OBTENCIN DE UN CULTIVO PURO DE BACTERIAS

Maira A. Acosta, Pedro M. Olmos, Oscar F. Hernndez, Luis F. Montes, Jill L.

Martnez.
Universidad de Sucre, Facultad de Educacin y Ciencias, Departamento de
Biologa, Laboratorio de Microbiologa
RESUMEN: La obtencin de un cultivo puro de bacterias parte de una
realizacin metodolgica excelente, ya que al realizar una buena metodologa
se asegura el crecimiento de microorganismos en un medio dado, en la
presente practica se realizaron 3 preparaciones de cultivos a partir de dos
muestras, suelo (Slido) y agua de arroyo (Lquido), utilizando 2 tcnicas:
Siembra por agotamiento, Siembra con hisopo. Los resultados de esta practica
fueron positivos, obteniendo crecimiento en todos los cultivos sembrados, la
esterilizacin de los instrumentos y el buen manejo de estos permitieron
obtener los resultados esperados.
Pa l a b r a s C l a v e : C u l t i v o pu r o , M i c r o o r g a n i s mo s , S i e mb r a po r a g o t a mi e n t o ,
S i e m b r a c o n h i s o p o , Es t e r i l i z a c i n , I n s t r u m e n t o s .
IN T R O D U C C I N
En la naturaleza podemos encontrar a
los microorganismos usualmente en
poblaciones mixtas, pero para poder
caracterizarlos y estudiarlos se necesita
tenerlos en cultivos puros [1].
Un cultivo puro o axnico se define
como el que contiene slo un tipo de
microorganismos. Estos se inician a
partir de colonias aisladas, de manera
que todos los individuos del mismo
tengan las misma composicin gentica.
Estos cultivos son esenciales para
estudiar las caracterticas de los
microorganismos
y
as
poder
identificarlos
con
seguridad.
Sin
embargo cada vez que se realiza un
cultivo de este tipo se debe tener en
cuenta que las condiciones en las que
estos
estn
creciendo
no
son
condiciones naturales, por consiguiente
los individuos que crecen en cultivos
puros
no
presentan
las
mismas
caractersticas fisiolgicas que los que
crecen en la naturaleza [2].

Las tcnicas para la obtencin de

cultivos puros fueron inicialmente
desarrolladas por De Bary y Brefeld
para el estudio de hongos y
consiguieron aislar clulas y cultivas
hongos sobre medios slidos. Pero
estas tcnicas no eran adecuadas para
el cultivo de bacterias. En los
primeros tiempos de la Microbiologa
se utilizaban como sustratos slidos
para inmovilizar los microorganismos
patatas o pan, con el inconveniente
de la opacidad de estos sustratos. En
el laboratorio de Robert Koch se
desarrollaron tcnicas para solidificar
un medio lquido con composicin
conocida aadiendo una sustancia sin
opacidad y con la posibilidad de
modificar la composicin del medio
lquido
segn
los
requerimientos
nutricionales del microorganismo a
aislar. La gelatina fue el primer
agente solidificante utilizdo por Koch,
sin embargo este presentaba el
inconveniente
de
que
muchos
microorganismos lo utilizaban para su
crecimiento. La gelatina fue sustituida

por el agar introducido

Eilshemius (1881) [3].

por

Fanny

O B J ET I V O S
1. Obtencin de colonias de bacterias
en cultivo puro mediante la tcnica de
estriado.
2. Entrenamiento a los estudiantes en
tcnicas de trabajo asptico.
3. Manipulacin adecuada de
microorganismos.

M A T ER I A L ES Y M T O D O S
1. Placas (cajas de Petri) con colonias
de microorganismos.
2. Cajas de agar nutritivo (AN).
3. Tubos con medio inclinado (en
cua) de AN.
4. Asas bacteriolgicas.
5. Papel absorbente.
6. Guantes.
7. Gradilla.
8. Incubadora.

3. Las cajas de petri se marcaron con

la tcnica aplicada y el medio de
cultivo utilizado, asi como el marcaje
con las 3 divisiones para tener una
guia a la hora de realizar el cultivo.

