Journal Oficiel de L'union Européenne-Solubilité Dans L'eau

FR
19.3.2014
Journal officiel de lUnion europenne
L 81/3
ANNEXE
Lannexe du rglement (CE) no 440/2008 est modifie comme suit:
1) le chapitre A.6 est remplac par le texte suivant:
A.6. SOLUBILIT DANS LEAU
INTRODUCTION
1.
La prsente mthode dessai est quivalente la ligne directrice 105 (1995) de lOCDE pour les essais de produits
chimiques. Cette mthode dessai constitue une rvision de la ligne directrice 105 adopte en 1981. Sil ny a pas
eu de modification de fond, la prsentation a t remanie. La rvision sappuie sur la mthode dessai Hydro
solubilit de lUnion europenne (1).
REMARQUES PRLIMINAIRES
2.
La prsence dimpurets peut considrablement modifier la solubilit dune substance dans leau. La prsente
mthode dessai porte sur la mesure de la solubilit de substances essentiellement pures, stables dans leau et non
volatiles. Avant de dterminer la solubilit dans leau, il est utile de disposer dinformations sur la substance telles
que la formule dveloppe, la pression de vapeur, la constante de dissociation et lhydrolyse en fonction du pH.
3.
Les deux mthodes dcrites dans cette mthode dessai, la mthode par lution sur colonne et la mthode du
flacon, couvrent respectivement les solubilits infrieures et suprieures 102 g/l. Un essai prliminaire simple
est galement dcrit. Il permet de dterminer approximativement la quantit de substance utiliser dans lessai
proprement dit, ainsi que le temps ncessaire pour atteindre la saturation.
DFINITIONS ET UNITS
4.
La solubilit dune substance dans leau est la concentration massique de saturation de cette substance dans leau
une temprature donne.
5.
La solubilit dans leau est exprime en masse de solut par volume de solution. Lunit SI est le kg/m3, mais on
utilise galement le g/l.
SUBSTANCES CHIMIQUES DE RFRENCE
6.
Il ny a pas lieu demployer des substances de rfrence lorsquon tudie une substance.
DESCRIPTION DES MTHODES
Conditions de lessai
7.
Lessai est pratiqu de prfrence 20 C 0,5 C. La temprature choisie sera maintenue constante dans toutes
les parties du dispositif exprimental o elle peut avoir une influence.
Essai prliminaire
8.
Des volumes deau croissants sont ajouts progressivement environ 0,1 g dchantillon (les solides doivent tre
pulvriss), temprature ambiante, dans un flacon gradu de 10 ml ferm par un bouchon en verre. Aprs
chaque ajout deau, le mlange est agit pendant 10 minutes. On vrifie ensuite visuellement si lchantillon est
compltement dissous. Si des parties non dissoutes de lchantillon subsistent aprs laddition de 10 ml deau,
lessai se poursuit dans un flacon gradu de 100 ml. La solubilit approximative est indique dans le tableau 1,
au-dessous du volume deau qui dissout compltement lchantillon. Si la solubilit est faible, le temps requis
pour dissoudre la substance peut tre long et il faut attendre au moins 24 heures. Si aprs 24 heures la substance
nest toujours pas dissoute, il y a lieu dattendre jusqu 96 heures ou de procder une dilution plus pousse,
afin de dterminer sil convient dutiliser la mthode par lution sur colonne ou la mthode du flacon.
Tableau 1
ml deau
0,1 g
dissolvant
solubilit approxima
tive en g/l
0,1
0,5
10
100
> 100
> 1 000
1 000 200
200 100
100 50
50 10
10 1
< 1
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Mthode par lution sur colonne

Principe
9.
Il sagit dluer la substance tudier avec de leau dune microcolonne remplie dun support inerte et prala
blement revtu dun excs de la substance tudier (2). La solubilit correspond au plateau de la courbe de la
concentration massique de lluat en fonction du temps.
Appareillage
10. Lappareil se compose dune microcolonne (figure 1) thermostate, relie soit une pompe de recirculation
(figure 2), soit un rservoir de remise niveau (figure 3). La microcolonne contient un support inerte maintenu
en place par un petit tampon de laine de verre, qui sert aussi filtrer les particules. Divers matriaux peuvent
tre employs comme support: billes de verre, terre de diatomes ou autres matriaux inertes.
11. La microcolonne reprsente la figure 1 convient au montage comportant une pompe de recirculation. Elle a
un volume tampon correspondant cinq fois le volume de son lit (les premiers cinq volumes de lit sont rejets
au dbut de lexprience) et au volume de cinq chantillons (prlevs pour analyse pendant lexprience). On peut
cependant rduire le volume tampon condition de pouvoir ajouter de leau au systme pendant lexprience
pour remplacer les premiers cinq volumes de lit limins avec les impurets. La colonne est relie, par un tuyau
en matriau inerte, une pompe de recirculation capable de pomper environ 25 ml/h. La pompe de recirculation
peut tre, par exemple, une pompe pristaltique ou une pompe membrane. Il faut veiller ce que le matriau
du tuyau noccasionne aucune contamination et/ou adsorption.
12. Un montage comportant un rservoir de remise niveau est schmatis la figure 3. Dans ce montage, la
microcolonne est munie dun robinet darrt une voie. Elle est relie au rservoir de remise niveau par un
tube en matriau inerte et un raccord en verre rod. Le dbit du rservoir de remise niveau doit avoisiner
25 ml/h.
Figure 1
Dimensions en mm
A.
Raccordement pour joint en verre rod
B.
Volume tampon
C.
Diamtre intrieur 5
D.
Diamtre extrieur 19
E.
Tampon en laine de verre
F.
Robinet darrt
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Figure 2
A.
quilibrage atmosphrique
B.
Dbitmtre
C.
Microcolonne
D.
Pompe de circulation thermostate
E.
Pompe de recirculation
F.
Robinet deux voies pour lchantillonnage

Figure 3
A.
Rservoir de remise niveau (par exemple, un flacon de laboratoire de 2,5 litres)
B.
Colonne
C.
Collecteur de fractions
D.
Thermostat
E.
Tuyau en tflon
F.
Joint en verre rod
G.
Conduite deau (entre le thermostat et la colonne, diamtre intrieur denviron 8 millimtres)
13. Verser environ 600 mg de matriau de support dans un flacon fond rond de 50 ml. Dissoudre une quantit
approprie de substance tudier dans un solvant volatil de qualit pour analyse et ajouter une quantit
dtermine de cette solution au matriau support. Le solvant doit tre compltement vapor, par exemple
laide dun vaporateur rotatif, sinon leau ne pourra pas saturer le support pendant llution cause dun effet de
rpartition la surface. Faire tremper le support charg pendant deux heures dans environ 5 ml deau et verser la
suspension dans la microcolonne, ou bien verser le support sec dans la microcolonne dj remplie deau et le
laisser squilibrer pendant deux heures.
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14. Le chargement du support peut causer des problmes conduisant des rsultats errons, par exemple lorsque la
substance tudier est dpose sous forme dhuile. Ces problmes doivent tre examins et dtaills dans le
rapport.
Mthode avec une pompe de recirculation
15. La circulation dans la colonne est amorce. Il est recommand dappliquer un dbit denviron 25 ml/h, soit dix
volumes de lit par heure pour la colonne dcrite. Les premiers cinq volumes de lit au moins sont rejets pour
liminer les impurets hydrosolubles. Aprs quoi, on laisse fonctionner la pompe jusqu ce que lquilibre soit
atteint. Lquilibre est attest lorsque lanalyse de cinq chantillons successifs donne des concentrations qui ne
diffrent pas de plus de 30 % de faon alatoire. Ces prlvements doivent tre spars entre eux par des
intervalles de temps correspondant au passage dau moins dix volumes de lit. Avec certaines mthodes analy
tiques, il peut tre prfrable de dmontrer que lquilibre est atteint laide dune courbe de la concentration en
fonction du temps.
Mthode avec rservoir de remise niveau
16. Des fractions successives dluat sont recueillies et analyses suivant la mthode choisie. Les fractions du milieu
de lintervalle dlution, l o la concentration demeure constante 30 % prs dans au moins cinq prlve
ments conscutifs, servent dterminer la solubilit.
17. Leau bidistille est le meilleur luant. On peut aussi utiliser de leau dsionise, caractrise par une rsistivit
suprieure 10 mgaohms/cm et une teneur totale en carbone organique infrieure 0,01 %.
18. Pour chaque mthode, lopration est rpte en rduisant le dbit de moiti. Si les rsultats des deux oprations
concordent, lessai est satisfaisant. Si lon mesure une solubilit plus leve avec le dbit infrieur, il y a lieu de
continuer diminuer le dbit de moiti jusqu ce que deux essais successifs donnent la mme solubilit.
19. Pour chaque mthode, il faut vrifier la prsence de matires collodales dans les fractions, par dtection de leffet
Tyndall. La prsence de particules fausse les rsultats et lessai doit tre rpt aprs avoir amlior le pouvoir de
filtration de la colonne.
20. Le pH de chaque chantillon doit tre mesur, de prfrence au moyen de bandelettes indicatrices spciales.
Mthode du flacon
Principe
21. La substance est dissoute dans leau (les solides doivent tre pulvriss) une temprature lgrement suprieure
celle de lessai. Une fois la saturation obtenue, le mlange est refroidi et maintenu la temprature de lessai. Il
est toutefois possible de raliser la mesure directement, la temprature de lessai, si un chantillonnage
pertinent prouve que lquilibre de saturation a t atteint. Ensuite, la concentration de la substance est dter
mine par une mthode analytique approprie (3). La solution analyse ne doit contenir aucune particule non
dissoute.
Appareillage
22. Le matriel suivant est requis:
verrerie et instruments courants de laboratoire,
dispositif pour agiter les solutions temprature constante,
si ncessaire, une centrifugeuse (thermostate de prfrence) pour les mulsions,
quipement danalyse.
Mode opratoire
23. valuer la quantit de substance ncessaire pour saturer le volume deau voulu, la lumire de lessai prlimi
naire. Introduire lquivalent denviron cinq fois cette quantit dans chacun des trois rcipients en verre munis
dun bouchon en verre (tubes centrifuger, flacons, par exemple). Ajouter un volume deau, choisi en fonction
de la mthode analytique et de la gamme de solubilit, dans chaque rcipient. Les rcipients sont bouchs
hermtiquement et ensuite agits 30 C. Il convient dutiliser un systme dagitation ou mlangeur capable de
fonctionner temprature constante, par exemple un agitateur magntique combin un bain-marie thermos
tat. Aprs un jour, laisser lun des rcipients squilibrer pendant 24 heures la temprature de lessai en
lagitant de temps en temps. Centrifuger ensuite le contenu du rcipient la temprature de lessai et dterminer,
par une mthode analytique idoine, la concentration de la substance dans la phase aqueuse limpide. Les deux
autres flacons sont traits de la mme manire aprs avoir t quilibrs 30 C pendant deux et trois jours
respectivement. Si les concentrations mesures au moins dans les deux derniers flacons ne diffrent pas de plus
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de 15 %, lessai est satisfaisant. Si les rsultats obtenus avec les flacons 1, 2 et 3 tendent crotre, il est ncessaire
de refaire tout lessai en appliquant des temps dquilibrage plus longs.
24. Lessai peut aussi tre conduit sans princubation 30 C. Afin destimer la rapidit avec laquelle stablit
lquilibre de saturation, des chantillons sont prlevs jusqu ce que la dure de lagitation ninfluence plus
les concentrations mesures.
25. Le pH de chaque chantillon doit tre mesur, de prfrence au moyen de bandelettes indicatrices spciales.
Dterminations analytiques
26. Il est prfrable demployer une mthode danalyse spcifique pour la substance, de petites quantits dimpurets
solubles pouvant fausser gravement la mesure de la solubilit. Parmi les mthodes possibles, citons la chromato
graphie en phase gazeuse ou liquide, le titrage, la photomtrie, la voltamtrie.
RSULTATS ET RAPPORT
Rsultats
27. Pour chaque essai, il faut calculer la moyenne et lcart-type sur au moins cinq chantillons conscutifs issus du
plateau de saturation. Les moyennes tablies partir de deux essais pratiqus des dbits diffrents ne doivent
pas scarter de plus de 30 %.
Mthode du flacon
28. On calcule la moyenne des rsultats obtenus avec chacun des trois flacons. Ces rsultats ne doivent pas diffrer
de plus de 15 %.
Rapport dessai
29. Le rapport dessai doit comporter les informations suivantes:
rsultats de lessai prliminaire,
identit chimique de la substance et impurets (tape de purification prliminaire, le cas chant),
concentration, dbit et pH pour chaque chantillon,
moyennes et carts-type sur au moins cinq chantillons provenant du plateau de saturation pour chaque
essai,
moyenne dau moins deux essais successifs,
temprature de leau au cours du processus de saturation,
mthode danalyse,
nature du matriau du support,
chargement du support,
solvant utilis,
toute manifestation dinstabilit chimique de la substance pendant lessai,
toute information utile linterprtation des rsultats, notamment en ce qui concerne les impurets et ltat
physique de la substance.
Mthode du flacon
30. Le rapport dessai doit comprendre les informations suivantes:
rsultats de lessai prliminaire,
identit chimique de la substance et impurets (tape de purification prliminaire, le cas chant),
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rsultats danalyse individuels et moyenne si plus dune valeur a t dtermine pour un mme flacon,
pH de chaque chantillon,
moyenne des valeurs de diffrents flacons lorsque celles-ci concordent,
temprature de lessai,
mthode danalyse,
toute manifestation dinstabilit chimique de la substance pendant lessai,
toute information utile linterprtation des rsultats, notamment en ce qui concerne les impurets et ltat
physique de la substance.
BIBLIOGRAPHIE:
(1) Directive 92/69/CEE de la Commission du 31 juillet 1992 portant dix-septime adaptation au progrs technique
de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions lgislatives, rglementaires
et administratives relatives la classification, lemballage et ltiquetage des substances dangereuses (JO L 383 du
29.12.1992, p. 113).
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (septembre 1985). Produits chimiques usage industriel Dtermination de la solubilit
dans leau des solides et liquides faible solubilit Mthode de llution sur colonne
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (septembre 1985). Produits chimiques usage industriel Dtermination de la solubilit
dans leau des solides et liquides forte solubilit Mthode du flacon.
2) le chapitre A.23 suivant est ajout:
A.23 COEFFICIENT DE PARTAGE (1-OCTANOL/EAU): MTHODE DU BRASSAGE LENT
INTRODUCTION
1.
chimiques. La mthode du brassage lent a permis de dterminer avec exactitude des valeurs logarithmiques du
coefficient de partage 1-octanol/eau (POE) allant jusqu 8,2 (1). Aussi constitue-t-elle une approche exprimentale
approprie pour la dtermination directe du POE de substances fortement hydrophobes.
2.
Les autres mthodes de dtermination du coefficient de partage 1-octanol/eau (POE), sont la mthode par
agitation en flacon (2) et la mthode par HPLC phase inverse (3). La mthode par agitation en flacon est
sujette des artfacts dus au transfert de micro-gouttelettes doctanol dans la phase aqueuse. Lorsque les
valeurs du POE augmentent, la prsence de ces gouttelettes dans la phase aqueuse engendre une surestimation
croissante de la concentration de la substance dessai dans leau. Aussi lusage de cette mthode est-il limit aux
substances dont le log POE est < 4. partir de valeurs fiables du POE directement dtermines, la deuxime
mthode talonne la relation entre le temps de rtention sur la colonne HPLC et des valeurs mesures du POE. Il
existait un projet de ligne directrice de lOCDE permettant de dterminer les coefficients de partage 1-octanol/eau
de substances ionisables (4), mais il ne doit plus tre utilis.
3.
La prsente mthode dessai a t labore aux Pays-Bas. La prcision des mthodes dcrites dans ce pays a t
valide et optimise au cours dun essai tournant de validation auquel ont particip 15 laboratoires (5).
Signification et utilisation
4.
Sagissant des substances organiques inertes, une relation trs significative a t mise en vidence entre leur
coefficient de partage 1-octanol/eau (POE) et leur bioaccumulation dans les poissons. De plus, une corrlation
entre le POE et, dune part, la toxicit pour les poissons et, dautre part, la sorption de produits chimiques sur des
solides tels que les sols et les sdiments, a galement t dmontre. La rfrence (6) livre un large aperu de ces
relations.
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5.
Des relations trs diverses entre le coefficient de partage 1-octanol/eau et dautres proprits des substances
intressant la chimie et la toxicologie environnementales ont t tablies. Le coefficient de partage 1-octanol/eau
est ainsi devenu un paramtre fondamental dans lvaluation des risques des substances chimiques pour len
vironnement et dans la prdiction du devenir de ces substances dans lenvironnement.
Champ dapplication
6.
La mthode du brassage lent est cense rduire la formation de micro-gouttelettes de 1-octanol dans la phase
aqueuse, ce qui carte le problme de la surestimation de la concentration en phase aqueuse due la prsence de
molcules de la substance dessai dans ces gouttelettes. Par consquent, la mthode du brassage lent convient
particulirement la dtermination du POE de substances dont le log POE est supposment suprieur ou gal 5,
gamme dans laquelle la mthode par agitation en flacon (2) tend fournir des rsultats faussss.
DFINITION ET UNITS
7.
Le coefficient de partage dune substance entre leau et un solvant lipophile (1-octanol) caractrise la rpartition
lquilibre de la substance chimique entre les deux phases. Le coefficient de partage entre leau et le 1-octanol
(POE) est dfini comme tant le rapport des concentrations lquilibre de la substance dessai dans du 1-octanol
satur avec de leau (CO) et dans de leau sature avec du 1-octanol (CE).
POE = CO/CE
Le rapport de deux concentrations est une valeur adimensionnelle. Il est exprim le plus souvent par son
logarithme dcimal (log POE). Le POE dpend de la temprature et les rsultats rapports doivent prciser la
temprature de mesure.
PRINCIPE DE LA MTHODE
8.
En vue de dterminer le coefficient de partage, on laisse le systme form par leau, le 1-octanol et la substance
dessai squilibrer temprature constante. Ensuite, on mesure les concentrations de la substance dessai dans les
deux phases.
9.
La mthode du brassage lent, propose ici, permet de rduire les difficults exprimentales associes la
formation de micro-gouttelettes dans la mthode par agitation en flacon. Avec le brassage lent, leau, le 1octanol et la substance dessai squilibrent dans un racteur thermostat soumis une agitation douce. Les
changes entre les phases sont acclrs par le brassage. Ce dernier produit une lgre turbulence qui favorise les
changes entre le 1-octanol et leau sans provoquer la formation de gouttelettes (1).
APPLICABILIT DE LESSAI
10. La prsence de substances autres que la substance dessai risquant dinfluencer le coefficient dactivit de la
substance dessai, celle-ci doit tre teste ltat pur. Il convient demployer une substance dessai prsentant le
degr de puret le plus lev que lon puisse trouver dans le commerce.
11. Cette mthode sapplique aux substances pures qui ne se dissocient ni sassocient et qui ne manifestent aucune
activit interfaciale sensible. Cette mthode convient galement aux mlanges. Le cas chant, les coefficients de
partage 1-octanol/eau dtermins varient en fonction de la composition chimique du mlange test et de la
composition lectrolytique employe comme phase aqueuse. condition de prendre certaines mesures suppl
mentaires, cette mthode peut aussi sappliquer des substances qui se dissocient ou sassocient (paragraphe 12).
12. Le partage des substances sujettes la dissociation, telles que les acides organiques et les phnols, les bases
organiques et les composs organomtalliques, entre leau et le 1-octanol comportant de multiples quilibres
dans ces phases, le POE est une constante conditionnelle qui dpend fortement de la composition lectrolytique
(7) (8). Do la ncessit de contrler le pH et la composition lectrolytique lors de la dtermination du POE et de
rapporter les valeurs de ces deux paramtres. Lvaluation de ces coefficients de partage doit tre confie un
expert. Il convient de slectionner des valeurs de pH appropries daprs la valeur de la ou des constantes de
dissociation, afin dtablir un coefficient de partage pour chaque tat dionisation. Les composs organomtal
liques doivent tre tests laide de tampons non complexants (8). la lumire des connaissances actuelles en
matire de chimie en phase aqueuse (constantes de complexation et de dissociation), on choisira des conditions
exprimentales permettant destimer la formation despces par la substance dessai en phase aqueuse. Il faut
instaurer une force ionique identique dans toutes les expriences en employant un lectrolyte de fond.
13. Les substances peu solubles dans leau ou prsentant un POE lev peuvent engendrer des problmes dus au fait
que leurs concentrations dans leau sont si faibles quil devient difficile de les dterminer avec exactitude. La
prsente mthode dessai livre des indications sur la manire de traiter ce problme.
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INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE DESSAI

14. Le degr de puret des ractifs chimiques doit au moins correspondre celui de la qualit pour analyse. Il est
recommand dutiliser des substances dessai non marques de composition chimique connue et dune puret
dau moins 99 % ou des substances dessai radiomarques de composition chimique et puret radiochimique
connues. Sil sagit de traceurs demi-vie courte, on appliquera des corrections pour tenir compte de la
dsintgration. Si la substance dessai est radiomarque, il y a lieu demployer une mthode analytique spcifique
la substance de telle sorte que la radioactivit mesure se rapporte directement la substance dessai.
15. Il est possible destimer le log POE avec les logiciels vendus dans le commerce cet effet, ou en sappuyant sur le
rapport des solubilits dans les deux solvants.
16. Avant de dterminer le POE par la mthode du brassage lent, il faut disposer des informations suivantes sur la
substance dessai:
a) formule structurale;
b) mthodes analytiques appropries la dtermination de la concentration de la substance dans leau et dans le
1-octanol;
c) constante(s) de dissociation des substances ionisables [ligne directrice 112 de lOCDE (9)];
d) solubilit dans leau (10);
e) hydrolyse abiotique (11);
f) biodgradabilit immdiate (12);
g) pression de vapeur (13).
DESCRIPTION DE LA MTHODE
Matriel et appareillage
17. Cette exprience ncessite du matriel courant de laboratoire, et en particulier:
des agitateurs magntiques et des barres dagitation magntiques recouvertes de Teflon pour agiter la phase
aqueuse,
des instruments danalyse permettant de dterminer la concentration de la substance dessai aux concen
trations attendues,
une bouteille agiter munie dun robinet sa base. Suivant lestimation du log POE et le seuil de dtection de
la substance dessai, on envisagera dutiliser un racteur dun volume suprieur un litre, de la mme
gomtrie, de manire obtenir un volume deau suffisant pour lextraction et lanalyse chimiques de la
substance dessai. La concentration de la substance dessai dans lextrait aqueux sera donc plus leve, ce qui
rendra la dtermination analytique plus fiable. Un tableau reproduisant des estimations du volume minimal
requis, le seuil de dtection de la substance, lestimation de son log POE et de sa solubilit dans leau figure en
appendice 1. Ce tableau se fonde sur la relation entre le log POE et le rapport des solubilits dans loctanol et
dans leau, telle que prsente par Pinsuwan et al. (14):
log POE = 0,88 log SR + 0,41
avec
SR = Soct/Seau (en molarit),
et sur la relation donne par Lyman (15) pour prdire la solubilit dans leau. Les solubilits dans leau
calcules avec lquation donne lappendice 1 sont considrer comme une premire estimation. Notons
que lutilisateur est libre destimer la solubilit dans leau laide de nimporte quelle autre relation juge
mieux reprsenter la relation entre lhydrophobie et la solubilit. Sagissant des substances solides, linclusion
du point de fusion dans la prdiction de la solubilit est par exemple recommande. Si lon utilise une
quation modifie, il faut vrifier que lquation permettant de calculer la solubilit dans loctanol est toujours
valable. Une bouteille agiter recouverte dune enveloppe de verre et dune capacit denviron un litre est
schmatise en appendice 2. Les proportions de la bouteille reprsente en appendice 2 se sont avres
propices et doivent tre conserves si la dimension de lappareil est modifie,
il est essentiel de maintenir la temprature constante durant le brassage lent, laide dun dispositif adquat.
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18. Les rcipients doivent tre composs dun matriau inerte rendant ngligeable ladsorption la surface des
rcipients.
Prparation des solutions exprimentales
19. La dtermination du POE requiert un 1-octanol de la qualit la plus pure qui puisse se trouver dans le commerce
(au moins 99 %). Il est recommand de purifier le 1-octanol par une extraction ralise avec un acide, une base
et de leau, suivie dun schage. Le 1-octanol peut, en plus, tre purifi par distillation. Les solutions talons des
substances dessai doivent tre prpares avec du 1-octanol purifi. Leau destine la dtermination du POE doit
tre distille laide dun dispositif en verre ou en quartz, ou traite par un systme de purification, ou encore
tre de qualit HPLC. Il convient de filtrer leau distille travers des mailles de 0,22 m et dinclure des blancs
afin de sassurer que les extraits concentrs ne renferment pas dimpurets susceptibles dinterfrer avec la
substance dessai. Si lon emploie un filtre en fibres de verre, il faut le nettoyer en le laissant au moins trois
heures dans un four 400 C.
20. Afin de saturer chaque solvant par lautre avant lexprience, on les quilibre dans un rcipient suffisamment
grand. Pour ce faire, le systme deux phases est soumis un brassage lent durant deux jours.
21. Une concentration approprie de la substance dessai est choisie et dissoute dans du 1-octanol (satur avec de
leau). Il y a lieu de dterminer le coefficient de partage 1-octanol/eau dans des solutions dilues dans du 1octanol et de leau. Aussi la concentration de la substance dessai ne doit-elle pas excder 70 % de sa solubilit
avec une concentration maximale de 0,1 M dans chaque phase (1). Les solutions de 1-octanol utilises pour
lexprience seront exemptes de substance dessai en suspension ltat solide.
22. La quantit approprie de substance dessai est dissoute dans du 1-octanol (satur avec de leau). Si lestimation
du log POE est suprieure 5, il faut sassurer que les solutions de 1-octanol utilises pour lexprience ne
renferment pas de substance dessai en suspension ltat solide. cette fin, la procdure suivante est applique
pour les substances chimiques dont la valeur estime de log POE > 5:
la substance dessai est dissoute dans du 1-octanol (satur avec de leau),
on laisse reposer la solution suffisamment longtemps pour que la substance suspendue ltat solide se
dpose. Durant la dcantation, la concentration de la substance dessai est mesure en continu,
une fois que les concentrations mesures dans la solution de 1-octanol ont atteint une valeur stable, la
solution mre est dilue avec un volume appropri de 1-octanol,
la concentration de la solution mre dilue est mesure. Si la concentration mesure concorde avec la
dilution, la solution mre dilue peut tre utilise dans le processus exprimental du brassage lent.
Extraction et analyse des chantillons
23. Le dosage de la substance dessai seffectue par une mthode analytique valide. Les chercheurs doivent prouver
que, durant lessai, les concentrations dans le 1-octanol satur avec de leau et dans la phase aqueuse sature avec
du 1-octanol sont suprieures au seuil de quantification du procd analytique employ. Il y a lieu dtablir avant
lessai le taux de rcupration par lanalyse de la substance dessai en phase aqueuse et en phase 1-octanol, dans
les cas o des mthodes dextraction savrent ncessaires. Le signal analytique doit tre corrig en fonction des
blancs et lon veillera viter tout transfert de la substance analyser dun chantillon lautre.
24. Les concentrations des substances dessai hydrophobes tant plutt faibles en phase aqueuse, il faudra proba
blement extraire la substance de la phase aqueuse laide dun solvant organique et prconcentrer lextrait avant
analyse. Pour la mme raison, il est ncessaire de rduire les ventuelles concentrations du blanc. cette fin, on
emploie des solvants trs purs, de prfrence des solvants pour lanalyse des rsidus. En outre, un nettoyage
soigneux (par exemple lavage au solvant ou cuisson haute temprature) de la verrerie avant lexprience peut
diminuer le risque de contamination croise.
25. Il est possible destimer le log POE laide dun programme destimation ou en faisant appel un expert. Si sa
valeur est suprieure six, dune part il convient dtre trs attentif aux corrections en fonction du blanc et tout
transfert de la substance analyser dun chantillon lautre et, dautre part, il est impratif dutiliser un talon de
substitution pour corriger le taux de rcupration, de faon pouvoir atteindre des facteurs de prconcentration
levs. Plusieurs logiciels destimation du log POE se trouvent dans le commerce (1), par exemple Clog P (16),
KOWWIN (17), ProLogP (18) et ACD logP (19). Les rfrences (20-22) dcrivent les diffrents procds des
timation.
(1) Cette information nest fournie qu titre indicatif. Dautres logiciels quivalents peuvent tre utiliss sil est dmontr quils produisent
les mmes rsultats.
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26. Les seuils de quantification pour la dtermination de la substance dessai dans le 1-octanol et dans leau sont
tablis suivant des mthodes acceptes. Comme principe de base, le seuil de quantification de la mthode
employe peut tre considr comme tant la concentration dans leau ou le 1-octanol qui produit un
rapport signal/bruit de dix. Il convient de choisir des mthodes dextraction et de prconcentration appropries
et de spcifier le taux de rcupration de lanalyse. Le facteur de prconcentration doit tre choisi de faon
produire un signal de lintensit requise lors de la dtermination analytique.
27. En fonction des paramtres de la mthode analytique et des concentrations escomptes, on dtermine le volume
de lchantillon qui permettra de dterminer avec exactitude la concentration de la substance dessai. Lutilisation
dchantillons aqueux trop petits pour obtenir un signal analytique suffisant est viter. Les chantillons aqueux
ne doivent pas non plus tre trop grands, car le volume deau restant risquerait dtre insuffisant pour le nombre
minimal danalyses requises (n = 5). Lappendice 1 indique les volumes minimaux des chantillons en fonction
du volume du rcipient, du seuil de dtection de la substance dessai et de sa solubilit.
28. La quantification des substances dessai seffectue par comparaison avec les courbes dtalonnage des substances
dessai. Les concentrations des talons doivent figurer entre parenthses ct des concentrations releves dans
les chantillons analyses.
29. Pour les substances dessai dont le log POE estim est suprieur six, on verse un talon de substitution dans
lchantillon aqueux avant lextraction afin de relever les pertes survenues durant lextraction et la prconcen
tration des chantillons aqueux. Pour que la correction du taux de rcupration soit correcte, les talons de
substitution doivent avoir des proprits trs semblables ou identiques celles de la substance dessai. cette fin,
on utilise de prfrence des analogues isotopiques (stables) marqus de la substance dessai (perdeutris ou
marqus au 13C, par exemple). Si lutilisation dun isotope marqu stable, cest--dire marqu au 13C ou au 2H,
est impossible, il faut dmontrer, en sappuyant sur des donnes fiables tires de publications, que les proprits
physico-chimiques de ltalon de substitution sont trs proches de celles de la substance dessai. Des mulsions
peuvent se former au cours de lextraction liquide-liquide de la phase aqueuse. Pour rduire ce phnomne, on
peut ajouter du sel et laisser reposer lmulsion toute une nuit. Les mthodes utilises pour extraire et prcon
centrer les chantillons doivent tre mentionnes.
30. Les chantillons prlevs dans la phase 1-octanol peuvent, si ncessaire, tre dilus avec un solvant adquat avant
lanalyse. De plus, lutilisation dtalons de substitution pour corriger la rcupration est recommande pour les
substances qui se sont avres prsenter un degr de variation lev lors des essais de rcupration (cart-type
relatif suprieur 10 %).
31. Les dtails de la mthode analytique devront figurer dans le rapport. Ceux-ci incluent la mthode dextraction, les
facteurs de prconcentration et de dilution, les paramtres des instruments, le processus dtalonnage, la gamme
dtalonnage, la rcupration de la substance dessai prsente dans leau par un procd analytique, lajout
dtalons de substitution pour corriger le taux de rcupration, les valeurs des blancs, les seuils de dtection
et les seuils de quantification.
Droulement de lessai
Rapports volumiques 1-octanol/eau optimaux
32. Les volumes deau et de 1-octanol sont choisis en fonction du seuil de quantification dans le 1-octanol et dans
leau, des facteurs de prconcentration appliqus aux chantillons aqueux, des volumes prlevs dans le 1-octanol
et dans leau et des concentrations prvues. Pour des raisons exprimentales, le volume de 1-octanol employ
dans le systme de brassage lent doit tre choisi de telle sorte que la couche de 1-octanol soit suffisamment
paisse (> 0,5 cm) pour quun prlvement puisse seffectuer dans la phase 1-octanol sans la perturber.
33. Les rapports volumiques utiliss couramment pour analyser des substances dont le log POE est suprieur ou gal
4,5 sont de 20 50 ml de 1-octanol et de 950 980 ml deau dans un rcipient dun litre.
Conditions exprimentales
34. Durant lessai, le racteur est thermostat de manire limiter la variation de temprature moins de 1 C.
Lessai doit tre conduit 25 C.
35. On protge le systme exprimental de la lumire du jour en effectuant lessai dans une pice obscure ou en
recouvrant le racteur dune feuille daluminium.
36. Lessai doit tre men dans un environnement aussi dpoussir que possible.
37. Le systme 1-octanol/eau est agit jusqu ce que lquilibre soit atteint. Le temps requis pour atteindre lquilibre
est valu au moyen dun essai pilote de brassage lent au cours duquel on prlve de leau et de loctanol
priodiquement. Les temps de prlvement doivent tre espacs dau moins cinq heures.
38. Chaque dtermination du POE doit seffectuer sur la base dau moins trois essais de brassage lent indpendants.
19.3.2014
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Dtermination du temps requis pour parvenir lquilibre

39. On admet que lquilibre est atteint lorsque la rgression du rapport des concentrations dans le 1-octanol et dans
leau en fonction du temps (la variable temps comprenant quatre point s) se traduit par une pente ne scartant
pas de manire significative de zro pour une valeur de p gale 0,05. Le temps minimal requis pour atteindre
lquilibre avant de pouvoir commencer les prlvements est dun jour. En principe, le prlvement des sub
stances dont le log POE estim est infrieur cinq peut seffectuer au cours des deuxime et troisime jours. Il est
possible que le temps pour parvenir lquilibre soit plus long pour les substances plus hydrophobes. Pour une
substance ayant un log POE gal 8,23 (dcachlorobiphnyle), 144 heures ont t suffisantes pour atteindre
lquilibre. Lquilibre est valu par une srie de prlvements effectus dans le mme rcipient.
Dbut de lessai
40. On commence par remplir le racteur avec de leau sature en 1-octanol. Ensuite, on attend que le systme
atteigne la temprature requise par le thermostat.
41. La quantit voulue de substance dessai (dissoute dans le volume requis de 1-octanol satur en eau) est ajoute
soigneusement au racteur. Il sagit dune tape critique de lessai car il faut viter le mlange turbulent des deux
phases. cette fin, la phase 1-octanol peut tre verse doucement laide dune pipette sur la paroi du rcipient
dessai, proximit de la surface de leau. Elle ruissellera ainsi le long de la paroi et formera un film au dessus de
la phase aqueuse. Il faut toujours viter de dcanter le 1-octanol directement dans la bouteille; on ne peut pas
faire tomber des gouttes de 1-octanol directement dans leau.
42. Une fois lagitation lance, on augmente lentement sa vitesse. Si les moteurs de lagitateur ne peuvent tre rgls
correctement, on envisagera dutiliser un transformateur. La vitesse dagitation doit tre rgle de manire crer
un vortex linterface entre leau et le 1-octanol dune profondeur de 0,5 2,5 cm au maximum. Il faut
diminuer la vitesse dagitation si la profondeur du vortex dpasse 2,5 cm, sinon des micro-gouttelettes de 1octanol peuvent se former dans la phase aqueuse et donner lieu une surestimation de la concentration de la
substance dessai dans leau. Daprs les rsultats dun essai tournant de validation (5), on recommande dap
pliquer une vitesse maximale dagitation de 2,5 cm. Elle reprsente un compromis permettant de parvenir
rapidement lquilibre tout en limitant la formation de microgouttelettes de 1-octanol.
Prlvement et traitement des chantillons
43. Il convient darrter lagitateur avant deffectuer les prlvements et dattendre que les liquides simmobilisent.
Lorsque le prlvement est termin, lagitateur est remis en marche doucement, comme dcrit plus haut; aprs
quoi on augmente la vitesse dagitation progressivement.
44. La phase aqueuse est prleve un robinet situ la base du racteur. Il faut toujours liminer le volume mort
deau contenu dans les robinets (environ 5 ml pour le rcipient illustr lappendice 2). Leau retenue dans les
robinets nest pas agite et donc pas en quilibre avec lensemble. On note le volume des chantillons aqueux et
on vrifie que la quantit de substance dessai prsente dans leau limine est prise en compte dans ltablis
sement du bilan massique. Il y a lieu de rduire au minimum les pertes par vaporation en permettant leau de
scouler doucement dans lentonnoir sparateur de faon ne pas perturber la couche eau/1-octanol.
45. On prlve les chantillons de 1-octanol en aspirant une petite aliquote (environ 100 l) de la couche 1-octanol
au moyen dune seringue de 100 microlitres en verre et mtal. Il faut veiller ne pas perturber linterface. Le
volume de liquide prlev est consign. Une petite aliquote suffit, tant donn que lchantillon de 1-octanol sera
dilu.
46. Les tapes inutiles de transfert dchantillons sont viter. Aussi le volume des chantillons est-il dtermin par
gravimtrie. Dans le cas des chantillons aqueux, cette dtermination seffectue par la collecte de lchantillon
aqueux dans un entonnoir sparateur contenant dj le volume de solvant requis.
RSULTATS ET RAPPORT
47. La mthode dessai prescrit de dterminer le POE en conduisant trois essais brassage lent (trois units exp
rimentales) dans des conditions exprimentales identiques. La rgression utilise pour dmontrer que lquilibre a
t atteint doit sappuyer sur les rsultats dau moins quatre dterminations du rapport CO/CE effectues quatre
moments ponctuels successifs. La variance ainsi calcule correspond une mesure de lincertitude de la valeur
moyenne obtenue pour chaque unit exprimentale.
48. Le POE peut tre caractris par la variance des donnes recueillies pour chaque unit exprimentale. Cette
information est employe pour calculer le POE en considrant quil quivaut la moyenne pondre des rsultats
de chaque unit exprimentale. Pour ce faire, linverse de la variance des rsultats des units exprimentales est
employ comme coefficient pondrateur. Ainsi, les donnes accusant une forte variation (exprime par la
variance), qui sont donc moins fiables, ont moins dinfluence sur le rsultat que les donnes offrant une variance
faible.
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49. Lcart-type pondr est calcul dune manire analogue. Il caractrise la rptabilit de la mesure du POE. Un
cart-type pondr faible traduit une rptabilit leve de la dtermination du POE au sein dun mme labora
toire. Le traitement statistique formel des donnes est rsum ci-dessous.
Traitement des rsultats
Dmonstration de la ralisation de lquilibre
50. Le logarithme du rapport des concentrations de la substance dessai dans le 1-octanol et dans leau (log CO/CE)
est calcul pour chaque instant de prlvement. On dmontre que lquilibre chimique est atteint en traant une
courbe de ce rapport en fonction du temps. Lapparition dun plateau sur ce trac, tabli partir dau moins
quatre points conscutifs sur laxe du temps, indique que lquilibre a t atteint et que le compos est
compltement dissous dans le 1-octanol. Dans le cas contraire, il faut poursuivre lessai jusqu ce que quatre
points de temps successifs prsentent une pente qui nest pas significativement diffrente de zro, pour une
valeur de p = 0,05, montrant ainsi que le log CO/CE est indpendant du temps.
Calcul du log POE
51. La valeur du log POE de lunit exprimentale correspond la moyenne pondre du log CO/CE pour la partie de
la courbe du log CO/CE en fonction du temps, pour laquelle ltat dquilibre a t dmontr. On calcule la
moyenne pondre en pondrant les donnes avec linverse de la variance de telle sorte que linfluence des
donnes sur le rsultat final est inversement proportionnelle lincertitude des donnes.
Moyenne des log POE
52. La valeur moyenne du log POE de diffrentes units exprimentales correspond la moyenne des rsultats de
chaque unit exprimentale pondrs avec leurs variances respectives.
Le calcul rpond la formule suivante:
log POE,moy = (wi log POE,i) (wi)1
o:
log POE,i
= est la valeur du log POE de chaque unit exprimentale i;
log POE
= est la moyenne pondre de tous les log POE;
wi
moy
= est le poids statistique attribu la valeur log POE de lunit exprimentale i.
Linverse de la variance de log POE,i est reprsente par wi (wi = var(log POE,i)1).
53. Lestimation de lerreur de la moyenne de log POE correspond la rptabilit des log CO/CE dtermins durant la
phase dquilibre dans chaque unit exprimentale. Elle se traduit par lcart-type pondr du log POE moy (log Poe
moy) qui mesure lerreur associe au log POE moy. Lcart-type pondr peut tre calcul partir de la variance
pondre (varlog Poe moy) de la faon suivante:
varlog
Poe,moy
= (wi (log POE,i - log POE,moy)2) (wi (n - 1))1
log
Poe,moy
= (varlog
Poe,moy
)0,5
o n reprsente le nombre dunits exprimentales.

Rapport dessai
54. Le rapport dessai doit mentionner les informations suivantes:
Substance dessai:
nom courant, nom chimique, numro CAS, formule structurale (montrant la position du radiomarqueur, le
cas chant) et proprits physico-chimiques pertinentes (voir paragraphe 17),
puret (impurets) de la substance dessai,
puret radiochimique des substances marques et activit molaire (sil y a lieu),
estimation prliminaire du log POE et mthode utilise pour ce calcul.
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Conditions exprimentales:
dates de la ralisation des tudes,
temprature laquelle sest droul lessai,
volumes de 1-octanol et deau au dbut de lessai,
volumes des chantillons de 1-octanol et deau prlevs,
volumes de 1-octanol et deau restant dans les rcipients exprimentaux;
description des rcipients exprimentaux et des conditions dagitation utilises (gomtrie de la barre dagi
tation et du rcipient exprimental, hauteur du vortex en mm et vitesse dagitation si elle est connue),
mthodes analytiques utilises pour dterminer la substance dessai et seuil de quantification de la mthode,
heures de prlvement,
pH de la phase aqueuse et tampons utiliss, lorsquon a ajust le pH pour des molcules ionisables,
nombre dexpriences identiques.
Rsultats:
rptabilit et sensibilit des mthodes analytiques employes,
concentrations de la substance dessai dtermines dans le 1-octanol et dans leau en fonction du temps,
dmonstration du bilan massique,
temprature et cart-type ou gamme de tempratures applique durant lessai,
rgression du rapport des concentrations en fonction du temps,
valeur moyenne de POE moy et son cart-type,
analyse et interprtation des rsultats,
exemples de donnes brutes dune analyse reprsentative (toutes les donnes brutes doivent tre conserves
conformment aux bonnes pratiques de laboratoire), notamment le taux de rcupration des produits de
substitution, le nombre de niveaux appliqu ltalonnage (ainsi que les critres rgissant le coefficient de
corrlation de la courbe dtalonnage) et rsultats de lassurance qualit/contrle qualit (AQ/CQ),
sil est disponible: rapport de validation du protocole exprimental ( mentionner parmi les rfrences).
BIBLIOGRAPHIE:
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Appendice 1
Tables permettant de calculer les volumes deau minimaux requis pour dtecter des substances dessai ayant
diffrentes valeurs de log POE en phase aqueuse
Hypothses:
Volume maximal de chaque aliquote = 10 % du volume total; 5 aliquotes = 50 % du volume total.
Concentration des substances dessai = 0,7 solubilit dans chaque phase. Si les concentrations sont infrieures, il
faudra utiliser de plus grands volumes.
Volume utilis pour la dtermination du seuil de dtection = 100 ml.
Log POE en fonction du log SE et le log POE en fonction de SR (Soct/Se) sont des reprsentations raisonnables de
relations pour les substances dessai.
Estimation de Se
log POE
quation
log Se
Se (mg/l)
()0,922 log Pow + 4,184
0,496
3,133E+00
4,5
()0,922 log Pow + 4,184
0,035
1,084E+00
()0,922 log Pow + 4,184
0,426
3,750E-01
5,5
()0,922 log Pow + 4,184
0,887
1,297E-01
()0,922 log Pow + 4,184
1,348
4,487E-02
6,5
()0,922 log Pow + 4,184
1,809
1,552E-02
()0,922 log Pow + 4,184
2,270
5,370E-03
7,5
()0,922 log Pow + 4,184
2,731
1,858E-03
()0,922 log Pow + 4,184
3,192
6,427E-04
Estimation de Soct
log POE
quation
Soct (mg/l)
log Pow = 0,88log SR + 0,41
3,763E+04
4,5
4,816E+04
6,165E+04
5,5
7,890E+04
1,010E+05
6,5
1,293E+05
1,654E+05
7,5
2,117E+05
2,710E+05
Masse totale de la substance

dessai
(mg)
1 319
Masseoct/Masseeau
MasseH2O
(mg)
ConcH2O
(mg/l)
Masseoct
(mg)
Concoct
(mg/l)
526
2,5017
2,6333
1 317
26 333
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FR
Masse totale de la substance

dessai
(mg)
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Masseoct/Masseeau
MasseH2O
(mg)
ConcH2O
(mg/l)
Masseoct
(mg)
Concoct
(mg/l)
1 686
1 664
1,0127
1,0660
1 685
33 709
2 158
5 263
0,4099
0,4315
2 157
43 149
2 762
16 644
0,1659
0,1747
2 762
55 230
3 535
52 632
0,0672
0,0707
3 535
70 691
4 524
1664 36
0,0272
0,0286
4 524
90 480
5 790
5263 16
0,0110
0,0116
5 790
115 807
7 411
1 664 357
0,0045
0,0047
7 411
148 223
9 486
5 263 158
0,0018
0,0019
9 486
189 713
Calcul des volumes

Volume minimal requis pour la phase H2O chaque concentration du seuil de dtection
Seuil de dtection
(microgrammes/l)
0,001
0,01
0,10
1,00
10
0,04
0,38
3,80
38
380
4,5
0,09
0,94
9,38
94
938
0,23
2,32
23,18
232
2 318
5,5
0,57
5,73
57,26
573
5 726
1,41
14,15
141
1 415
14 146
6,5
3,50
34,95
350
3 495
34 950
8,64
86,35
864
8 635
86 351
7,5
21,33
213
2 133
21 335
213 346
52,71
527
5 271
52 711
527 111
log KOE
0,1
Volume utilis pour le

seuil de dtection (L)
Lgende pour les calculs
Reprsente < 10 % du volume total de la phase aqueuse, rcipient dquilibrage de 1 litre.

Reprsente < 10 % du volume total de la phase aqueuse, rcipient dquilibrage de 2 litres.
Dpasse 10 % y compris du rcipient dquilibrage de 10 litres.
Vue densemble des volumes requis en fonction de la solubilit dans leau et du log POE
Volume minimal requis pour la phase H2O chaque concentration du seuil de dtection (ml)
log POE
Seuil de dtection
(microgrammes/l)
Se (mg/l)
0,001
0,01
0,10
1,00
10
10
0,01
0,12
1,19
11,90
118,99
0,02
0,24
2,38
23,80
237,97
0,04
0,40
3,97
39,66
396,62
0,12
1,19
11,90
118,99
1 189,86
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FR
log POE
Seuil de dtection
(microgrammes/l)
Se (mg/l)
4,5
5,5
6,5
7,5
0,001
0,01
L 81/19
0,10
1,00
10
0,02
0,20
2,03
20,34
203,37
0,05
0,51
5,08
50,84
508,42
0,10
1,02
10,17
101,68
1 016,83
0,5
0,20
2,03
20,34
203,37
2 033,67
0,09
0,87
8,69
86,90
869,01
0,5
0,17
1,74
17,38
173,80
1 738,02
0,375
0,23
2,32
23,18
231,75
2 317,53
0,2
0,43
4,35
43,45
434,51
4 345,05
0,4
0,19
1,86
18,57
185,68
1 856,79
0,2
0,37
3,71
37,14
371,36
3 713,59
0,1
0,74
7,43
74,27
742,72
7 427,17
0,05
1,49
14,85
148,54
1 485,43
14 854,35
0,1
0,63
6,35
63,48
634,80
6 347,95
0,05
1,27
12,70
126,96
1 269,59
12 695,91
0,025
2,54
25,39
253,92
2 539,18
25 391,82
0,0125
5,08
50,78
507,84
5 078,36
50 783,64
0,025
2,17
21,70
217,02
2 170,25
21 702,46
0,0125
4,34
43,40
434,05
4 340,49
43 404,93
0,006
9,04
90,43
904,27
9 042,69
90 426,93
0,003
18,09
180,85
1 808,54
18 085,39
180 853,86
0,006
7,73
77,29
772,89
7 728,85
77 288,50
0,003
15,46
154,58
1 545,77
15 457,70
154 577,01
0,0015
23,19
231,87
2 318,66
23 186,55
231 865,51
0,001
46,37
463,73
4 637,31
46 373,10
463 731,03
0,002
19,82
198,18
1 981,77
19 817,73
198 177,33
0,001
39,64
396,35
3 963,55
39 635,47
396 354,66
0,0005
79,27
792,71
7 927,09
79 270,93
792 709,32
0,00025
158,54
1 585,42
15 854,19
158 541,86
1 585 418,63
0,001
33,88
338,77
3 387,68
33 876,77
338 767,72
0,0005
67,75
677,54
6 775,35
67 753,54
677 535,44
0,00025
135,51
1 355,07
13 550,71
135 507,09
1 355 070,89
0,000125
271,01
2 710,14
27 101,42
271 014,18
2 710 141,77
Volume utilis pour le seuil

de dtection (L)
0,1
FR
L 81/20
19.3.2014
Appendice 2
Exemple de rcipient exprimental enveloppe de verre destin la dtermination du POE par la mthode du
brassage lent
3) le chapitre B.2 est remplac par le texte suivant:

B.2. TOXICIT AIGU PAR INHALATION
INTRODUCTION
1.
La prsente mthode dessai est quivalente la ligne directrice 403 (2009) de lOCDE (1) pour les essais de
produits chimiques. Une premire ligne directrice 403 pour les essais de toxicit aigu par inhalation a t
adopte en 1981. La prsente mthode dessai B.2 (quivalente la ligne directrice 403 rvise a t conue afin
doffrir une plus grande souplesse, de rduire lutilisation danimaux et de rpondre aux exigences rglementaires.
Elle dcrit deux types dtudes: un protocole traditionnel de dtermination de la CL50 et un protocole concen
tration temps (C t). Les principales caractristiques de cette ligne directrice tiennent au fait quelle permet
dobtenir une relation concentration-rponse pour les effets non ltaux ltaux, afin den dduire une concen
tration ltale mdiane (CL50), une concentration seuil non ltale (comme la CL01) et une pente, ainsi que de
dterminer si un des sexes est plus sensible la substance dessai. Le protocole C t est utilis lorsque sapplique
une rglementation particulire ou pour un besoin scientifique qui ncessite un essai sur des animaux pour
plusieurs dures dexposition diffrentes, par exemple des fins damnagement du territoire ou de planification
des interventions durgence: calcul des niveaux guides dexposition aigu, recommandations pour la planification
des mesures durgence, niveaux seuil dexposition aigu, etc.
2.
On trouvera dans le document dorientation no 39 sur les essais de toxicit aigu par inhalation (document
dorientation 39) des indications sur la conduite et linterprtation des tudes lies la prsente mthode dessai
(2).
3.
Le document dorientation 39 (2) regroupe les dfinitions utilises dans le contexte de la prsente mthode
dessai.
4.
La prsente mthode dessai permet de caractriser les substances dessai, de les soumettre une valuation
quantitative des risques, et de classer conformment au rglement (CE) no 1272/2008 (3). Le document dorien
tation 39 (2) fournit des indications sur le choix de la mthode dessai approprie pour les essais de toxicit
aigu. Lorsque seules sont requises des informations sur la classification et ltiquetage, le chapitre B.52 de la
prsente annexe (4) est gnralement recommand [voir document dorientation 39 (2)]. La mthode dessai B.2
nest pas spcifiquement destine tester des matriaux spciaux comme les substances isomtriques ou fibreuses
faiblement solubles ou les nanomatriaux manufacturs.
FR
19.3.2014
5.
Avant dentreprendre un essai conformment la prsente mthode dessai, le laboratoire dessai devra prendre
en compte toutes les informations disponibles sur la substance dessai, y compris les tudes existantes [par
exemple, le chapitre B.52 de la prsente annexe (4)] dont les rsultats viteraient des essais supplmentaires, afin
de recourir le moins possible aux animaux. Parmi les informations utiles pour la dtermination de lespce, de la
souche, du sexe, du mode dexposition et des concentrations dessai appropris, citons: lidentit, la structure
chimique et les proprits physico-chimiques de la substance dessai, les rsultats de tous les essais de toxicit in
vitro ou in vivo auxquels elle a t soumise, son (ses) utilisation(s) escompte(s) et les risques dexposition
humaine, les donnes (Q)SAR disponibles et les donnes toxicologiques sur les substances structurellement
apparentes, voir document dorientation 39 (2).
6.
Il convient dviter autant que possible de tester des substances corrosives et/ou irritantes des concentrations
susceptibles dengendrer une souffrance svre et/ou une dtresse. Pour dterminer sil est possible de renoncer
des essais complmentaires, le potentiel de corrosion/dirritation fait lobjet dune valuation reposant sur un
jugement dexpert bas sur les lments suivants: donnes exprimentales sur lhomme et lanimal (provenant,
par exemple, dessais doses rptes raliss des concentrations non corrosives ou irritantes), donnes in vitro
existantes [par exemple chapitres B.40 (5), B.40 bis (6) de la prsente annexe, ou ligne directrice 435 de lOCDE
(7)], valeurs du pH, informations concernant des substances analogues ou toute autre donne pertinente. des
fins rglementaires spcifiques (par exemple pour ltablissement de plans durgence), la prsente mthode dessai
peut tre utilise pour exposer des animaux ces substances car elle donne au directeur de ltude ou
linvestigateur principal la matrise du choix des concentrations cibles. Celles-ci ne doivent cependant pas
induire deffets corrosifs/irritants importants, mais elles sont suffisantes pour prolonger la courbe de concen
tration-rponse jusqu des niveaux correspondant lobjectif scientifique et rglementaire de lessai. Ces concen
trations sont choisies au cas par cas et une justification du choix des concentrations est apporte, voir document
dorientation 39 (2).
PRINCIPE DE LESSAI
7.
La prsente mthode dessai B.2 rvise doit en principe permettre dobtenir des informations suffisantes sur la
toxicit aigu dune substance dessai pour procder son classement, et fournir les donnes sur sa ltalit
ncessaires aux valuations quantitatives des risques (CL50, CL01 et pente, par exemple) pour lun des sexes ou les
deux. Cette mthode dessai propose deux mthodes. La premire suit un protocole traditionnel dans lequel des
groupes danimaux sont exposs une concentration limite (essai limite) ou une srie de concentrations
suivant un processus squentiel pendant une dure prdtermine de quatre heures en gnral. Des objectifs
rglementaires spcifiques peuvent ncessiter de recourir dautres dures dexposition. La seconde mthode suit
un protocole concentration x temps (C t) dans lequel des groupes danimaux sont exposs une concen
tration (concentration limite) ou une srie de concentrations diffrentes sur des dures diffrentes.
8.
Les animaux moribonds ou prsentant des signes de souffrance manifeste ou de dtresse svre et persistante
sont euthanasis. Ils sont pris en compte dans linterprtation des rsultats de lessai au mme titre que ceux qui
succombent au cours de lessai. Le document dorientation no 19 de lOCDE sur les effets mesurs thiquement
acceptables dtaille les critres orientant la dcision deuthanasier les animaux moribonds ou en grande souf
france, et aide reconnatre une mort prvisible ou imminente (8).
Choix des espces animales
9.
Le choix sorientera vers de jeunes rongeurs en bonne sant, de souches communment utilises en laboratoire.
Le rat tant lespce la plus utilise, il faudra justifier lemploi dautres espces.
Prparation des animaux
10. Les femelles sont nullipares et non gravides. Le jour de leur exposition, les animaux slectionns sont de jeunes
adultes gs de 8 12 semaines. Leur poids corporel nexcde pas, pour chaque sexe, 20 % du poids moyen
des animaux du mme ge prcdemment exposs. Slectionns au hasard, les animaux sont marqus pour tre
identifis individuellement. En vue de leur acclimatation aux conditions de laboratoire, ils sont conservs dans
leur cage pour une priode dau minimum 5 jours avant le dbut de lessai. Les animaux sont galement
acclimats aux appareils dessai, pendant une courte priode prcdant lessai, afin dattnuer le stress caus
par leur introduction dans un nouvel environnement.
Conditions dlevage des animaux
11. La temprature du local exprimental o les animaux sont conservs est de 22 3 C. Le taux dhumidit relative
est idalement maintenu entre 30 et 70 %, encore quil ne soit pas toujours possible de le faire si leau est utilise
comme vhicule. Avant et aprs exposition, les animaux sont gnralement mis en cage en groupes par sexe et
par concentration, mais le nombre danimaux par cage ne doit pas faire obstacle une observation prcise de
chaque animal, et ne doit engendrer quun minimum de pertes dues au cannibalisme et aux combats. Si les
animaux sont exposs nez seul, il peut tre ncessaire de les acclimater aux tubes de contention. Ceux-ci ne
doivent pas provoquer chez les animaux de stress excessif, quil soit de nature physique, thermique ou d leur
immobilisation. Les contraintes quils subissent peuvent en effet modifier les paramtres physiologiques mesurs
de lanimal, comme sa temprature corporelle (hyperthermie) et/ou son volume respiratoire par minute. Si lon
dispose de donnes gnriques montrant que de telles modifications ne se produisent pas de faon apprciable,
L 81/21
L 81/22
FR
alors la priode dadaptation pralable aux tubes de contention nest pas ncessaire. Les animaux exposs corps
entier un arosol sont enferms individuellement pendant lexposition pour empcher la filtration de larosol
dessai par la fourrure des congnres. lexception des priodes dexposition, le rgime alimentaire des animaux
est le rgime classique et certifi de laboratoire, avec eau potable satit. Lclairage est artificiel, la squence
dclairage tant de 12 heures de clart et 12 heures dobscurit.
Chambre dinhalation
12. Le choix de la chambre dinhalation prend en compte la nature de la substance dessai et lobjet de lessai. Le
mode dexposition nez seul (qui inclut les dispositifs tte seule, nez seul et museau seul) est privilgi. Le
mode dexposition nez seul est gnralement choisi pour les tudes darosols liquides ou solides et pour les
vapeurs susceptibles de se condenser en arosols. Lutilisation dun mode dexposition corps entier peut tre
prfrable pour les besoins spcifiques de ltude, mais cela est alors justifi dans le rapport dtude. Pour assurer
la stabilit de latmosphre dune chambre dexposition corps entier, on veille ce que le volume total des
animaux dexprience ne dpasse pas 5 % du volume de la chambre. Le document dorientation 39 (2) dcrit les
principes des techniques dexposition corps entier ou nez seul, ainsi que leurs avantages et inconvnients
spcifiques.
CONDITIONS DEXPOSITION
Administration des concentrations
13. Les expositions nez seul peuvent durer jusqu 6 heures pour les rats. Pour les souris, les expositions nez seul
ne dpassent pas 4 heures en gnral. Si des essais dune dure plus longue sont ncessaires, une justification est
apporte, voir document dorientation 39 (2). Les animaux exposs corps entier des arosols demeurent seuls
dans la chambre afin dviter lingestion de la substance dessai par le toilettage de leurs compagnons. Les
animaux sont privs de nourriture pendant la priode dexposition. Dans une exposition corps entier, les
animaux peuvent boire de leau.
14. Les animaux sont exposs la substance dessai prsente sous forme de gaz, de vapeur, darosol ou sous une
forme mixte. Ltat physique tester dpend des proprits physico-chimiques de la substance, de la concen
tration choisie, et/ou de la forme physique sous laquelle il est le plus probable quelle se prsente lors de sa
manipulation et de son utilisation. Les substances dessai chimiquement ractives ou hygroscopiques sont testes
sous air sec. On prendra soin dviter les concentrations susceptibles de provoquer une explosion.
Rpartition granulomtrique
15. Une mesure de la taille des particules est ralise pour tous les arosols et les vapeurs susceptibles de se
condenser pour former des arosols. Pour que toutes les rgions pertinentes de lappareil respiratoire soient
exposes, il est recommand dutiliser des arosols dont le diamtre arodynamique mdian de masse (DAMM) se
situe entre 1 et 4 m, avec un cart type gomtrique (g) compris entre 1,5 et 3,0 (2) (9) (10). Un effort
raisonnable est fourni pour remplir ces conditions, mais si tel nest pas le cas, un jugement dexpert est
ncessaire. Par exemple, les particules des fumes mtalliques peuvent avoir une taille infrieure cette
norme, tandis que les particules charges, les fibres et les substances hygroscopiques (dont la taille augmente
dans lenvironnement humide de lappareil respiratoire) peuvent avoir une taille suprieure.
Prparation de la substance dessai dans un vhicule
16. Pour atteindre la concentration et la taille granulomtrique appropries de la substance dessai, il est possible
davoir recours un vhicule; en rgle gnrale, leau est choisie de prfrence. Les substances particulaires
peuvent tre soumises des procds mcaniques afin datteindre la rpartition granulomtrique requise, mais un
soin particulier devra tre pris de ne pas dcomposer ou altrer la substance dessai. Lorsque les procds
mcaniques sont suspects davoir altr la composition de la substance dessai (temprature extrme due aux
frictions dun broyage excessif, par exemple), la composition de la substance dessai devra tre vrifie analyti
quement. On prendra soin de ne pas contaminer la substance dessai. Il nest pas ncessaire de tester les
substances granulaires non friables qui sont labores prcisment pour ne pas tre inhalables. Un test
dusure de surface est ralis pour dmontrer que la manipulation de la substance granulaire ne produit pas
de particules respirables. Dans le cas contraire, un essai de toxicit par inhalation est ralis.
Animaux tmoins
17. Un groupe tmoin ngatif (air) nest pas ncessaire. Lorsquun vhicule autre que leau est utilis pour produire
latmosphre dessai, un groupe tmoin du vhicule est utilis seulement quand on ne dispose pas de donnes
historiques sur la toxicit. Si aucune toxicit na t dtecte lors de ltude dune substance dessai prpare dans
un vhicule, ce dernier est considr comme non toxique la concentration teste; il ny a donc pas lieu dutiliser
de tmoin du vhicule.
CONTRLE DES CONDITIONS DEXPOSITION
Dbit dair dans la chambre dexposition
18. Le dbit dair dans la chambre est contrl avec soin, surveill en continu et enregistr au moins toutes les heures
pendant chaque exposition. Le suivi de la concentration de latmosphre dessai (ou stabilit temporelle) constitue
une mesure complte de tous les paramtres dynamiques et fournit un moyen indirect de contrler tous les
19.3.2014
19.3.2014
FR
paramtres dynamiques pertinents de production de latmosphre dessai. On prendra particulirement soin

dviter toute re-respiration dans les chambres dexposition nez seul lorsque le dbit dair travers le
systme dexposition ne permet pas de produire une circulation dynamique de latmosphre contenant la sub
stance dessai. Des mthodologies sont prvues pour dmontrer labsence de re-respiration dans les conditions
exprimentales choisies (2) (11). La concentration doxygne est dau moins 19 % et celle de dioxyde de carbone
ne dpasse pas 1 %. Si ces conditions ne peuvent tre respectes, les concentrations doxygne et de dioxyde de
carbone sont mesures.
Temprature et humidit relative de la chambre dexposition
19. La temprature de la chambre dexposition est maintenue 22 3 C. Dans les cas dexposition nez seul et
corps entier lhumidit relative dans la zone o respire lanimal est surveille et enregistre trois fois au
minimum pour les dures allant jusqu 4 heures, et toutes les heures pour des dures plus courtes. Lhumidit
relative est de prfrence comprise entre 30 et 70 %. Il est possible que ce taux ne puisse tre atteint (par
exemple lorsque la substance dessai se prsente sous forme de solution aqueuse), ou quil ne puisse tre mesur
en raison dinterfrences de la substance dessai avec la mthode dessai.
Substance dessai: concentration nominale
20. Dans la mesure du possible, la concentration nominale dans la chambre dexposition est calcule et enregistre.
La concentration nominale est la masse de la substance dessai divise par le volume dair total qui passe dans le
circuit de la chambre dinhalation. La concentration nominale ne sert pas caractriser lexposition des animaux,
mais une comparaison de la concentration nominale avec la concentration relle donne une indication de la
capacit de production du systme dessai, et peut donc permettre de mettre en vidence des problmes de
production.
Substance dessai: concentration relle
21. La concentration relle est la concentration de la substance dessai dans la zone de la chambre dinhalation o les
animaux respirent. Les concentrations relles peuvent tre obtenues par des mthodes spcifiques (par exemple,
chantillonnage direct, mthodes dadsorption ou de raction chimique, et caractrisation analytique ultrieure)
ou par des mthodes non spcifiques comme la gravimtrie sur filtre. Le recours lanalyse gravimtrique nest
acceptable que pour des arosols ne contenant quun seul composant en poudre ou pour des arosols de liquides
peu volatils, et des caractrisations spcifiques la substance dessai sont galement effectues par une prtude
approprie. Il est aussi possible davoir recours la gravimtrie pour dterminer la concentration dun arosol
contenant plusieurs composants en poudre, mais des donnes analytiques sont alors ncessaires, afin de dmon
trer que la composition du produit en suspension dans lair est analogue celle du produit de dpart. Faute de
cette information, il peut savrer ncessaire de soumettre la substance dessai (idalement en suspension dans
lair) une nouvelle analyse intervalles rguliers tout au long de ltude. Pour des agents arosoliss susceptibles
de svaporer ou de se sublimer, il faut dmontrer que toutes les phases ont t recueillies selon la mthode
choisie. Les concentrations cibles, nominales et relles sont fournies dans le rapport dtude, mais seules les
concentrations relles sont utilises dans les analyses statistiques pour calculer la valeur des concentrations
ltales.
22. Un seul lot de la substance dessai est utilis, si possible, et lchantillon est conserv dans des conditions
prservant sa puret, son homognit et sa stabilit. Avant le dbut de ltude, il convient de raliser une
caractrisation de la substance dessai afin de dterminer sa puret et, si cela est techniquement possible, son
identit et les quantits de contaminants et dimpurets identifis. Pour cela, on pourra recueillir les donnes
suivantes: temps de rtention et surface relative du pic, poids molculaire obtenu par spectroscopie de masse ou
chromatographie en phase gazeuse, ou autres estimations. Bien que le laboratoire dessai ne soit pas responsable
de lidentification de la substance dessai, il peut, par prudence, confirmer au moins une partie des caractris
tiques fournies par le donneur dordre (couleur, nature physique, etc.).
23. Latmosphre dexposition est maintenue aussi constante que possible et suivie soit en continu, soit de faon
intermittente suivant la mthode danalyse. Lorsque linjection seffectue de faon intermittente, les chantillons
datmosphre de la chambre sont prlevs au moins deux fois sur une tude de quatre heures. En cas dimpos
sibilit en raison de dbits dair limits ou de faibles concentrations, le recueil dun chantillon pour toute la
priode dexposition est acceptable. Si des fluctuations nettes apparaissent dun chantillon un autre, on a
recours quatre chantillons par exposition pour les concentrations dessai suivantes. Les carts entre la
concentration dans chaque chambre et la concentration moyenne nexcdent pas 10 % pour les gaz et
vapeurs ou 20 % pour les arosols liquides ou solides. Il convient de calculer et de noter le temps dquilibre
dans la chambre dexposition (t95). La dure dune exposition couvre le temps de production de la substance
dessai, y compris le temps ncessaire pour lgalisation des concentrations dans la chambre dexposition t95. Des
indications pour lestimation de t95 sont fournies dans le document dorientation 39 (2).
24. Pour des systmes trs complexes constitus de gaz ou vapeurs et darosols (atmosphres de combustion ou
substances dessai propulses partir de produits/dispositifs spcialiss, par exemple), chaque phase peut se
comporter diffremment dans la chambre dinhalation. Pour chacune des phases (gaz ou vapeur et arosol),
on choisit donc au moins une substance indicatrice (analyte), en gnral la substance active principale dans le
mlange. Quand la substance dessai est un mlange, la concentration analytique devra tre indique pour le
mlange et pas uniquement pour la substance active ou le composant (analyte). Pour plus dinformations sur les
concentrations relles, se reporter au document dorientation 39 (2).
L 81/23
L 81/24
FR
Substance dessai: rpartition granulomtrique

25. La rpartition granulomtrique des arosols est dtermine au minimum deux fois pour chaque exposition de
4 heures laide dun impacteur en cascade ou dun autre instrument, comme un spectromtre de mesure de la
taille des particules arodynamiques. Si les rsultats obtenus avec limpacteur en cascade et lautre instrument se
rvlent quivalents, ce dernier peut tre utilis tout au long de ltude. Pour confirmer la capacit de recueil des
particules de loutil principal, un second instrument devra tre utilis en parallle, par exemple un filtre gravi
mtrique ou un barboteur gaz/impacteur. La concentration massique obtenue par lanalyse granulomtrique se
rapproche, dans des limites raisonnables, de celle obtenue par lanalyse sur filtre, voir document dorientation 39
(2). Si cette quivalence est tablie au dbut de la phase dtude, il nest pas ncessaire deffectuer des mesures de
confirmation dans la suite de ltude. Pour le bien-tre des animaux, il convient de rduire au minimum les
donnes douteuses qui ncessiteraient de rpter une exposition. Une rpartition granulomtrique est effectue
dans le cas des vapeurs, sil est possible quune condensation de la vapeur conduise la formation dun arosol,
ou si des particules sont dtectes dans une atmosphre de vapeur susceptible de prsenter des phases mixtes
(voir paragraphe 15).
MODE OPRATOIRE
26. Les deux types dtudes dcrits ci-dessous sont le protocole traditionnel et le protocole C t. Tous deux peuvent
comprendre une tude prliminaire, une tude principale et/ou un essai limite (protocole traditionnel) ou un
essai une concentration limite (C t). Si lun des sexes est connu pour tre plus sensible la substance dessai,
le directeur de ltude peut choisir de raliser ces essais avec seulement des animaux de ce sexe. Si des espces de
rongeurs autres que le rat sont exposes nez seul, il est possible dajuster la dure maximale dexposition en
fonction du stress propre ces espces. Avant le dbut de ltude, toutes les donnes disponibles sont examines
afin de rduire lusage des animaux. Par exemple, les donnes obtenues selon le chapitre B.52 de la prsente
annexe (4) peuvent supprimer la ncessit dune tude prliminaire et aussi dmontrer si lun des sexes est plus
sensible la substance dessai, voir document dorientation 39 (2).
PROTOCOLE TRADITIONNEL
Considrations gnrales sur le protocole traditionnel
27. Dans une tude traditionnelle, des groupes danimaux sont exposs une substance dessai pendant une priode
de temps fixe (gnralement 4 heures) dans une chambre dexposition nez seul ou corps entier. Les animaux
sont exposs soit une concentration limite (essai limite), soit trois concentrations au minimum selon une
procdure squentielle (tude principale). Une tude prliminaire peut prcder ltude principale, sauf sil existe
dj des informations concernant la substance dessai, provenant par exemple dune tude prcdente effectue
selon ltude B.52, voir document dorientation 39 (2).
tude prliminaire pour le protocole traditionnel
28. Une tude prliminaire permet destimer lactivit de la substance dessai, didentifier des diffrences entre les
sexes quant la sensibilit cette substance, et de choisir plus facilement les niveaux de concentration pour
ltude principale ou lessai limite. Lors du choix des niveaux de concentration pour ltude prliminaire, toutes
les informations disponibles sont prises en compte, y compris les donnes (Q)SAR et les donnes correspondant
des produits chimiques analogues. Pour chaque concentration, on exposera au maximum trois mles et trois
femelles (il peut tre ncessaire dutiliser 3 animaux par sexe pour tablir une diffrence de sensibilit entre les
sexes). Une tude prliminaire peut tre effectue avec une seule concentration, ou plusieurs si ncessaire. Elle ne
porte pas sur un nombre danimaux ou de concentrations tel quelle ressemblerait une tude principale. Il est
possible dutiliser les rsultats dune tude B.52 (4) prcdente au lieu de raliser une tude prliminaire, voir
document dorientation 39 (2).
Essai limite pour le protocole traditionnel
29. Lessai limite est utilis si lon sait ou si lon prvoit que la substance dessai sera virtuellement non toxique, c'est-dire quelle ne suscitera une rponse de toxicit quau-del de la concentration limite rglementaire. Dans un
essai limite, un seul groupe de trois mles et trois femelles est expos la substance dessai une concentration
limite. Des informations sur la toxicit de la substance dessai peuvent tre tires dessais dj pratiqus sur des
substances analogues, en tenant compte de lidentit et du pourcentage des composants dont la toxicit est
avre. Si lon manque dinformations sur la toxicit de la substance dessai, ou si lon sattend ce quelle soit
toxique, lessai principal est ralis.
30. Le choix des concentrations limites dpend gnralement des exigences rglementaires. Lorsquon applique le
rglement (CE) no 1272/2008, les concentrations limites pour les gaz, les vapeurs et les arosols sont respec
tivement de 20 000 ppm, 20 mg/l et 5 mg/l (ou, dfaut, la concentration maximale pouvant tre atteinte) (3). Il
peut savrer techniquement difficile datteindre les concentrations limites de certaines substances dessai, en
particulier pour les vapeurs et les arosols. Pour les essais darosols, le principal objectif est datteindre une
taille de particule qui soit respirable (cest--dire dun DAMM de 1 4 m), ce qui est possible avec la plupart des
substances dessai des concentrations de 2 mg/l. Les essais sur des arosols des concentrations suprieures
2 mg/l ne sont tents que si lon peut obtenir des particules de taille respirable, voir document dorientation 39
(2). Selon le rglement (CE) no 1272/2008, il est dconseill de raliser des essais au-del des concentrations
limites pour des raisons de bien-tre des animaux (3). Les essais aux concentrations limites ne sont envisags que
sil est trs probable que leurs rsultats prsenteront un intrt direct pour la protection de la sant humaine (3),
et une justification est fournie dans le rapport dtude. En cas de substance potentiellement explosive, on prendra
soin dviter les conditions susceptibles de provoquer une explosion. Afin dviter le recours inutile des
animaux, un essai sans animaux est effectu avant lessai limite pour sassurer quil est possible datteindre
dans la chambre les conditions exprimentales dun essai limite.
19.3.2014
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31. Si une mortalit ou un tat moribond sont observs la concentration limite, les rsultats de lessai limite
peuvent servir dtude prliminaire pour les essais suivants dautres concentrations (voir tude principale). Si la
concentration limite est impossible atteindre du fait des proprits physiques ou chimiques de la substance
dessai, cest la concentration maximale pouvant tre atteinte qui devra tre teste. Si la ltalit cette concen
tration est infrieure 50 %, il ny a pas lieu de poursuivre lessai. Si la concentration limite na pas pu tre
atteinte, une explication, taye par des donnes, est fournie dans le rapport dtude. Si la concentration
maximale pouvant tre atteinte pour une vapeur ne provoque pas de toxicit, il peut tre ncessaire de produire
la substance dessai sous la forme dun arosol liquide.
tude principale pour le protocole traditionnel
32. Une tude principale fait en gnral appel cinq mles et cinq femelles (ou cinq animaux du sexe le plus
sensible, sil est connu) par niveau de concentration, avec au minimum trois niveaux de concentration. Les
niveaux de concentration sont suffisamment nombreux pour que lon puisse obtenir une analyse statistique
fiable. Lintervalle de temps entre lexposition des diffrents groupes est dtermin par le moment dapparition, la
dure et la gravit des signes de toxicit observs. Lexposition au niveau de concentration suprieur est retarde
jusqu ce que lon soit raisonnablement sr que les animaux prcdemment soumis au traitement ont survcu.
Le directeur de ltude peut alors ajuster la concentration cible pour le groupe suivant. Pour les essais de toxicit
par inhalation, qui ncessitent des technologies sophistiques, il ne sera pas toujours possible de procder ainsi,
cest pourquoi lexposition des animaux la concentration suprieure devra se baser sur lexprience acquise et
un jugement scientifique. Pour les essais portant sur des mlanges, il convient de se rfrer au document
PROTOCOLE CONCENTRATION TEMPS (C T)
Considrations gnrales sur le protocole C t
33. Une tude squentielle concentration temps (C t) peut constituer une alternative au protocole traditionnel
lorsquil sagit dvaluer la toxicit par inhalation (12) (13) (14). Avec cette approche, les animaux sont exposs
la substance dessai plusieurs niveaux de concentration et pour des dures dexposition variables. Tous les essais
sont raliss dans des chambres dexposition nez seul, les chambres corps entier ne se prtant pas ce
protocole. Un exemple de procdure squentielle illustrant ce protocole est prsent lappendice 1. Une analyse
de simulation a montr que le protocole traditionnel et le protocole C t taient tous les deux capables de
donner des valeurs fiables de la CL50, mais que le protocole C t permettait en gnral dobtenir des valeurs plus
sres pour la CL01 et la CL10 (15).
34. Une analyse de simulation a dmontr quil convient gnralement dutiliser deux animaux par intervalle de C t
(un animal de chaque sexe ou deux animaux du sexe le plus sensible) pour tester 4 concentrations et 5 dures
dexposition lors de ltude principale. Le directeur de ltude peut choisir, dans certaines circonstances, dutiliser
deux rats de chaque sexe par intervalle de C t (15), de manire rduire le biais et la variabilit des
estimations, augmenter le taux de succs de lestimation et amliorer la couverture de lintervalle de confiance.
Cependant, en cas dajustement insuffisant aux donnes (en utilisant un animal par sexe ou deux animaux du
sexe le plus sensible), une cinquime concentration dexposition peut galement suffire. Pour plus dinformations
sur le nombre danimaux et les concentrations utiliser pour une tude C t, se reporter au document
tude prliminaire pour le protocole C t
35. Une tude prliminaire permet destimer lactivit de la substance dessai et facilite le choix des niveaux de
concentration pour ltude principale. Une tude prliminaire avec au maximum trois animaux par sexe et par
concentration (pour plus de dtails, voir lappendice III du document dorientation 39) (2) peut tre utilise afin
de slectionner une concentration de dpart approprie pour ltude principale et de rduire le nombre dani
maux utiliss. Il peut en effet tre ncessaire de recourir trois animaux par sexe pour tablir une diffrence
selon le sexe. Ces animaux sont soumis une exposition unique, dune dure de 240 minutes en gnral. Pour
valuer la faisabilit de la production datmosphres dessai appropries, des essais techniques prliminaires sans
animaux sont raliss. Il nest gnralement pas ncessaire de procder une tude prliminaire si lon dispose de
donnes de mortalit provenant dune tude effectue suivant la mthode B.52 (4). Pour choisir la concentration
cible initiale dans une tude B.2, le directeur de ltude tient compte des profils de mortalit observs dans
nimporte quelle tude B.52 (4) disponible, pour les deux sexes et pour toutes les concentrations testes, voir
document dorientation 39 (2).
Concentration initiale pour le protocole C t
36. La concentration initiale (Session dexposition I) (voir appendice 1) est soit une concentration limite, soit une
concentration choisie par le directeur de ltude sur la base dune tude prliminaire. Des groupes constitus dun
animal de chaque sexe sont exposs cette concentration pendant des priodes de dure variable (15, 30, 60,
120 ou 240 minutes, par exemple), soit un total de 10 animaux, pour ce quon appelle la Session dexposition I
(voir appendice 1).
37. Le choix des concentrations limites dpend gnralement des exigences rglementaires. Lorsquon applique le
rglement (CE) no 1272/2008, les concentrations limites pour les gaz, les vapeurs et les arosols sont respec
tivement de 20 000 ppm, 20 mg/l et 5 mg/l (ou, dfaut, la concentration maximale pouvant tre atteinte) (3). Il
peut savrer techniquement difficile datteindre les concentrations limites de certaines substances dessai, en
particulier pour les vapeurs et les arosols. Pour les essais darosols, lobjectif est datteindre une taille de
particule qui soit respirable (cest-- dire un DAMM de 1 4 m), ce qui est possible avec la plupart des
substances dessai des concentrations de 2 mg/l. Les essais sur des arosols des concentrations suprieures
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2 mg/l ne sont tents que si lon peut obtenir des particules de taille respirable, voir document dorientation 39
(2). Selon le rglement (CE) no 1272/2008, il est dconseill de raliser des essais au-del des concentrations
limites pour des raisons de bien-tre des animaux (3). Les essais au-del de la concentration limite ne sont
envisags que sil est trs probable que leurs rsultats prsenteront un intrt direct pour la protection de la sant
humaine (3), et une justification est alors fournie dans le rapport dtude. En cas de substance potentiellement
explosive, on prendra soin dviter les conditions susceptibles de provoquer une explosion. Afin dviter le
recours inutile des animaux, un essai sans animaux est effectu avant lessai la concentration initiale pour
sassurer quil est possible datteindre dans la chambre les conditions exprimentales dun essai cette concen
tration.
38. Si une mortalit ou un tat moribond sont observs la concentration initiale, les rsultats obtenus cette
concentration peuvent servir de point de dpart pour les essais suivants dautres concentrations (voir tude
principale). Si la concentration limite est impossible atteindre du fait des proprits physiques ou chimiques de
la substance dessai, cest la concentration maximale pouvant tre atteinte qui est teste. Si la ltalit cette
concentration est infrieure 50 %, il ny a pas lieu de poursuivre lessai. Si la concentration limite na pas pu
tre atteinte, une explication, taye par des donnes, est fournie dans le rapport dtude. Si la concentration
maximale pouvant tre atteinte pour une vapeur ne provoque pas de toxicit, il peut tre ncessaire de produire
la substance dessai sous la forme dun arosol liquide.
tude principale pour le protocole C t
39. La concentration initiale (session dexposition I) (voir appendice 1) teste dans ltude principale est soit une
concentration limite, soit une concentration choisie par le directeur de ltude sur la base dune tude prlimi
naire. Si une mortalit a t observe pendant ou aprs la session I, lexposition minimale (C t) qui a provoqu
la mortalit sert de guide pour dterminer la concentration et les priodes dexposition pour la session II. Chaque
session dexposition suivante dpendra de la session prcdente (voir appendice 1).
40. Pour de nombreuses substances dessai, les rsultats obtenus la concentration initiale, plus ceux obtenus lors de
trois sessions dexposition supplmentaires sur une chelle de temps plus courte (la dure des priodes dexpo
sition successives suivant une progression gomtrique de facteur 2), sont suffisants pour tablir la relation de
mortalit C t (15). Nonobstant, il peut tre utile de recourir une cinquime concentration dexposition [voir
appendice 1 et document dorientation 39 (2)]. Pour le traitement mathmatique des rsultats concernant le
protocole C t, voir appendice 1.
OBSERVATIONS
41. Un examen clinique des animaux est pratiqu rgulirement pendant la priode dexposition. Aprs lexposition,
des examens cliniques sont raliss au minimum deux fois le jour de lexposition, ou plus frquemment suivant
la rponse des animaux au traitement, et au minimum une fois par jour par la suite pendant une priode de
14 jours. La dure de la priode dobservation nest pas fixe, mais est dtermine par la nature et le moment
dapparition des signes cliniques, ainsi que par la dure de la priode de rcupration. Les moments dapparition
et de disparition des signes de toxicit sont importants, en particulier quand on constate un certain retard dans
lapparition de ces signes. Toutes les observations sont systmatiquement enregistres individuellement pour
chaque animal. Les animaux moribonds ou prsentant des signes de souffrance manifeste ou de dtresse svre et
persistante sont euthanasis pour des raisons de bien-tre animal. Lors de lexamen clinique des signes de
toxicit, il convient de veiller ne pas confondre une pitre apparence initiale et des troubles respiratoires
passagers, imputables la procdure dexposition, avec une toxicit de la substance dessai qui impliquerait
deuthanasier les animaux plus tt. Les principes et critres rsums dans le document dorientation sur les effets
mesurs thiquement acceptables sont pris en considration, voir document dorientation 19 (7). Quand des
animaux sont retrouvs morts ou sont euthanasis, lheure de la mort est consigne le plus prcisment possible.
42. Les observations quotidiennes portent notamment sur les modifications de la peau et des poils, des yeux et des
muqueuses, mais aussi sur les changements affectant lappareil respiratoire, le systme circulatoire, les systmes
nerveux autonome et central, ainsi que lactivit somatomotrice et le comportement. Toute diffrentiation entre
les effets locaux et systmiques est consigne autant que possible. Les tremblements, les convulsions, la saliva
tion, les diarrhes, la lthargie, le sommeil et le coma doivent retenir lattention. La mesure de la temprature
rectale peut aider mettre en vidence une bradypne rflexe ou une hypo/hyperthermie lie au traitement ou au
confinement.
Poids corporel
43. Le poids corporel de chacun des animaux est enregistr une fois lors de la priode dacclimatation, le jour de
lexposition (jour 0) juste avant celle-ci et au moins les jours 1, 3, et 7 (puis de faon hebdomadaire par la suite),
ainsi quau moment de la mort ou de leuthanasie, sil est postrieur au jour 1. Le poids corporel est un
indicateur critique reconnu de la toxicit, on surveille donc attentivement les animaux, dont le poids reste
constamment infrieur de 20 %, ou plus celui prcdant ltude. Les animaux survivants sont pess et
euthanasis la fin de la priode postexposition.
Pathologie
44. Tous les animaux dexprience, y compris ceux morts au cours de lessai ou euthanasis et carts de ltude pour
des raisons de bien-tre animal, subissent une autopsie macroscopique. Lorsquun animal est dcouvert mort et
que son autopsie nest pas ralisable immdiatement, lanimal est rfrigr (mais non congel) une temprature
suffisamment basse pour minimiser lautolyse. Les autopsies sont ralises le plus tt possible, en gnral dans un
dlai dun deux jours. Tous les changements macropathologiques sont enregistrs pour chaque animal en
prtant particulirement attention aux voies respiratoires.
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45. Dautres observations, ajoutes a priori dessein, peuvent tre envisages afin dlargir linterprtation de ltude,
comme la mesure du poids pulmonaire des rats survivants et/ou la mise en vidence dune irritation par examen
de lappareil respiratoire au microscope. Peuvent aussi tre examins les organes montrant une pathologie
macroscopique chez les animaux survivant au moins 24 heures, et ceux pour lesquels une raction au traitement
est connue ou attendue. Un examen microscopique de lintgralit de lappareil respiratoire peut fournir des
informations utiles pour les substances dessai ractives leau, comme les acides et les substances hygrosco
piques.
RSULTATS ET RAPPORT
Rsultats
46. Pour chacun des animaux, le poids corporel et les conclusions de lautopsie sont fournis. Les rsultats des
observations cliniques sont rsums sous la forme de tableaux et indiquer pour chaque groupe dessai: le
nombre danimaux utiliss, le nombre danimaux prsentant des signes spcifiques de toxicit, le nombre
danimaux retrouvs morts au cours de lessai ou euthanasis, lheure de la mort de chacun des animaux, la
description et lvolution dans le temps des effets toxiques ainsi que leur rversibilit, et les conclusions de
lautopsie.
Rapport dessai
47. Le rapport dessai contient, sil y a lieu, les renseignements suivants:
Animaux dexprience et conditions dlevage:
description des conditions dencagement, y compris: nombre (ou volution du nombre) danimaux par cage,
matriel de litire, temprature ambiante et taux dhumidit relative, photopriode et identification du rgime
alimentaire,
espces/souches utilises et justification ventuelle de lutilisation dune espce autre que le rat,
nombre, ge et sexe des animaux,
mthode de randomisation,
dtails sur la qualit de la nourriture et de leau (notamment origine/type de rgime alimentaire, origine de
leau),
description dun ventuel conditionnement pralable lessai, tel que rgime alimentaire, quarantaine ou
traitement de maladie.
Substance dessai:
nature physique, puret et, sil y a lieu, proprits physico-chimiques (y compris isomrisation),
donnes didentification et numro CAS (Chemical Abstract Services) sil est connu.
Vhicule:
justification de lemploi dun vhicule et justification de son choix (sil ne sagit pas de leau),
donnes historiques ou concordantes dmontrant que le vhicule ninterfre pas avec les rsultats de ltude.
Chambre dinhalation:
description de la chambre dinhalation avec ses dimensions et son volume,
source et description de lquipement utilis pour lexposition des animaux et pour la production de
latmosphre,
quipement utilis pour mesurer la temprature, lhumidit, la granulomtrie et la concentration relle,
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source de lair, traitement de lair fourni/vacu et systme de climatisation utilis,

mthodes utilises pour talonner lquipement afin dassurer lhomognit de latmosphre dessai,
diffrence de pression (positive ou ngative),
orifices dexposition par chambre (nez seul) ou emplacement des animaux dans la chambre (corps entier),
homognit/stabilit temporelle de latmosphre dessai,
situation des capteurs thermiques et hygromtriques et chantillonnage de latmosphre dessai dans la
chambre dexposition,
dbits dair, dbit dair par orifice dexposition (nez seul) ou rapport du volume de lanimal la chambre
(corps entier),
informations sur lquipement utilis, le cas chant, pour mesurer loxygne et le dioxyde de carbone,
temps ncessaire pour atteindre lquilibre dans la chambre dexposition (t95),
nombre de changements de volume par heure,
doseurs (sil y en a).
Donnes concernant lexposition:
justification du choix de la concentration cible dans ltude principale,
concentrations nominales (masse totale de la substance dessai produite dans la chambre dinhalation, divise
par le volume dair traversant la chambre),
concentrations relles de la substance dessai obtenues dans la zone o respirent les animaux; pour les
mlanges tester produisant des formes physiques htrognes (gaz, vapeurs, arosols), chacun des consti
tuants peut tre analys sparment,
toutes les concentrations atmosphriques sont rapportes en units de masse (mg/l, mg/m3, etc.); les units
de volume (ppm, ppb, etc.) peuvent aussi tre indiques entre parenthses;
rpartition granulomtrique des particules, diamtre arodynamique mdian de masse (DAMM) et cart type
gomtrique (g), ainsi que leur mthode de calcul. Les autres analyses de la taille de particules sont
consignes.
dtails sur la prparation de la substance dessai, y compris sur les procdures utilises pour rduire la taille
des particules des matriaux solides ou pour prparer les solutions de la substance dessai. Lorsque des
procds mcaniques sont susceptibles davoir altr la composition de la substance dessai, inclure les
rsultats des analyses effectues pour vrifier la composition de la substance dessai,
description (si possible avec schma) de lquipement utilis pour produire latmosphre dessai et pour
exposer les animaux celle-ci,
dtails sur la mthode de chimie analytique utilise et la mthode de validation (notamment rendement de
rcupration de la substance dessai partir du milieu dchantillonnage),
jutification du choix des concentrations dessai.
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Rsultats:
tableau prsentant la temprature, le taux dhumidit et le dbit dair dans la chambre dinhalation,
tableau de donnes sur les concentrations nominales et relles dans la chambre dinhalation,
tableau de donnes sur la taille des particules, notamment donnes analytiques sur le prlvement dchan
tillons, la rpartition granulomtrique et les calculs du DAMM et de g,
tableau de donnes sur les rponses et le niveau de concentration pour chaque animal (cest--dire nombre
danimaux montrant des signes de toxicit, y compris de mortalit, et nature, svrit, moment dapparition
et dure des effets),
poids corporel de chacun des animaux enregistrs lors de lessai, date et heure de leur mort si celle-ci
intervient avant leuthanasie prvue; moment dapparition et volution des signes de toxicit et, le cas
chant, leur rversibilit,
pour chaque animal, rsultats de lautopsie et observations histopathologiques disponibles,
estimations de la ltalit (CL50, DL01 par exemple), notamment limites de confiance 95 % et pente (si elle
est fournie par la mthode dvaluation),
relation statistique, y compris lestimation du facteur n (pour le protocole C t). Le nom du logiciel de
statistiques utilis est indiqu.
Discussion et interprtation des rsultats:
un effort particulier est consacr la description des mthodes utilises pour rpondre aux critres de la
prsente mthode dessai, par exemple en ce qui concerne la concentration limite ou la taille des particules,
la respirabilit des particules est aborde la lumire des rsultats densemble, en particulier si les critres de
taille des particules nont pu tre remplis,
une explication est apporte sil a fallu euthanasier des animaux qui souffraient ou montraient des signes de
dtresse svre et persistante, en se basant sur les critres du document dorientation de lOCDE sur les effets
mesurs thiquement acceptables (8),
si un essai suivant le chapitre B.52 de la prsente annexe (4) a d tre interrompu en faveur de la prsente
mthode dessai B.2, les justifications sont fournies,
la cohrence des mthodes utilises pour dterminer les concentrations nominales et relles, et la relation
entre la concentration relle et la concentration nominale, sont incluses dans lapprciation densemble de
ltude,
la cause probable de la mort et le mode daction prdominant (systmique ou local) sont abords.
BIBLIOGRAPHIE:
(1) OCDE (2009). Toxicit aigu par inhalation. Ligne directrice de lOCDE pour les essais de produits chimique
no 403, OCDE Paris. Disponible sur l'internet (http://www.oecd.org/env/testguidelines).
(2) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Publications Hygine et Scurit de
lenvironnement Srie sur les essais et valuations no 39, Paris. Disponible sur l'internet (http://www.oecd.org/
env/testguidelines).
(3) Rglement (CE) no 1272/2008 du Parlement europen et du Conseil du 16 dcembre 2008 relatif la
classification, ltiquetage et lemballage des substances et des mlanges, modifiant et abrogeant les directives
67/548/CEE et 1999/45/CE et modifiant le rglement (CE) no 1907/2006 (JO L 353 du 31.12.2008, p. 1).
(4) Chapitre B.52 de la prsente annexe, Toxicit aigu par inhalation Mthode par classe de toxicit aigu (ATC).
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(5) Chapitre B.40 de la prsente annexe, Corrosion cutane in vitro: Essai de rsistance lectrique transcutane
(RET).
(6) Chapter B.40 bis de la prsente annexe, Corrosion cutane in vitro: Essai sur modle de peau humaine.
(7) OCDE (2005). Mthode dessai in vitro sur membrane dtanchit pour la corrosion cutane. Ligne directrice de
lOCDE pour les essais de produits chimiques no 435, OCDE, Paris. Disponible sur l'internet (http://www.oecd.
org/env/testguidelines).
(8) OCDE (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane
Endpoints for Experimental Animals Used in Safety valuation. Publications Hygine et Scurit de lenviron
nement Srie sur les essais et valuations no 19, OCDE, Paris. Disponible sur l'internet (http://www.oecd.org/
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recom
mendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
(10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
(11) Pauluhn J. and Thiel A. (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation
Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.
(12) Zwart J.H.E., Arts J.M., ten Berge W.F., Appelman L.M. (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by
Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard
LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
(13) Zwart J.H.E., Arts J.M., Klokman-Houweling E.D., Schoen E.D. (1990). Determination of Concentration-TimeMortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
(14) Ten Berge W.F. and Zwart A. (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz.
Mat. 21: 65-71.
(15) OCDE (2009), Performance Assessment: Comparison of 403 and C t Protocols via Simulation and for
Selected Real Data Sets. Publications Hygine et Scurit de lenvironnement - Srie sur les essais et valuations
no 104, OCDE, Paris. Disponible sur l'internet (http://www.oecd.org/env/testguidelines).
(16) Finney D.J. (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.
DFINITION
Substance dessai: toute substance ou tout mlange soumis un essai ralis suivant la prsente mthode dessai.
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Appendice 1
Protocole C t
1. Une tude squentielle Concentration Temps (C t) peut constituer une alternative au protocole traditionnel
lorsquil sagit dvaluer la toxicit par inhalation (12) (13) (14). Elle est privilgie lorsquune rglementation
particulire sapplique ou pour un besoin scientifique ncessitant des essais sur animaux portant sur des dures
dexposition multiples, par exemple des fins dtablissement de plans dintervention durgence ou damnagement du
territoire. Cette approche dbute en gnral avec un essai la concentration limite (session dexposition I) au cours
duquel les animaux sont exposs la substance dessai pendant cinq priodes de dures diffrentes (15, 30, 60, 120
et 240 minutes par exemple) de faon obtenir plusieurs dures dexposition pour une mme sance (voir figure 1).
Lorsquon applique le rglement (CE) no 1272/2008, les concentrations limites pour les gaz, les vapeurs et les
arosols sont respectivement de 20 000 ppm, 20 mg/l et 5 mg/l. Ces niveaux ne peuvent tre dpasss que sil est
indispensable de raliser des essais ces niveaux de concentration pour des raisons rglementaires ou scientifiques
(voir le paragraphe 37 de la mthode B.2).
2. Si lon manque dinformations sur la toxicit de la substance dessai, une tude prliminaire peut tre ralise, au
cours de laquelle des groupes dau maximum 3 animaux par sexe sont exposs des concentrations cibles slec
tionnes par le directeur de ltude, en gnral sur une dure de 240 minutes.
3. Si une concentration limite est teste lors de la session dexposition I et que lon observe une mortalit infrieure
50 %, il nest pas ncessaire deffectuer des essais supplmentaires. Si, pour des raisons rglementaires ou scientifiques,
il est indispensable dtablir la relation concentration/temps/rponse pour des niveaux plus levs que la concen
tration limite indique, lexposition suivante est ralise, par exemple, au double de la concentration limite (cest--dire
2L dans la figure 1).
4. Si une toxicit est observe la concentration limite, des essais supplmentaires (tude principale) sont ncessaires.
Ces expositions supplmentaires sont ralises soit des concentrations plus faibles (dans la figure 1: sessions
dexposition II, III ou IV), soit des concentrations plus fortes sur des dures plus courtes (dans la figure 1,
session dexposition IV) qui sont adaptes et moins espaces.
5. Lessai (concentration initiale et concentrations supplmentaires) est ralis avec lanimal de chaque sexe par point
concentration/temps, ou avec 2 animaux du sexe le plus sensible la substance dessai par point concentration/temps.
Le directeur de ltude peut choisir, dans certaines circonstances, dutiliser 2 rats de chaque sexe par point concen
tration/temps, ou 4 animaux du sexe le plus sensible la substance dessai par point concentration/temps (15).
Lutilisation de 2 animaux par point concentration/temps rduit en gnral le biais et la variabilit des estimations,
augmente le taux de succs de lestimation et amliore la couverture de lintervalle de confiance li ce protocole.
Pour plus de dtails, se reporter au document dorientation 39 (2).
6. Idalement, chaque session dexposition est excute sur une seule journe, ce qui donne la possibilit de retarder
lexposition suivante jusqu ce quon soit raisonnablement sr de la survie des animaux, et permet au directeur de
ltude dajuster la concentration cible et les dures pour la prochaine sance dexposition. Il est recommand de
commencer chaque sance dexposition avec le groupe qui sera expos le plus longtemps, 240 minutes par exemple,
suivi du groupe qui sera expos 120 minutes, et ainsi de suite. Si, par exemple, les animaux du groupe expos
240 minutes meurent aprs 90 minutes dexposition ou montrent des signes importants de toxicit (par exemple,
modifications considrables de la respiration, notamment difficults respiratoires), il est inutile dexposer un groupe
pendant 120 minutes car la mortalit serait trs vraisemblablement de 100 %. Le directeur de ltude choisit alors des
dures dexposition plus courtes pour cette concentration (90, 65, 45, 33 et 25 minutes par exemple).
7. La concentration dans la chambre dexposition est mesure rgulirement pour dterminer la concentration moyenne
pondre en fonction du temps pour chaque dure dexposition. Autant que possible, cest lheure de la mort de
chaque animal qui est utilise dans lanalyse statistique (et non la dure dexposition).
8. Il convient dexaminer les rsultats des quatre premires sessions dexposition pour reprer les ventuelles donnes
manquantes dans la courbe concentration-temps (voir figure 1). Sil manque effectivement des donnes, une expo
sition supplmentaire (5e concentration) peut tre ralise. La concentration et les dures dexposition de cette
5e exposition sont choisies de manire combler cette lacune.
9. Toutes les sessions dexposition (y compris la premire) seront utilises pour calculer la relation concentration-tempsrponse au moyen dune analyse statistique (16). On utilisera si possible, pour chaque intervalle C t, la concen
tration moyenne pondre en fonction du temps et la dure dexposition jusqu la mort (si celle-ci intervient durant
lexposition).
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Figure 1
Illustration hypothtique dune relation concentration-temps-mortalit chez des rats
Symboles vides = survivants; symboles pleins = animaux morts

