OBSERVACIN EXPERIMENTAL.

PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO Y ESTERILIZACIN

PROCEDIMIENTO
- Disolver en agua destilada los medios comerciales proporcionados, segn la
indicacin del envase.

Disolver el agar con agua destilada.

Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar el agar hasta
punto de ebullicin del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa
disolucin del agar (medios slidos y semislidos); para medios lquidos no es
necesario calentar, nicamente se agita la mezcla hasta la completa disolucin de la
misma.

Dejar enfriar el preparado, mezclar cada dilucin en el mezclador

Distribuir la mezcla en tubos y taponear con algodn.

Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de

contaminantes. Controla la esterilidad del medio, por incubacin del mismo a 37C
por 24 horas.

RESULTADOS:
A. Macconkey
A. Manitol salado
A. TSA
SIM

Cristal Violeta
Rojo de fenol
Amarrillo pardo
Pardo

CONCLUSIONES:

La preparacin adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los

nutrientes y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los
microorganismos en el laboratorio.
Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar con medios de cultivo
estriles.
Se aprendi y manejo la tcnica empleada para la preparacin de medios de cultivo.

Staphylococcus aureus
Es una bacteria anaerobia facultativa,
grampositiva, productora de coagulasa,
catalasa, inmvil y no esporulada. Las cepas
habituales de Staphylococcus aureus son
resistentes a la penicilina, dejando como los
antibiticos ms eficaces para combatirlos a
los aminoglucsidos, las cefalosporinas, la
oxacilina o la nafcilina.
Morfologa
S. aureus es un coco inmvil, de 0,5 a 1 m de
dimetro,15 forma grupos de clulas
irregulares semejantes a racimos de uvas.Los
racimos irregulares son caractersticos de
extendidos tomados de cultivos que se
desarrollan en medios slidos, mientras que en
otros cultivos son frecuentes las formas de
diplococos y en cadenas cortas. Unas pocas cepas producen una cpsula o capa de
baba que incrementa la virulencia del microorganismo. S. aureus es un
microorganismo grampositivo pero las clulas viejas y los microorganismos
fagocitados se tien como gramnegativos.

TCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS LQUIDOS, SEMISLIDOS Y

SLIDOS - ESTUDIO DEL DESARROLLO EN MEDIOS DE CULTIVO
Procedimiento:
1. Verter el agar en las cajas Petri, dejar solidificar.

2.

Con el asa en aro previamente esterilizada, tomar una asada del cultivo de
microorganismos, y sembrar por el mtodo de dispersin y agotamiento en las
placas de Manitol Salado y MacConkey

3.

Con el asa en punta previamente esterilizada, tomar el inculo del cultivo de

bacterias (Salmonella) y sembrar en agar SIM, por el mtodo de puntura.

4.

Con el asa en aro, toma el inculo del cultivo bacteriano y siembra en el tubo con
agar en pico de flauta o plano inclinado, por el mtodo de estra.

5.

Con el asa en aro previamente esterilizada, tomar una muestra del cultivo y
sembrar por el mtodo de inoculacin en el tubo con caldo CASO.

DESARROLLO BACTERIANO:
Efectuar la lectura, observacin e interpretacin de los resultados para cada uno de los
medios y cepas empleadas.

Resultados
Medio de Cultivo
Bacteria
Color
Oxidacin
Mtodo de siembra

Agar Manitol Salado

Staphylococcus aureus
De rojo fenol a amarillo
Positivo
De dispersin

Resultados
Medio de Cultivo
Bacteria
Color
Fermentacin
Mtodo de siembra

Agar Mac conkey

Salmonella
Traslucido
Negativo
De dispersin / agotamiento

PRUEBAS BIOQUIMICAS
En proceso de inoculacin

Despus de una semana de inoculacin

Interpretacin del Citrato

Negativo: el medio permanece de color verde debido a
que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

Interpretacin de la Lisina
Negativo: violeta, descarboxilizacin de la Lisina
Positivo: Ennegrecimiento, existencia de cido sulfrico
Interpretaciones antes de 18 a 24 horas pueden llevar a
resultados errneos debido a que la fermentacin de glucosa
ocurre a las 10-12 horas de incubacin generando un ambiente
cido, y la produccin de descarboxilasa slo se genera cuando
el medio se acidifica.

Interpretacin del SIM

Cuando una especie puede reducir el sulfuro hay
un precipitado negro que se forma girando el
negro de agar.
Azufre no se reduce / negativo (-)
Azufre reducido / (+)

Interpretacin de la TSA

Negativo: no hay fermentacin

Positivo: fermentacin, color blanquecino, crecimiento
de microorganismos.

