Un ejercicio de laboratorio para cromatografa de filtracin en gel visible

utilizando protenas fluorescentes.

Cromatografa de filtracin en gel (GFC) Separa las molculas segn tamao y
es uno de los mtodos ms utilizados para la purificacin de protenas. aqu,
rojo la protena fluorescente (GFP), la protena fluorescente amarilla (YEP), la
protena fluorescente cian (PPC), y/o sus protenas de fusin fueron
prokaryotically expresada, purificada y utilizada en un ejercicio de laboratorio
demuestran de manera intuitiva GFC

Como uno de los ms abundantes las macromolculas biolgicas, protenas se

producen en todos los organismos en una gran diversidad de tamaos y
funciones. Las protenas pueden estar separadas basadas en su tamao
relativo, carga y/o afinidad con resinas utilizadas en la cromatografa de
columna. Cromatografa de filtracin en gel (GFC), tambin conocida como
cromatografa de exclusin por tamao, separa las protenas en su estado natal
de acuerdo a su tamao relativo. Medios de filtracin en gel consisten
precisamente en forma de cordones con cavidades de un tamao determinado.
Muchas protenas fluorescentes,como el verde (GFP), amarillo (YFP), cian (PPC)
y protenas fluorescentes rojas (RFP), son visibles al ojo desnudo, y coloridos en
la solucin. Varias de estas protenas han sido utilizados en la enseanza de las
lecciones en expresin y purificacin de protenas y relaciones estructurafuncin. Tambin han sido utilizados para demostrar varias tcnicas de
purificacin de protenas, incluyendo GFC con polyhistidine-tagged RFP y MBPEGFP etiquetados.
A fin de facilitar el uso de coloridos y visiblemente protenas fluorescentes en
educacin, Bio-Rad suministra el kit transformacin bacteriana pGLO GFP a
expresar en E. coli y un kit de cromatografa GFP para purificar la GFP en
columnas de cromatografa hidrofbico. En el ejercicio actual, varias protenas
fluorescentes fueron fusionados para producir protenas coloreadas que
entonces fueron utilizados para evaluar los efectos del volumen de muestra y
el dimetro de la cavidad de la resina en el GFC resolucin.
Polyhistidine-etiquetados protenas de fusin de RFP, RFP-PPC, YFP-YFP RFP y
piruvato kinasa II-GFP fueron expresadas, purificada y separados
correctamente en una columna Superdex 200 (rango de fraccionamiento de
protenas globulares de 10-600 KD). Los estudiantes encontraron que GFC
resolucin podra reducirse dramticamente, aumentando el volumen de la
muestra o poniendo la resina cromatogrfica en Sephadex G-100.

Materiales y Reactivos Prime STAR polimerasa, endonucleasas de restriccin,

mezcla de dNTP, marcadores de ADN, y T4 DNA ligasa fueron adquiridos de
TaKaRa (Japn). La Lisozima, TDT, El IPTG, PMSF, y un pepstain fueron
adquiridos de Amresco (EE.UU.). Ni-NTA His-bind Novagen superflow era de
resina (Alemania). Superdex 200 y resinas Sephadex G-100 fueron obtenidos
de GE Healthcare (USA).
La ampicilina fue adquirido de Oxford LTD. Todos los dems productos qumicos
fueron de grado analtico y se obtuvieron a partir de las compaas nacionales,
pDsRed-N1 pEGFP-CI, pEYFP-N1, y pETCFP-CI fueron adquiridos de RYgene.
PD18-T simple vector fue adquirido de TaKaRa.
Vectores de expresin procariticos pHIS9 (un derivado del vector de pGEX-6P1, en el que el GST y PreScission regiones codificantes de proteasas fueron
sustituidas por una secuencia codificante para nueve histidina residuos), pGEXPK (vector pGEX-6P-1 albergar piruvatocinasa II de Escherichia coli). E. coli
DH5x y BL21 (DE3) fueron obtenidos de nuestra coleccin de laboratorio
Construccin de pRFP RFP para la expresin de PCR para amplificar secuencias
de nucletidos. La tpica mezcla PCR constaba de 2uL PCR buffer, 2uL dNTP
solucin (2.5 mM), 1uL de una solucin que contenga los cebadores de avance
y retroceso (100 ng/uL), 1uL ADN solucin (100 ng/uL), y ADN polimerasa 0.2uL
(1.0).
Las condiciones de PCR comprende 5 min hot start a 95C, seguido por 30 ciclos
de desnaturalizacin (30s a 95C), recocido (30s a 58C) y la extensin (60s a
72C). RFP fue amplificado utilizando cebadores RFPf y RFPr con pDsRed-N1
como plantilla. Despus posterior mediante la correspondiente digestin de
enzimas de restriccin, la RFP fragmento fue purificado por cromatografa en
gel y se inserta en el vector de expresin pRFP pHIS9 para el rendimiento.
Clonar secuencias fueron validadas por la secuenciacin.
Imprimaciones y amplifica los genes estn enumerados en la Tabla 1