Triangles = femelles; cercles = mles
Ligne pleine = valeurs de CL50 (de 7,5 240 minutes) pour les mles, n = 1
Ligne tirete = valeurs de CL50 (de 7,5 240 minutes) pour les femelles, n = 1
Lignes pointilles = valeurs de CL50 hypothtique pour les mles et les femelles si n avait t gal 2 (12).
Glossaire
concentration limite.
dure dexposition.
10. On trouvera ci-dessous un exemple de la procdure squentielle:
Session dexposition I Essai la concentration limite (voir figure 1)
1 animal/sexe par point concentration/temps; 10 animaux au total (a)
Concentration cible (b) = concentration limite
Exposer cinq groupes danimaux cette concentration cible pendant respectivement 15, 30, 60, 120 et
240 minutes.
Session dexposition II (c) tude principale

1 animal/sexe par point concentration/temps; 10 animaux au total.
(a) Si aucune information nest disponible sur la sensibilit de chaque sexe la substance dessai, des rats des deux sexes seront utiliss, soit
1 animal de chaque sexe par concentration. partir dinformations existantes ou sil apparat au cours de cette session dexposition
quun des sexes est plus sensible, 10 animaux de ce sexe seront utiliss (2 animaux par point concentration/temps) chaque niveau de
concentration pour les essais suivants.
b
( ) Lorsquon applique le rglement (CE) no 1272/2008, les concentrations limites pour les gaz, les vapeurs et les arosols sont respec
tivement de 20 000 ppm, 20 mg/l et 5 mg/l. Si lon sattend une toxicit ou en raison des rsultats de ltude prliminaire, on choisit
des concentrations de dpart plus faibles. Pour des besoins rglementaires ou scientifiques, des concentrations plus fortes peuvent tre
utilises.
c
( ) Idalement, lexposition des animaux au niveau de concentration suivant est retarde jusqu ce quon soit raisonnablement sr que les
animaux prcdemment soumis au traitement ont survcu. Le directeur de ltude peut alors ajuster la concentration cible et les dures
pour la session dexposition suivante.
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Exposer cinq groupes danimaux une concentration plus faible (d) (1/2L) pendant des dures lgrement plus
longues (dun facteur 2, voir figure 1).
Session dexposition III tude principale

Session dexposition IV tude principale

ou
Session dexposition IV tude principale
Exposer cinq groupes danimaux une concentration plus forte (e) (2L) pendant des dures lgrement plus
longues (dun facteur 2; voir figure 1).
Traitement mathmatique des rsultats pour le protocole C t
11. Une procdure C t constitue de 4 ou 5 concentrations dexposition et de 5 dures dexposition gnre respec
tivement 20 ou 25 points de donnes. Avec ces points de donnes, la relation C t peut tre calcule laide dune
analyse statistique (16):
quation 1:
Probit(P) = b0 + b1ln C + b2ln t

o C = concentration; t = dure dexposition, ou
quation 2:
Response = (Cnt)
o n b1 =b2 :
Avec lquation 1, la valeur de la CL50 peut tre calcule pour une priode de temps donne (par exemple, 4 heures,
1 heure, 30 minutes ou nimporte quelle priode de temps comprise dans la plage des priodes de temps testes) avec
P = 5 (50 % de rponse). noter que la rgle de Haber ne sapplique que lorsque n = 1. La CL01 est calcule avec
P = 2,67.
(d) La dose minimale (concentration temps) qui provoque la mortalit au cours de lessai la concentration initiale (premire session
dexposition) servira de guide pour dterminer la prochaine combinaison de concentrations et de dures dexposition. Gnralement, la
concentration diminuera de moiti (1/2L) et les animaux seront exposs sur une chelle de temps plus courte, les priodes dexposition
tant rparties selon une progression gomtrique de facteur 1,4 (2, voir rfrence 11) centre sur le temps correspondant au niveau
de la dose ltale minimale (temps concentration) observ lors de la premire exposition. Dans la figure 1, la mortalit au cours de la
Session dexposition I a dabord t observe au bout de 15 minutes; les dures de la Session II ont donc t centres autour de 30
minutes et sont de 15, 21, 30, 42 et 60 minutes. Aprs les deux premires expositions, il est fortement recommand de tracer les
rsultats dans un graphique similaire, comme indiqu ci-dessus, et de vrifier si la relation entre la concentration et le temps dfinit un
angle de 45 degrs (n = 1) ou si la pente de la relation concentration-temps-rponse est moins forte (n = 2 par exemple) ou plus forte
(n = 0,8 par exemple). Dans ces derniers cas, il est fortement recommand dadapter en consquence les concentrations et les dures
suivantes.
e
( ) Dans certains cas, il peut tre ncessaire daugmenter la concentration (2L) sur une chelle de temps plus courte, les priodes
dexposition tant rparties selon une progression gomtrique de facteur 1,4 (2) centre sur le temps correspondant au niveau de
dose ltale minimale observ lors de la premire exposition. La dure minimale dexposition est de prfrence suprieure 5 minutes et
la dure maximale dexposition ne dpasse pas 8 heures.
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4) les chapitres B.7 et B.8 sont remplacs par le texte suivant:

B.7. TUDE DE TOXICIT ORALE DOSE RPTE PENDANT 28 JOURS SUR LES RONGEURS
INTRODUCTION
1.
chimiques. La ligne directrice 407 originale avait t adopte en 1981. Des modifications y ont t apportes en
1995 afin de tirer davantage dinformations des animaux utiliss dans ltude, en particulier en matire de
neurotoxicit et dimmunotoxicit.
2.
LOCDE a lanc en 1998 une activit prioritaire destine rviser les lignes directrices existantes et en laborer
de nouvelles pour les essais et le dpistage des perturbateurs endocriniens (8). Lun des objectifs tait de mettre
jour la ligne directrice de lOCDE relative ltude de toxicit orale dose rpte pendant 28 jours sur les
rongeurs (407), en y introduisant des paramtres capables de dtecter lactivit endocrinienne des substances
dessai. Le protocole a alors fait lobjet dun programme international approfondi charg dvaluer la pertinence et
la praticabilit de ces paramtres additionnels, leur performance pour des produits chimiques activit (anti)s
trognique, (anti)andrognique et (anti)thyrodienne, leur reproductibilit intra- et inter-laboratoires et leur inter
frence avec les paramtres requis par la version antrieure de la ligne directrice. Les trs nombreuses donnes
ainsi recueillies ont t rassembles et values en dtail dans un rapport trs complet de lOCDE (9). La prsente
mise jour de la mthode B.7 est le fruit de lexprience et des rsultats accumuls durant le programme
international dessais. Elle permet de mettre certains effets mdiation endocrinienne en perspective avec dautres
effets toxicologiques.
REMARQUES PRLIMINAIRES ET LIMITATIVES
3.
Lors de lapprciation et de lvaluation des caractristiques toxiques dun produit chimique, la dtermination de
la toxicit orale doses rptes peut seffectuer aprs avoir obtenu des informations prliminaires sur la toxicit
partir dessais de toxicit aigu. La prsente mthode dessai vise tudier les effets toxiques des produits
chimiques sur un large spectre de cibles de toxicit. Elle fournit des informations sur les risques pour la sant que
peut entraner une exposition rpte durant une priode de temps relativement limite, notamment pour le
systme nerveux, le systme immunitaire et le systme endocrinien. Concernant ces critres deffet prcis, elle
devrait permettre didentifier des produits chimiques potentiellement neurotoxiques, pouvant justifier des tudes
plus approfondies de cet aspect, etdes produits chimiques qui interfrent avec la physiologie de la thyrode. Elle
pourrait galement fournir des donnes sur les produits chimiques qui affectent les organes reproducteurs mles
et/ou femelles des jeunes animaux adultes et donner des indications sur leurs effets immunologiques.
4.
Les rsultats de la prsente mthode dessai B.7 devraient servir lidentification des dangers et lvaluation des
risques. Les rsultats obtenus concernant les paramtres endocriniens devraient tre interprts la lumire du
Cadre conceptuel de lOCDE pour les essais et lvaluation des produits chimiques perturbant le systme
endocrinien (11). La mthode prvoit une tude basique de toxicit dose rpte, pouvant tre utilise sur
les produits chimiques pour lesquels une tude de 90 jours nest pas justifie (par exemple quand le volume de
production ne dpasse pas certaines limites) ou pralablement une tude long terme. La dure dexposition
doit tre de 28 jours.
5.
Le programme international men afin de valider les paramtres susceptibles de dtecter lactivit endocrinienne
dune substance dessai a montr que la qualit des donnes obtenues grce cette mthode dessai B.7 dpendra
beaucoup de lexprience du laboratoire pratiquant les essais. Ce constat concerne spcifiquement la dtermina
tion histopathologique de changements cycliques dans les organes reproducteurs femelles et la dtermination du
poids des petits organes hormono-dpendants, difficiles dissquer. Un document dorientation a t labor en
matire dhistopathologie (19). Il est disponible sur le site de lOCDE la rubrique consacre aux lignes
directrices pour les essais de produits chimiques. Il vise aider les pathologistes dans leurs investigations et
amliorer la sensibilit des essais. Un certain nombre de paramtres ont t identifis comme indicateurs de
toxicit endocrinienne et ont t ajouts la mthode dessai. Dautres, dont lutilit na pu tre prouve faute de
donnes suffisantes ou dont la capacit dtecter les perturbateurs endocriniens a t insuffisamment dmontre
par le programme de validation, sont proposs comme paramtres facultatifs (voir appendice 2).
6.
Sur la base des donnes produites par le processus de validation, il convient de souligner que la sensibilit de cet
essai est insuffisante pour identifier toutes les substances prsentant une action (anti)andrognique ou (anti)s
trognique (9). La prsente mhtode dessai ne sapplique pas un stade de vie trs sensible aux perturbations
endocriniennes. Elle a pourtant permis, pendant le processus de validation, didentifier des substances affectant
faiblement ou fortement la fonction thyrodienne, ainsi que des substances agissant fortement ou modrment
sur le systme endocrinien par le biais des rcepteurs aux strognes et aux andrognes, mais dans la plupart
des cas, nest pas parvenue identifier les substances agissant sur le systme endocrinien en affectant faiblement
ces rcepteurs. Ainsi ne peut-elle tre dcrite comme un essai de dpistage de lactivit endocrinienne.
7.
Par consquent, labsence deffet li ces modes daction ne peut constituer une preuve de labsence deffet sur le
systme endocrinien. En ce qui concerne les effets mdiation endocrinienne, la caractrisation des substances
ne doit donc pas sappuyer uniquement sur les rsultats de la prsente mthode dessai, mais doit tre utilise
dans le cadre dune dmarche fonde sur le poids de la preuve, combinant toutes les donnes existant sur un
produit chimique pour caractriser son action potentielle sur le systme endocrinien. Cest pourquoi la prise de
dcision rglementaire sur lactivit endocrinienne des produits chimiques (caractrisation des substances) doit
adopter une mthode large ne sappuyant pas sur les rsultats de cette seule mthode dessai.
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8.
Il est entendu que toutes les procdures dessai utilisant des animaux obiront aux normes locales en vigueur sur
le traitement leur rserver; la description des soins et traitements prodigus aux animaux utiliss dans le
prsent essai correspond donc des normes de performance minimales qui seront le cas chant adaptes la
lgislation locale si celle-ci est plus stricte. Dautres recommandations sur lhumanit du traitement rserver aux
animaux ont t formules par lOCDE (14).
9.
Lappendice 1 prsente les dfinitions utilises.

PRINCIPE DE LESSAI
10. La substance tester est administre quotidiennement par voie orale diffrents niveaux de dose plusieurs
groupes danimaux, raison dun niveau de dose par groupe, pendant une priode de 28 jours. Chaque jour au
cours de cette priode, les animaux sont examins soigneusement afin de dceler tout signe de toxicit. Les
animaux qui meurent ou qui sont euthanasis au cours de lessai sont autopsis et, au terme de lessai, les
animaux survivants sont galement euthanasis et autopsis. Une tude de 28 jours fournit des informations sur
les effets dune exposition rpte par voix orale et peut indiquer la ncessit dtudes ultrieures plus longues.
Elle peut galement apporter des informations sur la slection des concentrations en vue dtudes plus pousses.
Les donnes tires de lapplication de la mthode dessai devraient permettre de caractriser la toxicit de la
substance dessai, davoir une indication sur la relation dose rponse et de dterminer la concentration sans effet
nocif observ (CSENO).
Slection de lespce animale
11. Lespce de rongeur prfre est le rat, bien que dautres espces de rongeurs puissent tre utilises. Si les
paramtres spcifis dans la mthode dessai B.7 sont tudis sur une autre espce de rongeur, une justification
dtaille devra tre donne. Bien quil soit biologiquement plausible que dautres espces rpondent aux produits
toxiques de manire similaire au rat, lutilisation despces plus petites peut provoquer une variabilit accrue
compte tenu de la difficult technique dissquer des organes de plus petite taille. Le rat a t la seule espce
utilise lors du programme international de validation des paramtres pour la dtection des perturbateurs
endocriniens. Il convient demployer de jeunes animaux adultes sains issus de souches de laboratoire courantes.
Les femelles doivent tre nullipares et non gravides. Ladministration doit commencer ds que possible aprs le
sevrage et, dans tous les cas, avant lge de neuf semaines. Au dbut de ltude, les diffrences de poids entre les
animaux utiliss doivent tre minimales et ne pas excder 20 % de la moyenne du poids pour chaque sexe.
Lorsque lessai est conduit titre dtude prliminaire une tude de toxicit long terme, il est prfrable
dutiliser des animaux issus de la mme souche et de la mme source dans les deux tudes.
Encagement et alimentation
12. Toutes les procdures doivent respecter les normes locales en vigueur sur le traitement des animaux de labo
ratoire. La temprature dans le local dexprimentation doit tre de 22 C ( 3 C). Lhumidit relative doit tre
dau moins 30 % et si possible ne pas dpasser 70 %, except pendant le nettoyage de la pice, lidal tant 5060 %. Pour lclairage, on doit utiliser la lumire artificielle et respecter une squence de 12 heures dclairement
et 12 heures dobscurit. Le rgime alimentaire peut tre un rgime classique de laboratoire avec eau potable
satit. Le choix du rgime alimentaire peut tre influenc par la ncessit dassurer un mlange convenable de la
substance dessai, lorsquelle est administre dans la nourriture. Les animaux doivent tre encags par petits
groupes du mme sexe; ils peuvent tre encags individuellement si une ncessit scientifique le justifie. Pour
lencagement de groupe, il convient de ne pas dpasser cinq animaux par cage.
13. La nourriture doit tre analyse rgulirement la recherche de contaminants. Un chantillon en sera conserv
jusqu la finalisation du rapport.
14. De jeunes animaux adultes sains sont rpartis au hasard entre le groupe tmoin et les groupes traits. Les cages
doivent tre places de faon rduire au minimum linfluence ventuelle de leur disposition sur les rsultats. Les
animaux sont identifis individuellement et placs dans les cages au moins cinq jours avant le dbut de ltude,
pour leur permettre de sacclimater aux conditions du laboratoire.
Prparation des doses
15. La substance dessai est administre par gavage ou dans la nourriture ou leau de boisson, la mthode tant
choisie en fonction de lobjectif de ltude et des proprits physico-chimiques, toxiques et cintiques de la
substance dessai.
16. Lorsque cela savre ncessaire, la substance dessai est dissoute ou mise en suspension dans un vhicule adquat.
On recommande, de privilgier, dans la mesure du possible, lutilisation dune solution ou dune suspension
aqueuse. dfaut, on peut utiliser une solution ou une suspension dans lhuile (par exemple lhuile de mas) et
finalement une solution dans dautres vhicules. La toxicit des vhicules autres que leau doit tre connue. La
stabilit de la substance dessai dans le vhicule doit tre dtermine.
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PROTOCOLE
Nombre et sexe des animaux
17. Au moins 10 animaux (5 femelles et 5 mles) doivent tre utiliss pour chaque dose. Si on envisage deutha
nasier des animaux au cours de lessai, il faut accrotre le nombre danimaux dexprience du nombre danimaux
euthanasis avant la fin de lpreuve. On envisagera dinclure un groupe satellite supplmentaire de 10 animaux
(5 par sexe) dans le groupe tmoin et dans le groupe trait la plus forte dose, afin dobserver la rversibilit, la
persistance, ou lapparition tardive des effets toxiques, au moins 14 jours aprs le traitement.
Dosage
18. De manire gnrale, au moins trois groupes dessai et un groupe tmoin doivent tre utiliss, mais si daprs
lvaluation des autres donnes aucun effet nest attendu la dose de 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, un
essai limite peut tre ralis. Sil nexiste aucune donne pralable, une tude prliminaire (animaux de la mme
souche et de la mme provenance) peut tre mene pour faciliter la dtermination des doses utiliser. Exception
faite de lexposition avec la substance tester, les animaux du groupe tmoin doivent tre traits dune manire
identique ceux des groupes dessai. Si un vhicule est employ pour administrer la substance dessai, on
administrera au groupe tmoin le plus grand volume de vhicule utilis.
19. Les niveaux de dose doivent tre dtermins en tenant compte de toutes les informations disponibles concernant
les proprits toxiques ou toxico-cintiques de la substance dessai ou de substances analogues. La dose la plus
leve doit provoquer des effets toxiques, sans tre ltale ou causer de svres souffrances. Une squence de doses
dcroissantes doit ensuite tre slectionne en vue de mettre en vidence tout effet li la dose ainsi quune
concentration sans effet nocif observ (CSENO) la dose la plus faible. Des intervalles correspondant un
facteur 2 ou 4 sont souvent les plus appropris entre les doses dcroissantes et linclusion dun quatrime groupe
dessai est souvent prfrable la fixation de trs grands intervalles (par exemple un facteur suprieur 10) entre
les doses.
20. En cas dobservation dune toxicit gnrale (par exemple rduction du poids corporel, effets sur le foie, le cur,
les poumons ou les reins, etc.) ou dautres modifications susceptibles de ne pas constituer une rponse toxique
(par exemple diminution de la prise de nourriture, grossissement du foie), les effets observs sur les paramtres
neurologiques, endocriniens ou lis au systme immunitaire, devront tre interprts avec prcaution.
Essai limite
21. Si un essai pratiqu avec une seule dose dau moins 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, ou, pour une adminis
tration par le biais de la nourriture ou de leau, dun pourcentage quivalent de cette nourriture ou de cette eau
(en fonction de la dtermination du poids corporel), en suivant le mode opratoire dcrit pour cette tude, ne
produit aucun effet toxique observable et sil ny a pas de raison de penser que la substance soit toxique compte
tenu des donnes dont on dispose au sujet de substances ayant une structure analogue, on peut considrer quil
nest pas ncessaire de raliser une tude complte avec trois niveaux de dose. Lessai limite sapplique, sauf
lorsque les donnes dexposition humaine indiquent la ncessit dutiliser une dose plus leve.
Administration des doses
22. La substance dessai est administre aux animaux quotidiennement, sept jours sur sept, sur une priode de
28 jours. Lorsque la substance dessai est administre par gavage, les animaux doivent recevoir une dose unique,
introduite au moyen dune sonde gastrique ou dune canule dintubation approprie. Le volume maximal de
liquide pouvant tre administr en une fois dpend de la taille de lanimal dexprience. Ce volume ne doit pas
dpasser 1 ml/100 g de poids corporel, sauf dans le cas des solutions aqueuses o il peut aller jusqu 2 ml/100 g
de poids corporel. Exception faite des substances irritantes ou corrosives, qui provoqueront normalement des
effets exacerbs aux concentrations plus leves, il convient de rduire au minimum la variabilit du volume
dessai en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant toutes les doses.
23. Si la substance dessai est administre dans les aliments ou leau de boisson, il importe de sassurer que sa
quantit ninterfre ni avec la nutrition normale ni avec lquilibre hydrique. Lorsque la substance dessai est
incorpore aux aliments, deux possibilits sont offertes: soit le maintien dune concentration constante dans les
aliments (ppm), soit le maintien dun niveau de dose constant par rapport au poids corporel des animaux; il y a
lieu de prciser loption choisie. Si la substance est administre par gavage, la dose doit tre administre la
mme heure chaque jour et ajuste si ncessaire pour rester constante par rapport au poids corporel de lanimal.
Lorsquune tude doses rptes sert de dtude prliminaire une tude de toxicit long terme, il faut
applique le mme rgime alimentaire dans les deux tudes.
Observations
24. La priode dobservation doit durer 28 jours. Les animaux dun groupe satellite destins des observations
ultrieures ne doivent recevoir aucun traitement pendant au moins 14 jours en vue de dtecter dventuels effets
toxiques diffrs ou persistants, ou de mettre en vidence le rtablissement des animaux traits.
25. Les animaux doivent faire lobjet dun examen clinique gnral au moins une fois par jour, de prfrence aux
mmes heures, en prenant en considration la priode o les effets prvus devraient tre les plus marqus aprs
ladministration. Ltat de sant des animaux doit tre consign. Au moins deux fois par jour, lensemble des
animaux fait lobjet dun constat de morbidit et de mortalit.
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26. Tous les animaux doivent faire lobjet dun examen clinique dtaill, une fois avant la premire exposition (pour
pouvoir effectuer des comparaisons sur un mme individu), et ensuite au moins une fois par semaine. Ces
observations doivent tre effectues hors de la cage habituelle, sur une aire standard, de prfrence toujours au
mme moment de la journe. Elles doivent tre soigneusement consignes, de prfrence en utilisant un systme
de cotation, explicitement dfini par le laboratoire qui ralise lessai. Il faudrait sefforcer de minimiser les
variations des conditions dessai et prendre les dispositions ncessaires pour que les examens soient effectus
par des observateurs nayant pas connaissance du traitement. Les symptmes relevs devraient couvrir les
observations suivantes (sans que cette liste soit exhaustive): modifications de ltat de la peau, de la fourrure,
des yeux, des muqueuses, apparition de scrtions et dexcrtions, et de ractions neuro-vgtatives (par exemple,
scrtion de larmes, horripilation, dimension de la pupille, respiration anormale). Il convient galement de
consigner les changements dans la dmarche, la posture et les ractions la manipulation ainsi que la prsence
de mouvements cloniques ou toniques, des comportements strotyps (par exemple, toilettage excessif, parcours
circulaires rptitifs) ou comportements bizarres (par exemple, automutilation, marche reculons) (2).
27. Lors de la quatrime semaine dexposition, il faut vrifier la ractivit sensorielle diffrents types de stimuli (2)
(stimuli auditifs, visuels et proprioceptifs, par exemple) (3) (4) (5), et valuer la force de prhension (6) et
lactivit motrice (7). On trouvera dans les rfrences bibliographiques susmentionnes une description plus
dtaille des modes opratoires. Toutefois, on peut galement utiliser dautres modes opratoires que ceux qui
figurent dans les rfrences.
28. Les observations fonctionnelles ralises au cours de la quatrime semaine dexposition peuvent tre omises
lorsque lessai sert dtude prliminaire une tude subchronique ultrieure (90 jours). Dans ce cas, les obser
vations fonctionnelles devront tre menes au cours de la seconde tude. Cela tant, les donnes tires des
observations fonctionnelles de ltude doses rptes peuvent faciliter la slection des doses retenues pour
ltude subchronique ultrieure.
29. titre exceptionnel, les observations fonctionnelles peuvent aussi tre omises pour des groupes qui par ailleurs
prsentent des symptmes de toxicit un degr tel quils interfreraient sensiblement avec le droulement de
lessai fonctionnel.
30. Lors de lautopsie, le cycle stral de lensemble des femelles peut tre dtermin (facultatif) par frottis vaginal.
Ces observations fourniront des informations sur le stade du cycle stral atteint au moment de leuthanasie et
faciliteront lvaluation histologique des tissus sensibles aux strognes [voir le guide dorientations sur lhisto
pathologie (19)].
Poids corporel et consommation de nourriture et deau
31. Tous les animaux doivent tre pess au moins une fois par semaine. La consommation de nourriture doit
galement tre mesure au moins une fois par semaine. Si la substance dessai est administre dans leau de
boisson, la consommation deau doit aussi tre mesure au moins une fois par semaine.
Hmatologie
32. la fin de la priode dessai, il faut procder aux examens hmatologiques suivants: hmatocrite, concentration
dhmoglobine, numration des rythrocytes, reticulocytes, numration et formule leucocytaire, numration des
plaquettes et mesure du temps et potentiel de coagulation. Dautres analyses devant tre menes si la substance
dessai ou ses mtabolites supposs ont ou sont susceptibles davoir des proprits oxydantes portent notamment
sur la concentration de mthmoglobine et les corps de Heinz.
33. Des chantillons de sang doivent tre prlevs un endroit spcifi juste avant ou pendant la procdure
deuthanasie des animaux, et stocks dans des conditions appropries. Les animaux doivent avoir jen la
nuit prcdant leuthanasie (1).
Biochimie clinique
34. Les analyses de biochimie clinique destines tudier les principaux effets toxiques sur les tissus, et en particulier
sur le rein et le foie, devraient tre pratiques sur des chantillons de sang prlevs sur tous les animaux juste
avant ou pendant leur euthanasie ( lexception des animaux trouvs moribonds et/ou euthanasis avant la fin de
lessai). Les analyses du plasma ou du srum doivent porter sur le sodium, le potassium, le glucose, le cholestrol
total, lure, la cratinine, la concentration totale de protines et dalbumine, au moins deux enzymes indicatrices
des effets hpatocellulaires (telles que lalanine aminotransfrase, laspartate aminotransfrase, la phosphatase
alcaline, la gamma glutamyle transpeptidase et la glutamate dshydrognase), ainsi que sur les acides biliaires.
Le dosage dautres enzymes (dorigine hpatique ou autre) et de la bilirubine, peut fournir des informations utiles
dans certaines circonstances.
35. titre facultatif, on peut effectuer les analyses durine suivantes au cours de la dernire semaine de ltude sur
des chantillons durine prlevs des moments dtermins: apparence, volume, osmolalit ou poids spcifique,
pH, protines, glucose, sang et cellules sanguines.
(1) Il est prfrable de faire jener les animaux durant la nuit qui prcde la prise de sang pour un certain nombre de dosages dans le
srum et le plasma, surtout pour le dosage du glucose. Cette recommandation est principalement motive par laccroissement de
variabilit qui dcoulerait invitablement dune non- observation du jene et qui tendrait masquer des effets plus subtils, rendant de ce
fait linterprtation des rsultats plus difficile. En revanche, lobservation du jene durant une nuit entire risque de perturber le
mtabolisme gnral des animaux et, notamment lors dtudes o la substance dessai est administre dans la nourriture, risque de
perturber lexposition quotidienne la substance dessai. Si la pratique du jene durant la nuit est adopte, les analyses de biochimie
clinique doivent tre ralises aprs les observations fonctionnelles faites au cours de la quatrime semaine de ltude.
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36. Il faudrait envisager par ailleurs de rechercher dans le plasma ou le srum des marqueurs de lsions gnrales des
tissus. Si les proprits connues de la substance dessai risquent ou sont souponnes daffecter certaines voies
mtaboliques, on devrait procder dautres analyses, notamment celles du calcium, du phosphate, des trigly
crides, dhormones spcifiques et de la cholinestrase. La ncessit de ces analyses doit tre dtermine pour
certaines classes de produits chimiques ou au cas par cas.
37. Bien que lvaluation internationale des paramtres lis au systme endocrinien nait pas pu tablir de faon claire
lintrt de lanalyse des hormones thyrodiennes (T3, T4) et de la TSH, il peut tre utile de conserver des
chantillons de plasma ou de srum pour mesurer la T3, la T4 et la TSH (facultatif) sil semble quun effet sur
laxe hypophyso-thyrodien puisse exister. Ces chantillons pourront tre congels - 20 C pour tre stocks.
Les facteurs suivants peuvent influencer la variabilit et les concentrations absolues lors de lanalyse hormonale:
moment de leuthanasie, en raison de la variation diurne des concentrations hormonales,
mthode deuthanasie, vitant de stresser inutilement les animaux, ce qui pourrait affecter leurs concentra
tions hormonales,
kits danalyse hormonale pouvant diffrer par leurs courbes standards.
Lidentification dfinitive des substances chimiques actives sur le systme thyrodien sappuiera de manire plus
fiable sur lanalyse histopathologique que sur les niveaux hormonaux.
38. Les chantillons de plasma destins spcifiquement lanalyse hormonale doivent tre prlevs aux mmes
heures de la journe. Il est recommand de prendre en considration les taux de T3, T4 et TSH provoqus
par des altrations de lhistopathologie de la thyrode. Les valeurs numriques obtenues lors de lanalyse des
concentrations hormonales diffrent selon les kits dessai du commerce utiliss. Il peut ainsi ne pas tre possible
de fournir des critres de performance fonds sur des donnes historiques homognes. Pour pallier cet incon
vnient, les laboratoires sefforceront de maintenir les coefficients de variation en dessous de 25 pour la T3 et
pour la T4 et de 35 pour la TSH. Toutes les concentrations doivent tre exprimes en ng/ml.
39. Si les donnes de rfrence historiques sont inappropries, il conviendra de prendre en compte les variables
dhmatologie et de biochimie clinique avant le dbut du dosage ou de prfrence sur un groupe danimaux
distincts des groupes dessai.
PATHOLOGIE
Autopsie gnrale
40. Tous les animaux utiliss dans ltude feront lobjet dune autopsie gnrale, complte et dtaille, qui comporte
un examen approfondi de la surface externe du corps, de tous les orifices ainsi que des cavits crnienne,
thoracique et abdominale et de leur contenu. Le foie, les reins, les glandes surrnales, les testicules, les pidi
dymes, lensemble form par la prostate, les vsicules sminales et les glandes coagulantes, le thymus, la rate, le
cerveau et le cur de tous les animaux ( lexception des animaux moribonds et/ou euthanasis avant la fin de
lessai) doivent tre dbarrasss, le cas chant, de tout tissu adhrent et pess ltat frais ds que possible aprs
la dissection, afin dviter leur dessiccation. Il convient denlever trs soigneusement les tissus adhrents de
lensemble de la prostate, de faon viter toute ponction de la vsicule sminale remplies de liquide. Une
alternative consistera dbarrasser la vsicule sminale et la prostate des tissus adhrents et de les peser aprs
fixation.
41. De manire facultative, deux autres organes peuvent aussi tre pess ds que possible aprs la dissection, afin
dviter leur dessiccation: les deux ovaires (poids frais) et lutrus, y compris le col de lutrus [des orientations
sur lablation et la prparation des tissus utrins pour leur pese sont donnes par la ligne directrice 440 de
lOCDE (18)].
42. Le poids de la thyrode (facultatif) peut tre dtermin aprs la fixation. Llimination des tissus adhrents doit
galement soprer avec beaucoup de soin et seulement aprs la fixation pour viter dabmer les tissus, et par l
de compromettre lanalyse dhistopathologie.
43. Les tissus suivants doivent tre conservs dans le milieu de fixation le plus appropri compte tenu la fois du
type de tissu et des examens histopathologiques prvus (voir paragraphe 47): toutes les lsions macroscopiques,
lencphale (les rgions reprsentatives du cerveau comprenant les hmisphres crbraux, le cervelet et la
protubrance annulaire), la moelle pinire, les yeux, lestomac, lintestin grle, le gros intestin (y compris les
plaques de Peyer), le foie, les reins, les glandes surrnales, la rate, le cur, le thymus, la thyrode, la trache et les
poumons (prservs par injection de fixateur, puis immergs), les gonades (testicules et ovaires), les organes
gnitaux auxiliaires (utrus et col de lutrus, pididymes, prostate + vsicules sminales et glandes coagulantes),
le vagin, la vessie, les ganglions lymphatiques [le ganglion lymphatique le plus proximal et un autre, en fonction
de lexprience du laboratoire (15)], un nerf priphrique (sciatique ou poplit interne), de prfrence tout prs
du muscle, un muscle squelettique et un os, avec la moelle osseuse (coupe ou dfaut une ponction examine
immdiatement). Il est recommand de fixer les testicules par immersion dans un fixateur de Bouin ou de
Davidson modifi (16) (17). Lalbugine du testicule doit tre ponctionne dlicatement et superficiellement aux
deux ples de lorgane avec une aiguille pour permettre la pntration rapide du fixateur. Les rsultats des
observations cliniques et autres peuvent conduire lexamen de tissus supplmentaires. En outre, il y a lieu de
conserver tout organe qui pourrait tre considr comme un organe cible possible, eu gard aux proprits
connues de la substance dessai.
19.3.2014
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44. Les tissus suivants peuvent apporter des informations utiles sur les effets endocriniens: gonades (ovaires et
testicules), organes gnitaux auxiliaires (utrus et col de lutrus, pididymes, vsicules sminales et glande
coagulante, prostate dorsolatrale et ventrale), vagin, hypophyse, glande mammaire mle, glande thyrodienne
et glande surrnale. Les changements survenant dans les glandes mammaires mles nont pas encore t
insuffisamment documents, mais ce paramtre peut savrer trs sensible aux substances action strognique.
Lobservation des organes/tissus non cits au paragraphe 43 est facultative (voir appendice 2).
45. Le document dorientation sur lhistopathologie (19) fournit des informations supplmentaires sur la dissection,
la fixation, le prlvement et lhistopathologie des tissus endocriniens.
46. Au cours du programme dessais international, des lments de preuve ont t apports montrant que des effets
subtils sur le systme endocrinien de substances chimiques susceptibles de faiblement dsquilibrer lhomostasie
des hormones sexuelles peuvent tre identifis par leur capacit perturber la synchronisation du cycle stral
dans diffrents tissus plutt que par une nette altration histopathologique des organes sexuels femelles. Bien
quaucune preuve dfinitive nait t apporte sur ces effets, il est recommand que les preuves dune asynchronie
possible du cycle oestral soient prises en compte dans linterprtation de lexamen histopathlogique des ovaires
(cellules folliculaires, thcales et de la granulosa), de lutrus, du col de lutrus et du vagin. Si elle est value
(facultatif), la priode du cycle dtermine par les frottis vaginaux peut galement tre incluse dans cette
comparaison
Histopathologie
47. Un examen histopathologique complet doit tre pratiqu sur les tissus et organes conservs de tous les animaux
appartenant au groupe tmoin et au groupe trait la dose la plus leve. Ces examens devront tre tendus aux
animaux de tous les autres groupes de dosage ds lors quon observe des modifications lies au traitement dans
le groupe trait la dose la plus leve.
48. Toutes les lsions macroscopiques seront examines.
49. Si un groupe satellite est inclus, les tissus et organes sur lesquels des effets ont t observs dans les groupes
traits doivent faire lobjet dun examen histopathologique.
RSULTATS ET RAPPORT
Rsultats
50. Il faut prsenter les rsultats correspondant chaque animal. En outre, toutes les donnes doivent tre rsums
sous forme de tableaux faisant apparatre, pour chaque groupe dessai, le nombre danimaux au dbut de lessai,
le nombre danimaux trouvs morts au cours de lessai ou euthanasis, le moment de la mort ou de leuthanasie,
le nombre danimaux prsentant des signes de toxicit, et une description des ces signes, notamment le moment
de leur apparition, leur dure et leur gravit, le nombre danimaux prsentant des lsions, les types de lsions,
leur gravit et le pourcentage danimaux affect par chaque type de lsion.
51. Dans la mesure du possible, les rsultats numriques devraient tre valus par une mthode statistique appro
prie et largement reconnue. La comparaison des effets au sein dune mme fourchette de dosage devrait viter
davoir recourir des tests de t multiples. Les mthodes statistiques devront tre slectionnes au stade de la
conception de ltude.
52. des fins de contrle de la qualit, il est suggr de recueillir des donnes de contrle historiques et de calculer
les coefficients de variation pour les donnes numriques, en particulier pour les paramtres lis la dtection
des perturbateurs endocriniens. Ces donnes peuvent tre utilises des fins comparatives lorsque des tudes
relles sont values.
Rapport dessai
53. Le rapport dessai doit inclure les informations suivantes:
Substance dessai:
tat physique, puret et proprits physico-chimiques,
donnes permettant lidentification chimique.
Vhicule, le cas chant:
justification du choix du vhicule, sil est autre que leau.
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Animaux dessai:
espce/souche utilise,
source, conditions dencagement, rgime alimentaire, etc.,
poids de chaque animal au dbut de lessai,
justification du choix de lespce sil ne sagit pas de rat.
Conditions dessai:
justification du choix des doses,
description dtaille de la prparation de la substance tester et/ou de son incorporation dans la nourriture,
la concentration obtenue, la stabilit et lhomognit de la prparation,
dtails relatifs ladministration de la substance dessai,
conversion de la concentration de la substance dessai dans la nourriture ou leau de boisson (en ppm) en
dose relle (mg/kg de poids corporel/jour), sil y a lieu,
dtails concernant la qualit de la nourriture et de leau.
Paramtres optionnels tudis:
liste des paramtres facultatifs tudis.
Rsultats:
poids corporel/variation du poids corporel,
consommation de nourriture et deau, le cas chant,
donnes sur la rponse toxique par sexe et par dose et description des symptmes de toxicit,
nature, gravit et dure des observations cliniques (rversibles ou non),
valuations de lactivit sensorielle, de la force de prhension et de lactivit motrice,
analyses de sang et valeurs normales de rfrence,
analyses de biochimie clinique et valeurs normales de rfrence,
poids corporel lors de leuthanasie et poids des organes,
rsultats dautopsie,
description dtaille de tous les rsultats des examens histopathologiques,
donnes relatives labsorption, si elles sont disponibles,
traitement statistique des rsultats, sil y a lieu.
Discussion des rsultats
Conclusions
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Appendice 1
DFINITIONS
Activit antiandrognique: capacit dun produit chimique supprimer laction dune hormone andrognique naturelle
(par exemple la testostrone) chez un mammifre.
Activit antistrognique: capacit dun produit chimique supprimer laction dune hormone strognique naturelle
(par exemple lstradiol 17) chez un mammifre.
Activit antithyrodienne: capacit dun produit chimique supprimer laction dune hormone thyrodienne naturelle
(par exemple la T3) chez un mammifre.
Activit thyrodienne: capacit dun produit chimique agir comme une hormone thyrodienne naturelle (par exemple
la T3) chez un mammifre.
Andrognicit: capacit dun produit chimique agir comme une hormone andrognique naturelle (par exemple la
testostrone) chez un mammifre.
CSENO: sigle pour concentration (maximale) sans effet nocif observ, cest--dire la dose la plus leve laquelle aucun
effet nocif li au traitement nest observ.
Dosage: terme gnral recouvrant la dose, sa frquence et la dure de ladministration
Dose: quantit de substance dessai administre. La dose est exprime en poids de substance dessai par unit de poids de
lanimal dexprience par jour (par exemple en mg/kg de poids corporel/jour), ou en concentration constante dans la
nourriture.
strognicit: capacit dun produit chimique agir comme une hormone strognique naturelle (par exemple ls
tradiol 17) chez un mammifre.
Toxicit manifeste: terme gnral dsignant des signes vidents de toxicit qui surviennent la suite de ladministration
dune substance dessai. Ces signes doivent tre suffisants pour permettre lvaluation des dangers et doivent tre tels quon
puisse sattendre ce quune augmentation de la dose administre entrane lapparition de signes de toxicit grave et
probablement la mort.
Validation: processus scientifique destin caractriser les impratifs oprationnels et les limites dune mthode dessai et
dmontrer sa fiabilit et sa pertinence pour un objectif particulier.
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Appendice 2
Paramtres recommands dans la mthode dessai B.7 pour la dtection des perturbateurs endocriniens
Paramtres obligatoires
Paramtres facultatifs
Poids
Testicules
Ovaires
pididymes
Utrus, y compris col de lutrus
Glandes surrnales
Thyrode
Prostate + vsicules sminales et glandes coagulantes

Histopathologie
Gonades:
Frottis vaginaux
Testicules et
Glandes mammaires mles
Ovaires
Hypophyse
Organes sexuels auxiliaires:

pididymes,
Prostate + vsicules sminales et glandes coagulantes
Utrus, y compris col de lutrus
Glandes surrnales
Thyrode
Vagin
Dosages hormonaux
Niveaux circulants de T3 et de T4
Niveaux circulants de TSH
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19.3.2014
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B.8. TOXICIT SUBAIGU PAR INHALATION: TUDE SUR 28 JOURS
RSUM
La prsente mthode dessai B.8 rvise a t conue afin de caractriser pleinement la toxicit par inhalation de la
substance dessai, la suite dune exposition rpte sur une priode de temps limite (28 jours), et de fournir des
donnes pour les estimations quantitatives des risques lis linhalation. Des groupes de rongeurs, composs dau
minimum 5 mles et 5 femelles, sont exposs 6 heures par jour, pendant 28 jours: a) la substance dessai trois
niveaux de concentration ou plus, b) de lair filtr (tmoin ngatif), et/ou c) au vhicule (groupe tmoin du
vhicule). Les animaux sont exposs en gnral 5 jours par semaine, mais il est aussi permis de les exposer 7
jours par semaine. Des mles et des femelles sont toujours utiliss, mais peuvent tre exposs des niveaux de
concentration diffrents si lun des sexes est connu pour tre plus sensible une substance dessai donne. Afin de
mieux caractriser la toxicit de la substance dessai, la prsente mthode dessai laisse la possibilit au directeur de
ltude dinclure des groupes satellites (rversibilit), des lavages broncho-alvolaires (LBA), des tests neurologiques et
des valuations histopathologiques ou de pathologie clinique supplmentaires.
INTRODUCTION
1.
La prsente mthode dessai est quivalente la ligne directrice 412 (2009) de lOCDE pour les essais de
produits chimiques. Le texte original de la ligne directrice 412 sur la toxicit subaigu par inhalation avait t
adopt en 1981 (1). La prsente mthode dessai B.8 (quivalente la ligne directrice 412) a t rvise pour
prendre en compte ltat de la science et rpondre aux exigences rglementaires actuelles et futures.
2.
La prsente mthode permet de caractriser les effets nocifs rsultant dune exposition quotidienne rpte, par
inhalation, une substance dessai pendant 28 jours. Les donnes issues dune tude sur la toxicit subaigu par
inhalation sur 28 jours peuvent tre utilises pour des estimations quantitatives de risques (si ltude nest pas
suivie dun essai de toxicit subchronique par inhalation sur une priode de 90 jours, voir chapitre B.29 de la
prsente annexe). Ces donnes peuvent galement fournir des informations permettant la dtermination des
concentrations pour des tudes plus long terme comme lessai de toxicit subchronique par inhalation sur une
priode de 90 jours. La prsente mthode dessai nest pas spcifiquement destine tester les nanomatriaux. Le
document dorientation no 39 (2) regroupe les dfinitions utilises dans le contexte de cette mthode dessai.
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FR
L 81/44
3.
Avant toute tude, le laboratoire dessai devra prendre en compte toutes les informations disponibles sur la
substance dessai afin damliorer la qualit de ltude et de recourir le moins possible aux animaux. Parmi les
informations utiles pour la dtermination des concentrations dessai appropries, citons: lidentit, la structure
chimique et les proprits physico-chimiques de la substance dessai; les rsultats de tous les essais de toxicit in
vitro ou in vivo auxquels elle a t soumise; son (ses) utilisation(s) escompte(s) et les risques dexposition
humaine; les donnes (Q)SAR disponibles et les donnes toxicologiques sur les substances structurellement
apparentes; ainsi que les donnes issues des essais de toxicit aigu par inhalation. En cas de neurotoxicit,
connue ou observe au cours de ltude, le directeur de ltude pourra dcider dinclure les valuations juges
ncessaires, comme une batterie dobservations fonctionnelles (FOB) et des mesures de lactivit motrice. Bien
que la dure des expositions par rapport des examens spcifiques puisse tre critique, lexcution de ces
activits supplmentaires ninterfre pas avec la conception de ltude principale.
4.
Les dilutions de substances corrosives ou irritantes peuvent tre testes des concentrations qui permettront
datteindre le degr de toxicit dsir, voir document dorientation 39 (2). Lors de lexposition des animaux ces
substances, les concentrations cibles sont assez faibles pour ne causer ni souffrance manifeste ni dtresse, mais
suffisantes pour prolonger la courbe concentration-rponse jusqu des niveaux correspondant lobjectif
scientifique et rglementaire de lessai. Le choix de ces concentrations est fait au cas par cas, de prfrence
sur la base dune tude prliminaire de dtermination des concentrations, conue de faon approprie, et qui
fournit des informations sur leffet critique mesur, un ventuel seuil dirritation et le moment de son apparition
(voir paragraphes 11-13). La justification du choix des concentrations est fournie.
5.
sont euthanasis. Les animaux moribonds sont pris en compte au mme titre que ceux qui succombent au cours
de lessai. Le document dorientation de lOCDE sur les effets mesurs thiquement acceptables (3) dtaille les
critres orientant la dcision deuthanasier les animaux moribonds ou en grande souffrance, et aide reconnatre
une mort prvisible ou imminente.
Slection des espces animales
6.
Le choix sorientera vers de jeunes rongeurs adultes en bonne sant, de souches communment utilises en
laboratoire. Le rat tant lespce la plus utilise, il faudra justifier lemploi dautres espces.
7.
Les femelles sont nullipares et non gravides. Le jour de la randomisation, les animaux slectionns sont de
jeunes adultes gs de 7 9 semaines. Leur poids corporel ne devra pas excder 20 % du poids moyen pour
chaque sexe. Slectionns au hasard, les animaux seront marqus pour tre identifis individuellement. En vue de
leur acclimatation aux conditions de laboratoire, ils seront conservs dans leur cage pour une priode dau
minimum 5 jours avant le dbut de lessai.
8.
Les animaux sont identifis de faon individuelle, de prfrence laide de dispositifs sous-cutans, afin de
faciliter leur observation et dviter toute confusion. La temprature du local exprimental o les animaux sont
conservs est maintenue 22 3 C. Le taux dhumidit relative est idalement maintenu entre 30 et 70 %,
encore quil ne soit pas toujours possible de le faire si leau est utilise comme vhicule. Avant et aprs
exposition, les animaux sont gnralement mis en cage en groupes par sexe et par concentration, mais le
nombre danimaux par cage ne fait pas obstacle une observation prcise de chaque animal, et nengendrer
quun minimum de pertes dues au cannibalisme et aux combats. Si les animaux sont exposs nez seul, il peut
tre ncessaire de les acclimater aux tubes de contention. Ceux-ci ne provoquent pas chez les animaux de stress
excessif, quil soit de nature physique, thermique ou d leur immobilisation. Les contraintes quils subissent
peuvent en effet modifier les paramtres physiologiques mesurs de lanimal, comme sa temprature corporelle
(hyperthermie) et/ou son volume respiratoire par minute. Si lon dispose de donnes gnriques montrant que
de telles modifications ne se produisent pas de faon apprciable, alors la priode dadaptation pralable aux
tubes de contention nest pas ncessaire. Les animaux exposs corps entier un arosol sont enferms
individuellement pendant lexposition pour les empcher de filtrer larosol dessai grce la fourrure de
leurs congnres. lexception des priodes dexposition, le rgime alimentaire des animaux est le rgime
classique et certifi de laboratoire, avec eau potable satit. Lclairage est artificiel, la squence dclairage
tant de 12 heures de clart et 12 heures dobscurit.
Chambres dinhalation
9.
Le choix de la chambre dinhalation prend en compte la nature de la substance dessai et lobjet de lessai. Le
prfrable pour les besoins spcifiques de ltude, mais cela est justifi dans le rapport de ltude. Pour assurer la
stabilit de latmosphre dune chambre dexposition corps entier, on veillera ce que le volume total des
spcifiques.
19.3.2014
19.3.2014
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TUDES DE TOXICIT
Concentrations limites
10. Contrairement aux tudes de toxicit aigu, aucune concentration limite nest dfinie pour les tudes de toxicit
subaigu par inhalation sur 28 jours. La concentration maximale teste prend en compte: 1) la concentration
maximale pouvant tre atteinte, 2) le niveau dexposition humaine correspondant au pire des cas, 3) la
ncessit de maintenir une alimentation adquate en oxygne, et/ou 4) le bien-tre des animaux. En labsence
de limites fondes sur des donnes, les valeurs limites pour la toxicit aigu du rglement (CE) no 1272/2008
(13) peuvent tre utilises (cest--dire jusqu une concentration maximale de 5 mg/l pour les arosols, 20 mg/l
pour les vapeurs et 20 000 ppm pour les gaz); voir document dorientation 39 (2). Sil est ncessaire de dpasser
ces limites lors dessais de gaz ou de substances dessai hautement volatiles (comme les rfrigrants), une
justification est produite. La concentration limite permet dobtenir une toxicit sans quivoque, sans causer
de stress excessif chez les animaux ni affecter leur longvit (3).
tude prliminaire de dtermination des concentrations
11. Avant le dbut de ltude principale, une tude prliminaire de dtermination des concentrations peut savrer
ncessaire. Plus complte quune tude dobservation, elle nest pas limite au choix des concentrations. Les
connaissances acquises grce une tude prliminaire de dtermination des concentrations peuvent conduire
la russite de ltude principale. En effet, une telle tude peut fournir des informations techniques sur les
mthodes danalyse, la taille des particules, la dcouverte de mcanismes de toxicit, les donnes histopatholo
giques et de pathologie clinique, et les estimations de la concentration sans effet nocif observ (CSENO) et de la
concentration maximale acceptable (CMA) dans une tude principale. Le directeur dtude peut dcider de
sappuyer sur une tude prliminaire de dtermination des concentrations pour identifier: le seuil dirritation
de lappareil respiratoire (par exemple avec une histopathologie de lappareil respiratoire, des tests de la fonction
pulmonaire ou des lavages bronchoalvolaires), la concentration la plus leve tolre par les animaux sans
provoquer de stress excessif, et les paramtres qui permettront de caractriser au mieux la toxicit de la
substance dessai.
12. Une tude prliminaire de dtermination des concentrations peut comporter un ou plusieurs niveaux de
concentration. Pour chaque niveau de concentration, on exposera au maximum trois mles et trois femelles.
La dure dune tude prliminaire de dtermination des concentrations est dau minimum 5 jours et ne pas
excder 14 jours en gnral. Il convient dexposer dans le rapport dtude les raisons du choix des concen
trations retenues pour ltude principale, dont lobjet est de dmontrer une relation concentration-rponse base
sur leffet mesur le plus sensible auquel on sattend. La concentration la plus faible nengendre en principe
aucune manifestation de toxicit, tandis que la concentration la plus leve permet dobtenir une toxicit sans
quivoque, sans causer de stress excessif chez les animaux ni affecter leur longvit (3).
13. Lors du choix des niveaux de concentration pour ltude prliminaire de dtermination des concentrations,
toutes les informations disponibles sont prises en compte, y compris les relations structure-activit et les
donnes correspondant des produits chimiques analogues (voir paragraphe 3). Une tude prliminaire de
dtermination des concentrations peut confirmer ou rfuter le choix des effets mesurs les plus sensibles selon
des critres mcanistiques, comme linhibition de la cholinestrase par des composs organophosphors, la
formation de mthmoglobine par des agents cytotoxiques disomrie rythro, les hormones thyrodiennes
(T3, T4) dans le cas de thyrotoxiques, les protines, la LDH, ou les neutrophiles dans les lavages bronchoal
volaires dans le cas de particules inoffensives faiblement solubles ou darosols irritants pour les poumons.
tude principale
14. Ltude principale de toxicit subaigu comporte en gnral trois niveaux de concentration ainsi quun tmoin
ngatif (air) et/ou un tmoin du vhicule, sil y a lieu (voir paragraphe 17). Lensemble des informations
disponibles doit permettre de dterminer les niveaux dexposition appropris, y compris les rsultats des
tudes systmiques de toxicit, le mtabolisme et la cintique (on prendra garde dviter les niveaux de concen
tration leve avec des processus cintiques de saturation). Chaque groupe dessai comprend au moins 10
rongeurs (5 mles et 5 femelles) exposs la substance dessai 6 heures par jour, 5 jours par semaine
pendant 4 semaines (soit une dure totale de ltude de 28 jours). Les animaux peuvent aussi tre exposs 7
jours par semaine (par exemple dans le cas dessais sur des produits pharmaceutiques inhals). Sil est connu
quun des sexes est plus ractif la substance dessai, les niveaux de concentration peuvent diffrer selon le sexe
afin doptimiser la concentration-rponse telle que dcrite au paragraphe 15. Si des espces de rongeurs autres
que le rat sont exposes nez seul, il est possible dajuster la dure maximale dexposition en fonction du stress
propre ces espces. Lorsque la dure dexposition est infrieure 6 heures par jour ou quil est ncessaire de
mener une tude dexposition corps entier de longue dure (par exemple de 22 heures par jour), des
justifications sont fournies, voir document dorientation 39 (2). Les animaux sont privs de nourriture
pendant lexposition sauf si sa dure dpasse 6 heures. Dans une exposition corps entier, les animaux
peuvent boire de leau.
15. Les concentrations cibles choisies permettent didentifier le(s) organe(s) cible(s) et de mettre en vidence une
concentration-rponse claire:
le niveau de concentration lev produit des effets toxiques sans engendrer de signes persistants ou la mort,
ce qui empcherait une valuation valable des rsultats,
le(s) niveau(x) de concentration intermdiaire(s) doi(ven)t tre espac(s) de manire produire une gradation
dans les effets toxiques observs avec une concentration faible et avec une concentration leve,
le niveau de concentration faible ne produit quasiment aucune manifestation de toxicit.
L 81/45
L 81/46
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tude satellite (tude de rversibilit)

16. Une tude de rversibilit peut tre utilise pour mettre en vidence le caractre rversible, persistant ou retard
de la toxicit, pour une priode post-traitement dune dure approprie dau minimum 14 jours. Les groupes
satellites sont constitus de cinq mles et de cinq femelles exposs en mme temps que les animaux dexprience
de ltude principale. Ils sont exposs la concentration la plus leve de la substance dessai. Il convient
galement de faire appel un tmoin concurrent (air) et, le cas chant, un tmoin du vhicule (voir
paragraphe 17).
Animaux tmoins
17. Les animaux du groupe tmoin ngatif (air) sont traits dune manire identique ceux du groupe danimaux
dessai, mais au lieu de la substance dessai, ils sont exposs de lair filtr. Lorsque de leau ou une autre
substance est utilise pour produire latmosphre dessai, un groupe tmoin du vhicule est inclus dans ltude,
la place du groupe tmoin ngatif expos lair seulement. Autant que possible, leau est le vhicule utilis. Dans
ce cas, les animaux tmoins sont exposs un air dont le taux dhumidit relative est le mme que pour les
groupes exposs la substance dessai. Le choix du vhicule sopre sur la base dune tude prliminaire
approprie ou de donnes historiques. Si la toxicit dun vhicule est mal connue, le directeur de ltude
peut choisir dutiliser un tmoin ngatif (air) et un tmoin du vhicule, mais cela est toutefois fortement
dconseill. Si les donnes historiques montrent quun vhicule nest pas toxique, le groupe tmoin lair
nest pas ncessaire et seul un tmoin du vhicule est utilis. Si aucune toxicit na t dtecte lors de
ltude prliminaire dune substance dessai prpare dans un vhicule, ce vhicule est considr comme non
toxique la concentration teste et ce vhicule tmoin est utilis.
18. Les animaux sont exposs la substance dessai prsent sous forme de gaz, de vapeur, darosol ou dun
mlange des deux. Ltat physique tester dpend des proprits physico-chimiques de la substance, de la
concentration choisie, et/ou de la forme physique sous laquelle il est le plus probable quelle se prsente lors de
sa manipulation et de son utilisation. Les substances dessai chimiquement ractives ou hygroscopiques sont
testes sous air sec. On prendra soin dviter les concentrations susceptibles de provoquer une explosion. Les
substances particulaires peuvent tre soumises des procds mcaniques afin de rduire la taille des particules.
Pour plus dinformations, se reporter au document dorientation 39 (2).
19. Une mesure de la taille des particules est ralise pour tous les arosols et les vapeurs susceptibles se condenser
pour former des arosols. Pour que toutes les rgions pertinentes de lappareil respiratoire soient exposes, il est
recommand dutiliser (4) des arosols dont le diamtre arodynamique mdian de masse (DAMM) se situe entre
1 et 3 m, avec un cart type gomtrique (g) compris entre 1,5 et 3,0. Un effort raisonnable est fourni pour
remplir ces conditions, mais si tel nest pas le cas, un jugement dexpert est ncessaire. Par exemple, les
particules des fumes mtalliques peuvent avoir une taille infrieure cette norme, et les particules charges
ou les fibres une taille suprieure.
20. La substance dessai est idalement teste sans vhicule. Sil est ncessaire davoir recours un vhicule pour
atteindre la concentration et la taille particulaire voulues de la substance dessai, leau est choisie de prfrence.
Chaque fois quune substance dessai est dissoute dans un vhicule, sa stabilit est dmontre.
21. Le dbit dair dans la chambre dexposition est contrl avec soin, surveill en continu et enregistr au moins
toutes les heures pendant chaque exposition. Le suivi en temps rel de la concentration de latmosphre dessai
(ou stabilit temporelle) constitue une mesure complte de tous les paramtres dynamiques et fournit un moyen
indirect de contrler tous les paramtres dinhalation dynamiques pertinents. Si la concentration est suivie en
temps rel, la frquence peut tre ramene une seule mesure du dbit de lair par exposition et par jour. Un
soin particulier est apport viter toute rerespiration dans les chambres dexposition nez seul. La concen
tration doxygne est dau moins 19 % et celle de dioxyde de carbone ne dpasser pas 1 %. Si ces conditions ne
peuvent tre respectes, les concentrations doxygne et de dioxyde de carbone sont mesures. Si les mesures du
premier jour dexposition montrent que la concentration de ces gaz est approprie, aucune mesure compl
mentaire ne devrait tre ncessaire.
corps entier, lhumidit relative dans la zone o respire lanimal est autant que possible surveille en continu et
enregistre toutes les heures pendant chaque exposition. Lhumidit relative est de prfrence comprise entre 30
et 70 %. Il est possible que ce taux ne puisse tre atteint (par exemple lorsque la substance dessai se prsente
sous forme de solution aqueuse), ou quil ne puisse tre mesur en raison dinterfrences de la substance dessai
avec la mthode dessai.
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production.
24. La concentration relle est la concentration de la substance dessai prleve dans la zone de la chambre
dinhalation o les animaux respirent. Les concentrations relles peuvent tre obtenues par des mthodes
spcifiques (par exemple, chantillonnage direct, mthodes dadsorption ou de raction chimique, et caractri
sation analytique ultrieure) ou par des mthodes non spcifiques comme la gravimtrie sur filtre. Le recours
lanalyse gravimtrique nest acceptable que pour des arosols ne contenant quun seul composant en poudre ou
pour des arosols de liquides peu volatils, et des caractrisations spcifiques la substance dessai sont galement
effectues par une pr-tude approprie. Il est aussi possible davoir recours la gravimtrie pour dterminer la
concentration dun arosol contenant plusieurs composants en poudre, mais des donnes analytiques sont alors
ncessaires, afin de dmontrer que la composition du produit en suspension dans lair est analogue celle du
produit de dpart. Faute de cette information, il peut savrer ncessaire de soumettre le produit tester
(idalement en suspension dans lair) une nouvelle analyse intervalles rguliers tout au long de ltude.
Pour des agents arosoliss susceptibles de svaporer ou de se sublimer, il faut dmontrer que toutes les phases
ont t recueillies selon la mthode choisie.
25. Pendant toute la dure de ltude, il est recommand de nemployer si possible quun seul lot de la substance
dessai, et lchantillon de la substance est conserv dans des conditions prservant sa puret, son homognit
et sa stabilit. Avant le dbut de ltude, il conviendrait de raliser une caractrisation de la substance dessai afin
de dterminer sa puret et, si cela est techniquement possible, son identit et les quantits de contaminants et
dimpurets identifis. Pour cela, on pourra recueillir les donnes suivantes: temps de rtention et surface relative
du pic, poids molculaire obtenu par spectroscopie de masse ou chromatographie en phase gazeuse, ou autres
estimations. Bien que le laboratoire dessai ne soit pas responsable de lidentification de la substance dessai, il
peut, par prudence, confirmer au moins une partie des caractristiques fournies par le donneur dordre (couleur,
nature physique, etc.).
26. Latmosphre dexposition est maintenue constante autant que possible. Un dispositif de suivi en temps rel, tel
quun photomtre arosol pour les arosols ou un analyseur dhydrocarbures totaux pour les vapeurs, peut
tre utilis pour dmontrer la stabilit des conditions dexposition. La concentration relle dans la chambre est
mesure au moins 3 fois chaque jour dexposition et pour chaque niveau dexposition. En cas dimpossibilit en
raison de dbits dair limits ou de faibles concentrations, lutilisation dun chantillon par priode dexposition
est accepte. En principe, cet chantillon est alors recueilli pendant la totalit de la priode dexposition. Les
carts entre la concentration dans chaque chambre et la concentration moyenne nexcdent pas 10 % pour les
gaz et vapeurs et 20 % pour les arosols liquides ou solides. Il convient de calculer et de noter le temps
dquilibre dans la chambre dexposition (t95). La dure dune exposition couvre le temps de production de la
substance dessai, y compris le temps ncessaire pour lgalisation des concentrations dans la chambre dexpo
sition (t95) et leur dclin. Des indications pour lestimation de t95 sont fournies dans le document dorientation
39 (2).
27. Pour des systmes trs complexes constitus de gaz ou de vapeurs et darosols (atmosphres de combustion et
comporter diffremment dans la chambre dinhalation. Pour chacune des phases (gaz ou vapeur et arosol), on
choisira donc au moins une substance indicatrice (analyte), en gnral la principale substance active du mlange.
Quand la substance dessai est un mlange, la concentration analytique devra tre indique pour le mlange
global et pas uniquement pour le principe actif ou la substance indicatrice (analyte). Pour plus dinformations
sur les concentrations relles, se reporter au document dorientation 39 (2).
28. La rpartition granulomtrique des arosols est dtermine au minimum chaque semaine pour chaque niveau de
concentration, laide dun impacteur en cascade ou dun autre instrument, comme un spectromtre de mesure
de la taille des particules arodynamiques (APS). Si les rsultats obtenus avec limpacteur en cascade et lautre
instrument se rvlent quivalents, ce dernier peut tre utilis tout au long de ltude.
29. Pour confirmer la capacit de recueil des particules de loutil principal, un second instrument devra tre utilis
en parallle, par exemple un filtre gravimtrique ou un barboteur gaz/impacteur. La concentration massique
obtenue par lanalyse granulomtrique se rapproche, dans des limites raisonnables, de celle obtenue par lanalyse
sur filtre, voir document dorientation 39 (2). Si pour toutes les concentrations testes, cette quivalence est
tablie au dbut de la phase dtude, il nest pas ncessaire deffectuer des mesures de confirmation dans la suite
de ltude. Pour le bien-tre des animaux, il convient de rduire au minimum les donnes douteuses qui
ncessiteraient de rpter lessai.
30. Une rpartition granulomtrique est effectue dans le cas des vapeurs, sil est possible quune condensation de la
vapeur conduise la formation dun arosol, ou si des particules sont dtectes dans une atmosphre de vapeur
susceptible de prsenter des phases mixtes.
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OBSERVATIONS
31. Un examen clinique attentif des animaux est pratiqu avant, pendant, et aprs la priode dexposition. Des
observations plus frquentes peuvent tre ralises en fonction de la rponse des animaux pendant lexposition.
Lorsque lobservation des animaux savre difficile en raison des tubes de contention, du mauvais clairage des
chambres dexposition corps entier ou datmosphres opaques, les animaux seront observs attentivement
aprs lexposition. Les observations effectues avant lexposition du lendemain peuvent permettre destimer
une ventuelle rversibilit ou exacerbation des effets toxiques.
32. Toutes les observations sont enregistres individuellement pour chaque animal. Quand des animaux sont
retrouvs morts ou sont euthanasis, lheure de la mort est consigne le plus prcisment possible.
muqueuses, de lappareil respiratoire, du systme circulatoire, du systme nerveux, ainsi que de lactivit soma
tomotrice et du comportement. Les tremblements, les convulsions, la salivation, les diarrhes, la lthargie, le
sommeil et le coma retiennent lattention. La mesure de la temprature rectale peut aider mettre en vidence
une bradypne rflexe ou une hypo/hyperthermie lie au traitement ou au confinement. Il est possible denrichir
le protocole dtude par des estimations complmentaires telles que: cintique, surveillance biologique, fonction
pulmonaire, rtention de produits peu solubles qui saccumulent dans les tissus pulmonaires et changements
comportementaux.
POIDS CORPOREL
34. Le poids de chacun des animaux est enregistr individuellement: juste avant la premire exposition (jour 0), deux
fois par semaine par la suite (par exemple les vendredis et lundis, afin de mettre en vidence leur rtablissement
aprs un week-end sans exposition, ou dans un dlai permettant lvaluation de la toxicit systmique), et au
moment de leur mort ou de leur euthanasie. Si aucun effet nest observ les 2 premires semaines, le poids
corporel peut ntre mesur quune fois par semaine pendant le reste de ltude. Les animaux du groupe satellite
(tude de rversibilit) sont toujours pess de faon hebdomadaire tout au long de la priode de rcupration.
Au terme de ltude, tous les animaux sont pess juste avant leur sacrifice pour ne pas fausser le calcul des
rapports du poids des organes au poids du corps.
CONSOMMATION DEAU ET DE NOURRITURE
35. La quantit de nourriture consomme est mesure une fois par semaine. La consommation deau peut galement
ltre.
PATHOLOGIE CLINIQUE
36. Tous les animaux, y compris ceux des groupes tmoins et satellites, quand ils sont sacrifis, subissent des
examens cliniques. Le dlai entre la fin de lexposition et la prise de sang est enregistr, en particulier quand la
reconstitution de leffet vis est rapide. la fin de lexposition, un chantillonnage est recommand pour les
paramtres ayant une courte demi-vie plasmatique (HbCO, ChE et MetHb, par exemple).
37. Le tableau 1 numre les paramtres de pathologie clinique gnralement requis pour toutes les tudes toxi
cologiques. Une analyse durine nest pas ncessaire en rgle gnrale, mais peut tre ralise si on lestime utile
daprs la toxicit probable ou observe. Afin de mieux caractriser la toxicit de la substance dessai, le directeur
de ltude peut faire appel dautres paramtres (cholinestrase, lipides, hormones, quilibre acido-basique,
mthmoglobine ou corps de Heinz, cratine kinase, rapport mylode/rythrode, troponines, gaz du sang,
lactate dshydrognase, sorbitol dshydrognase, glutamate dshydrognase, gamma glutamyl transpeptidase,
etc.).
Tableau 1
Paramtres standards de pathologie clinique
Hmatologie
Nombre drythrocytes
Nombre total de leucocytes
Hmatocrite
Diffrentiel leucocytaire
Concentration dhmoglobine
Nombre de plaquettes sanguines
Teneur corpusculaire moyenne en hmoglobine
Potentiel de coagulation (en choisir un):
Volume corpusculaire moyen
Temps de prothrombine
Concentration corpusculaire moyenne dhmoglobine
Temps de coagulation
Rticulocytes
Temps de thromboplastine partielle
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Chimie clinique
Glucose (*)
Alanine aminotransfrase
Cholestrol total
Aspartate aminotransferase
Triglycrides
Phosphatase alcaline
Azote urique dans le sang
Potassium
Bilirubine totale
Sodium
Cratinine
Calcium
Protines totales
Phosphore
Albumine
Chlore
Globuline
Analyse durines (facultative)
Apparence (couleur et turbidit)
Protines totales
Volume
Glucose
Densit ou osmolarit
Sang/cellules sanguines
pH
(*) Le directeur dtude dcidera si une priode de jene est ncessaire ou non pour les animaux, une longue priode de jene
pouvant conduire des mesures de glucose partiellement errones pour les animaux traits par rapport aux animaux
tmoins. La priode de jene est approprie lespce utilise: pour le rat, elle peut tre de 16 heures environ (jene
pendant sa nuit). La dtermination de la glycmie jeun peut tre effectue aprs la priode de jene de la nuit, pendant la
dernire semaine dexposition, ou aprs la priode de jene de la nuit prcdant lautopsie (avec, dans ce dernier cas, tous les
autres paramtres de pathologie clinique).
38. Quand il est prouv que les voies respiratoires basses (cest--dire les alvoles pulmonaires) sont le principal site
de dpt et de rtention, le lavage broncho-alvolaire (LBA) peut alors tre la technique de choix pour effectuer
une analyse quantitative les paramtres de la relation dose-effet base sur les hypothses, en se concentrant sur
lalvolite, linflammation pulmonaire et la phospholipidose. Ceci permet dtudier convenablement lvolution
de la relation dose-effet et du dcours temporel dune lsion alvolaire. Le fluide du LBA peut tre analys en se
basant sur le nombre total et diffrentiel de leucocytes, les protines totales et la lactate dshydrognase.
Dautres paramtres peuvent galement tre considrs, comme ceux mettant en vidence une lsion lysosomale,
une phospholipidose, une fibrose, une inflammation allergique ou irritante, laquelle peut inclure la dtermina
tion de cytokines ou de chimiokines pro-inflammatoires. Les mesures lies au LBA compltent souvent les
rsultats des examens histopathologiques sans toutefois sy substituer. Des indications sur la manire de raliser
un lavage de poumon sont disponibles dans le document dorientation 39 (2).
MACROPATHOLOGIE ET POIDS DES ORGANES
39. Tous les animaux dexprience, y compris ceux morts au cours de lessai et ceux carts de ltude pour des
raisons de bien-tre animal, subissent une exsanguination complte (si cela est possible) et une autopsie
macroscopique. Il convient denregistrer le dlai entre la fin de la dernire exposition de chaque animal et
leur sacrifice. Lorsquun animal est dcouvert mort et que son autopsie nest pas ralisable immdiatement,
lanimal est rfrigr (mais non congel) une temprature suffisamment basse pour minimiser lautolyse. Les
autopsies sont ralises le plus tt possible, en gnral dans un dlai dun deux jours. Tous les changements
macropathologiques sont enregistrs pour chaque animal en prtant particulirement attention aux voies
respiratoires.
40. Le tableau 2 numre les organes et tissus devant tre conservs dans un milieu appropri lors de lautopsie
macroscopique en vue dun examen histopathologique. La conservation des organes et tissus [entre crochets], et
de tous les autres organes et tissus, est la discrtion du directeur dtude. Les organes indiqus en gras sont
dcoups et pess ltat humide, le plus tt possible aprs la dissection, pour viter leur dessiccation. La
thyrode et les pididymes ne sont pess que si cela est ncessaire car leur dcoupe peut gner lvaluation
histopathologique. Les organes et tissus sont fixs laide de formol tamponn 10 %, ou dun autre fixateur
appropri, ds que lautopsie est effectue, et pas moins de 24 48 heures avant le dcoupage, en fonction du
fixateur utilis.
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Tableau 2
Organes et Tissus Conserver Pendant Lautopsie Macroscopique
[Bulbe olfactif]
Capsules surrnales
Cerveau (y compris les tronons du cortex crbral
et de la moelle/du pont)
Reins
Testicules
Testicules
Thymus
Cur
Thyrode
Estomac
Tissus nasopharyngs [au moins 4 niveaux; 1 niveau

comprenant le conduit du nasopharynx et le tissu
lymphode associ la muqueuse nasale (NALT)]
Foie
Ganglions lymphatiques depuis la rgion hilaire du
poumon, spcialement pour les substances dessai
particulaires peu solubles. Pour des examens plus
approfondis et/ou des tudes but immunologique,
dautres ganglions lymphatiques peuvent tre envisa
gs, comme ceux des rgions mdiastinale, cervicale/
submandibulaire et/ou auriculaire.
Larynx (3 niveaux, dont 1 niveau qui comprend la
base de lpiglotte)
Moelle pinire (niveau cervical, au milieu du thorax
et lombaire)
Trache (au moins 2 niveaux comprenant 1 coupe

longitudinale le long de la carne et 1 coupe transver
sale)
Utrus
Vsicules sminales
[Vessie]
[Yeux (rtine, nerf optique) et paupires]
Toutes lsions macroscopiques
Moelle osseuse (et/ou un aspirat frais)

sophage
Ovaires
Poumons (tous les lobes sur un niveau, y compris
les bronches principales)
Rate
41. Les poumons sont retirs intacts, pess et perfuss avec un fixateur appropri une pression de 20 30 cm
deau pour veiller ce que larchitecture pulmonaire soit prserve (5). Les coupes sont recueillies pour tous les
lobes sur un niveau, comprenant les bronches principales. Si un lavage du poumon est ralis, le lobe qui na
pas t lav est sectionn sur trois niveaux (pas de coupe en srie).
42. Au moins 4 niveaux des tissus nasopharyngs sont examins, dont un devant comporter le conduit du
nasopharynx (5) (6) (7) (8) (9) pour permettre un examen adquat de lpithlium squameux, transitionnel
(respiratoire non-cili), respiratoire (respiratoire cili) et olfactif, ainsi que du tissu lymphatique (NALT) (10) (11).
Trois niveaux du larynx sont examins, dont un comprenant la base de lpiglotte (12). Au moins deux niveaux
de la trache sont examins, y compris une coupe longitudinale le long de la carne de la bifurcation des
bronches extrapulmonaires et une coupe transversale.
HISTOPATHOLOGIE
43. Une valuation histopathologique de tous les organes et tissus du tableau 2 est ralise pour les animaux des
groupes tmoins et des groupes exposs une concentration leve de la substance dessai, ainsi que pour les
animaux qui meurent ou sont sacrifis au cours de ltude. On portera une attention particulire aux voies
respiratoires, aux organes cibles et aux lsions macroscopiques. Les organes et tissus prsentant des lsions dans
le groupe expos une concentration leve sont examins pour tous les groupes. Le directeur de ltude peut
choisir de raliser des valuations histopathologiques pour dautres groupes afin de mettre en vidence une
relation concentration-rponse claire. Lorsquun groupe satellite (tude de rversibilit) est utilis, il y a lieu
deffectuer un examen histopathologique pour tous les tissus et organes ayant laiss apparatre des effets dans les
groupes traits. Lorsquun trop grand nombre de morts prcoces ou dautres problmes survenant dans le
groupe expos une concentration leve compromettent la porte des rsultats, le groupe expos la
concentration immdiatement infrieure subit un examen histopathologique. On tentera de corrler les obser
vations macroscopiques et les constatations au niveau microscopique.
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RSULTATS ET RAPPORT
Rsultats
44. Pour chacun des animaux, les donnes suivantes sont fournies: poids corporel, consommation de nourriture,
pathologie clinique, pathologie macroscopique, poids des organes et histopathologie. Les rsultats des observa
tions cliniques sont rsums sous la forme de tableaux et indiquent pour chaque groupe dessai: le nombre
danimaux utiliss, le nombre danimaux prsentant des signes spcifiques de toxicit, le nombre danimaux
retrouvs morts au cours de lessai ou euthanasis, lheure de la mort de chacun des animaux, la description et
lvolution dans le temps des effets toxiques ainsi que leur rversibilit, et les conclusions de lautopsie. Tous les
rsultats, quantitatifs et fortuits, sont valus laide dune mthode statistique approprie. Toute mthode
statistique gnralement reconnue peut tre utilise; il y a lieu de slectionner les mthodes statistiques au
stade de la conception de ltude.
Rapport dessai
45. Le rapport dessai contient les renseignements suivants:
Animaux dexprience et conditions dlevage
Description des conditions dencagement, y compris: nombre (ou volution du nombre) danimaux par cage,
alimentaire.
Espces/souches utilises et justification ventuelle de lutilisation dune espce autre que le rat. Des donnes
sources et historiques peuvent tre fournies si elles proviennent danimaux exposs des conditions dex
position, dencagement et de jene similaires.
Nombre, ge et sexe des animaux.
Mthode de randomisation.
Description dun ventuel conditionnement pralable lessai, tel que rgime alimentaire, quarantaine ou
Substance dessai
Nature physique, puret et, sil y a lieu, proprits physico-chimiques (y compris isomrisation).
Donnes didentification et numro CAS (Chemical Abstract Services) sil est connu.
Vhicule
Justification de lemploi dun vhicule et justification de son choix (sil ne sagit pas de leau).
Donnes historiques ou concordantes dmontrant que le vhicule ninterfre pas avec les rsultats de ltude.
Chambre dinhalation
Description dtaille de la chambre dinhalation, y compris son volume et son schma.
Source et description de lquipement utilis pour lexposition des animaux et pour la production de
latmosphre.
quipement utilis pour mesurer la temprature, lhumidit, la granulomtrie et la concentration relle.
Source dair et systme de climatisation utilis.
Mthodes utilises pour talonner lquipement afin dassurer lhomognit de latmosphre dessai.
Diffrence de pression (positive ou ngative).
Orifices dexposition par chambre (nez seul) ou emplacement des animaux dans la chambre (corps
entier).
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Stabilit de latmosphre dessai.

Situation des capteurs thermiques et hygromtriques et chantillonnage de latmosphre dessai dans la
chambre dexposition.
Traitement de lair fourni/vacu.
Dbits dair, dbit dair/orifice dexposition (nez seul) ou rapport du volume de lanimal la chambre
(corps entier).
Temps ncessaire pour atteindre lquilibre dans la chambre dexposition (t95).
Nombre de changements de volume par heure.
Doseurs (sil y en a).
Donnes concernant lexposition
Justification du choix de la concentration cible dans ltude principale.
Concentrations nominales (masse totale de substance dessai produite dans la chambre dinhalation, divise
par le volume dair traversant la chambre).
Concentrations relles de la substance dessai obtenues dans la zone o respirent les animaux; pour les
mlanges dessai produisant des formes physiques htrognes (gaz, vapeurs, arosols), chacun des consti
tuants peut tre analys sparment.
Toutes les concentrations dair sont rapportes en units de masse (mg/l, mg/m3, etc.) plutt quen units de
volume (ppm, ppb, etc.).
Rpartition granulomtrique des particules, diamtre arodynamique mdian de masse (DAMM) et cart type
consignes.
Dtails sur la prparation de la substance dessai, y compris sur les procdures utilises pour rduire la taille
des particules des solides ou pour prparer les solutions de la substance dessai.
Description (si possible avec schma) de lquipement utilis pour produire latmosphre dessai et pour
exposer les animaux celle-ci.
Dtails sur lquipement utilis pour contrler la temprature et le taux dhumidit de la chambre ainsi que le
dbit dair dans chambre (ralisation dune courbe dtalonnage).
Dtails sur lquipement utilis pour recueillir les chantillons servant dterminer les concentrations dans la
chambre et la rpartition granulomtrique.
Dtails sur la mthode de chimie analytique utilise et la mthode de validation (notamment rendement de
rcupration de la substance dessai partir du milieu dchantillonnage).
Mthode de randomisation utilise pour lassignation des animaux aux groupes dessai et aux groupes
tmoins.
Dtails sur la qualit de la nourriture et de leau (notamment origine/type de rgime alimentaire, origine de
leau).
Justification du choix des concentrations dessai.
Rsultats
Tableau prsentant la temprature, le taux dhumidit et le dbit dair dans la chambre dinhalation.
Tableau de donnes sur les concentrations nominales et relles dans la chambre dinhalation.
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Tableau de donnes sur la taille des particules, notamment donnes analytiques sur le prlvement dchan
tillons, la rpartition granulomtrique et les calculs du DAMM et de g.
Tableau de donnes sur les rponses et le niveau de concentration pour chaque animal (pour les animaux
montrant des signes de toxicit, notamment mortalit, nature, svrit, moment dapparition et dure des
effets).
Tableau du poids de chacun des animaux.
Tableau de la consommation de nourriture.
Tableau des rsultats de pathologie clinique.
Rsultats de lautopsie et observations histopathologiques pour chaque animal, sils sont disponibles.
Tableau de tous les autres paramtres mesurs.
Discussion et interprtation des rsultats
Un effort particulier est consacr la description des mthodes utilises pour rpondre aux critres de la
prsente mthode dessai, par exemple en ce qui concerne la concentration limite ou la taille des particules.
La respirabilit des particules est aborde la lumire des rsultats densemble, en particulier si les critres de
taille des particules nont pu tre remplis.
La cohrence des mthodes utilises pour dterminer les concentrations nominales et relles, et la relation
ltude.
La cause probable de la mort et le mode daction prdominant (systmique ou local) sont abords.
Une explication est apporte sil a fallu euthanasier des animaux qui souffraient ou montraient des signes de
mesurs thiquement acceptables (3).
Le ou les organes cibles sont identifis.
La concentration sans effet nocif observ (CSENO) et la concentration minimale avec effet nocif observ
(CMENO) sont dtermines.
BIBLIOGRAPHIE:
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Appendice 1
DFINITION
B.29. TOXICIT SUBCHRONIQUE PAR INHALATION: TUDE SUR 90 JOURS
RSUM
La prsente mthode dessai B.29 rvise a t conue afin de caractriser pleinement la toxicit par inhalation dune
substance dessai la suite dune exposition subchronique (90 jours), et de fournir des donnes fiables en vue
destimations quantitatives des risques lis linhalation. Des groupes de rongeurs (10 mles et 10 femelles) sont
exposs 6 heures par jour pendant une priode de 90 jours (13 semaines) a) la substance dessai trois niveaux de
concentration ou plus, b) de lair filtr (tmoin ngatif), et/ou c) au vhicule (groupe tmoin du vhicule). Les
animaux sont exposs en gnral 5 jours par semaine, mais il est aussi permis de les exposer 7 jours par semaine.
Des mles et des femelles sont toujours utiliss, mais peuvent tre exposs des niveaux de concentration diffrents
si lun des sexes est connu pour tre plus sensible une substance dessai donne. Afin de mieux caractriser la
toxicit de la substance dessai, la prsente mthode laisse la possibilit au directeur de ltude dinclure des groupes
satellites (tude de rversibilit), des sacrifices en cours dessai, des lavages broncho-alvolaires (LBA), des tests
neurologiques et des valuations histopathologiques ou de pathologie clinique supplmentaires.
INTRODUCTION
1.
La prsente mthode dessai est quivalente la ligne directrice 413 de lOCDE pour les essais de produits
chimiques (2009). Le texte original de la ligne directrice 413 sur la toxicit subchronique par inhalation avait t
adopt en 1981 (1). La prsente mthode dessai B.29 [quivalente la ligne directrice 413 rvise (2009)] a t
mise jour pour prendre en compte ltat de la science et rpondre aux exigences rglementaires actuelles et
futures.
2.
Les tudes de toxicit subchronique par inhalation sont principalement utilises pour calculer des concentrations
rglementaires en vue dvaluer les risques pour les travailleurs en milieu professionnel. Elles servent aussi
estimer les risques lis lexposition humaine dans les lieux dhabitation, les transports et lenvironnement. La
prsente mthode dessai permet de caractriser les effets nocifs rsultant dune exposition quotidienne rpte,
par inhalation, une substance dessai pendant 90 jours (approximativement 10 % de la dure de vie dun rat).
Les donnes drives des tudes de toxicit subchronique par inhalation peuvent tre utilises pour procder
des estimations quantitatives des risques et pour choisir les concentrations dans les tudes de toxicit chronique.
La prsente mthode dessai nest pas spcifiquement destine tester les nanomatriaux. Le document dorien
tation no 39 regroupe les dfinitions utilises dans le contexte de cette mthode dessai (2).
3.
Avant toute tude, le laboratoire dessai devra prendre en compte toutes les informations disponibles sur la
substance tester afin damliorer la qualit de ltude et de recourir le moins possible aux animaux. Parmi les
informations utiles pour la dtermination des concentrations dessai appropries, citons: lidentit, la structure
chimique et les proprits physico-chimiques de la substance dessai; les rsultats de tous les essais de toxicit in
vitro ou in vivo auxquels elle a t soumise; son (ses) utilisation(s) escompte(s) et les risques dexposition
humaine; les donnes (Q)SAR disponibles et les donnes toxicologiques sur les substances structurellement
apparentes; ainsi que les donnes issues dautres tudes sur lexposition rpte. En cas de neurotoxicit,
connue ou observe au cours de ltude, le directeur de ltude pourra dcider dinclure les valuations juges
ncessaires, comme une batterie dobservations fonctionnelles (FOB) et des mesures de lactivit motrice. Bien que
la dure des expositions par rapport des examens spcifiques puisse tre critique, lexcution de ces activits
supplmentaires ninterfre pas avec la conception de ltude principale.
4.
Les dilutions de substances corrosives ou irritantes peuvent tre testes des concentrations qui permettront
datteindre le degr de toxicit dsir. Le document dorientation no 39 (2) fournit de plus amples informations.
Lors de lexposition des animaux ces substances, les concentrations cibles sont assez faibles pour ne causer ni
souffrance manifeste ni dtresse, mais suffisantes pour prolonger la courbe concentration-rponse jusqu des
niveaux correspondant lobjectif scientifique et rglementaire de lessai. Le choix de ces concentrations est fait
au cas par cas, de prfrence sur la base dune tude prliminaire de dtermination des concentrations, conue de
faon approprie, et qui fournit des informations sur leffet critique mesur, un ventuel seuil dirritation et le
moment de son apparition (voir paragraphes 11-13). La justification du choix des concentrations est fournie.
5.
sont euthanasis. Les animaux moribonds sont pris en compte au mme titre que ceux qui succombent au cours
de lessai. Le document dorientation de lOCDE sur les effets mesurs thiquement acceptables (3) dtaille les
critres orientant la dcision deuthanasier les animaux moribonds ou en grande souffrance, et aide reconnatre
une mort prvisible ou imminente.
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Slection des espces animales
6.
Le choix sorientera vers de jeunes rongeurs adultes en bonne sant, de souches communment utilises en
laboratoire. Le rat tant lespce la plus utilise, il faudra justifier lemploi dautres espces.
7.
Les femelles sont nullipares et non gravides. Le jour de la randomisation, les animaux slectionns sont de jeunes
adultes gs de 7 9 semaines. Leur poids corporel nexcde pas 20 % du poids moyen pour chaque sexe.
Slectionns au hasard, les animaux sont marqus pour tre identifis individuellement. En vue de leur accli
matation aux conditions de laboratoire, ils sont conservs dans leur cage pour une priode dau minimum
5 jours avant le dbut de lessai.
8.
Les animaux sont identifis de faon individuelle, de prfrence laide de dispositifs sous-cutans, afin de
faciliter leur observation et dviter toute confusion. La temprature du local exprimental o les animaux
sont conservs est maintenue 22 3 C. Le taux dhumidit relative est idalement maintenu entre 30 et
70 %, encore quil ne soit pas toujours possible de le faire si leau est utilise comme vhicule. Avant et aprs
exposition, les animaux sont gnralement tre mis en cage en groupes par sexe et par concentration, mais le
nombre danimaux par cage ne fait pas obstacle une observation prcise de chaque animal, et nengendre quun
minimum de pertes dues au cannibalisme et aux combats. Si les animaux sont exposs nez seul, il peut tre
ncessaire de les acclimater aux tubes de contention. Ceux-ci ne doivent pas provoquer chez les animaux de
stress excessif, quil soit de nature physique, thermique ou d leur immobilisation. Les contraintes quils
subissent peuvent en effet modifier les paramtres physiologiques mesurs de lanimal, comme sa temprature
corporelle (hyperthermie) et/ou son volume respiratoire par minute. Si lon dispose de donnes gnriques
montrant que de telles modifications ne se produisent pas de faon apprciable, alors la priode dadaptation
pralable aux tubes de contention nest pas ncessaire. Les animaux exposs corps entier un arosol sont
enferms individuellement pendant lexposition pour empcher la filtration de larosol dessai par la fourrure
des congnres. lexception des priodes dexposition, le rgime alimentaire des animaux est le rgime classique
et certifi de laboratoire, avec eau potable satit. Lclairage est artificiel, la squence dclairage tant de
12 heures de clart et 12 heures dobscurit.
Chambre dinhalation
9.
Le choix de la chambre dinhalation prend en compte la nature de la substance dessai et lobjet de lessai. Le
prfrable pour les besoins spcifiques de ltude, mais cela est justifi dans le rapport de ltude. Pour assurer la
spcifiques.
TUDES DE TOXICIT
Concentrations limites
10. Contrairement aux tudes de toxicit aigu, aucune concentration limite nest dfinie dans les tudes de toxicit
subchronique par inhalation. La concentration maximale teste prend en compte: 1) la concentration maximale
pouvant tre atteinte, 2) le niveau dexposition humaine correspondant au pire des cas, 3) la ncessit de
maintenir une alimentation adquate en oxygne, et/ou 4) le bien- tre des animaux. En labsence de limites
fondes sur des donnes, les valeurs limites pour la toxicit aigu du rglement (CE) no 1272/2008 (13) peuvent
tre utilises (cest--dire jusqu une concentration maximale de 5 mg/l pour les arosols, 20 mg/l pour les
vapeurs et 20 000 ppm pour les gaz); voir document dorientation 39 (2). Sil est ncessaire de dpasser ces
limites lors dessais de gaz ou de substances dessai hautement volatils (comme les rfrigrants), une justification
est produite. La concentration limite doit permettre dobtenir une toxicit sans quivoque, sans causer de stress
excessif chez les animaux ni affecter leur longvit (3).
tude prliminaire de dtermination des concentrations
11. Avant le dbut de ltude principale, une tude prliminaire de dtermination des concentrations est gnrale
ment ncessaire. Plus complte quune tude dobservation, elle nest pas limite par le choix des concentrations.
Les connaissances acquises grce une tude prliminaire de dtermination des concentrations peuvent conduire
la russite de ltude principale. En effet, une telle tude peut fournir des informations techniques sur les
mthodes danalyse, la taille des particules, la dcouverte de mcanismes de toxicit, les donnes histopatholo
giques et de pathologie clinique, et les estimations de la concentration sans effet nocif observ (CSENO) et de la
concentration maximale acceptable (CMA) dans une tude principale. Le directeur dtude peut dcider de
sappuyer sur une tude prliminaire de dtermination des concentrations pour identifier: le seuil dirritation
de lappareil respiratoire (par exemple avec une histopathologie de lappareil respiratoire, des tests de la fonction
pulmonaire ou des lavages bronchoalvolaires), la concentration la plus leve tolre par les animaux sans
provoquer de stress excessif, et les paramtres qui permettront de caractriser au mieux la toxicit de la substance
dessai.
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12. Une tude prliminaire de dtermination des concentrations peut comporter un ou plusieurs niveaux de concen
tration. Selon les effets mesurer retenus, trois six mles et trois six femelles sont exposs chaque niveau
de concentration. La dure dune tude prliminaire de dtermination des concentrations est dau minimum
5 jours et ne pas excder 28 jours en gnral. Il convient dexposer dans le rapport dtude les raisons du choix
des concentrations retenues pour ltude principale, dont lobjet est de dmontrer une relation concentrationrponse base sur leffet mesur le plus sensible auquel on sattend. La concentration la plus faible nengendre en
principe aucune manifestation de toxicit, tandis que la concentration la plus leve permet dobtenir une toxicit
sans quivoque, sans causer de stress excessif chez les animaux ni affecter leur longvit (3).
13. Lors du choix des niveaux de concentration pour ltude prliminaire de dtermination des concentrations, toutes
les informations disponibles sont prises en compte, y compris les relations structure-activit et les donnes
correspondant des produits chimiques analogues (voir paragraphe 3). Une tude prliminaire de dtermination
des concentrations peut confirmer ou rfuter le choix des effets mesurs les plus sensibles selon des critres
mcanistiques, comme linhibition de la cholinestrase par des composs organophosphors, la formation de
mthmoglobine par des agents cytotoxiques disomrie rythro, les hormones thyrodiennes (T3, T4) dans le cas
de thyrotoxiques, les protines, la LDH, ou les neutrophiles dans les lavages bronchoalvolaires dans le cas de
particules inoffensives faiblement solubles ou darosols irritants pour les poumons.
tude principale
14. Ltude principale de toxicit subchronique comporte en gnral trois niveaux de concentration ainsi quun
tmoin ngatif (air) et/ou un tmoin du vhicule, sil y a lieu (voir paragraphe 18). Lensemble des informations
disponibles doit permettre de dterminer les niveaux dexposition appropris, y compris les rsultats des tudes
systmiques de toxicit, le mtabolisme et la cintique (on prendra garde dviter les niveaux de concentration
leve avec des processus cintiques de saturation). Chaque groupe dessai comprend au moins
10 rongeurs mles et 10 rongeurs femelles exposs la substance dessai 6 heures par jour, 5 jours par
semaine pendant 13 semaines (soit une dure totale de ltude dau moins 90 jours). Les animaux peuvent
aussi tre exposs 7 jours par semaine (par exemple dans le cas dessais sur des produits pharmaceutiques
inhals). Sil est connu quun des sexes est plus ractif la substance dessai, les niveaux de concentration peuvent
diffrer selon le sexe afin doptimiser la concentration-rponse telle que dcrite au paragraphe 15. Si des espces
de rongeurs autres que le rat sont exposes nez seul, il est possible dajuster la dure maximale dexposition en
fonction du stress propre ces espces. Lorsque la dure dexposition est infrieure 6 heures par jour ou quil
est ncessaire de mener une tude dexposition corps entier de longue dure (par exemple de 22 heures par
jour), des justifications sont fournies, voir document dorientation 39 (2). Les animaux sont privs de nourriture
pendant lexposition sauf si sa dure dpasse 6 heures. Dans une exposition corps entier, les animaux peuvent
boire de leau.
15. Les concentrations cibles choisies permettent didentifier le(s) organe(s) cible(s) et de mettre en vidence une
concentration-rponse claire:
le niveau de concentration lev produit des effets toxiques sans engendrer de signes persistants ou la mort,
ce qui empcherait une valuation valable des rsultats,
le(s) niveau(x) de concentration intermdiaire(s) est (sont) espac(s) de manire produire une gradation dans
les effets toxiques observs avec une concentration faible et avec une concentration leve,
le niveau de concentration faible ne produit quasiment aucune manifestation de toxicit.
Sacrifices en cours dessai
16. Si lon envisage le sacrifice danimaux en cours dessai, il faut accrotre le nombre danimaux exposs chaque
niveau de concentration du nombre prvu danimaux sacrifis avant la fin de lpreuve. Le recours aux sacrifices
en cours dessai est justifi, et les analyses statistiques en tiennent dment compte.
tude satellite (tude de rversibilit)
17. Une tude de rversibilit peut tre utilise pour mettre en vidence le caractre rversible, persistant ou retard
de la toxicit, pour une priode post-traitement dune dure approprie dau minimum 14 jours. Les groupes
satellites sont constitus de dix mles et de dix femelles exposs en mme temps que les animaux dexprience de
ltude principale. Ils sont exposs la concentration la plus leve de la substance dessai. Il convient galement
de faire appel un tmoin parallle (air) et, le cas chant, un tmoin du vhicule (voir paragraphe 18).
Animaux tmoins
18. Les animaux du groupe tmoin ngatif (air) sont traits dune manire identique ceux du groupe danimaux
dessai, mais au lieu de la substance dessai, ils sont exposs de lair filtr. Lorsque de leau ou une autre
substance est utilise pour produire latmosphre dessai, un groupe tmoin du vhicule est inclus dans ltude,
la place du groupe tmoin ngatif expos lair seulement. Autant que possible, leau est le vhicule utilis. Dans
ce cas, les animaux tmoins sont exposs un air dont le taux dhumidit relative est le mme que pour les
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groupes exposs la substance dessai. Le choix du vhicule sopre sur la base dune tude prliminaire
approprie ou de donnes historiques. Si la toxicit dun vhicule est mal connue, le directeur de ltude peut
choisir dutiliser un tmoin ngatif (air) et un tmoin du vhicule, mais cela est toutefois fortement dconseill. Si
les donnes historiques montrent quun vhicule nest pas toxique, le groupe tmoin lair nest pas ncessaire et
seul un tmoin du vhicule est utilis. Si aucune toxicit na t dtecte lors de ltude prliminaire dune
substance dessai prpare dans un vhicule, ce vhicule est considr comme non toxique la concentration
teste et est utilis comme vhicule tmoin.
forme mixte. Ltat physique tester dpend des proprits physico-chimiques de la substance, des concen
trations choisies, et/ou de la forme physique sous laquelle il est le plus probable quelle se prsente lors de sa
sous air sec. On prendra soin dviter les concentrations susceptibles de provoquer une explosion. Les matires
particulaires peuvent tre soumises des procds mcaniques afin de rduire la taille des particules. Pour plus
dinformations, se reporter au document dorientation 39 (2).
20. Une mesure de la taille des particules est ralise pour tous les arosols et les vapeurs susceptibles se condenser
pour former des arosols. Pour que toutes les rgions pertinentes de lappareil respiratoire soient exposes, il est
recommand dutiliser des arosols dont le diamtre arodynamique mdian de masse (DAMM) se situe entre 1
et 3 m, avec un cart type gomtrique (g) compris entre 1,5 et 3,0 (4). Un effort raisonnable est fourni pour
remplir ces conditions, mais si tel nest pas le cas, un jugement dexpert est ncessaire. Par exemple, les particules
des fumes mtalliques auront une taille infrieure cette norme, et les particules charges ou les fibres peuvent
avoir une taille suprieure.

