La chromatographie

aspects gnraux
Mthode de sparation et de quantification de composs
prsents dans une phase homogne liquide ou gazeuse.
Le principe est bas sur les quilibres successifs des
composs prsents entre 2 phases dont lune est dite
stationnaire, emprisonne dans la colonne et lautre, dite
mobile qui se dplace en entranant les substances.
Lentranement diffrentiel des composs prsents dans la
colonne conduit leur sparation.
Intrt: couplage avec des dtecteurs trs sensibles.
9 le chromatogramme permet dobtenir des informations qualitatives
(temps de rtention dun compos) et quantitative (surface ou
hauteur du pic chromatographique).
9 domaine de mesure: 10-3 10-9. Ordre du nanogramme.

Processus analytique
Lanalyse de composs dans des matrices complexes (sang, urine,)
ncessite souvent une optimisation de la sparation chromatographique.

ANALYSE
Prparation
dchantillon

Sparation

?
Slectivit

Dtection

Rsultats

Types de matrices
Nombre dchantillons traiter
Appareillage disposition
Type de dtection (UV, Fluo, NPD, MS)
Possibilit dautomatisation

La chromatographie: historique
La chromatographie La chromatographie(du grec
chroma: couleur et graphein: crire) a t invente par
le botaniste Mikhail Tswett au dbut du XXme sicle.
Une colonne de CaCO3 permet de sparer des
pigments vgtaux (chlorophylles et xanthophylles).
Par adjonction de solvant, on obtient des bandes
colores qui se dplacent le long de la colonne des
vitesses propres.
Le Prix Nobel de chimie est attribu en 1952 aux
biochimistes Martin et Synge pour leur contribution au
dveloppement de la chromatographie moderne.

Principe de base
Le principe qui rgit pratiquement toute
purification / sparation en chimie, se base sur la
(r)partition dune substance A (analyte) entre
deux phases
Cristallisation: partition phase liquide phase
cristalline
Distillation: partition phase liquide phase gazeuse
Sublimation: partition phase solide phase gazeuse
Extraction: partition entre deux phases liquides non
miscibles (LLE) ou phase liquide phase solide (SPE)
Chromatographie: partition phase stationnaire
phase mobile.

Principe de sparation
Si le compos B a une grande affinit pour la phase
stationnaire et le compos A une grande affinit pour la
phase mobile, le compos A aura tendance tre lu
plus rapidement. Son temps de rtention sera plus petit
que le temps de rtention de B.
Cette diffrence daffinit pour les deux phases est le
principe mme de la chromatographie!
Il existe diverses mthodes de chromatographie utilises
quotidiennement par les chimistes, biologistes, etc.

GC
HPLC
CCM
EC
Etc

Dfinitions
La chromatographie est une technique dans laquelle les
constituants dun mlange se sparent en fonction des vitesses
auxquelles ils sont entrans travers une phase stationnaire
par une phase mobile.
La phase stationnaire est une phase qui reste en place, soit
dans une colonne, soit sur une surface plane.
La phase mobile est une phase qui se dplace sur ou travers
la phase stationnaire, entranant lanalyte avec elle.
Llution est un processus au cours duquel les analytes sont
entrans travers une phase stationnaire par le mouvement
dune phase mobile.
Un chromatogramme est le graphique dune fonction de la
concentration de lanalyte en fonction du temps dlution (ou
temps de rtention).

Proprits physico-chimiques
Chromatographie: partition phase stationnaire phase mobile

En fonction des proprits PHYSICO-CHIMIQUES

des molcules et surtout, en GC
- Volatilit / Polarit
- Solubilit
- Hydrophobe / Hydrophile
- Acide / Base

Chromatographie en phase
gazeuse
La chromatographie en phase gazeuse (GC) est
base sur le partage de lanalyte entre une phase
gazeuse mobile et une phase liquide immobilise
sur la surface dun support inerte.
La phase (liquide) immobilise est le plus souvent
un polymre organique modifi (siloxane
R3SiO[SiR2O]nSiR3).
Le gaz porteur est un gaz inerte, typiquement
lhlium (He).
La dtection la sortie de la colonne peut tre de
plusieurs types (FID, NPD, ECD, MSD, etc).

