, tomar un hisopo estril e introducirlo en el caldo Mueller Hinton.
5. Antes de sacar el hisopo del caldo, eliminar el exceso de lquido apoyndose de las
paredes del tubo de ensaye.
6. Tomar la placa de Petri con la Gelosa Mueller Hinton e inocular con el hisopo toda la
superficie del medio con una estra masiva. Girar el hisopo durante el estriado.
7. Finalmente, pasar el hisopo por la periferia de la placa con gelosa.
8. Dejar secar la superficie de la placa.
9. Antes de 15 minutos, realizar la colocacin de los discos de antibiticos con ayuda de
una pinza previamente desinfectada con la flama del mechero. (Los discos tiene que
estar previamente atemperados).
10. Tomar los discos con las pinzas en forma asptica. Un disco no debe ser removido una
vez que tom contacto con la superficie del agar debido a que algunos antibiticos se
difunden rpidamente.
11. Al aplicar el disco en el agar hacer una presin con ayuda de la pinza a fin de dejarlo
fijo.
12. Incubar a 37C por 24 horas.
13. Medir con ayuda de una regla el dimetro en milmetros de las zonas de inhibicin.
14. Reportar observaciones y resultados.
Distribucin de los discos sobre las placas de gelosa Mueller Hinton, de acuerdo su
clasificacin Gram.
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Para Staphylococcus aureus

AN

SxT

CC
FOX

CIP

Para Escherichia coli


AN

SxT

CIP
AmC

CAZ

CRO

AM

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RESULTADOS.
1. Anotar en la tabla siguiente el efecto de los diferentes antibiticos sobre el crecimiento
de cada uno de los microorganismos utilizados durante la prctica.

Microorganismo Gram positivo: Staphylococcus aureus


Interpretacin del resultado:
Antibitico
Dimetro en mm
Sensible, resistente o intermedio

Dibuja tu placa despus de la incubacin.

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Microorganismo Gram negativo: Escherichia coli


Interpretacin del resultado:
Antibitico
Dimetro en mm
Sensible, resistente o intermedio

Dibuja tu placa despus de la incubacin.

CUESTIONARIO.
1. Cmo influye el medio de cultivo en el antibiograma?
2. La respuesta que se observa in vitro (antibiograma), es la misma que in vivo?
3. Mencionar los factores que pueden influir en la actividad de los antibiticos in vivo?
4. Describir brevemente otros mtodos que pueden emplearse en la determinacin de la
sensibilidad a los antimicrobianos.
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5. Describir la clasificacin de los antibiticos.

OBSERVACIONES.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFA.

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BIBLIOGRAFA.

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