21. La substance dessai est idalement teste sans vhicule. Sil est ncessaire davoir recours un vhicule pour
atteindre la concentration et la taille particulaire voulues de la substance dessai, leau est choisie de prfrence.
Chaque fois quune substance dessai est dissoute dans un vhicule, sa stabilit est dmontre.

22. Le dbit dair dans la chambre dexposition est contrl avec soin, surveill en continu et enregistr au moins
toutes les heures pendant chaque exposition. Le suivi en temps rel de la concentration de latmosphre dessai
(ou stabilit temporelle) constitue une mesure complte de tous les paramtres dynamiques et fournit un moyen
indirect de contrler tous les paramtres dinhalation dynamiques pertinents. Si la concentration est suivie en
temps rel, la frquence peut tre ramene une seule mesure du dbit de lair par exposition et par jour. On
prendra particulirement soin dviter toute re-respiration dans les chambres dexposition nez seul. La concen
tration doxygne est dau moins 19 % et celle de dioxyde de carbone ne dpasse pas 1 %. Si ces conditions ne
peuvent tre respectes, les concentrations doxygne et de dioxyde de carbone sont mesures. Si les mesures du
premier jour dexposition montrent que la concentration de ces gaz est approprie, aucune mesure complmen
taire ne devrait tre ncessaire.

corps entier, lhumidit relative dans la zone o respire lanimal est autant que possible surveille en continu et
enregistre toutes les heures pendant chaque exposition. Lhumidit relative est de prfrence comprise entre 30
et 70 %. Il est possible que ce taux ne puisse tre atteint (par exemple lorsque la substance dessai se prsente
sous forme de solution aqueuse), ou quil ne puisse tre mesur en raison dinterfrences de la substance avec la
mthode dessai.

production.
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25. La concentration relle est la concentration de la substance dessai prleve dans la zone de la chambre
dinhalation o les animaux respirent. Les concentrations relles peuvent tre obtenues par des mthodes
spcifiques (par exemple, chantillonnage direct, mthodes dadsorption ou de raction chimique, et caractri
sation analytique ultrieure) ou par des mthodes non spcifiques comme la gravimtrie sur filtre. Le recours
lanalyse gravimtrique nest acceptable que pour des arosols ne contenant quun seul composant en poudre ou
pour des arosols de liquides peu volatils, et des caractrisations spcifiques la substance dessai sont galement
effectues par une pr-tude approprie. Il est aussi possible davoir recours la gravimtrie pour dterminer la
concentration dun arosol contenant plusieurs composants en poudre, mais des donnes analytiques sont alors
ncessaires, afin de dmontrer que la composition du produit en suspension dans lair est analogue celle du
produit de dpart. Faute de cette information, il peut savrer ncessaire de soumettre le produit tester
(idalement en suspension dans lair) une nouvelle analyse intervalles rguliers tout au long de ltude.
Pour des agents arosoliss susceptibles de svaporer ou de se sublimer, il faut dmontrer que toutes les
phases ont t recueillies selon la mthode choisie.
26. Pendant toute la dure de ltude, il est recommand de nemployer si possible quun seul lot de la substance
dessai, et lchantillon de la substance est conserv dans des conditions prservant sa puret, son homognit et
sa stabilit. Avant le dbut de ltude, il convient de raliser une caractrisation de la substance dessai afin de
dterminer sa puret et, si cela est techniquement possible, son identit et les quantits de contaminants et
dimpurets identifis. Pour cela, on pourra recueillir les donnes suivantes: temps de rtention et surface relative
du pic, poids molculaire obtenu par spectroscopie de masse ou chromatographie en phase gazeuse, ou autres
estimations. Bien que le laboratoire dessai ne soit pas responsable de lidentification de la substance dessai, il
peut, par prudence, confirmer au moins une partie des caractristiques fournies par le donneur dordre (couleur,
nature physique, etc.).
27. Latmosphre dexposition est maintenue constante autant que possible. Un dispositif de suivi en temps rel, tel
quun photomtre arosol pour les arosols ou un analyseur dhydrocarbures totaux pour les vapeurs, peut tre
utilis pour dmontrer la stabilit des conditions dexposition. La concentration relle dans la chambre est
mesure au moins 3 fois chaque jour dexposition et pour chaque niveau dexposition. En cas dimpossibilit
en raison de dbits dair limits ou de faibles concentrations, lutilisation dun chantillon par priode dexpo
sition est acceptable. En principe, cet chantillon est alors recueilli pendant la totalit de la priode dexposition.
Les carts entre la concentration dans chaque chambre et la concentration moyenne nexcdent pas 10 % pour
les gaz et vapeurs et 20 % pour les arosols liquides ou solides. Il convient de calculer et de noter le temps
dquilibre dans la chambre dexposition (t95). La dure dune exposition couvre le temps de production de la
substance dessai, y compris le temps ncessaire pour lgalisation des concentrations dans la chambre dexpo
sition (t95) et leur dclin. Des indications pour lestimation de t95 sont fournies dans le document dorientation
39 (2).
28. Pour des systmes trs complexes constitus de gaz ou vapeurs et darosols (atmosphres de combustion ou
substance dessai propulss partir de produits/dispositifs spcialiss, par exemple), chaque phase peut se
on choisira donc au moins une substance indicatrice (analyte), en gnral le principal principe actif du mlange.
Quand la substance dessai est un mlange, la concentration analytique devra tre indique pour la prparation
totale et pas uniquement pour le principe actif ou la substance indicatrice (analyte). Pour plus dinformations sur
les concentrations relles, se reporter au document dorientation 39 (2).

29. La rpartition granulomtrique des arosols est dtermine au minimum chaque semaine pour chaque niveau de
concentration, laide dun impacteur en cascade ou dun autre instrument, comme un spectromtre de mesure
de la taille des particules arodynamiques (APS). Si les rsultats obtenus avec limpacteur en cascade et lautre
instrument se rvlent quivalents, ce dernier peut tre utilis tout au long de ltude.
30. Pour confirmer la capacit de recueil des particules de loutil principal, un second instrument devra tre utilis en
parallle, par exemple un filtre gravimtrique ou un barboteur gaz/impacteur. La concentration massique
obtenue par lanalyse granulomtrique se rapproche, dans des limites raisonnables, de celle obtenue par lanalyse
sur filtre, voir document dorientation 39 (2). Si pour toutes les concentrations testes, cette quivalence est
tablie au dbut de la phase dtude, il nest pas ncessaire deffectuer des mesures de confirmation dans la suite
de ltude. Pour le bien-tre des animaux, il convient de rduire au minimum les donnes douteuses qui
ncessiteraient de rpter lessai.
31. Une rpartition granulomtrique est effectue dans le cas des vapeurs, sil est possible quune condensation de la
vapeur conduise la formation dun arosol, ou si des particules sont dtectes dans une atmosphre de vapeur
susceptible de prsenter des phases mixtes.
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OBSERVATIONS
32. Un examen clinique attentif des animaux est pratiqu avant, pendant, et aprs la priode dexposition. Des
observations plus frquentes peuvent tre ralises en fonction de la rponse des animaux pendant lexposition.
Lorsque lobservation des animaux savre difficile en raison des tubes de contention, du mauvais clairage des
chambres dexposition corps entier ou datmosphres opaques, les animaux seront observs attentivement aprs
lexposition. Les observations effectues avant lexposition du lendemain peuvent permettre destimer une ven
tuelle rversibilit ou exacerbation des effets toxiques.
33. Toutes les observations sont enregistres individuellement pour chaque animal. Quand des animaux sont
retrouvs morts ou sont euthanasis, lheure de la mort est consigne le plus prcisment possible.
muqueuses, de lappareil respiratoire, du systme circulatoire, du systme nerveux, ainsi que de lactivit soma
tomotrice et du comportement. Les tremblements, les convulsions, la salivation, les diarrhes, la lthargie, le
sommeil et le coma retiennent lattention. La mesure de la temprature rectale peut aider mettre en vidence
une bradypne rflexe ou une hypo/hyperthermie lie au traitement ou au confinement. Il est possible denrichir
le protocole dtude par des estimations complmentaires telles que: cintique, surveillance biologique, fonction
pulmonaire, rtention de produits peu solubles qui saccumulent dans les tissus pulmonaires et changements
comportementaux.
POIDS CORPOREL
35. Le poids de chacun des animaux est enregistr individuellement: juste avant la premire exposition (jour 0), deux
fois par semaine par la suite (par exemple les vendredis et lundis, afin de mettre en vidence leur rtablissement
aprs un week-end sans exposition, ou dans un dlai permettant lvaluation de la toxicit systmique), et au
moment de leur mort ou de leur euthanasie. Si aucun effet nest observ les 4 premires semaines, le poids
corporel peut ntre mesur quune fois par semaine pendant le reste de ltude. Les animaux du groupe satellite
(tude de rversibilit) sont toujours pess de faon hebdomadaire tout au long de la priode de rcupration. Au
terme de ltude, tous les animaux sont pess juste avant leur sacrifice pour ne pas fausser le calcul des rapports
du poids des organes au poids du corps.
CONSOMMATION DE NOURRITURE ET DEAU
36. La quantit de nourriture consomme est mesure une fois par semaine. La consommation deau peut galement
ltre.
PATHOLOGIE CLINIQUE
37. Tous les animaux, y compris ceux des groupes tmoins et satellites, quand ils sont sacrifis, subissent des
examens cliniques. Le dlai entre la fin de lexposition et la prise de sang est enregistr, en particulier quand
la reconstitution de leffet vis est rapide. la fin de lexposition, un chantillonnage est recommand pour les
paramtres ayant une courte demi-vie plasmatique (HbCO, ChE et MetHb, par exemple).
38. Le tableau 1 numre les paramtres de pathologie clinique gnralement requis pour toutes les tudes toxico
logiques. Une analyse durine nest pas ncessaire en rgle gnrale, mais peut tre ralise si on lestime utile
daprs la toxicit probable ou observe. Afin de mieux caractriser la toxicit de la substance dessai, le directeur
de ltude peut faire appel dautres paramtres (cholinestrase, lipides, hormones, quilibre acido-basique,
mthmoglobine ou corps de Heinz, cratine kinase, rapport mylode/rythrode, troponines, gaz du sang,
lactate dshydrognase, sorbitol dshydrognase, glutamate dshydrognase, gamma glutamyl transpeptidase,
etc.).
Tableau 1
Paramtres standards de pathologie clinique
Hmatologie
Nombre drythrocytes
Nombre total de leucocytes
Hmatocrite
Diffrentiel leucocytaire
Concentration dhmoglobine
Nombre de plaquettes sanguines
Teneur corpusculaire moyenne en hmoglobine
Potentiel de coagulation (en choisir un):
Volume corpusculaire moyen
Temps de prothrombine
Concentration corpusculaire moyenne dhmoglobine
Temps de coagulation
Rticulocytes
Temps de thromboplastine partielle
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Chimie clinique
Glucose (*)
Alanine aminotransfrase
Cholestrol total
Aspartate aminotransfrase
Triglycrides
Phosphatase alcaline
Azote urique dans le sang
Potassium
Bilirubine totale
Sodium
Cratinine
Calcium
Protines totales
Phosphore
Albumine
Chlorure
Globuline
Analyse durine (facultative)
Apparence (couleur et turbidit)
Protines totales
Volume
Glucose
Densit ou osmolarit
Sang/cellules sanguines
pH
(*) Le directeur dtude dcidera si une priode de jene est ncessaire ou non pour les animaux, une longue priode de jene
pouvant conduire des mesures de glucose partiellement errones pour les animaux traits par rapport aux animaux
tmoins. La priode de jene est approprie lespce utilise: pour le rat, elle peut tre de 16 heures environ (jene
pendant la nuit). La dtermination de la glycmie jeun peut tre effectue aprs la priode de jene de la nuit, pendant la
dernire semaine dexposition, ou aprs la priode de jene de la nuit prcdant lautopsie (avec, dans ce dernier cas, tous les
autres paramtres de pathologie clinique).
39. Quand il est prouv que les voies respiratoires basses (cest--dire les alvoles pulmonaires) sont le principal site
de dpt et de rtention, le lavage broncho-alvolaire (LBA) peut alors tre la technique de choix pour effectuer
une analyse quantitative des paramtres de la relation dose-effet base sur les hypothses, en se concentrant sur
lalvolite, linflammation pulmonaire et la phospholipidose. Ceci permet dtudier convenablement lvolution de
la relation dose-effet et du dcours temporel dune lsion alvolaire. Le fluide du LBA peut tre analys en se
basant sur le nombre total et diffrentiel de leucocytes, les protines totales et la lactate dshydrognase. Dautres
paramtres peuvent galement tre considrs, comme ceux mettant en vidence une lsion lysosomale, une
phospholipidose, une fibrose, une inflammation allergique ou irritante, laquelle peut inclure la dtermination de
cytokines ou de chimiokines pro-inflammatoires. Les mesures lies au LBA compltent souvent les rsultats des
examens histopathologiques sans toutefois sy substituer. Des indications sur la manire de raliser un lavage de
poumon sont disponibles dans le document dorientation 39 (2).
EXAMEN OPHTALMOLOGIQUE
40. laide dun ophthalmoscope ou dun dispositif quivalent, un examen ophthalmologique du fond dil, des
milieux de rfraction, de liris et de la conjonctivite est effectu avant ladministration de la substance dessai pour
tous les animaux, et au terme de ltude pour tous les groupes tmoins et groupes exposs la concentration
leve. Si des changements dans les yeux sont dcels, tous les animaux des autres groupes sont examins, y
compris le groupe satellite (tude de rversibilit).
MACROPATHOLOGIE ET POIDS DES ORGANES
41. Tous les animaux dexprience, y compris ceux morts au cours de lessai et ceux carts de ltude pour des
raisons de bien-tre animal, subissent une exsanguination complte (si cela est possible) et une autopsie macro
scopique. Il convient denregistrer le dlai entre la fin de la dernire exposition de chaque animal et leur sacrifice.
Lorsquun animal est dcouvert mort et que son autopsie nest pas ralisable immdiatement, lanimal est
rfrigr (mais non congel) une temprature suffisamment basse pour minimiser lautolyse. Les autopsies
sont ralises le plus tt possible, en gnral dans un dlai dun deux jours. Tous les changements macropa
thologiques sont enregistrs pour chaque animal en prtant particulirement attention aux voies respiratoires.
42. Le tableau 2 numre les organes et tissus devant tre conservs dans un milieu appropri lors de lautopsie
macroscopique en vue dun examen histopathologique. La conservation des organes et tissus [entre crochets], et
de tous les autres organes et tissus, est la discrtion du directeur dtude. Les organes indiqus en gras sont
dcoups et pess ltat humide, le plus tt possible aprs la dissection, pour viter leur dessiccation. La
thyrode et les pididymes ne sont pess que si cela est ncessaire car leur dcoupe peut gner lvaluation
histopathologique. Les organes et tissus sont fixs laide de formol tamponn 10 %, ou dun autre fixateur
appropri, ds que lautopsie est effectue, et pas moins de 24 48 heures avant le dcoupage, en fonction du
fixateur utilis.
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Tableau 2
Organes et tissus conserver lors de lautopsie macroscopique
Aorte
[Bulbe olfactif]
Moelle osseuse (et/ou un aspirat frais)

Muscle (cuisse)
Ccum
Nerf priphrique (sciatique ou tibial, de prfrence

proche du muscle)
Capsules surrnales
sophage
Cerveau (y compris segments dhmisphres, cervelet Ovaires

et bulbe rachidien/pont)
Cur
Clon
Pancras
Parathyrodes
Peau
Dents
Duodnum
Poumons (tous les lobes sur un niveau, y compris les

bronches principales)
[pididymes]
Prostate
Fmur avec articulation
Rate
Foie
Rectum
Ganglions lymphatiques (distaux par rapport au site

dentre)
Reins
Sternum
Ganglions lymphatiques depuis la rgion hilaire du

Testicules
poumon, en particulier pour les substances particu
laires peu solubles. Pour des examens plus appro
fondis et/ou des tudes but immunologique, dau Thymus
tres ganglions lymphatiques peuvent tre envisags,
comme ceux des rgions mdiastinale, cervicale/sub Thyrode
mandibulaire et/ou auriculaire.
Tissus nasopharyngs [au moins 4 niveaux; 1 niveau
comprenant le conduit nasopharyngien et le tissu
[Glandes de Harder]
lymphode associ la muqueuse nasale (NALT)]
[Glandes lacrymales (extraorbitales)]
Estomac
Glande mammaire (femelles)
Glandes salivaires
Hypophyse
Trache (au moins 2 niveaux comprenant 1 coupe longi

tudinale le long de la carne et 1 coupe transversale)
[Uretre]
[Urtre]
Utrus
Vsicule biliaire (si prsente)
Ilon
Jnunum
[Langue]
Larynx (3 niveaux, dont la base de lpiglotte)
Vsicules sminales
Vessie
[Yeux (rtine, nerf optique) et paupires]
Organes cibles
Moelle pinire (niveaux cervical, msothoracique et

Toutes les masses et lsions macroscopiques
lombaire)
43. Les poumons sont retirs intacts, pess et perfuss avec un fixateur appropri une pression de 20 30 cm
deau pour veiller ce que larchitecture pulmonaire soit prserve (5). Les coupes sont recueillies pour tous les
lobes sur un niveau comprenant les bronches principales. Si un lavage du poumon est ralis, le lobe qui na pas
t lav est sectionn sur trois niveaux (pas de coupe en srie).
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44. Au moins 4 niveaux des tissus nasopharyngs sont examins, dont un devant comporter le conduit nasopha
ryngien (5) (6) (7) (8) (9) pour permettre un examen adquat de lpithlium squameux, transitionnel (respiratoire
non-cili), respiratoire (respiratoire cili) et olfactif, ainsi que du tissu lymphatique (NALT) (10) (11). Trois
niveaux du larynx sont examins, dont un comprenant la base de lpiglotte (12). Au moins deux niveaux de
la trache sont examins, y compris une coupe longitudinale le long de la carne de la bifurcation des bronches
extrapulmonaires et une coupe transversale.
HISTOPATHOLOGIE
45. Une valuation histopathologique de tous les organes et tissus du tableau 2 est ralise pour les animaux des
groupes tmoins et des groupes exposs une concentration leve de la substance dessai, ainsi que pour les
animaux qui meurent ou sont sacrifis au cours de ltude. On portera une attention particulire aux voies
respiratoires, aux organes cibles et aux lsions macroscopiques. Les organes et tissus prsentant des lsions dans
le groupe expos une concentration leve sont examins pour tous les groupes. Le directeur de ltude peut
choisir de raliser des valuations histopathologiques pour dautres groupes afin de mettre en vidence une
relation concentration-rponse claire. Lorsquun groupe satellite (tude de rversibilit) est utilis, il y a lieu
deffectuer un examen histopathologique pour tous les tissus et organes ayant laiss apparatre des effets dans les
groupes traits. Lorsquun trop grand nombre de morts prcoces ou dautres problmes survenant dans le groupe
expos une concentration leve compromettent la porte des rsultats, le groupe expos la concentration
immdiatement infrieure subit un examen histopathologique. On tentera de corrler les observations macro
scopiques et les constatations au niveau microscopique.
RSULTATS ET RAPPORT
Donnes
46. Pour chacun des animaux, les donnes suivantes sont fournies: poids corporel, consommation de nourriture,
pathologie clinique, pathologie macroscopique, poids des organes et histopathologie. Les rsultats des observa
tions cliniques sont rsums sous la forme de tableaux et indiquent pour chaque groupe dessai: le nombre
danimaux utiliss, le nombre danimaux prsentant des signes spcifiques de toxicit, le nombre danimaux
retrouvs morts au cours de lessai ou euthanasis, lheure de la mort de chacun des animaux, la description et
lvolution dans le temps des effets toxiques ainsi que leur rversibilit, et les conclusions de lautopsie. Tous les
rsultats, quantitatifs et fortuits, sont valus laide dune mthode statistique approprie. Toute mthode
statistique gnralement reconnue peut tre utilise; il y a lieu de slectionner les mthodes statistiques au
stade de la conception de ltude.
Rapport dessai
Animaux dexprience et conditions dlevage
Description des conditions dencagement, y compris: nombre (ou volution du nombre) danimaux par cage,
alimentaire.
Espces/souches utilises et justification ventuelle de lutilisation dune espce autre que le rat. Des donnes
sources et historiques peuvent tre fournies si elles correspondent des animaux soumis des conditions
dexposition, dencagement et de jene similaires.
Nombre, ge et sexe des animaux.
Mthode de randomisation.
Description dun ventuel conditionnement pralable lessai, tel que rgime alimentaire, quarantaine ou
Substance dessai
Nature physique, puret et, sil y a lieu, proprits physico-chimiques (y compris isomrisation).
Donnes didentification et numro CAS (Chemical Abstract Services) sil est connu.
Vhicule
Justification de lemploi dun vhicule et justification de son choix (sil ne sagit pas de leau).
Donnes historiques ou concordantes dmontrant que le vhicule ninterfre pas avec les rsultats de ltude.
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Chambre dinhalation
Description dtaille de la chambre dinhalation, y compris son volume et son schma.
Source et description de lquipement utilis pour lexposition des animaux et pour la production de latmo
sphre.
quipement utilis pour mesurer la temprature, lhumidit, la granulomtrie et la concentration relle.
Source dair et systme de climatisation utilis.
Mthodes utilises pour talonner lquipement afin dassurer lhomognit de latmosphre dessai.
Diffrence de pression (positive ou ngative).
Orifices dexposition par chambre (nez seul) ou emplacement des animaux dans la chambre (corps entier).
Stabilit de latmosphre dessai.
Situation des capteurs thermiques et hygromtriques et chantillonnage de latmosphre dessai dans la
chambre dexposition.
Traitement de lair fourni/vacu.
Dbits dair, dbit dair/orifice dexposition (nez seul) ou rapport du volume de lanimal la chambre (corps
entier).
Temps ncessaire pour atteindre lquilibre dans la chambre dexposition (t95).
Nombre de changements de volume par heure.
Doseurs (sil y en a).
Donnes concernant lexposition
Justification du choix de la concentration cible dans ltude principale.
Concentrations nominales (masse totale de la substance dessai produite dans la chambre dinhalation, divise
par le volume dair traversant la chambre).
Concentrations relles de la substance dessai obtenues dans la zone o respirent les animaux; pour les
tuants peut tre analys sparment.
Toutes les concentrations atmosphriques sont rapportes en units de masse (mg/l, mg/m3, etc.) plutt quen
units de volume (ppm, ppb, etc.).
Rpartition granulomtrique des particules, diamtre arodynamique mdian de masse (DAMM) et cart type
consignes.
Dtails sur la prparation de la substance dessai, y compris sur les procdures utilises pour rduire la taille
des particules des matriaux solides ou pour prparer les solutions de la substance dessai.
Description (si possible avec schma) de lquipement utilis pour produire latmosphre dessai et pour
exposer les animaux celle-ci.
Dtails sur lquipement utilis pour contrler la temprature et le taux dhumidit de la chambre ainsi que le
dbit dair dans la chambre (ralisation dune courbe dtalonnage).
Dtails sur lquipement utilis pour recueillir les chantillons servant dterminer les concentrations dans la
chambre et la rpartition granulomtrique.
Dtails sur la mthode de chimie analytique utilise et la mthode de validation (notamment rendement de
rcupration de la substance dessai partir du milieu dchantillonnage).
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Mthode de randomisation utilise pour lassignation des animaux aux groupes dessai et aux groupes
tmoins.
Dtails sur la qualit de la nourriture et de leau (notamment origine/type de rgime alimentaire, origine de
leau).
Justification du choix des concentrations dessai.
Rsultats
Tableau prsentant la temprature, le taux dhumidit et le dbit dair dans la chambre dinhalation.
Tableau de donnes sur les concentrations nominales et relles dans la chambre dinhalation.
Tableau de donnes sur la taille des particules, notamment donnes analytiques sur le prlvement dchan
tillons, la rpartition granulomtrique et les calculs du DAMM et de g.
Tableau de donnes sur les rponses et le niveau de concentration pour chaque animal (cest--dire nombre
danimaux montrant des signes de toxicit, y compris de mortalit, et nature, svrit, moment dapparition
et dure des effets).
Tableau du poids de chacun des animaux.
Tableau de la consommation de nourriture.
Tableau des rsultats de pathologie clinique.
Pour chaque animal, rsultats de lautopsie et observations histopathologiques disponibles.
Discussion et interprtation des rsultats
Un effort particulier est consacr la description des mthodes utilises pour rpondre aux critres de la
prsente mthode dessai, par exemple en ce qui concerne la concentration limite ou la taille des particules.
La respirabilit des particules est aborde la lumire des rsultats densemble, en particulier si les critres de
taille des particules nont pu tre remplis.
La cohrence des mthodes utilises pour dterminer les concentrations nominales et relles, et la relation
ltude.
La cause probable de la mort et le mode daction prdominant (systmique ou local) sont abords.
Une explication est apporte sil a fallu euthanasier des animaux qui souffraient ou montraient des signes de
Le ou les organes cibles sont identifis.
La concentration sans effet nocif observ (CSENO) et la concentration minimale avec effet nocif observ
(CMENO) sont dtermines.
BIBLIOGRAPHIE:
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lenvironnement Srie sur les essais et valuations no 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OCDE, Paris.
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Appendice 1
DFINITION
______
B.30. TUDES DE TOXICIT CHRONIQUE
INTRODUCTION
1.
La prsente mthode dessai est quivalente la ligne directrice 452 de lOCDE pour les essais de produits
chimiques (2009). La ligne directrice 452 initiale avait t adopte en 1981. La rvision de cette mthode B.30 a
t juge ncessaire afin de tenir compte des volutions rcentes dans le domaine du bien-tre animal, ainsi que
des nouvelles exigences rglementaires (1) (2) (3) (4). La mise jour de la mthode dessai B.30 a t effectue
en parallle avec la rvision des chapitres B.32 (tudes de cancrogense) et B.33 (tudes combines de toxicit
chronique et de cancrogense) de la prsente annexe, dans le but dobtenir des informations additionnelles
partir des animaux utiliss dans ltude, et de fournir des prcisions concernant le choix des doses. La prsente
mthode dessai vise les essais portant sur une large gamme de produits chimiques, dont des pesticides et des
produits chimiques industriels.
2.
La plupart des tudes de toxicit chronique tant menes sur des espces de rongeurs, la prsente mthode
dessai est destine sappliquer principalement des tudes ralises avec ces espces. Sil savrait ncessaire de
mener de telles tudes avec des non-rongeurs, les principes et procdures dcrits dans la prsente mthode
dessai et dans le chapitre B.27 de la prsente annexe (Toxicit orale doses rptes non-rongeurs: 90 jours)
(5) pourront aussi tre appliqus, moyennant des modifications appropries, comme indiqu dans le document
dorientation de lOCDE no 116 sur llaboration et la conduite des tudes de toxicit chronique et de canc
rogense (6).
3.
Les trois principales voies dadministration utilises dans les tudes de toxicit chronique sont la voie orale, la
voie cutane et linhalation. Le choix de la voie dadministration dpend des caractristiques physiques et
chimiques de la substance dessai, et de la voie dexposition prdominante chez lhomme. Des informations
complmentaires sur le choix de la voie dexposition sont fournies dans le document dorientation no 116 (6).
4.
La prsente mthode dessai porte essentiellement sur lexposition par voie orale, la voie la plus communment
utilise dans les tudes de toxicit chronique. Bien que des tudes de toxicit chronique long terme utilisant
lexposition par voie cutane ou par inhalation puissent aussi tre ncessaires pour valuer le risque pour la
sant humaine et/ou exiges en vertu de certains rgimes rglementaires, ces deux voies dexposition ncessitent
des dispositifs techniques dune grande complexit. De telles tudes devront tre conues au cas par cas, encore
que la prsente mthode dessai, qui porte sur la caractrisation et lvaluation de la toxicit chronique par voie
orale, puisse fournir les bases dun protocole dtude par voie cutane et/ou linhalation, notamment en ce qui
concerne les recommandations relatives aux dures de traitement, aux paramtres cliniques et pathologiques, etc.
Il existe des documents dorientation de lOCDE sur ladministration exprimentale de substances dessai par
inhalation (6) (7) et par voie cutane (6). Les chapitres B.8 (8) et B.29 (9) de la prsente annexe, ainsi que le
document dorientation de lOCDE sur les essais de toxicit aigu par inhalation (7) doivent en particulier tre
consults lors de la conception dtudes plus long terme portant sur une exposition par inhalation. Le chapitre
B.9 de la prsente annexe (10) doit tre consult dans le cas dun essai par voie cutane.
5.
Ltude de toxicit chronique donne des lments dinformation sur les risques pour la sant susceptibles de
dcouler dune exposition rpte sur une portion considrable de la dure de vie des espces employes. Ltude
fournit des informations sur les effets toxiques de la substance dessai, et indiquera les organes cibles et la
possibilit daccumulation dans ces organes. Elle peut aussi donner une estimation de la dose sans effet nocif
observ, qui permet dtablir les critres de scurit concernant lexposition humaine. De plus, il convient
daccorder une attention particulire lobservation clinique des animaux afin dobtenir le plus dinformations
possible.
6.
Les objectifs des tudes couvertes par la prsente mthode dessai sont les suivants:
identification de la toxicit chronique dune substance dessai,
identification des organes cibles,
caractrisation de la relation dose-effet,
identification dun niveau de dose sans effet nocif observ (DSENO) ou du point de dpart pour ltablis
sement dune dose de rfrence (DR),
prvision des effets de toxicit chronique aux niveaux reprsentatifs de lexposition humaine,
obtention de donnes permettant de vrifier les hypothses concernant le mode daction (6).
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7.
Lors de lvaluation des caractristiques toxicologiques dune substance chimique dessai, le laboratoire charg de
ltude prend en compte toutes les informations disponibles sur la substance dessai avant de raliser ltude, afin
de pouvoir orienter celle-ci de manire tester plus efficacement le potentiel de toxicit chronique, et faire le
moins possible appel aux animaux. Les informations utiles pour concevoir ltude sont notamment: lidentit, la
structure chimique et les proprits physico-chimiques de la substance dessai; les informations ventuelles sur
son mode daction; les rsultats dventuelles tudes de toxicit in vitro ou in vivo; lutilisation (les utilisations)
prvue(s) et le potentiel dexposition humaine; les donnes Q(SAR) disponibles et les donnes toxicologiques
relatives aux substances chimiques structurellement apparentes; les donnes toxicocintiques disponibles (dose
unique et doses rptes, si ces donnes existent) et les rsultats dautres tudes doses rptes. La dtermi
nation de la toxicit chronique nest effectue quaprs obtention des premiers rsultats dessais de toxicit
doses rptes sur 28 jours et/ou 90 jours. Il convient denvisager ladoption dune approche par tapes pour les
essais de toxicit chronique entrepris dans le cadre de lvaluation globale des effets nocifs potentiels dune
substance dessai particulire (11) (12) (13) (14).
8.
Les mthodes statistiques les plus appropries pour lanalyse des rsultats, compte tenu du plan exprimental et
des objectifs de ltude, sont identifies avant le dbut de ltude. Il convient notamment de dterminer si les
statistiques doivent prendre en compte lajustement en fonction de la survie et lanalyse effectue en cas de mort
prmature des animaux dun ou plusieurs groupes. On trouvera des indications concernant les analyses
statistiques appropries, ainsi que des rfrences cls des mthodes statistiques reconnues au plan international,
dans le document dorientation no 116 (6) ainsi que dans le document dorientation no 35 sur lanalyse et
lvaluation des tudes de toxicit chronique et de cancrogense (15).
9.
Lors de la ralisation dune tude de toxicit chronique, il est recommand de toujours suivre les principes et
considrations noncs dans le document dorientation no 19 de lOCDE sur la reconnaissance, lvaluation et
lutilisation des signes cliniques en tant queffets mesurs thiquement acceptables dans les exprimentations
animales menes des fins dvaluation de la scurit (16). Le paragraphe 62 de ce document, en particulier,
stipule ce qui suit: Dans les tudes comportant ladministration de doses rptes, lorsqu'un animal prsente des signes
cliniques progressifs de dtrioration de son tat, une dcision deuthanasier ou non lanimal est prise en connaissance de
cause. Cette dcision met en balance des facteurs tels que la valeur des informations pouvant tre obtenues en maintenant
lanimal dans ltude dune part, et ltat gnral de celui-ci dautre part. Si la dcision est prise de poursuivre lessai sur cet
animal, la frquence des observations est augmente selon les besoins. Il est aussi possible, sans toutefois nuire lobjectif de
lessai, dinterrompre ladministration de la substance dessai pour soulager la douleur ou la dtresse de lanimal, ou de
rduire la dose teste.
10. On trouvera des informations dtailles et une discussion sur les principes dterminant le choix des doses pour
les tudes de toxicit chronique et de cancrogense dans le document dorientation no 116 (6) ainsi que dans
deux publications de lInstitut international des sciences de la vie (17) (18). La stratgie de base pour le choix des
doses dpend du ou des objectifs principaux de ltude (paragraphe 6). En choisissant des niveaux de dose
appropris, il convient de trouver un quilibre entre, dune part, lidentification des dangers et, dautre part, la
caractrisation des rponses aux faibles doses et leur pertinence. Cet quilibre est particulirement ncessaire
dans le cas o une tude combine de toxicit chronique et de cancrogense (chapitre B.33 de la prsente
annexe) est mene (paragraphe 11).
11. Il convient dexaminer lopportunit de raliser une tude combine de toxicit chronique et de cancrogense
(chapitre B.33 de la prsente annexe), plutt que de raliser sparment une tude de toxicit chronique (la
prsente mthode dessai B.30) et une tude de cancrogense (chapitre B.32 de la prsente annexe). Lessai
combin permet une meilleure efficacit en temps et en cots, par rapport la conduite de deux essais spars,
et ne compromet pas la qualit des donnes de la phase chronique ou de la phase de cancrogense. Toutefois,
les principes dterminant le choix de la dose (paragraphes 9 et 20-25) sont respects rigoureusement lors de la
ralisation dune tude combine de toxicit chronique et de cancrogense (chapitre B.33 de la prsente
annexe); il est reconnu galement que certains cadres rglementaires peuvent imposer la conduite dtudes
spares.
12. Les dfinitions utilises dans le contexte de la prsente mthode dessai figurent dans le document dorientation
no 116 (6).
PRINCIPE DE LESSAI
13. La substance dessai est administre quotidiennement plusieurs groupes danimaux dexprience des doses
progressives, en gnral pendant une priode de 12 mois, bien que des dures plus longues ou plus courtes
puissent aussi tre choisies, en fonction des exigences rglementaires (voir paragraphe 33). Cette dure est assez
longue pour permettre aux effets de toxicit cumule de se manifester, tout en vitant les effets perturbateurs
des changements lis au vieillissement. Les dviations par rapport une dure dexposition de 12 mois sont
justifies, surtout dans le cas de dures plus courtes. La substance dessai est normalement administre par voie
orale, mais la voie inhalatoire ou la voie cutane peut aussi tre approprie. Un ou plusieurs sacrifices en cours
dtude peuvent aussi tre prvus, par exemple 3 et 6 mois, auquel cas des groupes danimaux supplmentaires
pourront tre enrls (voir paragraphe 19). Au cours de la priode dadministration, les animaux sont examins
soigneusement afin de dceler tout signe de toxicit. Les animaux qui meurent ou qui sont sacrifis en cours
dessai sont autopsis et, au terme de lessai, les animaux survivants sont sacrifis et autopsis.
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14. La prsente mthode dessai traite principalement de la caractrisation et de lvaluation de la toxicit chronique
chez les rongeurs (voir paragraphe 2), bien que certains rgimes rglementaires puissent exiger la ralisation
dtudes similaires chez des non-rongeurs. Dans ce cas, le choix de lespce est justifi. Sil savrait ncessaire de
raliser des tudes de toxicit chronique avec des non- rongeurs, le plan et la conduite de ltude devraient tre
conformes aux principes dcrits dans la prsente mthode dessai ainsi quau chapitre B.27 de la prsente annexe
(Toxicit orale doses rptes non-rongeurs: 90 jours) (5). Des informations additionnelles sur le choix des
espces et des souches sont disponibles dans le document dorientation no 116 (6).
15. La prsente mthode dessai se rapporte essentiellement au rat, mais dautres espces de rongeurs, comme la
souris, peuvent tre utilises. Les rats et les souris sont les modles exprimentaux choisis de prfrence, en
raison de leur courte dure de vie, de leur utilisation frquente dans les tudes pharmacologiques et toxicolo
giques, de leur sensibilit linduction de tumeurs, et de la disponibilit de souches suffisamment caractrises.
Ces caractristiques permettent dobtenir une grande quantit dinformations sur la physiologie et la pathologie
de ces animaux. Il convient demployer de jeunes animaux adultes sains, de souches communment utilises
dans les laboratoires. Ltude de toxicit chronique sera effectue de prfrence sur des animaux de mme
souche et de mme provenance que ceux utiliss dans ltude (les tudes) de toxicit prliminaire(s) de plus
courte dure. Les femelles sont nullipares et non gravides.
Conditions dhbergement et dalimentation
16. Les animaux peuvent tre logs individuellement ou runis dans des cages en petits groupes du mme sexe,
lhbergement individuel ntant envisager que dans des cas scientifiquement justifis (19) (20) (21). Les cages
sont places de faon telle que linfluence ventuelle de leur disposition sur les rsultats soit rduite au
minimum. La temprature du local des animaux dexprience est de 22 C ( 3 C). Lhumidit relative est
dau moins 30 % et nexcde pas de prfrence 70 % en dehors des moments o le local est nettoy, lidal
tant quelle soit comprise entre 50 et 60 %. Lclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumire et 12 heures
dobscurit. Le rgime alimentaire peut tre un rgime classique de laboratoire, avec eau potable satit. Il
satisfait tous les besoins nutritionnels de lespce tudie, et la teneur en contaminants alimentaires susceptibles
dinfluer sur les rsultats de lessai (rsidus de pesticides, polluants organiques persistants, phyto-strognes,
mtaux lourds et mycotoxines, par exemple) est aussi faible que possible. Des donnes analytiques sur les
teneurs en nutriments et en contaminants alimentaires sont recueillies rgulirement, au moins au dbut de
ltude et lors des changements de lots; ces donnes figurent dans le rapport final. Des donnes analytiques sur
leau de boisson utilise dans le cadre de ltude sont de mme fournies. Le choix du rgime alimentaire peut
tre influenc par la ncessit dassurer un mlange convenable de la substance dessai, et de satisfaire les besoins
nutritionnels des animaux lorsque la substance dessai est administre dans la nourriture.
17. Il convient dutiliser des animaux sains, acclimats aux conditions de laboratoire depuis au moins 7 jours, et
nayant jamais t soumis auparavant des protocoles exprimentaux. Dans le cas des rongeurs, ladministration
de la substance commence ds que possible aprs le sevrage et lacclimatation, et de prfrence avant lge de
8 semaines. Lespce, la souche, la provenance, le sexe, le poids et lge des animaux dexprience sont prciss.
Au dbut de ltude, la variation de poids des animaux de chaque sexe est minimale, et nexcde pas 20 % du
poids moyen de tous les animaux tudis, et ce pour chaque sexe sparment. Les animaux sont affects de
manire alatoire aux diffrents groupes (tmoins et traits). Aprs la randomisation, les poids moyens des
groupes de chaque sexe ne prsentent pas de diffrences significatives. En cas de diffrences statistiquement
significatives, la phase de randomisation est rpte dans la mesure du possible. Chaque animal reoit un
numro didentification unique et en est marqu de manire permanente par tatouage, implant de micropuce ou toute autre mthode approprie.
PROTOCOLE
18. Il convient dutiliser des animaux des deux sexes. Leur nombre est suffisant pour qu la fin de ltude, chaque
groupe contienne un nombre de sujets permettant deffectuer une valuation statistique et biologique complte.
Pour les rongeurs, il convient normalement demployer au moins 20 animaux de chaque sexe chaque niveau
de dose, tandis que pour les non-rongeurs, un minimum de 4 animaux de chaque sexe par groupe est
recommand. Dans les tudes utilisant des souris, il peut tre ncessaire de prvoir des animaux supplmentaires
dans chaque groupe de dose pour pouvoir effectuer tous les examens hmatologiques requis.
Sacrifices en cours dtude, groupes satellites et animaux sentinelles
19. Ltude peut prvoir le sacrifice danimaux en cours dtude (au moins 10 animaux de chaque sexe par groupe),
par exemple 6 mois, afin de recueillir des donnes sur la progression des changements toxicologiques et des
informations mcanistiques, si cela est scientifiquement justifi. Si lon dispose dj de ces donnes, obtenues
antrieurement lors dtudes de toxicit doses rptes sur la substance dessai, les sacrifices en cours dtude
peuvent ne pas tre scientifiquement justifis. Des groupes satellites peuvent galement tre constitus, afin de
contrler la rversibilit des ventuelles altrations toxicologiques induites par la substance chimique tudie. En
gnral, ces investigations portent uniquement sur les doses maximales de ltude et sur le groupe tmoin. Un
groupe supplmentaire danimaux sentinelles (gnralement 5 animaux de chaque sexe) peut tre inclus si
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ncessaire pour le suivi de ltat pathologique au cours de ltude (22). Si des sacrifices en cours dtude ou
linclusion de groupes sentinelles ou satellites sont prvus, le nombre danimaux utiliss dans ltude est
augment du nombre danimaux que lon prvoit de sacrifier avant lachvement de ltude. Ces animaux
sont normalement sujets aux mmes observations que ceux soumis la phase de toxicit chronique de
ltude principale, notamment en ce qui concerne le poids corporel, la prise daliments et deau, les mesures
hmatologiques et de biochimie clinique et les examens pathologiques. Toutefois, des dispositions peuvent aussi
tre prises (dans les groupes danimaux sacrifis en cours dtude) pour limiter ces observations des mesures
essentielles spcifiques telles que la neurotoxicit ou limmunotoxicit.
Groupes de dose et dosage
20. Le document dorientation no 116 (6), donne des indications sur tous les aspects du choix des doses et des
carts entre les doses. Il convient dutiliser au moins trois doses et un groupe tmoin, sauf si un essai limite est
pratiqu (voir paragraphe 27). Les niveaux de doses seront gnralement bass sur les rsultats dtudes plus
court terme doses rptes, ou dtudes prliminaires de dtermination des concentrations, et prennent en
compte toutes les donnes toxicologiques et toxicocintiques existantes relatives la substance dessai ou aux
substances chimiques apparentes.
21. moins de contraintes dues la nature physico-chimique ou aux effets biologiques de la substance dessai, le
niveau de dose le plus lev est choisi de manire permettre didentifier les principaux organes cibles et les
effets toxiques de la substance, tout en vitant la souffrance, une toxicit svre ou une forte morbidit ou
ltalit chez les animaux tests. Compte tenu des facteurs prsents au paragraphe 22 ci-dessous, le niveau de
dose le plus lev est choisi pour provoquer une manifestation de toxicit, par exemple un ralentissement de la
prise de poids corporel (denviron 10 %).
22. Toutefois, en fonction des objectifs de ltude (voir paragraphe 6), on pourra choisir un niveau de dose maximal
plus faible que la dose qui provoque des signes de toxicit; par exemple une dose entranant un effet indsirable
proccupant, mais dont limpact sur lesprance de vie ou le poids corporel reste faible. La dose maximale ne
dpasse pas 1 000 mg/kg de poids corporel (dose limite, voir paragraphe 27).
23. Les niveaux de dose et les intervalles entre les doses peuvent tre choisis de manire pouvoir tablir une
relation dose-rponse et une DSENO ou tout autre rsultat escompt de ltude, notamment une DR (voir
paragraphe 25) au plus bas niveau de dose. Les facteurs prendre en compte dans le choix des faibles doses
sont notamment la pente attendue de la courbe dose-rponse, les doses qui provoquent des changements
mtaboliques importants ou qui modifient notablement le mode daction toxique, le niveau auquel on peut
prvoir un seuil, ou celui auquel on peut prvoir de fixer un point de dpart pour une extrapolation aux faibles
doses.
24. Les intervalles entre les doses dpendront des caractristiques de la substance dessai, et ne peuvent donc pas tre
prescrits dans la prsente mthode dessai, mais des intervalles correspondant un facteur 2 ou 4 sont souvent
les plus appropris entre les doses dcroissantes, et linclusion dun quatrime groupe dessai est souvent
prfrable la fixation de trs grands intervalles (correspondant par exemple un facteur de plus de 6
10) entre les doses. En gnral, les facteurs suprieurs 10 sont vits, et leur utilisation fait lobjet dune
justification.
25. Comme le prcise le document dorientation no 116 (6), les facteurs prendre en compte dans le choix des
doses sont notamment les suivants:
non-linarits ou points dinflexion connus ou supposs de la courbe dose-rponse,
toxicocintique et gammes de doses auxquelles linduction mtabolique, la saturation ou la non-linarit
entre des doses externes et internes surviennent ou non,
lsions prcurseurs, marqueurs deffets ou indicateurs du droulement de processus biologiques cls sousjacents,
aspects principaux (ou prsums) du mode daction, par exemple doses auxquelles une cytotoxicit
commence se manifester, les dosages hormonaux sont perturbs, les mcanismes homostatiques sont
dpasss, etc.,
rgions de la courbe dose-rponse ncessitant une estimation particulirement prcise, par exemple dans le
domaine de la DR prvue ou dun seuil prsum,
prise en compte des niveaux prvus dexposition humaine.
26. Le groupe tmoin est un groupe non-trait ou un groupe recevant le vhicule si la substance dessai est
administre dans un vhicule. Exception faite de ladministration de la substance dessai, les animaux du
groupe tmoin sont traits de la mme manire que ceux des groupes dessai. Si un vhicule est employ,
on administrera au groupe tmoin le plus grand volume de vhicule utilis pour les groupes traits. Si la
substance dessai est incorpore aux aliments et entrane une diminution sensible de la prise de nourriture lie
une moindre apptence de celle-ci, il pourra tre utile dutiliser un groupe tmoin supplmentaire nourri en
parallle, qui constituerait un tmoin plus appropri.
19.3.2014
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27. Sil est possible danticiper, en se basant sur les rsultats dtudes prliminaires, quun essai dose unique,
quivalant au moins 1 000 mg/kg poids corporel/jour, ralis en suivant les procdures dcrites pour la
prsente tude, ne produira probablement pas deffets indsirables, et si la toxicit est improbable compte
tenu des donnes disponibles sur les substances chimiques structurellement apparentes, on peut considrer
quune tude complte trois niveaux de dose nest pas indispensable. Une limite de 1 000 mg/kg poids
corporel/jour peut sappliquer sauf si lexposition humaine indique quil est ncessaire de recourir un
niveau de dose plus lev.
Prparation des doses et administration de la substance dessai
28. La substance dessai est normalement administre par voie orale, soit dans la nourriture ou leau de boisson, soit
par gavage. Des informations complmentaires sur les voies et mthodes dadministration figurent dans le
document dorientation no 116 (6). La voie et le mode dadministration dpendent de la finalit de ltude,
des proprits physico-chimiques de la substance dessai, de sa biodisponibilit, ainsi que de la voie et du mode
prdominants dexposition humaine. Il convient de justifier le choix de la voie et du mode dadministration.
Dans lintrt des animaux, le gavage oral nest normalement choisi que pour les substances pour lesquelles cette
voie et ce mode dadministration correspondent une voie dexposition potentielle raisonnable chez lhomme
(produits pharmaceutiques, par exemple). Dans le cas des produits chimiques alimentaires ou environnementaux,
notamment les pesticides, ladministration se fait dordinaire via le rgime alimentaire ou leau de boisson.
Toutefois, dans certains contextes, tels que lexposition professionnelle, ladministration par dautres voies
peut tre plus approprie.
29. Si ncessaire, la substance dessai est dissoute ou mise en suspension dans un vhicule appropri. Il convient de
prendre en compte les caractristiques suivantes du vhicule et des autres additifs, sil y a lieu: effets sur
labsorption, la rpartition, le mtabolisme ou la rtention de la substance dessai; effets sur les proprits
chimiques de la substance dessai susceptibles de modifier sa toxicit; et effets sur la prise daliments ou
deau, ou sur ltat nutritionnel des animaux. Il est recommand, chaque fois que les circonstances le permettent,
denvisager en premier lieu lutilisation dune solution ou dune suspension aqueuse, puis celle dune solution ou
dune mulsion dans une huile (par exemple huile de mas), et en dernier lieu celle dune solution dans dautres
vhicules. Les caractristiques de toxicit des vhicules autres que leau sont connues. Il convient de disposer
dinformations sur la stabilit de la substance dessai et sur lhomognit des solutions ou rations contenant les
diffrentes doses (selon les cas) dans les conditions dadministration (nourriture, par exemple).
30. Il importe de veiller ce que les quantits de substances administres dans les aliments ou leau de boisson
ninterfrent pas avec la nutrition ou avec lquilibre hydrique. Dans les tudes de toxicit long terme faisant
intervenir une administration par voie alimentaire, la concentration de la substance dessai dans les aliments ne
dpasse pas normalement 5 % de la ration totale, afin dviter les dsquilibres nutritionnels. Si la substance
dessai est incorpore la nourriture, on peut utiliser soit une concentration alimentaire constante (mg/kg
daliment ou ppm), soit un niveau de dose constant par rapport au poids corporel de lanimal (mg/kg de
poids corporel), calcul sur une base hebdomadaire. La solution choisie est spcifie.
31. En cas dadministration par voie orale, les animaux reoivent une dose quotidienne de la substance dessai (
raison de sept jours par semaine), et ce normalement pendant une priode de 12 mois (voir galement le
paragraphe 33) encore quune dure plus longue puisse tre requise selon les prescriptions rglementaires. Tout
autre rgime de dosage, par exemple une administration cinq jours par semaine, fait lobjet dune justification.
En cas dadministration par voie cutane, les animaux reoivent normalement le traitement pendant au moins
6 heures par jour, 7 jours par semaine, comme le prcise le chapitre B.9 de la prsente annexe (10), et ce
pendant une priode de 12 mois. Lexposition par inhalation est ralise pendant 6 heures par jour, 7 jours par
semaine, mais il est possible, si cela se justifie, de limiter lexposition 5 jours par semaine. La priode
dexposition est normalement de 12 mois. Si des espces de rongeurs autres que le rat sont exposes nez
seul, il est possible dajuster la dure maximale dexposition en fonction du stress propre ces espces. Le choix
dune dure dexposition infrieure 6 heures par jour devra tre justifi. Voir galement le chapitre B.8 de la
prsente annexe (8).
32. Lorsque la substance dessai est administre aux animaux par gavage, lopration est pratique aux mmes
moments de la journe au moyen dune sonde gastrique ou dune canule dintubation approprie. Normalement,
une dose unique sera administre une fois par jour mais lorsque, par exemple, la substance chimique est un
irritant local, il pourra tre envisag de maintenir la dose quotidienne en la fractionnant (deux fois par jour). Le
volume maximal de liquide pouvant tre administr en une fois dpend de la taille de lanimal dexprience. Le
volume est maintenu aussi faible que possible et ne dpasse pas normalement 1 ml/100 g de poids corporel
pour les rongeurs (22). Il convient de minimiser la variabilit du volume test en ajustant la concentration pour
obtenir un volume constant tous les niveaux de doses. Les substances potentiellement corrosives ou irritantes
sont lexception et leur dilution permet dviter tout effet local svre. Il convient dviter les concentrations
dessai susceptibles dtre corrosives ou irritantes pour le tube digestif.
Dure de ltude
33. Bien que la prsente mthode dessai concerne principalement des essais de toxicit chronique dune dure de
12 mois, le plan de ltude permet une application de dure plus courte (6 9 mois par exemple) ou plus
longue (18 24 mois), pour rpondre aux exigences de rgimes rglementaires particuliers ou obtenir des
donnes mcanistiques spcifiques. Les dviations par rapport une dure dexposition de 12 mois font lobjet
de justifications, surtout dans le cas de dures plus courtes. Les groupes satellites inclus pour contrler la
rversibilit des ventuelles altrations toxicologiques induites par la substance dessai sont maintenus sans
traitement, pendant une priode dau moins 4 semaines et dau plus un tiers de la dure totale de ltude,
aprs la cessation de lexposition. Le document dorientation no 116 (6) fournit des indications supplmentaires,
notamment en ce qui concerne la survie des animaux dexprience.
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OBSERVATIONS
34. Tous les animaux sont soumis un examen quotidien, gnralement en dbut et en fin de journe, fins de
semaine et jours fris compris, pour dterminer la morbidit et la mortalit. Des observations cliniques sont
effectues au moins une fois par jour, de prfrence au(x) mme(s) moment(s) de la journe, en tenant compte
du moment o lon prvoit que les effets des diffrentes doses atteindront leur intensit maximale aprs
administration par gavage.
35. Tous les animaux font lobjet dobservations cliniques dtailles au moins une fois avant la premire exposition
(pour permettre des comparaisons intra-individuelles), la fin de la premire semaine de ltude, et une fois par
mois ensuite. Les observations respectent un protocole qui rduit au minimum les variations entre observateurs,
et les rend indpendantes du groupe test. Ces observations sont effectues hors de la cage o sont logs les
animaux, de prfrence dans une enceinte normalise et heures fixes. Elles sont soigneusement consignes, de
prfrence en utilisant un systme de cotation explicitement dfini par le laboratoire qui ralise lessai. Les
conditions dobservation demeurent aussi constantes que possible. Les observations portent notamment porter
sur les symptmes suivants (sans que cette liste soit exhaustive): modifications de ltat de la peau, de la
fourrure, des yeux et des muqueuses, apparition de scrtions et dexcrtions, et ractions neurovgtatives
(par exemple, scrtion de larmes, horripilation, variation du diamtre pupillaire, respiration anormale). Il
convient galement de consigner les changements dans la dmarche, la posture et les ractions la manipu
lation, ainsi que la prsence de mouvements cloniques ou toniques et les comportements strotyps (par
exemple, toilettage excessif, parcours circulaires rptitifs) ou bizarres (par exemple, automutilation, marche
reculons) (24).
36. Avant la premire administration de la substance dessai, tous les animaux font lobjet dun examen ophtalmo
logique effectu laide dun ophtalmoscope ou de tout autre appareil appropri. lissue de ltude, cet examen
est ralis de prfrence sur tous les animaux, mais au moins sur ceux du groupe traits la dose la plus leve
et du groupe tmoin. Si des altrations oculaires lies au traitement sont dtectes, tous les animaux sont
examins. Si lanalyse structurale ou dautres donnes suggrent une toxicit oculaire, il faut augmenter la
frquence des examens oculaires.
37. Dans le cas de substances ayant prsent un potentiel dinduction deffets neurotoxiques lors dessais antrieurs
de toxicit doses rptes sur 28 jours et/ou 90 jours, une vrification de la ractivit sensorielle diffrents
types de stimuli (24) (stimuli auditifs, visuels ou proprioceptifs, par exemple) (25) (26) (27), et une valuation de
la force de prhension (28) ainsi que de lactivit motrice (29) pourront tre menes en option. Elles seront
ralises avant le dbut de ltude et tous les 3 mois par la suite, jusqu 12 mois inclusivement, ainsi qu la fin
de ltude (si celle-ci dure plus de 12 mois). On trouvera dans les rfrences bibliographiques susmentionnes
une description plus dtaille des modes opratoires. Toutefois, dautres modes opratoires que ceux figurant
dans ces rfrences sont galement utilisables.
38. Dans le cas de substances ayant prsent un potentiel dinduction deffets immunotoxiques lors dessais ant
rieurs de toxicit doses rptes sur 28 jours et/ou 90 jours, dautres examens sur cet effet peuvent tre mens
en option la fin de ltude.
Poids corporel, prise daliments et deau, et efficacit nutritionnelle
39. Tous les animaux sont pess au dbut du traitement, au moins une fois par semaine pendant les 13 premires
semaines, puis au moins une fois par mois. La prise daliments et lefficacit alimentaire sont aussi mesures au
moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Lorsque la
substance dessai est administre dans leau de boisson, la prise deau est mesure au moins une fois par semaine
pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Il peut galement tre utile de mesurer la
prise deau dans les tudes o celle-ci est modifie.
Hmatologie et biochimie clinique
40. Dans les tudes faisant intervenir des rongeurs, des examens hmatologiques sont effectus sur au moins
10 mles et 10 femelles de chaque groupe, 3, 6 et 12 mois, ainsi qu la fin de ltude (si celle-ci dure
plus de 12 mois), en utilisant les mmes animaux tout au long de ltude. Si des souris sont utilises, il peut tre
ncessaire de constituer des groupes satellites afin de pouvoir effectuer tous les examens hmatologiques requis
(voir paragraphe 18). Dans les tudes faisant intervenir des non- rongeurs, les chantillons seront prlevs sur un
plus petit nombre danimaux (par exemple, 4 animaux de chaque sexe par groupe dans les tudes chez le chien)
des stades intermdiaires et la fin de ltude, de la mme manire que chez les rongeurs. Il ne sera pas
ncessaire deffectuer des examens 3 mois, chez les rongeurs comme chez les autres animaux, si aucun effet
sur les paramtres hmatologiques na t observ lors dune tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux
de doses comparables. Les chantillons de sang sont prlevs en un point dtermin, par exemple par ponction
cardiaque ou au niveau du sinus rtro-orbitaire, sous anesthsie.
41. Les investigations portent sur les paramtres suivants (30): numration leucocytaire totale et diffrentielle,
numration rythrocytaire et plaquettaire, concentration dhmoglobine, hmatocrite (volume cellulaire
sanguin aprs centrifugation), volume corpusculaire moyen (VCM), hmoglobine corpusculaire moyenne
(HCM), concentration dhmoglobine corpusculaire moyenne (CHCM), temps de prothrombine et temps de
thromboplastine partielle active. Dautres paramtres hmatologiques tels que les corps de Heinz et autres
anomalies morphologiques rythrocytaires ou la mthmoglobine peuvent tre tudis si ncessaire en fonction
de la toxicit de la substance dessai. Dans lensemble, il convient dadapter lapproche suivie leffet observ
et/ou attendu dune substance dessai donne. Si la substance dessai exerce un effet sur le systme hmato
potique, des numrations rticulocytaires et une cytologie mdullaire peuvent galement tre indiques mais
nont pas tre pratiques de manire systmatique.
19.3.2014
19.3.2014
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42. Des analyses de biochimie clinique visant tudier les principaux effets toxiques sur les tissus, et en particulier
sur le rein et le foie, sont effectues partir dchantillons de sang prlevs sur au moins 10 mles et 10
femelles de chaque groupe, des intervalles de temps semblables ceux spcifis pour les examens hmato
logiques, et en utilisant les mmes animaux tout au long de ltude. Si des souris sont utilises, il peut tre
ncessaire de constituer des groupes satellites afin de pouvoir effectuer toutes les analyses de biochimie clinique
ncessaires. Dans les tudes faisant intervenir des non-rongeurs, les chantillons seront prlevs sur un plus petit
nombre danimaux (par exemple, 4 animaux de chaque sexe par groupe dans les tudes chez le chien) des
stades intermdiaires et la fin de ltude, de la mme manire que chez les rongeurs. Il ne sera pas ncessaire
deffectuer des examens 3 mois, chez les rongeurs comme chez les autres animaux, si aucun effet sur les
paramtres de biochimie clinique na t observ lors dune tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux
de doses comparables. Il est recommand de faire jener les animaux ( lexception des souris) pendant la nuit
qui prcde la prise de sang. Les investigations portent sur les paramtres suivants (30): glucose, ure (azote
urique), cratinine, protines totales, albumine, calcium, sodium, potassium, cholestrol total, au moins deux
enzymes rvlatrices des effets hpatocellulaires (alanine aminotransfrase, aspartate aminotransfrase, glutamate
dshydrognase, acides biliaires totaux) (31) et au moins deux enzymes rvlatrices des effets hpatobiliaires
(phosphatase alcaline, gamma-glutamyl transfrase, 5- nuclotidase, bilirubine totale, acides biliaires totaux) (31).
Dautres paramtres de chimie clinique, tels que les triglycrides jeun, des hormones spcifiques et la choli
nestrase peuvent tre mesurs si ncessaire en fonction en fonction de la toxicit de la substance dessai. Dans
lensemble, il convient dadapter lapproche suivie leffet observ et/ou attendu dune substance dessai donne.
43. Des analyses durine sont effectues partir dchantillons prlevs sur au moins 10 mles et 10 femelles de
chaque groupe, des intervalles de temps semblables ceux spcifis pour les examens hmatologiques et de
chimie clinique. Il ne sera pas ncessaire deffectuer des dosages 3 mois si les analyses durine pratiques dans
le cadre dune tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux de doses comparables nont rvl aucun effet.
La liste suivante de paramtres tudier fait partie dune recommandation dexperts relative aux tudes de
pathologie clinique (30): aspect, volume, osmolalit ou poids spcifique, pH, protines totales et glucose.
Dautres mesures, notamment la recherche de corps ctoniques, durobilinogne, de bilirubine et de sang occulte,
peuvent aussi tre ralises. Ltude dautres paramtres peut aussi savrer ncessaire pour largir les recherches
sur leffet ou les effets observs.
44. On considre gnralement que dans les tudes portant sur des chiens, il convient de dterminer les variables
hmatologiques et de biochimie clinique de base avant le dbut du traitement, mais que ce nest pas indispen
sable dans les tudes portant sur des rongeurs (30). Toutefois, si lon ne dispose pas de donnes historiques de
base appropries (voir paragraphe 50), il convient denvisager den obtenir
Pathologie
Autopsie macroscopique
45. Tous les animaux de ltude font normalement lobjet dune autopsie macroscopique complte et dtaille,
comprenant un examen attentif de la surface externe du corps et de tous les orifices ainsi que des cavits
crnienne, thoracique et abdominale et de leur contenu. Toutefois, des dispositions peuvent aussi tre prises
(dans les groupes danimaux sacrifis en cours dtude ou les groupes satellites) pour limiter ces observations
des mesures essentielles telles que la neurotoxicit ou limmunotoxicit (voir paragraphe 19). Il nest pas
ncessaire que ces animaux fassent lobjet dune autopsie, ni des procdures ultrieures dcrites dans les para
graphes qui suivent. Lautopsie des animaux sentinelles peut devoir tre effectue au cas par cas, la discrtion
du directeur dtude.
46. Il convient de dterminer le poids des organes de tous les animaux hormis ceux mentionns dans la dernire
partie du paragraphe 45. Les glandes surrnales, le cerveau, les pididymes, le cur, les reins, le foie, les ovaires,
la rate, les testicules, la thyrode (pese aprs fixation, avec les glandes parathyrodes) et lutrus de tous les
animaux (except ceux trouvs moribonds et/ou ayant t sacrifis en cours dtude) sont dbarrasss, le cas
chant, de tout tissu adhrent et pess ltat frais ds que possible aprs la dissection, pour prvenir la
dessiccation. Dans les tudes chez la souris, la pese des glandes surrnales est facultative.
47. Les tissus suivants sont conservs dans le milieu de fixation le plus appropri, la fois pour le type de tissu et
pour lexamen histopathologique prvu (32) (lexamen des tissus indiqus entre crochets est facultatif):
toutes les lsions macro
scopiques
ganglions lymphatiques
(superficiels et profonds)
muscle squelettique
rein
aorte
glande coagulante
nerf priphrique
[sternum]
[bulbe olfactif]
glande de Harder
[voies respiratoires sup

rieures dont nez, cornets
et sinus paranasaux]
testicule
ccum
glande lacrymale (exor

bitale)
il (dont rtine)
thymus
cerveau (y compris
segments dencphale, de
cervelet et de bulbe rachi
dien/pont)
glande mammaire (obli

gatoire pour les femelles
et, si visible la dissec
tion, aussi pour les
mles)
sophage
thyrode
cur
glande salivaire
ovaire
trache
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col utrin
glande surrnale
pancras
[uretre]
clon
hypophyse
parathyrode
[urtre]
[dents]
ilon
peau
utrus (col inclus)
duodnum
jjunum
poumon
vagin
pididyme
[langue]
prostate
vsicule biliaire (pour les

espces autres que le rat)
estomac (pr-estomac,
estomac glandulaire)
moelle pinire (niveaux

cervical, msothoracique
et lombaire)
rate
vsicule sminale
[fmur avec articulation]
segment de moelle
osseuse et/ou moelle
osseuse frachement
ponctionne
rectum
vessie
foie
Dans le cas des organes allant par paires, par exemple les reins ou les glandes surrnales, les deux organes sont
prservs. Les observations, notamment cliniques, peuvent amener examiner dautres tissus. Tous les organes
considrs comme des organes cibles potentiels du fait des proprits connues de la substance dessai sont aussi
conservs. Dans les tudes portant sur une administration par la voie cutane, il y a lieu de conserver les
organes figurant sur la liste tablie pour la voie orale, et de procder un prlvement et une conservation
spcifiques de la peau provenant du site dapplication. Pour les tudes par inhalation, la liste des tissus des voies
respiratoires conservs et examins est conforme aux recommandations des chapitres B.8 (8) et B.29 (9) de la
prsente annexe. Pour les autres organes et tissus (outre les tissus de lappareil respiratoire spcifiquement
conservs), il convient dexaminer les organes de la liste tablie pour la voie orale.
Histopathologie
48. Des informations sont disponibles sur les meilleures pratiques en matire de conduite des tudes de pathologie
toxicologique (32). Au minimum, les examens histopathologiques devront porter sur les tissus suivants:
tous les tissus prlevs dans le groupe dose leve et le groupe tmoin,
tous les tissus prlevs sur les animaux morts ou sacrifis au cours de ltude,
tous les tissus prsentant des anomalies macroscopiques,
tissus des organes cibles, ou tissus prsentant des altrations dues au traitement dans le groupe dose leve,
prlevs sur tous les animaux de tous les autres groupes de doses,
dans le cas des organes allant par paires, comme les reins ou les glandes surrnales, les deux organes sont
examins.
RSULTATS ET RAPPORT
Rsultats
49. Des donnes sont recueillies pour chaque animal sur tous les paramtres valus. En outre, toutes les donnes
sont rsumes sous forme de tableaux synoptiques indiquant, pour chaque groupe exprimental, le nombre
danimaux au dbut de lessai, le nombre danimaux trouvs morts au cours de lessai ou euthanasis, le moment
de la mort ou du sacrifice, le nombre danimaux prsentant des signes de toxicit, la description des signes de
toxicit observs, ainsi que le moment de lapparition, la dure et la gravit de tous les effets toxiques observs,
le nombre danimaux prsentant des lsions, les types de lsions et le pourcentage danimaux prsentant chaque
type de lsion. Les tableaux rcapitulatifs prsentent les moyennes et les carts types (pour les donnes recueillies
en continu) pour les animaux prsentant des effets toxiques ou des lsions, ainsi quune cotation des lsions.
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50. Les donnes de contrle historiques peuvent faciliter linterprtation des rsultats de ltude, par exemple lorsque
les donnes provenant des tmoins concurrents semblent diverger de manire significative de donnes rcentes
obtenues sur des animaux tmoins issus de la mme installation dessai/colonie dlevage. Si elles sont values,
les donnes de contrle historiques manent du mme laboratoire et porter sur des animaux du mme ge et de
la mme souche, produits dans les cinq ans prcdant ltude en question.
51. Si possible, les rsultats numriques devront tre valus laide dune mthode statistique approprie et
largement reconnue. Les mthodes statistiques et les donnes analyser sont choisies au moment de la
conception de ltude (paragraphe 8). Ce choix permet doprer des ajustements en fonction de la survie, si
ncessaire.
Rapport dessai
52. Le rapport dessai mentionne les informations suivantes:
Substance dessai:
donnes didentification,
provenance de la substance dessai,
numro de lot,
certificat danalyse chimique.
Vhicule (le cas chant):
justification du choix de vhicule (sil est autre que leau).
Animaux dexprience:
espce/souche utilise et justification du choix opr,
nombre, ge et sexe des animaux au dbut de lessai,
provenance, conditions dencagement, rgime alimentaire, etc.,
poids de chaque animal au dbut de lessai.
justification de la voie dadministration et du choix des doses,
le cas chant, mthodes statistiques utilises pour analyser les donnes,
dtails concernant la formulation de la substance dessai ou son incorporation dans les aliments,
donnes analytiques sur la concentration obtenue, la stabilit et lhomognit de la prparation,
voie dadministration et dtails concernant ladministration de la substance dessai,
pour les tudes par inhalation, mention de la voie dentre (nez seul ou corps entier),
doses relles (mg/kg de poids corporel/jour) et, le cas chant, facteur de conversion en dose relle de la
concentration de la substance dessai (en mg/kg ou en ppm) dans les aliments ou leau de boisson,
dtails concernant la qualit de lalimentation et de leau de boisson.
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Rsultats (les rsultats comprendront des donnes gnrales sous forme de tableaux synoptiques et des donnes propres
chaque animal):
donnes sur la survie,
poids corporel/variations du poids corporel,
prise daliments, calculs de lefficacit alimentaire, si effectus, et prise deau, le cas chant,
rponse toxique par sexe et dose, y compris signes de toxicit,
nature, incidence (et, si elle est value, svrit), et dure des observations cliniques (transitoires ou
permanentes),
examen ophtalmologique,
examens hmatologiques,
preuves de biochimie clinique,
examens durine,
rsultats des recherches de neurotoxicit ou dimmunotoxicit,
poids corporel lissue de lessai,
poids des organes (et leur rapport au poids corporel, le cas chant),
rsultats dautopsie,
description dtaille de tous les rsultats histopathologiques lis au traitement,
donnes relatives labsorption, le cas chant.
Traitement statistique des rsultats, le cas chant
Discussion des rsultats, notamment:
relations dose-rponse,
examen de toutes les informations concernant le mode daction,
examen de toutes les approches de modlisation,
dtermination des DR, DSENO et DMENO (dose minimale avec effet nocif observ),
donnes de contrle historiques,
applicabilit des rsultats ltre humain.
Conclusions
BIBLIOGRAPHIE:
(1) OCDE (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity
Testing (Rome, 1995), document de travail interne, direction de lenvironnement, OCDE, Paris.
(2) Combes R.D., Gaunt I., Balls M. (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health
Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System.
ATLA 32: 163-208.
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(8) Chapitre B.8 de la prsente annexe, Toxicit subaigu par inhalation: tude sur 28 jours.
(9) Chapitre B.29 de la prsente annexe, Toxicit subchronique par inhalation: tude sur 90 jours.
(10) Chapitre B.9 de la prsente annexe, Toxicit cutane doses rptes tude sur 28 jours.
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Appendice 1
DFINITION

B.32. TUDES DE CANCROGENSE
INTRODUCTION
1.
chimiques. La ligne directrice 451 initiale sur les tudes de cancrogense a t adopte en 1981. Sa rvision a
t juge ncessaire afin de tenir compte des volutions rcentes dans le domaine du bien-tre animal, ainsi que
des nouvelles exigences rglementaires (2) (3) (4) (5) (6). La mise jour de la prsente mthode dessai B.32 a t
effectue en parallle avec la rvision des chapitres B.30 (tudes de toxicit chronique) et B.33 (tudes combines
de toxicit chronique et de cancrogense) de la prsente annexe, dans le but dobtenir des informations
additionnelles partir des animaux utiliss dans ltude, et de fournir des prcisions concernant le choix des
doses. La prsente mthode dessai B.32 vise les essais portant sur une large gamme de produits chimiques, dont
des pesticides et des produits chimiques industriels. Il convient toutefois de noter que certains aspects et certaines
dispositions peuvent diffrer pour les produits pharmaceutiques (voir la Confrence internationale sur lharmo
nisation, thme S1B: valuation de la cancrognicit des produits pharmaceutiques).
2.
La plupart des tudes de cancrogense tant menes sur des espces de rongeurs, la prsente mthode dessai est
destine sappliquer principalement des tudes ralises avec ces espces. Sil savrait ncessaire de mener de
telles tudes avec des non-rongeurs, il conviendrait dappliquer, moyennant des modifications appropries, les
principes et procdures dcrits dans la prsente mthode dessai et au chapitre B.27 Toxicit orale doses
rptes non-rongeurs: 90 jours de la prsente annexe (6). Des informations complmentaires peuvent aussi
tre trouves dans le document dorientation de lOCDE no 116 sur llaboration et la conduite des tudes de
toxicit chronique et de cancrogense (7).
3.
Les trois principales voies dadministration utilises dans les tudes de cancrogense sont la voie orale, la voie
cutane et linhalation. Le choix de la voie dadministration dpend des caractristiques physiques et chimiques de
la substance dessai et de la voie dexposition prdominante chez lhomme. Des informations complmentaires
sur le choix de la voie dexposition sont fournies dans le document dorientation no 116 (7).
4.
La prsente mthode dessai porte principalement sur lexposition par voie orale, la voie la plus communment
utilise dans les tudes de cancrogense. Bien que des tudes de cancrogense utilisant lexposition par voie
cutane ou par inhalation puissent aussi tre ncessaires pour valuer le risque pour la sant humaine et/ou
exiges en vertu de certains rgimes rglementaires, ces deux voies dexposition ncessitent des dispositifs
techniques dune grande complexit. De telles tudes devront tre conues au cas par cas, encore que la prsente
mthode dessai, qui porte sur la caractrisation et lvaluation de la cancrognicit par voie orale, puisse fournir
les bases dun protocole dtude par voie cutane ou par inhalation, notamment en ce qui concerne les
recommandations relatives aux dures de traitement, aux paramtres cliniques et pathologiques, etc. Il existe
des documents dorientation de lOCDE sur ladministration exprimentale de substances dessai par voie cutane
(7) et par inhalation (7) (8). Les chapitres B.8 (9) et B.29 (10) de la prsente annexe, ainsi que le document
dorientation de lOCDE sur lessai de toxicit aigu par inhalation (8), mritent tout particulirement dtre
consults lors de la conception dtudes long terme portant sur une exposition par inhalation. Le chapitre B.9
de la prsente annexe (11) doit tre consult dans le cas dun essai portant sur la voie cutane.
5.
Ltude de cancrogense donne des lments dinformation sur les risques pour la sant susceptibles de dcouler
dune exposition rpte pendant une priode pouvant couvrir la vie entire de lespce considre. Ltude
fournit des informations sur les effets toxiques de la substance dessai, y compris sur son pouvoir cancrogne, et
peut indiquer les organes cibles et la possibilit daccumulation dans ces organes. Elle peut aussi donner une
estimation de la dose sans effet nocif observ pour ce qui est des effets toxiques et, dans le cas des substances
cancrognes non gnotoxiques, des rponses tumorales. Cette estimation permet dtablir les critres de scurit
concernant lexposition humaine. De plus, il convient daccorder une attention particulire lobservation
clinique des animaux afin dobtenir le plus dinformations possibles.
6.
Les objectifs des tudes de cancrogense couvertes par la prsente mthode dessai sont les suivants:
identification des proprits cancrognes dune substance dessai susceptibles daugmenter les risques de
noplasmes, la frquence de survenue de noplasmes malins ou la diminution du temps ncessaire leur
apparition, par rapport aux groupes tmoins concurrents,
identification dun ou de plusieurs organes cibles de la cancrogense,
identification du temps dapparition des noplasmes,
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caractrisation de la relation entre la dose administre et la rponse tumorale,

identification du niveau de dose sans effet nocif observ (DSENO) ou du point de dpart pour ltablissement
dune dose de rfrence (DR),
extrapolation des effets cancrognes aux niveaux dexposition humaine correspondant de faibles doses,
obtention de donnes permettant de vrifier les hypothses concernant le mode daction (2) (7) (12) (13) (14)
(15).
7.
Pour caractriser et valuer la cancrognicit potentielle dun produit chimique, le laboratoire charg de ltude
prend en compte toutes les informations disponibles sur la substance dessai avant de raliser ltude, afin de
pouvoir orienter celle-ci de manire tester plus efficacement le potentiel cancrogne de la substance, et faire le
moins possible appel aux animaux. La connaissance du mode daction dun agent cancrogne suspect et sa
prise en compte (2) (7) (12) (13) (14) (15) sont particulirement importantes puisque la conception optimale de
lessai peut diffrer selon que la substance dessai est ou nest pas un agent cancrogne gnotoxique connu ou
suspect. Des informations complmentaires sur certains aspects du mode daction peuvent tre trouves dans le
document dorientation no 116 (7).
8.
Les informations utiles pour concevoir ltude sont notamment: lidentit, la structure chimique et les proprits
physico-chimiques de la substance dessai; les rsultats de toutes les tudes de toxicit in vitro ou in vivo menes
et notamment des essais de gnotoxicit; lutilisation (les utilisations) prvue(s) et le potentiel dexposition
humaine; les donnes (Q)SAR disponibles et les donnes toxicologiques (par exemple mutagnicit, gnotoxicit
et pouvoir cancrogne) relatives aux substances chimiques structurellement apparentes; les donnes toxicoci
ntiques disponibles (dose unique et doses rptes, si ces donnes existent) et les rsultats dautres tudes
doses rptes. La caractrisation du pouvoir cancrogne est effectue aprs obtention des premiers rsultats
dessais de toxicit doses rptes mens sur 28 jours et/ou 90 jours. Les essais dinitiation-promotion de
cancers court terme peuvent aussi livrer des informations utiles. Il convient denvisager ladoption dune
approche par tapes pour ltude exprimentale de la cancrogense entreprise dans le cadre de lvaluation
globale des effets nocifs potentiels dune substance dessai (16) (17) (18) (19).
9.
statistiques doivent prendre en compte lajustement en fonction de la survie, lanalyse des risques de tumeurs
cumules lis la dure de survie, lanalyse du temps ncessaire lapparition dune tumeur et lanalyse effectue
en cas de mort prmature des animaux dun ou de plusieurs groupes. On trouvera des indications concernant
les analyses statistiques appropries, ainsi que des rfrences cls des mthodes statistiques reconnues au plan
international, dans le document dorientation no 116 (7), ainsi que dans le document dorientation no 35 sur
lanalyse et lvaluation des tudes de toxicit chronique et de cancrogense (20).
10. Lors de la ralisation dune tude de cancrogense, il est recommand de toujours suivre les principes et
considrations noncs dans le document dorientation no 19 de lOCDE sur la reconnaissance, lvaluation et
lutilisation des signes cliniques comme effets observs thiquement acceptables dans les exprimentations
stipule ce qui suit: Dans les tudes comportant ladministration de doses rptes, lorsquun animal prsente des signes
lessai, dinterrompre ladministration de la substance dessai pour soulager la douleur ou la dtresse de lanimal, ou de rduire
la dose teste.
les tudes de toxicit chronique et de cancrogense dans le document dorientation no 116 (7), ainsi que dans
doses dpend du ou des principaux objectifs de ltude (paragraphe 6). En choisissant des niveaux de doses
appropris, il convient de trouver un quilibre entre, dune part, lidentification des dangers et, dautre part, la
caractrisation des rponses aux faibles doses et leur pertinence. Cet quilibre est particulirement ncessaire dans
le cas o une tude combine de toxicit chronique et de cancrogense (chapitre B.33 de la prsente annexe) est
mene (paragraphe 12).
12. Il convient dexaminer lopportunit de raliser une tude combine de toxicit chronique et de cancrogense
(chapitre B.33 de la prsente annexe) plutt que de raliser sparment une tude de toxicit chronique (chapitre
B.30 de la prsente annexe) et une tude de cancrogense (la prsente mthode dessai B.32). Lessai combin
permet une meilleure efficacit en temps et en cots par rapport la conduite de deux essais spars, et ne
compromet pas la qualit des donnes de la phase chronique ou de la phase de cancrogense. Lors de la
ralisation dune tude combine (chapitre B.33 de la prsente annexe), il convient toutefois de respecter les
principes dterminant le choix de la dose (paragraphes 11 et 22 25) et il est galement reconnu que certains
cadres rglementaires peuvent imposer la conduite dtudes spares.
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13. Les dfinitions utilises dans le contexte de la prsente mthode dessai figurent la fin du prsent chapitre et
dans le document dorientation no 116 (7).
PRINCIPE DE LESSAI
14. La substance dessai est administre quotidiennement diffrents groupes danimaux, pendant la plus grande
partie de leur vie, des doses progressives et habituellement par la voie orale. Les essais par inhalation ou par la
voie cutane peuvent aussi tre appropris. Les animaux sont observs attentivement pendant la priode dad
ministration afin de dceler dventuels signes de toxicit et le dveloppement de lsions noplasiques. Les
animaux qui meurent ou sont sacrifis en cours dessai sont autopsis et, au terme de lessai, les animaux
survivants sont sacrifis et autopsis.
15. La prsente mthode dessai traite principalement de la caractrisation et de lvaluation de la cancrognicit
chez les rongeurs (paragraphe 2). Le recours des espces autres que des rongeurs peut tre envisag si les
donnes disponibles laissent escompter une meilleure prdiction des effets de la substance sur la sant humaine.
Dans ce cas, le choix de lespce est justifi. Lespce de rongeur prfre est le rat, mais dautres rongeurs comme
la souris peuvent tre utiliss. Bien que le recours la souris dans les tudes de cancrogense puisse ne
prsenter quun intrt limit (24) (25) (26), certains programmes rglementaires actuels exigent tout de
mme la conduite dessais de cancrogense sur la souris, sauf lorsquil est tabli quune telle tude nest pas
ncessaire sur le plan scientifique. Les rats et les souris sont les modles exprimentaux choisis de prfrence, en
raison de leur dure de vie relativement courte, de leur utilisation frquente dans les tudes pharmacologiques et
toxicologiques, de leur sensibilit linduction de tumeurs et de la disponibilit de souches suffisamment
caractrises. Ces caractristiques permettent dobtenir une grande quantit dinformations sur la physiologie
et la pathologie de ces animaux. Des informations additionnelles sur le choix des espces et des souches sont
disponibles dans le document dorientation no 116 (7).
16. Il convient demployer des animaux adultes sains, de souches communment utilises dans les laboratoires.
Ltude de cancrogense sera effectue de prfrence sur des animaux de mme souche et de mme provenance
que ceux utiliss dans ltude (les tudes) de toxicit prliminaire(s) de plus courte dure. Si toutefois ces animaux
sont rputs ne pas rpondre aux critres de survie gnralement admis dans les tudes long terme [voir le
document dorientation no 116 (7)], il convient denvisager dutiliser une souche dun animal dont le taux de
survie permette de raliser une tude long terme. Les femelles sont nullipares et non gravides.

17. Les animaux peuvent tre logs individuellement ou runis dans des cages en petits groupes du mme sexe,
lhbergement individuel ntant envisager que dans des cas scientifiquement justifis (27) (28) (29). Les cages
sont places de faon telle que linfluence ventuelle de leur disposition sur les rsultats de ltude soit rduite au
minimum. La temprature du local des animaux dexprience est de 22 C ( 3 C). Lhumidit relative est dau
moins 30 % et nexcde pas de prfrence 70 % en dehors des moments o le local est nettoy, lidal tant
quelle soit comprise entre 50 et 60 %. Lclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumire et 12 heures
dobscurit. Le rgime alimentaire peut tre un rgime classique de laboratoire avec eau potable satit. Il
mtaux lourds et mycotoxines, par exemple) est aussi faible que possible. Des donnes analytiques sur les teneurs
en nutriments et en contaminants alimentaires sont recueillies rgulirement, au moins au dbut de ltude et
lors des changements de lots; ces donnes figurent dans le rapport final. Des donnes analytiques sur leau de
boisson utilise lors de ltude sont de mme fournies. Le choix du rgime alimentaire peut tre influenc par la
ncessit dassurer un mlange convenable de la substance dessai et de satisfaire les besoins nutritionnels des
animaux lorsque la substance dessai est administre dans la nourriture.