Para la realizacin correcta de esta

practica se realizaron los siguientes
pasos:
1. Desinfeccin del rea en donde se
trabaj, para asegurar un lugar
completamente limpio y as proceder a
manipular los instrumentos.
4. Se sembr el medio por la tcnia
estriada y agotamiento de la muestra,
2. Se procedi a encender el mechero siguiendo el patrn marcado con
y esterilizar el asa con calor desde la anterioridad en forma de T, pasando
punta hasta la base para as eliminar sin levantar el asa de un cuadro a
cualquier microorganismo presente.
otro, a, b y por ultimo c.

5. Lo mismo se realiz para sembrar el

cultivo en medio slido y con la
tcnica del hisopo.

Imagen 1: Cultivo sembrado por la

tcnia de agotamiento o en estra, con
la muestra lquida (agua de arooyo), se
observ un crecimiento en todas las
divisiones de la caja, no fue muy
efcaz puediendose deber a la forma de
sembrar la muestra.

RESULTADOS Y ANLISIS
Las muestras que se sembraron en el
laboratorio se dejaron en la incubadora
por 24 horas para as poder observar el
crecimiento de microorganismos.
Para todas las muestras se observ un
crecimiento
positivos
de
los
microorganismos, creciendo as un solo
tipo, tomando como base para la el
cultivo sembrado con muestra de suelo
(Slido) y para la muestra de agua de
arroyo (Lquido).

Imagen 2: En la tcnica de siembra con El crecimiento se define como el

hisopo se pudo notar un mayor aumento del nmero de bacterias en
crecimiento que en la tcnica anterior. una
poblacin
determinada.
Es
importante
diferenciar
entre
el
crecimiento de una clula individual y
el de una poblacin. Dicho crecimiento
celular es el resultado del aumento del
tamao de la clula, seguido de su
divisin. El crecimiento de una
poblacin, en cambio, es el resultado
del nmero total de clulas, que puede
ser cuantificado directamente (contando
el nmero de clulas) o indirectamente
(midiendo la masa celular) [4].
Imagen
3:
En
la
tcnica
por
agotamiento o estra pero con la
muestra slida (Suelo), se observa un
crecimiento muy positivo, se observa
que creci el mismo microorganismo
presente en el cultivo prefijado de
donde se tom la muestra, eso nos
quiere decir que se realiz una buena
siembra y que la muestra no se
encontraba contaminada.
El paso esencial para el inicio del
estudio de una cepa de bacteria, es el
cultivo. Este paso es fundamental ya
que gracias a este se puede proveer de
una poblacin de bacterias para
analizarlas
mediante
pruebas
bioqumicas, serolgicas, genticas y de
susceptibilidad
de
abtibiticos.
El
cultivo es el proceso de propagacin de
los microorganismos en el laboratorio,
que
se
obtiene
aportando
las
condiciones ambientales adecuadas y
los nutrientes necesarias para el
crecimiento bacteriano. Las bacterias
para tener un ptimo crecimiento
requieren de un medio que cumpla con
sus necesidades bsicas (nutrientes,
requerimientos
atmosfricos
y
[4]
ambientales) .

El crecimiento de las poblaciones

bacterianas en un sistema de cultivo
cerrado,
est
limitado
por
el
agotamiento de los nutrientes o bien
por la acumulacin de productos
txicos
del
metabolismo.
En
el
laboratorio para medir el crecimiento
de dicha poblacin bacteriana se debe
contar con un medio de cultivo apto
para el desarrollo de las mismas, este
medio es una mezcla equilibrada de
nutrientes
que
permiten
dicho
crecimiento. Este cultivo debe contener
todos los nutrientes necesarios en
cantidades
apropiadas
a
los
requerimientos del microorganismo y
en
condiciones
de
pH,
presin
osmtica,
oxgeno
disuelto,
etc.,
adecuado para el crecimiento. Aunque
los diferentes tipos de microorganismos
presentan diferencias fisolgicas y
requerimientos nutricionales distinto, la
composicin qumica de las clulas es
constante en todo el mundo vivo [5].
Existen muchos medios con diferentes
utilidades que pueden ser clasificados
de la siguiente manera. Segn su
consistencia: Lquidos, semislidos y
slidos. lLos medios slidos son usados