Aspects thoriques
Chaque analyte a une affinit plus ou moins prononce pour la phase
mobile et la phase stationnaire (proprits physico-chimiques).
Le coefficient de distribution dun analyte A est dfini comme la
constante dquilibre (KA ou DA) entre la phase mobile et la phase
stationnaire (partage du solut entre les 2 phases).
AMobile

AStationnaire

KA = CS / CM

Le facteur de slectivit () dune colonne pour deux espces A et B

est dfini comme le rapport des coefficients de distribution KA et KB:
= KA / KB

( 1)

Le facteur de capacit (k) permet de comparer, pour un solut donn,

diffrentes colonnes chromatographiques:
k = mS / mM (m:
masse du solut dans chaque phase).
De faibles valeurs de k indiquent que le compos est peu retenu.
Habituellement, on travaille avec des k compris entre 1 et 10.

Aspects thoriques
Nombre de plateaux thoriques (N)
Ce paramtre permet de dfinir
lefficacit dune colonne. Plus ce
nombre est grand (valeurs de lordre
de 100000), plus la colonne est
efficace.
Afin de pouvoir comparer les
colonnes entre elles, on dfinit la
hauteur quivalente de plateaux
thoriques (H ou HEPT)
HEPT = H = L / N
L = longueur de la colonne

Aspects thoriques
La rsolution (Rs)
Ce paramtre reprsente la sparation entre 2 pics. Elle dpend de 3
facteurs:
- slectivit
- facteur de capacit k (doit tre
compris entre 1 et 10)
- efficacit de la colonne N
Rs = 2 [(tr2 tr1) / (w1 + w2)]
tr: le temps de rtention du compos
w: largeur du pic mimi-hauteur

Plus Rs est grand, meilleure est la sparation.

A partir de Rs = 1.5 la sparation entre 2 composs est complte.

Rsolution

GC: Appareillage

Helium

GC: linjecteur
L'injecteur est log dans un bloc
mtallique dont la temprature est
rgule afin d'assurer une bonne
homognit thermique du
systme. L'chantillon va tre
introduit, travers une pastille autoobturante appele septum, par
l'intermdiaire d'une microseringue.
L'chantillon sera vaporis et les
soluts traverseront l'injecteur
travers un tube en verre (parfois
mtallique) appel liner (ou insert),
grce au gaz porteur, jusqu' la tte
de la colonne.

Linjecteur

liner

Split: injection dune partie de lchantillon

dans la colonne (1:10, par exemple).

Splitless: injection de la totalit de

lchantillon dans la colonne (1 10 l).

Split

Splitless

Colonne

Colonne capillaire
Support pour la
colonne capillaire
Injecteur

Dtecteur
Silice greffe
recouverte dune
couche de polyimide

Four GC

La silice greffe
(phase stationnaire)
Nombreuses colonnes capillaires
commercialiss:
- nature de la phase greffe (polarit)
- longueur de la colonne (10m 60m)
- diamtre de la colonne capillaire
(0.18mm 0.53 mm)
- diamtre de la couche greffe
(0.10m 1.50 m)

Choix de la colonne (greffage) en

fonction des substances que lon veut
analyser.
Attention !
- stabilit du greffage (dure de vie
des colonnes, peut dpendre du
fabricant)

etc

La sparation des molcules

50 C

XXOS
SSOOXO
OXSSXSOO
SOXXXOX

T1

O XX S
OOO X SS
OOO XX SSS
OO XXXX S

300 C

AUGMENTATION DE LA TEMPERATURE

INJECTEUR

O
OOO
OOO
OO

T2

XX
X
XX
XXXX

S
SS
SSS
S

T3
DETECTEUR

Abondance

Temps (min)

Le chromatogramme
Abondance

Caractristique de la quantit de
substance initiallement prsente dans
le volume qui a t inject

Temps de rtention (min)

Temps que met la substance depuis

son introduction dans la colonne
(injection) jusquau moment o elle
arrive au dtecteur

Pics chromatographiques

Pics chromatographiques

La migration dans la colonne

O
OOO
OOO
OO

XX
X
XX
XXXX

S
SS
SSS
S
DETECTEUR

La vitesse de migration des substances dans la colonne

capillaire dpend de leur volatilit et leur polarit
(interaction avec la phase stationnaire).
de l, dpend lordre darrive au dtecteur!