18. Il convient dutiliser des animaux sains, acclimats aux conditions de laboratoire depuis au moins 7 jours et
Au dbut de ltude, la variation de poids des animaux de chaque sexe est minimale et nexcde pas 20 % du
significatives, la phase de randomisation est rpte dans la mesure du possible. Chaque animal reoit un numro
didentification unique et en est marqu de manire permanente par tatouage, implant de micropuce ou toute
autre mthode approprie.
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PROTOCOLE
19. Il convient dutiliser des animaux des deux sexes. Leur nombre est suffisant pour permettre une valuation
biologique et statistique complte. Chaque groupe de dose, de mme que chaque groupe tmoin correspondant,
comprend au moins 50 animaux de chaque sexe. Selon le but de ltude, il est possible daugmenter la puissance
statistique des principales estimations en rpartissant les animaux de manire diffrencie entre les groupes de
doses, avec plus de 50 animaux dans les groupes faibles doses pour estimer par exemple la cancrognicit aux
faibles doses. Il convient toutefois de noter quune augmentation modre de la taille dun groupe entranera une
augmentation relativement faible de la puissance statistique de ltude. On trouvera des donnes complmentaires
sur la conception statistique de ltude, et sur le choix de niveaux de doses permettant doptimiser la puissance
statistique, dans le document dorientation no 116 (7).
Sacrifices en cours dtude et groupes satellites (sentinelles)
20. Ltude peut prvoir le sacrifice danimaux en cours dtude, par exemple 12 mois, afin de recueillir des
donnes sur la progression des altrations noplasiques et des donnes mcanistiques, si cela est scientifiquement
justifi. Si lon dispose dj de ces donnes, obtenues antrieurement lors dtudes de toxicit doses rptes sur
la substance dessai, les sacrifices en cours dtude peuvent ne pas tre scientifiquement justifis. Sils sont
nanmoins inclus dans ltude, les groupes danimaux traits destins tre sacrifis en cours dtude comptent
normalement 10 animaux de chaque sexe, et le nombre total danimaux utiliss dans ltude est augment du
nombre danimaux que lon prvoit de sacrifier avant lachvement de ltude. Un groupe supplmentaire
danimaux sentinelles (gnralement 5 animaux de chaque sexe) peut tre inclus si ncessaire pour le suivi de
ltat pathologique au cours de ltude (30). Des informations complmentaires figurent dans le document
dorientation no 116 (7).
Groupes de dose et dosage
21. Le document dorientation no 116 (7) donne des indications sur tous les aspects du choix des doses et des carts
entre les doses. Il convient dutiliser au moins trois doses et un groupe tmoin. Les niveaux de doses seront
gnralement bass sur les rsultats dtudes plus court terme doses rptes, ou dtudes prliminaires de
dtermination des concentrations, et prennent en compte toutes les donnes toxicologiques et toxicocintiques
existantes relatives la substance dessai ou aux substances chimiques apparentes.
effets toxiques de la substance tout en vitant la souffrance, une toxicit svre ou une forte morbidit ou ltalit
chez les animaux tests. Compte tenu des facteurs mentionns au paragraphe 23 ci-dessous, la plus forte dose est
normalement choisie pour provoquer une manifestation de toxicit, par exemple un ralentissement de la prise de
poids corporel (denviron 10 %). Toutefois, en fonction des objectifs de ltude (voir paragraphe 6), on pourra
choisir un niveau de dose maximal plus faible que la dose qui provoque des signes de toxicit, par exemple une
dose entranant un effet ngatif proccupant mais dont limpact sur lesprance de vie ou le poids corporel reste
faible.
23. Les niveaux de doses et les intervalles entre les doses peuvent tre choisis de manire pouvoir tablir une
relation dose-rponse et, selon le mode daction de la substance dessai, une DSENO ou tout autre rsultat
escompt de ltude, notamment une DR (voir paragraphe 25) au plus bas niveau de dose. Les facteurs prendre
en compte dans le choix des faibles doses sont notamment la pente attendue de la courbe dose-rponse, les
doses qui provoquent des changements mtaboliques importants ou qui modifient notablement le mode daction
toxique, le niveau auquel on peut prvoir un seuil, ou celui auquel on peut prvoir de fixer un point de dpart
pour une extrapolation aux faibles doses.
24. Les intervalles entre les doses dpendront des caractristiques de la substance dessai, et ne peuvent donc pas tre
prescrits dans la prsente mthode dessai, mais des intervalles correspondant un facteur 2 ou 4 sont souvent
les plus appropris entre les doses dcroissantes, et linclusion dun quatrime groupe dessai est souvent
prfrable la fixation de trs grands intervalles (correspondant par exemple un facteur de plus de 6 10)
entre les doses. En gnral, les facteurs suprieurs 10 sont vits, et leur utilisation est justifie.
25. Comme le prcise le document dorientation no 116 (7), les facteurs prendre en compte dans le choix des doses
sont notamment les suivants:
toxicocintique et gammes de doses auxquelles linduction mtabolique, la saturation ou la non-linarit entre
les doses internes et externes surviennent ou non,
commence se manifester, les dosages hormonaux sont modifis, les mcanismes homostatiques sont
dpasss, etc.,
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prise en compte des niveaux prvus dexposition humaine.
26. Le groupe tmoin sera un groupe non trait ou un groupe recevant le vhicule si la substance est administre
dans un vhicule. Exception faite de ladministration de la substance dessai, les animaux du groupe sont traits
de la mme manire que ceux des groupes dessai. Si un vhicule est employ, on administrera au groupe tmoin
le plus grand volume de vhicule utilis pour les groupes traits. Si la substance dessai est incorpore aux
aliments et entrane une diminution sensible de la prise de nourriture lie une moindre apptence de celle-ci, il
pourra tre utile dutiliser un groupe tmoin supplmentaire nourri en parallle, qui constituerait un tmoin plus
appropri.
des proprits physico-chimiques de la substance dessai, de sa biodisponibilit ainsi que de la voie et du mode
prdominants dexposition humaine. Il convient de justifier le choix de la voie et du mode dadministration. Dans
lintrt des animaux, le gavage oral nest normalement choisi que pour les substances pour lesquelles cette voie
et ce mode dadministration correspondent une voie dexposition potentielle raisonnable chez lhomme (pro
duits pharmaceutiques, par exemple). Dans le cas des produits chimiques alimentaires ou environnementaux,
Toutefois, dans certains contextes, tels que lexposition professionnelle, ladministration par dautres voies peut
tre plus approprie.
chimiques de la substance dessai susceptibles de modifier sa toxicit; et effets sur la consommation daliments
ou deau, ou sur ltat nutritionnel des animaux. Il est recommand, dans la mesure du possible, denvisager en
premier lieu une solution ou une suspension aqueuse, puis celle dune solution ou dune mulsion dans une huile
(par exemple huile de mas), et en dernier lieu celle dune solution dans dautres vhicules. Les caractristiques de
toxicit des vhicules autres que leau sont connues. Il convient de disposer de donnes sur la stabilit de la
substance dessai et sur lhomognit des solutions ou rations contenant les diffrentes doses (selon les cas) dans
les conditions dadministration (nourriture, par exemple).
29. Il importe de veiller ce que les quantits de substances administres dans les aliments ou leau de boisson
ninterfrent pas avec la nutrition ou lquilibre hydrique. Dans les tudes de toxicit long terme faisant
intervenir une administration par voie alimentaire, la concentration de la substance dessai dans les aliments
ne dpasse pas normalement 5 % de la ration totale, afin dviter les dsquilibres nutritionnels. Si la substance
dessai est incorpore la nourriture, on peut utiliser soit une concentration alimentaire constante (mg/kg
daliment ou ppm) soit un niveau de dose constant par rapport au poids corporel de lanimal (mg/kg de
raison de 7 jours par semaine) et ce normalement pendant une priode de 24 mois pour les rongeurs (voir aussi
le paragraphe 32). Tout autre rgime de dosage, par exemple une administration 5 jours par semaine, fait lobjet
dune justification. En cas dadministration par voie cutane, les animaux reoivent normalement le traitement
pendant au moins 6 heures par jour, 7 jours par semaine, comme le spcifie le chapitre B.9 de la prsente
annexe (11), et ce pendant une priode de 24 mois. Lexposition par inhalation est ralise pendant 6 heures par
jour, 7 jours par semaine, mais il est possible, si cela se justifie, de limiter lexposition 5 jours par semaine. La
priode dexposition est normalement de 24 mois. Si des espces de rongeurs autres que le rat sont exposes
nez seul, il est possible dajuster la dure maximale dexposition en fonction du stress propre ces espces. Le
choix dune dure dexposition infrieure 6 heures par jour devra tre justifi. Voir aussi ce sujet le chapitre
B.8 de la prsente annexe (9).
irritant local, il pourra tre envisag de maintenir la dose journalire en la fractionnant (deux fois par jour). Le
volume est maintenu aussi faible que possible et nexcde pas normalement 1 ml/100 g de poids corporel pour
les rongeurs (31). Il convient de minimiser la variabilit du volume test en ajustant la concentration pour
sont lexception et leur dilution permettra dviter tout effet local svre. Lessai nest donc pas men des
concentrations susceptibles dtre corrosives ou irritantes pour le tube digestif.
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Dure de ltude
32. La dure de ltude sera normalement de 24 mois pour les rongeurs, ce qui correspond la majeure partie de la
dure de vie normale des animaux utiliss. Elle pourra tre allonge ou raccourcie selon la dure de vie de la
souche de lespce animale utilise, mais cette dcision fait lobjet dune justification. Pour certaines souches
particulires de souris, par exemple AKR/J, C3H/J ou C57BL/6J, une dure de 18 mois peut tre plus approprie.
On trouvera ci-aprs des informations sur la dure, la clture de ltude et la survie; dautres considrations,
relatives notamment lacceptabilit dune tude de cancrogense estime ngative du fait de la survie des
animaux, figurent dans le document dorientation no 116 (7).
La clture de ltude est envisage lorsque le nombre de survivants des groupes soumis aux plus faibles doses
ou du groupe tmoin tombe en dessous de 25 pour cent.
La clture de ltude nest pas dclenche par la mort prmature des animaux du seul groupe ayant reu la
dose la plus leve.
La survie des animaux est prise en considration sparment pour chaque sexe.
Ltude nest pas prolonge au-del du point o les donnes pouvant tre tires de ltude ne sont plus
suffisantes pour permettre une valuation statistiquement valable.
OBSERVATIONS
33. Un examen de la morbidit ou de la mortalit est effectu quotidiennement chez tous les animaux, gnralement
en dbut et en fin de journe, fins de semaine et jours fris compris. Une recherche de signes spcifiques
significatifs sur le plan toxicologique devra aussi tre effectue une fois par jour en tenant compte du moment
o lon prvoit que les effets des diffrentes doses atteindront leur intensit maximale aprs administration par
gavage. Une attention particulire est accorde au dveloppement de tumeurs, et le moment dapparition, la
localisation, les dimensions, laspect et la progression de chaque tumeur nettement visible ou palpable sont
consigns.
Poids corporel, consommation de nourriture et deau, et efficacit alimentaire
semaines, puis au moins une fois par mois. La consommation de nourriture et lefficacit alimentaire sont aussi
mesures au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois.
Lorsque la substance dessai est administre dans leau de boisson, la consommation deau est aussi mesure au
moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Il peut
galement tre utile de mesurer la consommation deau dans les tudes o la prise deau est modifie.
Hmatologie, biochimie clinique et autres mesures
35. Afin dobtenir le plus possible dinformations de ltude, surtout en ce qui concerne le mode daction de la
substance, il peut tre utile deffectuer des prlvements sanguins afin de procder des analyses hmatologiques
et de biochimie clinique, mais la dcision appartient au directeur de ltude. Des analyses durine peuvent tre
aussi appropries. On trouvera des informations complmentaires sur lintrt de tels prlvements pour une
tude de cancrogense dans le document dorientation no 116 (7). Sil y a lieu, des prlvements sanguins en
vue danalyses hmatologiques et de chimie clinique et des analyses durines peuvent tre effectus dans le cadre
de sacrifices raliss en cours dtude (paragraphe 20) et la fin de ltude sur un minimum de 10 animaux de
chaque sexe par groupe. Les chantillons de sang sont prlevs en un point dtermin, par exemple par ponction
cardiaque ou au niveau du sinus rtro-orbital sous anesthsie, et seront conservs si ncessaire dans des
conditions appropries. Des talements sanguins peuvent aussi tre prpars en vue dun examen, notamment
si la moelle osseuse semble tre lorgane cible, bien que lutilit dun tel examen pour lvaluation du potentiel
cancrogne/oncogne ait t mise en question (32).
PATHOLOGIE
36. Tous les animaux de ltude lexception des sentinelles et autres animaux satellites (voir paragraphe 20) font
lobjet dune autopsie macroscopique complte et dtaille, comprenant un examen attentif de la surface externe
du corps et de tous les orifices ainsi que des cavits crnienne, thoracique et abdominale et de leurs contenus.
Lautopsie des sentinelles et autres animaux satellites peut devoir tre effectue au cas par cas, la discrtion du
directeur de ltude. La pese des organes ne fait normalement pas partie dune tude de cancrogense car les
changements lis lge ou, dans des phases plus avances, au dveloppement de tumeurs rendent superflues les
donnes relatives au poids des organes. Ces donnes peuvent toutefois prsenter un grand intrt pour les
valuations fondes sur le poids de la preuve, notamment en ce qui concerne le mode daction. Si ces donnes
font partie dune tude satellite, elles ne sont pas collectes au-del dun an aprs le dbut de ltude.
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scopiques
cur
pancras
glande surrnale
ilon
glande parathyrode
[dents]
aorte
jjunum
nerf priphrique
testicule
cerveau (segments denc

phale, de cervelet et de
bulbe rachidien/pont)
rein
hypophyse
thymus
ccum

bital)
prostate
thyrode
col utrin
foie
rectum
[langue]
glande coagulante
poumon
glande salivaire
trache
clon
vsicule sminale
vessie
duodnum

mles)
muscle squelettique
utrus (col inclus)
pididyme

peau
[uretre]
il (y compris rtine)
sophage
moelle pinire (niveaux

cervical, msothoracique
et lombaire)
[urtre]
[bulbe olfactif]
rate
vagin

ovaire
[sternum]
segment de moelle
osseuse frachement
ponctionne
glande de Harder
conservs. Dans les tudes portant sur une administration par la voie cutane, il y a lieu de conserver les organes
figurant sur la liste tablie pour la voie orale, et de procder un prlvement et une conservation spcifiques de
la peau provenant du site dapplication. Dans les tudes par inhalation, la liste des tissus des voies respiratoires
conservs et examins est conforme aux recommandations des chapitres B.8 et B.29 de la prsente annexe. Pour
les autres organes et tissus (outre les tissus des voies respiratoires spcifiquement conservs), il convient dexa
miner les organes de la liste tablie pour la voie orale.
Histopathologie
toxicologique (33). Au minimum, les examens devront porter sur les tissus suivants:
tous les tissus prsentant des anomalies macroscopiques, notamment des tumeurs,
lorsque des altrations histopathologiques dues au traitement sont observes dans le groupe dose leve, ces
mmes tissus sont examins chez tous les animaux de tous les autres groupes de doses,
examins.
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RSULTATS ET RAPPORTS
Donnes
toxicit observs ainsi que le moment de lapparition, la dure et la gravit de tous les effets toxiques observs, le
nombre danimaux prsentant des lsions, les types de lsions et le pourcentage danimaux prsentant chaque
type de lsion. Les tableaux synoptiques prsentent les moyennes et les carts-types (pour les donnes recueillies
en continu) pour les animaux prsentant des effets toxiques ou des lsions, ainsi quune cotation des lsions.
les donnes de contrle historiques manent du mme laboratoire et portent sur des animaux du mme ge et
de la mme souche, produits dans les cinq ans prcdant ltude en question.
41. Si possible, les rsultats numriques devront tre valus laide dune mthode statistique approprie et
largement reconnue. Les mthodes statistiques et les donnes analyser sont choisies au moment de la
conception de ltude (paragraphe 9). Ce choix permet doprer des ajustements en fonction de la survie, si
ncessaire.
Rapport dessai
Substance dessai:
provenance de la substance chimique,
numro de lot,
justification du choix du vhicule (sil est autre que leau).
Animaux dexprience:
espce/souche utilise et justification du choix fait,
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chaque animal)
Rsultats gnraux:
donnes toxicocintiques (si disponibles),
ophtalmoscopie (si disponible),
hmatologie (si disponible),
chimie clinique (si disponible).
Rsultats cliniques:
signes de toxicit,
incidence (et, si elle est value, svrit) de toute anomalie observe,
nature, svrit et dure des observations cliniques (transitoires ou permanentes).
Donnes relatives aux autopsies:
poids des organes et leur rapport au poids corporel, le cas chant,
rsultats dautopsie; incidence et svrit des anomalies.
Histopathologie:
observations deffets histopathologiques non noplasiques,
observations deffets histopathologiques noplasiques,
corrlation entre les observations macroscopiques et microscopiques,
description dtaille de tous les rsultats histopathologiques lis au traitement et chelle dvaluation de la
svrit,
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rapport sur lanalyse ventuelle des lames par des pairs.

applicabilit des rsultats ltre humain;
Conclusions
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no 116, disponible sur le site internet public de lOCDE relatifs aux essais de produits chimiques (www.oecd.org/
(9) Chapitre B.8 de la prsente annexe Toxicit subaigu par inhalation: tude sur 28 jours.
(10) Chapitre B.29 de la prsente annexe Toxicit subchronique par inhalation: tude sur 90 jours.
(11) Chapitre B.9 de la prsente annexe Toxicit cutane doses rptes (28 jours).
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Appendice 1
DFINITION
______
B. 33. TUDES COMBINES DE TOXICIT CHRONIQUE ET DE CANCROGENSE
INTRODUCTION
1.
La prsente mthode dessai est quivalente la ligne directrice 453 (2009) de lOCDE pour les essais de
produits chimiques. La ligne directrice 453 originale avait t adopte en 1981. La prsente mthode dessai
B.33 actualise a t juge ncessaire afin de tenir compte des volutions rcentes dans le domaine du bien- tre
animal, ainsi que des nouvelles exigences rglementaires (1) (2) (3) (4) (5). La mise jour de la prsente mthode
dessai B.33 a t effectue en parallle avec la rvision des chapitres B.32 (tudes de cancrogense) et B.30
(tudes de toxicit chronique) de la prsente annexe, dans le but dobtenir des informations additionnelles
partir des animaux utiliss dans ltude, et de fournir des prcisions concernant le choix des doses. La prsente
mthode dessai vise les essais portant sur une large gamme de produits chimiques, dont des pesticides et des
produits chimiques industriels. Il convient toutefois de noter que certains aspects et certaines dispositions
peuvent diffrer pour les produits pharmaceutiques (voir la Confrence internationale sur lharmonisation,
thme S1B: valuation de la cancrognicit des produits pharmaceutiques).
2.
La plupart des tudes de toxicit chronique et de cancrogense tant menes sur des espces de rongeurs, la
prsente mthode dessai est destine sappliquer principalement des tudes ralises avec ces espces. Sil
savrait ncessaire de mener de telles tudes avec des non-rongeurs, il conviendrait dappliquer, moyennant des
modifications appropries, les principes et procdures dcrits dans la prsente mthode dessai et dans le
chapitre B.27 Toxicit orale doses rptes non-rongeurs: 90 jours (6) de la prsente annexe, comme
indiqu dans le document dorientation no 116 de lOCDE sur llaboration et la conduite des tudes de toxicit
chronique et de cancrogense (7).
3.
Les trois principales voies dadministration utilises dans les tudes de toxicit chronique et de cancrogense
sont la voie orale, la voie cutane et linhalation. Le choix de la voie dadministration dpend des caractristiques
physiques et chimiques de la substance dessai et de la voie dexposition prdominante chez lhomme. Des
informations complmentaires sur le choix de la voie dexposition sont fournies dans le document dorientation
no 116 (7).
4.
La prsente mthode dessai porte principalement sur lexposition par voie orale, la voie la plus communment
utilise dans les tudes de toxicit chronique et de cancrogense. Bien que des tudes long terme utilisant
lexposition par voie cutane ou par inhalation puissent aussi tre ncessaires pour valuer le risque pour la
sant humaine et/ou exiges en vertu de certains rgimes rglementaires, ces deux voies dexposition ncessitent
des dispositifs techniques dune grande complexit. De telles tudes devront tre conues au cas par cas, encore
que la prsente mthode dessai, qui porte sur la caractrisation et lvaluation de la toxicit chronique et de la
cancrognicit par voie orale, puisse fournir les bases dun protocole dtude par voie cutane et/ou inhalation,
notamment en ce qui concerne les recommandations relatives aux dures de traitement, aux paramtres
cliniques et pathologiques, etc. Il existe des documents dorientation de lOCDE sur ladministration exprimen
tale de substances dessai par inhalation (7) (8) et par voie cutane (7). Les chapitres B.8 (9) et B.29 (10) de la
prsente annexe, ainsi que le document dorientation de lOCDE sur les essais de toxicit aigu par inhalation (8),
mritent tout particulirement dtre consults lors de la conception dtudes long terme portant sur une
exposition par inhalation. Le chapitre B.9 de la prsente annexe (11) doit tre consult dans le cas dun essai
portant sur la voie cutane.
5.
Ltude combine de toxicit chronique et de cancrogense donne des lments dinformation sur les risques
pour la sant susceptibles de dcouler dune exposition rpte pendant une priode pouvant couvrir la vie
entire de lespce considre. Ltude fournit des informations sur les effets toxiques de la substance dessai, y
compris sur son pouvoir cancrogne, et peut indiquer les organes cibles et la possibilit daccumulation dans
ces organes. Elle peut aussi donner une estimation de la dose sans effet nocif observ pour ce qui est des effets
toxiques et, dans le cas de substances cancrognes non gnotoxiques, des rponses tumorales. Cette estimation
permet dtablir les critres de scurit concernant lexposition humaine. De plus, il convient daccorder une
attention particulire lobservation clinique des animaux afin dobtenir le plus dinformations possibles.
6.
Les objectifs des tudes de toxicit chronique et de cancrogense couvertes par la prsente mthode dessai sont
les suivants:
identification des proprits cancrognes dun produit chimique susceptibles daugmenter les risques de
noplasmes, la frquence de survenue de noplasmes malins ou la diminution du temps ncessaire leur
apparition, par rapport aux groupes tmoins concurrents,
identification du temps dapparition de noplasmes,
identification de la toxicit chronique dune substance dessai,
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identification dun ou de plusieurs organes cibles de la toxicit chronique et de la cancrogense,

caractrisation de la relation dose-effet,
identification dun niveau de dose sans effet nocif observ (DSENO) ou du point de dpart pour ltablis
sement dune dose de rfrence (DR),
extrapolation des effets cancrognes aux niveaux dexposition humaine correspondant de faibles doses,
prvision des effets de toxicit chronique aux niveaux reprsentatifs de lexposition humaine,
obtention de donnes permettant de vrifier les hypothses concernant le mode daction (2) (7) (12) (13)
(14) (15).
7.
Pour caractriser et valuer la cancrognicit potentielle et la toxicit chronique dune substance dessai, le
laboratoire charg de ltude prend en compte toutes les informations disponibles sur la substance dessai avant
de raliser ltude, afin de pouvoir orienter celle-ci de manire tester plus efficacement les proprits toxico
logiques de la substance, et faire le moins possible appel aux animaux. La connaissance du mode daction dun
agent cancrogne suspect et sa prise en compte (2) (7) (12) (13) (14) (15) sont particulirement importantes
puisque la conception optimale de lessai peut diffrer selon que la substance est ou nest pas un agent
cancrogne gnotoxique connu ou suspect. Des informations complmentaires sur certains aspects du
mode daction peuvent tre trouves dans le document dorientation no 116 (7).
8.
Les informations utiles pour concevoir ltude sont notamment: lidentit, la structure chimique et les proprits
physico-chimiques de la substance dessai; les informations ventuelles sur son mode daction; les rsultats de
toutes les tudes de toxicit in vitro ou in vivo menes et notamment des essais de gnotoxicit; lutilisation (les
utilisations) prvue(s) et le potentiel dexposition humaine; les donnes (Q)SAR disponibles et les donnes
toxicologiques (par exemple mutagnicit, gnotoxicit et pouvoir cancrogne) relatives aux substances struc
turellement apparentes; les donnes toxicocintiques disponibles (dose unique et doses rptes, si ces donnes
existent) et les rsultats dautres tudes doses rptes. La dtermination de la toxicit chronique et du pouvoir
cancrogne nest effectue quaprs obtention des premiers rsultats dessais de toxicit doses rptes mens
sur 28 jours et/ou 90 jours. Les essais dinitiation-promotion de cancers court terme peuvent aussi livrer des
informations utiles. Il convient denvisager ladoption dune approche par tapes pour ltude exprimentale de
cancrogense entreprise dans le cadre de lvaluation globale des effets nocifs potentiels dune substance
chimique (16) (17) (18) (19).
9.
statistiques doivent prendre en compte lajustement en fonction de la survie, lanalyse des risques de tumeurs
cumules lis la dure de survie, lanalyse du temps ncessaire lapparition dune tumeur et lanalyse effectue
en cas de mort prmature des animaux dun ou de plusieurs groupes. On trouvera des indications concernant
les analyses statistiques appropries, ainsi que des rfrences cls des mthodes statistiques reconnues au plan
international, dans le document dorientation no 116 (7), ainsi que dans le document dorientation no 35 sur
lanalyse et lvaluation des tudes de toxicit chronique et de cancrogense (20).
10. Lors de la ralisation dune tude de cancrogense, il est recommand de toujours suivre les principes et
considrations noncs dans le document dorientation de lOCDE no 19 sur la reconnaissance, lvaluation et
lutilisation des signes cliniques comme effets observs thiquement acceptables dans les exprimentations
stipule ce qui suit: Dans les tudes comportant ladministration de doses rptes, lorsquun animal prsente des signes
lessai, dinterrompre ladministration de la substance dessai pour soulager la douleur ou la dtresse de lanimal, ou de
rduire la dose teste.
les tudes de toxicit chronique et de cancrogense dans le document dorientation no 116 (7), ainsi que dans
doses dpend du ou des principaux objectifs de ltude (paragraphe 6). En choisissant des niveaux de doses
appropris, il convient de trouver un quilibre, entre dune part, lidentification des dangers et, dautre part, la
caractrisation des rponses aux faibles doses et leur pertinence. Cet quilibre est particulirement ncessaire
dans le cas de ltude combine de toxicit chronique et de cancrogense considre ici.
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12. Il convient dexaminer lopportunit de raliser la prsente tude combine de toxicit chronique et de canc
rogense plutt que de raliser sparment une tude de toxicit chronique (chapitre B.30 de la prsente annexe)
et une tude de cancrogense (chapitre B.32 de la prsente annexe). Lessai combin permet une meilleure
efficacit en temps et en cots, et un moindre recours aux animaux, par rapport la conduite de deux essais
spars, et ne compromet pas la qualit des donnes de la phase chronique ou de la phase de cancrogense.
Lors de la ralisation dune telle tude combine, il convient toutefois de respecter les principes dterminant le
choix de la dose (paragraphes 11 et 22 26) et il est galement reconnu que certains cadres rglementaires
peuvent imposer la conduite dtudes spares. On trouvera dans le document dorientation no 116 (7) des
indications supplmentaires sur les moyens de concevoir de manire optimale ltude combine de toxicit
chronique et de cancrogense afin de rduire le nombre danimaux utiliss et en rationalisant les diverses
procdures exprimentales.
13. Les dfinitions utilises dans le contexte de la prsente mthode dessai figurent la fin du prsent chapitre et
dans le document dorientation no 116 (7).
PRINCIPE DE LESSAI
14. Ltude comprend deux phases parallles: une phase chronique et une phase de cancrogense (dont les dures
respectives font lobjet des paragraphes 34 et 35). La substance dessai est normalement administre par la voie
orale, mais la voie inhalatoire ou la voie cutane peuvent aussi tre appropries. Durant la phase chronique, la
substance dessai est administre quotidiennement plusieurs groupes danimaux dexprience des doses
progressives, raison dun niveau de dose par groupe, en gnral pendant une priode de 12 mois, bien
que des dures plus longues ou plus courtes puissent aussi tre choisies en fonction des exigences rglementaires
(voir paragraphe 34). Cette dure est suffisamment longue pour permettre aux effets de toxicit cumule de se
manifester, tout en vitant les effets perturbateurs des changements lis au vieillissement. Un ou plusieurs
sacrifices en cours dtude peuvent aussi tre prvus, par exemple 3 et 6 mois, auquel cas des groupes
danimaux supplmentaires pourront tre inclus dans ltude (voir paragraphe 20). Durant la phase de canc
rogense, la substance dessai est administre quotidiennement diffrents groupes danimaux pendant la plus
grande partie de leur vie. Au cours des deux phases, les animaux sont observs attentivement pour dceler
dventuels signes de toxicit et le dveloppement de lsions noplasiques. Les animaux qui meurent ou sont
sacrifis en cours dessai sont autopsis et, au terme de lessai, les animaux survivants sont sacrifis et autopsis.
15. La prsente mthode dessai traite principalement de la caractrisation et de lvaluation de la toxicit chronique
et de la cancrognicit chez les rongeurs (paragraphe 2). Le recours des espces autres que des rongeurs peut
tre envisag si les donnes disponibles laissent escompter une meilleure prdiction des effets de la substance sur
la sant humaine. Dans ce cas, le choix de lespce est justifi. Lespce de rongeur prfre est le rat, mais
dautres rongeurs comme la souris peuvent tre utiliss. Bien que le recours la souris dans les tudes de
cancrogense puisse ne prsenter quun intrt limit (24) (25) (26), certains programmes rglementaires actuels
exigent tout de mme la conduite dessais de cancrogense sur la souris, sauf lorsquil est tabli que de tels
essais ne sont pas ncessaires sur le plan scientifique. Les rats et les souris sont les modles exprimentaux
choisis de prfrence, en raison de leur dure de vie relativement courte, de leur utilisation frquente dans les
tudes pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilit linduction de tumeurs et de la disponibilit de
souches suffisamment caractrises. Ces caractristiques permettent dobtenir une grande quantit dinformations
sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Sil savrait ncessaire de raliser des tudes de toxicit
chronique et de cancrogense avec des espces de non- rongeurs, le plan et la conduite de ltude devraient
suivre les principes dcrits dans la prsente mthode dessai ainsi que dans le chapitre B.27 de la prsente
annexe Toxicit orale doses rptes non-rongeurs: 90 jours (6). Des informations additionnelles sur le
choix des espces et des souches sont disponibles dans le document dorientation no 116 (7).
16. Il convient demployer des animaux adultes sains, de souches communment utilises dans les laboratoires.
Ltude combine de toxicit chronique et de cancrogense sera effectue de prfrence sur des animaux de
mme souche et de mme provenance que ceux utiliss dans ltude (les tudes) de toxicit prliminaire(s) de
plus courte dure. Si toutefois ces animaux sont rputs ne pas rpondre aux critres de survie gnralement
admis dans les tudes long terme [voir le document dorientation no 116 (7)], il convient denvisager dutiliser
une souche dun animal dont le taux de survie permette de raliser une tude long terme. Les femelles sont
nullipares et non gravides.
17. Les animaux peuvent tre logs individuellement ou dans des cages en petits groupes du mme sexe, lhber
gement individuel ntant envisager que dans des cas scientifiquement justifis (27) (28) (29). Les cages sont
places de faon telle que linfluence ventuelle de leur disposition sur les rsultats de ltude soit rduite au
minimum. La temprature du local des animaux dexprience est de 22 C ( 3 C). Lhumidit relative est dau
moins 30 % et nexcde pas de prfrence 70 % en dehors des moments o le local est nettoy, lidal tant
quelle soit comprise entre 50 et 60 %. Lclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumire et 12 heures
dobscurit. Le rgime alimentaire peut tre un rgime classique de laboratoire avec eau potable satit. Il
mtaux lourds et mycotoxines, par exemple) est aussi faible que possible. Des donnes analytiques sur les
teneurs en nutriments et en contaminants alimentaires sont recueillies rgulirement, au moins au dbut de
ltude et lors des changements de lots; ces donnes figurent dans le rapport final. Des donnes analytiques sur
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leau de boisson utilise lors de ltude sont de mme fournies. Le choix du rgime alimentaire peut tre
influenc par la ncessit dassurer un mlange convenable de la substance dessai et de satisfaire les besoins
nutritionnels des animaux lorsque la substance est administre dans la nourriture.
18. Il convient dutiliser des animaux sains, acclimats aux conditions de laboratoire depuis au moins 7 jours et
Au dbut de ltude, la variation de poids des animaux de chaque sexe est minimale et nexcde pas 20 % du
significatives, la phase de randomisation est rpte dans la mesure du possible. Chaque animal reoit un
numro didentification unique et en est marqu de manire permanente par tatouage, implant de micropuce
ou toute autre mthode approprie.
PROTOCOLE
19. Il convient dutiliser des animaux des deux sexes. Leur nombre est suffisant pour permettre une valuation
biologique et statistique complte. Pour les rongeurs, chaque groupe de dose (comme dfini au paragraphe 22)
et chaque groupe tmoin concurrent prvu pour participer la phase de cancrogense de ltude comprend donc
au moins 50 animaux de chaque sexe. Selon le but de ltude, il sera possible daugmenter la puissance statistique
des principales estimations en rpartissant les animaux de manire diffrencie et non gale en nombre dans les
divers groupes de dose, avec plus de 50 animaux dans les groupes faibles doses pour estimer par exemple la
cancrognicit aux faibles doses. Il convient toutefois de noter quune augmentation modre de la taille dun
groupe entranera une augmentation relativement faible de la puissance statistique de ltude. Chaque groupe de
dose (comme dfini au paragraphe 22), et chaque groupe tmoin concurrent prvu pour participer la phase de
toxicit chronique de ltude, comprend au moins, dans le cas des rongeurs, 10 animaux de chaque sexe. On notera
que ce nombre est plus faible que celui prconis dans ltude de toxicit chronique (chapitre B.30 de la prsente
annexe). Linterprtation des donnes obtenues partir de ce nombre rduit danimaux par groupe dans la phase de
toxicit chronique de la prsente tude combine sappuie cependant sur les donnes provenant des animaux plus
nombreux tudis lors de la phase de cancrogense de ltude. Dans les tudes utilisant des souris, il peut tre
ncessaire de prvoir des animaux supplmentaires dans chaque groupe trait lors de la phase de toxicit chronique
pour pouvoir effectuer tous les examens hmatologiques requis. On trouvera des donnes complmentaires sur la
conception statistique de ltude et le choix de niveaux de doses permettant doptimiser la puissance statistique dans
le document dorientation no 116 (7).
Sacrifices en cours dtude, groupes satellites et animaux sentinelles
20. Ltude peut prvoir le sacrifice danimaux en cours dtude, par exemple 6 mois pour la phase de toxicit
chronique, afin de recueillir des donnes sur la progression des altrations non noplasiques et des donnes
mcanistiques, si cela est scientifiquement justifi. Si lon dispose dj de ces donnes, obtenues antrieurement
lors dtudes de toxicit doses rptes sur la substance dessai, les sacrifices en cours dtude peuvent ne pas
tre scientifiquement justifis. Les animaux tudis pendant la phase de toxicit chronique de ltude, norma
lement sur une dure de 12 mois (paragraphe 34), fournissent les donnes correspondant aux sacrifices en cours
dtude pour la phase de cancrogense, ce qui rduit le nombre total danimaux tudis. Des groupes satellites
peuvent aussi tre constitus pour la phase de toxicit chronique afin de contrler la rversibilit des ventuelles
altrations toxicologiques induites par la substance dessai. Ces investigations pourront ne porter que sur les
doses maximales de ltude et sur le groupe tmoin. Un groupe supplmentaire danimaux sentinelles (gnra
lement 5 animaux de chaque sexe) peut tre inclus si ncessaire pour le suivi de ltat pathologique au cours de
ltude (30). On trouvera des indications supplmentaires sur les sacrifices en cours dtude et sur le recours
des animaux satellites et sentinelles, ainsi que sur la limitation du nombre total danimaux tudis, dans le
document dorientation no 116 (7).
21. Si linclusion danimaux satellites et/ou des sacrifices en cours dessai sont prvus, le nombre danimaux dans
chaque groupe de dose prvu cet effet sera normalement de 10 animaux de chaque sexe, et le nombre total
danimaux tudis devra tre augment du nombre danimaux devant tre sacrifis avant lachvement de ltude.
Les animaux destins tre sacrifis en cours dtude et les animaux satellites sont normalement sujets aux
mmes observations que ceux soumis la phase de toxicit chronique de ltude principale, notamment en ce
qui concerne le poids corporel, la prise daliments et deau, les mesures hmatologiques et de biochimie clinique,
et les examens pathologiques. Toutefois, des dispositions peuvent aussi tre prises (dans les groupes danimaux
sacrifis en cours dtude) pour limiter ces observations des mesures essentielles spcifiques telles que la
neurotoxicit ou limmunotoxicit.
Groupes de dose et dosages
22. Le document dorientation no 116 (7) donne des indications sur tous les aspects du choix des doses et des carts
entre les doses. Il convient dutiliser au moins trois doses et un groupe tmoin, aussi bien pour la phase de
toxicit chronique que pour la phase de cancrogense. Les niveaux de doses seront gnralement bass sur les
rsultats dtudes plus court terme doses rptes, ou dtudes prliminaires de dtermination des concen
trations, et devront prendre en compte toutes les donnes toxicologiques et toxicocintiques existantes relatives
la substance dessai ou aux substances chimiques apparentes.
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23. Pour la phase de toxicit chronique de ltude, une tude complte portant sur trois niveaux de doses peut ne
pas tre considre comme indispensable sil est possible danticiper quun essai dose unique, quivalant au
moins 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, ne produira probablement pas deffets indsirables. La dcision est
fonde sur les rsultats dtudes prliminaires et sur labsence probable de toxicit de la substance dessai,
compte tenu des donnes disponibles sur des substances structurellement apparentes. Une limite de
1 000 mg/kg de poids corporel/jour peut sappliquer sauf si lexposition humaine indique quil est ncessaire
de recourir un niveau de dose plus lev.
effets toxiques de la substance tout en vitant la souffrance, une toxicit svre ou une forte morbidit ou ltalit
chez les animaux tests. La plus forte dose est normalement choisie pour provoquer une manifestation de
toxicit, par exemple un ralentissement de la prise de poids corporel (denviron 10 %). Toutefois, en fonction des
objectifs de ltude (voir paragraphe 6), on pourra choisir un niveau de dose maximal plus faible que la dose qui
provoque des signes de toxicit, par exemple une dose entranant un effet ngatif proccupant mais dont
limpact sur lesprance de vie ou le poids corporel reste faible.
25. Les niveaux de doses et les intervalles entre les doses peuvent tre choisis de manire pouvoir tablir une
relation dose-rponse et, selon le mode daction de la substance dessai, une DSENO ou tout autre rsultat
escompt de ltude, notamment une DR (voir le paragraphe 27). Les facteurs prendre en compte dans le choix
des faibles doses sont notamment la pente attendue de la courbe dose-rponse, les doses qui provoquent des
changements mtaboliques importants ou qui modifient notablement le mode daction toxique, le niveau auquel
on peut prvoir un seuil, ou celui auquel on peut prvoir de fixer un point de dpart pour une extrapolation aux
faibles doses. Le principal objectif lors de la ralisation dune tude combine de cancrogense et de toxicit
chronique sera la collecte dinformations des fins dvaluation des risques de cancrogense, et les donnes sur
la toxicit chronique seront normalement un objectif subsidiaire. Il conviendra de sen souvenir lors du choix
des niveaux de doses et des intervalles entre les doses pour ltude.
26. Les intervalles entre les doses dpendront des objectifs de ltude et des caractristiques de la substance dessai, et
ne peuvent donc pas tre prescrits de manire dtaille dans la prsente mthode dessai, mais des intervalles
correspondant un facteur 2 ou 4 sont souvent les plus appropris entre les doses dcroissantes, et linclusion
dun quatrime groupe dessai est souvent prfrable la fixation de trs grands intervalles (correspondant par
exemple un facteur de plus de 6 10) entre les doses. En gnral, les facteurs suprieurs 10 sont vits, et
leur utilisation est justifie.
27. Comme le prcise le document dorientation no 116 (7), les facteurs prendre en compte dans le choix des
doses sont notamment les suivants:
toxicocintique et gammes de doses auxquelles linduction mtabolique, la saturation ou la non-linarit
entre les doses internes et externes surviennent ou non,
commence se manifester, les dosages hormonaux sont perturbs, les mcanismes homostatiques sont
dpasss, etc.,
prise en compte des niveaux prvus dexposition humaine, en particulier lors du choix des doses moyennes
et faibles.
28. Le groupe tmoin sera un groupe non trait ou un groupe recevant le vhicule si la substance est administre
dans un vhicule. Exception faite de ladministration de la substance dessai, les animaux du groupe tmoin sont
traits de la mme manire que ceux des groupes dessai. Si un vhicule est employ, on administrera au groupe
tmoin le plus grand volume de vhicule utilis pour les groupes traits. Si la substance dessai est incorpore
aux aliments et entrane une diminution sensible de la prise de nourriture lie une moindre apptence de celleci, il pourra tre utile dutiliser un groupe tmoin supplmentaire nourri en parallle, qui constituerait un tmoin
plus appropri.
des proprits physico-chimiques de la substance dessai, de sa biodisponibilit ainsi que de la voie et du mode
prdominants dexposition humaine. Il convient de justifier le choix de la voie et du mode dadministration.
Dans lintrt des animaux, le gavage oral nest normalement choisi que pour les substances pour lesquelles cette
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voie et ce mode dadministration correspondent une voie dexposition potentielle raisonnable chez lhomme
(produits pharmaceutiques, par exemple). Dans le cas des produits chimiques alimentaires ou environnementaux,
Toutefois, dans certains contextes, tels que lexposition professionnelle, ladministration par dautres voies
peut tre plus approprie.
chimiques de la substance dessai susceptibles de modifier sa toxicit; et effets sur la prise daliments ou
deau, ou sur ltat nutritionnel des animaux. Il est recommand, chaque fois que les circonstances le permettent,
denvisager en premier lieu lutilisation dune solution ou dune suspension aqueuse, puis celle dune solution ou
dune mulsion dans une huile (par exemple huile de mas), et en dernier lieu celle dune solution dans dautres
vhicules. Les caractristiques de toxicit des vhicules autres que leau sont connues. Il convient de disposer de
donnes sur la stabilit de la substance dessai et sur lhomognit des solutions ou rations contenant les
diffrentes doses (selon les cas) dans les conditions dadministration (nourriture, par exemple).
31. Il importe de veiller ce que les quantits de substances dessai administres dans les aliments ou leau de
boisson ninterfrent pas avec la nutrition ou avec lquilibre hydrique. Dans les tudes de toxicit long terme
faisant intervenir une administration par voie alimentaire, la concentration de la substance dessai dans les
aliments ne dpasse normalement pas 5 % de la ration totale, afin dviter les dsquilibres nutritionnels. Si la
substance dessai est incorpore la nourriture, on peut utiliser soit une concentration alimentaire constante
(mg/kg daliment ou ppm) soit un niveau de dose constant par rapport au poids corporel de lanimal (mg/kg de
raison de 7 jours par semaine) et ce pendant une priode de 12 mois (phase chronique) ou de 24 mois (phase
de cancrogense) pour les rongeurs (voir aussi les paragraphes 33 et 34). Tout autre rgime de dosage, par
exemple une administration 5 jours par semaine, donne lieu une justification. En cas dadministration par voie
cutane, les animaux reoivent normalement le traitement pendant au moins 6 heures par jour, 7 jours par
semaine, comme le spcifie le chapitre B.9 de la prsente annexe (11), et ce pendant une priode de 12 mois
(phase chronique) ou de 24 mois (phase de cancrogense). Lexposition par inhalation est ralise pendant
6 heures par jour, 7 jours par semaine, mais il est possible, si cela se justifie, de limiter lexposition 5 jours par
semaine. La priode dexposition est normalement de 12 mois (phase chronique) ou de 24 mois (phase de
cancrogense). Si des espces de rongeurs autres que le rat sont exposes nez seul, il est possible dajuster la
dure maximale dexposition en fonction du stress propre ces espces. Le choix dune dure dexposition
infrieure 6 heures par jour fait lobjet dune justification. Voir aussi ce sujet le chapitre B.8 de la prsente
annexe (9).
irritant local, il pourra tre envisag de maintenir la dose journalire en la fractionnant (deux fois par jour). Le
volume est maintenu aussi faible que possible et nexcde normalement pas 1 ml/100 g de poids corporel pour
les rongeurs (31). Il convient de minimiser la variabilit du volume test en ajustant la concentration pour
sont lexception et leur dilution permettra dviter tout effet local svre. Lessai nest pas men des concen
trations susceptibles dtre corrosives ou irritantes pour le tube digestif.
Dure de ltude
34. Si la priode dadministration et la dure de la phase chronique de cette tude sont normalement de 12 mois, le
plan de ltude permet une application des essais de dure plus courte (6 9 mois par exemple) ou plus
longue (18 24 mois), pour rpondre aux exigences de rgimes rglementaires particuliers ou obtenir des
donnes mcanistiques spcifiques. Les dviations par rapport une dure dexposition de 12 mois font lobjet
de justifications, surtout dans le cas de dures plus courtes. Le traitement de tous les groupes de doses affects
cette phase est interrompu au moment prvu pour lvaluation de la toxicit chronique et de lsions patholo
giques non noplasiques. Les groupes satellites inclus pour contrler la rversibilit des ventuelles altrations
toxicologiques induites par la substance dessai sont maintenus sans traitement, pendant une priode dau moins
4 semaines et dau plus un tiers de la dure totale de ltude, aprs la cessation de lexposition.
35. La dure de la phase de cancrogense de cette tude sera normalement de 24 mois pour les rongeurs, ce qui
correspond la majeure partie de la dure de vie normale des animaux utiliss. Elle peut tre allonge ou
raccourcie selon la dure de vie de la souche de lespce animale utilise, mais ce changement de dure fait
lobjet dune justification. Pour certaines souches particulires de souris, par exemple AKR/J, C3H/J ou C57BL/6J,
une dure de 18 mois peut tre plus approprie. On trouvera ci- aprs des informations sur la dure, la
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clture de ltude et la survie; dautres considrations, relatives notamment lacceptabilit dune tude de
cancrogense estime ngative du fait de la survie des animaux, figurent dans le document dorientation
no 116 (7):
la clture de ltude est envisage lorsque le nombre de survivants des groupes soumis aux plus faibles doses
ou du groupe tmoin tombe en dessous de 25 pour cent,
la clture de ltude nest pas dclenche par la mort prmature des animaux du seul groupe ayant reu la
dose la plus leve,
la survie des animaux est prise en considration sparment pour chaque sexe,
ltude nest pas prolonge au-del du point o les donnes pouvant tre tires de ltude ne sont plus
suffisantes pour permettre une valuation statistiquement valable.
OBSERVATIONS (PHASE DE TOXICIT CHRONIQUE)
36. Tous les animaux sont soumis un examen quotidien, gnralement en dbut et en fin de journe, fins de
semaine et jours fris compris, pour dterminer la morbidit et la mortalit. Des observations cliniques
gnrales sont effectues au moins une fois par jour, de prfrence au(x) mme(s) moment(s) de la journe,
en tenant compte du moment o lon prvoit que les effets des diffrentes doses atteindront leur intensit
maximale aprs administration par gavage.
37. Tous les animaux font lobjet dobservations cliniques dtailles au moins une fois avant la premire exposition
(pour permettre des comparaisons intra-individuelles), la fin de la premire semaine de ltude, et une fois par
mois ensuite. Les observations respectent un protocole qui rduit au minimum les variations entre observateurs
et les rend indpendantes du groupe test. Ces observations sont effectues hors de la cage o sont logs les
animaux, de prfrence dans une enceinte normalise et heures fixes. Elles sont soigneusement consignes, de
prfrence en utilisant un systme de cotation explicitement dfini par le laboratoire qui ralise lessai. Les
conditions dobservation demeurent aussi constantes que possible. Les observations portent notamment sur les
symptmes suivants (sans que cette liste soit exhaustive): modifications de ltat de la peau, de la fourrure, des
yeux et des muqueuses, apparition de scrtions et dexcrtions, et ractions neurovgtatives (par exemple,
scrtion de larmes, horripilation, variation du diamtre pupillaire, respiration anormale). Il convient galement
de consigner les changements dans la dmarche, la posture et les ractions la manipulation, ainsi que la
prsence de mouvements cloniques ou toniques et les comportements strotyps (par exemple, toilettage
excessif, parcours circulaires rptitifs) ou bizarres (par exemple, automutilation, marche reculons) (32).
38. Avant la premire administration de la substance dessai, tous les animaux font lobjet dun examen ophtalmo
logique effectu laide dun ophtalmoscope ou dun autre appareil appropri. lissue de ltude, cet examen
est ralis de prfrence sur tous les animaux, mais au moins sur ceux du groupe trait la dose la plus leve
et du groupe tmoin. Si des altrations oculaires lies au traitement sont dtectes, tous les animaux sont
examins. Si lanalyse structurale ou dautres observations suggrent une toxicit oculaire, il faut augmenter la
frquence des examens oculaires.
39. Dans le cas de substances ayant prsent un potentiel dinduction deffets neurotoxiques lors dessais antrieurs
de toxicit doses rptes sur 28 et/ou 90 jours, une vrification de la ractivit sensorielle diffrents types
de stimuli (32) (stimuli auditifs, visuels ou proprioceptifs, par exemple) (33) (34) (35) et une valuation de la
force de prhension (36) ainsi que de lactivit motrice (37) pourront tre menes en option. Elles seront
ralises avant le dbut de ltude et tous les 3 mois par la suite, jusqu 12 mois inclusivement, ainsi qu
la fin de ltude (si celle-ci dure plus de 12 mois). On trouvera dans les rfrences bibliographiques susmen
tionnes une description plus dtaille des modes opratoires. Toutefois, dautres modes opratoires que ceux
figurant dans ces rfrences sont galement utilisables.
40. Dans le cas de substances ayant prsent un potentiel dinduction deffets immunotoxiques lors dessais ant
rieurs de toxicit doses rptes sur 28 et/ou 90 jours, dautres examens sur cet effet peuvent tre mens en
option la fin de ltude.
Poids corporel, prise daliments et deau, et efficacit alimentaire
substance dessai est administre dans leau de boisson, la prise deau est aussi mesure au moins une fois par
semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Il peut galement tre utile de
mesurer la prise deau dans les tudes o celle- ci est modifie.
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Hmatologie et biologie clinique

42. Dans les tudes faisant intervenir des rongeurs, des examens hmatologiques sont effectus sur tous les animaux
dexprience (10 mles et 10 femelles par groupe) 3, 6 et 12 mois, ainsi qu la fin de ltude (si celle-ci dure
plus de 12 mois). Si des souris sont utilises, il peut tre ncessaire de constituer des groupes satellites afin de
pouvoir effectuer tous les examens hmatologiques requis (voir paragraphe 19). Dans les tudes faisant inter
venir des non-rongeurs, les chantillons seront prlevs sur un plus petit nombre danimaux (par exemple
4 animaux de chaque sexe par groupe dans les tudes chez le chien), des stades intermdiaires et la fin
de ltude, de la mme manire que chez les rongeurs. Il ne sera pas ncessaire deffectuer des examens 3 mois,
chez les rongeurs comme chez les autres animaux, si aucun effet sur les paramtres hmatologiques na t
observ lors dune tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux de doses comparables. Les chantillons de
sang sont prlevs en un point dtermin, par exemple par ponction cardiaque ou au niveau du sinus rtroorbitaire, sous anesthsie.
43. Les investigations portent sur les paramtres suivants (38): numration leucocytaire totale et diffrentielle,
numration rythrocytaire et plaquettaire, concentration dhmoglobine, hmatocrite (volume cellulaire
sanguin aprs centrifugation), volume corpusculaire moyen (VCM), hmoglobine corpusculaire moyenne
(HCM), concentration dhmoglobine corpusculaire moyenne (CHCM), temps de prothrombine et temps de
thromboplastine partielle active. Dautres paramtres hmatologiques tels que les corps de Heinz et autres
anomalies morphologiques rythrocytaires ou la mthmoglobine peuvent tre tudis si ncessaire en fonction
de la toxicit de la substance dessai. Dans lensemble, il convient dadapter lapproche suivie leffet observ
et/ou attendu dune substance dessai donne. Si la substance dessai exerce un effet sur le systme hmato
potique, des numrations rticulocytaires et une cytologie mdullaire peuvent tre galement indiques mais
nont pas tre pratiques de manire systmatique.
44. Des analyses de biochimie clinique, visant tudier les principaux effets toxiques sur les tissus, et en particulier
sur le rein et le foie, sont effectues partir dchantillons de sang prlevs sur tous les animaux tudis
(10 mles et 10 femelles par groupe) des intervalles de temps semblables ceux spcifis pour les
examens hmatologiques. Si des souris sont utilises, il peut tre ncessaire de constituer des groupes satellites
afin de pouvoir effectuer toutes les analyses de biochimie clinique ncessaires. Dans les tudes faisant intervenir
des non-rongeurs, les chantillons seront prlevs sur un plus petit nombre danimaux (par exemple 4 animaux
de chaque sexe par groupe dans les tudes chez le chien), des stades intermdiaires et la fin de ltude, de la
mme manire que chez les rongeurs. Des examens 3 mois, chez les rongeurs comme chez les autres
animaux, sont superflus si aucun effet sur les paramtres de biochimie clinique na t observ lors dune
tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux de doses comparables. Il est recommand de faire jener
les animaux ( lexception des souris) pendant la nuit qui prcde la prise de sang (1). Les investigations portent
sur les paramtres suivants (38): glucose, ure (azote urique), cratinine, protines totales, albumine, calcium,
sodium, potassium, cholestrol total, au moins deux enzymes rvlatrices des effets hpatocellulaires (alanine
aminotransfrase, aspartate aminotransfrase, glutamate dshydrognase, acides biliaires totaux) (39) et au moins
deux enzymes rvlatrices des effets hpatobiliaires (phosphatase alcaline, gamma- glutamyl transfrase, 5nuclotidase, bilirubine totale, acides biliaires totaux) (39). Dautres paramtres de chimie clinique, tels que
les triglycrides jeun, des hormones spcifiques et la cholinestrase peuvent tre mesurs si ncessaire en
fonction de la toxicit de la substance dessai. Dans lensemble, il convient dadapter lapproche suivie leffet
observ et/ou attendu dune substance dessai donne.
45. Des analyses durine sont effectues partir dchantillons prlevs sur tous les animaux tudis (10 mles et
10 femelles par groupe) des intervalles de temps semblables ceux spcifis pour les examens hmatologiques
et de chimie clinique. Il ne sera pas ncessaire deffectuer des dosages 3 mois si les analyses durine pratiques
dans le cadre dune tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux de doses comparables nont rvl aucun
effet. La liste suivante de paramtres tudier fait partie dune recommandation dexperts relative aux tudes de
pathologie clinique (38): aspect, volume, osmolalit ou poids spcifique, pH, protines totales et glucose.
Dautres mesures, notamment la recherche de corps ctoniques, durobilinogne, de bilirubine et de sang occulte,
peuvent aussi tre ralises. Ltude dautres paramtres peut aussi savrer ncessaire pour largir les recherches
sur leffet ou les effets observs.
46. On considre gnralement que dans les tudes portant sur des chiens, il est ncessaire de dterminer les
variables hmatologiques et de biochimie clinique de base avant le dbut du traitement, mais que ce nest
pas indispensable dans les tudes portant sur des rongeurs (38). Toutefois, si lon ne dispose pas de donnes
historiques de base appropries (voir paragraphe 58), il convient denvisager den obtenir.
PATHOLOGIE
47. Tous les animaux de ltude font normalement lobjet dune autopsie macroscopique complte et dtaille,
comprenant un examen attentif de la surface externe du corps et de tous les orifices ainsi que des cavits
crnienne, thoracique et abdominale et de leurs contenus. Toutefois, des dispositions peuvent aussi tre prises
(dans les groupes danimaux sacrifis en cours dtude ou les groupes satellites) pour limiter ces observations
des mesures essentielles spcifiques telles que la neurotoxicit ou limmunotoxicit (voir paragraphe 21). Il nest
pas ncessaire que ces animaux fassent lobjet dune autopsie, ni des procdures ultrieures dcrites dans les
paragraphes qui suivent. Lautopsie des animaux sentinelles pourra devoir tre effectue au cas par cas, la
discrtion du directeur de ltude.
(1) Pour un certain nombre de dosages effectus sur le srum ou le plasma, et plus particulirement pour le dosage du glucose, il est
prfrable de faire jener les animaux durant la nuit qui prcde la prise de sang. En labsence de jene, la variabilit des rsultats est en
effet plus grande, et risque de masquer des effets plus subtils ainsi que de rendre linterprtation plus difficile. En revanche, le jene peut
modifier le mtabolisme gnral des animaux et, en particulier dans les tudes dalimentation, perturber lexposition quotidienne la
substance dessai. Tous les animaux sont valus dans le mme tat physiologique et il sera donc prfrable de programmer les
valuations dtailles ou neurologiques pour un autre jour que celui des prlvements de biochimie clinique.
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48. Il convient de dterminer le poids des organes de tous les animaux hormis ceux mentionns dans la dernire
partie du paragraphe 47. Les glandes surrnales, le cerveau, les pididymes, le cur, les reins, le foie, les ovaires,
la rate, les testicules, la thyrode (pese aprs fixation, avec les glandes parathyrodes) et lutrus de tous les
animaux (except ceux trouvs moribonds et/ou ayant t sacrifis en cours dtude) sont dbarrasss, le cas
chant, de tout tissu adhrent et pess ltat frais ds que possible aprs la dissection, pour prvenir la
dessiccation.
toutes les lsions
macroscopiques
muscle squelettique
rein
aorte
glande coagulante
nerf priphrique
[sternum]
[bulbe olfactif]
glande de Harder

testicule
ccum
glande lacrymale (exorbi

tale)
il (dont rtine)
thymus
cerveau (segments den

cphale, de cervelet et de
glande mammaire (obliga

toire pour les femelles et,
si visible la dissection,
aussi pour les mles)
sophage
thyrode
cur
glande salivaire
ovaire
trache
col utrin
glande surrnale
pancras
[uretre]
clon
hypophyse
parathyrode
[urtre]
[dents]
ilon
peau
utrus (col inclus)
duodnum
jjunum
poumon
vagin
pididyme
[langue]
prostate

moelle pinire rate
vsicule sminale
(niveaux cervical, mso

thoracique et lombaire)
segment de moelle
osseuse frachement
ponctionne
rectum
vessie
foie
conservs. Dans les tudes portant sur une administration par la voie cutane, il y a lieu dexaminer les organes
figurant sur la liste tablie pour la voie orale et de procder un prlvement et une conservation spcifiques de
conservs et examins est conforme aux recommandations des chapitres B.8 (9) et B.29 (10) de la prsente
annexe. Pour les autres organes et tissus (outre les tissus des voies respiratoires spcifiquement conservs), il
convient dexaminer les organes de la liste tablie pour la voie orale.
Histopathologie
toxicologique (40). Au minimum, les examens devront porter sur les tissus suivants:
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tous les tissus prsentant des anomalies macroscopiques,
tissus des organes cibles, ou tissus prsentant des altrations dues au traitement dans le groupe dose leve,
prlevs sur tous les animaux de tous les autres groupes de doses,
examins.
OBSERVATIONS (PHASE DE CANCROGENSE)
51. Un examen de la morbidit ou de la mortalit est effectu quotidiennement chez tous les animaux, gnrale
ment en dbut et en fin de journe, fins de semaine et jours fris compris. Une recherche de signes spcifiques
significatifs sur le plan toxicologique est aussi effectue une fois par jour. Dans le cas dune tude par gavage, les
animaux sont examins immdiatement aprs ladministration de la dose. Une attention particulire devra tre
accorde au dveloppement de tumeurs, et le moment dapparition, la localisation, les dimensions, laspect et la
progression de chaque tumeur nettement visible ou palpable sont consigns.
substance dessai est administre dans leau de boisson, la prise deau est aussi mesure au moins une fois par
semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Il peut galement tre utile de
mesurer la prise deau dans les tudes o celle- ci est modifie.
Hmatologie, biochimie clinique et autres mesures
53. Afin dobtenir le plus possible dinformations de ltude, surtout en ce qui concerne le mode daction de la
substance, il peut tre utile deffectuer des prlvements sanguins afin de procder des analyses hmatologiques
et de biochimie clinique, mais la dcision concernant ces prlvements appartient au directeur de ltude. Des
analyses durine peuvent tre aussi appropries. Les donnes obtenues sur les animaux tudis dans la phase de
toxicit chronique, normalement dune dure de 12 mois (voir paragraphe 34), renseignent sur ces paramtres.
On trouvera des informations complmentaires sur lintrt de tels prlvements pour une tude de cancro
gense dans le document dorientation no 116 (7). Les ventuels prlvements sanguins sont recueillir la fin
de ltude, juste avant ou pendant le sacrifice des animaux. Ils sont effectus en un point dtermin, par exemple
par ponction cardiaque ou au niveau du sinus rtro-orbital, sous anesthsie. Des talements sanguins peuvent
aussi tre prpars en vue dun examen, notamment si la moelle osseuse semble tre lorgane cible, bien que
lutilit dun tel examen pour lvaluation du potentiel cancrogne/oncogne pendant la phase de cancrogense
ait t mise en question (38).
PATHOLOGIE
54. Tous les animaux de ltude lexception des sentinelles et autres animaux satellites (voir paragraphe 20), font
lobjet dune autopsie macroscopique complte et dtaille, comprenant un examen attentif de la surface externe
du corps et de tous les orifices ainsi que des cavits crnienne, thoracique et abdominale et de leurs contenus.
Lautopsie des sentinelles et autres animaux satellites peut tre effectue au cas par cas, la discrtion du
directeur de ltude. La pese des organes ne fait normalement pas partie dune tude de cancrogense car les
changements lis lge ou, dans des phases plus avances, au dveloppement de tumeurs rendent superflues les
donnes relatives au poids des organes. Ces donnes peuvent toutefois prsenter un grand intrt pour les
valuations fondes sur le poids de la preuve, notamment en ce qui concerne le mode daction. Si ces donnes
font partie dune tude satellite, elles sont collectes dans lanne suivant le dbut de ltude.
scopiques
muscle squelettique
rein
aorte
glande coagulante
nerf priphrique
[sternum]
[bulbe olfactif]
glande de Harder

testicule
ccum

bitale)
il (dont rtine)
thymus
cerveau (segments den

cphale, de cervelet et de

mles)
sophage
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thyrode
cur
glande salivaire
ovaire
trache
col utrin
glande surrnale
pancras
[uretre]
clon
hypophyse
parathyrode
[urtre]
[dents]
ilon
peau
utrus (col inclus)
duodnum
jjunum
poumon
vagin
pididyme
[langue]
prostate

moelle pinire rate
vsicule sminale
(niveaux cervical, mso

thoracique et lombaire)
segment de moelle
osseuse et/ou aspirat
frais
rectum
vessie
foie
conservs. Dans les tudes portant sur une administration par la voie cutane, il y a lieu dexaminer les organes
figurant sur la liste tablie pour la voie orale et de procder un prlvement et une conservation spcifiques de
conservs et examins est conforme aux recommandations des chapitres B.8 (8) et B.29 (9) de la prsente
annexe. Pour les autres organes et tissus (outre les tissus des voies respiratoires spcifiquement conservs), il
convient dexaminer les organes de la liste tablie pour la voie orale.
Histopathologie
toxicologique (40). Au minimum, les examens histopathologiques devront porter sur les tissus suivants:
tous les tissus prsentant des anomalies macroscopiques, notamment des tumeurs,
lorsque des altrations histopathologiques dues au traitement sont observes dans le groupe dose leve,
ces mmes tissus sont examins chez tous les animaux de tous les autres groupes de doses,
examins.
RSULTATS ET RAPPORT (CANCROGENSE ET TOXICIT CHRONIQUE)

Rsultats
toxicit observs, ainsi que le moment de lapparition, la dure et la gravit de tous les effets toxiques observs,
le nombre danimaux prsentant des lsions, les types de lsions et le pourcentage danimaux prsentant chaque
type de lsion. Les tableaux rcapitulatifs prsentent les moyennes et les carts-types (pour les donnes recueil
lies en continu) pour les animaux prsentant des effets toxiques ou des lsions, ainsi quune cotation des lsions.
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les donnes de contrle historiques manent du mme laboratoire, portent sur des animaux du mme ge et de
la mme souche, produits dans les cinq ans prcdant ltude en question.
59. Si possible, les rsultats numriques sont valus laide dune mthode statistique approprie et largement
reconnue. Les mthodes statistiques et les donnes analyser sont choisies au moment de la conception de
ltude (paragraphe 9). Ce choix permet doprer des ajustements en fonction de la survie, si ncessaire.
Substance dessai:
provenance de la substance,
numro de lot,
justification du choix du vhicule (sil est autre que leau).
Animaux dexprience:
espce/souche utilise et justification du choix fait,
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chaque animal)
Rsultats gnraux:
donnes toxicocintiques (si disponibles),
ophtalmoscopie (si disponible),
hmatologie (si disponible),
chimie clinique (si disponible).
Rsultats cliniques:
signes de toxicit,
incidence (et, si elle est value, svrit) de toute anomalie observe,
nature, svrit et dure des observations cliniques (transitoires ou permanentes).
Donnes relatives aux autopsies:
poids des organes et leur rapport au poids corporel, le cas chant,
rsultats dautopsie; incidence et svrit des anomalies.
Histopathologie:
observations deffets histopathologiques non noplasiques,
observations deffets histopathologiques noplasiques,
corrlation entre les observations macroscopiques et microscopiques,
description dtaille de tous les rsultats histopathologiques lis au traitement et chelle dvaluation de la
svrit,
apport sur lanalyse ventuelle des lames par des pairs.
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applicabilit des rsultats ltre humain.
Conclusions
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(8) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Srie sur les essais et valuations
(9) Chapitre B.8 de la prsente annexe. Toxicit subaigu par inhalation: tude sur 28 jours.
(10) Chapitre B.29 de la prsente annexe, Toxicit subchronique par inhalation: tude sur 90 jours.
(11) Chapitre B.9 de la prsente annexe, Toxicit doses rptes (28 jours) (administration cutane).
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Appendice 1
DFINITION
______
7) le chapitre B.36 est remplac par le texte suivant:
B.36. TOXICOCINTIQUE
INTRODUCTION
1.
chimiques. Les tudes portant sur la toxicocintique dune substance chimique dessai ont pour objet de fournir
des informations adquates sur labsorption, la distribution, la biotransformation (cest--dire le mtabolisme) et
lexcrtion de cette substance, de faciliter ltablissement dune relation entre la concentration ou la dose et la
toxicit observe, et daider comprendre le mcanisme de toxicit. La toxicocintique peut aider comprendre
les tudes de toxicologie en dmontrant que lexposition des animaux dexprience la substance dessai est de
nature systmique, et en rvlant quels sont les lments circulants (substance mre/mtabolites). Les principaux
paramtres toxicocintiques tirs de ces tudes fourniront galement des renseignements sur le potentiel dac
cumulation de la substance dessai dans les tissus et/ou organes, et sur le risque dinduction dune biotrans
formation sous leffet dune exposition cette substance.
2.
Les donnes toxicocintiques peuvent aider valuer ladquation et la pertinence des donnes de toxicit
animale, des fins dextrapolation des dangers pour lhomme et/ou dvaluation des risques. De plus, les
tudes de toxicocintique peuvent apporter des informations utiles pour dterminer les doses utiliser dans
les tudes de toxicit (cintique linaire vs non linaire), et les effets lis la voie dadministration, la biodis
ponibilit et autres aspects relatifs la conception de ltude. Certains types de donnes toxicocintiques peuvent
servir laborer des modles toxicocintiques base physiologique (TCBP).
3.
Les donnes sur la toxicocintique et le mtabolisme prsentent de lintrt plusieurs titres. Elles peuvent
notamment indiquer les toxicits et modes daction ventuels, ainsi que leur relation aux doses et la voie
dexposition. En outre, les donnes sur le mtabolisme peuvent apporter des informations utiles pour valuer
limportance, sur le plan toxicologique, de lexposition des mtabolites exognes de la substance dessai.
4.
Des donnes toxicocintiques adquates aideront confirmer lacceptabilit et lapplicabilit des mthodes
fondes sur les relations quantitatives structure-activit, les prvisions partir de donnes croises sur de subs
tances analogues ou le regroupement des substances pour valuer la scurit des substances chimiques. Les
donnes de cintique peuvent aussi servir valuer la pertinence toxicologique dautres tudes (par exemple in
vivo/in vitro).
5.
Sauf mention contraire (voir en particulier les paragraphes 74 78), la prsente mthode dessai suppose
ladministration orale de la substance dessai.
6.
Les rgimes rglementaires ont des exigences et des besoins diffrents quant aux effets et paramtres toxicoci
ntiques mesurer pour diffrentes classes de produits chimiques (par exemple pesticides, biocides, produits
industriels). Contrairement la plupart des autres, la prsente mthode dessai dcrit des essais de toxicocintique
impliquant des mesures et des effets observs multiples. lavenir, plusieurs nouvelles mthodes dessai et/ou
document(s) dorientation pourraient tre labors pour dcrire sparment et plus en dtail chaque effet mesur.
Dans le cas de la prsente mthode dessai, ce sont les exigences et/ou besoins de chaque dispositif rglementaire
qui dterminent les essais ou lvaluation mettre en uvre.
7.
De nombreuses tudes peuvent tre ralises pour valuer des fins rglementaires le comportement toxicoci
ntique dune substance dessai. Nanmoins, en fonction des besoins ou des situations rglementaires particu
lires, toutes ces tudes ne sont pas ncessaires lvaluation dun produit. Dans la conduite des tudes de
toxicocintique, il faut faire preuve de souplesse et prendre en considration les caractristiques de la substance
dessai. Dans certains cas, ltude dune srie prcise de questions peut suffire cerner les dangers et les risques
associs la substance dessai. Parfois, les donnes toxicocintiques peuvent tre collectes dans le cadre dune
valuation relevant dautres tudes toxicologiques. Dans dautres cas, il peut tre ncessaire de raliser des tudes
de toxicocintique supplmentaires et/ou plus approfondies, si la rglementation en vigueur lexige et/ou lorsque
lvaluation de la substance dessai soulve de nouvelles interrogations.
8.
Avant de lancer une tude, et pour en amliorer la qualit et viter une utilisation non ncessaire danimaux, le
laboratoire dessai prend en compte toutes les informations disponibles sur la substance dessai et sur ses
mtabolites et analogues pertinents. Parmi ces informations pourront figurer des donnes obtenues grce
dautres mthodes dessai appropries (tudes in vivo, in vitro, et/ou valuations in silico). Les proprits
physico-chimiques, comme le coefficient de partage octanol-eau (log POE), le pKa, lhydrosolubilit, la pression
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de vapeur et le poids molculaire dun produit chimique, peuvent tre utiles pour planifier ltude et interprter
ses rsultats. Les mthodes dcrites cet effet dans les diffrentes mthodes dessai permettront de les dterminer
LIMITATIONS
9.
La prsente mthode dessai ne vise pas les cas particuliers, comme les femelles gravides ou en lactation et leur
progniture, ni lvaluation de la prsence ventuelle de rsidus chez des animaux exposs servant lalimen
tation. Nanmoins, les donnes obtenues lissue dune tude mene selon la mthode B.36 peuvent fournir des
informations susceptibles dorienter la conception dtudes spcifiques sur ces sujets. La prsente mthode dessai
nest pas destine aux essais de nanomatriaux. Lexamen prliminaire des Lignes directrices de lOCDE pour les
essais de produits chimiques en vue dvaluer leur applicabilit aux nanomatriaux indique en effet que la ligne
directrice 417 (quivalente la prsente mthode dessai) peut ne pas sappliquer ces derniers (1).
DFINITIONS
10. Les dfinitions utilises aux fins de la prsente mthode dessai figurent en appendice.
CONSIDRATIONS RELATIVES AU BIEN-TRE DES ANIMAUX
11. On trouvera dans le document dorientation de lOCDE no 19 (2) des indications concernant le traitement
thiquement acceptable des animaux. La consultation de ce document est recommande pour toutes les
tudes in vivo et in vitro dcrites dans la prsente mthode dessai.
DESCRIPTION DES MTHODES
tudes pilotes
12. Pour le choix des paramtres exprimentaux sappliquant aux tudes de toxicocintique (par exemple mtabo
lisme, bilan massique, protocoles analytiques, dosage, exhalation de CO2, etc.), il est recommand et conseill de
recourir des tudes pilotes. La caractrisation de ces paramtres ne ncessite pas systmatiquement lemploi de
substances radiomarques.
Slection des animaux
Espces
13. Les espces (et souches) animales utilises pour les essais de toxicocintique sont de prfrence les mmes que
celles employes dans dautres tudes toxicologiques ralises avec la substance dessai concerne. Cest norma
lement le rat qui est retenu, puisque les tudes toxicologiques lutilisent massivement. Le recours dautres
espces, la place ou en complment, est lgitime si des tudes toxicologiques majeures indiquent des effets
toxiques significatifs sur ces espces, ou sil est dmontr que le comportement de ces dernires en termes de
toxicit/toxicocintique est plus pertinent pour lhomme. Il conviendra de justifier le choix de lespce animale et
de la souche.
14. Sauf mention contraire, la prsente mthode dessai suppose le rat comme espce dessai. Certains aspects de
cette mthode dessai pourraient devoir tre modifis en cas de recours une autre espce.
ge et souche
15. Il convient demployer de jeunes animaux adultes en bonne sant, gs normalement de 6 12 semaines au
moment de ladministration de la dose (voir galement les paragraphes 13 et 14). Lutilisation danimaux autres
que des jeunes adultes fait lobjet de justification. Tous les animaux ont peu prs le mme ge au dbut de
ltude. Les carts de poids entre individus ne dpassent pas 20 % du poids moyen du groupe dessai.
Idalement, la souche utilise est la mme que celle employe pour constituer la base de donnes toxicologiques
concernant la substance dessai.
16. Pour chaque dose teste, au minimum quatre animaux de mme sexe sont utiliss. Il convient de justifier le sexe
des animaux employs. Lutilisation danimaux des deux sexes (quatre mles et quatre femelles) est envisage sil
existe des lments attestant de diffrences de toxicit notables en fonction du sexe.
17. Les animaux sont en gnral placs dans des cages individuelles pendant la priode dessai. Lencagement collectif
se justifie dans des circonstances particulires. Lclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumire et
12 heures dobscurit. La temprature de lanimalerie dexprience est de 22 C ( 3 C) et lhumidit relative
de 30 70 %. Lalimentation pourra comporter une nourriture classique de laboratoire et de leau satit.
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Substance dessai
18. Une substance dessai radiomarque au 14C est utilise pour tous les aspects de ltude concernant le bilan
massique et lidentification des mtabolites; nanmoins, sil peut tre dmontr:
quil est possible dvaluer correctement le bilan massique et de procder lidentification des mtabolites
laide dune substance dessai non marque, et
que la spcificit et la sensibilit analytiques de la mthode utilisant une substance dessai non radioactive
sont gales ou suprieures celles quon obtiendrait avec une substance radiomarque,
alors il nest pas ncessaire de recourir une substance dessai radiomarque. Par ailleurs, dautres isotopes
radioactifs et stables peuvent tre employs, en particulier si llment en question cause la toxicit ou fait partie
de la portion toxique de la substance dessai. Si possible, le marqueur radioactif se situe dans une portion centrale
mtaboliquement stable (cest--dire qui nest pas changeable, nest pas limine par mtabolisme sous forme de
CO2, et nest pas incorpore dans lensemble des radicaux monocarbons de lorganisme) de la molcule. Le
marquage de sites multiples ou de rgions spcifiques de la molcule peut tre ncessaire pour suivre le devenir
mtabolique de la substance dessai.
19. Les substances dessai radiomarques et non radiomarques sont analyses laide de mthodes appropries
permettant dtablir leur puret et leur identit. La radiopuret de la substance dessai radioactive est la meilleure
quon puisse obtenir pour une substance donne (dans lidal, elle est suprieure 95 %) et un effort raisonnable
est fourni pour identifier les impurets prsentes hauteur de 2 % ou plus. La puret ainsi que lidentit et la
proportion des ventuelles impurets identifies sont incluses dans le rapport dessai. Certains programmes
rglementaires peuvent choisir de fournir des orientations supplmentaires pour aider dfinir et spcifier
les substances dessai composes de mlanges, ainsi que les mthodes de dtermination de la puret.
Choix des doses
tude pilote
20. Le plus souvent, une dose orale unique suffit pour ltude pilote. La dose est non toxique, mais suffisamment
leve pour permettre lidentification des mtabolites dans les excrta (et, le cas chant, dans le plasma), ainsi
que pour remplir lobjectif assign ltude pilote au paragraphe 12 de la prsente mthode dessai.
tudes principales
21. Pour les tudes principales, il est prfrable dadministrer un minimum de deux doses, car les informations
runies partir dau moins deux groupes de dose peuvent faciliter la dtermination des doses pour dautres
tudes de toxicit, ainsi que lvaluation de la relation dose-effet dessais de toxicit dj disponibles.
22. Lorsque deux doses sont administres, elles sont toutes deux suffisamment leves pour permettre lidentification
des mtabolites dans les excrta (et, le cas chant, dans le plasma). Les informations tires des tudes de toxicit
disponibles sont prises en compte pour le dosage. Si lon ne dispose pas dinformations (provenant, par exemple,
dtudes de toxicit orale aigu indiquant des signes cliniques de toxicit, ou dtudes de toxicit par doses
rptes), on peut envisager pour la dose la plus leve une valeur infrieure lestimation de la DL50 (voies orale
et cutane) ou de la CL50 (voie par inhalation), ou infrieure la valeur basse de la plage des estimations de
toxicit aigu. La dose la plus faible correspondra une fraction de la dose la plus leve.
23. Si un seul dosage est utilis, la dose est idalement suffisamment leve pour permettre lidentification des
mtabolites dans les excrta (et, le cas chant, dans le plasma), sans pour autant produire de toxicit apparente.
Il convient de justifier la dcision de ne pas inclure un second niveau de dose.
24. Si lon a besoin de dterminer leffet de la dose sur les processus cintiques, deux doses peuvent ne pas suffire et
il convient quau moins une dose soit assez leve pour saturer ces processus. Si laire sous la courbe des
concentrations plasmatiques en fonction du temps [area under the plasma concentration- time curve] (AUC) ne varie
pas de faon linaire entre deux niveaux de dose utiliss dans ltude principale, on peut en dduire que la
saturation dun ou de plusieurs des processus cintiques sopre quelque part entre ces deux niveaux de dose.
25. Pour les substances dessai faiblement toxiques, il convient demployer une dose maximale de 1 000 mg/kg de
poids corporel (voies orale et cutane) si ladministration se fait par inhalation, se rfrer au chapitre B.2 de la
prsente annexe; gnralement la dose nexcdera pas 2 mg/l. Des considrations spcifiques au produit peuvent
rendre ncessaire une dose suprieure, en fonction des besoins rglementaires. Le choix des doses fait toujours
lobjet dune justification.
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26. Les donnes relatives la toxicocintique ou la distribution tissulaire fondes sur une dose unique peuvent
convenir pour dterminer le potentiel daccumulation et/ou de persistance. Nanmoins, dans certaines circons
tances, ladministration de doses rptes peut tre ncessaire i) pour mieux valuer le potentiel daccumulation
et/ou de persistance, ou lvolution des paramtres toxicocintiques (par exemple induction et inhibition enzy
matiques), ou ii) pour rpondre aux exigences du dispositif rglementaire en vigueur. Dans les tudes doses
rptes, si ladministration de doses faibles suffit gnralement, il peut parfois savrer ncessaire dadministrer
des doses leves (voir galement le paragraphe 57).
Administration de la substance dessai
27. La substance dessai est dissoute ou mise en suspension homogne dans le mme vhicule que celui employ
pour les autres tudes de toxicit par gavage oral ralises avec la substance dessai, si des informations sont
disponibles ce sujet. Le choix du vhicule fait lobjet dune justification. Le choix du vhicule et le volume de
dosage sont pris en compte lors de la conception de ltude. La mthode dadministration classique est le gavage;
nanmoins, ladministration de la substance dans une capsule de glatine ou mlange la nourriture peut tre
avantageuse dans certaines situations (dans les deux cas, le choix fait lobjet dune justification). Il convient en
outre de vrifier la dose effectivement administre chaque animal.
28. Le volume maximal de liquide administrer par gavage oral en une seule fois dpend de la taille des animaux
dexprience, du type de vhicule de dosage, et de la suppression ou du maintien de la nourriture avant
ladministration de la substance dessai. La dcision de maintenir ou de restreindre lalimentation avant ladminis
tration de la dose fait lobjet dune justification. Normalement, le volume est aussi faible que possible, que le
vhicule employ soit aqueux ou non. Pour les rongeurs, le volume de dose ne dpasse pas normalement
10 ml/kg de poids corporel. Dans le cas de substances dessai plus lipophiles, les volumes de vhicule utiliss
peuvent tre de 4 ml/kg de poids corporel ou plus. En cas de doses rptes, si le jene quotidien est contreindiqu, il faut envisager des volumes de dose plus faibles (par exemple de 2 4 ml/kg de poids corporel). Si
possible, lutilisation de volumes de dose en accord avec ceux utiliss pour la substance dessai dans des tudes
orales par gavage est envisage.
29. Ladministration de la substance dessai en intraveineuse (IV) et sa mesure dans le sang et/ou les excrta peuvent
servir dterminer la biodisponibilit ou labsorption orale relative. Pour ce type dtude, une dose unique de la
substance dessai (gnralement quivalente, mais non suprieure, la dose orale la plus faible voir Choix des
doses) est administre laide dun vhicule appropri. Cette dose est administre dans un volume idoine (par
exemple 1 ml/kg de poids corporel) et au site choisi, au moins quatre animaux du sexe appropri (des animaux
des deux sexes peuvent tre employs sil y a lieu, voir paragraphe 16). Ladministration intraveineuse de la
substance dessai suppose de prparer une dose intgralement dissoute ou mise en suspension. On fera en sorte
que le vhicule choisi pour cette administration ninterfre pas avec le flux sanguin ou lintgrit des cellules
sanguines. Si la substance dessai est perfuse, la vitesse de perfusion est consigne et normalise pour tous les
animaux, condition quune pompe perfusion soit utilise. Il convient de recourir lanesthsie en cas de
canulation de la veine jugulaire (pour administrer la substance dessai et/ou faire un prlvement sanguin) ou si
lon utilise lartre fmorale pour ladministration. Le type danesthsie est mrement rflchi, car il peut avoir des
consquences toxicocintiques. Les animaux doivent pouvoir se rtablir avant que la substance dessai et le
vhicule leur soient injects.
30. Dautres voies dadministration, comme la voie cutane et linhalation (voir paragraphes 74 78) peuvent
galement convenir pour certaines substances dessai, en fonction de leurs proprits physico-chimiques et
des conditions dutilisation ou de la voie dexposition humaine prvisibles.
Mesures
Bilan massique
31. Le bilan massique est dtermin par la somme du pourcentage de la dose (radioactive) administre excrts dans
lurine, les fces et lair expir, et du pourcentage prsent dans les tissus, la carcasse rsiduelle, et le liquide de
lavage de la cage (voir paragraphe 46). En gnral, une rcupration totale de plus de 90 % de la substance
dessai (radioactivit) administre est considre comme satisfaisante.
Absorption
32. Une estimation initiale de labsorption peut tre ralise en excluant du bilan massique le pourcentage de la dose
retrouv dans le tractus gastro-intestinal et/ou dans les fces. Pour le calcul du pourcentage dabsorption, voir le
paragraphe 33. Pour lanalyse des excrta, voir les paragraphes 44 49. Si limportance exacte de labsorption
faisant suite ladministration dune dose orale ne peut tre tablie partir des tudes de bilan massique (par
exemple, lorsque plus de 20 % de la dose administre est prsente dans les fces), des explorations plus pousses
peuvent tre ncessaires. Elles peuvent comprendre soit 1) ladministration orale de la substance dessai et la
mesure de sa prsence dans la bile, soit 2) ladministration orale et intraveineuse de la substance dessai, et la
mesure de la quantit nette de substance prsente dans lurine, plus dans lair expir, plus dans la carcasse pour
chacune de ces deux voies. Dans les deux cas, la mesure de la radioactivit est utilise comme mthode de
substitution lanalyse spcifique de la substance dessai et de ses mtabolites.
33. Pour tudier lexcrtion biliaire, on administre gnralement la substance dessai par voie orale. Dans ce type
dtude, les voies biliaires dau moins quatre animaux du sexe appropri (ou des deux sexes le cas chant) sont
canules et une dose unique de la substance dessai est administre. Aprs ladministration, il convient de
surveiller aussi longtemps que ncessaire lexcrtion de radioactivit/substance dessai dans la bile, afin destimer
le pourcentage de la dose administre excrt par cette voie, ce qui peut ensuite servir calculer lampleur de
labsorption orale, de la manire suivante:
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Pourcentage dabsorption = (quantits prsentes dans la bile + lurine + lair expir + la carcasse hors tractus
gastro-intestinal)/quantit administre 100
34. Pour certaines classes de substances dessai, une scrtion directe de la dose absorbe peut avoir lieu au travers
des membranes intestinales. Dans ce cas, la mesure du pourcentage de la dose prsent dans les fces aprs
administration orale chez un rat aux voies biliaires canules nest pas juge reprsentative de la dose non
absorbe. Il est recommand, si on prvoit une scrtion intestinale, de calculer le pourcentage de la dose
absorb en estimant labsorption par comparaison de lexcrtion aprs administration par voie orale et par
voie intraveineuse (rat intact ou voies biliaires canules) (voir paragraphe 35). Il est galement conseill,
quand la quantification de la scrtion intestinale est juge ncessaire, de mesurer lexcrtion chez le rat
voies biliaires canules aprs administration intraveineuse de la dose.
Biodisponibilit
35. Il est possible de dterminer la biodisponibilit partir de la cintique plasmatique/sanguine des groupes oraux et
IV, comme dcrit aux paragraphes 50 52, par une analyse spcifique de la substance dessai et/ou de son (ses)
mtabolite(s) pertinent(s), cest--dire sans quil soit besoin de recourir une substance dessai radiomarque. Le
calcul de la biodisponibilit (F) de la substance dessai ou de son (ses) mtabolite(s) pertinents seffectue alors
comme suit:
F = (AUCexp/AUCIV) (DoseIV/Doseexp)
o AUC est laire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps et exp la voie dadminis
tration (orale, cutane ou par inhalation).
36. Afin dvaluer les risques lis aux effets systmiques, on prfre gnralement utiliser la biodisponibilit du
composant toxique plutt que le pourcentage dabsorption pour comparer les concentrations systmiques
provenant dtudes animales avec des donnes analogues de surveillance biologique tires dtudes sur lexposi
tion des travailleurs. La situation peut se complexifier si les doses se situent dans la plage non linaire, aussi
importe-t-il que ltude de toxicocintique dtermine des doses dans la plage linaire.
Distribution tissulaire
37. Connatre la distribution tissulaire dune substance dessai et/ou de ses mtabolites est important pour identifier
les tissus cibles, comprendre les mcanismes de toxicit luvre et obtenir des informations sur le potentiel
daccumulation et de persistance de la substance dessai et de ses mtabolites. Le pourcentage de dose (radioac
tive) totale dans les tissus et dans la carcasse rsiduelle est mesur au minimum la fin de ltude dexcrtion (par
exemple normalement 7 jours aprs le dosage ou moins en fonction du comportement spcifique de la sub
stance dessai). Lorsque aucune substance dessai nest dtecte dans les tissus la fin de ltude (par exemple
parce que la substance peut avoir t limine avant la fin de ltude en raison dune courte demi-vie), il convient
de prendre soin de ne pas mal interprter les donnes. Dans ce type de situation, la distribution tissulaire est
examine au moment du pic de concentration plasmatique/sanguine (Tmax) ou au maximum du taux dexcrtion
urinaire de la substance dessai (et/ou de ses mtabolites) selon le cas, (voir paragraphe 38). De plus, il se peut
que la collecte de tissues dautres moments soit ncessaire pour valuer la variation de la distribution en
fonction du temps (sil y a lieu), pour aider tablir le bilan massique, et/ou si une autorit comptente lexige.
Parmi les tissus prlever figurent le foie, la graisse, le tractus gastro-intestinal, le rein, la rate, le sang total, la
carcasse rsiduelle, les tissus des organes cibles et tout autre tissu potentiellement intressant pour lvaluation
toxicologique de la substance dessai, par exemple thyrode, hmaties, organes reproducteurs, peau, il (en
particulier pour les animaux pigments). On envisagera danalyser un plus large ventail de tissus aux mmes
moments afin doptimiser lutilisation des animaux et si des tudes de toxicit chronique ou subchronique
mettent en vidence une toxicit pour certains organes cibles. Il convient galement de consigner la concen
tration du rsidu (radioactif) et les ratios tissu-plasma (sanguin).
38. Il est possible que lvaluation de la distribution tissulaire dautres moments, tels quaux moments du pic de
concentration plasmatique/sanguine (par exemple Tmax) ou au maximum du taux dexcrtion urinaire, obtenue
partir des tudes de cintique plasmatique/sanguine ou dexcrtion respectivement, soit aussi ncessaire ou exige
par une autorit comptente. Cette information peut tre utile pour comprendre la toxicit et le potentiel
daccumulation et de persistance de la substance dessai et des mtabolites. Le choix des lments prlever
fait lobjet dune justification; les prlvements destins tre analyss sont gnralement les mmes que ceux
numrs au paragraphe 37.
39. Pour les tudes sur la distribution tissulaire, il est possible de quantifier la radioactivit en procdant la
dissection, lhomognisation, la combustion et/ou la solubilisation des organes, puis un comptage par
scintillation liquide des rsidus pigs. Certaines techniques, actuellement diffrents stades de dveloppement,
notamment lautoradiographie quantitative du corps entier et lautoradiographie microscopique des rcepteurs,
peuvent savrer utiles pour dterminer la distribution dune substance dessai dans les organes et/ou les tissus (3)
(4).
40. Pour les voies dadministration autres que la voie orale, on prlve et analyse des tissus spcifiques, comme les
poumons dans les tudes par inhalation ou la peau dans les tudes par voie cutane. Voir les paragraphes 74
78.
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Mtabolisme
41. On recueille les excrta (et, le cas chant, le plasma) afin didentifier et de quantifier la substance dessai et ses
mtabolites, non modifis, selon la mthode indique aux paragraphes 44 49. Il est acceptable de regrouper les
excrta pour faciliter lidentification des mtabolites au sein dun groupe de dose donn. Il est recommand
dtablir le profil des mtabolites chaque priode de ltude. Nanmoins, si labsence dchantillons ou de
radioactivit empche de le faire, il est acceptable de regrouper lurine et les fces recueillies diffrents
moments, mais provenant uniquement danimaux du mme sexe ayant reu la mme dose. Des mthodes
qualitatives et quantitatives appropries sont mises en uvre pour tudier lurine, les fces et la radioactivit
expire par les animaux traits, ainsi que la bile, le cas chant.
42. Un effort raisonnable est fait pour identifier tous les mtabolites prsents hauteur de 5 % ou plus de la dose
administre et pour fournir un schma mtabolique de la substance dessai. Il convient didentifier les substances
dessai ayant t caractrises, dans les excrta, comme comprenant 5 % ou plus de la dose administre.
Lidentification quivaut la dtermination exacte de la structure des composants. Habituellement, lidentification
est ralise en soumettant simultanment une chromatographie le mtabolite et des talons connus, en utilisant
deux systmes diffrents, ou grce des techniques mme de fournir une identification structurale positive, par
exemple spectromtrie de masse, rsonance magntique nuclaire (RMN), etc. Dans le cas dune co-chromato
graphie, il faut viter dutiliser des techniques chromatographiques employant la mme phase stationnaire avec
deux systmes de solvants diffrents pour vrifier lidentit de mtabolites, car alors les mthodes ne sont pas
indpendantes. Lidentification par co-chromatographie fait usage de deux systmes dissemblables, analytique
ment indpendants, par exemple une chromatographie sur couche mince (CCM) phase inverse et une CCM
phase normale, ou une CCM et une chromatographie liquide haute performance (CLHP). Du moment que la
qualit de la sparation chromatographique est acceptable, aucune confirmation supplmentaire par spectro
scopie nest demande. Les mthodes qui apportent des informations structurales, telles que la chromatographie
gazeuse/spectromtrie de masse (CG-SM), la chromatographie liquide/spectromtrie de masse (CL-SM), ou la
chromatographie liquide/spectromtrie de masse en tandem (CL-SM/SM) et la spectromtrie par RMN,
peuvent galement fournir une identification non ambigu.
43. Sil est impossible didentifier les mtabolites prsents hauteur de 5 % ou plus de la dose administre, il
convient de le justifier ou de lexpliquer dans le rapport final. Il peut tre avis didentifier les mtabolites
reprsentant moins de 5 % de la dose administre, afin de mieux comprendre la voie mtabolique en vue
dvaluer les dangers et/ou les risques lis la substance dessai. Une confirmation de la structure de ces
mtabolites est autant que possible fournie. Pour cela, il pourra tre ncessaire dtablir leur profil dans le
plasma, le sang ou dautres tissus.
Excrtion
44. Le taux et limportance de lexcrtion de la dose administre sont dtermins par la mesure du pourcentage de la
dose (radioactive) retrouv dans lurine, les fces et lair expir. Ces donnes aideront galement tablir le bilan
massique. Les quantits de substance dessai (radioactivit) limines dans lurine, les fces et lair expir sont
values des intervalles de temps appropris (voir les paragraphes 47 49). Les expriences doses rptes
sont conues de manire permettre dobtenir des donnes sur lexcrtion, afin de remplir les objectifs dfinis au
paragraphe 26. On pourra ainsi effectuer des comparaisons avec les expriences dose unique.
45. Si une tude pilote montre que la substance dessai (radioactivit) nest pas excrte en quantits significatives
(voir paragraphe 49) dans lair expir, il ne sera pas ncessaire de collecter celui-ci dans le cadre de ltude
dfinitive.
46. Chaque animal est plac, pour la collecte des excrta (urine, fces et air expir), dans une unit individuelle
dtude du mtabolisme. la fin de chaque priode de collecte (voir paragraphes 47 49), ces units sont
rinces laide dun solvant appropri (lavage de la cage) pour assurer une rcupration maximale de la substance
dessai (radioactivit). La collecte des excrta sachve au bout de 7 jours, ou aprs rcupration, avant ce dlai,
dau moins 90 % de la dose administre.
47. La quantit totale de substance dessai (radioactivit) dans lurine est dtermine deux moments au moins de la
premire journe de collecte, dont une fois 24 h aprs ladministration de la dose, puis quotidiennement jusqu
la fin de ltude. Il est recommand de retenir plus de deux points dchantillonnage pendant la premire journe
(par exemple, 6 h, 12 h et 24 h aprs ladministration de la dose). Les rsultats des tudes pilotes sont analyss
afin dobtenir des informations sur les moments de collecte alternatifs ou supplmentaires mettre en uvre. Le
calendrier de collecte fait lobjet dune justification.
48. La quantit totale de substance dessai (radioactivit) dans les fces est dtermine quotidiennement, 24 h aprs
ladministration de la dose et jusqu la fin de ltude, sauf si les tudes pilotes suggrent deffectuer des
prlvements plus frquents ou dautres moments. Dans ce cas, une justification est fournie.
49. La collecte du CO2 expir et dautres produits volatils peut tre interrompue dans une tude donne quand on
retrouve moins de 1 % de la dose administre dans lair exhal pendant 24 h de collecte.
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tudes en fonction du temps

Cintique sanguine/plasmatique
50. Ces tudes visent estimer les principaux paramtres toxicocintiques [par exemple Cmax, Tmax, demi-vie (t1/2),
AUC] concernant la substance dessai. Elles peuvent se mener dose unique, mais impliquent gnralement deux
doses ou plus. Le dosage est dfinir en fonction de la nature de lexprience et/ou de la question tudie. Des
donnes cintiques peuvent tre ncessaires pour rsoudre des questions comme la biodisponibilit de la sub
stance dessai et/ou dterminer leffet de la dose sur llimination (cest--dire pour tablir si la saturation de
llimination dpend ou non de la dose).
51. Pour ce type dtude, il convient dutiliser au moins quatre animaux du mme sexe par groupe de dose. Le choix
du sexe des animaux employs fait lobjet dune justification. Lutilisation danimaux des deux sexes (quatre mles
et quatre femelles) est envisage sil existe des lments attestant de diffrences de toxicit notables en fonction
du sexe.
52. Aprs ladministration de la substance dessai (radiomarque), il convient de prlever des chantillons de sang sur
chaque animal, des moments et selon une mthode appropris. Le volume et le nombre des chantillons
sanguins prlevs par animal sont susceptibles dtre limits par les effets ventuels de prlvements rpts sur
la sant/la physiologie des animaux et/ou par la sensibilit de la mthode analytique. Les chantillons seront
analyss sparment pour chaque animal. Dans certaines circonstances (par exemple caractrisation des mta
bolites), il peut tre ncessaire de regrouper les chantillons prlevs sur plusieurs animaux. Ces chantillons
regroups sont clairement identifis, et le regroupement fait lobjet dune explication. Si une substance dessai
radiomarque est utilise, il peut y avoir lieu danalyser la radioactivit totale. Dans ce cas, lanalyse est effectue
dans le sang total et le plasma, ou dans le plasma et les globules rouges, pour permettre de calculer le rapport
sang/plasma. Dans dautres circonstances, il peut tre ncessaire de procder une tude plus approfondie
requrant lidentification du compos parent et/ou de ses mtabolites, ou dvaluer la fixation aux protines.
Autres tudes de cintique tissulaire
53. Ces tudes ont pour objet dobtenir des informations sur lvolution dans le temps afin de rpondre des
questions lies notamment au mode daction toxique, la bioaccumulation et la biopersistance en dterminant
la concentration de la substance dessai dans diffrents tissus. Le choix des tissus et le nombre de points
temporels valus dpendront de laspect tudi et de la base de donnes toxicologiques disponible sur la
substance dessai. Pour concevoir ces tudes de cintique tissulaire complmentaires, il convient de tenir
compte des informations recueillies dcrites aux paragraphes 37 40. Ces tudes peuvent ncessiter un
dosage unique ou un dosage rpt. La mthode retenue fait lobjet dune justification dtaille.
54. Des tudes de cintique tissulaire complmentaires peuvent tre entreprises:
lorsquon constate une demi-vie sanguine allonge, suggrant la possibilit dune accumulation de la sub
stance dessai dans diffrents tissus, ou
pour voir si un niveau dtat stationnaire a t atteint dans des tissus particuliers (dans des tudes doses
rptes, par exemple, mme quand un niveau dtat stationnaire a apparemment t atteint dans le sang, il
peut tre utile de sassurer quil en est de mme dans les tissus cibles).
55. Pour ce type dtude en fonction du temps, il convient dadministrer une dose orale approprie de la substance
dessai au moins quatre animaux par dose et par point temporel, et de surveiller lvolution dans le temps de la
distribution dans les tissus choisis. moins quune toxicit spcifique lie au sexe ait t observe, on emploiera
des animaux dun seul sexe. La question de savoir si lanalyse doit porter sur la radioactivit totale ou sur la
substance mre et/ou ses mtabolites dpendra du problme trait. La distribution tissulaire est value laide
des techniques appropries.
Induction/inhibition enzymatique
56. Des tudes sur les effets possibles de linduction/inhibition enzymatique ou sur la biotransformation de la
substance dessai concerne peuvent tre ncessaires dans lun ou plusieurs des cas suivants:
1) lorsque des lments indiquent une relation entre la biotransformation de la substance dessai et laugmen
tation de la toxicit;
2) lorsque les donnes de toxicit disponibles indiquent une relation non linaire entre la dose et le mtabo
lisme;
3) si les tudes sur lidentification des mtabolites rvlent un mtabolite potentiellement toxique qui pourrait
tre le produit dune voie enzymatique induite par la substance dessai;
4) pour expliquer des effets a priori lis des phnomnes dinduction enzymatique;
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5) si lon observe des modifications toxicologiques importantes dans le profil mtabolique de la substance
dessai, dans le cadre dexpriences in vitro ou in vivo menes sur diffrentes espces ou dans diffrentes
conditions, il peut tre ncessaire de caractriser lenzyme ou les enzymes impliques (par exemple, des
enzymes de phase I comme les isoenzymes constituant le systme des mono-oxygnases cytochrome P
450, des enzymes de phase II comme les isoenzymes de la sulfotransfrase ou de luridine diphosphate
glucuronosyltransfrase, ou tout autre enzyme pertinente). Ces informations peuvent servir valuer la
pertinence des extrapolations interespces.
57. Pour valuer les variations toxicocintiques lies la substance dessai, il convient de mettre en uvre des
protocoles dtude adquats, convenablement valids et justifis. Ces tudes peuvent par exemple consister
administrer des doses rptes dune substance dessai non marque, puis une dose unique radiomarque le
14e jour, ou des doses rptes dune substance dessai radiomarque et des chantillonnages les 1er, 7e et 14e
jours pour dterminer le profil des mtabolites. Ladministration de doses rptes dune substance dessai
radiomarque peut galement fournir des renseignements sur la bioaccumulation (voir paragraphe 26).
MTHODES COMPLMENTAIRES
58. Outre les expriences in vivo dcrites dans la prsente mthode dessai, des mthodes complmentaires peuvent
fournir des informations sur labsorption, la distribution, le mtabolisme ou llimination dune substance dessai
chez certaines espces.
Utilisation dinformations in vitro
59. Plusieurs aspects concernant le mtabolisme de la substance dessai peuvent tre tudis dans le cadre dtudes in
vitro faisant appel des systmes dessai appropris. Des hpatocytes frachement isols ou en culture et des
fractions subcellulaires (par exemple microsomes et cytosol ou fraction S9) du foie peuvent servir tudier les
mtabolites possibles. Le mtabolisme local dans lorgane cible, par exemple le poumon, peut tre intressant
pour lvaluation des risques. cette fin, les fractions microsomales des tissus cibles peuvent tre utiles. Les
tudes sur microsomes peuvent permettre de traiter les diffrences potentielles entre les sexes et selon les stades
de la vie, et de caractriser les paramtres enzymatiques (Km et Vmax) qui peuvent aider valuer la dosedpendance du mtabolisme en lien avec les niveaux dexposition. En outre, les microsomes peuvent permettre
didentifier les enzymes microsomales impliques dans le mtabolisme de la substance dessai qui peuvent servir
pour lextrapolation inter-espces (voir aussi paragraphe 56). On peut galement examiner le potentiel dinduc
tion de la biotransformation laide de fractions subcellulaires du foie (par exemple, microsomes et cytosol)
danimaux prtraits par la substance dessai concerne, par le biais dtudes in vitro dinduction sur les hpa
tocytes, ou partir de lignes cellulaires spcifiques exprimant des enzymes pertinentes. Dans certaines circons
tances et certaines conditions, on peut envisager dutiliser des fractions subcellulaires provenant de tissus
humains, afin de dterminer les ventuelles diffrences entre espces en matire de biotransformation. Les
rsultats dtudes in vitro peuvent galement servir llaboration de modles toxicocintiques base physio
logique (TCBP) (5).
60. Les tudes dabsorption cutane in vitro peuvent fournir des renseignements supplmentaires pour caractriser
labsorption (6).
61. Des cultures primaires de cellules hpatiques et des coupes de tissus frais peuvent tre utilises pour rpondre
aux mmes questions que les microsomes hpatiques. Dans certains cas, il est possible de rpondre certaines
questions en utilisant des lignes cellulaires exprimant spcifiquement lenzyme pertinente ou des lignes cellu
laires gntiquement modifies. Il peut aussi tre utile dtudier linhibition et linduction disoenzymes particu
lires du cytochrome P450 (par exemple CYP1A1, 2E1, 1A2, etc.) et/ou denzymes de phase II par le compos
parent dans le cadre dessais in vitro. Les informations obtenues peuvent prsenter de lintrt pour des composs
de structure proche.
Utilisation des donnes toxicocintiques provenant dtudes de toxicit
62. Lanalyse des chantillons de sang, de tissus et/ou dexcrta obtenus au cours dautres tudes de toxicit peut
fournir des donnes sur la biodisponibilit, lvolution de la concentration plasmatique dans le temps (AUC,
Cmax), le potentiel de bioaccumulation, les taux dlimination et les variations mtaboliques et cintiques lies au
sexe ou au stade de vie.
63. Le plan dtude peut aussi tre adapt pour rpondre des questions concernant la saturation de labsorption, les
voies de biotransformation ou dexcrtion des doses plus leves, lemprunt de nouvelles voies mtaboliques
des doses plus leves, ou la limitation des mtabolites toxiques des doses plus leves.
64. Dautres aspects lis lvaluation des dangers peuvent aussi tre abords, notamment:
la sensibilit en fonction de lge, qui dpend de ltat de la barrire hmato-encphalique, des reins et/ou des
capacits de dtoxication,
la sensibilit de certaines sous-populations due des diffrences de capacit de biotransformation ou
dautres diffrences toxicocintiques,
lampleur de lexposition du ftus par transfert transplacentaire des produits chimiques ou de celle du
nouveau-n par le biais de la lactation.
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Utilisation de modles toxicocintiques

65. Les modles toxicocintiques peuvent contribuer diffrents aspects de lvaluation des dangers et des risques,
par exemple la prvision de lexposition systmique et de la dose dlivre aux tissus internes. En outre, pour
aborder des questions particulires portant sur le mode daction, ces modles peuvent servir de base lextra
polation entre espces, entre voies dexposition, entre dosages, et des fins dvaluation des risques pour
lhomme. Les donnes utiles llaboration de modles TCBP pour une substance dessai sur une espce
quelconque sont 1) les coefficients de partage, 2) les constantes biochimiques et paramtres physiologiques,
3) les paramtres dabsorption des diffrentes voies dexposition et 4) les donnes cintiques in vivo pour
lvaluation des modles [par exemple paramtres dlimination pour les voies dexcrtion pertinentes
(> 10 %), Km et Vmax pour le mtabolisme]. Les donnes exprimentales utilises pour laborer le modle
sont obtenues par des mthodes scientifiquement valables, et les rsultats du modle sont valids. Les paramtres
spcifiques la substance dessai ou lespce, comme le taux dabsorption, le coefficient de partage sang-tissu et
les constantes de vitesse mtabolique, sont souvent dtermins pour faciliter llaboration de modles non
compartimentaux ou base physiologique (7).
RSULTATS ET RAPPORT
66. Il est recommand de faire figurer une table des matires dans le rapport dessai.
Corps du rapport
67. Le corps du rapport prsente les informations dcrites par la prsente mthode dessai, organises en sections et
paragraphes de la manire suivante:
Rsum
68. Cette section du rapport dtude rsume la conception de ltude et dcrit les mthodes utilises. Elle met
galement en relief les principaux rsultats concernant le bilan massique, la nature et limportance des mtabo
lites, les rsidus tissulaires, le taux dlimination, le potentiel de bioaccumulation, les diffrences lies au sexe, etc.
Ce rsum est suffisamment dtaill pour permettre une valuation des rsultats.
Introduction
69. Cette section du rapport prsente les objectifs de ltude, les raisons layant motive et les principes de sa
conception, ainsi que les rfrences utiles et un historique permettant de la resituer.
Matriels et mthodes
70. Cette section du rapport dcrit en dtail toutes les informations pertinentes, notamment:
a) Substance dessai
Cette sous-section porte sur lidentification de la substance dessai: nom chimique, structure molculaire,
dtermination qualitative et quantitative de sa composition chimique, puret chimique et, si possible, type
et quantit des ventuelles impurets. Elle comprend galement des informations sur les proprits physicochimiques de la substance, notamment: tat physique, couleur, coefficient de solubilit et/ou de partage brut,
stabilit et, ventuellement, corrosivit. Le cas chant, des informations sont galement donnes sur les
isomres. Si la substance dessai est radiomarque, cette sous-section renseigne sur le type de radionuclide, la
position du marqueur, lactivit spcifique et la puret radiochimique.
Il convient dindiquer le type de vhicule, diluant, agent de suspension, mulsifiant ou autre matriau utilis
pour administrer la substance dessai, ou den donner une description.
b) Animaux dexprience
Cette sous-section renseigne sur les animaux dexprience, notamment: choix de lespce et de la souche et
justification de ce choix, ge au dbut de ltude, sexe, poids corporel, tat de sant et conditions dlevage.
c) Mthodes
Cette sous-section dcrit en dtail la conception de ltude et la mthode utilise. Elle comprend les lments
suivants:
1) justification des ventuelles modifications apportes la voie ou aux conditions dexposition, sil y a lieu;
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2) justification du choix des niveaux de dose;

3) description des ventuelles tudes pilotes utilises pour la conception exprimentale des tudes de suivi.
Les donnes lappui des tudes pilotes sont jointes;
4) mode de prparation de la solution administre et, le cas chant, type de solvant ou de vhicule;
5) nombre de groupes de traitement et nombre danimaux par groupe;
6) niveaux et volume des doses (et, si la radioactivit est utilise, activit spcifique de la dose);
7) voie(s) et mthodes dadministration;
8) frquence dadministration;
9) priode de jene (le cas chant);
10) radioactivit totale par animal;
11) manipulation des animaux;
12) collecte et traitement des chantillons;
13) mthodes danalyse utilises pour la sparation, la quantification et lidentification des mtabolites;
14) limites de dtection des mthodes employes;
15) autres mesures et protocoles exprimentaux utiliss (notamment validation des mthodes danalyse des
mtabolites).
d) Analyse statistique
Si on recourt lanalyse statistique pour dpouiller les rsultats de ltude, il convient dapporter suffisamment
dinformations sur la mthode danalyse et le logiciel employs pour quun examinateur/statisticien indpen
dant puisse rvaluer et reconstruire lanalyse.
Si on recourt une modlisation systmique (par exemple un modle TCBP), la prsentation du modle
employ comporte une description complte du modle, afin quun expert indpendant puisse reconstruire et
valider celui-ci (voir le paragraphe 65 et lappendice des dfinitions).
Rsultats
71. Toutes les donnes sont rcapitules et prsentes sous forme de tableaux accompagns dune valuation
statistique approprie, comme dcrit dans la prsente section. Les donnes rsultant du comptage de la radioac
tivit sont rcapitules et prsentes de manire approprie ltude, gnralement en microgrammes ou milli
grammes dquivalents par masse dchantillon, mais dautres units peuvent tre utilises. Cette section comporte
des graphiques illustrant les rsultats, reproduit les donnes chromatographiques et spectromtriques reprsen
tatives, identifie/quantifie les mtabolites et prsente les voies mtaboliques proposes, y compris la structure
molculaire des mtabolites. En outre, les renseignements suivants figurent, le cas chant, dans cette section:
1) quantit et pourcentage de rcupration de la radioactivit dans lurine, les fces, lair expir, ainsi que dans
lurine et les fces rcupres lors du nettoyage de la cage.
Pour les tudes par voie cutane, inclure galement les donnes relatives la rcupration de la substance
dessai sur la peau traite et lors du nettoyage cutan, les donnes sur la radioactivit rsiduelle prsente
dans le dispositif couvrant la peau et lunit dtude du mtabolisme, ainsi que les rsultats de ltude de
nettoyage cutan; pour plus de prcisions, voir les paragraphes 74 77.
Pour les tudes par inhalation, inclure galement des donnes sur la rcupration de la substance dessai
dans les poumons et dans les tissus nasaux (8); pour plus de prcisions, voir le paragraphe 78;
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2) distribution tissulaire, en pourcentage de la dose administre et en concentration (microgrammes dquiva

lents par gramme de tissu) et ratios tissu/sang et tissu/plasma;
3) bilan-matire labor pour chaque tude impliquant lanalyse des tissus et des excrta;
4) concentrations plasmatiques et paramtres toxicocintiques (biodisponibilit, AUC, Cmax, Tmax, limination,
demi-vie) aprs administration de la substance par la ou les voies dexposition pertinentes;
5) vitesse et importance de labsorption de la substance dessai aprs administration par la ou les voies dexpo
sition pertinentes;
6) quantits de substance dessai et de mtabolites (en pourcentage de la dose administre) collectes dans les
excrta;
7) rfrence aux donnes prsentes en annexe, qui comprennent les donnes par animal pour tous les critres
de mesure (par exemple administration de la dose, pourcentage de rcupration, concentrations, paramtres
toxicocintiques, etc.);
8) graphique reprsentant les voies mtaboliques proposes et la structure molculaire des mtabolites.
Discussion et conclusions
72. Dans cette section, il convient pour le ou les auteurs de:
1) proposer une voie mtabolique, en sappuyant sur les rsultats concernant le mtabolisme et llimination de
la substance dessai;
2) examiner les ventuelles diffrences potentielles lies lespce ou au sexe concernant llimination et/ou la
biotransformation de la substance dessai;
3) prsenter dans un tableau et examiner lidentit et limportance des mtabolites, les taux dlimination, le
potentiel de bioaccumulation et le niveau des rsidus tissulaires de la substance mre et/ou de ses mtabolites,
ainsi que les ventuelles modifications dose-dpendantes des paramtres toxicocintiques, sil y a lieu;
4) intgrer cette section toute donne toxicocintique pertinente obtenue au cours dtudes de toxicit;
5) formuler une conclusion succincte pouvant tre taye par les rsultats de ltude;
6) ajouter des sections supplmentaires (si ncessaire ou opportun).
73. Les sections supplmentaires serviront prsenter des informations bibliographiques, tableaux, graphiques,
annexes, etc.
AUTRES VOIES DEXPOSITION
Voie cutane
Traitement cutan
74. Cette section fournit des renseignements spcifiques sur les tudes de toxicocintique par voie cutane. Pour
labsorption cutane, il convient de consulter le chapitre B.44 [Absorption cutane: mthode in vivo (9)] de la
prsente annexe. Pour dautres effets observs, tels que la distribution et le mtabolisme, la prsente mthode
dessai B.36 peut tre utilise. Pour le traitement par voie cutane, on peut utiliser un ou plusieurs niveaux de
dose. La substance dessai (cest--dire la prparation pure, dilue ou le mlange contenant la substance dessai
appliquer sur la peau) est identique (ou reprsente un substitut raliste) aux produits auxquels pourraient tre
exposs lhomme ou les autres espces cibles potentielles. Le choix du ou des niveaux de dose seffectue
conformment aux indications des paragraphes 20 26 de la prsente mthode dessai. Parmi les facteurs
prendre en considration figurent lexposition humaine potentielle et/ou les doses auxquelles une toxicit a t
observe au cours dautres tudes de toxicit cutane. Si ncessaire, il convient de dissoudre la ou les doses
cutanes dans un vhicule adquat et de les appliquer dans un volume adapt leur administration. Peu de
temps avant lessai, la fourrure de la rgion dorsale du tronc des animaux tester est tondue. Le rasage peut tre
employ mais il est effectu environ 24 heures avant lessai. Lorsque la fourrure est rase ou tondue, cette
opration seffectue en vitant toute lsion de la peau qui pourrait entraner une modification de sa permabilit.
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Environ 10 % de la superficie corporelle sont dgags pour application de la substance dessai. Dans le cas de
substances dessai hautement toxiques, la zone couverte peut tre plus petite, mais il convient de recouvrir une
surface aussi large que possible dune pellicule mince et uniforme. La surface de traitement utilise est la mme
pour tous les groupes dessai par voie cutane. Les zones traites sont recouvertes laide dune protection
adapte maintenue en place. Les animaux sont encags sparment.
75. Une tude de nettoyage cutan est mene afin dvaluer la quantit de la dose applique susceptible dtre retire
de la peau lors dun lavage de la zone traite au savon doux et leau. Cette tude peut galement aider tablir
le bilan massique quand la substance dessai est administre par voie cutane. Pour ce type dtude, il convient
dappliquer une dose unique de la substance dessai deux animaux. Le niveau de dose est choisi conformment
aux indications du paragraphe 23 de la prsente mthode dessai (voir galement le paragraphe 76 propos du
temps de contact avec la peau). La quantit de substance dessai rcupre lors de ce lavage permet dvaluer
lefficacit dlimination de la substance dessai par la procdure de nettoyage.
76. Sauf si sa corrosivit lempche, la substance dessai est applique et maintenue sur la peau pendant un minimum
de 6 heures. Une fois la protection retire, la zone traite est lave selon la procdure dcrite pour ltude de
nettoyage cutan (voir paragraphe 75). La protection et la solution ayant servi au nettoyage sont analyses la
recherche de rsidus de la substance dessai. la fin de ltude, les animaux sont euthanasis conformment
(2), et la peau traite est prleve. Une section approprie de la peau traite est analyse pour dterminer la
prsence rsiduelle de la substance dessai (radioactivit).
77. Pour lvaluation toxicocintique des produits pharmaceutiques, des procdures diffrentes peuvent tre nces
saires, en accord avec les dispositions rglementaires.
Inhalation
78. Pour ce type dtude, on utilise une concentration unique de la substance dessai, ou davantage si ncessaire. Le
choix de la ou des concentrations seffectue conformment aux indications des paragraphes 20 26 de la
prsente mthode dessai. Les traitements par inhalation seront mens laide dun appareillage de type cne
nasal ou tte seule pour empcher labsorption par dautres voies dexposition (8). Si dautres mthodes
dexposition par inhalation sont retenues, il convient de justifier et de documenter ce choix. La dure dexpo
sition par inhalation est dfinie; elle est gnralement comprise entre 4 et 6 heures.
BIBLIOGRAPHIE:
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terials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OCDE, Paris.
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based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharma
cology 50: 400 411.
(6) Chapitre B.45 de la prsente annexe, Absorption cutane: mthode in vitro.
(7) IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-Based Pharmacokinetic Models in Risk Assess
ment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Genv, Organisation mondiale de la sant, Programme
international sur la scurit des substances chimiques.
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(9) Chapitre B.44 de la prsente annexe, Absorption cutane: mthode in vivo.