para
el
aislamiento
bacteriano,
mientras que los lquidos son tiles
para el enriquecimiento de una
poblacin bacteriana de inters. Segn
su
composicin:
definidos
(de
composicin qumica conocida, medios
simples) y complejos (con agregados de
sustancias no definidas, por ejemplo
extracto
de
levadura).
segn
la
cantidad de nutrientes: pobres (por
ejemplo el agar simple) y ricos (por
ejemplo el agar sangre). Tambin
pueden
clasificarse
en
medios:
diferenciales, que permiten diferenciar
algunas propiedades distintivas del
grupo bacteriano (por ejemplo el uso
de lactosa en agar CLED); y selectivo,
que permiten el desarrollo de algunos
microorgnismos pero no de otros (por
ejemplo el Mac Conckey para la
seleccin
de
bacterias
Gramm
negativas). Tambin existen los medos
especiales para el transporte de
muestras o cepas, o aquellos especficos
para identificar alguna va metablica
determinada [6].
C O N C L U S I N
La obtencin de bacterias en un cultivo
puro
es
el
resultado
de
una
metodologa seguida correctamente, de
un buen manejo de instrumentos y de
que el medio en el que las bacterias
crecieron contena todos los nutrientes
necesarios para que estas pudieran
crecer, en el laboratorio se logr lo
deseado, se obtuvo un crecimiento
bacteriano en las 3 muestras aplicando
las dos tcnicas.

haber sido as, se hubiera presentado

en los resultados el crecimiento de
distintos tipos de microorganismos en
un mismo medio, por la contaminacin
a la hora de sembrar o incluaso de los
mismos intrumentos.
Cabe resaltar que la manipulacin de
estos microorganismos debe ser de una
forma muy profesional ya que aunque
estos
microorganismos
no
son
patgenos, son de aguas estancadas y
de suelo, no se debe hablar durante la
siembra del cultivo ni este debe ser
manipulado por dos personas a la vez.
C U ES T I O N A R I O
a.USTED TIENE UNCULTIVO LIQUIDO
MIXTO Y DESEA OBTENER CULTIVO
PURO COMO PROCEDERIA?
Un cultivo puro es aquel en el que
todos los microorganismos provienen
de una sola clula.
La obtencin de un cultivo puro, a
partir de una poblacin mixta, se lleva
a cabo en dos etapas:

1. La muestra debe diseminarse de

manera
tal
que
los
diferentes
microorganismos
queden
lo
suficientemente separados sobre la
superficie de un medio de cultivo
slido, de manera que luego de la
incubacin
ellos
formen
colonias
visibles aisladas. Este proceso se conoce
como aislamiento.
En esta placa tendremos diferentes
tipos de colonias correspondientes a los
diferentes microorganismos presentes en
La esterilizacin del medio de trabajo la poblacin original.
as como el de los instrumentos fue
una parte fundamental de la practica, 2. Luego de tener las colonias aisladas,
ya que esto influy mucho en los stas
deben
transferirse
con
el
resultados obtenidos, ya que de no filamento a un tubo que contenga agar

nutritivo estril para cultivar esa

colonia aislada; este procedimiento se
conoce como transplante .
Para garantizar la pureza del cultivo
obtenido, es conveniente, a partir de
cada tipo de colonia aislada, repetir el
proceso de aislamiento antes descrito.
Se considerar que se ha obtenido un
cultivo puro, cuando al realizar este
proceso, todas las colonias obtenidas
presenten las mismas caractersticas[7].

b.
QUE
ES
BACTERIANA?

UNA

d.QUE ES UNA CEPA PURA? Y LAS

INSTITUCIONES QUE SE ENCARGAN
DE VENDERLAS.

EnviroProcess / Cultibac
Cientifica Senna
Kholsen
MEXENIL
MediHC
INCISE
Vesalius Pharma
Proquifa
Pharma Insumos S.A de C.V
Biotecnologia Diagnostica:
COLONIA
CHEMSOL
D. Q. Microbiologia Laboratorios

Es
una
agrupacin
de
bacterias
formada a partir de la reproduccin de
una Unidad Formadora de Colonia
sobre un medio slido; aunque vara de
tamao generalmente es visible a
simple vista.
Las colonias bacterianas tienen una
medida, forma, textura y en algunos
casos color caractersticos, que aunque
puede variar de acuerdo al medio en
que se encuentren, es constante bajo
condiciones controladas y depende de
la especie bacteriana que la forme [8].

e. MORFOLOGICAMENTE, QUE TIPOS

DE
COLONIAS
BACTERIANAS
EXISTEN?