Volatilit et polarit
CH3
CH2CHCH3

O
C OCH3
O

NH2

C
O

Amphtamine
C9H13N
MW = 135

Cocaine
C17H21NO4
MW = 303

B.p. = 203 C

B.p. = 98 C

Molcule peu polaire

Molcule polaire

Analyse directe par GC-MS !

Il est ncessaire de driver la molcule

pour lanalyse par GC-MS !

La dtection
Dtecteur les plus couramment utiliss:
- FID: Flame Ionization Detector
- TCD: Thermal Conductivity Detector
- ECD: Electron Capture Detector
- NPD: Nitrogen Phosphorous Detector (dtecteur spcifique)
- MSD: Mass Spectrometer Detector (dtecteur universel)

NPD

ECD

FID

FPD

PID

TCD

STABILITE du dtecteur:
Reproductibilit des
injections!

MSD

La linarit
LINEARITE du dtecteur:
Zone de concentration dans laquelle le signal de dtection est directement
proportionnel la concentration en analyte (quantit injecte).

Signal / Abondance / Aire du pic

Saturation
Domaine de linarit

LOQ
LOD

LOD: limite de dtection

LOQ: limite de quantification

Quantit injecte (l)

Concentration (g/ml, ng/ml)

Sensibilit
Tropacocane
Cuscohygrine
NPD

FID

Norcocane

Slectivit / Spcificit

NPD

MS

Quantit de substance dtecte

OOO
OOOOOOO
OOOOOO
OOOO
2

X
XX
XXX
X
1

DETECTEUR
Abondance

Laire sous le pic

chromatographique est
caractristique de la concentration
de la substance dans lchantillon
analys

2
Temps rtention

La surface ou la hauteur du pic chromatographique est proportionnelle la masse ou

la concentration injecte. Il est ainsi possible, au moyen dune courbe dtalonnage,
de dterminer avec prcision la quantit chromatographie. En GC, linjection ntant
pas trs reproductible, il est ncessaire dutiliser un standard interne (SI). Le choix du
SI est trs important car il doit se comporter comme le ou les produits analyser et ne
doit pas interfrer sur le chromatogramme.

Liner
L'intrt du liner est de retenir les constituants non volatils de l'chantillon,
impropres par nature la chromatographie.

Liner

Standard interne
- Compos organique ajout un mlange inconnu, une concentration
connue.
- Utiliser pour dterminer la concentration dun ou de plusieurs composs
dans un mlange inconnu.
- Le volume dchantillon inject na pas dimportance, contrairement la
mthode de la courbe dtalonnage.
- Trois conditions doivent tre respectes pour pouvoir lutiliser :
1) Le compos choisi doit tre idalement de structure chimique
similaire aux composs tudis.
2) Le compos choisi comme standard interne doit tre absent du
mlange inconnu, car sil y est, sa concentration deviendra
inconnue.
3) Le pic du standard interne doit tre bien spar des autres pics
du mlange inconnu, sinon le calcul de sa surface sera inexact.

Rfrences
La plupart des schmas et figures contenues dans cette prsentation
sont tires des ouvrages suivants:
- F. Rouessac et A. Rouessac: Analyse Chimique, Mthodes
et Techniques Instrumentales Modernes, Masson, 2me dition, 303 p., 1994.
- G. Schwedt: Atlas de Poche des Mthodes dAnalyse, Flammarion, dition
franaise, 234 p., 1993.
- M.S. Klee: GC Inlets An Introduction, Hewlett-Packard, 132 p., 1990.