(10) Barton H.A. et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
(11) Gibaldi M. and Perrier D., (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York.
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Appendice
DFINITIONS
Absorption orale: pourcentage de la dose de substance dessai absorb partir du site dadministration ( savoir le
tractus gastro-intestinal). Ce paramtre essentiel peut permettre de comprendre quelle proportion de la substance dessai
administre atteint la veine porte, et par la suite le foie.
Absorption: processus par le(s)quel(s) une substance chimique pntre dans, ou traverse, des tissus. Labsorption se rfre
au compos parent et tous ses mtabolites. ne pas confondre avec la biodisponibilit.
Accumulation (bioaccumulation): augmentation dans le temps de la quantit dune substance dessai prsente dans les
tissus (gnralement les tissus adipeux, la suite dune exposition rpte); si une substance dessai pntre dans le corps
une vitesse suprieure son taux dlimination, cette substance saccumule dans lorganisme et peut atteindre des
concentrations toxiques.
ADME: acronyme de Absorption, Distribution, Mtabolisme et Excrtion.
AUC (aire sous la courbe des concentrations plasmatiques): aire sous la courbe dans un diagramme reprsentant
lvolution dans le temps de la concentration dune substance dessai dans le plasma. Cette aire correspond la quantit
totale de substance dessai absorbe par le corps pendant une priode de temps prdfinie. Dans des conditions de
linarit, lAUC (du temps zro linfini) est proportionnelle la quantit totale de substance dessai absorbe par le corps,
indpendamment du taux dabsorption.
Autoradiographie microscopique des rcepteurs (microautoradiographie des rcepteurs): cette technique peut
servir tudier linteraction xnobiotique avec des sites tissulaires ou des populations cellulaires spcifiques, par
exemple dans le cadre dtudes sur la fixation au rcepteur ou le mode daction spcifique qui peuvent ncessiter une
qualit de rsolution et de sensibilit impossible obtenir par dautres techniques comme lautoradiographie du corps
entier.
Autoradiographie (autoradiographie du corps entier): cette technique, qui sert dterminer qualitativement et/ou quan
titativement la localisation tissulaire dune substance dessai radioactive, utilise limagerie par rayons X ou, innovation plus
rcente, limagerie numrique par plaque au phosphore pour visualiser les molcules ou fragments de molcules radio
marqus en enregistrant le rayonnement mis au sein de lobjet tudi. Par rapport la dissection des organes, lauto
radiographie quantitative du corps entier peut prsenter des avantages pour valuer la distribution de la substance dessai,
la rcupration globale et la rsolution du matriau radioactif dans les tissus. Par exemple, on peut utiliser cette technique
sur un modle animal pigment, afin dvaluer lassociation possible de la substance dessai avec la mlanine, qui peut se
lier certaines molcules. Cependant, tout en offrant un moyen commode de visualiser lensemble des sites de fixation de
grande capacit et de faible affinit dans le corps entier, cette technique est probablement moins performante pour
identifier des sites cibles spcifiques tels que les sites de liaison au rcepteur, dont la dtection ncessite une rsolution et
une sensibilit relativement leves. Lorsquon recourt lautoradiographie, les expriences visant dterminer le bilan
massique du compos administr sont menes sur un groupe spar ou dans le cadre dune tude distincte de ltude de
distribution tissulaire, dans laquelle tous les excrta (qui peuvent inclure galement lair expir) et toutes les carcasses sont
homogniss et analyss par comptage scintillation liquide.
Bilan massique: comptabilit des entres de la substance dessai dans le systme, et de ses sorties de celui- ci.
Bilan matire: voir bilan massique.
Bioaccumulation: voir Accumulation.
Biodisponibilit: fraction dune dose administre qui atteint la circulation systmique ou est rendue disponible sur le site
de lactivit physiologique. Gnralement, la biodisponibilit dune substance dessai se rfre au compos parent, mais elle
peut galement se rfrer ses mtabolites. Elle ne tient compte que dune seule forme chimique. Nota bene biodispo
nibilit et absorption ne sont pas synonymes. La diffrence, par exemple, entre labsorption orale (cest--dire la prsence
dans la paroi intestinale et la veine porte) et la biodisponibilit (cest--dire la prsence dans le sang systmique et dans les
tissus) peut, entre autres facteurs, provenir de la dgradation chimique lie au mtabolisme de la paroi intestinale, lefflux
vers la lumire intestinale ou encore au mtabolisme prsystmique dans le foie (10). La biodisponibilit du composant
toxique (compos parent ou mtabolite) est un paramtre essentiel, dans lvaluation des risques pour la sant humaine
(extrapolation de dose leve faible, extrapolation de voie voie), pour driver une valeur interne de la dose sans effet
nocif observ (DSENO) ou de la dose de rfrence (BMD) externes (dose applique). Pour tudier les effets sur le foie en
cas dadministration orale, labsorption orale suffit. Nanmoins, pour valuer tout autre effet que leffet la porte dentre,
la biodisponibilit est gnralement un paramtre plus fiable pour lvaluation des risques.
Biopersistance: voir Persistance.
Biotransformation: conversion chimique (gnralement enzymatique), dans lorganisme, dune substance dessai donne
en une autre. Synonyme de mtabolisme.
Cmax: concentration maximale (pic de concentration) dans le sang (plasma/srum) aprs ladministration, ou excrtion
maximale (pic dexcrtion) urinaire ou fcale aprs ladministration.
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Coefficient de partage: galement appel coefficient de distribution, il mesure la solubilit diffrentielle dune substance
chimique dans deux solvants.
Compartiment: portion (ou unit) structurelle ou biochimique dun corps, dun tissu ou dune cellule spare du reste de
ce corps, de ce tissu ou de cette cellule.
Concentration sanguine (plasmatique) ltat stationnaire: tat hors quilibre dun systme ouvert dans lequel toutes
les forces agissant sur le systme sont exactement contrebalances par des forces opposes, de sorte que tous les
composants du systme ont une concentration stationnaire, bien que de la matire scoule au travers de ce systme.
Concentration sanguine (plasmatique/srique) maximale: concentration maximale (pic de concentration) dans le sang
(plasma/srum) aprs ladministration (voir aussi Cmax).
Demi-vie (t1/2): temps ncessaire pour que la concentration de la substance dessai diminue de moiti dans un compar
timent. Elle se rfre gnralement la concentration plasmatique ou la quantit de substance dessai prsente dans
lensemble du corps.
Distribution: dispersion dune substance dessai et de ses drivs au travers dun organisme.
Distribution tissulaire: dplacement rversible dune substance dessai dun endroit du corps un autre. La distribution
tissulaire peut studier par dissection, homognisation, combustion et comptage par scintillation liquide des organes ou
par autoradiographie qualitative et/ou quantitative du corps entier. La premire mthode est utile pour obtenir la
concentration et le pourcentage de rcupration dans les tissus et la carcasse des mmes animaux, mais peut avoir
une rsolution trop faible pour tous les tissus et atteindre une rcupration globale infrieure loptimum (< 90 %). Voir
la dfinition de lautoradiographie.
Enzymes/Isoenzymes: protines qui catalysent des ractions chimiques. Les isoenzymes sont des enzymes qui catalysent
des ractions chimiques similaires mais diffrent par leur squence dacides amins.
Excrtion biliaire: excrtion par les voies biliaires.
Excrtion: processus par le(s)quel(s) une substance dessai administre et/ou ses mtabolites sont limins du corps.
Exogne: dorigine extrieure lorganisme ou au systme, ou produit lextrieur de lui.
Extrapolation: infrence dune ou de plusieurs valeurs inconnues partir de ce qui est connu ou a t observ.
Induction/induction enzymatique: synthse denzymes en rponse un stimulus environnemental ou une molcule
inductrice.
Linarit/cintique linaire: en cintique, un processus est linaire quand tous les taux de transfert entre compartiments
sont proportionnels aux quantits ou aux concentrations prsentes, cest--dire de premier ordre. En consquence, les
volumes dlimination et de distribution sont constants, de mme que les demi-vies. Les concentrations obtenues sont
proportionnelles au taux dadministration (exposition), et laccumulation est plus aisment prvisible. On peut juger de la
linarit/non-linarit en comparant les paramtres pertinents, par exemple lAUC, aprs administration de diffrentes
doses ou aprs exposition unique et exposition rpte. Labsence de dose-dpendance peut indiquer la saturation des
enzymes participant au mtabolisme du compos; une augmentation de lAUC aprs exposition rpte par rapport une
exposition unique peut indiquer une inhibition du mtabolisme, et une diminution de lAUC peut signaler une induction
du mtabolisme [voir aussi (11)].
Mcanisme (mode) de toxicit/daction: le mcanisme daction se rfre aux interactions biochimiques spcifiques par
lesquelles une substance dessai produit son effet. Le mode daction se rapporte aux phnomnes plus gnraux conduisant
la toxicit dune substance dessai.
Mtabolisme: synonyme de biotransformation.
Mtabolites: produits du mtabolisme ou des processus mtaboliques.
Modlisation systmique (modle toxicocintique base physiologique, base pharmacocintique, pharmacocintique
base physiologique, base biologique, etc.): modle abstrait utilisant le langage mathmatique pour dcrire le compor
tement dun systme.
Paramtres enzymatiques: Km, constante de Michaelis et Vmax, vitesse maximale.
Persistance (biopersistance): prsence long terme dune substance chimique (dans un systme biologique) sexpliquant
par sa rsistance la dgradation/llimination.
Prvision partir de donnes croises: les informations sur les effets mesurs pour une ou plusieurs substances
chimiques sont utilises pour prdire leffet observ pour la substance chimique cible.
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Saturation: tat dans lequel un ou plusieurs processus cintiques (par exemple, absorption, mtabolisme ou limination)
sont leur maximum (cest--dire saturs).
Sensibilit: capacit dune mthode ou dun instrument de mesure distinguer entre des rponses correspondant
diffrents niveaux dune variable dintrt.
Tissu cible: tissu sur lequel se manifeste un effet indsirable majeur dune susbtance toxique.
Tmax: temps ncessaire pour atteindre Cmax.
Toxicocintique (pharmacocintique): tude de labsorption, de la distribution, du mtabolisme et de lexcrtion des
substances chimiques au cours du temps.
Validation des modles: processus destin valuer si un modle dcrit convenablement les donnes toxicocintiques
disponibles. Les modles peuvent tre valus par comparaison statistique ou visuelle de leurs prvisions avec les valeurs
exprimentales, en fonction dune variable indpendante commune (par exemple le temps). Lampleur de lvaluation est
justifie en fonction de lusage escompt du modle.
Vitesse dlimination: mesure quantitative de la vitesse laquelle une substance dessai est limine du sang, du plasma
ou dun tissu donn, par unit de temps.
Voie dadministration (orale, intraveineuse, cutane, par inhalation, etc.): se rapporte aux moyens par lesquels une
substance chimique est administre dans le corps (par exemple, par gavage oral, oralement mlange la nourriture,
par voie cutane, par inhalation, en intraveineuse, etc.).
Voies de dtoxication: srie dtapes conduisant llimination des substances chimiques toxiques du corps, que ce soit
par transformation mtabolique ou par excrtion.
8) le chapitre B.52 suivant est ajout:
B.52. TOXICIT AIGU PAR INHALATION MTHODE PAR CLASSE DE TOXICIT AIGU
INTRODUCTION
1.
chimiques. Une premire ligne directrice pour les essais de toxicit aigu par inhalation (403) avait t adopte
en 1981 et a t rvise depuis [voir chapitre B.2 de la prsente annexe (1)]. la suite de ladoption, en 2001,
de la mthode par classe de toxicit aigu par voie orale [chapitre B.1 ter de la prsente annexe (5)], il est apparu
appropri de dvelopper une mthode par classe de toxicit aigu par inhalation (2) (3) (4). Une valuation
rtrospective des performances de la mthode dessai par classe de toxicit aigu pour la toxicit aigu par
inhalation a montr que cette mthode tait utilisable des fins de classification et dtiquetage (6). La mthode
dessai pour les essais de toxicit par inhalation faisant appel la mthode par classe de toxicit aigu permettra
lutilisation dtapes successives de concentrations cibles fixes pour dterminer la classe de toxicit de la sub
stance dessai. Bien que la ltalit soit le principal effet mesur, les animaux moribonds ou prsentant des signes
de souffrance ou de dtresse svre sont euthanasis afin de minimiser leur souffrance. Des prcisions concernant
les effets mesurs thiquement acceptables sont disponibles dans le document dorientation n o 19 de lOCDE (7).
2.
On trouvera dans le document dorientation no 39 sur les essais de toxicit aigu par inhalation des indications
pour la conduite et linterprtation de la prsente mthode dessai (8).
3.
Les dfinitions utilises dans la prsente mthode dessai figurent lappendice 1 et dans le document dorien
tation no 39 (8).
4.
Cette mthode dessai fournit des informations qui permettent la fois lvaluation des dangers et le classement
de la substance dessai conformment au rglement (CE) no 1272/2008 relatif la classification pour les sub
stances prsentant une toxicit aigu (9). Si des estimations ponctuelles des valeurs de la CL50 ou des analyses de
la courbe concentration- rponse sont ncessaires, il convient de se reporter au chapitre B.2 de la prsente
annexe (1). Pour plus dinformations sur le choix des mthodes dessai, il convient de se reporter au document
dorientation no 39 (8). La prsente mthode dessai nest pas spcifiquement destine tester des articles
spciaux comme les substances isomtriques ou fibreuses faiblement solubles ou les nanomatriaux manufac
turs.
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5.
Avant dentreprendre un essai conformment la prsente mthode dessai, le laboratoire dessai devra prendre
en compte toutes les informations disponibles sur la substance dessai, y compris les tudes existantes dont les
rsultats viteraient des essais supplmentaires, afin de recourir le moins possible aux animaux. Parmi les
informations utiles pour la dtermination de lespce, de la souche, du sexe, du mode dexposition et des
concentrations dessai appropris, citons: lidentit, la structure chimique et les proprits physico-chimiques
de la substance dessai; les rsultats de tous les essais de toxicit in vitro ou in vivo auxquels elle a t soumise;
son (ses) utilisation(s) escompte(s) et les risques dexposition humaine; les donnes (Q)SAR disponibles et les
donnes toxicologiques sur les substances structurellement apparentes. Les concentrations susceptibles dengen
drer une souffrance ou une dtresse svres, du fait de proprits corrosives (1) ou fortement irritantes, ne sont
pas testes laide de cette mthode dessai, voir document dorientation 39 (8).
PRINCIPE DE LESSAI
6.
Le principe de cet essai est dobtenir, avec un processus squentiel, des informations suffisantes sur la toxicit
aigu par inhalation de la substance dessai, pour parvenir son classement avec une exposition de 4 heures. Des
objectifs rglementaires spcifiques peuvent ncessiter de recourir dautres dures dexposition. Les essais pour
chacun des niveaux de concentration dfinis porteront sur 3 animaux de chaque sexe. En fonction de la
mortalit et/ou de ltat moribond des animaux, 2 tapes peuvent suffire pour permettre de juger de la toxicit
aigu de la substance dessai. Sil est prouv que lun des sexes est plus sensible la substance dessai, lessai peut
se poursuivre avec seulement les animaux de ce sexe. Le rsultat de ltape prcdente dtermine ltape suivante,
cest--dire:
a) larrt de lessai;
b) un essai sur trois animaux par sexe; ou
c) un essai sur 6 animaux, tous du sexe le plus sensible la substance dessai, la limite infrieure de la classe de
toxicit devant tre dtermine partir dessais portant sur 6 animaux par groupe de concentration dessai,
indpendamment du sexe.
7.
sont euthanasis, et sont pris en compte dans linterprtation des rsultats de lessai au mme titre que ceux qui
succombent au cours de lessai. Le document dorientation de lOCDE no 19 sur les effets mesurs thiquement
acceptables dtaille les critres orientant la dcision deuthanasier les animaux moribonds ou en grande souf
france, et aide reconnatre une mort prvisible ou imminente (7).
8.
Le choix sorientera vers de jeunes rongeurs en bonne sant, de souches communment utilises en laboratoire.
Le rat tant lespce la plus utilise, il faudra justifier lemploi dautres espces.
9.
Les femelles sont nullipares et non gravides. Le jour de leur exposition, les animaux slectionns sont de jeunes
adultes gs de 8 12 semaines. Leur poids corporel ne devra pas excder, pour chaque sexe, 20 % du poids
moyen des animaux du mme ge prcdemment exposs. Slectionns au hasard, les animaux sont marqus
pour tre identifis individuellement. En vue de leur acclimatation aux conditions de laboratoire, ils seront
conservs dans leur cage pour une priode dau minimum 5 jours avant le dbut de lessai. Les animaux sont
galement acclimats aux appareils dessai, pendant une courte priode prcdant lessai, afin dattnuer le stress
caus par leur introduction dans un nouvel environnement.
10. La temprature du local exprimental o les animaux sont conservs est de 22 3 C. Le taux dhumidit relative
est idalement maintenu entre 30 et 70 %, encore quil ne soit pas toujours possible de le faire si leau est utilise
comme vhicule. Avant et aprs exposition, les animaux sont gnralement mis en cage en groupes par sexe et
par concentration, mais le nombre danimaux par cage ne doit pas faire obstacle une observation prcise de
chaque animal, et ne doit engendrer quun minimum de pertes dues au cannibalisme et aux combats. Si les
animaux sont exposs nez seul, il peut tre ncessaire de les acclimater aux tubes de contention. Ceux-ci ne
doivent pas provoquer chez les animaux de stress excessif, quil soit de nature physique, thermique ou d leur
immobilisation. Les contraintes quils subissent peuvent en effet modifier les paramtres physiologiques mesurs
de lanimal, comme sa temprature corporelle (hyperthermie) et/ou son volume respiratoire par minute. Si lon
dispose de donnes gnriques montrant que de telles modifications ne se produisent pas de faon apprciable,
(1) Lvaluation de la corrosivit peut reposer sur un avis dexpert bas sur les lments suivants: donnes exprimentales sur lhomme et
lanimal, donnes (in vitro) existantes [voir, par exemple, le chapitre B.40 (11) de la prsente annexe ou la ligne directrice 435 de
lOCDE (12), valeurs du pH, informations concernant des substances analogues ou toute autre donne pertinente].
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alors la priode dadaptation pralable aux tubes de contention nest pas ncessaire. Les animaux exposs corps
entier un arosol sont enferms individuellement pendant lexposition pour empcher la filtration de larosol
par la fourrure de leurs congnres. lexception des priodes dexposition, le rgime alimentaire des animaux
est le rgime classique et certifi de laboratoire, avec eau potable satit. Lclairage est artificiel, la squence
dclairage tant de 12 heures de clart et 12 heures dobscurit.
Chambres dinhalation
11. Le choix de la chambre dinhalation prend en compte la nature de la substance dessai et lobjet de lessai. Le
prfrable pour les besoins spcifiques de ltude, mais elle est justifie dans le rapport de ltude. Pour assurer la
spcifiques
12. Il est recommand une dure fixe dexposition de quatre heures, sans compter le temps dquilibration. Dautres
dures dexposition sont possibles pour rpondre des besoins spcifiques, cependant une justification devra tre
apporte dans le rapport dtude, voir document dorientation 39 (8). Les animaux exposs corps entier
demeurent seuls dans la chambre afin dviter lingestion de la substance dessai par le toilettage de leurs
compagnons. Les animaux sont privs de nourriture pendant la priode dexposition. Dans une exposition
corps entier, les animaux peuvent boire de leau.
forme mixte. Ltat physique tester dpend des proprits physico-chimiques de la substance, de la concen
tration choisie, et/ou de la forme physique sous laquelle il est le plus probable quelle se prsente lors de sa
sous air sec. On prendra soin dviter les concentrations susceptibles de provoquer une explosion.
14. Une mesure de la taille des particules est ralise pour tous les arosols et les vapeurs susceptibles de se
condenser pour former des arosols. Pour que toutes les rgions pertinentes de lappareil respiratoire soient
exposes, il est recommand dutiliser des arosols dont le diamtre arodynamique mdian de masse (DAMM) se
situe entre 1 et 4 m, avec un cart type gomtrique (g) compris entre 1,5 et 3,0 (8) (13) (14). Un effort
raisonnable est fourni pour remplir ces conditions, mais si tel nest pas le cas, un jugement dexpert est
ncessaire. Par exemple, les particules des fumes mtalliques peuvent avoir une taille infrieure cette
norme, tandis que les particules charges, les fibres et les substances hygroscopiques (dont la taille augmente
dans lenvironnement humide du tractus respiratoire) peuvent avoir une taille suprieure.
15. Pour atteindre la concentration et la taille granulomtrique appropries de la substance dessai, il est possible
davoir recours un vhicule; en rgle gnrale leau est choisie de prfrence. Les substances particulaires
peuvent tre soumises des procds mcaniques afin datteindre la rpartition granulomtrique requise, mais
un soin particulier devra tre pris de ne pas dcomposer ou altrer la substance dessai. Lorsque les procds
mcaniques sont suspects davoir altr la composition de la substance dessai (temprature extrme due aux
frictions dun broyage excessif, par exemple), la composition de la substance dessai devra tre vrifie analyti
quement. On prendra soin de ne pas contaminer la substance dessai. Il nest pas ncessaire de tester les
substances granulaires non friables qui sont labores prcisment pour ne pas tre inhalables. Un test
dusure de surface est ralis pour dmontrer que la manipulation de la substance granulaire ne produit pas
de particules respirables. Dans le cas contraire, un essai de toxicit par inhalation est ralis.
Animaux tmoins
16. Un groupe tmoin ngatif (air) nest pas ncessaire. Lorsquun vhicule autre que leau est utilis pour produire
latmosphre dessai, un groupe tmoin du vhicule est utilis seulement quand on ne dispose pas de donnes
historiques sur la toxicit. Si aucune toxicit na t dtecte lors de ltude de la substance dessai prpare dans
un vhicule, celui-ci est considr comme non toxique la concentration teste; il ny a donc pas lieu dutiliser
de tmoin du vhicule.
17. Le dbit dair dans la chambre est contrl avec soin, suivi en continu et enregistr au moins toutes les heures
pendant chaque exposition. Le suivi de la concentration de latmosphre dessai (ou stabilit temporelle) constitue
une mesure complte de tous les paramtres dynamiques et fournit un moyen indirect de contrler tous les
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paramtres dynamiques pertinents de la production de latmosphre dessai. On prendra particulirement soin

dviter toute re-respiration dans les chambres dexposition nez seul lorsque le dbit dair travers le systme
dexposition ne permet pas de produire une circulation dynamique de latmosphre contenant la substance
dessai. Des mthodologies sont prvues pour dmontrer labsence de re-respiration dans les conditions expri
mentales choisies (8) (15). La concentration doxygne est dau moins 19 % et celle de dioxyde de carbone ne
dpasse pas 1 %. Si ces conditions ne peuvent tre respectes, les concentrations doxygne et de dioxyde de
carbone sont mesures.
corps entier lhumidit relative dans la zone o respire lanimal est suivie et enregistre trois fois au minimum
pour les dures allant jusqu 4 heures, et toutes les heures pour les dures plus courtes. Le taux dhumidit
relative est idalement compris entre 30 et 70 %. Il est possible que ce taux ne puisse tre atteint (par exemple,
dans le cas dun mlange base deau), ou quil ne puisse tre mesur en raison dinterfrences de la substance
dessai avec la mthode dessai.
production.
20. La concentration relle est la concentration de la substance dessai dans la zone de la chambre dinhalation o les
animaux respirent. Les concentrations relles peuvent tre obtenues par des mthodes spcifiques (par exemple,
chantillonnage direct, mthodes dadsorption ou de raction chimique, et caractrisation analytique ultrieure)
ou par des mthodes non spcifiques comme la gravimtrie sur filtre. Le recours lanalyse gravimtrique nest
acceptable que pour des arosols ne contenant quun seul composant en poudre ou pour des arosols de liquides
peu volatils, et des caractrisations spcifiques la substance dessai sont galement effectues par une pr-tude
approprie. Il est aussi possible davoir recours la gravimtrie pour dterminer la concentration dun arosol
contenant plusieurs composants en poudre, mais des donnes analytiques sont alors ncessaires, afin de dmon
trer que la composition du produit en suspension dans lair est analogue celle du produit de dpart. Faute de
cette information, il peut savrer ncessaire de soumettre la substance dessai (idalement en suspension dans
lair) une nouvelle analyse intervalles rguliers tout au long de ltude. Pour des agents arosoliss susceptibles
de svaporer ou de se sublimer, il faut dmontrer que toutes les phases ont t recueillies selon la mthode
choisie. Les concentrations cibles, nominales et relles sont fournies dans le rapport dtude, mais seules les
concentrations relles sont utilises dans les analyses statistiques pour calculer la valeur des concentrations
ltales.
21. Il est recommand de nemployer si possible quun seul lot de la substance dessai, et lchantillon de la substance
est conserv dans des conditions prservant sa puret, son homognit et sa stabilit. Avant le dbut de ltude,
il convient de raliser une caractrisation de la substance dessai afin de dterminer sa puret et, si cela est
techniquement possible, son identit et les quantits de contaminants et dimpurets identifis. Pour cela, on
pourra recueillir les donnes suivantes: temps de rtention et surface relative du pic, poids molculaire obtenu
par spectroscopie de masse ou chromatographie en phase gazeuse, ou autres estimations. Bien que le laboratoire
dessai ne soit pas responsable de lidentification de la substance dessai, il peut, par prudence, confirmer au
moins une partie des caractristiques fournies par le donneur dordre (couleur, nature physique, etc.).
22. Latmosphre dexposition est maintenue aussi constante que possible, et suivie soit en continu, soit par inter
mittence en fonction de la mthode danalyse. Lorsque linjection seffectue de faon intermittente, les chan
tillons datmosphre de la chambre sont prlevs au moins deux fois sur une tude de quatre heures. En cas
dimpossibilit en raison de dbits dair limits ou de faibles concentrations, le recueil dun chantillon pour toute
la priode dexposition est acceptable. Si des fluctuations nettes apparaissent dun chantillon un autre, la
prochaine concentration dessai devra utiliser quatre chantillons par exposition. Les carts entre la concentration
dans chaque chambre et la concentration moyenne nexcdent pas 10 % pour les gaz et vapeurs et 20 %
pour les arosols liquides ou solides. Il convient de calculer et de noter le temps dquilibre dans la chambre
dexposition (t95). La dure dune exposition couvre le temps de production de la substance dessai, y compris le
temps ncessaire pour lgalisation des concentrations dans la chambre dexposition t95. Des indications pour
lestimation de t95 sont fournies dans le document dorientation 39 (8).
23. Pour des mlanges trs complexes constitus de gaz ou vapeurs et darosols (atmosphres de combustion ou
on choisira donc au moins une substance indicatrice (analyte), en gnral le principe actif du mlange. Quand la
substance dessai est un mlange, la concentration analytique devra tre indique pour le mlange global et pas
uniquement pour le principe actif ou le composant (analyte). Pour plus dinformations sur les concentrations
relles, se reporter au document dorientation 39 (8).
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24. La rpartition granulomtrique des arosols est dtermine au minimum deux fois pour chaque exposition de
4 heures, laide dun impacteur en cascade ou dun autre instrument, comme un spectromtre de mesure de la
taille des particules arodynamiques. Si les rsultats obtenus avec limpacteur en cascade ou un autre instrument
se rvlent quivalents, ce dernier peut tre utilis tout au long de ltude. Pour confirmer la capacit de recueil
des particules de loutil principal, un second instrument devra tre utilis en parallle, par exemple un filtre
gravimtrique ou un barboteur gaz/impacteur. La concentration massique obtenue par lanalyse granulom
trique se rapproche, dans des limites raisonnables, de celle obtenue par lanalyse sur filtre, voir document
dorientation 39 (8). Si cette quivalence est tablie au dbut de la phase dtude, il nest pas ncessaire deffectuer
des mesures de confirmation dans la suite de ltude. Pour le bien-tre des animaux, il convient de rduire au
minimum les donnes douteuses qui ncessiteraient de rpter une exposition. Une rpartition granulomtrique
est effectue dans le cas des vapeurs, sil est possible quune condensation de la vapeur conduise la formation
dun arosol, ou si des particules sont dtectes dans une atmosphre de vapeur susceptible de prsenter des
phases mixtes (voir paragraphe 14).
MODE OPRATOIRE
Essai principal
25. Pour chaque tape, trois animaux de chaque sexe, ou six animaux du sexe le plus sensible la substance dessai,
seront utiliss. Si des espces de rongeurs autres que le rat sont exposes nez seul, il est possible dajuster la
dure maximale dexposition en fonction du stress propre ces espces. Le niveau de concentration utiliser
comme dose initiale est choisi parmi les quatre niveaux fixs; le niveau de concentration initiale est celui le plus
susceptible de prsenter une toxicit pour certains des animaux traits. Les schmas dessai pour les gaz, les
vapeurs et les arosols (prsents dans les appendices 2 4) correspondent aux essais effectus aux valeurs
limites des catgories 1 4 du rglement relatif la classification, ltiquetage et lemballage (9), pour les gaz
(100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (appendice 2), pour les vapeurs (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (appendice 3) et
pour les arosols (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (appendice 4). La catgorie 5, que ne prvoit pas le rglement (CE)
no 1272/2008 (9), se rapporte des concentrations dpassant les concentrations limites respectives. Chacune des
concentrations de dpart possde son propre schma dessai. En fonction du nombre danimaux morts ou
euthanasis, le mode opratoire dessai suit les flches indiques jusqu ce quune catgorisation puisse tre
tablie.
26. Lintervalle de temps entre lexposition des diffrents groupes est dtermin par le moment dapparition, la dure
et la gravit des signes de toxicit observs. Lexposition des animaux au niveau de concentration suprieur est
retarde jusqu ce que lon soit raisonnablement sr que les animaux prcdemment soumis au traitement ont
survcu. Il est recommand despacer de trois quatre jours les expositions chaque niveau de concentration
afin de permettre lobservation dune toxicit retarde. Lintervalle de temps peut tre ajust, par exemple en cas
de rponses peu concluantes.
Essai limite
27. Lessai limite est utilis si lon sait ou si lon prvoit que la substance dessai sera virtuellement non toxique, c'est-dire quelle ne suscitera une rponse de toxicit quau-del de la concentration limite rglementaire. Des
informations sur la toxicit de la substance dessai peuvent tre tires dessais dj pratiqus sur des substances
ou mlanges analogues, en tenant compte de lidentit et du pourcentage des composants dont la toxicit est
avre. Si lon manque dinformations sur la toxicit de la substance dessai, ou si lon sattend ce quelle soit
toxique, lessai principal est ralis; le document dorientation 39 fournit de plus amples informations ce sujet
(8).
28. Selon le mode opratoire normal, trois animaux par sexe, ou six animaux du sexe le plus sensible la substance
dessai, sont exposs des concentrations de 20 000 ppm pour les gaz, 20 mg/l pour les vapeurs et 5 mg/l pour
les poussires/brouillards. Si elles sont atteintes, ces concentrations servent de limite dessai pour la prsente
mthode dessai. Pour les essais darosols, le principal objectif est datteindre une taille de particule qui soit
respirable (cest--dire un DAMM de 1 4 m), ce qui est possible avec la plupart des substances dessai des
concentrations de 2 mg/l. Les essais sur des arosols des concentrations suprieures 2 mg/l ne sont tents que
si lon peut obtenir des particules de taille respirable, voir document dorientation 39 (8). Selon le SGH (16), il
est dconseill de raliser des essais au-del des concentrations limites, pour des raisons de bien-tre des
animaux. Les essais en catgorie 5 du SGH (16), non prvue par le rglement (CE) no 1272/2008 (9), ne
sont envisags que sil est trs probable que leurs rsultats prsenteront un intrt direct pour la protection
de la sant humaine, et une justification est alors fournie dans le rapport dessai. En cas de substance poten
tiellement explosive, on prendra soin dviter les conditions susceptibles de provoquer une explosion. Afin
dviter le recours inutile des animaux, un essai sans animaux est effectu avant lessai limite pour sassurer
quil est possible datteindre dans la chambre les conditions exprimentales dun essai limite.
OBSERVATIONS
29. Un examen clinique des animaux est pratiqu rgulirement pendant la priode dexposition. Aprs lexposition,
des examens cliniques sont raliss au minimum deux fois le jour de lexposition, ou plus frquemment suivant
la rponse des animaux au traitement, et au minimum une fois par jour par la suite pendant une priode de
14 jours. La dure de la priode dobservation nest pas fixe, mais est dtermine par la nature et le moment
dapparition des signes cliniques, ainsi que par la dure de la priode de rcupration. Les moments dapparition
et de disparition des signes de toxicit sont importants, en particulier lorsque les signes de toxicit ont tendance
tre retards. Toutes les observations sont systmatiquement enregistres individuellement pour chaque animal.
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sont euthanasis pour des raisons de bien-tre animal. Lors de lexamen clinique des signes de toxicit, il
convient de veiller ne pas confondre une pitre apparence initiale et des troubles respiratoires passagers,
imputables la procdure dexposition, avec les effets lis au traitement. Les principes et critres rsums
dans le document dorientation sur les effets mesurs thiquement acceptables sont pris en considration (7).
Quand des animaux sont retrouvs morts ou sont euthanasis, lheure de la mort est consigne le plus prci
sment possible.
muqueuses, mais aussi sur les changements affectant lappareil respiratoire, le systme circulatoire, les systmes
nerveux autonome et central, ainsi que lactivit somatomotrice et le comportement. Toute diffrentiation entre
les effets locaux et systmiques est consigne autant que possible. Les tremblements, les convulsions, la saliva
tion, les diarrhes, la lthargie, le sommeil et le coma doivent retenir lattention. La mesure de la temprature
rectale peut aider mettre en vidence une bradypne rflexe ou une hypo/hyperthermie lie au traitement ou au
confinement.
Poids corporel
31. Le poids corporel de chacun des animaux est enregistr une fois lors de la priode dacclimatation, le jour de
lexposition (jour 0) juste avant celle-ci, et au moins les jours 1, 3 et 7 (puis de faon hebdomadaire par la suite)
ainsi quau moment de la mort ou de leuthanasie, sil est postrieur au jour 1. Le poids corporel est un
indicateur critique reconnu de la toxicit, on surveillera donc attentivement les animaux, dont le poids reste
constamment infrieur de 20 % ou plus celui prcdant ltude. Les animaux survivants sont pess et eutha
nasis la fin de la priode postexposition.
Pathologie
32. Tous les animaux dexprience, y compris ceux morts au cours de lessai ou euthanasis et carts de ltude pour
des raisons de bien-tre animal, subissent une autopsie macroscopique. Lorsquun animal est dcouvert mort et
que son autopsie nest pas ralisable immdiatement, lanimal est rfrigr (mais non congel) une temprature
suffisamment basse pour minimiser lautolyse. Les autopsies sont ralises le plus tt possible, en gnral dans un
dlai dun deux jours. Tous les changements macropathologiques sont enregistrs pour chaque animal en
prtant particulirement attention aux voies respiratoires.
33. Dautres observations, ajoutes a priori dessein, peuvent tre envisages afin dlargir linterprtation de ltude,
comme la mesure du poids pulmonaire des rats survivants et/ou la mise en vidence dune irritation par examen
de lappareil respiratoire au microscope. Les organes examins peuvent tre ceux pour lesquels une raction au
traitement est connue ou attendue et ceux montrant une pathologie macroscopique chez les animaux survivant
au moins 24 heures. Un examen microscopique de lintgralit de lappareil respiratoire peut fournir des
informations utiles pour les substances dessai ractives leau, comme les acides et les substances hygrosco
piques.
RSULTATS ET RAPPORT
Rsultats
34. Pour chacun des animaux, le poids corporel et les conclusions de lautopsie sont fournis. Les rsultats des
observations cliniques sont rsums sous la forme de tableaux et indiquer pour chaque groupe dessai: le
nombre danimaux utiliss, le nombre danimaux prsentant des signes spcifiques de toxicit, le nombre
danimaux retrouvs morts au cours de lessai ou euthanasis, lheure de la mort de chacun des animaux, la
description et lvolution dans le temps des effets toxiques ainsi que leur rversibilit, et les conclusions de
lautopsie.
Rapport dessai
Animaux dexprience et conditions dlevage:
description des conditions dencagement, y compris: nombre (ou volution du nombre) danimaux par cage,
alimentaire,
espces/souches utilises et justification ventuelle de lutilisation dune espce autre que le rat,
mthode de randomisation,
dtails sur la qualit de la nourriture et de leau (notamment origine/type de rgime alimentaire, origine de
leau),
description dun ventuel conditionnement pralable lessai, tel que rgime alimentaire, quarantaine ou
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Substance dessai:
nature physique, puret et, sil y a lieu, proprits physico-chimiques (y compris isomrisation),
donnes didentification et numro CAS (Chemical Abstract Services) sil est connu.
Vhicule:
justification de lemploi dun vhicule et justification de son choix (sil ne sagit pas de leau),
donnes historiques ou concordantes dmontrant que le vhicule ninterfre pas avec les rsultats de ltude.
Chambre dinhalation:
description de la chambre dinhalation avec ses dimensions et son volume,
source et description de lquipement utilis pour lexposition des animaux et pour la production de latmo
sphre,
quipement utilis pour mesurer la temprature, lhumidit, la granulomtrie et la concentration relle,
source dair, traitement de lair fourni/vacu et systme de climatisation utilis,
mthodes utilises pour talonner lquipement afin dassurer lhomognit de latmosphre dessai,
diffrence de pression (positive ou ngative),
orifices dexposition par chambre (nez seul) ou emplacement des animaux dans le systme (corps entier),
homognit/stabilit temporelle de latmosphre dessai,
situation des capteurs thermiques et hygromtriques et chantillonnage de latmosphre dessai dans la
chambre dexposition,
dbits dair, dbit dair/orifice dexposition (nez seul) ou rapport du volume de lanimal la chambre (corps
entier),
informations sur lquipement utilis, le cas chant, pour mesurer loxygne et le dioxyde de carbone,
temps ncessaire pour atteindre lquilibre dans la chambre dexposition (t95),
nombre de changements de volume par heure,
doseurs (sil y en a).
Donnes concernant lexposition:
justification du choix de la concentration cible dans ltude principale,
concentrations nominales (masse totale de substance dessai produite dans la chambre dinhalation, divise
par le volume dair traversant la chambre),
concentrations relles de la substance dessai obtenues dans la zone o respirent les animaux; pour les
tuants peut tre analys sparment,
toutes les concentrations atmosphriques sont rapportes en units de masse (mg/l, mg/m3, etc.); les units
de volume (ppm, ppb) peuvent aussi tre indiques entre parenthses,
rpartition granulomtrique des particules, diamtre arodynamique mdian de masse (DAMM) et cart type
consignes.
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dtails sur la prparation de la substance dessai, y compris sur les procdures utilises pour rduire la taille
des particules des substances solides ou pour prparer les solutions de la substance dessai. Lorsque des
procds mcaniques sont susceptibles davoir altr la composition de la substance dessai, inclure les
rsultats des analyses effectues pour vrifier la composition de la substance dessai,
description (si possible avec schma) de lquipement utilis pour produire latmosphre dessai et pour
exposer les animaux celle-ci,
dtails sur la mthode de chimie analytique utilise et la mthode de validation (notamment rendement de
rcupration de la substance dessai partir du milieu dchantillonnage),
justification du choix des concentrations dessai.
Rsultats:
tableau prsentant la temprature, le taux dhumidit et le dbit dair dans la chambre dinhalation,
tableau de donnes sur les concentrations nominales et relles dans la chambre dinhalation,
tableau de donnes sur la taille des particules, notamment donnes analytiques sur le prlvement dchan
tillons, la rpartition granulomtrique et les calculs du DAMM et de g,
tableau de donnes sur les rponses et le niveau de concentration pour chaque animal (cest--dire nombre
danimaux montrant des signes de toxicit, y compris de mortalit, et nature, svrit et dure des effets),
poids corporel de chacun des animaux enregistrs lors de lessai, date et heure de leur mort si celle-ci
intervient avant leuthanasie prvue; moment dapparition et volution des signes de toxicit et, le cas
chant, leur rversibilit,
pour chaque animal, rsultats de lautopsie et observations histopathologiques disponibles,
classement dans les catgories du rglement (CE) no 1272/2008 et valeur limite de la CL50.
Discussion et interprtation des rsultats:
un effort particulier est consacr la description des mthodes utilises pour rpondre aux critres de la
prsente mthode dessai, par exemple en ce qui concerne la concentration limite ou la taille des particules,
la respirabilit des particules est aborde la lumire des rsultats densemble, en particulier si les critres de
taille des particules nont pu tre remplis,
la cohrence des mthodes utilises pour dterminer les concentrations nominales et relles, et la relation
ltude,
la cause probable de la mort et le mode daction prdominant (systmique ou local) sont abords,
une explication est apporte sil a fallu euthanasier des animaux qui souffraient ou montraient des signes de
BIBLIOGRAPHIE:
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L 81/130
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(8) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Publications Hygine
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(http://www.oecd.org/env/testguidelines).
(10) Chapitre B.40 de la prsente annexe, Corrosion cutane in vitro: essai de rsistance lectrique transcutane
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(11) Chapitre B.40 bis de la prsente annexe, Corrosion cutane in vitro: essai sur modle de peau humaine.
(12) OCDE (2005). Mthode dessai in vitro sur membrane dtanchit pour la corrosion cutane. Ligne directrice de
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(16) Nations unies (2007), Systme gnral harmonis de classification et dtiquetage des produits chimiques (SGH),
ST/SG/AC.10/30, Nations unies, New York et Genve. Disponible sur l'internet (http://www.unece.org/trans/
danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html).
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Appendice 1
DFINITION
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Appendice 2
Procdure suivre pour chacune des concentrations initiales dans le cas des gaz (ppm/4 h)
Remarques gnrales (1)
Pour chaque concentration initiale, les schmas dessai figurant dans le prsent appendice indiquent la procdure suivre.
Appendice 2 bis:
concentration initiale de 100 ppm.
Appendice 2 ter:
concentration initiale de 500 ppm.
Appendice 2 quater:
concentration initiale de 2 500 ppm.
Appendice 2 quinquies: concentration initiale de 20 000 ppm.

Selon le nombre danimaux morts ou euthanasis, la procdure dessai se poursuit en suivant les flches indiques.
(1) Les tableaux ci-aprs renvoient au systme gnral harmonis de classification et dtiquetage des produits chimiques (SGH). Lquivalent
de ce systme au sein de lUnion europenne est le rglement (CE) no 1272/2008. Dans le cas de la toxicit aigu par inhalation, le
rglement (CE) no 1272/2008 (9) ne prvoit pas la catgorie 5.
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Appendice 2 bis
Toxicit aigu par inhalation:
Procdure dessai avec une concentration initiale de 100 ppm/4 h pour les gaz
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Appendice 2 ter
procdure d'essai avec une concentration initiale de 500 ppm/4h pour les gaz
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Appendice 2 quater
procdure d'essai avec une concentration initiale de 2 500 ppm/4h pour les gaz
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Appendice 2 quinquies
procdure d'essai avec une concentration initiale de 20 000 ppm/4h pour les gaz
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Appendice 3
Procdure suivre pour chacune des concentrations initiales dans le cas des vapeurs (mg/l/4 h)
Appendice 3 bis:
concentration initiale de 0,5 mg/l.
Appendice 3 ter:
Appendice 3 quater:
concentration initiale de 10 mg/l.
Appendice 3 quinquies: concentration initiale de 20 mg/l.

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Appendice 3 bis
procdure d'essai avec une concentration initiale de 0,5 mg/l/4h pour les vapeurs
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Appendice 3 ter
procdure d'essai avec une concentration initiale de 2 mg/l/4h pour les vapeurs
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Appendice 3 quater
Procdure d'essai avec une concentration initiale de 10 mg/l/4h pour les vapeurs
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Procdure d'essai avec une concentration initialede 20 mg/l/4h pour les vapeurs
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Appendice 4
Procdure suivre pour chacune des concentrations initiales dans le cas des arosols (mg/l/4 h)
Appendice 4 bis:
Appendice 4 ter:
Appendice 4 quater:
concentration initiale de 1 mg/l.
Appendice 4 quinquies: concentration initiale de 5 mg/l.

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Appendice 4 bis
Procdure d'essai avec une concentration initiale de 0.05 mg/l/4h pour les vapeurs
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L 81/144
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Appendice 4 ter
Procdure dessai avec une concentration initiale de 0,5 mg/l/4h pour les arosols
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19.3.2014
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Appendice 4 quater
Procdure dessai avec une concentration initiale de 1 mg/l/4h pour les arosols
L 81/145
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Procdure d'essai avec une concentration initiale de 5 mg/l/4h pour les arosols
9) le chapitre C.10 est remplac par le texte suivant:

C.10. ESSAI DE SIMULATION TRAITEMENT AROBIE DES EAUX USES: C.10-A: UNITS DE
TRAITEMENT PAR BOUES ACTIVES C.10-B: BIOFILMS
C.10-A: Units de traitement par boues actives
INTRODUCTION
1.
chimiques. Dans les annes 50, on sest rendu compte que les nouveaux tensioactifs provoquaient un gonflement
excessif de la mousse dans les stations de traitement des eaux uses et les cours deau. Ils ntaient pas
compltement limins par le traitement arobie et limitaient dans certains cas llimination dautres matires
organiques. Ce constat a t lorigine de nombreuses tudes sur les moyens dliminer les tensioactifs des eaux
uses et sur les possibilits dapplication des nouvelles substances chimiques produites par lindustrie au traite
ment des eaux uses. Des modles dunits reprsentant les deux principaux types de traitement biologique
arobie des eaux uses (boues actives et lits ruissellement, ou lits bactriens) ont t utiliss cette fin. Il aurait
en effet t peu commode et trs coteux de rpartir chaque nouvelle substance entre diffrentes stations de
traitement grande chelle et dassurer un suivi des essais, mme au niveau local.
CONSIDRATIONS INITIALES
Units de traitement par boues actives
2.
Les descriptions de modles dunits boues actives mentionnent des dimensions comprises entre 300 ml et
environ 2 000 ml. Certaines units, rpliques assez fidles de stations en vraie grandeur, comportaient des
bassins de dcantation o les boues sjournaient avant dtre renvoyes par pompage dans le bassin daration,
tandis que dautres ntaient pas quipes pour cette opration, par exemple le modle de Swisher (1). La
dimension de lappareil rsulte dun compromis: il doit tre assez grand pour fonctionner correctement sur le
plan mcanique et traiter un volume dchantillons suffisant sans que son fonctionnement en soit altr et,
dautre part, il ne doit pas occuper trop despace ni demander une quantit de matriel excessive.
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19.3.2014
3.
Deux types dappareils, appliqus au dpart ltude des tensioactifs, ont t abondamment utiliss avec des
rsultats satisfaisants: les units dHusmann (2) et les units vase poreux (3) (4), qui sont dcrites dans la
prsente mthode dessai. Dautres units ont galement fait leurs preuves, par exemple celle dEckenfelder (5).
Compte tenu du cot relativement lev et des efforts exigs par la conduite de cet essai de simulation, des essais
de slection plus simples et moins onreux, qui figurent prsent au chapitre C.4-A F de la prsente annexe
(6), ont t tudis en parallle. Lexprience acquise avec de nombreux tensioactifs et dautres produits
chimiques a montr que ceux qui donnaient un rsultat positif aux essais de slection (facilement biodgradables)
se dgradaient aussi au cours de lessai de simulation. Certaines des substances rejetes par les essais de slection
taient acceptes daprs les essais de biodgradabilit intrinsque [chapitres C.12 (7) et C.19 (8) de la prsente
annexe] mais une partie seulement des substances formant ce dernier groupe se dgradait au cours de lessai de
simulation, tandis que les substances cartes par les essais de biodgradabilit intrinsque ntaient pas dgrades
au cours des essais de simulation (9) (10) (11).
4.
Les essais de simulation conduits sous une seule combinaison de conditions exprimentales suffisent remplir
certains objectifs; les rsultats sont exprims en pourcentage dlimination de la substance dessai ou du carbone
organique dissous (COD). Ce type dessai est dcrit dans la prsente mthode dessai. Toutefois, contrairement
la prcdente version du prsent chapitre, qui nabordait quun seul type dappareil traitant des eaux uses
synthtiques en mode coupl suivant une mthode relativement grossire dpuisement des boues, le prsent
texte propose plusieurs variations. Il prsente plusieurs options concernant les types dappareil, les modes de
fonctionnement, les eaux uses et lvacuation des boues puises. Il saligne troitement sur la norme ISO
11733 (12), qui a t examine trs attentivement durant sa prparation, bien que la mthode nait pas fait
lobjet dun essai circulaire.
5.
Pour dautres objectifs, il est ncessaire de connatre la concentration de la substance dessai dans leffluent avec
plus de prcision, ce qui demande une mthode plus labore. Le dbit des boues puises, par exemple, doit
subir un contrle plus prcis durant chaque journe dessai et sur toute la priode de lessai, et il faut faire
tourner les units plusieurs dbits de boues puises. Pour que ltude soit plus complte, les essais doivent
aussi tre mens deux ou trois tempratures diffrentes: le mode opratoire est expos par Birch (13) (14) et
rsum lappendice 6. Toutefois, les connaissances actuelles ne permettent pas de dcrter quels modles
cintiques sont applicables la biodgradation des produits chimiques lors du traitement des eaux uses et
dans le milieu aquatique en gnral. La cintique de Monod, donne titre dexemple lappendice 6, est limite
aux substances dont la concentration atteint au moins 1 mg/l, mais de lavis de certains, mme sous cette
condition, cela reste dmontrer. Des essais raliss des concentrations plus proches de celles trouves
dans les eaux uses sont prsents lappendice 7, mais ces essais et ceux de lappendice 6 ne figurent quen
appendices et ne font pas lobjet de mthodes dessai.
Lits
6.
Les modles de lits percolateurs ont beaucoup moins retenu lattention, sans doute parce quils sont plus
encombrants et moins compacts que les modles de stations boues actives. Gerike et al. ont mis au point
des units lits percolateurs quils ont fait fonctionner en mode coupl (15). Ces lits taient relativement grands
(hauteur 2 m; volume 60 l) et demandaient pas moins de 2 l/h deaux uses chacun. Baumann et al. (16) ont
simul des lits percolateurs en insrant dans des tubes de 1 m (14 mm de diamtre interne) des bandes de
polyester velues pralablement plonges dans des boues actives concentres pendant 30 minutes. La substance
dessai, qui constituait la seule source de carbone dans une solution de sels minraux, tait introduite par le haut
du tube vertical et la biodgradation tait value daprs les mesures du COD dans leffluent et du CO2 dans les
dgagements gazeux.
7.
Les filtres biologiques ont t simuls dune autre manire (15): on a aliment les surfaces internes de tubes
rotatifs lgrement inclins par rapport lhorizontale deaux uses (environ 250 ml/h) avec et sans la substance
dessai, puis recueilli les effluents pour analyse du COD et/ou de la substance dessai tudie.
PRINCIPE DE LESSAI
8.
Cette mthode a t conue pour dterminer llimination et la biodgradation primaire et/ou finale de
substances organiques solubles dans leau par des micro-organismes arobies dans un systme dessai fonc
tionnement continu et simulant laction des boues actives. Un milieu organique facilement biodgradable et la
substance dessai organique forment la source de carbone et dnergie des micro-organismes.
9.
Deux units dessai fonctionnement continu (stations boues actives ou vases poreux) tournent en parallle
dans des conditions identiques choisies en fonction de la finalit de lessai. Normalement, le temps de rtention
hydraulique moyen est de 6 h et lge moyen des boues (temps de rtention des boues) est de 6 10 jours. Les
boues sont puises par application de lune des deux mthodes et la substance dessai est habituellement ajoute
une concentration comprise entre 10 et 20 mg/l de carbone organique dissous (COD) aux eaux traiter (milieu
organique) dune seule des units. La deuxime unit sert de tmoin pour dterminer la biodgradation dans le
milieu organique.
10. Le COD, de prfrence, ou la demande chimique en oxygne (DCO), ainsi que la concentration de la substance
dessai (si ncessaire), sont dtermins par une analyse spcifique conduite sur des chantillons deffluents
frquemment prlevs de lunit qui reoit la substance dessai. On suppose que la diffrence de concentration
du COD ou de la DCO dans les effluents de lunit dessai et de lunit tmoin est due la substance dessai ou
ses mtabolites organiques. On la compare ensuite la concentration du COD ou de la DCO dans les eaux
traiter attribuable la substance dessai, afin de dterminer les quantits de substance dessai limines.
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11. On parvient normalement distinguer la biodgradation de la bioadsorption en tudiant attentivement la courbe

dlimination en fonction du temps, et elle peut ordinairement tre confirme par un essai de biodgradabilit
immdiate conduit laide dun inoculum acclimat provenant de lunit qui reoit la substance dessai.
12. Il est ncessaire de connatre la puret, la solubilit dans leau, la volatilit et les caractristiques dadsorption de
la substance dessai pour tre en mesure dinterprter les rsultats correctement. Les substances volatiles et
insolubles ne peuvent normalement tre testes sans prcautions particulires (voir appendice 5). Il faudrait
connatre galement la formule chimique dveloppe ou, au moins, empirique, pour calculer les valeurs tho
riques et/ou vrifier les valeurs mesures de paramtres tels que la demande thorique en oxygne (DthO), le
carbone organique dissous (COD) et la demande chimique en oxygne (DCO).
13. Des donnes sur la toxicit de la substance dessai lgard des micro-organismes (voir appendice 4) peuvent
aussi tre utiles la slection des concentrations dessai appropries, et essentielles pour linterprtation correcte
de faibles valeurs de biodgradation.
NIVEAUX DE SEUIL
14. Dans lapplication initiale de cet essai de simulation (de confirmation) la biodgradation primaire des tensioac
tifs, la mise sur le march du tensioactif tait subordonne un taux dlimination suprieur 80 pour cent.
dfaut datteindre un taux de 80 pour cent, on peut mener cet essai de simulation (de confirmation) lissue
duquel le tensioactif ne sera mis sur le march que sil est limin plus de 90 pour cent. En gnral, avec les
produits chimiques, la question dun rsultat dessai positif ou ngatif nentre pas enjeu, et le pourcentage
dlimination obtenu peut servir calculer en gros la concentration probable dans lenvironnement introduire
dans lvaluation des risques dus aux substances chimiques. Les rsultats ont tendance tre de type tout ou rien.
Le pourcentage dlimination du COD atteint dans plusieurs tudes sur des substances chimiques pures tait
suprieur 90 pour cent pour plus des trois quarts des produits chimiques prsentant un degr de biodgra
dabilit significatif et suprieur 80 pour cent pour plus de 90 pour cent dentre eux.
15. Relativement peu de substances chimiques, par exemple des tensioactifs, sont prsentes dans les eaux uses aux
concentrations (environ 10 mg C/l) appliques dans cet essai. Certains produits chimiques peuvent tre inhibi
teurs de telles concentrations, tandis que la cintique dlimination dautres substances risque dtre diffrente
aux faibles concentrations. Il est possible dvaluer la dgradation avec plus de prcision en recourant des
mthodes modifies et en choisissant des concentrations de la substance dessai ralistement faibles; les rsultats
obtenus pourraient servir calculer les constantes cintiques. Cependant, non seulement les techniques expri
mentales ne sont pas encore entirement valides, mais les modles cintiques, qui reproduisent les ractions de
biodgradation, nont pas t tablis (voir appendice 7).
SUBSTANCES DE RFRENCE
16. Pour sassurer que le mode opratoire est correctement suivi, il est quelquefois utile de tester des substances dont
le comportement est connu, paralllement aux substances dessai tudies. Il sagit notamment de lacide
adipique, du 2-phnylphnol, du bnaphthol, de lacide diphnique, de lacide 1-naphthoque, etc. (9) (10) (11).
REPRODUCTIBILIT DES RSULTATS DES ESSAIS
17. Il existe beaucoup moins de rapports dessais de simulation que de rapports dessais de biodgradabilit imm
diate. La reproductibilit entre essais conduits simultanment est bonne (de 10 15 pour cent) pour des
substances dessai dgrades 80 pour cent ou plus, mais la variabilit augmente pour les substances moins
bien dgrades. Certaines substances limites ont donn des rsultats trs disparates (par exemple 10 pour cent,
90 pour cent) diffrentes reprises au cours des neuf semaines de lessai.
18. Les rsultats obtenus laide des deux types dappareils ne diffraient gure, mais certaines substances ont subi
une dgradation plus pousse et plus constante avec les eaux uses domestiques quavec les eaux uses synth
tiques reconstitues selon la formule de lOCDE.
DESCRIPTION DE LA MTHODE DESSAI
Appareils
Systme dessai
19. Le systme dessai dune seule substance comprend une unit dessai et une unit tmoin, mais les analyses
spcifiques (biodgradation primaire) ne demandent quune unit dessai. Une unit tmoin peut servir plusieurs
units dessai recevant des substances dessai identiques ou diffrentes. En cas de couplage (appendice 3), chaque
unit dessai doit avoir sa propre unit tmoin. Le systme dessai peut consister en un modle de station boues
actives: unit dHusmann (appendice 1, figure 1) ou vase poreux (appendice 1, figure 2). Dans les deux cas, il
faut employer des rcipients de stockage de capacit suffisante pour accueillir les eaux traiter et les effluents
ainsi que des pompes pour doser les eaux traiter, mlangs ou non la solution contenant la substance dessai.
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20. Chaque unit boues actives se compose dun rcipient daration dune capacit connue de quelque trois litres
de boues actives et dun dcanteur secondaire qui contient environ un litre et demi; il est possible de modifier
les volumes dans une certaine mesure en ajustant la hauteur du dcanteur. Lutilisation de rcipients de dimen
sions diffrentes est permise condition de leur faire supporter des charges hydrauliques comparables. Sil ny a
pas moyen de maintenir la temprature de lenceinte dessai dans la gamme souhaite, on recommande dem
ployer des rcipients chemise deau thermostate. Les boues actives du dcanteur sont ramenes dans le
rcipient daration, en continu ou intervalles rguliers, laide dun mulseur air ou dune pompe doseuse,
pour y tre recycle.
21. Le systme du vase poreux consiste en un cylindre poreux fond conique plac lintrieur dun rcipient
lgrement plus grand de la mme forme, mais fabriqu en matire plastique impermable. Le matriau qui
convient au cylindre poreux est du polythylne de 2 mm dpaisseur dont les pores nexcdent pas 90 m. La
sparation des boues et du milieu organique trait est opre par un passage diffrentiel travers la paroi
poreuse. Les effluents se dversent dans lespace annulaire do ils dbordent dans le rcipient collecteur. Aucune
dcantation na lieu, si bien quil ny a pas de retour de boues. Lensemble du systme peut tre mont dans un
bain-marie thermostat. Les vases poreux sobstruent et risquent de dborder au dbut. Si cela se produit, il faut
remplacer le revtement poreux interne par un revtement propre en commenant par siphonner les boues du
vase dans un seau propre avant denlever le revtement obstru. Aprs avoir essuy le cylindre impermable
extrieur, on place un revtement propre et on remet la boue dans le vase. Si des boues adhrent sur les cts du
revtement obstru, celles-ci doivent tre soigneusement grattes et transfres. Le nettoyage des vases obstrus
seffectue dabord laide dun mince jet deau pour enlever les boues restantes, ensuite par trempage dans une
solution dilue dhypochlorite de sodium, puis dans leau, et sachve par un rinage complet leau.
22. Il convient dappliquer des techniques appropries laration des boues dans les rcipients daration des deux
systmes, par exemple des cubes fritts (pierres diffuseuses) et de lair comprim. Si ncessaire, lair sera pur par
passage travers un filtre convenable, et lav. Une quantit dair suffisante doit tre insuffle dans le systme
pour maintenir larobiose et conserver les boues ltat de floc pendant toute la dure de lessai.
Appareil de filtration ou centrifugeuse
23. Les chantillons seront filtrs travers une membrane possdant une porosit adquate (diamtre douverture
nominal de 0,45 m) qui adsorbe les substances organiques solubles et libre le moins possible de carbone
organique. Si les lits utiliss librent du carbone organique, il faut les laver soigneusement leau chaude afin
dvacuer le carbone organique lixiviable. Une centrifugeuse tournant 40 000 m/s2 peut remplacer lappareil de
filtration.
Matriel danalyse
24. Appareils permettant de dterminer:
le COD (carbone organique dissous) et le COT (carbone organique total), ou la DCO (demande chimique en
oxygne),
la substance donne, sil y a lieu,
les solides en suspension, le pH, la concentration doxygne dans leau,
la temprature, lacidit, lalcalinit,
lammonium, les nitrites et les nitrates, si lessai est ralis dans des conditions nitrifiantes.
Eau
25. Eau du robinet renfermant moins de 3 mg/l de COD. Mesurer lalcalinit si elle est inconnue.
26. Eau dsionise contenant moins de 2 mg/l de COD.
Milieu organique
27. Les eaux uses synthtiques, les eaux uses domestiques ou un mlange des deux sont accepts comme milieu
organique. Il a t dmontr (11) (14) que les eaux uses domestiques employes seules augmentaient souvent le
pourcentage dlimination du COD et entranaient mme llimination et la biodgradation de certaines
substances chimiques non biodgrades par les eaux uses synthtiques formules selon lOCDE. En outre,
laddition constante ou intermittente deaux uses domestiques stabilise souvent les boues actives, y compris
sa capacit dcanter convenablement, laquelle est dterminante. Aussi prconise-t-on lutilisation deaux uses
domestiques. On mesure la concentration du COD ou de la DCO. Lacidit ou lalcalinit du milieu organique
doivent tre connues. Il peut tre ncessaire de tamponner le milieu organique par un compos appropri
(hydrognocarbonate de sodium ou dihydrognophosphate de potassium) sil est faiblement acide ou alcalin,
pour maintenir le pH environ 7,5 0,5 dans le rcipient daration durant lessai. La quantit de tampon
ajouter et le moment de cette addition seront dcids au cas par cas. Lorsquon utilise des mlanges de faon
continue ou intermittente, le COD (ou la DCO) de ces mlanges doivent tre maintenus une valeur peu prs
constante, par exemple par dilution dans leau.
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Eaux uses synthtiques

28. Dans chaque litre deau du robinet, dissoudre 160 mg de peptone, 110 mg dextrait de viande, 30 mg dure,
28 mg dhydrognophosphate de potassium anhydre (K2HPO4), 7 mg de chlorure de sodium (NaCl), 4 mg de
chlorure de calcium dihydrat (CaCl2.2H2O) et 2 mg de sulfate de magnsium heptahydrat (Mg2SO4.7H20).
Cette eau use synthtique formule selon lOCDE offre un exemple o la concentration moyenne de COD dans
les eaux traiter atteint quelque 100 mg/l. Utiliser en alternance dautres compositions donnant peu prs la
mme concentration de COD, plus proches des eaux uses domestiques. Si les eaux traiter doivent tre moins
concentres, diluer les eaux uses synthtiques, 1/1 par exemple, dans de leau du robinet afin dobtenir une
concentration denviron 50 mg/l. Ces eaux traiter allges favoriseront la croissance des organismes nitrifiants;
cette modification devra tre mise profit au cas o savre ncessaire ltude de la simulation de stations
dpuration des eaux uses en rgime nitrifiant. Ces eaux uses synthtiques, base deau distille, peuvent tre
confectionnes sous une forme concentre et stockes environ 1 C pendant une semaine au maximum. Selon
les besoins, diluer avec de leau du robinet (ce milieu nest pas satisfaisant, notamment parce quil prsente une
concentration en azote trs leve et une teneur en carbone relativement faible, mais rien de mieux na t
suggr, en dehors dun apport supplmentaire de tampon phosphate et de peptone).
Eaux uses domestiques
29. Utiliser des eaux uses qui viennent dtre dcantes, recueillies quotidiennement dans une station dpuration qui
reoit principalement des eaux uses domestiques. Elles doivent tre prleves avant la sdimentation primaire,
au niveau du dversoir de la cuve de sdimentation primaire ou dans les eaux brutes de la station de traitement
par boues actives. Les eaux uses peuvent tre utilises aprs plusieurs jours de stockage (gnralement pas plus
de sept) environ 4 C, sil est prouv que le COD (ou la DCO) nont pas diminu de manire significative (cest-dire de moins de 20 pour cent) durant le stockage. Afin de limiter la perturbation du systme, il conviendrait
dajuster le COD (ou la DCO) de chaque nouveau lot avant son utilisation une valeur constante adquate, par
exemple en le diluant avec de leau du robinet.
Boues actives
30. Prlever les boues actives destines linoculation dans la cuve daration dune station dpuration des eaux
uses correctement exploite ou dune unit boues actives conue lchelle exprimentale traitant principa
lement des eaux uses domestiques.
Solutions mres de la substance dessai
31. Pour les substances prsentant une solubilit convenable, prparer des solutions mres aux concentrations
appropries (par exemple, 1 5 g/l) dans de leau dsionise, ou dans la fraction minrale de leau use
synthtique. En ce qui concerne les substances insolubles et volatiles, se reporter lappendice 5. Dterminer
le COD et le carbone organique total (COT) de la solution mre et rpter les mesures chaque nouveau lot. Si
la diffrence entre le COD et le COT excde 20 pour cent, il faut vrifier lhydrosolubilit de la substance dessai.
Comparer le COD ou la concentration de la substance dessai mesure par une analyse spcifique de la solution
mre la valeur nominale, pour sassurer que la rcupration est suffisante (elle doit normalement dpasser
90 pour cent). Vrifier, en particulier pour les dispersions, si le COD peut tre utilis comme paramtre danalyse
ou si seule une technique danalyse spcifique de la substance dessai est applicable. Les dispersions imposent la
centrifugation des chantillons. Pour chaque nouveau lot, mesurer le COD, la DCO, ou la substance dessai par
une analyse spcifique.
32. Dterminer le pH de la solution mre. Les valeurs extrmes indiquent que laddition de la substance est
susceptible dinfluencer le pH des boues actives dans le systme dessai. Dans ce cas, il faut neutraliser la
solution mre pH 7 0,5 avec de faibles quantits dun acide ou dune base inorganiques, tout en vitant la
prcipitation de la substance dessai.
MODE OPRATOIRE
33. Le mode opratoire est dcrit pour les units boues actives; pour le systme du vase poreux, il doit tre
lgrement adapt.
Prparation de linoculum
34. Au dbut de lessai, inoculer le systme dessai avec des boues actives ou un inoculum contenant une faible
concentration de micro-organismes. Linoculum est conserv dans un endroit ar temprature ambiante avant
dtre utilis dans les 24 heures. Dans le premier cas, on prlve un chantillon de boues actives de la cuve
daration dune station dpuration biologique des eaux uses exploite avec efficacit ou dune installation de
traitement de laboratoire qui soit essentiellement alimente par des eaux uses domestiques. Sil y a lieu de
simuler des conditions nitrifiantes, collecter les boues dune station de traitement des eaux uses en rgime
nitrifiant. Dterminer la concentration des solides en suspension et, si ncessaire, concentrer les boues par
dcantation pour que le volume ajout au systme dessai soit minimal. Vrifier que la teneur en matire
sche de dpart tourne autour de 2,5 g/l.
35. Dans le deuxime cas, 2 ml/l 10 ml/l dun effluent dune station dpuration biologique des eaux uses
constitueront linoculum. Afin de runir autant despces bactriennes que possible, il peut tre utile dajouter
des inoculums de diverses autres sources, par exemple les eaux de surface. Dans ces conditions, les boues actives
vont se former et se dvelopper dans le systme dessai.
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Dosage du milieu organique

36. Nettoyer mticuleusement les rcipients destins recevoir les eaux traiter et les effluents ainsi que les tuyaux
reliant ces deux rcipients, afin de prvenir toute prolifration de micro-organismes, au dbut de lessai et tout au
long de celui-ci. Assembler les systmes dessai dans une pice thermostate (normalement entre 20 et 25 C) ou
utiliser des units dessai chemise deau. Prparer un volume suffisant du milieu organique requis (paragraphes
27-29). Commencer par remplir le rcipient daration et le dcanteur avant dintroduire linoculum (paragraphes
34, 35). Actionner le dispositif daration de telle sorte que les boues soient maintenues en suspension et en
arobiose, et entamer le dosage des eaux traiter et le recyclage des boues dcantes. Doser le milieu organique
des rcipients de stockage et introduire ce dernier dans les rcipients daration (paragraphes 20, 21) des units
dessai et tmoin et recueillir leurs effluents respectifs dans des rcipients de stockage similaires. Le temps de
rtention hydraulique normal de 6 heures sera assur par un pompage du milieu organique raison de 0,5 l/h.
Pour confirmer ce dbit, mesurer la quantit quotidienne de milieu organique dos en enregistrant la diminution
de volume du milieu dans les rcipients de stockage. Il faudrait faire appel dautres mthodes de dosage pour
dterminer les effets du dversement intermittent et du traitement de choc par des produits chimiques.
37. Si le milieu organique est prpar en vue dune utilisation dont la dure dpasse un jour, il y a lieu de le
rfrigrer environ 4 C ou de le conserver par une autre mthode adquate, afin de prvenir la croissance des
micro-organismes et la biodgradation en dehors des units dessai (paragraphe 29). Si lon emploie une eau use
synthtique, il est possible de prparer et dentreposer environ 4 C une solution mre concentre (par exemple
dix fois la concentration normale, voir paragraphe 28). Cette solution mre peut tre convenablement mlange
un volume adquat deau du robinet avant usage, ou tre pompe directement, tandis que le volume adquat
deau du robinet est pomp sparment.
Dosage de la substance dessai
38. Un volume appropri de la solution mre de la substance dessai (paragraphe 31) est introduit dans le rcipient
de stockage des eaux traiter ou dos directement, laide dune autre pompe, dans le rcipient daration. La
concentration dessai moyenne normale dans les eaux traiter doit se situer entre 10 mg/l et 20 mg/l de COD, et
la concentration maximale 50 mg/l. Si lhydrosolubilit de la substance dessai est faible ou si des effets
toxiques risquent de se produire, abaisser la concentration 5 mg/l de COD ou mme moins, mais seulement
si une mthode danalyse spcifique est applicable (les substances dessai disperses peu solubles dans leau
peuvent tre ajoutes par le biais de techniques de dosage spciales, voir appendice 5).
39. Une fois que le systme est stabilis et limine le COD du milieu organique avec efficacit (environ 80 pour
cent), commencer ajouter la substance dessai. Il est important de vrifier que toutes les units travaillent avec
le mme rendement avant dajouter la substance dessai; si ce nest pas le cas, il est souvent utile de mlanger les
diffrentes boues et de redistribuer des volumes gaux aux units. Lorsquon utilise un inoculum de quelque
2,5 g/l (poids sec) de boues actives, la substance dessai peut tre ajoute ds le dbut de lessai, car laddition
directe de quantits croissantes ds le dpart offre lavantage de pouvoir rendre les boues actives mieux
adaptables la substance dessai. Quelles que soient les modalits de ladjonction de la substance dessai, il
est recommand de mesurer les dbits et/ou les volumes correspondants dans le(s) rcipient(s) de stockage
intervalles rguliers.
Manipulation des boues actives
40. La concentration des solides des boues actives se stabilise normalement durant lessai, quel que soit linoculum
utilis, entre 1 et 3 g/l (poids sec) suivant la qualit et la concentration du milieu organique, les conditions
exprimentales, la nature des micro-organismes prsents et linfluence de la substance dessai.
41. Dterminer les solides en suspension dans les rcipients daration au moins une fois par semaine en jetant les
boues excdentaires, afin de maintenir la concentration entre 1 g/l et 3 g/l (poids sec), ou veiller la constance de
lge moyen des boues, qui doit gnralement se situer entre 6 et 10 jours. Si lon choisit, par exemple, un temps
de rtention des boues de 8 jours, on enlvera chaque jour 1/8 du volume des boues actives dans le rcipient
daration et on le jettera. Effectuer cette opration quotidiennement ou, de prfrence, utiliser une pompe
automatique intermittente. Le maintien de la concentration des solides en suspension une valeur constante
ou entre des limites troites ne fige pas le temps de rtention des boues, qui est la variable permettant de
dterminer la concentration de la substance dessai dans leffluent.
42. Tout au long de lessai, ter au moins une fois par jour la boue qui adhre aux parois du rcipient daration et
du dcanteur et remettre cette dernire en suspension. Inspecter et nettoyer rgulirement tous les tuyaux afin de
prvenir la croissance dun biofilm. Recycler les boues dcantes du dcanteur en la renvoyant dans le rcipient
daration, de prfrence par pompage intermittent. Le systme des vases poreux ne comporte pas de recyclage,
mais il faut veiller placer des cylindres internes propres avant que le volume natteigne une croissance
significative dans le rcipient (paragraphe 21).
43. Une mauvaise dcantation et des pertes de boues peuvent se produire dans les units dHusmann. On peut y
remdier en effectuant en parallle dans les units dessai et les units tmoin une ou plusieurs des oprations
numres ci-dessous:
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ajouter des boues fraches ou un floculant (2 ml par rcipient dune solution de FeCl3 50 g/l, par exemple)
intervalles rguliers, par exemple hebdomadaires, en sassurant que le FeCl3 ne ragit pas avec la substance
dessai et ne la fasse pas prcipiter,
remplacer lmulseur air par une pompe pristaltique, afin dinstaurer un flux de recirculation des boues
peu prs gal au dbit entrant appliquer et de permettre la formation dune zone anarobie dans les boues
dcantes (la gomtrie du dispositif airlift limite le dbit minimum du retour des boues environ douze fois
celui des eaux traiter),
pomper les boues, par intermittence, du dcanteur vers le rcipient daration (par exemple pendant
5 minutes toutes les 2,5 heures afin de recycler 1 1,5 l/h,
utiliser un agent antimousse non toxique une concentration minimale pour empcher les pertes dues
la formation de mousse (de lhuile de silicone, par exemple),
insuffler de lair travers les boues dans le dcanteur par puissantes saccades (par exemple pendant
10 secondes toutes les heures),
doser le milieu organique par intervalles dans le rcipient daration (par exemple pendant 3
10 minutes toutes les heures).
chantillonnage et analyse
44. intervalles rguliers, mesurer la concentration doxygne dissous, la temprature et le pH des boues actives
dans les rcipients daration. Faire en sorte quil y ait toujours suffisamment doxygne disponible (> 2 mg/l) et
que la temprature demeure dans la gamme requise (normalement de 20 C 25 C). Maintenir le pH 7,5 0,5
en dosant de petites quantits dune base ou dun acide inorganiques que lon introduit dans le rcipient
daration ou dans les eaux traiter, ou en augmentant le pouvoir tampon du milieu organique (voir paragraphe
27). Si une nitrification a lieu, elle gnre de lacide, loxydation de 1 mg dazote produisant lquivalent de
quelque 7 mg de CO3. La frquence des mesures dpend du paramtre mesurer et de la stabilit du systme, et
peut varier entre une cadence journalire et hebdomadaire.
45. Dterminer le COD ou la DCO dans les eaux traiter des rcipients dessai et tmoins. Mesurer la concentration
de la substance dessai dans les eaux brutes par une analyse spcifique ou estimer cette variable daprs la
concentration dans la solution mre (paragraphe 31), le volume utilis et la quantit deaux uses doses
dans lunit dessai. Il est recommand de calculer la concentration de la substance dessai afin de rduire la
variabilit des donnes relatives la concentration.
46. Prlever des chantillons appropris dans leffluent recueilli (par exemple des chantillons composites sur
24 heures) qui seront filtrs travers une membrane pores de 0,45 m ou centrifugs environ 40
000 m/s2 pendant prs dun quart dheure. Il convient de recourir la centrifugation si la filtration pose des
difficults. Dterminer le COD ou la DCO au moins deux fois, afin de mesurer par une analyse spcifique de la
substance dessai la biodgradation finale et, selon les besoins, la biodgradation primaire.
47. Lutilisation de la DCO peut donner lieu des problmes analytiques aux faibles concentrations et nest donc
recommande que si la concentration dessai est suffisante (environ 30 mg/l). Sagissant de substances trs
adsorbantes, on prconise de mesurer la quantit de substance adsorbe dans les boues par une technique
danalyse spcifique de la substance dessai.
48. La frquence de l'chantillonnage dpend de la dure suppose de l'essai. Un rythme de trois fois par semaine est
recommand. Une fois que les units fonctionnent de manire efficace, on leur laisse une priode d'adaptation de
une six semaines maximum aprs l'introduction de la substance d'essai, afin de leur permettre d'atteindre un
tat stationnaire. Il faut, de prfrence, obtenir au moins 15 valeurs valables pendant la phase plateau (para
graphe 59), qui dure normalement trois semaines, pour valuer le rsultat de lessai. Lessai peut sarrter l si lon
a atteint un degr dlimination suffisant (par exemple suprieur 90 pour cent) et si lon possde ces 15 valeurs
issues danalyses conduites chaque jour de semaine pendant trois semaines. Lessai ne doit normalement pas se
prolonger au-del de 12 semaines aprs laddition de la substance dessai.
49. Si les boues sont nitrifiantes et que les effets de la substance dessai sur la nitrification sont tudier, analyser des
chantillons prlevs dans les effluents de lunit dessai et de lunit tmoin, au moins une fois par semaine pour
lammonium et/ou les nitrites et nitrates.
50. Toutes les analyses doivent tre excutes le plus vite possible, en particulier celles qui portent sur lazote. Au cas
o les analyses doivent tre diffres, conserver les chantillons environ 4 C lobscurit dans des bouteilles
pleines et bouches hermtiquement. Sil y a lieu de stocker les chantillons pendant plus de 48 heures, on les
conservera par conglation, acidification (par exemple 10 ml/l dune solution dacide sulfurique 400 g/l) ou par
adjonction dun toxique appropri [par exemple 20 ml/l dune solution de chlorure de mercure (II) 10 g/l].
Sassurer que la technique de conservation ninfluence pas les rsultats de lanalyse.
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Couplage des units dessai

51. Si lon effectue un couplage (appendice 3), changer quotidiennement la mme quantit de boues actives (de
150 ml 1 500 ml pour les rcipients daration contenant trois litres de liquide) entre les rcipients daration
de lunit dessai et de lunit tmoin. Si la substance dessai sadsorbe fortement sur les boues, nchanger que le
surnageant des dcanteurs. Introduire dans les deux cas un facteur de correction dans le calcul des rsultats de
lessai (paragraphe 55).
RSULTATS ET RAPPORT
52. Calculer le pourcentage dlimination de la substance dessai en termes de COD ou de DCO pour chaque
valuation programme dans le temps laide de lquation suivante:
Dt
Cs E Eo
100
Cs
o
Dt = pourcentage dlimination du COD ou de la DCO linstant t;
Cs = COD ou DCO dans les eaux traiter, induits par la substance dessai, estims de prfrence partir de la
solution mre (mg/l);
E = valeur mesure du COD ou de la DCO dans les effluents dessai linstant t (mg/l);
Eo = valeur mesure du COD ou de la DCO dans les effluents tmoins linstant t (mg/l).
53. Le degr dlimination du COD ou de la DCO du milieu organique de lunit tmoin est utile pour valuer
lactivit de biodgradation des boues actives pendant lessai. Calculer le pourcentage dlimination selon
lquation suivante:
DB
CM Eo
100
CM
o
DB = pourcentage dlimination du COD ou de la DCO du milieu organique de lunit tmoin linstant t;
CM = COD ou DCO du milieu organique des eaux brutes tmoins (mg/l).
Calculer, facultativement, le pourcentage dlimination du COD ou de la DCO engendrs par le milieu organique
et la substance dessai dans lunit dessai, partir de lquation suivante:
DT
CT E
100
CT
o
DT = pourcentage dlimination du COD ou de la DCO dans la totalit des eaux brutes dessai;
CT = COD ou DCO de la totalit des eaux brutes dessai ou calculs partir des solutions mres (mg/l).
54. Calculer llimination de la substance dessai si elle a t mesure par une mthode danalyse spcifique chaque
instant dvaluation, selon lquation suivante:
DST
Si Se
100
Si
o
DST = pourcentage dlimination primaire de la substance dessai linstant t;
Si
= concentration mesure ou estime de la substance dessai dans les eaux brutes dessai (mg/l);
Se
= concentration mesure de la substance dessai dans les eaux brutes dessai linstant t (mg/l).
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55. En mode coupl, compenser la dilution de la substance dessai dans le rcipient daration, occasionne par
lchange de boues, par un facteur de correction (voir appendice 3). Si on a appliqu un temps de rtention
hydraulique moyen de six heures et chang la moiti du volume de boues actives contenu dans le rcipient
daration, il faut corriger les valeurs dtermines de llimination quotidienne (Dt, paragraphe 52) afin dobtenir
le degr rel dlimination, Dtc, de la substance dessai, partir de lquation suivante:
Dtc
4Dt 100
3
Expression des rsultats de lessai

56. Tracer une courbe des pourcentages dlimination Dt (ou Dtc) et DST, le cas chant, en fonction du temps (voir
appendice 2). Certaines conclusions peuvent tre tires de lallure de la courbe dlimination de la substance
dessai (proprement dite ou travers le COD) sur le processus dlimination.
Adsorption
57. Si lon observe une limination leve de la substance dessai en termes de COD ds le dbut de lessai, cette
substance est probablement vacue par adsorption sur les solides des boues actives. Il est possible de prouver
ce phnomne en mesurant la substance dessai adsorbe au moyen dune analyse spcifique. Il est rare que
llimination du COD de substances adsorbables demeure leve tout au long de lessai; normalement, le degr
dlimination est lev au dpart puis dcline progressivement jusqu une valeur dquilibre. Si toutefois la
substance dessai tait de nature acclimater la population de micro-organismes dune faon ou dune autre,
llimination du COD de la substance dessai augmenterait pour atteindre une valeur plateau leve.
Phase de latence
58. Beaucoup de substances dessai, comme cela se produit dans les essais de slection statiques, traversent une phase
de latence avant que la biodgradation nopre plein rgime. Durant la phase de latence, les bactries qui
dgradent sacclimatent ou sadaptent et nliminent presque pas la substance dessai, ensuite elles commencent
crotre. Cette phase sachve et la phase de dgradation est cense dbuter lorsque environ 10 pour cent de la
quantit initiale de la substance dessai est limine (y compris par adsorption, le cas chant). La phase de
latence est souvent trs variable et peu reproductible.
Phase plateau
59. Le plateau de la courbe dlimination dun essai conduit en continu est dfini comme la phase au cours de
laquelle la dgradation est maximale. La phase plateau doit durer au moins trois semaines et tre dtermine par
une quinzaine de valeurs mesures valables.
Degr moyen dlimination de la substance dessai
60. Calculer la moyenne des valeurs dlimination (Dt) de la substance dessai durant la phase plateau. Arrondie au
nombre entier le plus proche (1 %), elle reprsente le degr dlimination de la substance dessai. On recom
mande galement de calculer lintervalle de confiance 95 % de la valeur moyenne.
limination du milieu organique
61. Porter sur un graphique le pourcentage dlimination du COD ou de la DCO du milieu organique dans lunit
tmoin (DB) en fonction du temps. Indiquer le degr dlimination moyen comme pour la substance dessai
(paragraphe 60).
Indication de la biodgradation
62. Si la substance dessai nest pas adsorbe de faon significative sur les boues actives et que la courbe dlimi
nation prsente le profil typique dune courbe de biodgradation avec phase de latence, dgradation et plateau
(paragraphes 58, 59), llimination mesure est attribuable coup sr la biodgradation. Si llimination est
leve au dbut, lessai de simulation ne permet pas de faire la distinction entre les processus dlimination
biologiques et non biologiques. Dans ces cas-l, comme dans dautres o la biodgradation suscite des doutes,
(par exemple si on observe une sparation), analyser les substances dessai adsorbes ou effectuer des essais de
biodgradation statiques supplmentaires fonds sur des paramtres qui attestent clairement des processus
biologiques. Il sagit dessais bass sur la consommation doxygne [chapitres C.4-D, E et F de la prsente
annexe (6)] ou sur la mesure de la production de dioxyde de carbone [chapitre C.4-C de la prsente annexe
(6)] ou de lessai au CO2 dans lespace de tte de lISO (18), conduire sur un inoculum prexpos provenant de
lessai de simulation. Si llimination du COD et de la substance proprement dite ont t mesures, des
diffrences significatives (le premier tant infrieur la seconde) entre les pourcentages indiquent que les
effluents renferment des produits organiques intermdiaires susceptibles dtre plus difficiles dgrader que la
substance parente.
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Validit des rsultats de lessai