Interpretacin de la TSI
Negativo: no hay fermentacin.
Positivo: Presencia de burbujas o ruptura del medio,
produccin de gas. Ennegrecimiento del medio, produccin
de cido sulfhdrico.

RESULTADOS:
CEPA
Salmonella
Staphylococcus aureus
Salmonella
Salmonella
Salmonella
Salmonella

AGAR
Mac conkey
Manitol salado
TSI
TSA
LIA
CITRATO

Crecimiento en agar
Bueno
Bueno
Bueno
Bueno
Bueno
Bueno

Color
translucido
amarillo
negro
blanquesino
negro
azul

Mac Conkey Agar.

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo,
aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa
en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y
el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la
flora Gram positiva.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un
viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la
precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa
producen colonias incoloras.

Manitol Salado Agar.

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de
estafilococos.
Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir de muestras
clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria.
Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de Vibrio, si no
se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas
especies pueden no desarrollar.

Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los
estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias
aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos,
presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se
repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la
prueba de la coagulasa.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de
carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono
fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el agente
selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicador
de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el
manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de
pH del color rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el
manitol.
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias
amarillas rodeadas de una zona del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas,
rodeadas de una zona del mismo color o prpura.
Tripteina Soya Agar
Medio utilizado para propsitos generales,favorece el desarrollo y aislamiento de una
gran variedad de microorganismos aerobios, y anaerobios facultativos y estrictos.
El agregado de sangre, permite el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y
anaerobios nutricionalmente exigentes y la observacin de reacciones de hemlisis.
Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio
agar chocolate.
Fundamento
La triptena y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en pptidos, aminocidos libres,
bases pricas y pirimdicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya aporta tambin
carbohidratos que estimulan el crecimiento de muchos microorganismos. El cloruro de
sodio mantiene el balance osmtico.
Adicionado con 5-10 % sangre , se logra un medio enriquecido y adecuado para observar
reacciones de hemlisis.
Cuando se prepara como agar chocolate, es til para el cultivo de Neisseria spp.,
Haemophilus influenzae y microorganismos exigentes similares. Incubado en forma
anaerobia, permite el crecimiento de Clostridium spp. y anaerobios NO esporulados. Es
un medio adecuado para cultivar y mantener cepas de Aeromonas, y aumentando el
porcentaje de cloruro de sodio, para mantener cepas de algunos Vibrios (excepto V.
cholerae).
SIM Medio
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de
sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo.
Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de
la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso
interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina
con el aldehido del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color
rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen

alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de

sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a
partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
MORFOLOGA DE LAS COLONIAS.
Staphylococcus aureus crecen fcilmente sobre casi todos los
medios bacteriolgicos, en cultivos su crecimiento es mejor
en el medio sal manitol y agar sangre. Es un coco anaerobio
facultativo, esto significa que puede crecer tanto en
condiciones con oxgeno como carente de ste.
MORFOLOGIA
Clulas esfricas de casi 1mm de dimetro
Pueden estar aislados, en pares o tetradas
No mviles, no esporulados
Gram +
CULTIVO
Crecen bien en condiciones aerbicas o microaerofilicas 37C
pero su pigmento se produce mejor a 20- 25C
En medios slidos son colonias grises o amarillo dorado

Bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con

flagelos peritricos y que no desarrollan cpsula ni esporas.
Son bacterias mviles que producen sulfuro de hidrgeno
(H2S). Fermentan glucosa por poseer una enzima
especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa.
Caractersticas coloniales de la salmonella: Inocular en
superficie por estra a partir de un medio de enriquecimiento
selectivo
Utilizado para la deteccin de Salmonella.
- Incubar a 37C durante 24 horas.

Medio de Cultivo Manitol salado

Salmonella typhi

Medio de Cultivo Macconkey

Salmonella typhi

TINCIN DE GRAM
Ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias
constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere
su rigidez a la pared celular bacteriana, y las gram positivas lo poseen en mucha mayor
proporcin que las gram negativas.
Preparacin de un frotis
Colocar en el portaobjeto cepas del cultivo.

- Fijar la muestra (frotis), realizar la coloracin con una gota de Cristal Violeta por un
minuto.

- Eliminar el exceso con agua destilada.

- Luego agregar una gota lugol por un minuto.

- Eliminar el exceso con agua destilada.

Decolorar con alcohol.

- Eliminar el exceso con agua destilada.

Agregar una gota de Safranina para colorear

- Observa al microscopio con lente de inmersin y anota las caractersticas morfolgicas.

Staphylococcus aureus
Bacilos Gram (+)

Salmonella
bcilos Gram (-)