Cultivo de virus

Muchos virus pueden desarrollarse en cultivos celulares o en huevos frtiles en

condiciones estrictamente controladas. Sigue recurrindose al crecimiento de los virus
en animales para el aislamiento primario de algunos de ellos, y para los estudios de la
patogenia de las enfermedades virales y de la oncognesis viral. En los laboratorios de
diagnstico se intenta recuperar a los virus de las muestras clnicas para establecer los
aspectos etiolgicos de las enfermedades. En los laboratorios de investigacin se
cultivan virus como base de los anlisis detallados de la expresin y la replicacin
virales.
La disponibilidad de clulas desarrolladas in vitro ha facilitado la identificacin y el
cultivo de virus recin aislados y la caracterizacin de los que ya se conocan. Hay tres
tipos bsicos de cultivo celular. Los cultivos primarios se efectan mediante dispersin
de clulas (por lo general con tripsina) de tejidos huspedes recin extirpados. En
general no pueden crecer ms all de unos cuantos pasos en cultivo, como cultivos
secundarios. Las lneas celulares diploides son cultivos secundarios que han
experimentado un cambio que permite su cultivo limitado (hasta 50 pasos), pero que
retienen su patrn cromosmico normal. Las lneas celulares continuas son cultivos
capaces de crecimiento ms prolongado, quiz indefinido, y que se han obtenido de
lneas celulares diploides o de tejidos malignos. Invariablemente tienen nmeros
alterados e irregulares de cromosomas. El tipo de cultivo celular que se emplee para
cultivar virus depende de la sensibilidad de las clulas a tal virus particular.
Identificacin de clulas infectadas por virus: Es posible vigilar la multiplicacin de un
virus de diversas maneras:
l. Desarrollo de efectos citopticos, es decir, cambios morfolgicos en las clulas. Los
tipos de efectos citopticos inducidos por virus consisten en lisis o necrosis celulares,
formacin de inclusiones, formacin de clulas gigantes y vacuolizacin citoplsmica.
La mayor parte de los virus producen algn efecto citoptico manifiesto en las clulas
infectadas que es, en general, caracterstico del grupo del virus.
2. Aparicin de una protena codificada por el virus, como la hemaglutinina del virus de
la influenza. Se pueden emplear antisueros especficos para identificar la sntesis de
protenas virales en las clulas infectadas.
3. Adsorcin de eritrocitos a las clulas infectadas, tcnica que se llama hemadsorcin,
a causa de la presencia de hemaglutinina codificada por el virus (parainfluenza,
influenza) en las membranas celulares. Esta reaccin se vuelve positiva antes que sean
visibles los cambios citopticos y, en algunos casos, ocurre en ausencia de stos.
4. Interferencia por un virus no citopatgeno (por ejemplo, el de la rubola) con la
replicacin e induccin de efectos citopticos por un segundo virus de carga (por
ejemplo, echovirus) que se aade como indicador.

5. Transformacin morfolgica por un virus oncgeno (por ejemplo, virus del sarcoma
de Rous), que suele acompaarse de prdida de la inhibicin de contacto y
acumulacin de clulas en focos definidos.
Durante la multiplicacin de los virus en el interior de las clulas, pueden producirse
estructuras especficas de virus, denominadas cuerpos de inclusin. Estas estructuras
llegan a ser mucho ms grandes que las partculas individuales del virus, y a menudo
muestran afinidad para los colorantes cidos (por ejemplo, la eosina). Pueden situarse
en el ncleo (herpesvirus), en el citoplasma (poxvirus) o en ambos (virus del
sarampin). En muchas infecciones virales, los cuerpos de inclusin son el sitio de
desarrollo del virin (la fbrica del virus). En algunas infecciones (poxvirus, reovirus),
el cuerpo de inclusin consiste en masas de partculas virales en el proceso de
replicacin. Aun en otros casos ms, como en el cuerpo de inclusin intranuclear del
herpes, el virus se multiplica en una etapa ms temprana de la infeccin y el cuerpo de
inclusin parece ser un producto residual de la multiplicacin viral. Las variaciones en
el aspecto del material de inclusin, dependen de la composicin del fijador tisular
empleado.
La presencia de cuerpos de inclusin puede ser de considerable utilidad en el
diagnstico. Las inclusiones intracitoplsmicas de las clulas nerviosas, denominadas
cuerpos de Negri, son patognomnicas de la rabia.

MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de transporte son medios diseados especialmente para la transportacin de muestras para
cultivos, aseguran la viabilidad de los microorganismos desde el momento de la toma de la muestra hasta su
siembra en el laboratorio. El medio de Stuart modificado se usa para el transporte de gonococos,
streptococos beta hemolticos, haemophylus y otros microorganismos exigentes. La siembra debe efectuarse
hasta las 36 horas siguientes a la obtencin de la muestra.
El medio de Cary Blair se utiliza primordialmente en el transporte de coprocultivos, debido, a que la viabilidad
de las especies de Shigella es superior que en otros medios de transporte. Se ha obtenido desarrollo de
Salmonellas y Shigellas hasta despus de 45 das de estar en medio de Cary Blair.Y, se ha obtenido
desarrollo de Vibrio cholerae despus de 92 das en este medio.
El medio de transporte para anaerobios y microaerfilos se utiliza generalmente en casos de muestras de
heridas y abscesos.
Para las tomas de las muestras se recomienda usar T' en T' (Torulin en Tubo) trula en tubo con el medio de
transporte indicado para cada caso.

INOCULACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

En microbiologa se entiende por "siembra" la operacin que consiste en depositar un grmen aspticamente
en un medio de cultivo.
Toda siembra debe adaptarse a los siguientes principios generales:
1 . Practicarla en medios de cultivo favorables y previamente esterilizados.
2. Emplear instrumentos aspticos.
3. No contaminar ni destruir el inculo,
4. Depositarla aspticamente en los medios elegidos.
5. Esterilizar os instrumentos empleados antes y despus de cada operacin.
Los instrumentos corrientemente empleados en las siembras son los siguientes:
1 . El asa: Es un alambre de cromonquel, tiene un dimetro de 0,3 a 1 mm. de dimetro y est sujeto a un
mango de vidrio o de metal. El hilo puede terminar recto (aguja), en anillo (asa) o aplastado (esptula).
2. Pipeta pasteur.
3. Trula algodn.
Los medios de cultivo, como ya se ha dicho, pueden ser slidos o lquidos, y estar contenidos en tubos,
placas o frascos.
La tcnica general de las siembras variar segn el estado fsico del material a sembrar y del medio de
cultivo.

METODOS DE CULTIVO DE USO RUTINARIO:

Al inocular debe trabajarse siempre dentro del radio de un mechero Bunsen (30 cm.), o, en el ambiente dentro
de una campana de flujo laminar, ya que, la corriente ascendente de aire que va por la llama, o la corriente de
aire del flujo laminar arrastra el polvo y otras partculas con el aire hacia arriba, o hacia afuera; impidiendo la
contaminacin del medio de cultivo.
El asa o pipeta pasteur deben ser flameadas adecuadamente y enfriadas antes de tocar el inculo, o el medio
de cultivo.

Siembra en placas:
Con el asa ya esterilizada, se toma una gota de lquido o de una emulsin del producto patolgico y se
deposita en un costado del agar de una placa Petri, se estra a partir de ese punto pasando suavemente el
asa en zig-zag por la superficie del agar sin rasparlo, rotar la placa en 1/3 y repetir el procedimiento 2 a 3
veces. A menudo se reciben trulas para cultivo y con ellas se practica la primera de las estras, procediendo
despus a diseminar con el asa o pipeta en la forma descrita.

Siembra en tubos de agar tendido:

El cuello del tubo debe ser flameado antes y despus de ser sembrado. Con el asa previamente esterilizada
a la llama, se toma una pequea cantidad de la muestra y se lleva al fondo del tubo, luego se estra
suavemente la superficie del medio en forma ondulante.
Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo, debe dejarse suelto el tapn de goma para evitar que los
gases expulsen el tapn.
Siembra por picadura:
El inculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y
teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la boca del tubo
antes y despus de la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapn de
goma para evitar que los gases expulsen el tapn.

Siembra en superficie y picadura:

El inculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y
teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada
del agar haciendo suavemente una estra ondulada. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de la
siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapn de goma para evitar que los
gases expulsen el tapn.

Siembra en profundidad:
Al inocular un medio lquido como es el tioglocolato, el tubo se inclina y el material se extrae del asa por
frotamiento contra la pared del tubo, cuando ste se endereza el material se encuentra bajo la superficie del
medio. Al inocular el medio lquido con trula o con inculo lquido se deposita este en el fondo del tubo.

Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de efectuada la siembra. Antes de introducir el tubo a la
estufa de cultivo debe soltarse el tapn de goma para evitar que los gases expulsen el tapn.
INCUBACION:
Los medios de cultivo pueden ser: inoculados en estufa a 35C en aerobiosis, anaerobiosis o en atmsfera de
C02.
Para aerobiosis se incuban las placas y tubos en estufa de cultivo a 35C.
Para anaerobiosis se colocan las placas y tubos dentro de una jarra Anaerobia y luego sta se coloca en
estufa de cultivo a 35C. con un sobre productor de atmosfera anaerobia. Para incubar en atmsfera de C02
se colocan las placas y tubos dentro de la Jarra de C02 y sta se coloca en la estufa de cultivo a 35C con un
sobre productor de atmosfera microaerofila.

EXAMEN MICROSCOPICO:
El examen de las muestras que se reciben puede hacerse al fresco (sin tincin) o despus de su coloracin.
Al manipular la muestra se debe tener el mximo de precauciones para evitar contaminaciones.
1 . Examen al fresco: Consiste en examinar la muestra, o cultivo, entre porta y cubreobjeto con el fin de
observar movilidad o morfologa sin exponerse a ver deformaciones causadas por la fijacin. Terminada la
observacin, debe colocarse la preparacin dentro de un recipiente conteniendo una solucin desinfectante
(Solucin antisptica) o mezcla sulfocrmica.
2. Frotis Teido: Tiene por objeto apreciar con exactitud la morfologa y disposicin del grmen. La tincin se
hace sobre un frotis seco y fijo sobre el portaobjetos.
Preparacin del frotis: antes de hacer cualquier tincin debe obtenerse un frotis adecuado del material en
estudio. De sus cualidades depende en gran parte el xito de la tincin. Limpiar el portaobjetos y pasarlo
rpidamente por la llama de un mechero, dejarlo enfriar. Colocar 1 gota de agua en el centro de la lmina.
Con el asa, esterilizada a la llama previamente, tomar una porcin pequea de cultivo o material por examinar
que se emulsiona en la gota de agua. Se extiende suavemente en aproximadamente 1/3 del portaobjeto.
Esterilizar el asa despus de usarla. Secar el frotis pasndolo suavemente por la llama o en estufa a 35C.
TINCION DE GRAM:

Gram, bacteriolgo dinamarqus, descubri en 1884, que algunos grmenes (Gram positivos) contienen
ciertos elementos qumicos en gran cantidad , peptidoglicano, en su membrana dispuestos estructuralmente
en forma muy diferente a la de otros (Gram negativos) y forman con los colorantes derivados de la rosanilina
(violeta de genciana, cristal violeta) ms el yodo, un compuesto que resiste la accin de decolorantes (alcohol
absoluto, alcohol acetona). En consecuencia aplicando ste mtodo de coloracin diferencial los grmenes
que contienen esos elementos qumicos quedan coloreados violeta y se denominan Gram positivos, aquellos
que los contienen en pequea cantidad se decoloran y para observarlos es necesario teirlos nuevamente,
para este fin se utilizan colorantes como la fucsina y la safranina y se denominan Gram negativos.
Tcnica de coloracion:
1.Cubrir el portaobjeto seco y fijo con solucin de cristal violeta, esperar 1 a 2 minutos. Lavar con agua de la
llave. Eliminar el agua sin secarlo.
2. Cubrir el portaobjeto con una solucin de Lugol, esperar 1 a 2 minutos. Lavar con agua de la llave.
Eliminar el agua sin secarlo.

3. Cubrir el portaobjeto con alcohol-acetona, agente decolorante, dejar transcurrir 5 segundos. Lavar y
eliminar el agua sin secar.
4. Cubrir el portaobjeto con la solucin de safranina por 15 a 20 segundos, enjuagar con agua de la llave,
secar con un papel absorbente sin restregar.
5. Examinar al microscopio con lente de inmersin.
Resultado: Los grmenes teidos de violeta se denominan Gram positivos y los de rojo Gram negativos.
TINCION AZUL DE METILENO
(LOEFFLER):
Para determinados fines pueden ser utilies las tinciones con azul de metileno de Loeffler
Se utilizan para observar morfologia, agrupacion, elementos celulares ,leucocitos, celulas epiteliales,etc
Tecnica:
1.-Cubrir el frotis con azul de metileno por 1 a 2 minutos.
2.-Lavar con agua corriente.
3.-Secar.
4.-Observar al microscopio.