63. Lobtention dinformations sur lactivit de biodgradation normale de linoculum est subordonne la dter
mination du degr dlimination du milieu organique (paragraphe 53) dans lunit tmoin. Lessai est considr
comme valable si le degr dlimination du COD ou de la DCO dans la ou les units tmoins est suprieur
80 pour cent aprs deux semaines et quaucun phnomne inhabituel na t observ.
64. Si on a utilis une substance de rfrence immdiatement biodgradable, le degr de biodgradation (Dt,
paragraphe 52) doit tre suprieur 90 pour cent.
65. Si lessai est men dans des conditions nitrifiantes, la concentration moyenne dans les effluents doit tre < 1 mg/l
dazote ammoniacal et < 2 mg/l dazote sous forme de nitrites.
66. Faute de remplir ces critres (paragraphes 63-65), recommencer lessai en prlevant linoculum une source
diffrente, mettre une substance de rfrence lessai et rexaminer tout le mode opratoire.
Rapport dessai
67. Le rapport dessai doit inclure les informations suivantes:
Substance dessai:
nature chimique,
tat physique et, sil y a lieu, proprits physico-chimiques.
Conditions dessai:
type de systme dessai; toute modification impose par lessai de substances insolubles et volatiles,
type de milieu organique,
proportion et nature des effluents industriels dans les eaux uses, sils sont connus,
inoculum, nature et site(s) de prlvement, concentration et prtraitement ventuel,
solution mre de la substance dessai: teneur en COD et en COT; mode de prparation, sil sagit dune
suspension; concentration dessai applique; justifier pourquoi, le cas chant, on scarte de lintervalle 10
20 mg/l de COD; mthode daddition; date de la premire addition; toute modification,
ge moyen des boues et temps de rtention hydraulique moyen; mthode dpuisement des boues; mthodes
pour vaincre le foisonnement, pertes de boue, etc.,
techniques danalyse employes,
temprature dessai,
qualits du foisonnement des boues, indice des boues, matires en suspension de la liqueur mixte,
tout cart du mode opratoire normal et toute circonstance susceptibles davoir affect les rsultats.
Rsultats de lessai:
toutes les donnes mesures (COD, DCO, analyses spcifiques, pH, temprature, concentration doxygne,
solides en suspension, substances azotes, le cas chant),
toutes les valeurs calcules de Dt (ou Dtc), DB, DSt prsentes sous forme de tableau et de courbes dlimi
nation,
informations sur les phases de latence et de plateau, dure de lessai, degr dlimination de la substance
dessai et du milieu organique dans lunit tmoin, donnes statistiques, conclusions sur la biodgradabilit et
validit de lessai,
examen des rsultats.
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BIBLIOGRAPHIE:
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(6) Chapitre C.4 de la prsente annexe, Dtermination de la biodgradabilit facile.
(7) Chapitre C.12 de la prsente annexe, Biodgradation Test S.C.A.S. modifi.
(8) Chapitre C.19 de la prsente annexe, Estimation du coefficient dadsorption (KOC) sur le sol et les boues dpuration
par chromatographie liquide haute performance (HPLC).
(9) Gerike P. and Fischer W.K. (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in
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(13) Birch R.R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33-48.
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(17) Her Majestys Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and
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(18) ISO 14593 (1998). Qualit de leau valuation en milieu aqueux de la biodgradabilit arobie ultime des
composs organiques Mthode par analyse du carbone inorganique dans des rcipients hermtiquement clos
(Essai au CO2 dans lespace de tte).
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Appendice 1
Figure 1
Matriel utilis pour valuer la biodgradabilit
Unit dHusmann
A. Rcipient de stockage
E. mulseur air
B. Pompe doseuse
F.
C. Rcipient daration (3 litres)
G. Cuve daration
D. Dcanteur
H. Dbitmtre dair
Collecteur
Figure 2
Matriel utilis pour valuer la biodgradabilit
Vase poreux
A. Rcipient de stockage
E. Collecteur
B. Pompe doseuse
F.
C. Vase daration poreux
G. Dbitmtre dair
D. Enveloppe impermable
Diffuseur
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Figure 3
Agrandissement du vase daration poreux de 3 litres
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Appendice 2
Exemple dune courbe dlimination
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Appendice 3
COMPLMENT DINFORMATION
COUPLAGE DES UNITS DESSAI
Pour tenter dgaliser les populations de micro-organismes dans les boues de lunit dessai, qui reoit les eaux uses et une
substance dessai, et de lunit tmoin, qui ne reoit que les eaux uses, on a instaur un change de boue quotidien entre
ces deux units (1). Ce procd dit de couplage a donn lieu la mthode des units couples. Le couplage, ralis au
dpart sur des units boues actives de Husmann, a aussi t appliqu des units vase poreux (2) (3). Les rsultats
obtenus avec les units couples et non couples, quil sagisse des units dHusmann ou des units vase poreux, ne
donnent lieu aucune diffrence significative, si bien quil ny a aucun avantage investir plus de temps et dnergie dans
le couplage.
Les changes de boue peuvent laisser croire une limination assez considrable, puisquune partie de la substance dessai
est transfre et que lcart entre la concentration de la substance dessai dans les effluents dessai et dans les effluents
tmoins se comble. Il faut donc appliquer des facteurs de correction qui dpendent de la fraction change et du temps de
rtention hydraulique moyen. Une mthode de calcul plus dtaille a t publie (1).
Calculer le degr dlimination corrig du COD ou de la DCO selon la formule gnrale suivante:
Dtc = (Dt - 100 a r/12)/(1 - a r/12) %
o
Dtc = pourcentage dlimination corrig du COD ou de la DCO;

Dt = pourcentage dlimination dtermin du COD ou de la DCO;
a
= fraction volumique change entre les units boues actives;
= temps de rtention hydraulique moyen (h)
Si, par exemple, la moiti du volume du rcipient daration est change (a = 0,5) et que le temps de rtention
hydraulique moyen est de 6 h, la formule de correction devient:
Dtc
4Dt 100
3
BIBLIOGRAPHIE:
(1) Fischer W., Gerike P., Holtmann W. (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical
Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.
(2) Painter H.A., Bealing D.J. (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test.
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(3) Painter H.A., King E.F. (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical
Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
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Appendice 4
VALUATION DE LINHIBITION DES BOUES ACTIVES
Inhibition par les substances dessai
1. Il se peut quune substance chimique (ou des eaux uses) ne soient ni dgrades ni limines au cours de lessai de
simulation et quelles inhibent de surcrot les micro-organismes des boues. Dautres composs chimiques sont biod
grads faible concentration, mais ont une action inhibitrice des concentrations suprieures (hormse). Les effets
inhibiteurs peuvent avoir t rvls un stade prcdent ou tre dtermins par un essai de toxicit, conduit sur un
inoculum semblable ou identique celui utilis au cours de lessai de simulation (1). Ces mthodes ont trait
linhibition de la fixation doxygne [chapitre C.11 de la prsente annexe (2) et norme ISO 8192 (3)] ou linhibition
de la croissance des organismes des boues [norme ISO 15522 (4)].
2. Une inhibition survenant au cours dun essai de simulation se manifestera par une diffrence de COD ou de DCO entre
les effluents du rcipient dessai et ceux du rcipient tmoin suprieure au COD ajout par la substance dessai. En
dautres termes, la prsence de la substance dessai abaissera le pourcentage dlimination du COD (et de la demande
biochimique en oxygne DBO, de la demande chimique en oxygne DCO, et/ou de lion NH+4) du milieu organique
trait. Si cela se produit, il faudrait recommencer lessai en ramenant la concentration de la substance dessai jusqu un
niveau o elle nest pas inhibitrice et ventuellement aussi en diminuant davantage sa concentration jusqu une valeur
o elle est biodgrade. Nanmoins, si la substance dessai (ou les eaux uses) altrent le processus toutes les
concentrations testes, il est vraisemblable que la substance est difficile, voire impossible, traiter par voie biologique,
mais il peut tre pertinent de rpter lessai avec des boues actives prleves une autre source et/ou en soumettant
les boues une acclimatation plus progressive.
3. Par contre, si la substance dessai est limine par voie biologique du premier coup dans lessai de simulation, il
convient daccrotre sa concentration si lon cherche savoir si elle a un pouvoir inhibiteur.
4. Noublions pas, lorsquon tente de dterminer les degrs dinhibition, que la population dune boue active est
susceptible dvoluer, si bien quavec le temps, les micro-organismes peuvent devenir rsistants vis--vis dune substance
inhibitrice.
5. Calcul du degr dinhibition:
Les pourcentages dlimination globaux Ro de la DBO, du COD, de la DCO, etc., dans les units dessai et tmoins
peuvent tre calculs comme suit:
Ro = 100 (I - E)/I %
o:
I = concentration de la DBO, du COD, de la DCO etc., dans les eaux traiter des rcipients dessai ou tmoins
(mg/l);
E = concentrations respectives dans les effluents (mg/l).
I et E doivent tre corrigs pour tenir compte du COD provenant de la substance dessai dans les units dessai, sinon
le calcul du pourcentage dinhibition sera incorrect.
Le degr dinhibition dcoulant de la prsence de la substance dessai peut tre calcul selon cette formule:
% dinhibition = 100 (Rc - Rt)/Rc
o:
Rc = pourcentage dlimination dans les rcipients tmoins;
Rt = pourcentage dlimination dans les rcipients dessai.
BIBLIOGRAPHIE:
(1) Reynolds L. et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16:
2259.
(2) Chapitre C.11 de la prsente annexe, Biodgradation boues actives: essai dinhibition de la respiration.
(3) ISO 8192 (2007) Qualit de leau Essai dinhibition de la consommation doxygne par des boues actives pour
loxydation du carbone et de lammonium.
(4) ISO 15522 (1999) Dtermination de leffet inhibiteur des constituants de leau sur la croissance des micro-organismes
de boues actives.
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Appendice 5
Substances dessai peu solubles dans leau substances volatiles
Substances peu solubles dans leau
Il semble quil y ait peu de publications rapportant des essais de simulation de traitement des eaux uses conduits sur des
substances peu solubles dans leau et insolubles (1) (2) (3).
Il nexiste pas de mthode de dispersion universelle applicable toutes les substances dessai insolubles. Sur les quatre
catgories de mthodes dcrites dans la norme ISO 10634 (4), les deux qui paraissent convenir la dispersion des
substances destines un essai de simulation font appel des agents mulsifiants et/ou des ultrasons. La stabilit de la
dispersion obtenue doit tre tablie pour une priode dau moins 24 heures. Des dispersions convenablement stabilises
contenues dans des rservoirs agits en permanence (paragraphe 38), seront ensuite doses dans le rcipient daration
sparment des eaux uses domestiques ou synthtiques.
Si les dispersions sont stables, tudier comment dterminer la substance dessai sous sa forme disperse. Comme le COD
risque fort dtre inappropri, il faudrait mettre au point une mthode danalyse spcifique de la substance dessai
applicable aux effluents, aux solides des effluents et la boue active. Le devenir de la substance dessai dans la simulation
du traitement par boues actives serait alors dtermin dans les phases solides et liquides. On tablirait ainsi un bilan
massique pour savoir si la substance dessai a t biodgrade. Mais ce dernier nindique que la biodgradation primaire. Il
faudrait tcher de dmontrer la biodgradation finale par le biais dun essai de biodgradabilit immdiate au respiromtre
[chapitre C.4 de la prsente annexe (5), C, F ou D] en utilisant comme inoculum une boue expose la substance dessai
au cours de lessai de simulation.
Substances volatiles
Lapplication dun essai de simulation du traitement des eaux uses aux substances volatiles est discutable et problma
tique. Comme pour les substances dessai peu solubles dans leau, les rapports dcrivant des essais de simulation sur des
substances volatiles semblent trs rares. On adapte un appareil classique de mlange intgral en bouchant hermtiquement
le rcipient daration et le dcanteur, en mesurant et contrlant le flux dair par des dbitmtres et en faisant passer les
gaz sortants par des piges afin de recueillir les matires organiques volatiles. Dans certains cas, une pompe vide dirige
les gaz sortants vers un pige froid ou un pige purgeur contenant du Tenax ou un gel de silice pour analyse par
chromatographie en phase gazeuse. La substance dessai retenue par le pige peut tre dtermine par analyse.
Lessai est ralis en deux parties. Les units fonctionnent dabord sans boue, mais en pompant les eaux uses synthtiques
additionnes de la substance dessai dans le rcipient daration. On analyse la substance dessai dans des chantillons
deaux traiter, deffluents et de gaz sortants pendant quelques jours. partir des donnes recueillies, il est possible de
calculer le pourcentage (Rvs) de substance dessai extraite du systme.
Ensuite lessai biologique normal (avec boue) est men dans des conditions exprimentales identiques celles de ltude
dextraction. On mesure aussi le COD ou la DCO pour sassurer que les units fonctionnement efficacement. La substance
dessai est mesure de temps autre dans les eaux traiter, les effluents et les gaz sortants au cours de la premire partie
de lessai, et plus frquemment aprs lacclimatation. Les donnes tires de la phase stationnaire permettent nouveau de
calculer le pourcentage dlimination de la substance dessai dans la phase liquide par les processus physiques et
biologiques (RT) ainsi que la proportion (Rv) extraite du systme.
Calcul:
a) Dans lessai non biologique, le pourcentage (RVP) de substance dessai extraite du systme peut tre calcul partir de
la formule suivante:
RVP
SVP
100
SIP
o
RVP = limination de la substance dessai par volatilisation (%),
SVP = substance dessai collecte par le pige, exprime en quivalent de concentration dans la phase liquide (mg/l),
SIP = concentration de la substance dessai dans les eaux traiter (mg/l).
b) Dans lessai biologique, le pourcentage (RV) de la substance dessai extraite du systme peut tre calcul partir de la
formule suivante:
RV
SV
100
SI
o
RV = limination de la substance dessai par volatilisation au cours de lessai biologique (%),
SV = substance dessai collecte par le pige au cours de lessai biologique, exprime en quivalent de concentration
dans les flux liquides entrants (mg/l),
SI = concentration de la substance dessai dans les eaux brutes (mg/l).
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19.3.2014
c) Dans lessai biologique, le pourcentage (RT) de substance dessai limine par tous les processus est rgi par lquation
suivante:
RT 1
SE
100
SI
o
SE = concentration de la substance dessai dans les effluents (liquides) (mg/l).
d) Aussi, le pourcentage (RBA) enlev par biodgradation et par adsorption peut-il tre calcul comme suit:
RBA = (RT - RV)
Il conviendrait de raliser dautres essais pour dterminer si la substance dessai est adsorbe, auquel cas une correction
supplmentaire pourrait tre apporte.
e) Une comparaison entre la proportion de substance dessai extraite lors de lessai biologique (Rv) et de lessai non
biologique (Rvp) montre leffet global du traitement biologique sur lmission de la substance dessai dans latmosphre.
Exemple: Benzne
Temps de rtention des boues = 4 jours
Eaux uses synthtiques: temps de rtention = 8 heures
SIP = SI = 150 mg/l
SVP = 150 mg/l (SEP = 0)
SV = 22,5 mg/l
SE = 50 g/l
Donc,
RVP = 100 %, RV = 15 %
RT = 100 % and RBA = 85 %.
On a suppos quil ny avait pas adsorption du benzne sur la boue.
BIBLIOGRAPHIE:
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peu solubles dans leau en vue de lvaluation de leur biodgradabilit en milieu aqueux.
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Appendice 6
Effets du temps de rtention des boues (TRB) sur les possibilits de traitement des substances
chimiques
INTRODUCTION
1. La mthode dcrite dans le corps de texte a t conue pour vrifier si les substances chimiques testes (gnralement
celles connues comme tant intrinsquement, mais pas immdiatement biodgradables) pouvaient tre biodgrades
dans les limites imposes par les stations dpuration des eaux uses. Les rsultats sont exprims en pourcentage
dlimination et de biodgradation. Les conditions de fonctionnement des units boues actives et le choix des eaux
traiter autorisent une variation assez marque de la concentration de la substance dessai dans les effluents. Les
essais ne portent que sur une seule concentration nominale de solides des boues ou sur un seul temps de rtention
nominal des boues (TRB), et les rgimes dpuisement des boues dcrits sont susceptibles de faire varier considra
blement le TRB durant lessai, dun jour lautre et sur une journe.
2. Dans cette variante (1) (2), le TRB est rgul dans des limites beaucoup plus troites tout au long de chaque priode
de 24 heures (comme grande chelle), si bien que la concentration des effluents est plus constante. On recommande
les eaux uses domestiques, qui donnent des pourcentages dlimination plus rguliers et plus levs. Les effets de
plusieurs valeurs du TRB sont aussi examins et lincidence dune gamme de tempratures sur la concentration dans
les effluents peut tre dtermine dans une tude plus dtaille.
3. Il nexiste pas encore de consensus gnral sur les modles cintiques qui reproduisent la biodgradation des subs
tances chimiques dans les conditions dune station de traitement des eaux uses. Sagissant des donnes collectes, le
modle de croissance bactrienne et dutilisation du substrat de Monod a t choisi (1) (2) dans la mesure o la
mthode tait destine ne sappliquer quaux substances chimiques produites par tonnes et donc prsentes des
concentrations suprieures 1 mg/l dans les eaux uses. La validit du modle simplifi et des hypothses mises a
t tablie laide dune srie dalcoolthoxylates (2) (3) manifestant des degrs variables de biodgradabilit primaire.
Note: cette variante reprend en grande partie le texte de la prsente mthode dessai C.10-A, seuls les dtails qui sen
cartent tant mentionns ci-aprs.
PRINCIPE DE LESSAI
4. Des units boues actives comportant un vase poreux, conues pour faciliter lpuisement (presque) continu de la
liqueur mixte grce un rglage trs prcis du temps de rtention des boues (TRB, ou s), fonctionnent en mode non
coupl et couvrent une gamme de temps de rtention et, facultativement, de tempratures. Le temps de rtention
varie gnralement entre 2 et 10 jours et la temprature entre 5 et 20 C. Les eaux uses, de prfrence domestiques,
et une solution de la substance dessai sont doses sparment dans les units des frquences induisant le temps de
rtention des eaux uses requis (3 6 heures) et la concentration voulue de la substance dessai dans les eaux traiter.
Les units tmoins qui ne reoivent pas la substance dessai tournent en parallle, des fins de comparaison.
5. Dautres types dappareils peuvent tre utiliss, mais il faut tre trs attentif bien matriser le TRB. Lorsquon utilise,
par exemple, des installations qui comprennent un dcanteur, il peut tre ncessaire de tenir compte de la perte de
solides via les effluents de linstallation. En outre, les erreurs dues la variation de la quantit de boue dans le
dcanteur doivent tre vites par des prcautions particulires.
6. Les units fonctionnent sous chaque combinaison de conditions choisie et, une fois lquilibre atteint, on mesure les
concentrations moyennes de la substance dessai dans les effluents ltat stationnaire et, facultativement, le COD, sur
une priode denviron trois semaines. Lvaluation du pourcentage dlimination de la substance dessai et, faculta
tivement, du COD, sera complte par une reprsentation graphique de la relation entre les conditions de fonction
nement de linstallation et la concentration dans les effluents. partir de l, il est possible de calculer des constantes
cintiques exprimentales et de prvoir les conditions dans lesquelles la substance dessai peut tre traite.
INFORMATION SUR LA SUBSTANCE DESSAI
7. Appliquer les paragraphes 12 et 13 du chapitre C.10-A.
NIVEAUX DE SEUILS
SUBSTANCE DESSAI DE RFRENCE
9. Appliquer le paragraphe 16 du chapitre C.10-A.
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REPRODUCTIBILIT DES RSULTATS DESSAI

Appareils
11. Une unit qui convient ici est une adaptation du systme du vase poreux (appendice 6.1). Elle consiste en un vase
interne (ou revtement) en polypropylne poreux de 3,2 mm dpaisseur dont les pores mesurent environ 90 m;
lassemblage est soud bout bout, ce qui rend lunit plus robuste que celle dcrite au paragraphe 21 du prsent
chapitre, C.10-A). Le revtement est entour dune enveloppe en polythylne impermable qui comprend deux
parties: une base circulaire perfore pour laisser passer deux tuyaux air et un tuyau transportant la boue puise, et
un cylindre viss sur le dessus de la base et dot dune sortie place de manire ce quil dverse un volume connu
(3 l) dans le vase poreux. Lun des deux tuyaux air est quip dune pierre diffuseuse et lautre est ouvert aux
extrmits et dispos angle droit de la pierre dans le vase. Ce systme cre suffisamment de turbulences pour
assurer un mlange intgral des composants du vase et engendrer des concentrations en oxygne dissous suprieures
2 mg/l.
12. Les units, en nombre adquat, sont places dans un bain-marie ou dans des locaux temprature constante et
thermostates entre 5 et 20 C ( 1 C). On emploie deux pompes pour doser la solution de la substance dessai et les
boues dcantes dans les rcipients daration aux dbits requis (respectivement 0-1,0 ml/min et 0-25 ml/min) et une
troisime pompe pour vacuer la boue puise des rcipients daration. Le dbit ncessairement trs lent des boues
puises est imprim par une pompe qui fonctionne une vitesse suprieure et par intermittences, au moyen dun
minuteur qui lactionne, par exemple, pendant 10 secondes par minute avec un dbit de 3 ml/min, ce qui donne un
dbit de boue puise de 0,5 ml/min.
Appareil de filtration ou centrifugeuse
13. Appliquer le paragraphe 23 du chapitre C10-A.
Matriel danalyse
Eau
Milieu organique
Boues actives
19. Appliquer le paragraphe 30 du chapitre C10-A.
MODE OPRATOIRE
Prparation de linoculum
21. Voir chapitre C.10-A, paragraphe 34 uniquement utiliser des boues actives (environ 2,5 g/l).
Nombre dunits dessai
22. Sagissant dun essai simple, qui ne vise qu mesurer le pourcentage dlimination, un seul TRB suffit, mais si on veut
runir les donnes ncessaires pour calculer les constantes cintiques exprimentales, on aura besoin de 4 ou 5
valeurs de TRB. Les valeurs choisies sont gnralement comprises entre 2 et 10 jours. Il est plus pratique de raliser
un essai en appliquant 4 ou 5 valeurs de TRB simultanment la mme temprature; les tudes plus pousses
portent sur les mmes valeurs de TRB, ou ventuellement sur une gamme de valeurs diffrentes, dautres
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tempratures fixes entre 5 et 20 C. La biodgradation primaire (utilisation principale) ne requiert normalement

quune seule unit par combinaison de conditions. Il faut ajouter une unit tmoin par combinaison de conditions,
qui reoit les eaux uses mais pas la substance dessai, pour la biodgradation finale. Si on suppose que les eaux uses
employes renferment la substance dessai, il y a lieu dincorporer des units tmoins lorsquon value la biodgra
dation primaire, et dapporter les corrections ncessaires aux calculs.
Dosage du milieu organique et de la substance dessai
23. Voir le chapitre C.10-A, paragraphes 36 39, mais remarquer que la solution de la substance dessai est dose
sparment et diffrents dbits de boues puises sont appliqus. Surveiller frquemment, par exemple deux fois par
jour et ajuster si ncessaire 10 pour cent, les dbits des eaux traiter, des effluents et des boues puises. Si les
mthodes danalyse posent des difficults avec les eaux uses domestiques, mener lessai avec de leau use synth
tique, en sassurant que diffrents milieux donnent des rsultats cintiques comparables.
Manipulation des boues actives
24. Saligner sur le chapitre C.10-A, paragraphes 40 43, mais ne rguler le TRB que par un dbit constant de boues
puises.
25. Se rfrer au chapitre C.10-A, paragraphes 44 50, cette exception prs quon dterminera la concentration de la
substance dessai et, facultativement, le COD, mais la DOC ne doit pas tre utilise.
RSULTATS ET RAPPORT
26. Suivre le chapitre C.10-A, paragraphes 52 54.
27. Suivre le chapitre C.10-A, paragraphes 56 62.
Calcul des constantes cintiques
28. Il est plus raliste de mentionner la concentration moyenne de la substance dessai ltat stationnaire dans leffluent
et de dcrire comment elle varie en fonction des conditions de fonctionnement de linstallation que de citer le
pourcentage de biodgradation primaire. Lquation [6] de lappendice 6.2 est utile cet gard, qui livre des valeurs de
KS, m et SC, le temps de rtention critique des boues.
[Des valeurs approximatives de KS et de m peuvent aussi tre dduites laide dun programme informatique simple
qui ajuste la courbe thorique calcule partir de lquation [2] (appendice 6.2) aux valeurs exprimentales. Bien
quune solution donne ne constitue pas une rponse absolue, on peut parvenir une approximation raisonnable de
KS et de m].
Variabilit des rsultats
29. Il est frquent de trouver des paramtres cintiques variables pour une mme substance. On pense que les conditions
de croissance des boues et les conditions dans lesquelles sest droul lessai (comme au paragraphe 5 et dans dautres
essais) ont une incidence marque sur les rsultats. Un aspect de cette variabilit a t examin par Grady et al. (4),
qui ont propos que les termes effectif et intrinsque sappliquent deux tats extrmes reprsentant les limites de
ltat physiologique quune culture peut atteindre au cours dune exprience cintique. Si ltat est maintenu durant
lessai, les valeurs du paramtre cintique refltent les conditions du milieu dans lequel les micro-organismes ont t
prlevs; ces valeurs sont dites effectives. lautre extrme, si les conditions de lessai autorisent le plein dvelop
pement du systme de synthse des protines et donc un taux de croissance maximum, les paramtres cintiques
rsultants sont dits intrinsques et ne dpendent que de la nature du substrat et des types de bactries qui
composent la culture. titre indicatif, on obtiendra des valeurs effectives en appliquant un rapport de la concen
tration du substrat sur les micro-organismes qui dgradent (So/Xo) faible, par exemple de 0,025, et les valeurs
intrinsques apparatront avec un rapport lev, par exemple dau moins 20. Dans les deux cas, So doit tre suprieur
ou gal la valeur applicable de Ks, la constante de demi-saturation.
30. La variabilit et dautres aspects de la cintique de biodgradation ont t examins lors dune runion rcente du
SETAC (5). Quelles aient fait lobjet de publications ou quil sagisse de projets, ces tudes devraient bientt livrer une
image plus claire de la cintique qui gouverne le traitement des eaux uses dans les stations et permettre ainsi de
mieux interprter les donnes existantes et davancer des conceptions plus pertinentes concernant de futures
mthodes dessai.
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BIBLIOGRAPHIE:
(1) Birch R.R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33-48.
(2) Birch R.R. (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. JAOCS, 61(2): 340-343.
(3) Birch R.R. (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol.,
50: 411-422.
(4) Grady C.P.L., Smets B.F. and Barbeau D.S. (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible
causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742-748.
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port
Sunlight, UK. Eds. Hales S.G., Feitjel T., King H., Fox K., Verstraete W. 4-6th September 1996. SETAC Europe,
Brussels.
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Appendice 6.1
Vase poreux avec rgulation du TRB
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Appendice 6.2
Calcul des constantes cintiques
1. En supposant que la cintique de Monod sapplique et compte tenu dun bilan massique de solides actifs et de substrat
dans le systme boues actives (1), les expressions suivantes dcrivent ltat stationnaire:
1
m S1
Kd
s Ks S1
ou
S1
O:
Ks 1 Kd s
s m Kd 1
[1]
[2]
S1 = concentration de substrat dans les effluents (mg/l)

KS = constante de demi-saturation, concentration laquelle = m/2 (mg/l)
= taux de croissance spcifique (d1)
m = valeur maximale de m (d1)

Kd = vitesse de dgradation spcifique des solides actifs (d1)
S
= temps de rtention moyen des boues, TRB (d)
Ltude de cette quation amne les conclusions suivantes:
i) La concentration dans les effluents est indpendante de celle qui rgne dans les eaux traiter (S 0); aussi, le
pourcentage de biodgradation varie-t-il avec la concentration dans les eaux traiter, S0.
ii) Le seul paramtre rgul de linstallation qui affecte S1 est le temps de rtention des boues, S.
iii) Une concentration donne dans les eaux traiter, S0, correspondra un temps de rtention critique des boues
selon la relation:
1
s S0
Kd
SC Ks S0
O:
[3]
SC = temps de rtention critique des boues, en dessous duquel les micro-organismes qui dgradent seront
expulss de linstallation.
iv) Comme les autres paramtres de lquation [2] sont lis la cintique de croissance, la temprature est susceptible
daffecter la teneur en substrat dans les effluents et lge critique des boues, en dautres termes, le temps de
rtention des boues ncessaire pour obtenir un certain degr de traitement augmenterait mesure que la temp
rature diminuerait.
2. Soit un bilan massique de solides dans le systme vase poreux, et en supposant que la concentration des solides dans
les effluents de la station, X2, est faible compare celle du rcipient daration, X1, le temps de rtention des boues
sexprime comme suit:
s
et
V X1
Q0 Q1 X2 Q1 X1
V X1
V
Q 1 X1 Q 1
o:
V
= volume du rcipient daration (l)
X1 = concentration des solides dans le rcipient daration (mg/l)
[4]
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X2 = concentration des solides dans leffluent (mg/l)

Q0 = dbit des eaux traiter (l/d)
Q1 = dbit des boues puises (l/d)
Il est donc possible de rgler le temps de rtention des boues sur nimporte quelle valeur prslectionne en rgulant le
dbit des boues puises, Q1.
Conclusions:
3. Cet essai vise principalement permettre de prdire la concentration dans les effluents et, partir de l, la concen
tration de la substance dessai dans les eaux rceptrices.
4. La courbe de S1 en fonction de S autorise parfois une valuation immdiate du temps de rtention critique des boues,
SC; voir par exemple la courbe 3 la figure 1. Si cest impossible, on peut calculer SC en mme temps que des
valeurs approximatives de m et KS, en traant S1 en fonction de S1S.
Lquation [1] est reformule en ces termes:
S1 s
Ks S1
1 s Kd m m
[5]
Si Kd est petit, alors 1 + s Kd ~ 1 et [5] devient:

S1 s
Ks S1
m m
[6]
Par la suite, la courbe devrait prendre lallure dune droite (voir figure 2) de pente 1/m et intercepter KS/m; et
S ~1/m.
Figure 1
Trois tempratures; cinq TRB
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Figure 2
Droite de rgression TRB S1 en fonction de S1 T = 5 C
Glossaire
concentration de leffluent.
courbe.
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Appendice 7
ESSAIS RALISS FAIBLES CONCENTRATIONS (G/L)
1. De nombreuses substances chimiques sont normalement prsentes dans le milieu aquatique, mme dans les eaux uses,
de trs faibles concentrations (g/l). de telles teneurs, elles ne servent probablement pas de substrats primaires pour
la croissance, et il est plus vraisemblable quelles subissent une dgradation en tant que substrats secondaires sans
intervenir dans la croissance, paralllement diverses substances chimiques carbones naturelles. Par consquent, les
dgradations de ces substances chimiques ne correspondront pas au modle dcrit lappendice 6. De nombreux
modles pourraient les reprsenter et, dans les conditions qui rgissent les systmes de traitement des eaux uses,
celles-ci peuvent probablement se reflter simultanment dans plusieurs modles. Il faudra entreprendre des recherches
bien plus pousses pour lucider ce problme.
2. En attendant, le mode opratoire expos dans le corps de texte (chapitre C.10-A) peut tre suivi, mais il ne sapplique
qu la biodgradabilit primaire, des concentrations suffisamment basses (< 100 g/l), et requiert une mthode
danalyse valide. Le pourcentage de biodgradation peut tre calcul (voir au paragraphe 54 de la prsente mthode
dessai), mais condition de tenir compte des processus non biologiques (adsorption, volatilit, etc.). Ltude conduite
par Nyholm et son quipe (1) (2) sur un cycle de quatre heures dans un systme lit de contact en est un exemple. Ils
ont oppos des pseudo-constantes de premier ordre pour cinq substances chimiques ajoutes des eaux uses
synthtiques raison de 5 100 g/l (sagissant de la biodgradabilit finale, des substances dessai marques au
14
C peuvent tre utilises). La description dun procd nentre pas dans le cadre de la prsente mthode dessai dans la
mesure o aucun ne fait encore lunanimit, bien quune mthode propose pour la norme ISO 14592 (3) contienne
des indications concernant lemploi de substances marques au 14C.
Essai de biodgradation en semi-continu laide de boues actives
3. Un essai plus simple en deux tapes a t prsent ultrieurement (4) (5) (6); la mthode en semi-continu laide de
boues actives (SCBA) est suivie par des essais cintiques court terme pratiqus sur des chantillons prlevs dans les
units SCBA. Les dbits de boues puises sont connus dans le systme SCBA (contrairement la mthode dessai
originale C.12), qui est aliment par des eaux uses synthtiques (formule de lOCDE modifie) ou par des eaux uses
domestiques. Les eaux uses synthtiques ont t modifies ( cause de la fluctuation du pH et de la mauvaise
dcantabilit des boues) par addition dun tampon phosphate, dun extrait de levure, de chlorure de fer (III) et de
sels doligo-lments, et leur DCO a t releve jusqu environ 750 mg/l moyennant une augmentation de la concen
tration de peptone et dextrait de viande. Les units tournaient en cycles de 24 heures: aration pendant 23 heures,
puisement des boues, dcantation, enlvement du surnageant (effluent), suivis par ladjonction des eaux uses synth
tiques et de la substance dessai jusqu 100 g/l (cest--dire peu prs la mme concentration que celle applique
dans lessai court terme). Une fois par semaine, on remplace 10 pour cent de la totalit des boues par des boues
fraches, afin de maintenir lquilibre de la population de micro-organismes.
4. Les concentrations de la substance dessai sont mesures au dbut et la fin de laration, et lessai est poursuivi jusqu
ce que llimination de la substance dessai devienne constante, ce qui peut prendre une semaine plusieurs mois.
Essai court terme
5. Pratiquer un essai court terme (8 heures, par exemple), afin de dterminer la pseudo-constante cintique de premier
ordre relative la dgradation de la substance dessai dans des boues actives ayant des origines et des volutions
diffrentes, mais connues. En particulier, prlever des chantillons de boues des racteurs SCBA la fin dune priode
daration lorsque la concentration de substrat organique est basse au cours dun essai dacclimatation (paragraphes 3,
4). On peut aussi prlever des boues dune unit SCBA tournant en parallle et non expose la substance dessai,
pour comparaison. Arer des mlanges de boue et de substance dessai incorpore deux ou plusieurs concentrations
comprises entre 1 et 50 g/l, sans ajouter deaux uses synthtiques ni dautre substrat organique. La substance dessai
restant en solution est mesure intervalles rguliers, par exemple toutes les heures, suivant la dgradabilit de la
substance, durant une priode qui nexcde pas 24 heures. Centrifuger les chantillons avant de les soumettre une
analyse approprie..
Calculs
6. Les donnes provenant des units SCBA servent calculer le pourcentage dlimination de la substance dessai
(paragraphe 54). Une constante de vitesse moyenne, K1 (tablie en fonction de la concentration des solides en
suspension), peut aussi tre calcule partir de la formule suivante:
K1 1=t ln
O:
t
Ce
1=SS1=g h
Ci
= dure daration (23 h)
Ce = concentration la fin de la priode daration (g/l)

Ci = concentration au dbut de laration (g/l)
SS = concentration des solides des boues actives (g/l)
7. Dans lessai court terme, tracer la courbe du logarithme de la concentration (%) restante en fonction du temps; la
pente de la partie initiale (10-50 pour cent de dgradation) de la courbe est quivalente K1, la pseudo-constante de
premier ordre. tablir la constante en fonction de la concentration des solides des boues en divisant la pente par la
concentration de ces solides. Le rsultat indiqu doit prciser les concentrations initiales de la substance dessai et des
solides en suspension, le temps de rtention des boues, la charge et la source des boues ainsi que, le cas chant, la
prexposition la substance dessai.
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Variabilit des rsultats

8. La variabilit et dautres aspects de la cintique de biodgradation ont t examins lors dune runion rcente du
SETAC (7). Quelles aient fait lobjet de publications ou quil sagisse de projets, ces tudes devraient bientt livrer une
image plus claire de la cintique qui gouverne le traitement des eaux uses dans les stations et permettre ainsi de mieux
interprter les donnes existantes et davancer des conceptions plus pertinentes concernant de futures mthodes dessai.
BIBLIOGRAPHIE:
(1) Nyholm N., Jacobsen B.N., Pedersen B.M., Poulsen O., Dambourg A. and Schultz B. (1992). Removal of micropol
lutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353.
(2) Jacobsen B.N., Nyholm N., Pedersen B.M., Poulsen O., and Ostfeldt P. (1993). Removal of organic micropollutants in
laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510.
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality Evaluation of the aerobic biodegradability of
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(4) Nyholm N., Ingerslev F., Berg U.T., Pedersen J.P. and Frimer-Larsen H. (1996). Estimation of kinetic rate constants for
biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and
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(5) Berg U.T. and Nyholm N. (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors
with low (g/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735.
(6) Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental
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(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port
Sunlight, UK. Eds. Hales, S.G. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6th September 1996. SETAC
Europe, Brussels.
C.10-B: Biofilms
INTRODUCTION
1.
Les essais de simulation sappliquent normalement aux substances chimiques qui ont donn un rsultat ngatif
lessai de biodgradabilit immdiate [chapitre C.4-A F de la prsente annexe (9)], mais un rsultat positif
lessai de biodgradabilit intrinsque. Exceptionnellement, les essais de simulation se pratiquent aussi en vue
dobtenir des informations supplmentaires sur une substance dessai, en particulier les substances chimiques
produites en grandes quantits, et lon recourt normalement lessai de traitement par boues actives (C.10-A).
Toutefois, dans certaines circonstances, il y a lieu de connatre certaines donnes particulires concernant la
raction dune substance chimique des mthodes de traitement des eaux uses comportant des biofilms, savoir
des lits ruissellement ou lits bactriens, des disques biologiques et des lits fluidiss. Diffrents dispositifs ont t
crs cette fin.
2.
Gerike et al. (1) ont utilis de grands lits bactriens en mode coupl lchelle pilote. Ces lits occupaient
beaucoup despace et exigeaient des volumes relativement levs deaux uses domestiques ou synthtiques.
Truesdale et al. (2) ont dcrit des lits plus petits (1,83 m 0,15 m de diamtre) aliments par des eaux uses
naturelles dpourvues de tensioactifs, mais qui demandaient encore des volumes assez importants. Il ne fallait pas
moins de 14 semaines pour quun biofilm arrive maturit et 4 8 semaines supplmentaires aprs la premire
introduction du tensioactif dessai pour lacclimatation.
3.
Baumann et al. (3) ont mis au point un lit beaucoup plus petit base de polyester velu pralablement plong
dans des boues actives, servant de substrat inerte pour le biofilm. La substance dessai constituait la seule source
de carbone et la biodgradabilit tait value daprs la mesure du carbone organique dissous (COD) dans les
eaux traiter et les effluents, et la quantit de CO2 dans les dgagements gazeux.
4.
Une approche assez diffrente a t tente par Gloyna et al. (4), qui ont invent le racteur tubulaire rotatif. Ils
ont cultiv un biofilm sur la surface interne dun tube rotatif, sur la superficie connue, en y faisant passer des
eaux traiter quils dversaient au sommet du tube lgrement inclin par rapport lhorizontale. Le racteur a
servi tudier la biodgradabilit des tensioactifs (5) ainsi que lpaisseur optimale du biofilm et la diffusion
travers le film (6). Ces auteurs ont perfectionn le racteur, notamment pour pouvoir dterminer le CO2 dans les
dgagements gazeux.
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L 81/174
5.
Le racteur tubulaire rotatif a t adopt par le Standing Committee of Analysts (Royaume-Uni) comme mthode
de rfrence pour valuer la biodgradabilit des substances chimiques (7) ainsi que les possibilits de traitement
des eaux uses et leur toxicit (8). La mthode dcrite ici est simple, concise et reproductible et, de surcrot, ne
ncessite que des volumes relativement petits de milieu organique.
PRINCIPE DE LESSAI
6.
Des eaux uses synthtiques ou domestiques et la substance dessai sont appliques, sparment ou incorpores,
sur la surface interne dun tube inclin en rotation lente. Une couche de micro-organismes, semblables ceux
prsents dans le milieu du biofiltre, se dveloppe sur la surface interne. Le fonctionnement du racteur est rgul
de telle sorte quil entrane une limination adquate de la matire organique et, si ncessaire, loxydation de
lammonium.
7.
Les effluents du tube sont collects et dcants et/ou filtrs avant lanalyse du carbone organique dissous (COD)
et/ou de la substance dessai par une mthode spcifique. Les units tmoins, qui ne reoivent pas la substance
dessai, tournent en parallle dans les mmes conditions, des fins de comparaison. La diffrence entre les
concentrations de COD dans les effluents de lunit dessai et de lunit tmoin est impute par hypothse la
substance dessai et ses mtabolites organiques. On compare cette diffrence la concentration de la substance
dessai ajoute (en termes de COD) pour calculer llimination de la substance dessai.
8.
Il est normalement possible de distinguer la biodgradation de la bioadsorption par un examen attentif de la

courbe dlimination en fonction du temps. Lobservation peut gnralement tre confirme par un essai de
biodgradabilit immdiate (consommation doxygne ou production de dioxyde de carbone) ralis laide dun
inoculum acclimat prlev la fin de lessai dans les racteurs qui reoivent la substance dessai.
INFORMATION SUR LA SUBSTANCE DESSAI
9.
La puret, la solubilit dans leau, la volatilit et les caractristiques dadsorption de la substance dessai doivent
tre connues pour que linterprtation des rsultats soit correcte.
10. Normalement, les substances chimiques volatiles et peu solubles ne peuvent tre mises lessai sans prcautions
particulires (voir appendice 5 du chapitre C.10-A). Il faudrait connatre galement la formule chimique dve
loppe ou, au moins, empirique, pour calculer les valeurs thoriques et/ou vrifier les valeurs mesures de
paramtres tels que la demande thorique en oxygne (DthO) et le carbone organique dissous (COD).
11. Des donnes sur la toxicit de la substance dessai lgard des micro-organismes (voir appendice 4 du chapitre
C.10-A) peuvent aussi tre utiles la slection des concentrations dessai appropries et essentielles pour linter
prtation correcte de faibles valeurs de biodgradation.
NIVEAUX DE SEUIL
12. lorigine, la mise sur le march des tensioactifs tait subordonne un taux de biodgradation primaire
suprieur ou gal 80 pour cent. Faute datteindre un taux de 80 pour cent, on peut mener cet essai de
simulation (de confirmation) lissue duquel le tensioactif ne sera mis sur le march que sil est limin
plus de 90 pour cent. En gnral, avec les produits chimiques, la question dun rsultat dessai positif ou
ngatif nentre pas en jeu, et le pourcentage dlimination obtenu peut servir calculer en gros la concentration
probable dans lenvironnement introduire dans lvaluation des risques dus aux substances chimiques. Le
pourcentage dlimination du COD atteint dans plusieurs tudes sur des substances chimiques pures tait sup
rieur 90 pour cent pour plus des trois quarts des produits chimiques prsentant un degr de biodgradabilit
significatif et suprieur 80 pour cent pour plus de 90 pour cent dentre eux.
13. Pour sassurer que le mode opratoire est correctement suivi, il est quelquefois utile de tester des substances
chimiques dont le comportement est connu. Il sagit notamment de lacide adipique, du 2-phnylphenol, du 1naphthol, de lacide diphnique, de lacide 1-naphthoque.
REPRODUCTIBILIT DES RSULTATS DESSAI
14. Lcart-type obtenu par un laboratoire britannique slevait 3,5 % au moment des essais et 5 % entre les essais
(7).
Appareils
Racteurs tabulaires rotatifs
15. Lappareil (voir figures 1 et 2 de lappendice 8) consiste en une batterie de tubes en acrylique de 30,5 cm de long
et 5 cm de diamtre interne, supports par des roulettes entoures de caoutchouc, fixes sur un cadre mtallique.
Chaque tube saccroche aux roulettes par un bourrelet extrieur de 0,5 cm dpaisseur environ, et
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possde un bourrelet interne de la mme paisseur lextrmit suprieure (dalimentation) pour retenir le liquide;
la surface interne a t rendue rugueuse par un tampon de laine poils pais. Les tubes sont inclins un angle
denviron un degr par rapport lhorizontale pour que le milieu dessai appliqu sur un tube propre reste en
contact avec celui-ci le temps ncessaire. Les roulettes revtues de caoutchouc sont actionnes par un moteur lent
vitesse variable. La temprature des tubes est rgie par leur installation dans un local temprature constante.
16. En enfermant chaque racteur tubulaire dans un tube lgrement plus grand et ferm par un capuchon en veillant
ce que les connexions soient tanches aux gaz, on peut collecter les dgagements de CO2 dans une solution
alcaline en vue de mesures ultrieures (6).
17. Chaque tube est aliment en milieu organique et en substance dessai, le cas chant, par un rservoir de 20 litres
(A) (voir figure 2) pour une priode de 24 heures. Si ncessaire, la solution de la substance dessai peut tre dose
sparment. Il existe un orifice de sortie situ prs du fond de chaque rservoir connect par un tuyau fait dune
matire approprie, par exemple du caoutchouc de silicone, via une pompe pristaltique (B) un tube en verre ou
en acrylique qui senfonce sur 2 4 cm lintrieur de lextrmit suprieure (dalimentation) du tube inclin (C).
Leffluent sgoutte ainsi de lextrmit infrieure du tube inclin dans un autre rcipient de stockage (D). Leffluent
est dcant ou filtr avant analyse.
Appareil de filtration centrifugeuse
18. Les chantillons seront filtrs travers une membrane possdant une porosit adquate (diamtre douverture
nominale de 0,45 m) qui adsorbe les composs organiques solubles et libre le moins possible de carbone
organique. Si les lits utiliss librent du carbone organique, il faut les laver soigneusement leau chaude afin
dvacuer le carbone organique lixiviable. Une centrifugeuse tournant 40 000 m/s2 peut remplacer lappareil de
filtration.
19. Matriel danalyse permettant de dterminer:
le rapport carbone organique dissous (COD)/carbone organique total (COT), ou la demande chimique en
oxygne (DCO),
la substance chimique donne (CLHP, CG, etc.) sil y a lieu,
le pH, la temprature, lacidit, lalcalinit,
lammonium, les nitrites et les nitrates, si les essais sont raliss dans des conditions nitrifiantes.
Eau
20. Eau du robinet renfermant moins de 3 mg/l de COD.
21. Eau distille ou dsionise contenant moins de 2 mg/l de COD.
Milieu organique
22. Les eaux uses synthtiques, les eaux uses domestiques ou un mlange des deux sont accepts comme milieu
organique. Comme il a t dmontr que les eaux uses domestiques employes seules augmentaient souvent le
pourcentage dlimination du COD (dans les units boues actives) et entranaient mme la biodgradation de
certaines substances chimiques non biodgrades par les eaux uses synthtiques formules selon lOCDE, on
prconise lutilisation deaux uses domestiques. On mesure la concentration du COD ou de la DCO dans chaque
nouveau lot de milieu organique. Lacidit ou lalcalinit du milieu organique doivent tre connues. Il peut tre
ncessaire de tamponner le milieu organique par un compos appropri (hydrognocarbonate de sodium ou
hydrognophosphate de potassium) sil est faiblement acide ou alcalin, pour maintenir le pH environ 7,5 0,5
dans le racteur durant lessai. La quantit de tampon ajouter et le moment de cette addition seront dcids au
cas par cas.
23. Dans chaque litre deau du robinet, dissoudre 160 mg de peptone, 110 mg dextrait de viande, 30 mg dure,
28 mg dhydrognophosphate de potassium anhydre (K2HPO4), 7 mg de chlorure de sodium (NaCl), 4 mg de
chlorure de calcium dihydrat (CaCl2.2H2O) et 2 mg de sulfate de magnsium heptahydrat (MgSO4.7H20). Cette
eau use synthtique formule selon lOCDE offre un exemple o la concentration moyenne de COD dans les
eaux traiter atteint quelque 100 mg/l. On utilisera en alternance dautres compositions donnant peu prs la
mme concentration de COD, plus proches des eaux uses domestiques. Ces eaux uses synthtiques peuvent tre
confectionnes base deau distille, sous une forme concentre, et stockes environ 1 C pendant une semaine
au maximum. Selon les besoins, diluer avec de leau du robinet (ce milieu nest pas satisfaisant, notamment parce
quil prsente une concentration en azote trs leve et une teneur en carbone relativement faible, mais rien de
mieux na t suggr, en dehors dun supplment de tampon phosphate et de peptone).
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24. Utiliser des eaux uses qui viennent dtre dcantes, recueillies quotidiennement dans une station dpuration qui
reoit principalement des eaux uses domestiques. Elles doivent tre prleves au niveau du dversoir de la cuve
de sdimentation primaire ou dans les eaux traiter de la station de traitement par boues actives et renfermer
trs peu de grosses particules. Les eaux uses peuvent tre utilises aprs plusieurs jours de stockage environ
4 C, sil est prouv que le COD (ou la DCO) na pas diminu de manire significative (cest--dire de moins de
20 pour cent) durant le stockage. Afin de limiter la perturbation du systme, il conviendrait dajuster le COD (ou
la DCO) de chaque nouveau lot avant son utilisation une valeur constante adquate, par exemple en le diluant
avec de leau du robinet.
Lubrifiant
25. Les roulettes de la pompe pristaltique peuvent tre lubrifies avec du glycrol ou de lhuile dolive: les deux
conviennent aux tubes en caoutchouc de silicone.
26. Pour les substances chimiques prsentant une solubilit convenable, prparer des solutions mres aux concen
trations appropries (par exemple, 1 5 g/l) dans de leau dsionise, ou dans la fraction minrale de leau use
synthtique. En ce qui concerne les substances chimiques insolubles, se reporter lappendice 5 du chapitre C.10A. La prsente mthode nest pas applicable aux substances chimiques volatiles sans modification pralable des
racteurs tubulaires (paragraphe 16). Dterminer le COD et le carbone organique total (COT) de la solution mre
et rpter les mesures chaque nouveau lot. Si la diffrence entre le COD et le COT excde 20 pour cent, il faut
vrifier lhydrosolubilit de la substance dessai. Comparer le COD ou la concentration de la substance dessai
mesure par une analyse spcifique dans la solution mre la valeur nominale, pour sassurer que la rcupration
est suffisante (elle dpasse normalement 90 pour cent). Vrifier, en particulier pour les dispersions, si le COD peut
tre utilis comme paramtre danalyse ou si seule une technique danalyse spcifique de la substance dessai est
praticable. Les dispersions imposent la centrifugation des chantillons. Pour chaque nouveau lot, mesurer le COD,
la DCO, ou la substance dessai par une analyse spcifique.
27. Dterminer le pH de la solution mre. Les valeurs extrmes indiquent que laddition de la substance est suscep
tible dinfluencer le pH des boues actives dans le systme dessai. Dans ce cas, il faut neutraliser la solution mre
pH 7 0,5 avec de faibles quantits dun acide ou dune base inorganiques, tout en vitant la prcipitation de la
substance dessai.
MODE OPRATOIRE
Prparation du milieu organique doser
28. Nettoyer fond les rcipients destins recevoir les eaux traiter et les effluents ainsi que les tuyaux reliant ces
deux rcipients, afin de prvenir toute prolifration de micro-organismes, au dbut de lessai et tout au long de
celui-ci.
29. Utiliser des eaux uses synthtiques (paragraphe 23) prpares le jour mme, en diluant dans les proportions
requises les solides ou la solution mre concentre avec de leau du robinet. La quantit ncessaire est mesure
dans un cylindre et verse dans un rcipient propre destin recevoir les eaux traiter. Sil y a lieu, ajouter la
quantit voulue de solution mre de la substance dessai ou de substance de rfrence aux eaux uses synthtiques
avant la dilution. Si cela est plus appropri, ou ncessaire afin dviter des pertes de substance dessai, prparer
part une solution dilue de la substance dessai dans un autre rcipient et rpartir cette dernire dans les tubes
inclins au moyen dune autre pompe doseuse.
30. En alternance (et de prfrence), utiliser des eaux uses domestiques dcantes (paragraphe 24) rcoltes le jour
mme si possible.
Fonctionnement des racteurs tubulaires rotatifs
31. Lvaluation de la substance dessai demande deux racteurs tubulaires identiques assembls dans un local
temprature constante, normalement 22 2 C.
32. Ajuster les pompes pristaltiques de faon rpartir 250 25 ml/h de milieu organique (sans substance dessai)
dans les tubes inclins, qui tournent 18 2 tr/min. Lubrifier (paragraphe 25) les tuyaux de la pompe au dbut
de lessai et rgulirement au cours de celui-ci afin de lui assurer un bon fonctionnement et de prolonger la vie
des tuyaux.
33. Rgler langle dinclinaison des tubes par rapport lhorizontale de faon produire un temps de sjour de leau
dalimentation de 125 12,5 secondes dans un tube propre. Estimer le temps de rtention en ajoutant un
marqueur non biologique (par exemple: NaCl, un colorant inerte) leau dalimentation: le temps requis pour
atteindre la concentration maximale dans leffluent est cens tre le temps de rtention moyen (quand le
dveloppement du film est son maximum, le temps de rtention peut saccrotre jusqu environ 30 minutes).
34. On a constat que ces dbits, vitesses et temps donnaient des pourcentages dlimination adquats (suprieurs
80 pour cent) de COD (ou DCO) et engendraient des effluents nitrifis. Le dbit doit tre modifi si llimination
est insuffisante ou sil y a lieu de simuler le fonctionnement dune station dpuration donne. Dans ce cas, ajuster
le dbit de dose du milieu organique jusqu ce que le fonctionnement du racteur saligne sur celui de la station
dpuration.
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Inoculation
35. Linoculation par exposition lair peut suffire dclencher la croissance des micro-organismes lorsquon utilise
des eaux uses synthtiques, sinon on ajoutera 1 ml/l deaux uses dcantes lalimentation pendant trois jours.
Mesures
36. Vrifier intervalles rguliers que les dbits de dose et les vitesses de rotation restent dans les limites requises.
Mesurer aussi le pH de leffluent, en particulier sil devrait y avoir une nitrification.
37. La mthode, la rpartition et la frquence de lchantillonnage sont choisies en fonction de la finalit de lessai.
Prlever au hasard des chantillons deaux traiter et deffluents, par exemple, ou rcolter des chantillons sur une
priode plus longue, comprise entre trois et six heures, par exemple. Durant la premire priode, savoir en
labsence de substance dessai, prlever des chantillons deux fois par semaine. Les chantillons sont filtrs
travers des membranes ou centrifugs quelque 40 000 m/s2 pendant environ 15 minutes (paragraphe 18). Il
peut tre ncessaire de dcanter et/ou de filtrer grossirement les chantillons avant leur filtration travers la
membrane. Dterminer le COD (ou la DCO) au moins deux fois et, selon les besoins, la DBO, lammonium, les
nitrites et les nitrates.
38. Toutes les analyses doivent tre excutes le plus vite possible aprs la collecte et la prparation des chantillons.
Au cas o les analyses doivent tre diffres, conserver les chantillons environ 4 C lobscurit dans des
bouteilles pleines et bouches hermtiquement. Sil y a lieu de stocker les chantillons pendant plus de 48 heures,
les conserver par conglation, acidification ou adjonction dune substance toxique approprie [par exemple
20 ml/l dune solution de chlorure de mercure (II) 10 g/l]. Sassurer que la technique de conservation ninfluence
pas les rsultats de lanalyse.
Priode de mise en route
39. Durant cette priode, le biofilm superficiel se dveloppe jusqu atteindre une paisseur optimale, ce qui prend
normalement environ deux semaines et ne doit pas en dpasser six. Llimination (paragraphe 44) du COD (ou de
la DCO) saccrot et atteint un plateau. Lorsque le plateau prsente la mme valeur dans les deux tubes,
slectionner le tube qui servira de tmoin pour le restant de lessai, au cours duquel leur fonctionnement
devra conserver les mmes caractristiques..
Introduction de la substance dessai
40. ce stade, ajouter la substance dessai dans lautre racteur la concentration requise, ordinairement 10 20 mg
C/l. Le tmoin continue de ne recevoir que le milieu organique.
Priode dacclimatation
41. Poursuivre les analyses bihebdomadaires du COD (ou de la DCO) et, sil faut valuer la biodgradabilit primaire,
mesurer aussi la concentration de la substance dessai par une analyse spcifique. Appliquer une priode dac
climatation dune six semaines (ou davantage dans des conditions spciales) aprs la premire adjonction de la
substance dessai. Lorsque le pourcentage dlimination (paragraphes 43-45) atteint son maximum, dterminer 12
15 valeurs valables au cours de la phase plateau sur environ trois semaines, afin dvaluer le pourcentage
dlimination moyen. Lessai est considr comme termin si un degr dlimination suffisamment lev a t
obtenu. Lessai ne doit normalement pas se prolonger au-del de 12 semaines aprs la premire introduction de la
substance dessai.
Dtachement du film
42. Le brusque dtachement de grandes quantits de film excdentaire des tubes (sloughing) se produit assez
rgulirement. On veillera ce que ce processus naltre pas la comparabilit des rsultats, en laissant les
essais couvrir au moins deux cycles complets de croissance et de dtachement.
RSULTATS ET RAPPORT
43. Calculer le pourcentage dlimination de la substance dessai en termes de COD (ou de DCO) pour chaque
valuation programme dans le temps laide de la formule suivante:
Dt = 100 [Cs - (E - Eo)]/Cs %

o:
Dt = pourcentage dlimination du COD (ou de la DCO) linstant t;
Cs = concentration de COD (ou DCO) dans les eaux traiter due la substance dessai, estime de prfrence
daprs la concentration dans la solution mre et le volume de cette solution ajout (mg/l);
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= COD (ou DCO) mesurs dans les effluents dessai linstant t (mg/l);
Eo = COD (ou DCO) mesurs dans les effluents tmoins linstant t (mg/l).
Rpter le calcul pour la substance de rfrence, le cas chant.
Rsultats du racteur tmoin
44. Le degr dlimination du COD ou de la DCO (DB) du milieu organique dans les racteurs tmoins est utile pour
aluer lactivit de biodgradation du biofilm durant lessai. Calculer le pourcentage dlimination selon lquation
suivante:
DB = 100 (1 - Eo/Cm) %
o:
Cm = COD (ou DCO) du milieu organique dans les eaux traiter tmoins (mg/l).
45. Calculer llimination (DST) de la substance dessai, si elle a t mesure par une mthode danalyse spcifique,
chaque instant dvaluation partir de lquation suivante:
DST = 100 (1 - Se/Si) %

o:
Si
= concentration mesure ou, de prfrence, estime de la substance dessai dans les eaux brutes dessai (mg/l)
Se = concentration mesure de la substance dessai dans les effluents dessai linstant t (mg/l)
Si la mthode danalyse donne une valeur positive dans les eaux uses non amliores quivalente S c mg/l,
calculer le pourcentage dlimination (DSC) selon la formule suivante:
DSC = 100 (Si - Se + Sc)/(Si + Sc) %
46. Porter sur un graphique les pourcentages dlimination Dt et DST (ou DSC), sils sont disponibles, en fonction du
temps (voir appendice 2 du chapitre C.10-A). Prendre la moyenne (arrondie au nombre entier le plus proche) et
lcart-type des 12 15 valeurs de DT (et de DST, le cas chant) obtenue au cours de la phase plateau comme
pourcentage dlimination de la substance dessai. Lallure de la courbe dlimination permet de tirer certaines
conclusions sur les processus dlimination.
Adsorption
47. Si on observe une limination substantielle de la substance dessai en termes de COD au dbut de lessai, cest
probablement cause de ladsorption de cette substance sur le biofilm. Il devrait tre possible de prouver ce
phnomne en mesurant la substance dessai adsorbe sur les solides qui se dtachent du film. Il est rare que
llimination du COD de substances adsorbables demeure leve tout au long de lessai; le degr dlimination est
normalement lev au dbut, puis dcline progressivement jusqu une valeur dquilibre. Si, toutefois, la
substance dessai adsorbe est de nature acclimater la population de micro-organismes, llimination de la
substance dessai en termes de COD augmenterait pour atteindre une valeur de plateau leve.
Phase de latence
48. Beaucoup de substances dessai, comme cela se produit dans les essais de slection statiques, traversent une phase
de latence avant que la biodgradation nopre plein rgime. Durant la phase de latence, les bactries responsa
bles de la dgradation sacclimatent ou sadaptent et nliminent presque pas la substance dessai; ensuite elles
commencent crotre. Aprs lachvement de cette phase, on considre de manire arbitraire que la phase de
dgradation dbute lorsque 10 pour cent environ de la quantit initiale de la substance dessai est limine (aprs
avoir laiss ladsorption se produire, le cas chant). La phase de latence est souvent trs variable et peu
reproductible.
Phase plateau
49. Le plateau de la courbe dlimination dun essai conduit en continu est dfini comme la phase au cours de
laquelle la dgradation est maximale. La phase plateau doit durer au moins trois semaines et tre dtermine
grosso modo par 12 15 valeurs mesures valables.
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Degr dlimination moyen de la substance dessai

50. Calculer la moyenne des valeurs dlimination Dt (et DST le cas chant) de la substance dessai durant la phase
plateau. Arrondie au nombre entier le plus proche (1 pour cent), elle reprsente le degr dlimination de la
substance dessai. On recommande galement de calculer lintervalle de confiance 95 pour cent de la valeur
moyenne. Calculer de la mme manire le degr moyen (DB) dlimination du milieu organique dans le rcipient
tmoin.
Indication de la biodgradation
51. Si la substance dessai nest pas adsorbe de faon significative sur le biofilm et que la courbe dlimination
prsente le profil typique dune courbe de biodgradation avec phase de latence, dgradation et plateau (para
graphes 48, 49), llimination mesure est avec certitude attribuable la biodgradation. Si llimination est leve
au dbut, lessai de simulation ne permet pas de faire la distinction entre les processus dlimination biologiques
et non biologiques. Dans ces cas-l, comme dans dautres o la biodgradation suscite des doutes (par exemple si
on observe une sparation), analyser les substances dessai adsorbes sur des chantillons du film ou effectuer des
essais de biodgradation statiques (de slection) supplmentaires fonds sur des paramtres qui attestent claire
ment des processus biologiques. Il sagit dessais reposant sur la consommation doxygne (chapitre C.4 de la
prsente annexe, D, E et F) (9) ou sur la mesure de la production de dioxyde de carbone (chapitre C.4-C de la
prsente annexe ou mthode de lespace de tte ou de lespace tte) (10); il convient dutiliser comme inoculum
un biofilm prexpos issu du bioracteur appropri.
52. Si llimination du COD et de la substance proprement dite ont t mesures, des diffrences significatives entre
les pourcentages observs (le premier tant infrieur au second) indiquent que les effluents renferment des
produits organiques intermdiaires susceptibles dtre plus difficiles dgrader; ceux-ci doivent tre examins.
Validit des rsultats de lessai
53. Considrer lessai comme valable si le degr dlimination (DB) du COD ou de la DCO dans les units tmoins est
suprieur 80 pour cent aprs deux semaines de fonctionnement et quaucun phnomne inhabituel na t
observ.
54. Si une substance de rfrence facilement biodgradable a t mise lessai, le degr de biodgradation doit tre
suprieur 90 pour cent et la diffrence entre des valeurs mesures en parallle ne doit pas excder 5 pour cent.
Faute de satisfaire ces deux critres, rexaminer les mthodes exprimentales et/ou prlever des eaux uses
domestiques une autre source.
55. De mme, les diffrences de valeurs de biodgradation entre deux units identiques (le cas chant) traitant une
substance dessai ne doivent pas scarter de plus de cinq pour cent. Si ce critre nest pas rempli, mais que
llimination est leve, poursuivre lanalyse pendant trois semaines supplmentaires. Si llimination est faible,
tudier les effets inhibiteurs de la substance dessai, sils ne sont pas connus, et recommencer lessai une
concentration plus basse de la substance dessai, si cest possible.
Rapport dessai
56. Le rapport dessai doit livrer les informations suivantes:
Substance dessai:
nature chimique,
tat physique et, sil y a lieu, proprits physico-chimiques.
Conditions dessai:
toute modification du systme dessai, notamment si des substances volatiles ou insolubles ont t testes,
type de milieu organique,
proportion et nature des dchets industriels dans les eaux uses, si cette information est pertinente et connue,
mthode dinoculation,
solution mre de la substance dessai teneurs en COD (carbone organique dissous) et COT (carbone
organique total); mode de prparation, dans le cas dune suspension; concentration(s) dessai utilise(s),
justification des concentrations de COD qui sortiraient de lintervalle 10-20 mg/l; mthode daddition; date
de la premire adjonction; toute variation de concentration,
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temps de rtention hydraulique moyen (sans croissance); vitesse de rotation du tube, angle dinclinaison
approximatif, si possible,
dtails du dtachement du biofilm; moment et intensit,
temprature dessai et gamme de tempratures,
techniques danalyse employes.
Rsultats de lessai:
toutes les valeurs mesures: COD, DCO, analyses spcifiques, pH, temprature, composs azots, le cas
chant,
toutes les valeurs calcules de Dt (ou Dtc), DB, Ds prsentes sous forme de tableaux et de courbes dlimi
nation,
informations sur les phases de latence et de plateau, dure de lessai, degr dlimination de la substance
dessai, de la substance de rfrence (si teste) et du milieu organique (dans lunit tmoin), donnes statis
tiques, conclusions sur la biodgradabilit et validit de lessai,
examen des rsultats.
BIBLIOGRAPHIE:
(1) Gerike P., Fischer W., Holtmann W. (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared
with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758.
(2) Truesdale G.A., Jones K., Vandyke K.G. (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes:
Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.
(3) Baumann U., Kuhn G. and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewsserkologisch
relevanter Daten, UWSF Z. Umweltchem. kotox. 10: 214-220.
(4) Gloyna E.F., Comstock R.F., Renn C.E. (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste
24: 1355-1357.
(5) Kumke G.W., Renn C.E. (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92-94.
(6) Tomlinson T.G., Snaddon D.H.M. (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air
Wat. Pollut. 10: 865-881.
(7) Her Majestys Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assess
ment of biodegradability, 1981, London.
(8) Her Majestys Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods
for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment
processes, 1982, London.
(9) Chapitre C.4 de la prsente annexe, Dtermination de la biodgradabilit facile, A-F.
(10) ISO 14593 (1998). Qualit de leau valuation en milieu aqueux de la biodgradabilit arobie ultime des
composs organiques. Mthode par analyse du carbone inorganique dans des rcipients hermtiquement clos
(Essai au CO2 dans lespace de tte).
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Appendice 8
Figure 1
Tubes rotatifs
Glossaire
vue en plan.
vue A/B.
roues menes.
roues folles.
moteur dentranement.
rducteur.
bride interne.
dispositif de basculement.
couple conique dentranement.
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Figure 2
Schma de droulement
A: rservoir.
B: pompe pristaltique.
C: tube rotatif.
D: rcipient recueillant les effluents.
DFINITIONS:
Substances chimiques: il est noter que le terme produit chimique utilis dans les accords de la CNUED et dans les
documents ultrieurs comprend les substances, les produits, les mlanges, les prparations et tout autre terme utilis dans
les systmes actuels pour dcrire les produits chimiques viss.
10) les chapitres C.27, C.28, C.29 et C.30 sont ajouts:
C.27 ESSAI DE TOXICIT SUR LES CHIRONOMES DANS UN SYSTME EAU-SDIMENT DOP
INTRODUCTION
1.
chimiques. Cette mthode dessai est conue pour valuer les effets dune exposition prolonge des substances
chimiques sur des larves de Chironomus sp., un diptre vivant dans les sdiments deau douce. Elle sappuie sur
des protocoles dessais de toxicit sur Chironomus riparius et Chironomus tentans, mis au point en Europe (1) (2) (3)
et en Amrique du Nord (4) (5) (6) (7) (8), et soumis des essais circulaires (1) (6) (9). Dautres espces de
chironomes bien documentes peuvent aussi tre employes, par exemple Chironomus yoshimatsui (10) (11).
2.
Le scnario dexposition appliqu dans cette mthode dessai consiste introduire la substance dessai dans le
sdiment. La slection du mode dexposition dpend de la finalit de lessai. Le dopage du sdiment vise simuler
laccumulation de produits chimiques persistants dans le sdiment. Ce chargement seffectue dans un systme
exprimental eau-sdiment.
3.
En gnral, les substances tester sur des organismes vivant dans les sdiments subsistent longtemps dans ce
compartiment. Ces organismes peuvent tre exposs par diverses voies. Limportance relative de chaque voie
dexposition et le temps pris par chacune dentre elles pour contribuer leffet toxique global dpendent des
proprits physico-chimiques de chaque substance chimique. Dans le cas des substances fortement adsorbantes
(par exemple avec un log Koe> 5) ou des substances lies de faon covalente au sdiment, lingestion daliments
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contamins peut constituer une voie dexposition non ngligeable. Afin de ne pas sous-estimer la toxicit des
substances fortement lipophiles, on envisagera dajouter de la nourriture au sdiment avant lapplication de la
substance dessai. La prsente mthode dessai est axe sur lexposition long terme, de faon couvrir toutes les
voies dexposition potentielles. Lessai dure de 20 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et de 28 65 jours
pour C. tentans. Si lon a besoin de donnes court terme pour un motif prcis, par exemple pour tudier les
effets dune substance chimique instable, des rcipients supplmentaires, ajouts au dispositif exprimental,
peuvent tre retirs aprs 10 jours dessai.
4.
Les effets observs sont le nombre total dadultes mergs et temps coul jusqu lmergence. Si lon a besoin
de donnes court terme, il est recommand de ne mesurer la survie et la croissance des larves quaprs
10 jours, en ajoutant le nombre ncessaire de rcipients supplmentaires.
5.
Lutilisation dun sdiment reconstitu est recommande en raison de ses avantages par rapport aux sdiments
naturels:
la variabilit exprimentale est rduite parce que le sdiment reconstitu forme une matrice normalise
reproductible; en outre, il nest plus ncessaire de trouver des sources de sdiments non contamins et non
pollus,
les essais peuvent tre effectus nimporte quel moment de lanne, la variabilit saisonnire nintervenant
plus, et il nest pas ncessaire de traiter pralablement le sdiment afin dliminer la faune indigne; lutili
sation de sdiments reconstitus diminue aussi le cot associ la collecte sur le terrain dune quantit
suffisante de sdiments pour les essais systmatiques,
les sdiments reconstitus permettent de comparer la toxicit des substances et de les classer en consquence.
6.
Lappendice 1 contient les dfinitions employes dans la prsente mthode dessai.

PRINCIPE DE LESSAI
7.
Des chironomes au premier stade larvaire sont exposs une gamme de concentrations de la substance dessai
dans un systme sdiment-eau. Une fois la substance dessai incorpore au sdiment, des larves au premier stade
sont introduites dans des bchers o les concentrations deau et de sdiment ont t stabilises. Lmergence des
chironomes et leur vitesse de dveloppement sont mesures la fin de lessai. La survie des larves et leur poids
peuvent aussi tre mesurs aprs 10 jours si ncessaire (en ajoutant le nombre dexpriences identiques requis).
Ces donnes sont analyses, soit laide dun modle de rgression pour estimer la concentration qui entranerait
une rduction de x % de lmergence ou de la survie des larves ou de leur croissance (par exemple CE15, CE50,
etc.), soit par la vrification dune hypothse statistique afin de dterminer une CSEO/CMEO. Cette dernire
ncessite une comparaison entre les valeurs efficaces et les valeurs des tmoins laide de tests statistiques.
8.
Il faudrait connatre lhydrosolubilit de la substance dessai, sa pression de vapeur, son coefficient de partage
mesur ou calcul dans le sdiment et sa stabilit dans leau et le sdiment. Il convient de disposer dune
mthode danalyse fiable pour quantifier la substance dessai dans leau sus-jacente, dans leau des pores et
dans le sdiment, et pour laquelle la prcision et le seuil de dtection sont connus. Il est galement utile de
connatre la formule structurale et la puret de la substance dessai ainsi que son devenir chimique (par exemple
sa dissipation, sa dgradation abiotique et biotique, etc.). Des indications complmentaires pour tester les
substances se prtant difficilement lessai en raison de leurs proprits physico-chimiques sont fournies la
rfrence (12).
9.
Des substances de rfrence pourront tre testes rgulirement afin de dmontrer, la fiabilit du protocole et des
conditions de lessai. Voici quelques exemples de toxiques de rfrence ayant fait leurs preuves dans des essais
circulaires et des tudes de validation: lindane, trifluraline, pentachlorophnol, chlorure de cadmium et chlorure
de potassium (1) (2) (5) (6) (13).
VALIDIT DE LESSAI
10. Pour que lessai soit valide, les conditions suivantes doivent tre remplies:
lmergence chez les tmoins doit atteindre au moins 70 % la fin de lessai (1) (6),
sagissant de C. riparius et C. yoshimatsui, lmergence au stade adulte dans les rcipients tmoins doit avoir
lieu entre 12 et 23 jours aprs leur introduction dans les rcipients exprimentaux; C. tentans ncessite une
priode de 20 65 jours,
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la fin de lessai, le pH et la concentration doxygne dissous seront mesurs dans chaque rcipient. La
concentration doxygne devrait atteindre au moins 60 % de la valeur de saturation en air (VSA) la
temprature applique et le pH de leau sus-jacente devrait tre compris entre 6 et 9 dans tous les rcipients
exprimentaux,
la temprature de leau ne devrait pas varier de plus de 1,0 C et pourrait tre contrle grce une
chambre isotherme, auquel cas la temprature de la chambre devra tre confirme intervalles appropris.
Rcipients exprimentaux
11. Lessai se droule dans des bchers en verre de 600 ml, mesurant 8 cm de diamtre. Dautres rcipients peuvent
tre utiliss condition quils permettent de garantir une profondeur adquate deau et de sdiment. Le sdiment
doit offrir une superficie de 2 3 cm2 par larve. Le quotient de la profondeur de la couche de sdiment par la
profondeur de la couche deau sus-jacente doit tre gal 1/4. Les rcipients et les autres appareils qui entreront
en contact avec le systme dessai doivent tre composs uniquement de verre ou dun autre matriau chimi
quement inerte (par exemple du Tflon).
Slection des espces
12. Chironomus riparius est lespce qui convient le mieux. Chironomus tentans peut aussi tre utilis, mais il est plus
difficile manipuler et ncessite une priode dessai plus longue. Chironomus yoshimatsui convient galement. La
mthode de culture de Chironomus riparius est dtaille lappendice 2. Dautres documents dcrivent les
conditions de culture des autres espces: Chironomus tentans (4) et Chironomus yoshimatsui (11). Lidentification
de lespce est confirmer avant lessai, mais nest pas requise avant chaque essai si les organismes proviennent
dun levage interne.
Sdiment
13. Il est prfrable demployer un sdiment reconstitu (galement dnomm sdiment artificiel ou synthtique).
Nanmoins, si lon opte pour un sdiment naturel, il faudrait le caractriser, au moins quant au pH et la teneur
en carbone organique, (la dtermination dautres paramtres, tels que le rapport C/N et la granulomtrie est aussi
recommande) et sassurer quil nest pas contamin et nabrite pas dautres organismes qui pourraient entrer en
comptition avec les chironomes ou les consommer. Avant dutiliser un sdiment naturel dans un essai de
toxicit sur les chironomes, il est galement recommand de le maintenir durant sept jours dans des conditions
identiques celles qui seront appliques durant lessai (conditionnement). Le sdiment reconstitu dcrit cidessous, bas sur le sol artificiel utilis dans la mthode dessai C.8, est recommand (14) (1) (15) (16):
a) 4-5 % (poids sec) de tourbe, avec un pH aussi proche que possible de 5,5 6,0; il est important dutiliser une
tourbe sous forme de poudre, finement broye (dimension des particules 1 mm) et sche uniquement
lair;
b) 20 % (poids sec) dargile kaolinique (teneur en kaolinite de prfrence suprieure 30 %);
c) 75-76 % (poids sec) de sable quartzique (compos en majorit de sable fin, plus de 50 % des particules
mesurant entre 50 et 200 m);
d) ajouter de leau dsionise jusqu ce que la teneur en humidit du mlange final atteigne 30 50 %;
e) ajouter du carbonate de calcium de qualit chimiquement pure (CaCO3) pour ajuster le pH du mlange final
composant le sdiment 7,0 0,5. Il convient dobtenir 2 % ( 0,5 %) de carbone organique dans le mlange
final en y ajoutant les quantits appropries de tourbe et de sable, comme indiqu en a) et en c).
14. Les sources de tourbe, de kaolin et de sable doivent tre connues. On vrifiera que les composants du sdiment
ne sont pas contamins par des substances chimiques (par exemple des mtaux lourds, des composs organo
chlors, des composs organophosphors, etc.). Un exemple de prparation de sdiment reconstitu est dcrit
lappendice 3. Les composants peuvent aussi tre mlangs ltat sec, condition de dmontrer quaprs lajout
de leau sus-jacente, les composants du sdiment ne se sparent pas (flottement de particules de tourbe, par
exemple) et que la tourbe ou le sdiment sont suffisamment conditionns.
Eau
15. Toute eau conforme aux caractristiques chimiques dune eau de dilution acceptable selon les critres spcifis
aux appendices 2 et 4 peut servir lessai. Toute eau approprie, naturelle (eau superficielle ou souterraine),
reconstitue (voir appendice 2) ou eau du robinet dchlore, est acceptable comme eau pour llevage et les essais
si les chironomes y survivent sur toute la dure de llevage et de lessai sans manifester de signes de stress. Au
dbut de lessai, le pH de leau dessai se situera entre 6 et 9 et sa duret totale ne dpassera pas 400 mg/l en
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CaCO3. Nanmoins, si lon suspecte une interaction entre les ions qui provoquent la duret et la substance
dessai, il faudra utiliser une eau moins dure (et ne pas employer le milieu Elendt M4 dans ce cas). Le mme type
deau doit tre utilis tout au long de ltude. Les caractristiques de la qualit de leau numres lappendice 4
sont mesurer au moins deux fois par an ou chaque fois que ses caractristiques sont susceptibles davoir t
significativement modifies.
Solutions mres sdiments dops
16. Les sdiments dops sont gnralement prpars la concentration souhaite en ajoutant directement une
solution de la substance dessai au sdiment. Une solution mre de la substance dessai dissoute dans de leau
dsionise est mlange au sdiment reconstitu laide dun agitateur rouleaux, dun mlangeur pour aliments
ou mlange la main. Si la substance dessai est peu soluble dans leau, elle peut tre dissoute dans un volume
aussi petit que possible dun solvant organique adquat (hexane, actone ou chloroforme, par exemple). Cette
solution est ensuite mlange 10 g de sable quartzique fin par rcipient dessai. Il faut attendre que le solvant
svapore jusqu ce quil soit totalement limin du sable; le sable est ensuite mlang avec la quantit appro
prie de sdiment par bcher. Seuls des agents trs volatils peuvent tre utiliss pour solubiliser, disperser ou
mulsifier la substance dessai. On noubliera pas de tenir compte de la quantit de sable apporte avec le
mlange de la substance dessai et du sable lors de la prparation du sdiment (ce dernier sera prpar avec
moins de sable). Il faudra veiller mlanger compltement la substance dessai au sdiment et ly rpartir
uniformment. Si ncessaire, on analysera des sous-chantillons afin de dterminer le degr dhomognit.
CONCEPTION DE LESSAI
17. La conception de lessai dfinit le nombre et lespacement des concentrations exprimentales, le nombre de
rcipients chaque concentration et le nombre de larves par rcipient. La marche suivre pour estimer une
valeur de CE, la CSEO et mener un essai limite est dcrite.
Conduite dune analyse de rgression
18. La concentration efficace (par exemple, CE15, CE50) et la gamme de concentrations dans laquelle leffet produit
par la substance dessai est dintrt doivent tre couvertes par les concentrations incluses dans lessai. Gnra
lement, lexactitude, et plus particulirement la validit, de lestimation des concentrations efficaces (CEx) sac
croissent lorsque la concentration efficace se situe dans la gamme des concentrations testes. Il faut viter
dextrapoler des rsultats trs en dessous de la concentration efficace la plus faible ou au-dessus de la concen
tration maximale. Il est utile de conduire un essai prliminaire pour dterminer la gamme des concentrations
utiliser (voir paragraphe 27).
19. Sil faut estimer la CEx, au moins cinq concentrations et trois rptitions par concentration doivent tre mises
lessai. En tout tat de cause, il est recommand de tester suffisamment de concentrations pour obtenir une
bonne estimation du modle. Le facteur sparant les concentrations ne doit pas excder deux (sauf dans les cas
o la courbe dose-effet prsente une pente faible). Le nombre de rptitions par traitement peut tre diminu si
le nombre de concentrations exprimentales entranant diffrents effets est augment. Laugmentation du nombre
de rptitions ou la contraction des intervalles entre les concentrations exprimentales tend rduire les
intervalles de confiance pour lessai. Le nombre de rptitions sera augment sil y a lieu destimer le taux de
survie et la croissance des larves aprs dix jours.
Procdure destimation dune CSEO/CMEO
20. Sil faut estimer la CMEO ou la CSEO, il convient de tester cinq concentrations exprimentales et au moins
quatre rptitions par concentration, le facteur sparant les concentrations nexcdant pas deux. Le nombre
dexpriences identiques doit tre tel quil fournit une puissance statistique permettant de dtecter une diffrence
de 20 % avec le tmoin, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). Sagissant de la vitesse de
dveloppement, une analyse de la variance (ANOVA) convient gnralement, telle que le test de Dunnett ou
le test de Williams (17) (18) (19) (20). Sagissant du taux dmergence, le test de Cochran-Armitage, le test exact
de Fisher (avec correction selon Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent tre utiliss.
Essai limite
21. Si lessai prliminaire de dtermination de lordre de grandeur des concentrations na engendr aucun effet, un
essai limite peut tre conduit (une concentration exprimentale et un tmoin). Lessai limite se pratique avec une
concentration suffisamment leve pour permettre aux dcideurs dexclure tout effet toxique possible de la
substance dessai et la limite est fixe une concentration cense ne jamais tre atteinte dans les conditions
relles. Une concentration de 1 000 mg/kg (poids sec) est recommande. Il est gnralement ncessaire de mener
au moins six rptitions pour les organismes traits et les tmoins. Il y a lieu de dmontrer que la puissance
statistique est suffisante pour dtecter une diffrence de 20 % avec les tmoins, au seuil de signification statistique
de 5 % (p = 0,05). En ce qui concerne leffet sur la vitesse de dveloppement et sur le poids, le test t constitue
une mthode statistique approprie, si les donnes respectent les conditions exiges par ce test (normalit,
variances homognes). On pourra recourir au test t variance ingale ou un test non paramtrique, tel que
le test de Wilcoxon-Mann-Whitney si ces conditions ne sont pas remplies. Sagissant du taux dmergence, le test
exact de Fisher convient.
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MODE OPRATOIRE
Conditions dexposition
Prparation du systme sdiment dop eau
22. La procdure de mlange de la substance dessai au sdiment dcrite dans la mthode dessai C.8, Toxicit pour
les vers de terre, est recommande pour cet essai (14). Les sdiments dops sont placs au fond des rcipients
avant dy verser leau, de faon obtenir un ratio volumique sdiment-eau de 1/4 (voir paragraphes 11 et 15). La
profondeur de la couche de sdiment doit tre comprise entre 1,5 et 3 cm. Afin dviter la sparation des
constituants du sdiment et la resuspension des particules fines pendant le remplissage de la colonne deau, on
peut recouvrir le sdiment dun disque en plastique durant cette opration et retirer le disque juste aprs. Dautres
dispositifs conviennent galement.
23. Les rcipients exprimentaux doivent tre couverts (par des plaques de verre, par exemple). On prendra soin de
remplacer les volumes deau vapore durant ltude, le cas chant, et ce avec de leau distille ou dsionise afin
dempcher laccumulation de sels.
Stabilisation
24. Une fois que le sdiment dop surmont dune couche deau a t prpar, il est souhaitable de laisser la
substance dessai se rpartir entre la phase aqueuse et le sdiment (3) (4) (6) (13), et ce, de prfrence, dans
les mmes conditions de temprature et daration que durant lessai. Lquilibre met de quelques heures
quelques jours stablir, voire 4-5 semaines dans de rares cas, selon le sdiment et la substance chimique. Il
ne faut pas attendre que lquilibre soit atteint, car beaucoup de substances risquent de se dgrader durant cette
priode, mais un temps dattente de 48 heures est recommand. Au terme de cette priode dquilibrage, on
mesure la concentration de la substance dessai dans leau sus-jacente, les pores et le sdiment, au moins pour la
concentration la plus leve et la plus faible (voir paragraphe 38). Ces dterminations analytiques de la substance
dessai permettent de calculer le bilan massique et dexprimer les rsultats en fonction des concentrations
mesures.
Introduction des organismes dessai
25. Quatre cinq jours avant dintroduire les organismes dessai dans les rcipients, des amas dufs sont prlevs
dans les cultures et dposs dans de petits flacons contenant du milieu de culture. Un milieu plus ancien issu de
la culture mre tout comme un milieu frachement prpar peuvent tre utiliss. Si ce dernier est utilis, on
ajoutera une petite quantit de nourriture, par exemple des algues vertes et/ou quelques gouttes du filtrat dune
suspension de paillettes pour poissons finement broyes, au milieu de culture (voir appendice 2). Seuls des amas
dufs frachement pondus peuvent tre utiliss. Normalement, les larves commencent clore quelques jours
aprs la ponte (2 3 jours pour Chironomus riparius 20 C et 1 4 jours pour Chironomus tentans 23 C et
Chironomus yoshimatsui 25 C) et le dveloppement des larves se droule en quatre stades, dont chacun dure 4
8 jours. Cet essai se pratique au premier stade larvaire (2-3 ou 1-4 jours aprs lclosion). Il est possible de
vrifier le stade de dveloppement des moucherons daprs la largeur de la capsule cphalique (6).
26. Vingt larves au premier stade, choisies au hasard, sont dposes dans chaque rcipient contenant le sdiment
dop et leau, laide dune pipette mousse. Laration de leau doit tre interrompue ds quon introduit les
larves dans les rcipients exprimentaux, et ce durant 24 heures aprs lajout des larves (voir paragraphes 25 et
32). Selon le protocole exprimental suivi (voir paragraphes 19 et 20), le nombre de larves utilises par
concentration slve au moins 60 pour lestimation dune valeur de concentration efficace (CE) et 80
pour la dtermination de la CSEO.
Concentrations dessai
27. Il peut tre utile de conduire un essai de dtermination de lordre de grandeur pour dlimiter la gamme de
concentrations appliquer dans lessai proprement dit. cet effet, on utilise une srie de concentrations
largement espaces de la substance dessai. Afin de reproduire la mme densit de surface par chironome que
dans lessai proprement dit, les chironomes sont exposs chaque concentration de la substance dessai durant
une priode permettant destimer les concentrations exprimentales appropries et aucune exprience identique
nest ncessaire.
28. Les concentrations pour lessai dfinitif sont choisies en fonction des rsultats de lessai de dtermination de
lordre de grandeur. Au moins cinq concentrations doivent tre appliques et slectionnes comme dcrit aux
paragraphes 18 20.
Tmoins
29. Lessai inclura le nombre ncessaire de rcipients tmoins pourvus du sdiment mais exempts de toute substance
dessai (voir paragraphes 19-20). Si la substance dessai a t applique laide dun solvant (voir paragraphe 16),
il convient dajouter un tmoin dont le sdiment contient galement le solvant.
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Systme exprimental
30. Des systmes statiques sont utiliss. Des systmes semi-statiques ou coulement continu avec renouvellement
intermittent ou continu de leau sus-jacente peuvent tre utiliss dans des cas exceptionnels, par exemple si les
spcifications de la qualit de leau deviennent inappropries pour lorganisme dexprience ou affectent lqui
libre chimique (si, par exemple, la concentration doxygne dissous devient trop basse, la concentration des
excrta augmente de faon trop importante ou si des minraux lessivs partir du sdiment affectent le pH et/ou
la duret de leau). Nanmoins, dautres mthodes damlioration de la qualit de leau sus-jacente, telles que
laration, seront normalement suffisantes et prfrables.
Alimentation
31. Les larves ont besoin dtre nourries, de prfrence quotidiennement TetraPhyll; ou au moins trois fois par
semaine. Durant les dix premiers jours, chaque jeune larve recevra quotidiennement 0,25 0,5 mg (0,35-0,5 mg
pour C. yoshimatsui) de nourriture pour poissons (suspendue dans leau ou finement moulue, par exemple
TetraMin ou TetraPhyll; voir les dtails lappendice 2). Il peut tre ncessaire daugmenter lgrement cette
quantit pour les larves plus ges: 0,5-1 mg par larve et par jour devrait suffire pour le reste de lessai. On
diminuera la ration alimentaire de tous les organismes traits et tmoins si des champignons se dveloppent ou
si des organismes tmoins meurent. Si la croissance fongique savre impossible enrayer, lessai doit tre
renouvel. Si lessai porte sur des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log Koe > 5) ou des
substances lies de faon covalente au sdiment, la quantit de nourriture ncessaire la survie et la croissance
naturelle des organismes peut tre ajoute au sdiment reconstitu avant la priode de stabilisation. Dans ce cas,
la nourriture pour poissons est remplace par une ration vgtale, par exemple 0,5 % (poids sec) de feuilles
finement broyes dortie (Urtica dioica), de mrier (Morus alba), de trfle blanc ou rampant (Trifolium repens),
dpinard (Spinacia oleracea), par exemple, ou dun autre matriau vgtal (Cerophyl ou alpha-cellulose).
Conditions dincubation
32. Leau sus-jacente est soumise une lgre aration, mise en route de prfrence 24 heures aprs lintroduction
des larves et maintenue jusqu la fin de lessai (il faut veiller ce que la concentration doxygne dissous ne
tombe pas en dessous de 60 % de la valeur de saturation en air). Lair est insuffl travers une pipette Pasteur en
verre fixe 2 3 cm au-dessus de la couche de sdiment (une ou quelques bulles par seconde). Si la substance
dessai est volatile, il faudra ventuellement supprimer laration.
33. Lessai est men temprature constante (20 C 2 C). Pour C. tentans et C. yoshimatsui, les tempratures
recommandes slvent respectivement 23 C et 25 C ( 2 C). La photopriode est de 16 heures et lclai
rement compris entre 500 et 1 000 lux.
Dure de lexposition
34. Lexposition dbute avec lintroduction des larves dans les rcipients traits et tmoins. La dure maximale de
lexposition slve 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et 65 jours pour C. tentans. Si les moucherons
mergent plus tt, lessai peut sachever au moins cinq jours aprs lmergence du dernier adulte tmoin.
Observations
mergence
35. La dure du dveloppement et le nombre total de moucherons mles et femelles adultes totalement mergs sont
dterminer. Les mles sont faciles identifier grce leurs antennes plumeuses.
36. Au moins trois fois par semaine, on vrifiera que les organismes des rcipients exprimentaux ne manifestent
aucun comportement anormal (sortie du sdiment, nage inhabituelle par exemple) par rapport aux tmoins.
Chaque jour, durant la priode suppose de lmergence, on comptera le nombre de moucherons mergs et on
consignera le sexe et le nombre de moucherons compltement mergs. Aprs identification, les moucherons
sont retirs des rcipients. Tout amas dufs dpos avant la fin de lessai doit tre recens puis enlev afin
dempcher la rintroduction de larves dans le sdiment. Le nombre de pupes visibles nayant pas russi
merger est aussi enregistr. Des indications sur la faon de mesurer lmergence sont donnes lappendice 5.
Croissance et survie
37. Sil faut fournir des donnes sur la survie et la croissance des larves aprs 10 jours, des rcipients dessai
supplmentaires seront ajouts ds le dbut de lessai, pour pouvoir tre utiliss ultrieurement. Le sdiment
de ces rcipients supplmentaires sera tamis travers des mailles de 250 m pour retenir les larves. La mort est
dtermine par deux critres: limmobilit et labsence de raction un stimulus mcanique. Les larves non
rcupres doivent aussi tre comptabilises parmi les mortes (les larves qui sont mortes au dbut de lessai ont
pu tre dgrades par des microbes). Aprs avoir dtermin le poids sec (sans cendres) des larves survivantes par
rcipient exprimental, on calcule le poids sec individuel moyen par rcipient. Il est utile dtablir quel stade se
trouvent les larves survivantes, et ce daprs la largeur de la capsule cphalique de chaque individu.
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Mesures analytiques
Concentration de la substance dessai
38. Avant le dbut de lessai (cest--dire avant lintroduction des larves), on prlve des chantillons du sdiment dau
moins un rcipient par traitement, afin de dterminer analytiquement la concentration de la substance dessai
dans le sdiment. Il est recommand danalyser, au minimum, des chantillons de leau sus-jacente, de leau des
pores, et du sdiment, au dbut (voir paragraphe 24) et la fin de lessai, et ce de la concentration la plus leve
et dune concentration plus basse. Les concentrations de la substance dessai nous renseignent sur le compor
tement et la rpartition de la substance dessai dans le systme eau-sdiment.
39. Lorsquon effectue des mesures intermdiaires (par exemple au septime jour) et si lanalyse requiert des chan
tillons volumineux qui ne peuvent tre prlevs des rcipients sans influencer le systme exprimental, les
analyses seront pratiques sur des chantillons provenant de rcipients exprimentaux supplmentaires traits
de la mme faon (y compris par la prsence des organismes dessai), mais non utiliss pour des observations
biologiques.
40. Pour isoler leau interstitielle, on recommande de centrifuger les chantillons 10 000 g et 4 C durant
30 minutes. Cependant, sil est dmontr que la substance dessai ne sadsorbe pas sur les filtres, la filtration
est galement acceptable. Avec des chantillons trop petits, il arrive que les concentrations dans leau des pores
soient impossibles analyser.
Paramtres physico-chimiques
41. Le pH de leau et la temprature des rcipients dessai doivent tre mesurs de faon approprie (voir paragraphe
10). La duret de leau et la teneur en ammoniac sont mesures dans les rcipients tmoins et dans un rcipient
trait la concentration la plus leve, au dbut et la fin de lessai.
RSULTATS ET RAPPORT
42. Cet essai vise dterminer leffet de la substance dessai sur la vitesse de dveloppement et le nombre total de
moucherons mles et femelles totalement mergs ou, dans le cas de lessai de 10 jours, les effets sur la survie et
le poids des larves. Si rien nindique que les deux sexes prsentent des diffrences statistiques de sensibilit, les
rsultats obtenus sur les mles et les femelles peuvent tre regroups pour lanalyse statistique. Les diffrences de
sensibilit entre les sexes peuvent tre juges statistiquement par un test (de tableau) 2 - r 2, par exemple. La
survie des larves et le poids sec individuel moyen par rcipient doivent tre dtermins aprs dix jours, le cas
chant.
43. Il est prfrable de calculer les concentrations efficaces, exprimes en fonction du poids sec, partir des
concentrations mesures dans le sdiment au dbut de lessai (voir paragraphe 38).
44. Pour estimer ponctuellement la CE50 ou une quelconque CEx, les statistiques par rcipient peuvent tre utilises
comme des expriences identiques proprement dites. Lorsquon calcule un intervalle de confiance pour une
quelconque CEx, il faut tenir compte de la variabilit entre les rcipients ou montrer que celle-ci est ngligeable.
Si le modle est ajust par la mthode des moindres carrs, il convient dappliquer une transformation des
donnes pour les statistiques par rcipient afin daccrotre lhomognit de la variance. Toutefois, les valeurs de
la CEx sont calculer aprs que les rsultats ont t retransforms de faon recouvrer leur valeur originale.
45. Si lanalyse statistique vise dterminer la CSEO/CMEO par la vrification dune hypothse, la variabilit entre les
rcipients doit tre prise en compte, par exemple laide dune analyse de la variance (ANOVA) embote. Par
contre, des tests plus robustes (21) peuvent tre utiliss au cas o les hypothses habituelles de lanalyse de la
variance ne se vrifient pas.
Taux dmergence
46. Le taux dmergence donne une rponse par tout ou rien et peut tre analys par le test de Cochran-Armitage
appliqu de faon rgressive si la relation dose-effet est suppose tre monotone et si les taux dmergence
corroborent cette hypothse. Dans le cas contraire, un test exact de Fisher ou un test de Mantel-Haenszel avec
des valeurs de p corriges selon Bonferroni-Holm peuvent tre employs. Sil savre que la variabilit entre
expriences identiques la mme concentration est suprieure ce quune distribution binomiale indiquerait
(variation souvent qualifie dextra-binomiale), on appliquera un test plus robuste (Cochran-Armitage ou test
exact de Fisher) comme propos la rfrence (21).
La somme des moucherons mergs par rcipient, ne, est dtermine et divise par le nombre de larves
introduites, na:
TE
ne
na
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o:
TE = taux dmergence
ne = nombre de moucherons mergs par rcipient
na = nombre de larves introduites par rcipient
47. Une variante plus approprie aux chantillons de grande taille, lorsque la variance est extra-binomiale, consiste
traiter le taux dmergence comme une rponse continue et appliquer une mthode telle que le test de William
si la relation dose-effet est suppose tre monotone et si les taux dmergence corroborent cette hypothse. Le
test de Dunnett convient dans le cas o la relation ne savre pas monotone. Ici, on considre quun chantillon
est de grande taille lorsque le nombre de moucherons mergs et le nombre de chironomes non mergs
dpassent chacun cinq, par rcipient exprimental.
48. Pour raliser lanalyse de la variance (ANOVA), il convient dappliquer aux valeurs de TE une transformation
arcsinus-racine carre ou Freeman-Tukey afin dobtenir une distribution proche de la normale et dgaliser les
variances. Le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction de Bonferroni) ou le test de
Mantel-Haenszel peuvent tre employs lorsquon utilise des frquences absolues. La transformation arcsinusracine carre consiste calculer linverse du sinus (sinus-1) de la racine carre du TE.
49. Pour les taux dmergence, les valeurs de la CEx sont calcules par une analyse de rgression [ou par probit (22),
logit, Weibull, des logiciels commerciaux appropris, etc.]. Si lanalyse de la rgression choue (par exemple,
lorsquil y a moins de deux rponses partielles), on fait appel dautres mthodes non paramtriques telles que la
moyenne mobile ou une simple interpolation.
Vitesse de dveloppement
50. La priode de dveloppement moyenne reprsente le temps moyen coul entre lintroduction des larves (jour 0
de lessai) et lmergence de la cohorte exprimentale de moucherons (pour calculer la priode de dveloppement
relle, il faut tenir compte de lge des larves au moment de lintroduction). La vitesse de dveloppement est
linverse de la priode de dveloppement (unit: 1/jour) et reprsente la partie du dveloppement larvaire qui
seffectue par jour. Pour valuer la toxicit dans les sdiments, il est prfrable de choisir la vitesse de dvelop
pement, car sa variance est plus faible et ses valeurs sont plus homognes et plus proches dune distribution
normale, en comparaison avec la priode de dveloppement. Cest pourquoi les tests paramtriques puissants
conviennent mieux la vitesse de dveloppement qu la priode de dveloppement. Si la vitesse de dvelop
pement est traite comme une rponse continue, les valeurs de la CEx peuvent tre estimes par lanalyse de la
rgression, par exemple (23), (24).
51. Pour les tests statistiques suivants, le nombre de moucherons observs le jour sont considrs comme ayant
merg au milieu de lintervalle de temps compris entre le jour x et le jour x - 1 (1 = longueur de lintervalle
dobservation, habituellement 1 jour). La vitesse de dveloppement moyenne par rcipient (x) est calcule comme
suit:
m
X
i xi
i1
ne
o:
x: vitesse de dveloppement moyenne par rcipient
i:
indice de lintervalle dobservation
m: nombre maximal dintervalles dobservation

i : nombre de moucherons mergs durant lintervalle dobservation i
P
ne: nombre total de moucherons mergs la fin de lexprience (= i )
xi: vitesse de dveloppement des moucherons mergs durant lintervalle i

xi
1
jouri
1i
2
o:
jouri: jour dobservation (compt depuis lapplication)
li:
dure de lintervalle dobservation I (exprim en jours, habituellement 1 jour)
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L 81/190
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Rapport dessai
52. Le rapport dessai doit fournir au moins les informations suivantes:
Substance dessai:
tat physique et, sil y a lieu, proprits physico-chimiques (hydrosolubilit, pression de vapeur, coefficient de
partage dans le sol (ou dans le sdiment sil est connu), stabilit dans leau, etc.),
identification chimique (nom courant, nom chimique, formule structurale, numro CAS, etc.), puret et
mthode danalyse pour la quantification de la substance dessai.
Espce dessai:
animal dessai utilis: espce, nom scientifique, source et conditions dlevage,
informations sur la manipulation des amas dufs et des larves,
ge des animaux dexprience au moment o ils ont t dposs dans les rcipients exprimentaux.
sdiment utilis, cest--dire naturel ou reconstitu,
pour les sdiments naturels: localisation et description du site de prlvement et notamment, si possible, son
histoire en matire de contamination; caractristiques: pH, teneur en carbone organique, quotient C/N et
granulomtrie, le cas chant,
prparation du sdiment reconstitu: ingrdients et caractristiques (teneur en carbone organique, pH, humi
dit, etc. au dbut de lessai),
prparation de leau dessai (si leau est reconstitue) et caractristiques (concentration doxygne, pH, conduc
tivit, duret, etc. au dbut de lessai),
profondeur du sdiment et de leau sus-jacente,
volume de leau sus-jacente et de leau des pores; poids du sdiment humide avec et sans eau des pores,
rcipients exprimentaux (matriau et dimension),
mthode de chargement du sdiment: concentrations exprimentales appliques, nombre dexpriences iden
tiques et utilisation dun solvant, le cas chant,
phase de stabilisation du systme sdiment dop-eau: dure et conditions,
conditions dincubation: temprature, cycle et intensit de lumire, aration (frquence et intensit),
informations dtailles sur la nourriture: type, prparation, quantit et rgime dadministration.
Rsultats:
concentrations dessai nominales, concentrations dessai mesures et rsultats de toutes les analyses conduites
pour dterminer la concentration de la substance dessai dans le rcipient exprimental,
qualit de leau dans les rcipients exprimentaux: pH, temprature, oxygne dissous, duret et teneur en
ammoniac,
remplacement de leau dessai vapore, le cas chant,
nombre de moucherons mles et femelles mergs par rcipient et par jour,
nombre de larves non merges sous la forme de moucherons par rcipient,
poids sec individuel moyen des larves par rcipient, et par stade larvaire, sil y a lieu,
pourcentage dmergence par exprience identique et concentration dessai (regroupement des rsultats pour
les moucherons mles et femelles),
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vitesse de dveloppement moyenne des moucherons totalement mergs par exprience identique et concen
tration dessai (regroupement des rsultats pour les moucherons mles et femelles),
estimation des effets toxiques observs, par exemple CEx (et intervalles de confiance associs), CSEO et/ou
CMEO, et mthodes statistiques employes pour les dterminer,
analyse des rsultats, y compris les rpercussions sur les rsultats dun cart ventuel la prsente mthode
dessai.
BIBLIOGRAPHIE:
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test
system. Edited by M. Streloke and H. Kpp. Berlin 1995.
(2) Fleming R. et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the
European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine
Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Conta
minants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards.
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West
Conshohocken, PA.
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges
(Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants
with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition
dated June 1994.
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
(9) Milani D., Day K.E., McLeay D.J., and Kirby R.S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the
development and standardisation of Environment Canadas biological test methods for measuring sediment
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Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
(10) Sugaya Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J.
Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
(11) Kawai K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chirono
mids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
(12) OCDE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Publica
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(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control
Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
(14) Mthode dessai C.8 de la prsente annexe, Toxicit pour les vers de terre.
(15) Suedel B.C. and J.H. Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and
estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
(16) Naylor C. and C. Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated
sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
L 81/191
L 81/192
FR
(17) Dunnett C.W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J.
Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.
(18) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491.
(19) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared
with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.
(20) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.
(21) Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:
577-585.
(22) Christensen E.R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water
Research 18: 213-221.
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental
Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.
(24) Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
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Appendice 1
DFINITIONS
Les dfinitions suivantes sappliquent aux fins de la prsente mthode dessai:
Le sdiment reconstitu, ou artificiel ou synthtique, dsigne le mlange de matriaux utiliss pour reproduire au mieux
les composants physiques dun sdiment naturel.
Leau sus-jacente est leau surmontant le sdiment dans le rcipient exprimental.
Leau interstitielle, ou leau des pores, se rfre leau qui occupe les vides laisss entre le sdiment et les particules de
sol.
Le sdiment dop est un sdiment auquel on a ajout la substance dessai.
Une substance dessai est toute substance ou tout mlange soumis un essai ralis suivant la prsente mthode dessai.
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Appendice 2
Recommandations pour la culture de Chironomus riparius
1.
Les larves de Chironomus peuvent tre leves dans des cristallisoirs ou de grands rcipients. Du sable quartzique fin
est dpos en couche mince (environ 5 10 mm dpaisseur) sur le fond du rcipient. Le Kieselguhr (par exemple
lart. 8117 de Merck) convient aussi comme substrat (une couche encore plus mince de quelques millimtres peine
suffit). Une eau de qualit approprie, profonde de plusieurs centimtres, vient ensuite recouvrir le substrat. En cas
dvaporation, le niveau deau doit toujours tre ramen sa hauteur initiale, afin de prvenir toute dessiccation. Leau
peut tre remplace, si ncessaire. Une lgre aration est fournie. Les rcipients dlevage des larves doivent tre
placs dans des cages appropries, afin dempcher la fuite des adultes mergeant. La cage sera suffisamment grande
pour permettre aux adultes mergs dessaimer, sans quoi la copulation risque de ne pas avoir lieu (dimensions
minimales: 30 30 30 cm).
2.
Les cages doivent tre gardes temprature ambiante, ou 20 2 C si elles sont installes dans une chambre
ambiance constante, avec une photopriode de 16 heures de lumire (intensit: environ 1 000 lux) et 8 heures
dobscurit. Une humidit relative de lair infrieure 60 % serait susceptible dempcher la reproduction.
Eau de dilution
3.
Toute eau naturelle ou reconstitue approprie peut tre utilise. Leau dun puits, de leau du robinet dchlore et un
milieu artificiel (Elendt M4 ou M7, voir ci-aprs) sont souvent utiliss. Leau doit tre are avant emploi. Si
ncessaire, on peut renouveler leau de culture en versant ou en siphonnant soigneusement leau use des rcipients
exprimentaux, sans dtruire les tubes des larves.
Alimentation des larves
4.
Les larves de Chironomus reoivent des paillettes pour poissons (TetraMin, TetraPhyll ou une autre marque dpose
quivalente), raison denviron 250 mg par rcipient et par jour. Cette nourriture peut tre administre sous la forme
dune poudre moulue sec ou dune suspension dans leau: 1,0 g de paillettes ajoutes 20 ml deau de dilution et
agites de faon obtenir un mlange homogne. Cette prparation peut tre administre raison denviron 5 ml par
rcipient et par jour (agiter avant emploi). Les larves plus ges peuvent en recevoir plus.
5.
La nourriture est ajuste en fonction de la qualit de leau. Si le milieu de culture devient trouble, il convient de
rduire la ration. Les quantits de nourriture donnes sont soigneusement notes. Un manque de nourriture fera
migrer les larves vers la colonne deau, tandis quun excs de nourriture intensifiera lactivit microbienne et abaissera
la concentration doxygne. Ces deux conditions sont susceptibles de ralentir la croissance des organismes.
6.
Certaines cellules dalgues vertes (Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) peuvent aussi tre ajoutes lors de la
prparation de nouveaux rcipients de culture.
Alimentation des adultes mergents
7.
Certains exprimentateurs ont suggr de nourrir les adultes mergs au moyen dun tampon douate imbib dune
solution de sucrose sature.
mergence
8.
20 2 C, les adultes commencent merger des rcipients dlevage des larves aprs environ 13 15 jours. Il est
facile de distinguer les mles daprs leurs antennes plumeuses.
Amas dufs
9.
Ds que des adultes sont prsents dans la cage dlevage, il faut vrifier trois fois par semaine, dans tous les rcipients
dlevage de larves, si des amas dufs glatineux nont pas t dposs. Le cas chant, les amas dufs doivent tre
soigneusement enlevs et transfrs dans un petit rcipient contenant un chantillon de leau dlevage. Les amas
dufs servent prparer un nouveau rcipient de culture (2 4 amas dufs par rcipient, par exemple) ou
pratiquer des essais de toxicit.
10. Les larves au premier stade devraient clore aprs 2-3 jours.
Prparation de nouveaux rcipients de culture
11. Une fois que les cultures ont t lances, il devrait tre possible de prparer un nouveau rcipient de culture de larves,
une fois par semaine ou moins souvent, suivant les besoins de lessai, et de retirer les rcipients plus anciens aprs
que les moucherons adultes ont merg. Ce systme permet dobtenir rgulirement un contingent dadultes, avec une
organisation minimale.
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Prparation des solutions dessai M4 et M7