Construccin de RPC para la expresin de protenas de fusin RC el empalme

de RFP y PPC se efecta por superposicin de PCR. Secuencias
complementarias a RFP y PPC estn situados en los extremos de los cebadores
y RYir RYif, respectivamente. Dos fragmentos de ADN RFPi (derivados utilizando
cebadores RFPf y RYir) y ipfq (derivados utilizando cebadores RYif y YFPrEcoRI)
fueron amplificados a partir de plantillas pDsRed-N1 y pETCFP-Cl,
respectivamente.

RC fue amplificado utilizando cebadores RFPf y YFPrEcoRI con plantillas de RFPi

mixtos (50 ng) y ipfq (50 ng), y el producto se inserta entonces en pHIS9 para
producir el vector de expresin china despus de la digestin con BamH I y
EcoR I

Construccin de pYRY para la expresin de protenas de fusin YRY YFP fue

amplificado utilizando cebadores YFPf y YFPrBamHI junto con pEYFP-N1 como
plantilla. Siguiente La digestin con Nde I y BamH I, YFP se ligaban a pHIS9
para producir pYFP vector. Despus de amplificacin por PCR superpuestos
como se describi anteriormente, RY (RFP) YFP fue digerido utilizando BamH I y
EcoR I y ligarse en pYFP para crear la expresin vector pYRY.
Construccin de pPKG para la expresin de protenas de fusin PKG piruvato
kinasa II (PK) fue amplificado utilizando cebadores y PKf PKr y la plantilla pGEXPK. Despus de la doble digestin utilizando END I y BamH I, fue insertado en
pHIS PK9 para producir pPK. La GFP fue amplificado utilizando cebadores GFPf y
GFPr y la plantilla pEGFP-Cl. Despus de la digestin con BamH I y EcoR I, GFP
fue insertado en QPP a ceder pPKG

La expresin y purificacin de protenas, expresin y purificacin de protenas

se realiza segn lo descrito anteriormente [12]. Brevemente, vectores de
expresin se transformaron en E. coli BL21 (DE3). La cepa fue transformada
cultivadas en LB suplementado con 0,1 mg/mL de ampicilina durante la noche
a 37C. Una vez alcanzado el OD600 0.6-0.8, los cultivos se enfra a 16C y B-Disopropil-1-thiogalactopy-ranoside (IPTG) fue aadido a una concentracin final
de 0,5 mM para inducir la expresin de protenas por 16 h.

Las clulas fueron cosechadas por centrifugacin (5.000 g) 3 a 4C durante 10

min. Las clulas fueron resuspendidas en el tampn de lisis (50 mM KPO4, 0,4
M KCl, 290 lM PMSF, 1,5 lM pepstatin A 0,1 mg/mL de lisozima, pH 8,0) y se
incubaron a 4C durante 1 h. Las clulas fueron perturbado an ms mediante
un bao de ultrasonidos (450 W, 10 min a 0C) y la suciedad se elimina por
centrifugacin (18.000 g) a 4C durante 40 min. El sobrenadante se carga
Cargados en un Ni-NTA columna de afinidad (10 3 30 mm) con buffer
preequilibrated (50 mM KPO4, 0,4 M KCl, pH 8,0). La columna era entonces lav
con cinco veces el volumen del lecho de buffer B (50 mM KPO4, 0,4 M, 75 mM
de KCl imidazol, pH 7,3) y eluye con buffer C (50 mM KPO4, 0,4 M KCl, 5 mM bME y 250 mM imidazol, pH 7,3). Despus de la dilisis empleando buffer D (KCl
50 mM, 1,5 mM de TDT, 5% de glicerol y 50 mM Hepes, pH 8,0), el final de las
protenas fueron analizados por SDS-PAGE y almacenada en el 280C.