TINCION DE ZIEHL- NEELSEN:

Se denominan grmenes alcohol cido-resistentes a un grupo de organismos que, una vez teidos con
solucin colorante-mordientes, tienen la propiedad de resistir la decoloracin por cidos minerales (cido
sulfrico o ntrico) y alcohol.
Este carcter de cido alcohol resistencia se debe a las sustancias serosas y lipdcas que contiene la
membrana de envoltura de stos grmenes y que vara en las diferentes especies.
Entre los grmenes cido-resistentes se encuentran especies saprofitas y patgenas. Saprofitas son: por
ejemplo M. phlei, M. Smegmatis, Representantes patgenos son el M. tuberculosis, M. leprae, M. kansaii.
Tcnica:
1 . Cubrir la preparacin fijada y seca con fucsina fenicada y calentar suave con un hisopo impregnado en
alcohol hasta que la fucsina emita vapores sin que hierva, sto se repite 3 veces en un tiempo mximo de 5
minutos.
2. Botar el colorante y lavar con agua corriente.
3. Decolorar con alcohol cido las veces necesarias hasta que las partes ms finas queden incoloras.
4. Lavar con agua corriente.

5. Cubrir la lmina con azul de metileno durante 30 segundos.

6. Lavar con agua corriente.
7. Secar suavemente a la llama o a temperatura ambiente.
INTERPRETACION:
Los bacilos cido alcohol-resistentes se observan como bastoncitos rojos, largos y algo encorvados en un
fondo azul claro.
ELIMINACION DEL MATERIAL CONTAMINADO:
Es de gran importancia del problema de la existencia en el laboratorio de material contaminado, cuyo manejo
exige precauciones, a fin de evitar la difusin de material infeccioso a travs del laboratorio y sus alrededores
y evitar la contaminacion cruzada de los medios, lo cual puede dar lugar a errores de importancia.
Muros, mesones, estantes situados en el lugar donde se trabaja deben ser lavados frecuentemente con un
buen desinfectante Todo el material contaminado debe esterilizarse en autoclave antes de desecharse por la
basura o preferentemente debe ser incinerado.
En caso de no disponer de autoclave, se recomienda:
a) Diluir un frasco de solucin antisptica en 5 litros de agua, en esta solucin sumergir las placas y los tubos
abiertos por un perodo mnimo de 72 horas, desde la introduccin en la solucin del ltimo material
contaminado. Teniendo la precaucin de cubrir totalmente el material con la solucin antisptica. Despus del
plazo indicado efectuar un control de esterilidad, sembrando 1 muestra de la solucin en una placa de Agar
Sangre. Esta se incuba por un minimo de 36 a 48 horas. Si el cultivo de control est negativo, elimine el
1quido por el desage y las placas por la basura.
b) Colocar todo el material contaminado, en una caja de cartn de paredes gruesas forrada en papel de
diario. Asimismo el material contaminado a desechar debe envolverse en abundante papel de diario antes de
colocarse dentro de la caja. Despus de amarrar la caja firmemente ste se coloca en un horno a 160C por
un plazo mnimo de 1 hora. Terminada la esterilizacin, y una vez fra introduce la caja sin abrir en una bolsa
plstica gruesa la cual se sella y se elimina por la basura.
En ambos casos de esterilizacin, tanto en autoclave como en horno, deben
utilizarse controles de esterilizacin para asegurar que el material sale
no contaminante.
MTODOS DE ESTERILIZACIN
Agentes Fsicos
1.