12. Elendt (1990) a dcrit le milieu M4. Le milieu M7 est prpar comme le milieu M4, sauf pour les substances
reprises au tableau 1, dont les concentrations sont quatre fois plus faibles dans le milieu M7 que dans le milieu
M4. Une publication sur le milieu M7 est en prparation (Elendt, communication personnelle). La solution dessai
ne doit pas tre prpare selon les instructions dElendt et Bias (1990), car les concentrations de NaSiO35H2O,
NaNO3, KH2PO4 et K2HPO4 indiques pour la prparation des solutions mres ne conviennent pas.
Prparation du milieu M7
13. Chaque solution mre (I) est prpare sparment et une solution mre combine (II) est prpare partir de ces
solutions mres (I) (voir tableau 1). Cinquante millilitres de la solution mre combine (II) additionns de la quantit
de chaque solution mre de macronutriments indique au tableau 2 sont amens 1 litre avec de leau dsionise
pour prparer le milieu M7. On prpare une solution mre de vitamines en ajoutant trois vitamines de leau
dsionise, comme indiqu au tableau 3 et on verse 0,1 ml de la solution mre combine de vitamines au milieu
M7 final, peu avant lemploi (la solution mre de vitamines est stocke congele par petites aliquotes). Le milieu est
ar et stabilis.
BIBLIOGRAPHIE:
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by
M. Streloke and H. Kpp. Berlin 1995.
Tableau 1
Solutions mres dlments en traces pour les milieux M4 et M7
Solutions mres (I)
Pour prparer la solution mre

combine (II): mlanger les quantits
Quantit (mg)
pour former suivantes (ml) de solutions mres (I) et
complter 1 litre avec de leau
une solution d1
dsionise
litre avec de
leau dsionise
M4
M7
Concentrations finales dans les

solutions exprimentales (mg/l)
M4
M7
H3BO3 (1)
57 190
1,0
0,25
2,86
0,715
MnCl2 4 H2O (1)
7 210
1,0
0,25
0,361
0,090
LiCl (1)
6 120
1,0
0,25
0,306
0,077
RbCl (1)
1 420
1,0
0,25
0,071
0,018
SrCl2 6 H2O (1)
3 040
1,0
0,25
0,152
0,038
320
1,0
0,25
0,016
0,004
1 260
1,0
0,25
0,063
0,016
CuCl2 2 H2O (1)
335
1,0
0,25
0,017
0,004
ZnCl2
260
1,0
1,0
0,013
0,013
CaCl2 6 H2O
200
1,0
1,0
0,010
0,010
KI
65
1,0
1,0
0,0033
0,0033
Na2SeO3
43,8
1,0
1,0
0,0022
0,0022
NH4VO3
11,5
1,0
1,0
0,00058
0,00058
Na2EDTA 2 H2O (1) (2)
5 000
20,0
5,0
2,5
0,625
FeSO4 7 H2O (1) (2)
1 991
20,0
5,0
1,0
0,249
NaBr (1)
Na2MoO4 2 H2O (1)
(1) Ces substances sont doses diffremment en M4 et M7, comme indiqu plus haut.
(2) Ces solutions sont prpares sparment, puis mlanges et autoclaves immdiatement aprs.
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Tableau 2
Solutions mres de macronutriments pour les milieux M4 et M7
Quantits de solutions mres
Quantit (mg) pour former
de macronutriments ajoutes
solutions exprimentales M4
une solution d1 litre avec de pour prparer les milieux M4
et M7
leau dsionise
et M7
(mg/l)
(ml/l)
CaCl2 2 H2O
293 800
1,0
293,8
MgSO4 7 H2O
246 600
0,5
123,3
KCl
58 000
0,1
5,8
NaHCO3
64 800
1,0
64,8
NaSiO3 9 H2O
50 000
0,2
10,0
NaNO3
2 740
0,1
0,274
KH2PO4
1 430
0,1
0,143
K2HPO4
1 840
0,1
0,184
Tableau 3
Solution mre de vitamines pour les milieux M4 et M7. Les trois solutions de vitamines seront mlanges de
faon ne former quune solution mre de vitamines
Quantit pour former une
solution dun litre avec de
leau dsionise
(mg)
Quantit de solution mre de

vitamines ajoute pour
solutions dessai M4 et M7
prparer les milieux M4 et M7
(mg/l)
(ml/l)
Hydrochlorure de thiamine
750
0,1
0,075
Cyanocobalamine (B12)
10
0,1
0,0010
Biotine
7,5
0,1
0,00075
BIBLIOGRAPHIE:
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity
Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9):
1157-1167.
FR
19.3.2014
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Appendice 3
PRPARATION DU SDIMENT RECONSTITU
Composition du sdiment
Le sdiment sera reconstitu comme suit:
Ingrdient
% du sdiment
poids sec
Caractristiques
Tourbe
Tourbe de sphaigne, pH aussi proche que possible de 5,5-6,0, pas de

rsidus de plantes visibles, finement broye, particules ( 1 mm) et
sche lair
4 - 5
Sable quartzique
Dimension des particules: > 50 % des particules doivent mesurer

entre 50 et 200 m
75 - 76
Argile kaolinique
Taux de kaolinite 30 %
20
Carbone organique
Ajust par laddition de tourbe et de sable
2 ( 0,5)
Carbonate de calcium
CaCO3, pulvris, chimiquement pur
0,05 - 0,1
Eau
Conductivit 10 S/cm
30 - 50
Prparation
La tourbe est sche lair et broye en poudre fine. Une suspension de la quantit requise de poudre de tourbe dans de
leau dsionise est prpare laide dun homognisateur haute performance. Le pH de cette suspension est ajust
5,5 0,5 avec du CaCO3. La suspension est conditionne durant au moins deux jours en lagitant doucement 20 2 C,
afin de stabiliser le pH et dtablir une flore microbienne stable. Le pH est vrifi nouveau; il devrait atteindre 6,0 0,5.
Ensuite la suspension de tourbe est mlange avec les autres ingrdients (sable et argile kaolinique) et de leau dsionise
pour former un sdiment homogne avec une teneur en eau de 30 50 % du poids sec du sdiment. Le pH du mlange
final est encore mesur et ajust 6,5-7,5 avec du CaCO3, si ncessaire. On prlve des chantillons de sdiment afin de
dterminer le poids sec et la teneur en carbone organique. Ensuite, avant dutiliser le sdiment reconstitu dans lessai de
toxicit sur les chironomes, il est recommand de le conditionner durant sept jours dans des conditions identiques celles
qui seront appliques durant lessai subsquent.
Stockage
Les ingrdients secs destins la prparation du sdiment artificiel peuvent tre entreposs dans un endroit sec et frais,
temprature ambiante. Le sdiment reconstitu (humide) ne doit pas tre stock avant son utilisation dans lessai. Il doit
tre utilis immdiatement aprs la priode de conditionnement de sept jours qui achve sa prparation.
BIBLIOGRAPHIE:
Chapitre C.8 de la prsente annexe: Toxicit pour les vers de terre.
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachloro
benzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. Safety 39:
10-20.
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FR
19.3.2014
Appendice 4
Caractristiques chimiques dune eau de dilution acceptable
Substance
Concentrations
Matires particulaires
< 20 mg/l
Carbone organique total
< 2 mg/l
Ammoniac non ionis
< 1 g/l
Duret en CaCO3
< 400 mg/l (*)
Chlore rsiduel
< 10 g/l
Totalit des pesticides organophosphors
< 50 ng/l
Totalit des pesticides organochlors et des biphnyles polychlors
< 50 ng/l
Chlore organique total
< 25 ng/l
(*) Sil risque dy avoir une interaction entre les ions qui provoquent la duret de leau et la substance dessai, il convient dutiliser une eau
moins dure (auquel cas, le milieu Elendt M4 ne pourra pas tre utilis).
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Appendice 5
Conseils pour suivre lmergence des larves de chironomes
Les bchers exprimentaux sont coiffs par des piges mergence, du 20e jour jusqu la fin de lessai. Le schma cidessous illustre un exemple de pige:
A: toile de nylon.
B: coupelles en plastique renverses.
C: bcher exprimental sans bec.
D: ouvertures recouvertes de toile par o seffectuent les

changes.
E: eau.
F: sdiment.
C. 28. ESSAI DE TOXICIT SUR LES CHIRONOMES DANS UN SYSTME EAU CHARGE-SDIMENT
INTRODUCTION
1.
La prsente mthode dessai est quivalente la ligne directrice 219 de lOCDE (2004) pour les essais de produits
chimiques. Elles est conue pour valuer les effets dune exposition prolonge des substances chimiques sur des
larves de Chironomus sp., un diptre vivant dans les sdiments deau douce. Elle sinspire principalement de la
ligne directrice du BBA, dans laquelle lexposition seffectue laide dun systme exprimental sdiment-eau,
compos de sol artificiel et dune colonne deau (1). Elle tient compte galement des protocoles dessais de
toxicit sur Chironomus riparius et Chironomus tentans, mis au point en Europe et en Amrique du Nord (2) (3) (4)
(5) (6) (7) (8) et soumis des essais circulaires (1) (6) (9). Dautres espces de chironomes bien documentes
peuvent aussi tre employes, par exemple Chironomus yoshimatsui (10) (11).
2.
Le scnario dexposition appliqu dans la prsente mthode dessai consiste introduire la substance dessai dans
leau. La slection du scnario dexposition dpend de la finalit de lessai. Le scnario dexposition qui consiste
doper la colonne deau, vise simuler des pertes par dispersion lors de lpandage de pesticides et couvre le pic
de concentrations initial dans leau interstitielle. Il sapplique galement dautres types dexposition (notamment
des fuites de produits chimiques), lexclusion des processus daccumulation dune dure suprieure celle de
lessai.
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L 81/200
3.
En gnral, les substances tester sur des organismes vivant dans les sdiments subsistent longtemps dans ce
compartiment. Ces organismes peuvent tre exposs par diverses voies. Limportance relative de chaque voie
dexposition et le temps pris par chacune dentre elles pour contribuer leffet toxique global dpendent des
proprits physico-chimiques de chaque substance chimique. Dans le cas des substances fortement adsorbantes
(par exemple avec un log Koe > 5) ou des substances lies de faon covalente au sdiment, lingestion daliments
contamins peut constituer une voie dexposition non ngligeable. Afin de ne pas sous-estimer la toxicit des
substances fortement lipophiles, on envisagera dajouter de la nourriture au sdiment avant lapplication de la
substance dessai. La prsente mthode dessai est axe sur lexposition long terme, de faon couvrir toutes les
voies dexposition potentielles. Lessai dure de 20 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et de 28 65 jours
pour C. tentans. Si lon a besoin de donnes court terme pour un motif prcis, par exemple pour tudier les
effets de substances chimiques instables, des rcipients supplmentaires, ajouts au dispositif exprimental,
peuvent tre retirs aprs 10 jours dessai.
4.
Les effets mesurs sont le nombre total dadultes mergs et temps coul jusqu lmergence. Si lon a besoin de
donnes court terme, il est recommand de ne mesurer la survie et la croissance des larves quaprs 10 jours,
en ajoutant le nombre ncessaire de rcipients supplmentaires.
5.
Lutilisation dun sdiment reconstitu est recommande en raison de ses avantages par rapport aux sdiments
naturels:
la variabilit exprimentale est rduite parce que le sdiment reconstitu forme une matrice normalise
reproductible; en outre, il nest plus ncessaire de trouver des sources de sdiments non contamins et non
pollus,
les essais peuvent tre effectus nimporte quel moment de lanne, la variabilit saisonnire nintervenant
plus et il nest pas ncessaire de traiter pralablement le sdiment afin dliminer la faune indigne; lutili
sation de sdiments reconstitus diminue aussi le cot associ la collecte sur le terrain dune quantit
suffisante de sdiments pour les essais systmatiques,
les sdiments reconstitus permettent de comparer la toxicit des substances et de les classer en consquence;
les essais pratiqus sur des sdiments naturels et artificiels ont fourni des donnes de toxicit comparables
pour plusieurs substances chimiques (2).
6.
Lappendice 1 contient les dfinitions applicables la prsente mthode dessai.

PRINCIPE DE LESSAI
7.
Des chironomes au premier stade larvaire sont exposs une gamme de concentrations de la substance dessai
dans un systme sdiment-eau. Lessai dbute par lintroduction de larves au premier stade dans les bchers
exprimentaux contenant le systme sdiment-eau et lajout de la substance dessai leau. Lmergence des
chironomes et leur vitesse de dveloppement sont mesures la fin de lessai. La survie des larves et leur poids
peuvent aussi tre mesurs aprs 10 jours si ncessaire (en ajoutant le nombre dexpriences identiques requis).
Ces donnes sont analyses, soit laide dun modle de rgression pour estimer la concentration qui entranerait
une rduction de x % de lmergence ou de la survie des larves ou de leur croissance (par exemple CE15, CE50,
etc.), soit par la vrification dune hypothse statistique afin de dterminer une CSEO/CMEO. Cette dernire
requiert une comparaison entre les valeurs efficaces et les valeurs des tmoins laide de tests statistiques.
8.
Il faudrait connatre lhydrosolubilit de la substance dessai, sa pression de vapeur, son coefficient de partage
mesur ou calcul dans le sdiment et sa stabilit dans leau et le sdiment. Il convient de disposer dune
mthode danalyse fiable pour quantifier la substance dessai dans leau sus-jacente, leau interstitielle et le
sdiment, et pour laquelle la prcision et le seuil de dtection sont connus. Il est galement utile de connatre
la formule structurale et la puret de la substance dessai ainsi que son devenir chimique (par exemple dissipa
tion, dgradation abiotique et biotique, etc.). Des indications complmentaires pour tester les substances se
prtant difficilement lessai en raison de leurs proprits physico-chimiques sont fournies la rfrence (12).
9.
Des substances de rfrence pourront tre testes rgulirement pour dmontrer la fiabilit du protocole et des
conditions de lessai. Voici quelques exemples de toxiques de rfrence ayant fait leurs preuves dans des essais
circulaires et des tudes de validation: lindane, trifluraline, pentachlorophnol, chlorure de cadmium et chlorure
de potassium (1) (2) (5) (6) (13).
VALIDIT DE LESSAI
10. Pour que lessai soit valide, les conditions suivantes doivent tre remplies:
lmergence chez les tmoins doit atteindre au moins 70 % la fin de lessai (1) (6),
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sagissant de C. riparius et C. yoshimatsui, lmergence au stade adulte dans les rcipients tmoins doit avoir
lieu entre 12 et 23 jours aprs leur introduction dans les rcipients exprimentaux; C. tentans ncessite une
priode de 20 65 jours,
la fin de lessai, le pH et la concentration doxygne dissous seront mesurs dans chaque rcipient. La
concentration doxygne devrait atteindre au moins 60 % de la valeur de saturation en air (VSA) la
temprature applique et le pH de leau sus-jacente devrait tre compris entre 6 et 9 dans tous les rcipients
exprimentaux,
la temprature de leau ne devrait pas varier de plus de 1,0 C et pourrait tre contrle grce une
chambre isotherme, auquel cas la temprature de la chambre devra tre confirme intervalles appropris.
Rcipients exprimentaux
11. Lessai se droule dans des bchers en verre de 600 ml, mesurant 8 cm de diamtre. Dautres rcipients peuvent
tre utiliss condition quils permettent de garantir une profondeur adquate deau et de sdiment. Le sdiment
doit offrir une superficie de 2 3 cm2 par larve. Le quotient de la profondeur de la couche de sdiment par la
profondeur de la couche deau sus-jacente doit tre gal 1/4. Les rcipients et les autres appareils qui entreront
en contact avec le systme dessai doivent tre composs uniquement de verre ou dun autre matriau chimi
quement inerte (par exemple du Tflon).
Slection des espces
12. Chironomus riparius est lespce qui convient le mieux. Chironomus tentans peut aussi tre utilis, mais il est plus
difficile manipuler et ncessite une priode dessai plus longue. Chironomus yoshimatsui convient galement. La
mthode de culture de Chironomus riparius est dtaille lappendice 2. Dautres documents dcrivent les
conditions de culture des autres espces: Chironomus tentans (4) et Chironomus yoshimatsui (11). Lidentification
des espces est confirmer avant lessai, mais nest pas requise avant chaque essai si les organismes proviennent
dun levage interne.
Sdiment
13. Il est prfrable demployer un sdiment reconstitu (galement dnomm sdiment artificiel ou synthtique).
Nanmoins, si lon opte pour un sdiment naturel, il faudrait le caractriser, au moins quant au pH et la teneur
en carbone organique (la dtermination dautres paramtres, tels que le rapport C/N et la granulomtrie est aussi
recommande), et sassurer quil nest pas contamin et nabrite pas dautres organismes qui pourraient entrer en
comptition avec les chironomes ou les consommer. Avant dutiliser un sdiment naturel dans un essai de
toxicit sur les chironomes, il est galement recommand de le maintenir durant sept jours dans des conditions
identiques celles qui seront appliques durant lessai (conditionnement). Le sdiment reconstitu dcrit cidessous, bas sur le sol artificiel utilis dans la mthode dessai C.8 est recommand (14) (1) (15) (16):
a) 4-5 % (poids sec) de tourbe, avec un pH aussi proche que possible de 5,5 6,0; il est important dutiliser une
tourbe sous forme de poudre, finement broye (dimension des particules 1 mm) et sche uniquement
lair;
b) 20 % (poids sec) dargile kaolinique (teneur en kaolinite de prfrence suprieure 30 %);
c) 75-76 % (poids sec) de sable quartzique (compos en majorit de sable fin, plus de 50 % des particules
mesurant entre 50 et 200 m);
d) ajouter de leau dsionise jusqu ce que la teneur en humidit du mlange final atteigne 30 50 %;
e) ajouter du carbonate de calcium de qualit chimiquement pure (CaCO3) pour ajuster le pH du mlange final
de sdiments 7,0 0,5;
f) il convient dobtenir 2 % ( 0,5 %) de carbone organique dans le mlange final en y ajoutant les quantits
appropries de tourbe et de sable, comme indiqu en a) et en c).
14. Les sources de tourbe, dargile kaolinique et de sable doivent tre connues. On vrifiera que les composants du
sdiment ne sont pas contamins par des substances chimiques (par exemple des mtaux lourds, des composs
organochlors, organophosphors, etc.). Un exemple de prparation de sdiment reconstitu est dcrit lap
pendice 3. Les composants peuvent aussi tre mlangs ltat sec, condition de dmontrer quaprs lajout de
leau sus-jacente, les composants du sdiment ne se sparent pas (flottement de particules de tourbe, par
exemple) et que la tourbe ou le sdiment sont suffisamment conditionns.
L 81/201
L 81/202
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Eau
15. Toute eau conforme aux caractristiques chimiques dune eau de dilution acceptable selon les critres spcifis
aux appendices 2 et 4 convient lessai. Toute eau approprie, naturelle (eau superficielle ou souterraine),
reconstitue (voir appendice 2) ou eau du robinet dchlore, est acceptable comme eau pour llevage et les
essais si les chironomes y survivent sur toute la dure de llevage et de lessai sans manifester de signes de stress.
Au dbut de lessai, le pH de leau dessai se situera entre 6 et 9 et sa duret totale ne dpassera pas 400 mg/l en
CaCO3. Nanmoins, si lon suspecte une interaction entre les ions qui provoquent la duret et la substance
dessai, il faudra utiliser une eau moins dure (et ne pas employer le milieu Elendt M4 dans ce cas). Le mme type
deau doit tre utilis tout au long de ltude. Les caractristiques de la qualit de leau numres lappendice 4
sont mesurer au moins deux fois par an ou chaque fois que ses caractristiques sont susceptibles davoir t
significativement modifies.
Solutions mres eau charge
16. Les concentrations exprimentales sont calcules en fonction des concentrations dans la colonne deau recou
vrant le sdiment. Les solutions dessai sont gnralement prpares aux concentrations choisies par dilution
dune solution mre. Il est prfrable de prparer les solutions mres en dissolvant la substance dessai dans le
milieu dessai. Dans certains cas, il sera ncessaire dutiliser des solvants ou des dispersants pour obtenir une
solution mre la concentration voulue. Voici quelques exemples de solvants appropris: actone, thanol,
mthanol, thylneglycol, monothylther, dimthylther dthylneglycol, dimthylformamide et trithylnegly
col. Les dispersants qui peuvent tre utiliss sont le Cremophor RH40, le Tween 80, la mthylcellulose 0,01 %
et lHCO-40. La concentration de lagent solubilisant dans le milieu dessai final doit tre minimale ( 0,1 ml/l) et
identique dans tous les traitements. Lagent solubilisant, sil est utilis, ne doit pas avoir deffets significatifs sur la
survie, ni deffet nocif visible sur les larves de chironomes, et ce daprs lobservation des organismes du rcipient
tmoin trait uniquement au solvant. Nanmoins, lutilisation de ces substances est viter dans la mesure du
possible.
CONCEPTION DE LESSAI
17. La conception de lessai dfinit le nombre et lespacement des concentrations exprimentales, le nombre de
rcipients chaque concentration et le nombre de larves par rcipient. La marche suivre pour estimer une
valeur de CE, la CSEO et effectuer un essai limite est dcrite. Lanalyse de rgression est prfrable une
approche par vrification dhypothses.
Conduite dune analyse de rgression
18. La concentration efficace (par exemple, CE15, CE50) et la gamme de concentrations dans laquelle leffet de la
substance dessai est dintrt doivent tre couvertes par les concentrations incluses dans lessai. Gnralement,
lexactitude, et plus particulirement la validit, de lestimation des concentrations efficaces (CEx) saccroissent
lorsque la concentration efficace se situe dans la gamme des concentrations testes. Il faut viter dextrapoler des
rsultats trs en dessous de la concentration efficace la plus faible ou au-dessus de la concentration maximale. Il
est utile de conduire un essai prliminaire de dtermination de lordre de grandeur afin de dlimiter la gamme
des concentrations appliquer (voir paragraphe 27).
19. Sil faut estimer la CEx, au moins cinq concentrations et trois rptitions par concentration doivent tre testes.
En tout tat de cause, il est recommand de tester suffisamment de concentrations pour obtenir une bonne
estimation du modle. Le facteur sparant les concentrations ne doit pas excder deux (sauf dans les cas o la
courbe dose-effet prsente une pente faible). Le nombre de rptitions par traitement peut tre diminu si le
nombre de concentrations exprimentales entranant diffrents effets est augment. Laugmentation du nombre
de rptitions ou la contraction des intervalles entre les concentrations exprimentales tend rduire les
intervalles de confiance pour lessai. Le nombre de rptitions sera augment sil y a lieu destimer le taux de
survie et la croissance des larves aprs dix jours.
Procdure destimation dune CSEO/CMEO
20. Sil faut estimer la CMEO ou la CSEO, il convient de tester cinq concentrations exprimentales et au moins
quatre rptitions par concentration, le facteur sparant les concentrations nexcdant pas deux. Le nombre
dexpriences identiques doit tre tel quil fournit une puissance statistique permettant de dtecter une diffrence
de 20 % avec le tmoin, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). Sagissant de la vitesse de
dveloppement, une analyse de la variance (ANOVA) convient gnralement, telle que le test de Dunnett ou
le test de Williams (17) (18) (19) (20). Sagissant du taux dmergence, le test de Cochran-Armitage, le test exact
de Fisher (avec correction selon Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent tre utiliss.
Essai limite
21. Si lessai prliminaire de dtermination de lordre de grandeur des concentrations na engendr aucun effet, un
essai limite peut tre conduit (une concentration exprimentale et un tmoin). Lessai limite vise montrer que la
concentration toxique de la substance dessai est suprieure la concentration limite teste. Aucune concen
tration ne peut tre recommande pour cette mthode dessai; cela est laiss lapprciation des instances
rglementaires. Gnralement, il est ncessaire de mener au moins six rptitions pour les organismes traits
et les tmoins. Il y a lieu de dmontrer que la puissance statistique est suffisante pour rvler une diffrence de
20 % avec les tmoins, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). En ce qui concerne leffet sur la
vitesse de dveloppement et sur le poids, le test t constitue une mthode statistique approprie, si les donnes
respectent les conditions exiges par ce test (normalit, variances homognes). On pourra recourir au test t
variance ingale ou un test non paramtrique, tel que le test de Wilcoxon-Mann-Whitney si ces conditions ne
sont pas remplies. Sagissant du taux dmergence, le test exact de Fisher est appropri.
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MODE OPRATOIRE
Conditions dexposition
Prparation du systme eau charge-sdiment
22. Une quantit approprie de sdiment reconstitu (voir paragraphes 13-14 et appendice 3) est dpose dans les
rcipients exprimentaux, de faon former une couche dau moins 1,5 cm. La profondeur de leau verse sur ce
sdiment atteindra 6 cm (voir paragraphe 15). Le ratio entre la profondeur du sdiment et la profondeur de leau
nexcdera pas 1/4 et la couche de sdiment ne dpassera pas 3 cm. Le systme sdiment-eau sera laiss sous
aration lgre pendant 7 jours avant lajout des organismes dessai (voir paragraphe 14 et appendice 3). Afin
dviter la sparation des constituants du sdiment et la resuspension des particules fines durant le remplissage de
la colonne deau, on peut recouvrir le sdiment dun disque en plastique et retirer le disque juste aprs le
remplissage. Dautres dispositifs conviennent galement.
23. Les rcipients exprimentaux doivent tre couverts (par des plaques de verre, par exemple). On prendra soin de
remplacer les volumes deau vapore durant ltude, le cas chant, et ce avec de leau distille ou dsionise afin
dempcher laccumulation de sels.
Introduction des organismes dessai
24. Quatre cinq jours avant dintroduire les organismes dessai dans les rcipients, des amas dufs sont prlevs
dans les cultures et dposs dans de petits flacons contenant du milieu de culture. Un milieu plus ancien issu de
la culture mre tout comme un milieu frachement prpar peuvent tre utiliss. Si ce dernier est utilis, on
ajoutera une petite quantit de nourriture, par exemple des algues vertes et/ou quelques gouttes du filtrat dune
suspension de paillettes pour poissons finement broyes, au milieu de culture (voir appendice 2). Seuls des amas
dufs frachement pondus peuvent tre utiliss. Normalement, les larves commencent clore quelques jours
aprs la ponte (2 3 jours pour Chironomus riparius 20 C et 1 4 jours pour Chironomus tentans 23 C et
Chironomus yoshimatsui 25 C) et le dveloppement des larves se droule en quatre stades, dont chacun dure 4
8 jours. Cet essai se pratique au premier stade larvaire (2-3 ou 1-4 jours aprs lclosion). Il est possible de
vrifier le stade de dveloppement des moucherons daprs la largeur de la capsule cphalique (6).
25. Vingt larves au premier stade, choisies au hasard, sont dposes dans chaque rcipient contenant le sdiment
charg et leau, laide dune pipette mousse. Laration de leau doit tre interrompue ds quon introduit les
larves dans les rcipients exprimentaux, et ce durant 24 heures aprs lajout des larves (voir paragraphes 24 et
32). Selon le protocole exprimental suivi (voir paragraphes 19 et 20), le nombre de larves utilises par
concentration slve au moins 60 pour lestimation dune valeur de concentration efficace (CE) et 80
pour la dtermination de la CSEO.
26. Vingt-quatre heures aprs lintroduction des larves dans les rcipients exprimentaux, la substance dessai est
ajoute la colonne deau sus-jacente et une lgre aration est nouveau dispense. De petits volumes de la
solution contenant la substance dessai sont injects en dessous de la surface de la colonne deau laide dune
pipette. Ensuite, il convient de mlanger leau sus-jacente en prenant soin de ne pas remuer le sdiment.
27. Il peut tre utile de conduire un essai de dtermination de lordre de grandeur pour dlimiter la gamme de
concentrations appliquer dans lessai proprement dit. cet effet, on utilise une srie de concentrations
largement espaces de la substance dessai. Afin de reproduire la mme densit de surface par chironome que
dans lessai proprement dit, les chironomes sont exposs chaque concentration de la substance dessai durant
une priode permettant destimer les concentrations exprimentales appropries et aucune exprience identique
nest ncessaire.
28. Les concentrations exprimentales pour lessai dfinitif sont choisies en fonction des rsultats de lessai de
dtermination de lordre de grandeur. Au moins cinq concentrations doivent tre appliques et slectionnes
comme indiqu aux paragraphes 18 20.
Tmoins
29. Lessai comportera le nombre ncessaire de rcipients tmoins pourvus du sdiment mais exempts de toute
substance dessai (voir paragraphes 19-20). Si la substance dessai a t applique laide dun solvant (voir
paragraphe 16), il convient dajouter un tmoin dont le sdiment contient galement le solvant.
Systme exprimental
30. Des systmes statiques sont utiliss. Des systmes semi-statiques ou coulement continu avec renouvellement
intermittent ou continu de leau sus-jacente peuvent tre utiliss dans des cas exceptionnels, par exemple si les
spcifications de la qualit de leau deviennent inappropries pour lorganisme dexprience ou affectent lqui
libre chimique (si, par exemple, la concentration doxygne dissous devient trop basse, la concentration des
excrta augmente de faon trop importante ou si des minraux lessivs partir du sdiment affectent le pH et/ou
la duret de leau). Nanmoins, dautres mthodes damlioration de la qualit de leau sus-jacente, telles que
laration, seront normalement suffisantes et prfrables.
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Alimentation
31. Les larves ont besoin dtre nourries, de prfrence quotidiennement ou au moins trois fois par semaine. Durant
les dix premiers jours, chaque jeune larve recevra quotidiennement 0,25 0,5 mg (0,35-0,5 mg pour C.
yoshimatsui) de nourriture pour poissons (suspendue dans leau ou finement broye, par exemple TetraMin ou
TetraPhyll; voir les dtails lappendice 2). Il peut tre ncessaire daugmenter lgrement cette quantit pour les
larves plus ges: 0,5-1 mg par larve et par jour devrait suffire pour le reste de lessai. On diminuera la ration
alimentaire de tous les organismes traits et tmoins si des champignons se dveloppent ou si des organismes
tmoins meurent. Si la croissance fongique savre impossible enrayer, lessai doit tre renouvel. Si lessai porte
sur des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log Koe > 5) ou des substances lies de faon
covalente au sdiment, la quantit de nourriture ncessaire la survie et la croissance naturelle des organismes
peut tre incorpore au sdiment reconstitu avant la priode de stabilisation. Dans ce cas, la nourriture pour
poissons est remplace par une ration vgtale, par exemple 0,5 % (poids sec) de feuilles finement broyes dortie
(Urtica dioica), de mrier (Morus alba), de trfle blanc ou rampant (Trifolium repens), dpinard (Spinacia oleracea) ou
dun autre matriau vgtal (Cerophyl ou alpha-cellulose).
Conditions dincubation
32. Leau sus-jacente est soumise une lgre aration, mise en uvre de prfrence 24 heures aprs lintroduction
des larves et maintenue jusqu la fin de lessai (il faut veiller ce que la concentration doxygne dissous ne
tombe pas en dessous de 60 % de la valeur de saturation en air). Lair est insuffl travers une pipette Pasteur en
verre fixe 2 3 cm au-dessus de la couche de sdiment (une ou quelques bulles par seconde). Si la substance
dessai est volatile, il faudra ventuellement supprimer laration.
33. Lessai est men temprature constante (20 C 2 C). Pour C. tentans et C. yoshimatsui, les tempratures
recommandes slvent respectivement 23 C et 25 C ( 2 C). La photopriode est de 16 heures et lclai
rement compris entre 500 et 1 000 lux.
Dure de lexposition
34. Lexposition dbute avec lintroduction des larves dans les rcipients traits et tmoins. La dure maximale
dexposition atteint 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et 65 jours pour C. tentans. Si les moucherons
mergent plus tt, lessai peut sachever au moins cinq jours aprs lmergence du dernier adulte tmoin.
OBSERVATIONS
mergence
35. La dure du dveloppement et le nombre total de moucherons mles et femelles adultes totalement mergs sont
dterminer. Les mles sont faciles identifier grce leurs antennes plumeuses.
36. Au moins trois fois par semaine, on vrifiera que les organismes des rcipients dessai ne manifestent aucun
comportement anormal (sortie du sdiment, nage inhabituelle, par exemple) par rapport aux tmoins. Chaque
jour, durant la priode suppose de lmergence, il faut compter le nombre de moucherons mergs et consigner
le sexe et le nombre de moucherons compltement mergs. Une fois identifis, les moucherons sont retirs des
rcipients. Tout amas dufs dpos avant la fin de lessai doit tre recens puis enlev afin dempcher la
rintroduction de larves dans le sdiment. Le nombre de pupes visibles nayant pas russi merger est aussi
enregistr. Des indications sur la faon de mesurer lmergence sont donnes lappendice 5.
Croissance et survie
37. Sil faut fournir des donnes sur la survie et la croissance des larves aprs 10 jours, des rcipients exprimentaux
supplmentaires seront inclus ds le dbut de lessai, pour pouvoir tre utiliss ultrieurement. Le sdiment de
ces rcipients supplmentaires est tamis travers des mailles de 250 m pour retenir les larves. La mort est
dtermine par deux critres: limmobilit et labsence de raction un stimulus mcanique. Les larves non
rcupres doivent aussi tre comptabilises parmi les mortes (les larves qui sont mortes au dbut de lessai ont
pu tre dgrades par des microbes). Aprs avoir dtermin le poids sec (sans cendres) des larves survivantes par
rcipient exprimental, on calcule le poids sec individuel moyen par rcipient. Il est utile dtablir quel stade se
trouvent les larves survivantes, et ce daprs la largeur de la capsule cphalique de chaque individu.
Mesures analytiques
Concentration de la substance dessai
38. Il est recommand danalyser, au minimum, des chantillons de leau sus-jacente, de leau interstitielle, et du
sdiment, au dbut (de prfrence une heure aprs lapplication de la substance dessai) et la fin de lessai, et ce
pour la concentration la plus leve et pour une concentration plus faible. La concentration de la substance
dessai nous renseigne sur le comportement et la rpartition de la substance dessai dans le systme eau-sdiment.
Le prlvement dchantillons de sdiment au dbut de lessai risque de perturber le systme dessai (enlvement
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de larves, par exemple), il faut donc inclure des rcipients exprimentaux supplmentaires pour effectuer des
dterminations analytiques au dbut de lessai et, sil y a lieu, au cours de lessai (voir paragraphe 39). Il nest pas
forcment ncessaire danalyser le sdiment si la rpartition de la substance dessai entre leau et le sdiment a t
clairement dtermine par une tude eau/sdiment mene dans des conditions comparables (par exemple,
quotient sdiment/eau, type dapplication, teneur en carbone organique du sdiment).
39. Lorsquon effectue des mesures intermdiaires (par exemple au septime jour) et si lanalyse requiert des chan
tillons volumineux qui ne peuvent tre prlevs des rcipients sans influencer le systme exprimental, les
analyses seront pratiques sur des chantillons provenant de rcipients exprimentaux supplmentaires traits
de la mme faon (y compris par la prsence des organismes dessai), mais non utiliss pour les observations
biologiques.
40. Pour isoler leau interstitielle, on recommande de centrifuger des chantillons 10 000 g et 4 C durant
30 minutes. Cependant, sil est dmontr que la substance dessai ne sadsorbe pas sur les filtres, la filtration est
galement acceptable. Avec des chantillons trop petits, il arrive que les concentrations dans leau interstitielle
soient impossibles analyser.
Paramtres physico-chimiques
41. Le pH, loxygne dissous dans leau dessai et la temprature des rcipients exprimentaux doivent tre mesurs
de faon approprie (voir paragraphe 10). La duret de leau et la teneur en ammoniac sont mesures dans les
rcipients tmoins et dans un rcipient trait la concentration la plus leve, au dbut et la fin de lessai.
RSULTATS ET RAPPORT
42. Cet essai vise dterminer leffet de la substance dessai sur la vitesse de dveloppement et le nombre total de
moucherons mles et femelles totalement mergs ou, dans le cas de lessai de 10 jours, les effets sur la survie et
le poids des larves. Si rien nindique que les deux sexes prsentent des diffrences statistiques de sensibilit, les
rsultats obtenus sur les mles et les femelles peuvent tre regroups pour lanalyse statistique. Les diffrences de
sensibilit entre les sexes peuvent tre apprcies statistiquement par un test (de tableau) a 2 - r x 2, par
exemple. La survie des larves et le poids sec individuel moyen par rcipient doivent tre dtermins aprs dix
jours, le cas chant.
43. Il est prfrable de calculer les concentrations efficaces, exprimes en concentrations dans leau sus-jacente, en
fonction des concentrations mesures au dbut de lessai (voir paragraphe 38).
44. Pour estimer ponctuellement la CE50 ou une quelconque CEx, les statistiques par rcipient peuvent tre utilises
comme des expriences identiques proprement dites. Lorsquon calcule un intervalle de confiance pour une
quelconque CEx, il faut tenir compte de la variabilit entre les rcipients ou montrer que celle-ci est ngligeable.
Si le modle est ajust par la mthode des moindres carrs, il convient dappliquer une transformation des
donnes pour les statistiques par rcipient afin daccrotre lhomognit de la variance. Toutefois, les valeurs de
la CEx sont calculer aprs que les rsultats ont t retransforms de faon recouvrer leur valeur originale.
45. Si lanalyse statistique vise dterminer la CSEO/CMEO par la vrification dhypothses, la variabilit entre les
rcipients doit tre prise en compte, par exemple laide dune analyse de la variance (ANOVA) embote. Par
contre, des tests plus robustes (21) peuvent tre utiliss au cas o les hypothses habituelles de lanalyse de la
variance ne se vrifient pas.
Taux dmergence
46. Le taux dmergence donne une rponse par tout ou rien et peut tre analys par le test de Cochran-Armitage
appliqu de faon rgressive si la relation dose-effet est suppose tre monotone et si les taux dmergence
corroborent cette hypothse. Dans le cas contraire, un test exact de Fisher ou un test de Mantel-Haenszel avec
des valeurs de p corriges selon Bonferroni-Holm peuvent tre employs. Sil savre que la variabilit entre
expriences identiques la mme concentration est suprieure ce quune distribution binomiale indiquerait
(variation souvent qualifie dextra-binomiale), on appliquera un test plus robuste (Cochran-Armitage ou test
exact de Fisher) comme propos la rfrence (21).
47. La somme des moucherons mergs par rcipient, ne, est dtermine et divise par le nombre de larves
introduites, na:
TE
o:
TE = taux dmergence
ne = nombre de moucherons mergs par rcipient
ne = nombre de larves introduites par rcipient
ne
na
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FR
48. Une variante plus approprie aux chantillons de grande taille, lorsque la variance est extra-binomiale, consiste
traiter le taux dmergence comme une rponse continue et appliquer une mthode telle que le test de
Williams, si la relation dose-effet est suppose tre monotone et si les rsultats du taux dmergence corroborent
cette hypothse. Le test de Dunnett convient dans le cas o la relation ne savre pas monotone. Ici, on considre
quun chantillon est de grande taille lorsque le nombre de moucherons mergs et le nombre de chironomes
non mergs dpassent chacun cinq, par rcipient dessai.
49. Pour appliquer lanalyse de la variance (ANOVA), il convient dappliquer aux valeurs de TE une transformation
arcsinus-racine carre ou Freeman-Tukey afin dobtenir une distribution proche de la normale et dgaliser les
variances. Le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction de Bonferroni) ou le test de
Mantel-Haenszel peuvent tre employs lorsquon utilise des frquences absolues. La transformation arcsinusracine carre consiste calculer linverse du sinus (sinus-1) de la racine carre du TE.
50. Pour les taux dmergence, les valeurs de la CEx sont calcules par une analyse de rgression [ou par probit (22),
logit, Weibull, des logiciels commerciaux appropris, etc.]. Si lanalyse de la rgression choue (par exemple,
lorsquil y a moins de deux rponses partielles), on fait appel dautres mthodes non paramtriques telles que la
moyenne mobile ou une simple interpolation.
Vitesse de dveloppement
51. La priode moyenne de dveloppement reprsente le temps moyen coul entre lintroduction des larves (jour 0
de lessai) et lmergence de la cohorte exprimentale de moucherons (pour calculer la priode relle de
dveloppement, il faut tenir compte de lge des larves au moment de lintroduction). La vitesse de dveloppe
ment est linverse de la priode de dveloppement (unit: 1/jour) et reprsente la partie du dveloppement
larvaire qui seffectue par jour. Pour valuer la toxicit dans les sdiments, il est prfrable de choisir la vitesse de
dveloppement car sa variance est plus faible et ses valeurs sont plus homognes et plus proches dune
distribution normale, en comparaison avec la priode de dveloppement. Cest pourquoi les tests paramtriques
puissants conviennent mieux la vitesse de dveloppement qu la priode de dveloppement. Si la vitesse de
dveloppement est traite comme une rponse continue, les valeurs de la CEx peuvent tre estimes par lanalyse
de la rgression, par exemple (23), (24).
52. Pour les tests statistiques suivants, le nombre de moucherons observs le jour x sont considrs comme ayant
merg au milieu de lintervalle de temps compris entre le jour x et le jour x - 1 (1 = longueur de lintervalle
dobservation, habituellement 1 jour). La vitesse de dveloppement moyenne par rcipient (x) est calcule comme
suit:
x
m
X
i xi
i1
ne
o:
x:
vitesse de dveloppement moyenne par rcipient
i:
indice de lintervalle dobservation
m:
nombre maximal dintervalles dobservation
i :
nombre de moucherons mergs durant lintervalle dobservation i

P
nombre total de moucherons mergs la fin de lexprience (= i )
n e:
xi:
vitesse de dveloppement des moucherons mergs durant lintervalle i
li
xi 1= jouri
2
o:
jouri: jour dobservation (compt partir de lapplication)
li:
dure de lintervalle dobservation i (exprime en jours, habituellement 1 jour)
Rapport dessai
53. Le rapport dessai doit fournir au moins les informations suivantes:
Substance dessai:
tat physique et, sil y a lieu, proprits physico-chimiques (hydrosolubilit, pression de vapeur, coefficient de
partage dans le sol (ou dans le sdiment sil est connu), stabilit dans leau, etc.),
identification chimique (nom courant, nom chimique, formule structurale, numro CAS, etc.), puret et
mthode danalyse pour la quantification de la substance dessai.
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Espce dessai:
animal dessai utilis: espce, nom scientifique, source et conditions dlevage,
informations sur la manipulation des amas dufs et des larves,
ge des animaux dexprience au moment o ils ont t dposs dans les rcipients dessai.
sdiment utilis, cest--dire naturel ou reconstitu,
pour les sdiments naturels: localisation et description du site de prlvement et notamment, si possible, son
histoire en matire de contamination; caractristiques: pH, teneur en carbone organique, quotient C/N et
granulomtrie, le cas chant,
prparation du sdiment reconstitu: ingrdients et caractristiques (teneur en carbone organique, pH, humi
dit, etc. au dbut de lessai),
prparation de leau dessai (si leau est reconstitue) et caractristiques (concentration doxygne, pH, conduc
tivit, duret, etc. au dbut de lessai),
profondeur du sdiment et de leau sus-jacente,
volume de leau sus-jacente et de leau interstitielle; poids du sdiment humide avec et sans eau interstitielle,
rcipients exprimentaux (matriau et dimension),
mthode de prparation des solutions mres et des concentrations exprimentales,
application de la substance dessai: concentrations exprimentales utilises, nombre dexpriences identiques
et utilisation dun solvant, le cas chant,
conditions dincubation: temprature, cycle et intensit de lumire, aration (frquence et intensit),
informations dtailles sur la nourriture: type de nourriture, prparation, quantit et rgime dadministration.
Rsultats:
concentrations dessai nominales, concentrations dessai mesures et rsultats de toutes les analyses conduites
pour dterminer la concentration de la substance dessai dans le rcipient exprimental,
qualit de leau dans les rcipients exprimentaux: pH, temprature, oxygne dissous, duret et teneur en
ammoniac,
remplacement de leau dessai vapore, le cas chant,
nombre de moucherons mles et femelles mergs par rcipient et par jour,
nombre de larves non merges sous la forme de moucherons par rcipient,
poids sec individuel moyen des larves par rcipient, et par stade larvaire, sil y a lieu,
pourcentage dmergence par exprience identique et par concentration dessai (regroupement des rsultats
pour les moucherons mles et femelles),
vitesse de dveloppement moyenne des moucherons totalement mergs par exprience identique et par
concentration dessai (regroupement des rsultats pour les moucherons mles et femelles),
estimation des effets toxiques observs, par exemple CEx (et intervalles de confiance associs), CSEO et/ou
CMEO, et mthodes statistiques employes pour les dterminer,
analyse des rsultats, y compris les rpercussions sur les rsultats dun cart ventuel la prsente mthode
dessai.
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FR
BIBLIOGRAPHIE:
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(14) Chapitre C.8 de la prsente annexe, Toxicit pour les vers de terre.
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Appendice 1
DFINITIONS
Les dfinitions suivantes sappliquent aux fins de la prsente mthode dessai:
Le sdiment reconstitu, ou artificiel ou synthtique, dsigne le mlange de matriaux utiliss pour reproduire au mieux
les composants physiques dun sdiment naturel.
Leau sus-jacente est leau recouvrant le sdiment dans le rcipient dessai.
Leau interstitielle, ou leau des pores, se rfre leau qui occupe les vides laisss entre le sdiment et les particules
de sol.
Leau charge est leau dessai laquelle on a ajout la substance dessai.
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Appendice 2
Recommandations pour la culture de Chironomus riparius
1. Les larves de Chironomus peuvent tre leves dans des cristallisoirs ou de grands rcipients. Du sable quartzique fin
est dpos en couche mince (environ 5 10 mm dpaisseur) sur le fond du rcipient. Le Kieselguhr (par exemple
lart. 8117 de Merck) convient aussi comme substrat (une couche encore plus mince de quelques millimtres peine
suffit). Une eau de qualit approprie, profonde de plusieurs centimtres, vient ensuite recouvrir le substrat. En cas
dvaporation, le niveau deau doit toujours tre ramen sa hauteur initiale, afin de prvenir toute dessiccation. Leau
peut tre remplace, si ncessaire. Une lgre aration est fournie. Les rcipients dlevage des larves doivent tre
placs dans des cages appropries, afin dempcher la fuite des adultes mergeant. La cage sera suffisamment grande
pour permettre aux adultes mergs dessaimer, sans quoi la copulation risque de ne pas avoir lieu (dimensions
minimales: 30 30 30 cm).
2. Les cages doivent tre gardes temprature ambiante, ou 20 2 C si elles sont places dans une chambre
ambiance constante, avec une photopriode de 16 heures de lumire (intensit: environ 1 000 lux) et 8 heures
dobscurit. Une humidit relative de lair infrieure 60 % pourrait empcher la reproduction.
Eau de dilution
3. Toute eau naturelle ou reconstitue approprie peut tre utilise. Leau dun puits, de leau du robinet dchlore et un
milieu artificiel (Elendt M4 ou M7, voir ci-aprs) sont souvent utiliss. Leau doit tre are avant lemploi. Si
ncessaire, on peut renouveler leau de culture en versant ou en siphonnant soigneusement leau use des rcipients
exprimentaux, sans dtruire les tubes des larves.
Alimentation des larves
4. Les larves de Chironomus reoivent des paillettes pour poissons (Tetra Min, Tetra Phyll ou une autre marque
dpose quivalente), raison denviron 250 mg par rcipient et par jour. Cette nourriture peut tre administre sous
la forme dune poudre moulue sec ou dune suspension dans leau: 1,0 g de paillettes ajoutes 20 ml deau de
dilution et agites de faon obtenir un mlange homogne. Cette prparation peut tre administre raison
denviron 5 ml par rcipient et par jour (agiter avant emploi). Les larves plus ges peuvent en recevoir plus.
5. La nourriture est ajuste en fonction de la qualit de leau. Si le milieu de culture devient trouble, il convient de
rduire la ration. Les quantits de nourriture donnes sont soigneusement notes. Un manque de nourriture fera
migrer les larves vers la colonne deau, tandis quun excs de nourriture intensifiera lactivit microbienne et abaissera
la concentration doxygne. Ces deux conditions sont susceptibles de ralentir la croissance des organismes.
6. Certaines cellules dalgues vertes (Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) peuvent aussi tre ajoutes lors de la
prparation de nouveaux rcipients de culture.
Alimentation des adultes mergeant
7. Certains exprimentateurs ont suggr de nourrir les adultes mergs au moyen dun tampon douate imbib dune
solution de sucrose sature.
mergence
8. 20 2 C, les adultes commencent merger des rcipients dlevage des larves aprs environ 13 15 jours. Il est
facile de distinguer les mles daprs leurs antennes plumeuses.
Amas dufs
9. Ds que des adultes sont prsents dans la cage dlevage, il faut vrifier trois fois par semaine, dans tous les rcipients
dlevage de larves, si des amas dufs glatineux nont pas t dposs. Le cas chant, les amas dufs doivent tre
soigneusement enlevs et transfrs dans un petit rcipient contenant un chantillon de leau dlevage. Les amas
dufs sont utiliss pour prparer un nouveau rcipient de culture (2 4 amas dufs par rcipient, par exemple) ou
pratiquer des essais de toxicit.
10. Les larves au premier stade devraient clore aprs 2-3 jours.
Prparation de nouveaux rcipients de culture
11. Une fois que les cultures ont t lances, il devrait tre possible de prparer un nouveau rcipient de culture de larves,
une fois par semaine ou moins souvent, suivant les besoins de lessai, et de retirer les rcipients plus anciens aprs
que les moucherons adultes ont merg. Ce systme permet dobtenir rgulirement un contingent dadultes, avec une
organisation minimale.
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Prparation des solutions dessai M4 et M7

12. Elendt (1990) a dcrit le milieu M4. Le milieu M7 est prpar comme le milieu M4, sauf pour les substances
reprises au tableau 1, dont les concentrations sont quatre fois plus faibles dans le milieu M7 que dans le milieu
M4. Une publication sur le milieu M7 est en prparation (Elendt, communication personnelle). La solution dessai
ne doit pas tre prpare selon les instructions dElendt et Bias (1990), car les concentrations de NaSiO3 5 H2O,
NaNO3, KH2PO4 et K2HPO4 indiques pour la prparation des solutions mres ne conviennent pas.
Prparation du milieu M7
13. Chaque solution mre (I) est prpare sparment et une solution mre combine (II) est prpare partir de ces
solutions mres (I) (voir tableau 1). 50 ml de la solution mre combine (II) additionns de la quantit de chaque
solution mre de macronutriments indique au tableau 2 sont amens 1 l avec de leau dsionise pour composer le
milieu M7. On prpare une solution mre de vitamines en ajoutant trois vitamines de leau dsionise, comme
indiqu au tableau 3 et on verse 0,1 ml de la solution mre combine de vitamines au milieu M7 final, peu avant
lemploi (la solution mre de vitamines est stocke congele par petites aliquotes). Le milieu est ar et stabilis
Tableau 1
Solutions mres dlments en traces pour les milieux M4 et M7
Solutions mres (I)
Pour prparer la solution mre

Quantit (mg)
combine (II): mlanger les
pour former
quantits suivantes (ml) de
une solution
solutions mres (I) et complter
d'un litre avec
un litre avec de leau dsionise
de leau dsioni
se
M4
M7

solutions exprimentales (mg/l)
M4
M7
H3BO3 (1)
57 190
1,0
0,25
2,86
0,715
MnCl2 4 H2O (1)
7 210
1,0
0,25
0,361
0,090
LiCl (1)
6 120
1,0
0,25
0,306
0,077
RbCl (1)
1 420
1,0
0,25
0,071
0,018
SrCl2 6 H2O (1)
3 040
1,0
0,25
0,152
0,038
320
1,0
0,25
0,016
0,004
1 260
1,0
0,25
0,063
0,016
CuCl2 2 H2O (1)
335
1,0
0,25
0,017
0,004
ZnCl2
260
1,0
1,0
0,013
0,013
CaCl2 6 H2O
200
1,0
1,0
0,010
0,010
KI
65
1,0
1,0
0,0033
0,0033
Na2SeO3
43,8
1,0
1,0
0,0022
0,0022
NH4VO3
11,5
1,0
1,0
0,00058
0,00058
Na2EDTA 2 H2O (1) (2)
5 000
20,0
5,0
2,5
0,625
FeSO4 7 H2O (1) (2)
1 991
20,0
5,0
1,0
0,249
NaBr (1)
Na2MoO4 2 H2O (1)
(1) Ces substances sont doses diffremment dans M4 et M7, comme indiqu plus haut.
(2) Ces solutions sont prpares sparment, puis mlanges et autoclaves immdiatement aprs.
Tableau 2
Solutions mres de macronutriments pour les milieux M4 et M7
Concentrations finales dans
les solutions exprimentales
pour prparer les milieux
leau dsionise
M4 et M7
M4 et M7
(mg)
(mg/l)
(ml/l)
CaCl2 2 H2O
293 800
1,0
293,8
MgSO4 7 H2O
246 600
0,5
123,3
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les solutions exprimentales
pour prparer les milieux
M4 et M7
leau dsionise
M4 et M7
(mg/l)
(mg)
(ml/l)
KCl
58 000
0,1
5,8
NaHCO3
64 800
1,0
64,8
NaSiO3 9 H2O
50 000
0,2
10,0
NaNO3
2 740
0,1
0,274
KH2PO4
1 430
0,1
0,143
K2HPO4
1 840
0,1
0,184
Tableau 3
Solution mre de vitamines pour les milieux M4 et M7
Les trois solutions de vitamines sont mlanges de faon ne former quune solution mre de vitamines.
leau dsionise
(mg)

de vitamines ajoutes pour
les solutions dessai
prparer les milieux
M4 et M7
M4 et M7
(mg/l)
(ml/l)
Hydrochlorure de thiamine
750
0,1
0,075
Cyanocobalamine (B12)
10
0,1
0,0010
Biotine
7,5
0,1
0,00075
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BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited
by M. Streloke and H. Kpp. Berlin 1995.
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Appendice 3
PRPARATION DU SDIMENT RECONSTITU
Composition du sdiment
Le sdiment sera reconstitu comme suit:
Ingrdient
Caractristiques
% du sdiment
poids sec
Tourbe
Tourbe de sphaigne, pH aussi proche que possible de 5,5-6,0, pas de

rsidus de plantes visibles, finement broye, particules ( 1 mm) et
sche lair
4-5
Sable quartzique
Dimension des particules: > 50 % des particules doivent mesurer entre

50 et 200 m
75-76
Argile kaolinique
Taux de kaolinite 30 %
Carbone organique
Ajust par laddition de tourbe et de sable
Carbonate de calcium
CaCO3, pulvris, chimiquement pur
Eau
Conductivit 10 S/cm
20
2 ( 0,5)
0,05 - 0,1
30 - 50
Prparation
La tourbe est sche lair et broye en poudre fine. Une suspension de la quantit requise de poudre de tourbe dans de
leau dsionise est prpare laide dun homognisateur haute performance. Le pH de cette suspension est ajust
5,5 0,5 avec du CaCO3. La suspension est conditionne durant au moins deux jours en lagitant doucement 20 2 C,
afin de stabiliser le pH et dtablir une flore microbienne stable. Le pH est vrifi nouveau; il devrait atteindre 6,0 0,5.
Ensuite la suspension de tourbe est mlange avec les autres ingrdients (sable et argile kaolinique) et de leau dsionise
pour former un sdiment homogne avec une teneur en eau de 30 50 % du poids sec du sdiment. Le pH du mlange
final est encore mesur et ajust 6,5-7,5 avec du CaCO3, si ncessaire. On prlve des chantillons de sdiment afin de
dterminer le poids sec et la teneur en carbone organique. Ensuite, avant dutiliser le sdiment reconstitu dans lessai de
toxicit sur les chironomes, il est recommand de le conditionner durant sept jours dans des conditions identiques celles
qui seront appliques durant lessai subsquent.
Stockage
Les ingrdients secs destins la prparation du sdiment artificiel peuvent tre entreposs dans un endroit sec et frais,
temprature ambiante. Le sdiment reconstitu (humide) ne doit pas tre stock avant son utilisation dans lessai. Il doit
tre utilis immdiatement aprs la priode de conditionnement de sept jours qui achve sa prparation.
BIBLIOGRAPHIE:
Chapitre C.8 de la prsente annexe: Toxicit pour les vers de terre.
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachloro
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10-20.
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Appendice 4
Caractristiques chimiques dune eau de dilution acceptable
Substance
Concentrations
Matires particulaires
< 20 mg/l
Carbone organique total
< 2 mg/l
Ammoniac non ionis
< 1 g/l
Duret en CaCO3
< 400 mg/l (*)
Chlore rsiduel
< 10 g/l
Totalit des pesticides organophosphors
< 50 ng/l
Totalit des pesticides organochlors et des biphnyles polychlors
< 50 ng/l
Chlore organique total
< 25 ng/l
(*) Sil risque dy avoir une interaction entre les ions qui provoquent la duret de leau et la substance dessai, il convient dutiliser une eau
moins dure (auquel cas, le milieu Elendt M4 ne pourra pas tre utilis).
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Appendice 5
Conseils pour suivre lmergence des larves de chironomes
Les bchers exprimentaux sont coiffs par des piges mergence, du 20e jour jusqu la fin de lessai. Le schma cidessous illustre un exemple de pige:
A: toile de nylon.
B: coupelles en plastique renverses.
C: bcher exprimental sans bec.
D: ouvertures recouvertes de toile par o seffectuent les changes

deau.
E: eau.
F: sdiment.
C.29. BIODGRADABILIT FACILE DGAGEMENT DE CO2 DANS DES FLACONS

HERMTIQUEMENT CLOS (ESSAI DE LESPACE DE TTE AU-DESSUS DU LIQUIDE)
INTRODUCTION
1.
chimiques. Cette mthode de criblage permet de classer les substances chimiques en fonction de leur biod
gradabilit facile et fournit des informations semblables celles exposes dans les six mthodes dessai (A F)
dcrites au chapitre C.4 de la prsente annexe. Par consquent, une substance chimique livrant un rsultat positif
pour cet essai de lespace de tte peut tre considre comme facilement biodgradable et donc rapidement
dgradable dans lenvironnement.
2.
Lessai, dsormais bien mis au point, de dgagement de CO2 (1), bas sur lessai original de Sturm (2), qui permet
dvaluer la biodgradabilit des produits chimiques organiques daprs la mesure du dioxyde de carbone produit
par lactivit microbiologique, est normalement celui qui se prte le mieux lessai des substances chimiques peu
solubles et celles fortement adsorbantes. Il est galement choisi pour les substances solubles (mais non volatiles)
puisque beaucoup considrent que le dgagement de dioxyde de carbone constitue la seule preuve irrfutable de
lactivit microbiologique. La disparition du carbone organique dissous peut faire intervenir des processus
physico-chimiques (adsorption, volatilisation, prcipitation, hydrolyse) ainsi que laction microbiologique et de
nombreuses ractions non-biologiques consommant de loxygne; il est rare que le CO2 soit produit partir de
produits chimiques organiques par un processus abiotique. Dans les essais original et modifi
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de Sturm (1) (2), le CO2 est extrait de la phase liquide et envoy dans des rcipients absorbants par barbotage
(passage bulle bulle dair trait travers le milieu liquide pour liminer le CO2), alors que dans la version de
Larson (3) (4), lors de son transfert du racteur vers labsorbeur, le CO2 traverse un espace de tte contenant de
lair exempt de CO2, tandis que le racteur est agit en continu. Le racteur nest agit que dans la version de
Larson modifie; lagitation nest prescrite que pour les substances insolubles dans la norme ISO 9439 (5) et dans
la version originale des tats-Unis (6), qui prescrivent toutes deux le barbotage plutt que le remplacement de
lespace de tte. Dans une autre mthode officielle (7) de lAgence des tats-Unis pour la protection de lenvi
ronnement (US EPA), base sur la mthode de Gledhill (8), le racteur agit est ferm latmosphre et le CO2
produit est directement recueilli de la phase gazeuse dans un pige alcalin interne, comme dans les respiromtres
classiques de Warburg/Barcroft.
3.
Il a toutefois t dmontr que le carbone inorganique saccumule dans le milieu durant lapplication de lessai
standard modifi de Sturm plusieurs substances chimiques (9). La dgradation de laniline 20 mg C/l a
produit une concentration assez leve de carbone inorganique, savoir 8 mg/l. Autrement dit, la collecte de
CO2 dans les piges alcalins na pas reflt la quantit relle de CO2 produite par des processus microbiologiques
des moments intermdiaires au cours de la dgradation. Par consquent, la prescription selon laquelle une
production de CO2 suprieure 60 % de la production maximale thorique (ThCO2) doit tre atteinte dans un
intervalle de 10 jours (les dix jours suivant immdiatement le franchissement du seuil de 10 % de biodgrada
tion) pour une substance dessai classer comme facilement biodgradable, ne pourra tre respecte pour
certaines substances qui rentreraient dans cette classification daprs la disparition du carbone organique dissous.
4.
Lorsque le pourcentage de dgradation est infrieur au niveau attendu, il est probable que du carbone inorga
nique se soit accumul dans la solution exprimentale. ce moment-l, la dgradabilit peut tre value avec
les autres essais de biodgradabilit facile.
5.
Dautres inconvnients de la mthode de Sturm (laborieuse, longue, davantage sujette des erreurs exprimen
tales et non applicable aux substances volatiles) avaient dj incit les chercheurs sorienter vers une technique
en flacon hermtiquement clos, autre que celle de Gledhill, plutt que dutiliser un coulement gazeux continu
(10) (11). Boatman et al. (12) ont rexamin les mthodes prcdentes et adopt un systme despace de tte
ferm dans lequel le CO2 est libr dans lespace de tte la fin de lincubation moyennant une acidification du
milieu. Le CO2 tait mesur par chromatographie gazeuse (carbone inorganique) dans des chantillons prlevs
automatiquement de lespace de tte, mais le carbone inorganique dissous dans la phase liquide ntait pas pris
en compte. En outre, les rcipients utiliss taient trs petits (20 ml) et ne contenaient que 10 ml de milieu, ce
qui engendrait des problmes, par exemple lorsquon ajoutait des quantits forcment trs petites de substances
dessai insolubles, et/ou du fait que le milieu inocul risquait de ne pas renfermer (suffisamment) de microorganismes capables de dgrader les substances dessai.
6.
Ces problmes ont t rsolus par les tudes indpendantes de Struijs et Stoltenkamp (13) et de Birch et Fletcher
(14), ces derniers stant inspirs de leur exprience avec les appareils utiliss dans lessai de biodgradation
anarobie (15). Dans la premire mthode (13), le CO2 est mesur dans lespace de tte aprs acidification et
quilibrage, tandis que dans la seconde (14), le carbone inorganique dissous est mesur dans les phases gazeuse
et liquide, sans traitement; plus de 90 % du carbone inorganique form tait prsent dans la phase liquide. Ces
deux mthodes prsentent des avantages sur lessai de Sturm du fait que le systme exprimental est plus
compact et maniable, quelles sappliquent aussi aux substances volatiles et que le risque de retard dans la
mesure du CO2 produit est cart.
7.
Ces deux approches ont t combines dans la norme ISO (essai au CO2 espace de tte) (16) qui a fait lobjet
dun essai circulaire (17) et qui forme la base de la prsente mthode dessai. Ces deux approches ont galement
t appliques dans la mthode de lUS EPA (18). Deux mthodes de mesure du CO2 ont t recommandes,
savoir le CO2 dans lespace de tte aprs acidification (13) et le carbone inorganique dans la phase liquide aprs
lajout dun excs de base. Cette dernire mthode a t introduite par Peterson au cours de lessai circulaire,
conduit par le CONCAWE (19), de cette mthode de lespace de tte modifie pour mesurer la biodgradabilit
intrinsque. Les changements apports par la rvision effectue en 1992 (20) des mthodes contenues dans le
chapitre C.4 de la prsente annexe pour les essais de biodgradabilit facile ont t incorpors dans la prsente
mthode dessai, si bien que les conditions (milieu, dure, etc.) sont par ailleurs identiques celles de lessai
modifi de Sturm (20). Birch et Fletcher (14) ont montr que, sur les mmes substances, lessai de lespace de tte
livrait des rsultats trs proches de ceux de lessai circulaire organis par lOCDE des mthodes dessai rvises
(21).
PRINCIPE DE LESSAI
8.
Une population mixte de micro-organismes est ensemence dans un milieu tampon compos de sels minraux,
o la substance dessai, gnralement une concentration de 20 mg C/l, reprsente la seule source de carbone et
dnergie. Lessai est conduit dans des flacons hermtiquement clos comportant un espace de tte dair, qui sert
de rserve doxygne pour la biodgradation arobie. On dtermine le CO2 dgag par la biodgradation arobie
finale de la substance dessai en mesurant lexcdent de carbone inorganique produit dans les flacons dessai par
rapport au carbone inorganique produit dans les flacons tmoins blanc ne renfermant que le milieu ense
menc. Le degr de biodgradation est exprim en pourcentage de la production maximale thorique de carbone
inorganique (ThCI), daprs la quantit de substance dessai (en carbone organique) ajoute au dpart.
9.
La disparition de carbone organique dissous et/ou le niveau de la biodgradation primaire de la substance dessai
peuvent aussi tre mesurs (20).
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10. Il faut connatre la teneur (% poids) en carbone organique de la substance dessai, daprs sa structure chimique
ou par une mesure, de faon pouvoir calculer le pourcentage de dgradation. Dans le cas des substances dessai
volatiles, il est utile de mesurer ou de calculer la constante de Henry afin de dterminer un rapport volumique
espace de tte/liquide appropri. Les informations sur la toxicit de la substance dessai lgard des microorganismes permettent de choisir une concentration dessai approprie et facilitent linterprtation des rsultats
lorsque la biodgradabilit est faible: on recommande dinclure un tmoin dinhibition, sauf si lon sait que la
substance dessai ninhibe pas lactivit des micro-organismes (voir paragraphe 24).
CHAMP DAPPLICATION DE LA MTHODE
11. Cet essai convient aux substances insolubles et solubles dans leau, cependant la substance dessai doit tre bien
disperse. Si lon applique le rapport volumique espace de tte/liquide recommand de 1/2, les substances
volatiles dont la constante de Henry ne dpasse pas 50 Pa.m3.mol-1 peuvent tre testes puisque la proportion
de la substance dessai dans lespace de tte nexcdera pas 1 % (13). Un volume plus petit despace de tte peut
tre utilis pour tester des substances plus volatiles, mais dont la biodisponibilit risque dtre limitante, surtout
si elles sont peu solubles dans leau. Toutefois, les exprimentateurs doivent sassurer que le rapport volumique
espace de tte/liquide et la concentration de la substance dessai laissent suffisamment doxygne disponible pour
permettre la biodgradation arobie dtre complte (en vitant, par exemple, dutiliser un substrat trs
concentr et un petit espace de tte). Des orientations sur ce point figurent dans les rfrences (13) et (23).
12. Il faut vrifier le procd exprimental en testant en parallle une substance de rfrence de biodgradabilit
connue. cet effet, laniline, le benzoate de sodium ou lthylneglycol peuvent tre utiliss pour les substances
dessai solubles dans leau et le 1-octanol pour les substances dessai peu solubles (13). La biodgradation de ces
substances doit tre suprieure 60 % de la ThCI au bout de 14 jours.
REPRODUCTIBILIT
13. Lessai circulaire ralis par lISO de la mthode (17) a produit les rsultats suivants, pour les conditions
recommandes, notamment une concentration de la substance dessai de 20 mg C/l:
Pourcentage moyen
de biodgradation
(28 jours)
Coefficient de variation
(%)
Nombre de laboratoires
Aniline
90
16
17
1-octanol
85
12
14
Substance dessai
Avec laniline, la variabilit interne de lessai tait faible, les coefficients de variabilit ne dpassant pas 5 % dans
presque tous les essais. Dans les deux cas o la rptabilit a t moins bonne, la plus grande variabilit a
probablement t due une production leve de carbone inorganique dans les tmoins blanc. Le 1-octanol a
donn lieu une moins bonne rptabilit, mais avec une variabilit nanmoins infrieure 10 % dans 79 % des
essais. Cette plus grande variabilit interne de lessai pourrait rsulter derreurs de dosage, le volume de 1-octanol
injecter dans les flacons exprimentaux hermtiquement clos tant faible (3 4 l). Des concentrations plus
faibles de la substance dessai engendreraient des coefficients de variation plus levs, en particulier aux concen
trations infrieures 10 mg C/l. Ce problme pourrait tre en partie rsolu par la diminution de la concentration
du carbone inorganique total dans linoculum.
14. Un essai circulaire de cinq agents tensioactifs 10 mg C/L, organis par lUnion europenne (24), a livr les
rsultats suivants:
Pourcentage moyen de
biodgradation
(28 jours)
(%)
Benznesulfonate de ttra
propylne
17
45
10
Diisooctylsulfosuccinate
(anionique)
72
22
Chlorure
dammonium
hexadcyl-trimthyique (*)
(cationique)
75
13
10
Substance dessai
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Pourcentage moyen de
biodgradation
(28 jours)
(%)
(thoxylate d)9 isononyl

phnol
(non ionique)
41
32
10
Cocoamidepropyl- dim
thylhydroxy- sulfobtane
(amphotre)
60
23
11
Substance dessai
(*) Le SiO2 a t ajout pour neutraliser la toxicit.
Les rsultats montrent quen gnral, les agents tensioactifs les moins bien dgrads prsentent une plus grande
variabilit. La variabilit interne de lessai, qui tait infrieure 15 % dans plus de 90 % des cas, na pas dpass
30-40 %.
Note:
la plupart des agents tensioactifs ne se composent pas dune seule espce molculaire, mais sont des
mlanges disomres, dhomologues, etc. qui se dgradent lissue de diffrentes priodes de latence et
diffrentes vitesses, et qui gnrent des courbes brouilles, attnues, de sorte que le seuil de 60 %
risque de ntre pas atteint dans la fentre de dix jours, mme si chaque espce molculaire atteindrait
plus de 60 % en lespace de dix jours si elle avait t teste isolment. Ce phnomne peut aussi
sobserver avec dautres mlanges complexes.
Appareillage
15. Appareils courants de laboratoire et:
a) flacons srum en verre ferms avec des bouchons en caoutchouc butylique sertis de surcapsules en
aluminium. La capacit recommande est de 125 ml, soit un volume total denviron 160 ml (dans ce cas,
le volume de chaque flacon doit atteindre 160 ml avec une prcision de 1 ml). Des flacons plus petits
peuvent tre utiliss si les rsultats remplissent les conditions dcrites aux paragraphes 66 et 67;
b) analyseur de carbone ou autre instrument (chromatographe en phase gazeuse, par exemple) pour mesurer le
carbone inorganique;
c) seringues haute prcision pour les chantillons gazeux et liquides;
d) agitateur orbital dans un environnement thermostat;
e) source dair exempt de CO2 on peut la prparer en faisant passer lair travers des granules de chaux sode
ou en utilisant un mlange gazeux 80 % de N2 et 20 % dO2 (facultatif) (voir paragraphe 28);
f) appareil membrane filtrante pores de 0,20 0,45 m (facultatif);
g) analyseur de carbone organique (facultatif).
Ractifs
16. Tous les ractifs doivent tre de qualit pour analyse.
Eau
17. On utilise de leau distille ou dsionise dont la teneur en carbone organique total est 1 mg/l. Cela reprsente
une quantit 5 % de la teneur initiale en carbone organique introduite par la dose recommande de substance
dessai.
Solutions mres pour le milieu compos de sels minraux
18. Les solutions mres et le milieu minral sont similaires ceux de la norme ISO 14593 (16) et des essais de
biodgradabilit facile du chapitre C.4 (20). Lutilisation dune concentration plus leve de chlorure dammo
nium (2,0 g/l au lieu de 0,5 g/l) ne devrait tre ncessaire que dans des cas trs exceptionnels, par exemple
lorsque la concentration de la substance dessai est > 40 mg C/l. Les solutions mres doivent tre gardes au
froid et limines aprs six mois, ou avant si lon remarque une prcipitation ou une prolifration bactrienne.
Prparer les solutions mres suivantes:
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a) Dihydrognophosphate de potassium (KH2PO4) 8,50 g

Hydrognophosphate de potassium (K2HPO4) 21,75 g
Hydrognophosphate de sodium dihydrat (Na2HPO4.2H20) 33,40 g
Chlorure dammonium (NH4Cl) 0,50 g
Dissoudre dans leau et porter le volume 1 litre. Le pH de la solution doit tre gal 7,4 ( 0,2). Si ce nest
pas le cas, prparer une autre solution;
b) Chlorure de calcium dihydrat (CaCl2.2H2O) 36,40 g
Dissoudre dans leau et porter le volume 1 litre;
c) Sulfate de magnsium heptahydrat (MgSO4.7H2O) 22,50 g
Dissoudre dans leau et porter le volume 1 litre;
d) Chlorure de fer (III) hexahydrat (FeCl3.6H20) 0,25 g
Dissoudre dans leau, porter le volume 1 litre et ajouter une goutte de HCl concentr.
Prparation du milieu minral
19. Mlanger 10 ml de la solution a) avec environ 800 ml deau (paragraphe 17), puis ajouter 1 ml des solutions b),
c) et d) et complter le volume 1 litre avec de leau (paragraphe 17).
Autres ractifs
20. Acide phosphorique concentr (H3PO4) (> 85 % masse par volume).
Solution dhydroxyde de sodium 7M
21. Dissoudre 280 g dhydroxyde de sodium (NaOH) dans 1 litre deau (paragraphe 17). Dterminer la teneur en
carbone inorganique dissous de cette solution et tenir compte de cette valeur dans le calcul du rsultat de lessai
(voir paragraphes 55 et 61), notamment en fonction du critre de validit mentionn au paragraphe 66 b).
Prparer une nouvelle solution si la concentration en carbone inorganique dissous est trop leve.
Substance dessai
22. Prparer une solution mre dune substance dessai suffisamment hydrosoluble, dans leau (paragraphe 17) ou
dans le milieu dessai (paragraphe 19), une concentration de prfrence 100 fois suprieure la concentration
finale utiliser dans lessai; il peut tre ncessaire dajuster le pH de la solution mre. La solution mre doit tre
ajoute au milieu minral de telle sorte que la concentration finale de carbone organique atteigne entre 2 et
40 mg C/l, de prfrence 20 mg C/l. Des concentrations plus faibles que celles mentionnes ci-dessus risquent de
diminuer la prcision. Les substances liquides solubles et insolubles peuvent tre introduites directement dans les
rcipients laide de seringues haute prcision. Les substances dessai peu solubles et insolubles peuvent
requrir un traitement spcial (25), choisir parmi les suivants:
a) ajout direct de quantits de poids connu;
b) dispersion aux ultrasons avant lajout;
c) dispersion laide dagents mulsifiants dont il y a lieu dtablir, avant dajouter la substance dessai, sils
exercent une action inhibitrice ou stimulante sur lactivit microbiologique;
d) adsorption des substances dessai liquides, ou dune solution de la substance dessai dans un solvant volatil
appropri, sur un milieu ou un support inerte (par exemple un filtre en fibres de verre), suivie par lvapo
ration du solvant, le cas chant, et ajout direct de quantits connues;
e) ajout dun volume connu dune solution de la substance dessai dans un solvant suffisamment volatil pour
quil svapore compltement du rcipient, suivi par lvaporation du solvant.
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Il faut vrifier par un essai si les agents ou les solvants utiliss aux points c), d) et e) ont un effet stimulant ou
inhibiteur sur lactivit microbiologique [voir paragraphe 42 b)].
Substance de rfrence
23. Prparer une solution mre de la substance de rfrence (soluble) dans leau (paragraphe 17) une concentration
de prfrence 100 fois suprieure la concentration finale (20 mg C/l) utiliser dans lessai.
Vrification de linhibition
24. Il arrive souvent que les substances dessai ne se dgradent pas de faon significative dans les conditions
appliques aux valuations de la biodgradation immdiate. Cela peut rsulter du fait que la substance dessai
exerce un effet inhibiteur sur linoculum la concentration laquelle elle est teste. Une vrification de leffet
inhibiteur peut tre incluse dans la conception de lessai pour faciliter lidentification (rtrospective) de linhibi
tion comme lune des causes possibles ou lun des facteurs contributifs, soit, au contraire, pour liminer cette
possibilit dinterfrences, ce qui dmontrerait que la dgradation faible ou nulle nest imputable quau fait que
les micro-organismes nattaquent pas la substance dans les conditions de lessai. Afin dobtenir des informations
sur la toxicit de la substance dessai lgard des micro-organismes (arobies), on prpare une solution
contenant la substance dessai et la substance de rfrence dans le milieu dessai (paragraphe 19), chacune
la mme concentration que celle laquelle elles ont t ajoutes dans le milieu dessai lors de lessai (voir
paragraphes 22 et 23).
Inoculum
25. Linoculum peut provenir de diffrentes sources: boues actives, effluents deaux uses (non chlors); eaux de
surface et sols; ou dun mlange de ces milieux (20). Il convient de vrifier lactivit biodgradante de la source
laide dune substance de rfrence. Quelle que soit la source, il ne faut pas utiliser de micro-organismes ayant
dj t exposs la substance dessai pour lessai de biodgradabilit facile.
Attention: les boues actives, les eaux uses et les effluents deaux uses renferment des organismes pathognes et
doivent tre manipuls avec prcaution.
26. On sait empiriquement que le volume optimal de linoculum est celui qui:
suffit pour fournir une activit biodgradante adquate,
dgrade la substance de rfrence dans le pourcentage stipul (voir paragraphe 66),
fournit 102 105 units formant colonie par millilitre dans le mlange final,
donne normalement une concentration de 4 mg/l de solides en suspension dans le mlange final lorsquon
utilise de la boue active; des concentrations allant jusqu 30 mg/l peuvent tre utilises, mais elles risquent
daugmenter sensiblement la production de CO2 dans les tmoins blanc (26),
reprsente moins de 10 % de la concentration initiale de carbone organique introduite par la substance
dessai,
quivaut gnralement 1 10 ml dinoculum par litre de solution exprimentale.
Boues actives
27. Prlever un chantillon de boue active dans le bassin daration dune station dpuration ou dune installation
lchelle du laboratoire traitant principalement des eaux uses domestiques. liminer, si ncessaire, les grosses
particules laide dun tamis (possdant des orifices de 1 mm2, par exemple) et conserver ensuite la boue en
arobiose jusqu son utilisation.
28. Une autre possibilit consiste, aprs avoir limin toutes les grosses particules, laisser dcanter la boue ou la
centrifuger (par exemple 1 100 g pendant 10 minutes). liminer le surnageant. La boue peut tre lave dans la
solution minrale. Suspendre la boue concentre dans le milieu minral de faon obtenir une concentration de
3 5 g/l de matires en suspension. Arer ensuite la suspension jusqu son utilisation.
29. La boue doit provenir dune station dpuration ordinaire en bon tat de fonctionnement. Les boues issues dune
station dpuration dont le dbit est important, ainsi que les boues susceptibles de contenir des inhibiteurs,
doivent tre laves. Dcanter ou centrifuger la boue remise en suspension aprs agitation vigoureuse, liminer le
liquide surnageant et resuspendre la boue lave dans un volume de milieu minral frais. Rpter cette opration
jusqu ce que la boue puisse tre considre comme exempte de substrat en excs ou dinhibiteur.
30. Prlever un chantillon de boue remise en suspension (lorsque la resuspension est complte) ou de boue non
traite juste avant le moment de son utilisation afin de dterminer le poids sec des matires en suspension.
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31. Une autre possibilit consiste homogniser la boue active (entre 3 et 5 g/l de solides en suspension). Passer la
boue dans un mlangeur mcanique rgl sur une vitesse moyenne pendant 2 minutes. Laisser reposer la boue
homognise pendant 30 minutes, ou plus longtemps si ncessaire, et prlever la phase liquide, qui sera utilise
comme inoculum raison denviron 10 ml par litre de milieu minral.
32. Il est possible dobtenir une rduction plus importante du dgagement de CO2 dans le tmoin blanc en arant
la boue toute une nuit avec de lair exempt de CO2. Dans cet essai, la concentration de linoculum doit slever
4 mg/l de solides de boue active (13).
Effluent secondaire deaux uses
33. Linoculum peut galement provenir de leffluent secondaire dune station dpuration ou dune installation
lchelle du laboratoire recevant principalement des eaux uses domestiques. Conserv en arobiose, lchantillon
sera utilis le jour de son prlvement ou prconditionn si ncessaire. Leffluent doit tre filtr travers un filtre
grossier et son pH est mesur.
34. Pour rduire la teneur en carbone inorganique du filtrat, on fait barboter dans celui-ci de lair exempt de CO2
[paragraphe 15 e)] durant 1 heure tout en maintenant le pH 6,5 avec de lacide phosphorique (paragraphe 20).
La valeur du pH est ramene sa valeur de dpart avec de lhydroxyde de sodium (paragraphe 21) et on laisse
reposer le filtrat pendant environ 1 heure, avant dy prlever un volume appropri de surnageant pour lino
culation. Ce processus de barbotage diminue la teneur de linoculum en carbone inorganique. Par exemple, si on
utilise le volume maximal recommand deffluent filtr et barbot (100 ml) par litre comme inoculum, la
quantit de carbone inorganique prsente dans les flacons tmoins blanc est comprise entre 0,4 et 1,3 mg/l
(14), ce qui reprsente 2 6,5 % du carbone de la substance dessai 20 mg C/l et 4 13 % 10 mg C/l.
Eaux de surface
35. Dans une eau de surface adquate, on prlve un chantillon qui sera conserv en arobiose et utilis le jour
mme. Si ncessaire, lchantillon est concentr par filtration ou centrifugation. Le volume dinoculum utiliser
dans chaque rcipient exprimental doit satisfaire aux critres noncs au paragraphe 26.
Sols
36. Prlever un chantillon dans un sol appropri une profondeur allant jusqu 20 cm en dessous de la surface du
sol. Il convient denlever les pierres, les dbris vgtaux et les invertbrs de lchantillon de sol avant de le passer
au travers dun tamis pourvu dorifices de 2 mm (si lchantillon est trop mouill pour pouvoir tre tamis
immdiatement, on le sche partiellement lair). Il faut le garder en arobiose et lutiliser le jour mme (si
lchantillon est transport dans un sac noir de polythne ferm de manire non hermtique, il peut tre
conserv 2 4 C dans ce sac jusqu un mois).
Prconditionnement de linoculum
37. Linoculum peut tre prconditionn aux conditions exprimentales, mais non pradapt la substance dessai.
Le prconditionnement peut diminuer le dgagement de CO2 dans le tmoin blanc. Le prconditionnement
consiste arer la boue active, aprs lavoir dilue dans le milieu exprimental 30 mg/l, avec de lair humide
exempt de CO2 durant 5 7 jours la temprature de lessai.
MODE OPRATOIRE
Nombre de flacons
38. Le nombre de flacons [paragraphe 15 a)] requis pour un essai dpendra de la frquence des analyses et de la
dure de lessai.
39. On recommande danalyser les flacons en trois exemplaires, aprs un nombre suffisant dintervalles de temps
pour pouvoir identifier la fentre des dix jours. On analyse galement au moins cinq flacons exprimentaux
[paragraphe 15 a)] des sries a), b) et c) (voir paragraphe 42) la fin de lessai, afin de pouvoir calculer les
intervalles de confiance 95 % pour le pourcentage moyen de biodgradation.
Milieu ensemenc
40. Linoculum est utilis une concentration de 4 mg/l en solides secs de boue active. Juste avant lutilisation,
prparer une quantit suffisante de milieu ensemenc en ajoutant, par exemple, 2 ml de boue active
traite comme il convient (paragraphes 27 32) une concentration de 2 000 mg/l 1 litre de milieu
minral (paragraphe 19). Si lon utilise un effluent secondaire deaux uses, ajouter jusqu 100 ml deffluent
(paragraphe 33) 900 ml de milieu minral (paragraphe 19) et porter 1 litre avec du milieu.
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Prparation des flacons