La morfologa de una colonia viene

dada por su borde y forma de elevarse
sobre el medio de cultivo. El borde
puede ser liso (redondeado u ovalado)
o irregular (aserrado, lobulado o
espiculado). Si pudisemos hacer un
corte en un plano perpendicular a la
base de la colonia podramos encontrar
las siguientes posibilidades: [10].
-semiesfrica o convexa
-plana o en disco
c. A QUE ES LE DENOMINA CEPA
-acuminada
EN MICROBIOLOGIA?
-cerebroide
-plana con bordes elevados
La
unidad
taxonmica
de
la
-plana con centro elevado.
Microbiologa es el CLON o CEPA, se
denomina as a una poblacin de
clulas
genticamente
idnticas
f.
QUE
INFORMACIN
derivadas de la divisin sucesiva de
PROPORCIONAN EL DESARROLLO DE
una sola clula. Un grupo de cepas que
BACTERIAS EN MEDIOS LIQUIDOS Y
tiene
la
mayora
o
todas
las
SEMISOLIDOS.
caractersticas
en
comn
ser
clasificado como una ESPECIE, y las
En los medios liquidos las sustancias
especies relacionadas se clasifican en el
nutritivas se encuentran disueltas. Los
mismo GNERO [9].

medios ssemi solidos suelen consistir en

una base de agar, polmero de origen
vegetal que se mantiene en fase liquida
a altas temperaturas y que forma un
gel al enfriarse, que mantiene una alta
humedad y contiene los elementos
nutricionales necesarios. El cultivo
sobre
medios
semisolidos
permite
disponer facilmente de las colonias
bacterianas. Por otro lado, en medios
lquidos, el crecimiento suele ser mayor
porque la disponibilidad de nutrientes
tambin es mayor. El uso de uno u
otro tipo de medios depende del tipo
de muestra y del patogeno que se
busca [11].

R EF ER EN C I A S

[6]. Seeley, H.W.I, Jr and P.J. Van

Demark. 1972. Microbes in action.
W.H. Freeman and Company.
[7].http://www.ucv.ve/fileadmin/user_u
pload/facultad_farmacia/catedraMicro/1
0_Obtenci%C3%B3n_de_cultivos_puros.
pdf. (RECUPERADO 28/09/16)
[8].https://microdonto.files.wordpress.co
m/2009/03/morfologia-de-las-colonias
bacterianas.pdf.
(RECUPERADO
28/09/16)
[9].http://www.ucv.ve/fileadmin/user_u
pload/facultad_farmacia/catedraMicro/0
8_Tema_3_Taxonom%C3%Ada.pdf.
(RECUPERADO 28/09/16)

[10].https://microbitos.files.wordpress.co
[1] BBL Manual of products and
m/2010/06/morfologia-y-estructuralaboratories procedures 1973 Fifth
bacteriana.pdf.(RECUPERADO 28/09/16)
edition. BBL division of Beckton,
Dickinson and Co.
[11].https://www.seimc.org/contenidos/d
ocumentoscientificos/procedimientosmic
[2] Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M.
robiologia/seimc1992,
Microbiologa.
Manual
de
procedimientomicrobiologia37.pdf.
Mtodos Generales. Segunda edicin.
(RECUPERADO 28/09/16)
Facultad de Farmacia. Universidad
Central de Venezuela.
[3] Benson H. J. 1979. Microbiological
Application. A Laboratory Manual in
General Microbiology. Third edition.
Wm. C. Brown Company Publishers.
Dubuque, lowa.
[4]. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld
A.S.
editors.
Bailey
&
Scott's.
Diagnostic Microbiology. 11th. ed.
St.Louis, Missouri, Mosby. 2002.
[5]. Joklik WK, Willet HP, Amos DB,
Wilgert
CM,
editores,
Zinsser
Microbiologa
20
ed.
BsAs.
Panamericana; 1994.