Se determinaron las concentraciones de protenas mediante el mtodo de

Bradford [13] con seroalbmina bovina (BSA) como estndar

Cromatografa de filtracin en gel 500 mL O 2 mL de una mezcla que contiene

protena RFP, RC, YRF y PKG (0,3-0,5 mg cada una) fueron cargados en
preequilibrated (50 mM, 50 mM de KCl Hepes, pH 8,0) Superdex 200 (S200) o
Sephadex G-100 (SG100 1 3) columnas ( 30 cm) con AKTA Prime (GE) en
Ciencias de la salud. GFC separacin fue realizado con un caudal de 0,4
mL/min.

Resultados y Discusin el ejercicio de laboratorio el diseo de este ejercicio de

laboratorio fue diseado para un curso de Bioqumica avanzada integrado por
estudiantes que hayan completado previamente Bioqumica, Biologa Molecular
y la ingeniera gentica de los cursos. Tras una primera ponencia describiendo
los objetivos de este ejercicio, un calendario (Tabla 2), fue distribuido a los
estudiantes.
Los estudiantes trabajaron en grupos de dos para elegir uno de los genes para
clonar, expresan la protena correspondiente y configurar un experimento GFC
compartiendo las protenas purificadas.

Expresin y purificacin de protenas protenas fluorescentes altamente estable

fueron seleccionadas para este ejercicio de laboratorio. Las protenas
fluorescentes y combinaciones de los mismos fueron utilizados para obtener
diversas protenas coloreadas. Los genes de las protenas fluorescentes fueron
clonados y empalmado en vectores de expresin por los estudiantes (Fig. 1).
Teniendo en cuenta los requisitos previos de la biologa molecular y la
ingeniera gentica y, en particular, los correspondientes cursos de laboratorio

Los estudiantes ya estaban bien formados y experimentados en el gen de la

clonacin y la construccin de vectores. Etiquetado Polyhistidine protenas
fluorescentes se sobreexpresa prokaryotically y luego purificada utilizando un
Ni-NTA columna de afinidad. Resultados tpicos se muestran en la Fig. 2a. RFP,
RC, YRY PKG y mostrar los distintos colores (Fig. 2b). La mayora de los
estudiantes fueron sorprendidos por las nuevas protenas coloreadas que
resultaron de las distintas combinaciones. PKII fue encontrado a existir como
un dmero basados en filtracin en gel (H. Li y M. Sun, datos inditos). Por lo
tanto, PKG (monmero de 84 kDa) sera un 168- kD protena en su estado
nativo.

Cromatografa de filtracin en gel despus de la purificacin, cada grupo se

determin la concentracin de la solucin de protena y comparte estos datos
con los otros grupos para obtener un ejemplo de un conjunto de cuatro
protenas fluorescentes. Tres juegos fueron designados para evaluar los efectos
del tipo de resina y del volumen de muestra en la resolucin de separacin del
GFC. Un conjunto se utiliz con una columna Superdex 200 con un volumen de
0,5 mL de muestra (S200a), una segunda serie fue utilizada con una columna
Superdex 200 con un volumen de 2 mL de muestra (S200b), y el tercer grupo
se utiliz con Sephadex G-100 con un volumen de 0,5 mL de muestra (SG100).
Los caudales fueron 0,4 ml / min. Una columna tpica GFC cargado con el
S200a resina se muestra en la Fig. 3a. Las cuatro protenas se separaron bien
en la columna con RFP en la parte superior, seguido de RC, YRY, y PKG. El
cromatograma en la figura UV280. 3b es consistente con las bandas de color
de forma visible en la columna. Uno pico menor que corresponde a 22 ml ms
probable debido a los contaminantes de protenas. PKG fue el primero en eluir,
lo que sugiere la oligomerizacin de PKII. La columna que contiene GFC la
resina de S200B se muestra en la Fig. 4. Las cuatro protenas no fueron
separados tambin, y la cromatogrfico picos solapan significativamente, lo
que demuestra que el aumento de el volumen de muestra de 0,5 a 2 ml
disminuy la resolucin. Realizar la separacin mediante una columna
Sephadex G- 100 provoc incluso peor resolucin (Fig. 5). Las cuatro protenas
no estaban visiblemente separados (Fig. 5a), y slo un gran pico fue observada
en el cromatograma (Fig. 5b). Esto demuestra que la resina no era el adecuado
para estas protenas particulares o que la columna estaba lleno mal.