41. Verser des aliquotes de milieu ensemenc dans des flacons identiques en plusieurs exemplaires, de telle sorte que
le rapport espace de tte/liquide soit de 1/2 (introduire, par exemple 107 ml dans des flacons de 160 ml de
capacit). Dautres rapports peuvent tre appliqus, mais il faut tenir compte de lavertissement donn au
paragraphe 11. Quel que soit le type dinoculum utilis, on veillera mlanger correctement le milieu ensemenc
pour quil se rpartisse uniformment dans les flacons dessai.
42. Prparer des sries de flacons [paragraphe 15 a)] destins aux usages suivants:
a) flacons dessai (FT) contenant la substance dessai;
b) flacons tmoins blanc (FB) ne contenant que le milieu exprimental et linoculum; tous les produits
chimiques, solvants, agents ou filtres en fibres de verre utiliss pour introduire la substance dessai dans
les rcipients exprimentaux doivent aussi y tre ajouts;
c) flacons contenant la substance de rfrence (FC) pour vrifier le procd;
d) si ncessaire, flacons (FI) pour vrifier un ventuel effet inhibiteur de la substance dessai contenant la fois la
substance dessai et la substance de rfrence aux mmes concentrations (paragraphe 24) que dans les flacons
FT et FC respectivement;
e) flacons (FS) pour vrifier une ventuelle dgradation abiotique; il sagit des flacons (FT) auxquels on a ajout
50 mg/l de HgCl2 ou quon a striliss dune autre manire ( lautoclave, par exemple).
43. Les substances dessai et de rfrence solubles dans leau sont ajoutes aux flacons sous la forme de leurs
solutions mres aqueuses (paragraphes 22, 23 et 24), de manire fournir une concentration de 10
20 mg C/l.
44. Les substances dessai et de rfrence insolubles sont ajoutes aux flacons de diffrentes faons [voir paragraphe
22 a) e)] en fonction de la nature de la substance, avant ou aprs lajout du milieu ensemenc, selon la
mthode de traitement de la substance. Si lon utilise lune des procdures exposes au paragraphe 22 a) e), les
flacons tmoins blanc (FB) [paragraphe 42 b)] doivent tre traits de manire identique, si ce nest quils ne
contiendront ni la substance dessai ni la substance de rfrence.
45. Les substances dessai volatiles doivent tre introduites dans des flacons hermtiquement clos (paragraphe 47) au
moyen dune microseringue. La dose est calcule en fonction du volume inject et de la densit de la substance.
46. Si ncessaire, on ajoutera de leau aux flacons, afin que le volume de liquide soit identique dans tous les flacons.
On sassurera que le rapport espace de tte/liquide (gnralement de 1/2) et la concentration de la substance
dessai sont tels que lespace de tte renferme suffisamment doxygne pour permettre une biodgradation totale.
47. Tous les flacons sont ensuite ferms hermtiquement, par exemple au moyen de bouchons en caoutchouc
butylique et de surcapsules en aluminium. Les substances dessai volatiles doivent tre ajoutes ce stade
(paragraphe 45). Sil y a lieu de mesurer la baisse de concentration du carbone organique dissous dans la
solution exprimentale et danalyser au temps zro la concentration initiale de carbone inorganique ou dautres
paramtres [tmoins striles, paragraphe 42 e)], on prlve un chantillon appropri du flacon dessai. Le flacon
dessai et son contenu sont ensuite limins.
48. Les flacons hermtiquement clos sont placs sur un agitateur rotatif [paragraphe 15 d)], rgl sur une vitesse
dagitation suffisante pour que le contenu du flacon reste bien mlang et en suspension (par exemple 150
200 tpm), et mis incuber dans lobscurit temprature constante (20 C 1 C).
Prlvement
49. Le programme de prlvement dpendra de la priode de latence et de la vitesse de biodgradation de la
substance dessai. Des flacons sont retirs dfinitivement du dispositif exprimental afin dtre analyss le jour
du prlvement, lequel intervient au moins une fois par semaine ou plus frquemment (par exemple deux fois
par semaine), si une courbe de dgradation complte est requise. On retire le nombre ncessaire de flacons
identiques de lagitateur dans chaque catgorie: FT, FB et FC et, le cas chant FI et FS (voir paragraphe 42). Lessai
dure normalement 28 jours. Si la courbe de biodgradation atteint un plateau avant 28 jours, lessai peut
sarrter avant 28 jours. Prlever des chantillons dans les cinq flacons rservs aux analyses effectuer le
28e jour et utiliser les rsultats pour calculer les limites de confiance ou le coefficient de variation du pour
centage de biodgradation. Les flacons destins vrifier linhibition et la dgradation abiotique ne doivent pas
faire lobjet de prlvements aussi frquents que les autres flacons; il suffira de deux prlvements effectus
respectivement le 1er jour et le 28e jour.
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Analyse du carbone inorganique

50. On dtermine la production de CO2 dans les flacons en mesurant laugmentation de la concentration de carbone
inorganique durant lincubation. Deux mthodes, dcrites ci-aprs, sont recommandes pour mesurer la quantit
de carbone inorganique produite durant lessai. Au cours dun mme essai, il ne faudra utiliser quune seule
mthode, car ces mthodes risquent de donner des rsultats lgrement diffrents.
51. On recommande la mthode (a) si le milieu est susceptible de contenir des rsidus, par exemple de papier filtre
en verre et/ou dune substance dessai insoluble. Cette analyse peut tre pratique au moyen dun chromato
graphe en phase gazeuse, dfaut dun analyseur de carbone. Il est important de maintenir les flacons une
temprature assez proche de la temprature de lessai durant lanalyse du gaz de lespace de tte. La mthode (b)
peut savrer plus facile appliquer par les laboratoires qui mesurent le carbone inorganique laide dun
analyseur de carbone. Il importe que la solution dhydroxyde de sodium (paragraphe 21) utilise pour convertir
le CO2 en carbonate soit frachement prpare ou que sa teneur en carbone inorganique soit connue, de telle
sorte que ce paramtre puisse tre pris en compte lors du calcul des rsultats de lessai [voir paragraphe 66 b)].
Mthode (a): acidification pH < 3
52. Avant chaque lot danalyses, lanalyseur de carbone inorganique est talonn au moyen dun talon de carbone
inorganique appropri (par exemple une dilution 1 % poids/poids de CO2 dans du N2). Injecter de lacide
phosphorique concentr (paragraphe 20) travers le bouchon de chaque flacon destin un prlvement,
afin dabaisser le pH du milieu une valeur < 3 (ajouter, par exemple, 1 ml 107 ml de milieu exprimental).
Remettre les flacons sur lagitateur. Aprs avoir subi une agitation dune heure la temprature exprimentale,
les flacons sont retirs de lagitateur. On prlve des aliquotes de gaz (1 ml, par exemple) dans lespace de tte de
chaque flacon et on les injecte dans lanalyseur de carbone inorganique. Les concentrations de carbone inorga
nique mesures sont notes en mg C/l.
53. Cette mthode repose sur le principe suivant lequel aprs lacidification pH < 3 et lquilibrage 20 C, la
constante dquilibre de la rpartition du CO2 entre les phases liquide et gazeuse des flacons dessai est gale
1,0 lorsquelle est mesure sous forme de concentration (13). Cette relation doit tre dmontre au moins une
fois pour le systme exprimental, de la faon suivante:
Prparer des flacons contenant 5 et 10 mg/l de carbone inorganique laide dune solution de carbonate de
sodium anhydre (Na2CO3) dans de leau exempte de CO2 [prparer cette eau en lacidifiant pH 6,5 avec de
lacide phosphorique concentr (paragraphe 20), en y faisant barboter de lair exempt de CO2 toute une nuit et
en ramenant le pH une valeur neutre avec un produit alcalin]. Sassurer que le rapport volumique espace de
tte/liquide est le mme que dans les essais (1/2, par exemple). Acidifier et quilibrer comme indiqu au
paragraphe 52 et mesurer les concentrations de carbone inorganique dans lespace de tte et dans la phase
liquide. Vrifier que les deux concentrations sont identiques, lerreur exprimentale prs. Si elles ne le sont pas,
lexprimentateur devra rexaminer les procdures. Il nest pas ncessaire de vrifier la rpartition du carbone
inorganique entre les phases liquide et gazeuse chaque essai; cette vrification pourrait tre effectue au cours
de ltalonnage
54. Sil y a lieu de mesurer la disparition de carbone organique dissous (substances dessai hydrosolubles unique
ment), des chantillons sont prlevs dans la phase liquide de flacons spars (non acidifis), filtrs sur une
membrane et injects dans lanalyseur de carbone organique dissous. Ces flacons peuvent servir dautres
analyses, si ncessaire, permettant de mesurer la biodgradation primaire.
Mthode (b): conversion du CO2 en carbonate
55. Avant chaque lot danalyses, lanalyseur de carbone inorganique est talonn au moyen dun talon adquat, par
exemple une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO3) dans de leau exempte de CO2 (voir paragraphe 53),
une concentration de 0 20 mg de carbone inorganique/litre. Injecter une solution dhydroxyde de sodium
(7M, paragraphe 21) (par exemple raison d1 ml pour 107 ml de milieu) travers le bouchon de chaque flacon
destin un prlvement et agiter les flacons durant une heure la temprature de lessai. On utilise la mme
solution de NaOH dans tous les flacons retirs dfinitivement un jour donn, mais pas ncessairement pour tous
les prlvements effectus tout au long de lessai. Si les valeurs absolues de la teneur en carbone inorganique des
tmoins blanc sont requises chaque prlvement, il faudra dterminer la teneur en carbone inorganique de la
solution de NaOH chaque fois quelle est utilise. Enlever les flacons de lagitateur et laisser reposer. Extraire un
volume appropri (50 1 000 l, par exemple) de la phase liquide de chaque flacon laide dune seringue.
Injecter les chantillons dans lanalyseur de carbone inorganique et enregistrer les concentrations de carbone
inorganique. On sassurera que lanalyseur employ se prte au traitement des chantillons alcalins obtenus par
cette mthode.
56. Cette mthode repose sur le principe selon lequel aprs lajout dune solution alcaline et agitation, la concen
tration de carbone inorganique dans lespace de tte est ngligeable. Cela doit tre vrifi au moins une fois pour
le systme exprimental. Il faut, pour ce faire, utiliser des talons de carbone inorganique, ajouter une solution
basique et quilibrer, et mesurer la concentration de carbone inorganique dans lespace de tte et dans la phase
liquide (voir paragraphe 53). La concentration dans lespace de tte devrait avoisiner zro. Il nest pas ncessaire
de vrifier cette absorption pratiquement complte de CO2 chaque essai.
57. Si la disparition de carbone organique dissous (substances dessai hydrosolubles uniquement) est mesurer, des
chantillons sont prlevs dans la phase liquide de flacons spars (ne contenant pas de produit alcalin ajout),
filtrs sur une membrane et injects dans lanalyseur de carbone organique dissous. Ces flacons peuvent servir
dautres analyses, si ncessaire, pour mesurer la biodgradation primaire.
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RSULTATS ET RAPPORT
Calcul des rsultats
58. En supposant que la substance dessai a t minralise 100 % en CO2, la production maximale thorique de
carbone inorganique (ThCI) des flacons dessai excdant celle des tmoins blanc est gale au carbone organique
total (COT) ajout dans chaque flacon dessai au dbut de lessai, autrement dit:
ThCI = COT
La masse totale (mg) de carbone inorganique (CIT) dans chaque flacon est:
CIT = (mg de C dans le liquide + mg de C dans lespace de tte) = (VL CL) + (VH CH)
quation [1]
o:
VL = volume de liquide dans le flacon (litre);
CL = concentration de carbone inorganique dans le liquide (carbone en mg/l);
VH = volume de lespace de tte (litre);
CH = concentration de carbone inorganique dans lespace de tte (carbone en mg/l).
Les calculs du CIT pour les deux mthodes analytiques utilises pour mesurer le carbone inorganique dans cet
essai sont dcrits ci-dessous aux paragraphes 60 et 61. Le pourcentage de biodgradation (% D) dans chaque cas
est donn par lquation suivante:
%D
CITt CITb
100
COT
quation [2]
o:
CITt = mg de CIT dans le flacon dessai au temps t;
CITb = la moyenne des mg de CIT dans les flacons tmoins blanc au temps t;
COT = mg de COT ajouts initialement au flacon dessai.
Le pourcentage de biodgradation (% D) est calcul pour les flacons dessai (FT) et de rfrence (FC) et, le cas
chant, les flacons (FI) destins la vrification dun ventuel effet inhibiteur, partir des quantits respectives
de carbone inorganique total produites jusqu chaque temps de prlvement.
59. Une augmentation significative de la teneur en CIT dans les tmoins striles (FS) durant lessai permet de
conclure une dgradation abiotique de la substance dessai et il faut en tenir compte dans le calcul de D
dans lquation [2].
Acidification pH < 3
60. Lacidification pH < 3 et lquilibrage entranant lgalisation de la concentration de CIT entre les phases liquide
et gazeuse, seule la concentration de carbone inorganique dans la phase gazeuse doit tre mesure. Aussi, daprs
lquation [1], CIT = (VL + VH) CH = VB CH, o VB = est le volume du flacon de srum.
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Conversion du CO2 en carbonate

61. Dans cette mthode, les calculs sont effectus conformment lquation [1], mais la quantit ngligeable de
carbone inorganique dans la phase gazeuse est ignore, de sorte que VH CH = 0, et CIT = VL CL.
Expression des rsultats
62. On trace une courbe de biodgradation en reportant le pourcentage de biodgradation, D, en fonction du temps
dincubation, courbe qui indiquera, si possible, la phase de latence, la phase de biodgradation, la fentre des dix
jours et la phase plateau, cest--dire la phase durant laquelle la dgradation a atteint son maximum et o la
courbe de biodgradation marque un palier. Si des rsultats comparables sont obtenus pour les flacons dessai
(FT) tests en parallle (< 20 % de diffrence), on trace une courbe moyenne (voir appendice 2, figure 1); dans le
cas contraire, on trace une courbe pour chaque flacon dessai. On dtermine la valeur moyenne du pourcentage
de biodgradation dans la phase plateau ou on value sa valeur maximale (par exemple si la courbe flchit dans
la phase plateau), mais il est important destimer si, dans ce dernier cas, la valeur nest pas nettement divergente.
Ce niveau maximal de biodgradation doit tre mentionn en tant que degr de biodgradation de la substance
dessai dans le rapport dessai. Si le nombre de flacons dessai sest avr insuffisant pour prciser une phase
plateau, on utilise les donnes mesures du dernier jour de lessai pour calculer une valeur moyenne. Cette
dernire valeur, la moyenne de cinq essais identiques, sert indiquer la prcision avec laquelle le pourcentage de
biodgradation a t dtermin. La valeur obtenue au terme de la fentre des dix jours doit galement figurer
dans le rapport.
63. Tracer, de la mme manire, une courbe pour la substance de rfrence, FC, et, le cas chant, pour la vrification
de la dgradation abiotique FS et pour le contrle de linhibition, FI.
64. Les quantits de CIT prsentes dans les tmoins blanc (FB) sont consignes, de mme que celles prsentes dans
les flacons FS, si ces flacons sont inclus dans le systme exprimental.
65. Calculer D pour les flacons FI, daprs le rendement thorique escompt en carbone inorganique provenant
uniquement de la substance de rfrence du mlange. Si, au 28e jour, ([DFC ( (1)) DFI ( (2))]/DFC) 100 > 25 %,
il est permis de supposer que la substance dessai a inhib lactivit de linoculum, ce qui peut expliquer les
faibles valeurs de DFT obtenues dans les conditions de lessai. Dans ce cas, lessai pourrait tre rpt avec une
concentration dessai plus faible, et en rduisant de prfrence le carbone inorganique dissous (CID) dans
linoculum et le CIT form dans les tmoins blanc, car une diminution de la concentration de la substance
dessai amoindrit la prcision de la mthode. Un autre inoculum peut galement tre utilis. Si la quantit de CIT
dans le flacon FS (dgradation abiotique) montre une augmentation significative (> 10 %), il se peut quune
dgradation abiotique ait eu lieu.
Validit des rsultats
66. Un essai est considr comme valable si:
a) le pourcentage moyen de dgradation dans les flacons FC contenant la substance de rfrence est > 60 % au
14e jour de lincubation; et
b) la quantit moyenne de CIT prsente dans les tmoins blancs FB la fin de lessai est > 3 mg C/l.
Si ces limites ne sont pas atteintes, on rptera lessai avec un inoculum provenant dune autre source et/ou on
rvisera les procdures appliques. Par exemple, si une production leve de carbone inorganique dans le tmoin
blanc pose un problme, il convient de suivre la procdure expose aux paragraphes 27 32.
67. Si la substance dessai ne fournit pas 60 % de la production maximale thorique de carbone inorganique (ThCI)
et quil a t dmontr quelle nexerce aucun effet inhibiteur (paragraphe 65), lessai peut tre rpt avec une
concentration accrue dinoculum (jusqu 30 mg/l de boue active et 100 ml deffluent/l) ou avec un inoculum
provenant dautres sources, en particulier si la dgradation a atteint une valeur comprise entre 20 et 60 %.
Interprtation des rsultats
68. Si une substance dessai atteint une biodgradation > 60 % de la ThCI dans la fentre des dix jours au cours de
cet essai, cela dmontre quelle est facilement biodgradable en arobiose.
69. Si la valeur de seuil de 60 % de la ThCI na pas t atteinte, on mesure le pH du milieu des flacons qui nont pas
t acidifis ou alcaliniss; une valeur infrieure 6,5 pourrait indiquer quune nitrification a eu lieu. Dans ce cas,
on rpte lessai avec une solution tampon plus concentre.
(1) Le pourcentage de dgradation dans les flacons FC contenant la substance de rfrence.
(2) Le pourcentage de dgradation dans les flacons FI.
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Rapport dessai
70. Dresser un tableau du pourcentage de dgradation (% D) relev dans chaque flacon dessai (FT), de rfrence (FC)
et, le cas chant, de vrification de linhibition (FI) pour chaque jour de prlvement. Si les flacons identiques
livrent des rsultats comparables, tracer une courbe du % D moyen en fonction du temps. Noter la quantit de
carbone inorganique total dans les tmoins blanc (FB) et dans les tmoins striles (FS), de mme que le carbone
organique dissous et/ou dautres paramtres, ainsi que leur pourcentage de disparition.
71. Dterminer la valeur moyenne du % D dans la phase plateau ou utiliser la valeur maximale si la courbe de
biodgradation flchit dans la phase plateau et rapporter cette valeur en tant que degr de biodgradation de la
substance dessai. Il importe de vrifier que dans ce dernier cas, la valeur la plus leve nest pas nettement
divergente.
72. Le rapport dessai doit mentionner les informations suivantes:
Substance dessai:
nom courant, nom chimique, numro CAS, formule structurale et proprits physico-chimiques pertinentes,
puret (impurets) de la substance dessai.
rfrence la prsente mthode dessai,
description du systme exprimental utilis (par exemple, volume du flacon, rapport espace de tte/liquide,
mthode dagitation, etc.),
ajout de la substance dessai et de la substance de rfrence dans le systme exprimental: concentration
applique et quantit de carbone mesure dans chaque flacon dessai, et, le cas chant, solvants utiliss,
dtails sur linoculum utilis, traitement pralable et prconditionnement ventuels,
temprature dincubation,
validation du principe de lanalyse du carbone inorganique,
principales caractristiques de lanalyseur de carbone inorganique employ (et de toute autre mthode
danalyse utilise),
nombre de rptitions.
Rsultats:
donnes brutes et valeurs calcules de la biodgradabilit prsentes dans un tableau,
graphique du pourcentage de dgradation en fonction du temps pour les substances dessai et de rfrence,
phase de latence, phase de dgradation, fentre des dix jours et pente,
pourcentage de disparition au niveau du plateau, la fin de cet essai et aprs la fentre des dix jours,
justification en cas de rejet des rsultats exprimentaux,
tout autre fait se rapportant la procdure utilise,
analyse des rsultats.
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L 81/228
FR
BIBLIOGRAPHIE:
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19.3.2014
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(25) ISO 10634 (1996) Qualit de leau Lignes directrices pour la prparation et le traitement des composs organiques
peu solubles dans leau en vue de lvaluation de leur biodgradabilit en milieu aqueux.
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Appendice 1
ABRVIATIONS ET DFINITIONS
CI: carbone inorganique.
ThCO2: production thorique de CO2 (mg); correspond la quantit de dioxyde de carbone calcule partir de la teneur
en carbone connue ou mesure de la substance dessai, qui doit se dgager lors de la minralisation complte de celle-ci;
galement exprime en mg de dioxyde de carbone dgag par mg de substance dessai.
COD: le carbone organique dissous est le carbone organique prsent en solution ou qui traverse un filtre pores de
0,45 micron ou encore qui reste dans le surnageant aprs une centrifugation de 15 minutes environ 4 000 g
(40 000 m sec-2).
CID: carbone inorganique dissous.
ThCI: production thorique de carbone inorganique.
CIT: carbone inorganique total.
Facilement biodgradable: classification arbitraire des produits chimiques qui ont rpondu positivement certains essais
de dpistage spcifiques portant sur la biodgradabilit ultime; du fait de la rigueur de ces essais, on admet que de tels
composs se dgraderont rapidement et compltement en milieu aquatique dans des conditions arobies.
Fentre des dix jours: les dix jours qui suivent immdiatement le moment o le taux de biodgradation atteint 10 %.
Biodgradabilit intrinsque: classification des produits chimiques pour lesquels une biodgradation (primaire ou finale)
se manifeste sans ambigut au cours dun quelconque essai de biodgradabilit.
Biodgradation ultime en arobiose: niveau de dgradation atteint lorsque la totalit de la substance dessai a t utilise
par des micro-organismes pour produire du dioxyde de carbone, de leau, des sels minraux et de nouveaux constituants
cellulaires microbiologiques (biomasse).
Minralisation: dgradation complte dun compos organique en CO2 et en H2O dans des conditions arobies, et en
CH4, CO2 et H2O dans des conditions anarobies.
Phase de latence: correspond la priode qui commence au dbut de lessai et sachve au moment o les microorganismes dgradants se sont acclimats et/ou adapts et o le degr de biodgradation dune substance chimique ou
dune matire organique a atteint un niveau dtectable (par exemple 10 % de la biodgradation maximale thorique, ou
moins, suivant la prcision de la technique de mesure).
Phase de dgradation: correspond la priode qui commence la fin de la phase de latence et se termine au moment
o on atteint 90 % du taux maximal de dgradation.
Phase plateau: phase au cours de laquelle la dgradation atteint sa valeur maximale et o la courbe de biodgradation
marque un palier.
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Appendice 2
Exemple de courbe de biodgradation
Figure 1
Biodgradation du 1-octanol au cours de lessai de lespace de tte (dgagement de CO2)
Glossaire
biodgradation.
phase de dgradation.
niveau maximal de biodgradation.
phase plateau.
fentre de dix jours.
dure de lessai (jours).
C. 30. BIOACCUMULATION CHEZ LES OLIGOCHTES TERRESTRES
INTRODUCTION
1.
chimiques. Parmi les mthodes dessai relatives au devenir environnemental, celles intitules Bioconcentration:
essai avec renouvellement continu sur les poissons [chapitre C.13 de la prsente annexe (49)] et Bioaccumu
lation chez les oligochtes benthiques fouisseurs (53) ont t publies, respectivement, en 1996 et en 2008. Il
est difficile voire impossible dextrapoler aux organismes terrestres comme les vers de terre les donnes sur la
bioaccumulation en milieu aquatique. Des calculs de modles fonds sur la lipophilie dune substance dessai, voir
par exemple (14) ou (37), sont actuellement utiliss pour valuer la bioaccumulation des substances chimiques
dans le sol, notamment dans le document dorientation technique de lUnion europenne (19). La ncessit
dappliquer une mthode dessai comportant des compartiments spcifiques a dj t expose (55). Une telle
mthode est particulirement importante pour valuer lempoisonnement secondaire dans les chanes alimen
taires terrestres (4). Plusieurs mthodes dessai nationales portent sur la bioaccumulation chez les organismes
autres que les poissons, par exemple (2) et (72). Une mthode dvaluation de la bioaccumulation chez les vers de
terre (Eisenia fetida, Savigny) et les enchytres dans des sols contamins a t labore par lAmerican Society for
Testing and Materials (ASTM) (3). Une mthode internationalement reconnue visant dterminer la bioaccu
mulation dans un sol charg permettra de mieux valuer les risques des produits chimiques pour les cosystmes
terrestres, notamment (25) et (29).
2.
Les invertbrs gophages sont exposs aux substances chimiques prsentes dans le sol. Au nombre de ces
animaux, les oligochtes terrestres jouent un rle important dans la structure et la fonction des sols (15) (20).
Les oligochtes terrestres vivent dans le sol et, partiellement, sa surface (notamment sur la litire); ils
reprsentent frquemment lespce la plus abondante en termes de biomasse (54). Leur rle dans la bioturbation
du sol et leur fonction de proies confrent ces animaux une influence considrable sur la biodisponibilit des
substances chimiques pour dautres organismes comme les prdateurs invertbrs [dont les acariens et les
coloptres; voir notamment (64)] ou vertbrs [dont les renards et les mouettes (18) (62)]. Certaines
espces doligochtes terrestres actuellement utilises dans les essais cotoxicologiques sont dcrites lappen
dice 5.
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L 81/232
3.
Le guide de lASTM sur les essais en laboratoire consacrs la toxicit du sol ou la bioaccumulation chez les
vers de terre Eisenia fetida et les enchytres Enchytraeus albidus (3) fournit nombre dinformations essentielles qui
ont servi mettre en uvre la mthode dessai expose ici sur la bioaccumulation dans le sol. Parmi les autres
rfrences cites dans la prsente mthode dessai figurent le chapitre C.13 de la prsente annexe, intitul
Bioconcentration: essai avec renouvellement continu sur les poissons (49) et la ligne directrice 315 de
lOCDE intitule Bioaccumulation chez les oligochtes benthiques fouisseurs (53). Des expriences pratiques
tires dtudes et de diverses publications sur la bioaccumulation dans le sol, dont (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43)
(45) (57) (59) (76) (78) (79), ont galement largement inspir la prsente mthode dessai.
4.
Cette mthode dessai sapplique essentiellement aux substances chimiques organiques neutres, stables, qui ont
tendance tre adsorbes dans le sol. Elle permet galement dvaluer la bioaccumulation de composs
organomtalliques stables, associs au sol. Cette mthode sapplique aussi aux mtaux et autres lments
prsents ltat de traces.
PRREQUIS
5.
Les essais visant mesurer la bioaccumulation dune substance dans les oligochtes terrestres ont t raliss
avec des mtaux lourds [voir notamment (63)] et des substances organiques persistantes dont le log Kow (Koe) se
situe entre 3,0 et 6,0 (40). Ces essais sappliquent galement aux:
substances dont le log Kow est suprieur 6,0 (substances super-hydrophobes),
substances appartenant la classe des substances organiques connues pour leur potentiel de bioaccumula
tion dans les organismes vivants, par exemple les substances fortement adsorbantes ou tensio-actives,
substances qui prsentent un potentiel de bioaccumulation de par leurs caractristiques structurelles (ana
logues des substances dont le potentiel de bioaccumulation est connu),
mtaux.
6.
Avant de dbuter toute tude, il convient de disposer de certaines informations sur la substance dessai, comme
le nom courant, le nom chimique (de prfrence le nom IUPAC), la formule structurale, le numro CAS, la
puret, les mesures de scurit, les conditions de stockage appropries et les mthodes danalyse. Il faut aussi
connatre les proprits suivantes de la substance:
a) solubilit dans leau;
b) coefficient de partage octanol-eau, Kow;
c) coefficient de partage sol-eau, exprim par Koc;
d) pression de vapeur;
e) dgradabilit (dans le sol ou leau notamment);
f) mtabolites connus.
7.
Il est possible dutiliser des substances dessai radiomarques ou non. Cependant, lutilisation de substances
radiomarques est recommande car elle facilite lanalyse. La dcision dy recourir dpendra des limites de
dtection ou de la ncessit de mesurer le compos parent et les mtabolites. Dans le cas o une substance
radiomarque est utilise et o le total des rsidus radioactifs est mesur, il est important que les rsidus
radiomarqus tant dans le sol que dans les organismes dessai soient dfinis en pourcentages de la substance
dessai parente et de la substance marque non-parente, par exemple dans des chantillons prlevs un tat
stationnaire ou la fin de la phase dabsorption, pour permettre de calculer le facteur de bioaccumulation (FBA)
pour la substance dessai parente et les mtabolites du sol pertinents (voir paragraphe 50). Il peut savrer
ncessaire de modifier la mthode dcrite ici, en particulier en vue de disposer dune biomasse suffisante pour
mesurer les substances dessai organiques non-radiomarques ou les mtaux. Lorsque le total des rsidus
radioactifs est mesur (par comptage en scintillation liquide aprs extraction, combustion ou solubilisation
des tissus), le facteur de bioaccumulation est bas sur la susbtance dessai parente et sur les mtabolites. Il
est prfrable que le FBA soit calcul sur la base de la concentration de la substance dessai parente dans les
organismes et du total des rsidus radioactifs. Ensuite, le facteur daccumulation biota-sol (BSAF) (biota-soil
accumulation factor), normalis par rapport la teneur en lipides des vers et la teneur en carbone organique
(CO) du sol, est calcul partir du FBA pour garantir la comparabilit des rsultats de diffrents essais de
bioaccumulation.
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8.
Il convient que la toxicit de la substance dessai envers les espces utilises dans lessai soit connue, notamment
la concentration deffet (CEx) ou la concentration ltale (CLx) pour la dure de la phase dabsorption [(19) par
exemple]. La concentration de la substance dessai reprsente de prfrence environ 1 % de sa CL50 aigu
asymptotique, et elle est au moins dix fois suprieure sa limite de dtection dans le sol par la mthode
danalyse utilise. La prfrence est donne, lorsquelles sont disponibles, aux valeurs de toxicit issues dtudes
long terme sur les effets subltaux observs (51) et (52). Si ces donnes ne sont pas disponibles, un essai de
toxicit aigu apportera des informations utiles [voir notamment (23)].
9.
Il est ncessaire de disposer dune mthode danalyse approprie, dont on connat lexactitude, la prcision et la
sensibilit pour quantifier la substance dans les solutions dessai, dans le sol et dans le matriel biologique; il est
aussi ncessaire de disposer des dtails de la prparation et du stockage des chantillons, et des fiches de
donnes de scurit des substances. Il convient galement de connatre les limites de dtection analytiques de la
substance dessai dans le sol et les tissus du ver. Si une substance dessai marque au 14C est utilise, il est
ncessaire de connatre aussi la radioactivit spcifique (cest-- dire en Bq.mol-1) et le pourcentage de radioac
tivit associ aux impurets. La radioactivit spcifique de la substance dessai sera suffisamment leve pour
faciliter lanalyse et les concentrations dessai utilises ne provoqueront pas deffets toxiques.
10. Lessai peut tre ralis sur sol naturel ou artificiel. Avant le dbut de lessai, il convient de connatre les
caractristiques du sol naturel utilis, par exemple son origine ou ses constituants, son pH, sa teneur en
carbone organique, sa distribution granulomtrique (pourcentages de sable, de limon et dargile), et sa capacit
de rtention deau (CRE) (3) (48).
PRINCIPE DE LESSAI
11. Les paramtres qui caractrisent la bioaccumulation dune substance dessai se composent du facteur de bioac
cumulation (FBA), de la constante de vitesse dabsorption (ks) et de la constante de vitesse dlimination (ke).
Lappendice 1 donne des dfinitions dtailles de ces paramtres.
12. Lessai consiste en deux phases, la phase dabsorption (exposition) et la phase dlimination (postexposition).
Durant la phase dabsorption, des groupes rpliqus de vers sont exposs au sol charg avec la substance dessai.
En plus des animaux dessai, des groupes tmoins de vers sont conservs dans des conditions identiques, sans la
substance dessai. Le poids sec et la teneur en lipides des organismes dessai sont mesurs. Pour ce faire, on peut
utiliser des vers du groupe tmoin. Les valeurs de fond analytiques (essai blanc) peuvent tre obtenues en
analysant des chantillons des vers et du sol tmoins. Pour la phase dlimination, les vers sont transfrs dans
un sol dpourvu de la substance dessai. Une phase dlimination est toujours ncessaire sauf si labsorption de
la substance dessai au cours de la phase dexposition savre tre non significative. Elle permet de recueillir des
informations sur la vitesse laquelle la substance dessai est excrte par lorganisme dessai (27). Si un tat
stationnaire na pas t atteint durant la phase dabsorption, il est prfrable de dterminer les paramtres
cintiques constantes de vitesse dabsorption et dlimination, facteur de bioaccumulation cintique FBAk en
sappuyant sur lajustement simultan des rsultats des phases dabsorption et dlimination. La concentration de
la substance dessai dans ou sur les vers est contrle pendant toute la dure des deux phases de lessai.
13. Durant la phase dabsorption, des mesures sont effectues pendant des temps de prlvement pouvant durer
jusqu 14 jours (enchytres) ou 21 jours (vers de terre) jusqu ce que ltat stationnaire soit atteint (11) (12)
(67). On identifie un tat stationnaire lorsque le trac de la concentration dans les vers en fonction du temps est
parallle laxe du temps, et lorsque trois analyses successives de la concentration ralises sur des chantillons
prlevs des intervalles dau moins deux jours ne diffrent pas de plus de 20 % lune par rapport lautre sur
la base de comparaisons statistiques (par exemple, analyse de la variance, analyse de la rgression).
14. La phase dlimination consiste transfrer les organismes dessai dans des rcipients qui contiennent un
substrat identique, mais sans la substance dessai. Durant la phase dlimination, les mesures sont ralises
pendant des dures pouvant aller jusqu 14 jours (enchytres) ou 21 jours (vers de terre), moins quune
dtermination analytique antrieure nait mis en vidence une diminution de 90 % des rsidus de substance
dessai dans les vers. La concentration de la substance dessai dans les vers la fin de la phase dlimination est
consigne comme rsidus non limins. Le facteur de bioaccumulation ltat stationnaire (steady state) (FBAss)
est calcul de prfrence la fois comme le rapport de la concentration dans les vers (Ca) celle dans le sol (Cs)
un tat stationnaire apparent, et comme un facteur de bioaccumulation cintique (FBAK), cest--dire comme
le rapport de la constante de vitesse dabsorption partir du sol (ks) la constante de vitesse dlimination (ke)
(voir lappendice 1 pour les dfinitions) en supposant une cintique du premier ordre (voir lappendice 2 pour
les calculs). Si la cintique du premier ordre nest manifestement pas applicable, il convient demployer dautres
modles.
15. La constante de vitesse dabsorption, la constante de vitesse dlimination (ou les constantes, si dautres modles
ont t utiliss), le facteur de bioaccumulation cintique (FBAK), et lorsque cela est possible, les limites de
confiance de chacun de ces paramtres, sont calculs partir dquations de modles laide de programmes
informatiques (voir lappendice 2). La qualit de lajustement dun modle peut tre dtermine partir du
coefficient de corrlation ou du coefficient de dtermination (des coefficients proches de 1 indiquent une bonne
qualit dajustement) ou de la loi du chi-deux. De plus la grandeur de lcart-type ou de lintervalle de confiance
autour des paramtres estims peut donner une bonne indication de la qualit de lajustement du modle.
16. Pour rduire la variabilit des rsultats pour les substances de lipophilie leve, les facteurs de bioaccumulation
sont exprims par rapport la teneur en lipides et la teneur en carbone organique [teneur en kg de carbone
organique (CO) du sol par teneur en kg de lipides des vers]. Cette approche sappuie sur le fait que, pour
certaines classes chimiques, il existe une relation claire entre le potentiel de bioaccumulation et la lipophilie;
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cette relation a t clairement tablie pour le poisson (47). Il existe une relation entre la teneur en lipides du
poisson et la bioaccumulation de ces substances. Pour les organismes benthiques, des corrlations similaires ont
t trouves [voir notamment (30) (44)]. Cette corrlation a galement t dmontre pour les oligochtes
terrestres (5) (6) (7) (14). Si on dispose de suffisamment de tissu de vers, il est possible de dterminer la teneur
en lipides des animaux dessai sur le mme matriel biologique que celui utilis pour dterminer la concen
tration de la substance dessai. Il est galement possible de mesurer la teneur en lipides en utilisant des animaux
tmoins.
VALIDIT DE LESSAI
17. Pour quun essai soit valable, les critres suivants seront remplis tant concernant les animaux tmoins que les
animaux traits:
lissue de lessai, la mortalit totale au cours des phases dabsorption et dlimination ne dpasse pas 10 %
(vers de terre) ou 20 % (enchytres) du nombre total de vers introduits,
avec Eisenia fetida et Eisenia andrei, la perte de poids moyenne mesure la fin des phases dabsorption et
dlimination ne dpasse pas 20 % du poids frais initial au dbut de chaque phase.
Espces dessai
18. Diffrentes espces doligochtes terrestres sont recommandes pour les essais sur la bioaccumulation. Les
espces les plus couramment employes, Eisenia fetida ou Eisenia andrei (vers de terre) ou encore Enchytraeus
albidus, Enchytraeus crypticus ou Enchytraeus luxuriosus (enchytres), sont dcrites lappendice 5.
Appareillage
19. Il convient dviter avec soin dutiliser pour lappareillage des matriaux susceptibles de dissoudre ou dadsorber
la substance dessai ou de laisser schapper des substances ayant un effet dltre sur les animaux dessai. Il est
possible dutiliser des rcipients rectangulaires ou cylindriques standard, faits dans un matriau chimiquement
inerte et dune capacit adapte, conforme au taux de charge, cest-- dire au nombre de vers dessai. De lacier
inoxydable, du plastique ou du verre peut tre utilis pour tout quipement entrant en contact avec le milieu
dessai. Les rcipients dessai devront tre ferms de manire approprie, pour viter que les vers ne schappent,
tout en assurant un apport dair suffisant. Du verre silanis peut savrer ncessaire pour des substances de
coefficient dadsorption lev comme les pyrthrodes synthtiques. Dans ces cas de figure, lquipement devra
tre jet aprs usage (49). Il conviendra dviter lvaporation des substances radiomarques et des substances
chimiques volatiles. On utilisera des piges (par exemple des flacons de lavage des gaz) contenant un absorbant
permettant de capter dventuels rsidus susceptibles de svaporer des rcipients dessai.
Sol
20. Il convient que le sol dessai soit tre dune qualit permettant la survie et de prfrence la reproduction des
organismes dessai durant les priodes dacclimatation et dessai, sans quils ne prsentent un aspect ou un
comportement anormal. Les vers devront pouvoir senfouir dans le sol.
21. Il est recommand dutiliser comme substrat lors des essais le sol artificiel dcrit au chapitre C.8 de la prsente
annexe (48). La prparation du sol artificiel en vue dessais sur la bioaccumulation est dcrite lappendice 4, o
figurent galement des recommandations relatives au stockage de ce sol artificiel. Tout sol artificiel sch lair
peut tre stock temprature ambiante jusqu son utilisation.
22. Toutefois, il est possible dutiliser des sols naturels provenant de sites non pollus comme sol dessai et/ou
dlevage. Les sols naturels sont caractriss au moins par leur origine (site de prlvement), leur pH, leur teneur
en carbone organique, leur distribution granulomtrique (pourcentage de sable, de limon et dargile), leur
capacit maximale de rtention deau (CREmax), et leur teneur en eau (3). La recherche de micropolluants
dans le sol ou dans ses constituants, pralablement son utilisation, devrait fournir des informations utiles. En
cas dutilisation dun sol naturel prlev sur des terres agricoles, il convient que ce dernier nait pas t trait
avec des produits phytopharmaceutiques ou nait pas fait lobjet dun pandage de fumier danimaux traits
pendant au moins un an avant lchantillonnage, ou dun pandage dengrais organiques pendant au moins six
mois avant lchantillonnage (50). Les procdures de manipulation des sols naturels avant utilisation dans le
cadre dessais cotoxicologiques sur des oligochtes en laboratoire sont dcrites dans le document de lASTM (3).
La dure de stockage des sols naturels au laboratoire est aussi courte que possible.
Application de la substance dessai
23. La substance dessai est incorpore dans le sol. Il convient de prendre en compte les proprits physicochimiques de cette substance. Une substance dessai soluble dans leau est entirement dissoute dans leau
avant dtre mlange au sol. La procdure de chargement recommande pour les substances dessai peu
solubles dans leau consiste enrober un ou plusieurs des constituants du sol (artificiel) avec la substance
dessai. Par exemple, le sable de quartz, ou une portion de celui-ci, peut tre tremp dans une solution de la
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substance
dessai dans un solvant organique adapt, lequel est ensuite lentement vapor jusqu dessiccation. La fraction
enrobe peut ensuite tre mlange avec le sol mouill. Cette procdure a pour principal avantage de nin
troduire aucun solvant dans le sol. En cas dutilisation dun sol naturel, la substance dessai peut tre ajoute soit
par chargement dune portion du sol sche lair comme dcrit prcdemment pour le sol artificiel, soit par
mlange avec le sol mouill, puis vaporation si un agent de solubilisation est utilis. En rgle gnrale, il
conviendra dviter autant que possible tout contact du sol mouill avec les solvants. Les lments suivants sont
prendre en considration (3):
si un solvant autre que leau est utilis, il convient quil soit miscible leau et/ou puisse tre limin (par
vaporation notamment) pour ne laisser que la substance chimique dessai sur le sol,
si un tmoin solvant est utilis, aucun tmoin ngatif nest ncessaire. Le tmoin solvant prsentera la plus
forte concentration de solvant ajout au sol et le solvant en question sera issu du mme lot que celui utilis
pour la solution mre. La toxicit et la volatilit du solvant ainsi que la solubilit de la substance dessai dans
le solvant slectionn constituent les principaux critres de choix pour lagent de solubilisation.
24. Pour les substances peu solubles dans leau et les solvants organiques, 2,0 2,5 g de sable quartzique finement
broy par rcipient dessai peuvent tre mlangs, au moyen dun mortier et dun pilon par exemple, la
quantit ncessaire de la substance dessai pour obtenir la concentration exprimentale voulue. Ce mlange de
sable quartzique et de la substance dessai est ajout au sol prhumidifi, auquel il est mlang compltement
aprs lajout de la quantit ncessaire deau dsionise pour atteindre lhumidit requise. Le mlange final est
rparti entre les rcipients dessai. On rpte la procdure pour chaque concentration exprimentale et on
prpare un tmoin appropri de 2,0 2,5 g de sable quartzique finement broy par rcipient dessai.
25. La concentration de la substance dessai dans le sol est dtermine aprs chargement. La rpartition homogne
de la substance dessai dans le sol est contrle avant lintroduction des organismes dessai. La mthode de
chargement choisie et les raisons de ce choix sont notes (24).
26. Idalement, il convient dtablir un quilibre entre le sol et leau interstitielle avant lajout des organismes; une
priode de quatre jours 20 C est recommande. Pour un grand nombre de substances chimiques organiques
faiblement solubles dans leau, le laps de temps ncessaire pour quun vritable quilibre soit atteint entre les
parties adsorbes et dissoutes peut stendre sur plusieurs jours ou plusieurs mois. Selon lobjectif de ltude, par
exemple lorsquil sagit de simuler des conditions environnementales, il peut tre ncessaire de vieillir plus
longtemps le sol charg [trois semaines 20 C pour les mtaux notamment (22)].
levage des animaux dessai
27. Il est prfrable de conserver les vers en levage de laboratoire permanent. Des conseils sur les mthodes
dlevage en laboratoire concernant Eisenia fetida et Eisenia andrei, et les espces enchytres figurent lappendice
5 [voir aussi (48), (51) et (52)].
28. Il convient que les vers utiliss dans les essais ne prsentent pas de maladies, anomalies ou parasites observables.
DROULEMENT DE LESSAI
29. Les organismes dessai sont exposs la substance dessai durant la phase dabsorption. La phase dabsorption
dure 14 jours (enchytres) ou 21 jours (vers de terre) sauf sil est prouv que ltat stationnaire a t atteint.
30. Pour la phase dlimination, les vers sont transfrs sur un sol dpourvu de la substance dessai. Le premier
chantillon est prlev de 4 24 h aprs le dbut de la phase dlimination. Lappendice 3 donne des exemples
de programme dchantillonnage pour une phase dabsorption de 21 jours et une phase dlimination de 21
jours.
Organismes dessai
31. Chez de nombreuses espces doligochtes terrestres, le poids individuel est trs faible (5 10 mg de poids
humide par individu pour Enchytraeus albidus et moins pour Enchytraeus crypticus ou Enchytraeus luxuriosus); la
pese et lanalyse chimique peuvent ncessiter de runir les vers des rcipients de rplicats (tous les vers dun
rcipient de rplicat sont utiliss afin dobtenir un seul rsultat pour les tissus analyss). Vingt enchytres sont
ajouts chaque rplicat, et au moins trois rplicats sont utiliss. Si la limite de dtection analytique de la
substance dessai est leve, il peut tre ncessaire dutiliser un plus grand nombre de vers. Pour les espces
dessai de poids individuel suprieur (Eisenia fetida et Eisenia andrei), il est possible de recourir des rcipients de
rplicats contenant un seul individu.
32. Il convient que les vers de terre utiliss lors dun essai soient de poids similaire (Eisenia fetida et Eisenia andrei ont
par exemple un poids individuel de 250 600 mg). Les enchytres (Enchytraeus albidus notamment) mesurent
environ 1 cm de long. Tous les vers utiliss pour un mme essai proviennent de la mme source et sont adultes
(avec un clitellum) (appendice 5). Le poids et lge dun animal pouvant influer sur les valeurs de FBA (par
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exemple, du fait dune teneur en lipides variable et/ou de la prsence dufs), ces paramtres sont consigns
avec prcision, et pris en compte dans linterprtation des rsultats. De plus, des cocons sont susceptibles
dapparatre pendant la priode dexposition, ce qui a galement des rpercussions sur les valeurs de FBA. Il
est recommand de peser un sous-chantillon des vers avant lessai afin destimer les poids humides et secs
moyens.
33. Un rapport sol/vers lev est utilis afin de minimiser la baisse de la concentration de la substance dessai dans
le sol durant la phase dabsorption. Il est recommand que ce rapport slve au minimum, pour Eisenia fetida et
Eisenia andrei, 50 g de poids sec de sol par ver et, pour les enchytres, 10-20 g de poids sec de sol par
rcipient dessai. La couche de sol contenu dans les rcipients a une paisseur de 2 3 cm (enchytres) ou de 4
5 cm (vers de terre).
34. Les vers utiliss lors dun essai sont extraits du milieu dlevage (les enchytres par exemple laide de pinces de
joaillier). Les animaux adultes sont transfrs pour acclimatation sur un sol dessai non trait, puis nourris (voir
le paragraphe 36). Si les conditions dessai diffrent des conditions dlevage, une phase dacclimatation de 24
72 h devrait suffire ladaptation des vers aux conditions dessai. Une fois acclimats, les vers de terre sont
transfrs dans des rcipients en verre (des botes de Petri par exemple) contenant une eau propre pour y tre
rincs, puis ils sont pess avant dtre dposs sur le sol dessai. Avant la pese, tout excs deau est enlev en
tapotant dlicatement les vers contre le bord du rcipient ou en les schant prcautionneusement laide dune
serviette en papier lgrement humidifie.
35. Le comportement denfouissement des organismes dessai est observ et consign. Dans les essais mens avec
des vers de terre, les animaux (tmoins et traits) senfouissent dans le sol normalement en quelques heures; ceci
est vrifi 24 h maximum aprs lajout des vers dans le rcipient dessai. Si ce nest pas le cas (par exemple, plus
de 10 % ne senfouissent pas pendant plus de la moiti de la phase dabsorption), soit les conditions dessai ne
sont pas appropries, soit les organismes dessai ne sont pas en bonne sant. Il conviendra alors darrter lessai
et de le rpter. Les enchytres vivant essentiellement dans les pores interstitiels du sol, il arrive souvent que leur
tgument soit seulement partiellement en contact avec le substrat environnant. On suppose que lexposition des
enchytres enfouis et non enfouis est quivalente, et le non-enfouissement des enchytres nexige pas nces
sairement de rpter lessai.
Alimentation
36. Lalimentation des organismes dessai est envisage si le sol utilis prsente une faible teneur en carbone
organique total. Avec un sol artificiel, il est recommand dalimenter les vers suivant une frquence hebdoma
daire (une fois par semaine) raison de 7 mg de fumier sch par gramme de masse sche du sol pour les vers
de terre, et de 2 2,5 mg de flocons davoine moulus par gramme de masse sche du sol pour les enchytres
(11). La premire ration est mlange au sol immdiatement avant lajout des organismes dessai. Il convient
demployer, de prfrence, le mme type dalimentation que pour llevage (appendice 5).
Rgime dclairage et temprature
37. Les essais sont mens suivant un cycle contrl de 16/8 heures de lumire/obscurit, avec une intensit
lumineuse comprise de prfrence entre 400 et 800 lx au niveau des rcipients dessai (3). La temprature
est maintenue 20 2 C tout au long de lessai.
38. Une seule concentration est utilise. Les cas o une ou plusieurs concentrations seraient requises font lobjet
dune justification. Si la toxicit (CEx) de la substance dessai est voisine de la limite de dtection analytique, on
recommande lutilisation dune substance dessai radiomarque, de radioactivit spcifique leve. Pour les
mtaux, la concentration devra tre suprieure la concentration de fond dans les tissus et le sol.
Rplicats
39. Concernant les mesures de cintique (phase dabsorption et dlimination), le nombre minimum de rcipients de
rplicats traits devra tre de trois par point dchantillonnage. Le nombre total de rplicats prpars suffira
couvrir tous les temps de prlvement prvus au cours des phases dabsorption et dlimination.
40. Pour les observations et les mesures biologiques (rapport poids sec/poids humide, teneur en lipides) et pour
lanalyse des concentrations de fond dans les vers et le sol, au moins 12 rcipients de rplicats dun tmoin
ngatif (quatre chantillons prlevs au dmarrage, quatre la fin de la phase dabsorption et quatre la fin de
la phase dlimination) sont fournis, si aucun solvant autre que leau na t utilis. Si un agent de solubilisation
est utilis pour lapplication de la substance dessai, il convient de prvoir, en plus des rplicats traits, des
tmoins solvant (quatre rcipients de rplicats devront faire lobjet dun prlvement au dmarrage, quatre la
fin de la phase dabsorption et quatre la fin de la phase dlimination) contenant tous les constituants,
lexception de la substance dessai. Dans ce cas, quatre rcipients supplmentaires de rplicats dun tmoin
ngatif (sans solvant) pourront galement tre fournis pour procder un nouvel chantillonnage la fin de la
phase dabsorption. Ces rplicats pourront tre compars biologiquement avec le tmoin solvant afin dobtenir
des informations sur une ventuelle influence du solvant sur les organismes dessai. Il est recommand de
prvoir un nombre suffisant de rcipients supplmentaires de rplicats de rserve (huit, par exemple) pour les
vers traits et les vers tmoins.
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Frquence des mesures de la qualit du sol

41. Le pH et le taux dhumidit du sol sont mesurs au dbut et la fin des phases dabsorption et dlimination. La
temprature de la chambre dessai est releve en continu. Il convient de contrler lhumidit du sol une fois par
semaine en pesant les rcipients dessai et en comparant leur poids au moment des contrles avec leur poids en
dbut dessai. Les pertes dhumidit sont compenses par lajout deau dsionise.
chantillonnage et analyse des vers et du sol
42. Lappendice 3 donne un exemple de programme dchantillonnage pour les phases dabsorption et dlimination
des essais de bioaccumulation sur les vers de terre et les enchytres.
43. Un chantillon du sol est prlev dans les rcipients dessai pour dterminer la concentration de la substance
dessai avant lintroduction des vers, puis durant les phases dabsorption et dlimination. Pendant lessai, les
concentrations de la substance dessai sont dtermines dans les vers et dans le sol. En rgle gnrale, on mesure
les concentrations totales dans le sol. On peut galement mesurer les concentrations dans leau interstitielle;
dans ce cas, il convient de justifier ce choix et de dcrire les mthodes appropries prvues avant le dbut de
ltude, puis de consigner ces informations dans le rapport.
44. Les vers et le sol sont chantillonns au moins six reprises durant les phases dabsorption et dlimination. Si
la stabilit dune substance dessai est dmontre, le nombre danalyses du sol peut tre rduit. Il est recom
mand danalyser au moins trois rplicats au dbut et la fin de la phase dabsorption. Si la concentration
mesure dans le sol la fin de la phase dabsorption scarte de la concentration initiale de plus de 30 %, les
chantillons de sol prlevs dautres dates sont galement analyss.
45. Enlever du sol les vers dun rplicat donn chaque temps de prlvement (par exemple, aprs avoir tal le sol
du rplicat sur un plateau peu profond et prlev les vers laide dune pince de joaillier), les rincer rapidement
leau dans un rcipient peu profond en verre ou en acier. Enlever leau en excs (voir le paragraphe 34).
Transfrer dlicatement les vers dans un rcipient pralablement tar, et les peser immdiatement, en incluant le
contenu de lintestin.
46. Les vers de terre (Eisenia sp.) doivent pouvoir purger leur intestin pendant la nuit, par exemple sur un papier
filtre humide dans une bote de Petri ferme (voir paragraphe 34). Aprs la purge, il convient de dterminer le
poids des vers afin dvaluer la perte ventuelle de biomasse pendant lessai (voir les critres de validit au
paragraphe 17). La pese et lanalyse des tissus des enchytres sont effectues sans purge, ceci tant technique
ment difficile en raison de la petite taille de ces vers. Une fois le poids final dtermin, les vers sont tus
immdiatement, en utilisant la mthode la plus approprie (par exemple avec de lazote liquide, ou en congelant
les vers une temprature infrieure - 18 C).
47. Durant la phase dlimination, les vers remplacent le contenu contamin de leur intestin par des lments du sol
propre. Autrement dit, les mesures ralises sur un chantillon de vers qui ne se sont pas purgs (les enchytres
en loccurrence) immdiatement avant la phase dlimination incluent le sol contamin prsent dans lintestin.
Sagissant des oligochtes aquatiques, on suppose quaprs les 4 24 h initiales de la phase dlimination,
lessentiel du contenu intestinal contamin a t remplac par du sdiment propre [voir notamment (46)]. Des
observations similaires ont t rapportes pour les vers de terre lors dtudes sur laccumulation de cadmium et
de zinc radiomarqus (78). Chez les enchytres ne stant pas purgs, la concentration de ce premier chantillon
de la phase dlimination peut tre considre comme la concentration dans les tissus aprs la purge de
lintestin. Pour tenir compte de la dilution de la concentration de la substance dessai par du sol non contamin
durant la phase dlimination, il est possible destimer le poids du contenu de lintestin partir des rapports
poids des vers humides/poids des cendres de vers ou poids des vers secs/poids des cendres de vers.
48. Il est prfrable danalyser les chantillons de sol et de vers immdiatement aprs extraction (cest--dire dans les
1 2 jours suivants) afin dviter des dgradations ou dautres pertes, et il est recommand de calculer les
vitesses approximatives dabsorption et dlimination pendant le droulement de lessai. Si lanalyse est retarde,
les chantillons devront tre stocks suivant une mthode approprie, par exemple, en procdant leur
conglation ( - 18 C).
49. Il conviendra de vrifier que la prcision et la reproductibilit de lanalyse chimique, ainsi que la rcupration de
la substance dessai dans les chantillons de sol et de vers sont satisfaisantes pour la mthode donne; lefficacit
dextraction, la limite de dtection et la limite de quantification devront tre consignes. De mme, il faudra
sassurer que la substance dessai nest pas dtectable dans les rcipients tmoins des concentrations sup
rieures la concentration de fond. Si la concentration de la substance dessai dans lorganisme dessai Ca est > 0
pour les vers tmoins, il faudra linclure au calcul des paramtres cintiques (appendice 2). Pendant toute la
dure de lessai, tous les chantillons sont manipuls de faon rduire au minimum les contaminations et les
pertes (rsultant, par exemple, de ladsorption de la substance dessai sur le dispositif dchantillonnage).
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50. En cas dutilisation de substances dessai radiomarques, il est possible danalyser le produit parent et les
mtabolites. Une quantification de la substance dessai parente et des mtabolites ltat stationnaire ou la
fin de la phase dabsorption fournit des informations importantes. Les chantillons sont alors nettoys de faon
pouvoir quantifier sparment la substance dessai parente. Si des mtabolites simples excdent 10 % de la
radioactivit totale du ou des chantillons analyss, lidentification de ces mtabolites est recommande.
51. La rcupration globale et la rcupration de la substance dessai dans les vers, le sol, et le cas chant, dans les
piges contenant des absorbants permettant de retenir la substance dessai vapore, sont consignes et rappor
tes.
52. Le regroupement dindividus chantillonns partir dun rcipient dessai donn est acceptable pour les enchy
tres, plus petits que les vers de terre. Si ce regroupement implique de rduire le nombre de rplicats, cela
restreint les procdures statistiques pouvant sappliquer aux donnes. Si une procdure et une puissance
statistiques spcifiques sont requises, alors lessai comprend un nombre adquat de rcipients de rplicats,
adapt aux quantits, la procdure et la puissance voulues.
53. Il est recommand dexprimer le FBA la fois comme une fonction du poids sec total et, si ncessaire ( savoir
pour des substances fortement hydrophobes), comme une fonction de la teneur en lipides. La teneur en lipides
est dtermine par des mthodes appropries [certaines mthodes existantes, voir par exemple (31) ou (58), ont
besoin dtre adaptes cette fin]. Ces mthodes sappuient sur une technique dextraction au chloroforme/
mthanol. Toutefois, afin dviter lutilisation de solvants chlors, il convient dutiliser une version modifie de la
mthode de Bligh et Dyer (9) qui est dcrite dans (17). Comme les diverses mthodes ne conduisent pas
forcment des valeurs identiques, il est important de dtailler la mthode employe. Lorsque cela est possible,
cest--dire si on dispose de suffisamment de tissu de vers, la teneur en lipides est, idalement, analyse partir
du mme chantillon ou extrait que la substance dessai, lextrait devant souvent tre dbarrass de ses lipides
avant dtre analys par chromatographie (49). Une autre possibilit consiste mesurer la teneur en lipides sur
des animaux tmoins et utiliser la valeur obtenue pour normaliser les valeurs de FBA. Cette dernire approche
rduit la contamination de lquipement par la substance dessai.
RSULTATS ET RAPPORT
54. On obtient la courbe dabsorption de la substance dessai en portant la concentration de la substance dessai
dans/sur les vers durant la phase dabsorption en fonction du temps, en chelle arithmtique. Lorsque la courbe
atteint un plateau ou tat stationnaire (voir les dfinitions lappendice 1), le facteur de bioaccumulation ltat
stationnaire (FBAss) est calcul laide de la formule suivante:
Ca ltat stationnaire ou la fin de la phase dabsorption moyenne

Cs ltat stationnaire ou la fin de la phase dabsorption moyenne
Ca reprsente la concentration de la substance dessai dans lorganisme dessai, et

Cs la concentration de la substance dessai dans le sol.
55. Si la courbe natteint pas de plateau, le FBAK, fond sur les constantes de vitesse, devra tre dtermin la place
du BAFss comme suit:
dterminer le facteur daccumulation (FBAK) comme le rapport ks/ke,
les vitesses dabsorption et dlimination sont calcules de prfrence simultanment (voir lquation 11
lappendice 2),
La constante de vitesse dlimination (ke) est gnralement dtermine partir de la courbe dlimination
(cest--dire du trac de la concentration de la substance dessai dans les vers durant la phase dlimination).
La constante de vitesse dabsorption ks est ensuite calcule en fonction de ke et dune valeur de Ca qui est
drive de la courbe dabsorption voir la description de ces mthodes lappendice 2. La mthode prfre
pour lobtention du FBAK et des constantes de vitesse, ks et ke, consiste utiliser des mthodes informatises
non linaires destimation des paramtres. Si la courbe dlimination nobit manifestement pas une
cintique du premier ordre, des modles plus complexes devront alors tre utiliss.
Rapport dessai
56. Le rapport dessai comporte les informations suivantes:
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Substance dessai:
toute information disponible sur la toxicit aigu ou long terme (par exemple CEx, CLx, CSEO) de la
substance dessai vis--vis des oligochtes fouisseurs,
puret, tat physique et proprits physico-chimiques, par exemple log Kow, solubilit dans leau,
donnes didentification de la substance; provenance de la substance dessai, identit et concentration des
solvants ventuellement utiliss,
en cas dutilisation dune substance dessai radiomarque, position prcise des atomes marqus, radioactivit
spcifique et puret radiochimique.
Espces dessai:
nom scientifique, souche, source, traitement pralable ventuel, acclimatation, ge, taille, etc.
Conditions dessai:
procdure dessai utilise,
type et caractristiques de lclairage utilis et photopriode(s),
protocole dessai (par exemple, nombre et dimension des rcipients dessai, masse du sol et paisseur de la
couche de sol, nombre de rplicats, nombre de vers par rplicat, nombre de concentrations dessai, dure des
phases dabsorption et dlimination, frquence dchantillonnage),
justification du matriau choisi pour les rcipients dessai,
mthode de prparation et dapplication de la substance dessai, ainsi que raisons du choix de la mthode,
concentrations dessai nominales, moyennes et carts-types des valeurs mesures dans les rcipients dessai,
et mthode dobtention de ces valeurs,
source des constituants du sol artificiel ou si un milieu naturel est utilis origine du sol, description dun
ventuel traitement pralable, rsultats des contrles (survie, augmentation de la biomasse, reproduction),
caractristiques du sol [pH, teneur totale en carbone organique, distribution granulomtrique (pourcentage
de sable, de limon et dargile), capacit maximale de rtention deau (CREmax), teneur en eau au dbut et la
fin de lessai, et toutes autres mesures ralises],
informations dtailles sur le traitement des chantillons de sol et de vers, y compris les dtails concernant
la prparation, le stockage, les procdures de chargement en substance dessai, lextraction et les procdures
analytiques (et leur prcision) pour la substance dessai dans les vers et le sol, la teneur en lipides (si
mesure), et les mthodes de rcupration de la substance dessai.
Rsultats:
mortalit des vers tmoins et des vers dans chaque rcipient dessai et ventuel comportement anormal
observ (par exemple, vitement du sol, absence de reproduction lors dun essai de bioaccumulation chez les
enchytres),
rapport poids sec/poids humide du sol et des organismes dessai (utiles pour la normalisation),
poids humides des vers chaque temps de prlvement; pour les vers de terre, poids humides au dbut de
lessai, et chaque temps de prlvement avant et aprs la purge de lintestin,
teneur en lipides des organismes dessai (si dtermine),
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courbes montrant les constantes cintiques dabsorption et dlimination de la substance dessai chez les vers,
et la dure pour atteindre ltat stationnaire,
Ca et Cs (avec cart-type et fourchette, si ncessaire) pour tous les temps de prlvement (Ca exprim en
g.kg-1 de poids humide et sec du corps entier, Cs exprim en g.kg-1 du poids humide et sec). Si un facteur
daccumulation biote-sol (BSAF) est ncessaire (par exemple, pour une comparaison des rsultats entre deux
essais ou plus raliss avec des animaux de teneurs en lipides diffrentes), Ca est en plus tre exprim en
g.kg-1 de teneur en lipides de lorganisme et Cs est exprim en g.kg-1 de carbone organique (CO) du sol,
FBA (exprim en kg de sol kg-1 de ver), constante de vitesse dabsorption du sol ks (exprime en g de sol kg1
de vers j-1), et constante de vitesse dlimination ke (exprime en j-1); ventuellement, BSAF (exprim en kg
de CO du sol kg-1 de teneur en lipides des vers),
le cas chant: pourcentages de substance parente, de mtabolites et de rsidus lis (cest--dire le pourcen
tage de substance dessai ne pouvant tre extraite par les mthodes dextraction courantes) dtects dans le
sol et les animaux dessai,
mthodes utilises pour les analyses statistiques des donnes.
valuation des rsultats:
conformit des rsultats avec les critres de validit tels qunoncs au paragraphe 17,
rsultats inattendus ou inhabituels, par exemple limination incomplte de la substance dessai des animaux
dessai.
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(77) Venter J.M. and Reinecke A.J. (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South
African J. Zool. 23: 161-165.
(78) Vijver M.G., Vink J.P.M., Jager T., Wolterbeek H.T., van Straalen N.M., van Gestel C.A.M. (2005). Biphasic
elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated
floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
(79) Widianarko B. and Van Straalen N.M. (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonper
sistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402406.
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Appendice 1
DFINITIONS
La bioaccumulation est laugmentation de concentration de la substance dessai dans ou sur un organisme, par rapport
la concentration de la substance dessai dans le milieu environnant. La bioaccumulation est le rsultat combin des
processus de bioconcentration et de bioamplification (voir ci-dessous).
La bioconcentration est laugmentation de concentration de la substance dessai dans ou sur un organisme, rsultant de
labsorption de la substance exclusivement depuis le milieu environnant ( savoir via la surface du corps et le sol ingr),
par rapport la concentration de la substance dessai dans le milieu environnant.
La bioamplification est laugmentation de concentration de la substance dessai dans ou sur un organisme, rsultant
principalement de labsorption daliments ou de proies contamins, par rapport la concentration de la substance dessai
dans lalimentation ou la proie. La bioamplification peut conduire un transfert ou une accumulation de la substance
dessai dans les rseaux trophiques.
Llimination dune substance est la perte de cette substance par les tissus de lorganisme dessai selon des processus actifs
ou passifs survenant indpendamment de la prsence ou de labsence de la substance dessai dans le milieu environnant.
Le facteur de bioaccumulation (FBA) nimporte quel instant de la phase dabsorption de lessai de bioaccumulation, est
la concentration de la substance dessai dans ou sur lorganisme dessai (Ca en g.kg-1 de poids humide ou sec de ver)
divise par la concentration de la substance dans le milieu environnant (Cs en g.kg-1 de poids de sol humide ou sec). Le
FBA est exprim en kg de sol kg-1 de ver.
Le facteur de bioaccumulation ltat stationnaire (FBAss), qui est le FBA ltat stationnaire, ne varie pas de faon
significative pendant une longue priode, la concentration de la substance dessai dans le milieu environnant (Cs en g kg-1
de poids de sol sec) tant constante pendant cette priode.
Les facteurs de bioaccumulation calculs directement partir du rapport de la constante de vitesse dabsorption du sol
divise par la constante de vitesse dlimination (ks et ke, voir ci-dessous), sont appels facteurs de bioaccumulation
cintiques (FBAK).
Le facteur daccumulation biote-sol (BSAF) est la concentration de la substance dessai normalise par rapport aux
lipides dans/sur lorganisme dessai, divise par la concentration de la substance dessai normalise par rapport au carbone
organique, dans le sol ltat stationnaire. Ca est alors exprime en g.kg-1 de teneur en lipides de lorganisme, et Cs en
g.kg-1 de teneur en carbone organique du sol; le BSAF est exprim en kg de CO.kg-1 de lipides.
Un plateau ou tat stationnaire est dfini comme lquilibre entre les processus dabsorption et dlimination survenant
simultanment durant la phase dexposition. Ltat stationnaire est atteint, dans le trac du FBA en fonction du temps,
lorsque la courbe devient parallle laxe des temps et que trois analyses successives de FBA ralises sur des chantillons
pris intervalles dau moins deux jours ne diffrent pas de plus de 20 % les uns des autres et quil ny a pas de diffrence
statistique significative entre les trois priodes dchantillonnage. Pour les substances dessai absorbes lentement, des
intervalles plus appropris seraient de sept jours (49).
Le coefficient de partage carbone organique-eau (Kco) est le rapport de la concentration dune substance dans/sur la
fraction de carbone organique dun sol et de la concentration de substance dans leau lquilibre.
Le coefficient de partage octanol-eau (Kow) est le rapport des solubilits de la substance dans le n-octanol et dans leau
lquilibre; il est parfois exprim par Pow. Le logarithme de Kow (log Kow) est utilis comme indicateur du potentiel de
bioaccumulation de la substance par les organismes aquatiques.
La phase dabsorption ou dexposition est la dure pendant laquelle les organismes dessai sont exposs la substance
dessai.
La constante de vitesse dabsorption du sol (ks) est la valeur numrique dfinissant la vitesse daugmentation de la
concentration de la substance dessai dans/sur lorganisme dessai rsultant de labsorption de la phase du sol. ks est
exprim en g de sol kg-1 de ver j-1.
La phase dlimination est la dure, suite au transfert des organismes dessai depuis un milieu contamin dans un milieu
dpourvu de la substance dessai, durant laquelle est tudie llimination (ou la perte nette) de la substance par les
organismes dessai.
La constante de vitesse dlimination (ke) est la valeur numrique dfinissant la vitesse de rduction de la concentration
de la substance dessai dans/sur lorganisme dessai, suite au transfert des organismes dessai depuis un milieu contenant
llment dessai vers un milieu dpourvu de cette substance. ke est exprim en j-1.
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Appendice 2
Calcul des paramtres dabsorption et dlimination
Le principal effet observ dun essai de bioaccumulation est le facteur de bioaccumulation, FBA. Il est possible de calculer
le FBA en divisant la concentration dans lorganisme dessai, Ca, par la concentration dans le sol, Cs, ltat stationnaire. Si
ltat stationnaire nest pas atteint durant la phase dabsorption, le FBAK est calcul partir des constantes de vitesse et
non du FBAss. Il convient dindiquer si le FBA est bas, ou non, sur des concentrations ltat stationnaire.
La procdure habituelle pour obtenir le facteur de bioaccumulation cintique (FBAK), la constante de vitesse dabsorption
du sol (ks) et la constante de vitesse dlimination (ke) consiste faire appel des mthodes informatises non linaires
destimation des paramtres, par exemple partir des modles dcrits dans (68). Daprs un ensemble de valeurs squen
tielles de la concentration en fonction du temps et les quations de modles:
Ca
ks
Cs 1 ek et
ke
0 < t < tc
[quation 1]
t > tc
[quation 2]
ou
Ca
ks
Cs ek ettc ek et
ke
o:
Ca = concentration de la substance dans les vers [g.kg-1 de poids humide ou sec]
ks = constante de vitesse dabsorption dans les tissus [g de sol kg-1 de ver j - 1]
Cs = concentration de la substance dans le sol [g.kg-1 de poids humide ou sec]
ke = constante de vitesse dlimination [j - 1]
tc = temps la fin de la phase dabsorption,
ces programmes informatiques calculent les valeurs de FBAK, ks et ke.
Lorsque la concentration de fond dans les vers non exposs, par exemple au jour 0, diffre sensiblement de zro (cela
peut tre le cas pour les mtaux notamment), cette concentration (Ca,0) est incluse dans ces quations comme suit:
Ca Ca;0
ks
Cs 1 ek et
ke
0 < t < tc
[quation 3]
t > tc
[quation 4]
et
Ca Ca;0
ks
Cs ek ettc ek et
ke
Dans les cas o lon observe une forte baisse de la concentration de la substance dessai dans le sol durant la phase
dabsorption, il est possible de recourir aux modles suivants (par exemple, (67) et (79):
Cs = C0(ek0t)
[quation 5]
o:
Cs = concentration de la substance dans le sol [g.kg-1 de poids humide ou sec]
k0 = constante de vitesse de dgradation dans le sol [d-1]
C0 = concentration initiale de la substance dans le sol [g.kg-1 de poids humide ou sec]
Ca
ks
ek0 t ek et
ke k0
0 < t < tc
[quation 6]
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Ca
ks
ek0 tc ek etc ekttc
ke k0
t > tc
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[quation 7]
o:
Ca = concentration de la substance dans les vers [g.kg-1 de poids humide ou sec]
ks = constante de vitesse dabsorption dans les tissus [g de sol kg-1 de vers j-1]
k0 = constante de vitesse de dgradation dans le sol [j - 1]
ke = constante de vitesse dlimination [j - 1]
tc = temps la fin de la phase dabsorption.
Lorsquon a atteint un tat stationnaire durant la phase dabsorption (cest--dire t = ), il est possible de rduire
lquation 1
ks
Ca Cs 1 ek et
0 < t < tc
[quation 1]
ke
:
Ca
ks
Cs
ke
ou
Ca/Cs = ks/ke = BAFK
[quation 8]
Ensuite ks/ke Cs donne une valeur approche de la concentration de la substance dessai dans le tissu du ver ltat
stationnaire (Ca,ss).
Le facteur daccumulation biote-sol (BSAF) peut se calculer comme suit:
foc
BSAF BAFK
flip
[quation 9]
o foc est la fraction de carbone organique dans le sol, et flip est la fraction de lipides dans le ver, toutes deux tant
dtermines, de prfrence, sur des chantillons prlevs de lessai, et bases respectivement soit sur le poids sec, soit sur le
poids humide.
Il est possible de modliser les constantes cintiques dlimination en utilisant les donnes issues de la phase dlimination
et en appliquant lquation de modle suivante et une mthode informatise non linaire destimation des paramtres. Si le
trac des donnes en fonction du temps indique une dcroissance exponentielle constante de la concentration de la
substance dessai dans les animaux, le droulement temporel de llimination peut tre dcrit par un modle un
compartiment (quation 9).
Ca(t) = Ca,ss eket
[quation 10]
Les processus dlimination semblent parfois se drouler en deux tapes, montrant une dcroissance rapide de Ca au cours
des premires tapes, qui volue vers une perte plus lente des lments dessai dans les tapes ultrieures de llimination
[par exemple (27), (68)]. Les deux tapes peuvent tre interprtes en faisant lhypothse de lexistence de deux compar
timents dans lorganisme, compartiments partir desquels la substance dessai est limine diffrentes vitesses. Dans ces
cas particuliers, il convient dtudier la littrature pertinente, par exemple (38), (39), (40), (78).
laide des quations de modles ci-dessus, on peut galement calculer les paramtres cintiques (ks et ke) en une seule
fois, en appliquant un modle de cintique du premier ordre toutes les donnes des phases dabsorption et dlimination
simultanment. Pour une description dune mthode pouvant permettre un tel calcul combin des constantes de vitesse
dabsorption
B (73) et (70).
B
et dlimination, consulter (41),
Ks
Ks
Cs 1 eke t m 1
Cs eKe ttc eKe t m 2
[quation 11]
Ca
Ke
ke
Note: quand les paramtres dabsorption et dlimination sont estims simultanment partir des donnes combines
dabsorption et dlimination, m tel que mentionn dans lquation 11 est un descripteur qui permet au
programme informatique dattribuer les sous-termes de lquation aux ensembles de donnes de la phase corres
pondante et de faire une valuation correcte (m = 1 pour la phase dabsorption; m = 2 pour la phase dlimination).
Quoi quil en soit, ces quations de modles seront utilises avec prcaution, en particulier lorsque des modifications de la
biodisponibilit de la substance dessai, ou (bio)dgradation, surviennent durant lessai [voir notamment (79)].
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Appendice 3
EXEMPLES DE PROGRAMMES DCHANTILLONNAGE POUR DES ESSAIS DE BIOACCUMULATION DANS LE SOL
Essai sur des vers de terre
a) Phase dabsorption avec 8 dates dchantillonnage pour le calcul des paramtres cintiques
Jour
Activit
- 6
Conditionnement du sol prpar durant 48 h.
- 4
Chargement dune fraction du sol avec la solution de la substance dessai; vaporation de tout
solvant; mlange des constituants du sol; rpartition du sol dans les rcipients dessai; quili
bration dans les conditions dessai durant 4 jours (3 semaines pour les sols chargs en mtaux).
- 3 - 1
Sparation des organismes dessai du milieu dlevage pour acclimatation; prparation et humi
dification des constituants du sol.
Mesure de la temprature et du pH du sol; retrait dchantillons de sol des rcipients traits et des
tmoins au solvant pour la dtermination de la concentration de la substance dessai; ajout dune
ration alimentaire; pese et distribution alatoire des vers dans les rcipients dessai; conservation
dun nombre suffisant de sous-chantillons de vers pour la dtermination des valeurs de fond
analytiques, des poids humide et sec, ainsi que de la teneur en lipides; pese de tous les rcipients
dessai pour le contrle de lhumidit du sol; contrle de lalimentation en air, en cas de systme
en circuit ferm.
Contrle de lalimentation en air, consignation du comportement des vers et de la temprature;

prlvement dchantillons de sol et de vers pour la dtermination de la concentration de la
substance dessai.
Comme le 1er jour.
Contrle de lalimentation en air, du comportement des vers et de la temprature.
Comme le 1er jour.
5 6
Comme le 3e jour.
Comme le 1er jour; ajout dune ration alimentaire; contrle de lhumidit du sol en pesant de
nouveau les rcipients dessai et en compensant leau vapore.
8 9
Comme le 3e jour.
10
Comme le 1er jour.
11 13
Comme le 3e jour.
14
15 16
Comme le 3e jour.
17
Comme le 1er jour.
18 20
Comme le 3e jour.
21
Comme le 1er jour; mesure de la temprature et du pH du sol; contrle de lhumidit du sol en

pesant de nouveau les rcipients dessai; fin de la phase dabsorption; transfert des vers des
rplicats exposs restants vers des rcipients contenant du sol propre pour la phase dlimination
(sans purge de lintestin); chantillonnage du sol et des vers des tmoins au solvant.
Les activits pralables lexposition (phase dquilibration) sont programmes en tenant compte
des proprits de la substance dessai.
Les activits dcrites pour le 3e jour sont ralises quotidiennement (au moins les jours ouvrs).
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b) Phase dlimination
Jour
Activit
- 6
Prparation et humidification des constituants du sol; conditionnement du sol prpar durant

48 h.
- 4
Mlange des constituants du sol; rpartition du sol dans les rcipients dessai; incubation dans les
conditions dessai durant 4 jours.
0 (fin de la phase
dabsorption)
Mesure de la temprature et du pH du sol; pese et distribution alatoire des vers dans les
rcipients dessai; ajout dune ration alimentaire; transfert des vers des rplicats exposs restants
vers des rcipients contenant du sol propre; prlvement dchantillons de sol et de vers aprs 4
6 h pour la dtermination de la concentration de la substance dessai.

substance dessai.
Comme le 1er jour.
Comme le 1er jour.
5 6
Comme le 3e jour.
8 9
Comme le 3e jour.
10
Comme le 1er jour.
11 13
Comme le 3e jour.
14
15 16
Comme le 3e jour.
17
Comme le 1er jour.
18 20
Comme le 3e jour.
21
Comme le 1er jour; mesure de la temprature et du pH du sol; contrle de lhumidit du sol en

pesant de nouveau les rcipients dessai; chantillonnage du sol et des vers des tmoins au
solvant.
La prparation du sol avant le dbut de la phase dlimination intervient de la mme manire
quavant la phase dabsorption.
Les activits dcrites pour le 3e jour sont ralises quotidiennement (au moins les jours ouvrs).
Essai sur des enchytres

a) Phase dabsorption avec 8 dates dchantillonnage pour le calcul des paramtres cintiques
Jour
Activit
- 6
Conditionnement du sol prpar durant 48 h.
- 4
Chargement dune fraction du sol avec la solution de la substance dessai; vaporation de tout
solvant; mlange des constituants du sol; rpartition du sol dans les rcipients dessai; quili
bration dans les conditions dessai durant 4 jours (3 semaines pour les sols chargs en mtaux).
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L 81/250
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Jour
Activit
- 3 - 1
Sparation des organismes dessai du milieu dlevage pour acclimatation; prparation et humi
dification des constituants du sol.
Mesure de la temprature et du pH du sol; retrait dchantillons de sol des rcipients traits et des
tmoins au solvant pour la dtermination de la concentration de la substance dessai; ajout dune
ration alimentaire dans le sol; pese et distribution alatoire des vers dans les rcipients dessai;
conservation de suffisamment de sous-chantillons de vers pour la dtermination des valeurs de
fond analytiques, du poids sec et humide et de la teneur en lipides; pese de tous les rcipients
dessai pour le contrle de lhumidit du sol; contrle de lalimentation en air, en cas de systme
en circuit ferm.

substance dessai.
Comme le 1er jour.
Comme le 1er jour.
5 6
Comme le 3e jour.
Comme le 1er jour; ajout dune ration alimentaire dans le sol; contrle de lhumidit du sol en
pesant de nouveau les rcipients dessai et en compensant leau vapore.
Comme le 1er jour.
10
Comme le 3e jour.
11
Comme le 1er jour.
12 13
Comme le 3e jour.
14
Comme le 1er jour; ajout dune ration alimentaire dans le sol; mesure de la temprature et du pH
du sol; contrle de lhumidit du sol en pesant de nouveau les rcipients dessai; fin de la phase
dabsorption; transfert des vers des rplicats exposs restants vers des rcipients contenant du sol
propre pour la phase dlimination (sans purge de lintestin); chantillonnage du sol et des vers
des tmoins au solvant.
Les activits pralables lexposition (phase dquilibration) sont programmes en tenant compte
des proprits de la substance dessai.
Les activits dcrites pour le 3e jour sont ralises quotidiennement (au moins les jours ouvrs)
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Appendice 4
Sol artificiel recommandations pour la prparation et le stockage
Les sols naturels provenant dune source particulire ne sont pas toujours disponibles tout au long de lanne, et des
organismes indignes ainsi que la prsence de micropolluants peuvent influer sur lessai; il est donc recommand dutiliser
un substrat artificiel, le sol artificiel dcrit au chapitre C.8 de la prsente annexe, Toxicit pour les vers de terre (48).
Plusieurs espces dessai peuvent survivre, se dvelopper et se reproduire dans ce sol, et une normalisation maximum
double dune comparabilit intra- et interlaboratoire des conditions dessai et dlevage est propose.
Constituants du sol:
Tourbe:
10 %
Tourbe de sphaigne, conformment la ligne directrice 207 de lOCDE (48).
Sable quartzique:
70 %
Sable quartzique industriel (sch lair); taille des grains: plus de 50 % des
particules seront dans une fourchette comprise entre 50 et 200 m, mais
toutes seront 2 mm.
Argile kaolinique:
20 %
Teneur en kaolinite 30 %.
Carbonate de calcium:
1%
CaCO3, pulvris, chimiquement pur.
Il est galement possible de rduire la teneur en carbone organique du sol artificiel, notamment en abaissant la teneur en
tourbe 4-5 % de sol sec et en augmentant la teneur en sable en consquence. Cette rduction de la teneur en carbone
organique est susceptible de diminuer les possibilits dadsorption de la substance dessai sur le sol (carbone organique) et
daugmenter la disponibilit de la substance dessai pour les vers (74). Il a t dmontr que Enchytraeus albidus et Eisenia
fetida peuvent satisfaire aux critres de validit concernant la reproduction lorsquils sont tests sur des sols naturels dont
la teneur en carbone organique est infrieure (2,7 %, par exemple) (33) et (61), et on a constat exprimentalement quil
pouvait en aller de mme sur un sol artificiel renfermant 5 % de tourbe.
Prparation
Les constituants secs du sol sont soigneusement mlangs (par exemple, dans un grand mlangeur de laboratoire). Ce
mlange est ralis environ une semaine avant le dbut de lessai. Le mlange sec de constituants du sol est humidifi avec
de leau dsionise au moins 48 h avant lapplication de la substance dessai de manire quilibrer/stabiliser lacidit.
Pour dterminer le pH, on utilisera un mlange de sol et dune solution de 1 M KCl suivant un rapport de 1/5. Si le pH ne
se trouve pas dans la plage requise (6,0 0,5), soit on ajoute au sol une quantit suffisante de CaCO3, soit on prpare un
nouveau lot de sol.
La capacit maximale de rtention deau (CRE) du sol artificiel est dtermine conformment la norme ISO 11268-2
(35). Au moins deux jours avant de dmarrer lessai, on humidifie le sol artificiel sec en ajoutant suffisamment deau
dsionise ou reconstitue pour obtenir approximativement la moiti de la teneur finale en eau. Cette teneur finale en eau
devrait reprsenter 40 % 60 % de la CRE maximale. Au dbut de lessai, on divise le sol pralablement humidifi en lots
dun nombre gal celui des concentrations dessai et des tmoins utiliss pour lessai, et, en employant la solution de la
substance dessai et/ou en ajoutant de leau dsionise ou reconstitue, on ajuste le taux dhumidit pour quil se trouve
entre 40 et 60 % de la CREmax. Le taux dhumidit est dtermin au dbut et la fin de lessai ( 105 C). Il sera optimal
pour satisfaire les exigences des espces (le taux dhumidit peut aussi tre contrl comme suit: le sol lgrement press
dans la main doit laisser apparatre de petites gouttes deau entre les doigts).
Stockage
Les constituants secs du sol artificiel peuvent tre stocks temprature ambiante jusqu leur utilisation. Le sol prpar,
prhumidifi peut tre stock dans un endroit frais pendant maximum trois jours avant dtre charg; il convient de veiller
minimiser lvaporation de leau. Un sol charg avec la substance dessai sera utilis immdiatement, sauf si des
informations spcifient quil est possible de stocker ce sol sans affecter la toxicit et la biodisponibilit de la substance
dessai. Des chantillons de sol charg peuvent alors tre stocks dans les conditions recommandes pour la substance
dessai donne jusqu lanalyse.
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Appendice 5
Espces doligochtes terrestres recommandes pour les essais de bioaccumulation dans le sol
Vers de terre
Lespce dessai recommande est Eisenia fetida (Savigny, 1826), qui appartient la famille des Lumbricidae. Depuis 1972,
on la divise en deux sous-espces [Eisenia fetida et Eisenia andrei (10)]. Selon Jaenike (36), il sagit l de deux espces part
entire. Eisenia fetida est facilement reconnaissable ses larges bandes jaunes entre les segments alors quEisenia andrei
prsente une couleur rouge fonc uniforme. Probablement originaires de la rgion de la mer Noire, elles sont aujourdhui
prsentes partout dans le monde, surtout dans les habitats modifis par les activits anthropiques comme les tas de
compost. Toutes deux se prtent la ralisation dessais cotoxicologiques et dessais de bioaccumulation.
Eisenia fetida et Eisenia andrei sont disponibles dans le commerce, notamment comme appt pour la pche. Par rapport
dautres vers de terre de la mme famille, ces deux espces ont un cycle de vie court et atteignent leur maturit en 2 3
mois ( temprature ambiante). Leur temprature optimale oscille entre 20 et 24 C. Elles prfrent les substrats relati
vement humides, dun pH presque neutre et forte teneur en matire organique. Ces espces tant largement utilises
dans les essais cotoxicologiques normaliss depuis environ 25 ans, leur levage est bien tabli (48) (77).
Ces deux espces peuvent tre leves dans des djections animales trs diverses. Le milieu dlevage recommand par
lISO (35) est un mlange 50/50 de crottin de cheval ou de bouse de vache et de tourbe. Le milieu aura un pH denviron
6 7 (ajust avec du carbonate de calcium), une faible conductivit ionique (une concentration de sels infrieure 0,5 %
ou 6 mS/cm) et ne sera pas trop contamin par de lammoniac ou des urines animales. Il est galement possible
dutiliser de la terre de jardin, vendue dans le commerce, qui soit sans additifs, un sol artificiel tel que dfini par lOCDE
(48), ou encore un mlange des deux, parts gales (50/50). Le substrat sera humide, mais pas mouill. Des botes
dlevage dune capacit de 10 50 litres conviennent.
Pour obtenir une population de vers homogne quant lge et la masse, il vaut mieux commencer llevage avec des
cocons. cet effet, des vers adultes sont ajouts une bote dlevage qui contient du substrat frais pour produire des
cocons. Lexprience a montr quune densit dmographique denviron 100 vers adultes par kg de substrat (poids
humide) donne de bons taux de reproduction. Aprs 28 jours, les vers adultes sont retirs. Les vers de terre clos
sont utiliss pour les essais une fois adultes, soit 2 mois plus tard au moins mais pas au-del de 12 mois.
Les vers des espces dcrites prcdemment peuvent tre considrs comme sains sils se dplacent dans le substrat, ne
tentent pas de sen chapper et se reproduisent continuellement. Une extrmit postrieure qui bouge trs lentement ou
qui est jaune (sagissant dE. fetida) indique un puisement du substrat. Il est alors recommand dutiliser du substrat frais
et/ou de rduire le nombre danimaux par bote.
Rfrences bibliographiques complmentaires
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Graff O. (1953). Die Regenwrmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81.
Rmbke J., Egeler P., Fll C. (1997). Literaturstudie ber Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen
Medium. Bericht fr das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
Rundgren S. (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55.
Satchell J.E. (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201.
Sims R.W. and Gerard B.M. (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171.
Tomlin A.D. (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology - from Darwin to vermi
culture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp.
Enchytres
Lespce dessai recommande est Enchytraeus albidus, Henle 1837 (ver blanc). Enchytraeus albidus est lune des plus grosses
espces (jusqu 15 mm) de la famille des annlides oligochtes (Enchytraeidae) et cest la plus rpandue dans le monde (8).
Enchytraeus albidus colonise des habitats marins, dulcicoles et terrestres, constitus la plupart du temps de matire
organique en dcomposition (algues, compost), et frquente rarement les prairies (42). Le fait quil tolre une gamme
tendue de conditions cologiques et certaines variations morphologiques indiquent quil pourrait exister diffrentes races.
Enchytraeus albidus est disponible dans le commerce, plus particulirement sous forme de nourriture pour les poissons. Il
convient de vrifier si llevage est contamin par dautres espces, gnralement plus petites (60). Dans laffirmative, tous
les vers sont lavs leau dans une bote de Petri. De grands spcimens adultes dEnchytraeus albidus sont ensuite
19.3.2014
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slectionns ( laide dun stromicroscope) pour commencer un nouvel levage. Tous les autres vers sont limins. Le
cycle de vie de ces vers est court puisquils arrivent maturit entre 33 jours ( 18 C) et 74 jours ( 12 C). Seuls les vers
ayant t conservs en laboratoire pendant au moins 5 semaines (une gnration) sans problme devront tre utiliss pour
des essais.
Dautres espces du genre Enchytraeus conviennent galement, notamment Enchytraeus luxuriosus. Lunivers de vie de cette
espce est le sol, comme rcemment dcrit dans (65). Si on utilise dautres espces dEnchytraeus, il faut les identifier
clairement et justifier ce choix dans le rapport.
Lespce Enchytraeus crypticus (Westheide et Graefe, 1992) appartient au mme groupe quE. luxuriosus. Lexistence
Enchytraeus crypticus dans la nature nest pas certaine, cette espce nayant t dcrite que dans les levages de lombrics
et les tas de compost (Rmbke, 2003). Par consquent, on ne connat pas ses besoins cologiques dorigine. Cependant,
des tudes rcemment menes en laboratoire avec diffrents sols naturels ont confirm la grande tolrance de cette espce
vis--vis de proprits du sol telles que le pH et la texture (Jnsch et al., 2005). Ces dernires annes, cette espce a
souvent t utilise dans des tudes cotoxicologiques en raison de sa facilit dlevage et de mise lessai (Kuperman et
al., 2003). Nanmoins, elle est petite (3-12 mm; 7 mm en moyenne) (Westheide et Mller, 1996), ce qui la rend plus
difficile manipuler quEnchytraeus albidus. Si on utilise cette espce et non Enchytraeus albidus, les rcipients dessai peuvent
tre de plus petite taille, mais cela nest pas ncessaire. En outre, il convient de considrer que cette espce se reproduit
trs rapidement, son temps de gnration tant infrieur 20 jours 20 2 C (Achazi et al., 1999), voire encore plus
court des tempratures suprieures.
Les Enchytraeidae de lespce Enchytraeus albidus (comme dautres espces denchytres) peuvent tre levs dans de grandes
botes en plastique (par exemple: 30 60 10 cm ou 20 12 8 cm, ce qui convient la culture de vers de petite
taille) remplies dun mlange de sol artificiel et dune terre de jardin, vendue dans le commerce, non contamine et sans
additifs. Lemploi de compost, qui risque de contenir des substances toxiques, telles que des mtaux lourds, est viter. La
faune est retire du sol dlevage avant usage par triple conglation. Un sol entirement artificiel est galement envisagea
ble, mais le taux de reproduction pourrait tre moindre par rapport celui obtenu avec des substrats mixtes. Il convient
que le substrat prsente un pH de 6,0 0,5. Les vers sont conservs dans un incubateur une temprature de 15 2 C
sans lumire. Dans tous les cas, il convient dviter une temprature suprieure 23 C. Ce sol artificiel/naturel sera
humide, mais pas mouill. Lgrement press dans la main, il laissera apparatre de petites gouttes deau. Dans tous les cas,
on vite de crer des conditions anoxiques (si on utilise un couvercle, ce dernier devra comporter un nombre de trous
suffisamment lev pour assurer un change dair appropri). Il convient darer le sol dlevage en le remuant dlicate
ment une fois par semaine.
Les vers sont nourris au moins une fois par semaine ad libitum avec des flocons davoine placs dans une cavit la
surface du sol et recouverte de sol. Si de la nourriture reste de la fois prcdente, il convient dajuster la ration alimentaire
ajouter. Si la nourriture restante est infeste de champignons, elle est remplace par une nouvelle ration de flocons
davoine. Pour favoriser la reproduction, les flocons davoine peuvent tre remplacs toutes les deux semaines par une
poudre protique du commerce, enrichie en vitamines. Aprs trois mois, les animaux sont transfrs vers un substrat
dlevage frachement prpar. Les flocons davoine, qui sont conservs dans des rcipients hermtiquement ferms, sont
passs lautoclave ou chauffs avant lemploi afin de prvenir toute infection par des acariens de stockage (Glycyphagus
sp., Astigmata, Acarina, par exemple) ou des acariens prdateurs [Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina, par
exemple]. Une fois dsinfecte, la nourriture est moulue de faon pouvoir tre facilement parseme la surface du sol. Il
est galement possible de nourrir les vers avec de la levure de boulanger ou de la nourriture pour poissons TetraMin.
En rgle gnrale, les conditions dlevage sont satisfaisantes si les vers ne tentent pas de quitter le substrat, se dplacent
rapidement dans le sol, prsentent une surface brillante sur laquelle les particules de sol nadhrent pas, ont une couleur
plus ou moins blanchtre, et reprsentent diverses tranches dge. On peut considrer que les vers sont sains sils se
reproduisent continuellement.
Rfrences bibliographiques complmentaires
Achazi R.K., Frhlich E., Henneken M., Pilz C. (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge
on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on
Enchytraeidae 6: 117-126.
Jnsch S., Amorim M.J.B., Rmbke J. (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial
ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83.
Kuperman R.G., Checkai R.T., Simini M., Phillips C.T., Kolakowski J.E., Kurnas C.W., Sunahara G.I. (2003). Survival and
reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitroheterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.
Rmbke J. (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607-616.
Westheide W. and Graefe U. (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26:
479 488.
Westheide W. and Mller M.C. (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive
biology. Hydrobiologia 334: 263-267.
L 81/253

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Mthode par lution sur colonne

Raccordement pour joint en verre rod

Tampon en laine de verre

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Pompe de circulation thermostate

Robinet deux voies pour lchantillonnage

Rservoir de remise niveau (par exemple, un flacon de laboratoire de 2,5 litres)

Joint en verre rod

Conduite deau (entre le thermostat et la colonne, diamtre intrieur denviron 8 millimtres)

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INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE DESSAI

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Dtermination du temps requis pour parvenir lquilibre

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= est la valeur du log POE de chaque unit exprimentale i;

= est la moyenne pondre de tous les log POE;

= est le poids statistique attribu la valeur log POE de lunit exprimentale i.

= (wi (log POE,i - log POE,moy)2) (wi (n - 1))1

o n reprsente le nombre dunits exprimentales.

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()0,922 log Pow + 4,184

()0,922 log Pow + 4,184

()0,922 log Pow + 4,184

()0,922 log Pow + 4,184

()0,922 log Pow + 4,184

()0,922 log Pow + 4,184

()0,922 log Pow + 4,184

()0,922 log Pow + 4,184

()0,922 log Pow + 4,184

log Pow = 0,88log SR + 0,41

log Pow = 0,88log SR + 0,42

log Pow = 0,88log SR + 0,43

log Pow = 0,88log SR + 0,44

log Pow = 0,88log SR + 0,45

log Pow = 0,88log SR + 0,46

log Pow = 0,88log SR + 0,47

log Pow = 0,88log SR + 0,48

log Pow = 0,88log SR + 0,49

Masse totale de la substance

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Masse totale de la substance

Calcul des volumes

Volume utilis pour le

Reprsente < 10 % du volume total de la phase aqueuse, rcipient dquilibrage de 1 litre.

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Volume utilis pour le seuil

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3) le chapitre B.2 est remplac par le texte suivant:

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paramtres dynamiques pertinents de production de latmosphre dessai. On prendra particulirement soin