Este ejercicio de laboratorio de discusin se llev a cabo en la Facultad de

Qumica y Ciencias de la vida, Zhejiang Normal University. Los estudiantes
realizan el gen clonado, expresin de protenas, y GFC separacin. Tras el
ejercicio, los estudiantes fueron proporcionados con preguntas para llevar a
casa para reforzar los conceptos clave y ampliar sus conocimientos sobre las
protenas en general:
1. Las cuatro protenas fluorescentes fundidos tandemly tena aparente nativo
de pesos moleculares de 26,9, 54,9, 84,3 y 168 kD. Cul fue el orden de
elucin de las protenas a partir de la columna de filtracin en gel? Por qu?
2. La mayora de las protenas presentan fluorescencia visible? Explicar por
qu los elegidos son protenas fluorescentes.
3. Si PKII fueron un monmero en su estado natal, cmo afectara la orden de
elucin? Por qu?
4. Puede ser cualquier tipo de resina de Cromatografa de filtracin en gel
puede usarse en este ejercicio de laboratorio? Por qu?

Despus de la clase de evaluacin consisti de preguntas tales como, "Qu

piensas sobre este ejercicio?"; "Cmo fue til en la consecucin de los objetivos
del curso?"; "hay mejoras que podran introducirse en el experimento?" Ms del
80% de los estudiantes abandonaron la retroalimentacin positiva sobre este
ejercicio. Algunos de sus comentarios se enumeran a continuacin: "El colorido
de las protenas fluorescentes son hermosas. Son realmente impresionantes.
Jams olvidar esta experiencia." "Esta demostracin definitivamente me
ayudo a recordar que cuando se utiliza la cromatografa de filtracin en gel, los
grandes
Salen primero, no como en un tamiz donde los grandes son retenidos." Una
estudiante tambin dej un mensaje relativo a una limitacin en el
experimento: "Cuando mediante cromatografa de filtracin en gel, las
molculas se separan basada tanto en peso molecular (tamao) y su forma
tridimensional. Aqu, hemos visto los resultados de separacin en funcin de su
tamao, pero no de forma. Hay alguna manera de mostrar los efectos del
tamao y la forma de un ejercicio?" Esta es una mejora que podemos hacer en
el futuro.

Tambin podemos implementar experimentos adicionales para abordar algunas

de las otras variables que afectan el GFC resolucin y proporcionar opciones
adicionales para los estudiantes en la construccin de los genes de fusin.
Todas las construcciones hechas en este ejercicio de laboratorio estn
disponibles previa solicitud

Errores comunes y cuestiones de seguridad varios errores comunes y

cuestiones de seguridad se enumeran a continuacin:
1. Bromuro de etidio, un mutgeno potente, es un componente de la
electroforesis en gel de agarosa utilizado en durante la construccin del
plsmido. Se debe utilizar en un rea designada. Se deben utilizar guantes
para evitar el contacto directo de la piel. El material de desecho debe
eliminarse como residuo especial a travs de un programa de residuos
peligrosos.
2. La azida de sodio se utiliza a veces para evitar el crecimiento bacteriano en
columnas de filtracin en gel. Se deben utilizar guantes durante la
manipulacin de la azida de sodio. Los residuos deben ser saciada con cido
nitroso antes de su eliminacin
3. La impureza de polyhistidine-protenas marcadas pueden complicar los
resultados. La elucin con un degradado lineal de 10- 250 mM immidazole
resolvera este problema.

4. La calidad del acondicionamiento de la columna es esencial para efi- ciente

separacin de protenas. Resinas debe ser extrado antes de su embalaje. Si la
columna se seca, es necesario engrasar segn las instrucciones del fabricante.