Calor

Radiaciones

Calor Seco
Acci Rojo incipiente
n

Incinerac
in

dire
cta
de la
llam
a

Accin
directa
de la
llama

Accin
directa Estufa
de los
de
generad calor
ores de seco
calor

Calor
Hmed
o

Acci
n
del
agua
calie
nte

Bao
Mara
hirvie
nte

Calenta
miento
repetido

Ebullici
n directa

Accin
del Autoc
vapor lave
de agua

Radiaci
Ionizantes

ones

Ultraviolet
as

Calor
La efectividad del calor como mtodo de esterilizacin depende de:
Temperatura
Tiempo de exposicin
Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca
desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidativos
irreversibles en los microorganismos.
Calor Hmedo:
El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se debe principalmente
a dos razones:
El agua es una especie quimica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas (DNA, RNA, protenas, etc)
son producidas por reacciones que elimi0nan agua. Por lo tanto, reacciones inversas podran daar a la clula
a causa de la produccin de productos txicos. Adems, las estructuras secundarias y terciarias de las
protenas se estabilizan mediante uniones puente de hidrgeno intramoleculares que pueden ser
reemplazadas y rotos por el agua a altas temperaturas.
El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que el aire. Por lo
que, los materiales hmedos conducen el calor mucho ms rpidamente que los materiales secos debido a la
energa liberada durante la condensacin.
El Autoclave es el aparato ms comnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones
que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a temperaturas mayores a 100C. Una
temperatura de 121C (una atmsfera de sobrepresin) con un tiempo de exposicin mayor a 15 minutos sirve
para destruir organismos formadores de esporas.

Tabla 1.
Influencia de la descarga incompleta de aire en la temperatura del autoclave

Presin
(atm)

Temperatura
(C)

Descarga

Descarga de 2/3 Descarga de

Sin

completa del aire

del aire

1/2 del aire

1/3

109

100

90

72

2/3

115

109

100

90

121

115

109

100

4/3

126

121

115

109

5/3

130

126

121

115

133

130

126

121

descarga
del aire

Ventajas del calor hmedo:

Rpido calentamiento y penetracin
Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo
No deja residuos txicos
Hay un bajo deterioro del material expuesto
Econmico
Desventajas:
No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos
Calor Seco:
El calor seco produce desecacin de la clula, efectos txicos por niveles elevados de electrolitos, procesos
oxidativos y fusin de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a
los microorganismos que estn en contacto con stos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente

penetra ms lentamente que el vapor de agua en materiales porosos. La accin destructiva del calor sobre
protenas y lpidos requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio
es baja. Esto se debe a que las protenas se estabilizan mediante uniones puente de hidrgeno
intramoleculares que son ms difciles de romper por el calor seco.
La Estufa de esterilizacin es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor seco. Se
requiere mayor temperatura y tiempo de exposicin que el autoclave. La temperatura vara entre 120 y
180C, requirindose distintos tiempos de exposicin. A 140C se necesitan por lo menos 5 horas de
exposicin, mientras que a 160C se requieren al menos 2 horas de exposicin.
Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodn no pueden ser esterilizados a ms de 160C.
Ventajas del calor seco:
1

No es corrosivo para metales e instrumentos.

Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no voltiles.

Desventajas:
1

Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la baja penetracin del
calor.

Incineracin:
Se utiliza para destruir material descartable contaminado.
Accin directa de la llama:
Se lleva al rojo el material de metal como hansas, lancetas, agujas de diseccin.
RADIACIONES
Su accin depende de:
El tipo de radiacin
El tiempo de exposicin
La dosis
Ionizantes:
Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos nucleicos, estructuras proteicas y
lipdicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos.
Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolbiles (termosensibles) como
jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos.
No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen alteraciones de los
componentes.
Ultravioletas:
Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos debido a que forman dmeros de pirimidinas
adyacentes que inducen errores en la duplicacin y por lo tanto la prdida de la viabilidad de las clulas.
Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies.
AGENTES QUMICOS
1

Introduccin

Antispticos

Desinfectantes y/o Esterilizantes

Introduccin
Dentro de los compuestos qumicos podemos encontrar agentes esterilizantes, desinfectantes y antispticos.
La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actan:

Antispticos

Alcoholes

Iodo

Agentes
catinicos,
aninicos y
anfteros

Organo
Mercuriales

Colorantes

Desinfectantes y/o Esterilizantes

Cloro y
Compuestos
clorados

Aldehdos

Oxido de
Etileno

Compuestos
Fenlicos

Acidos y
Alcalis

Concentracin: vara con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma concentracin del
agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos.
Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que no todos los
microorganismos mueren al mismo tiempo.
pH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes qumicos. El aumento de pH por encima de 7
incrementa la carga negativa de los microorganismos afectando la concentracin del agente sobre la clula. El
pH determina el grado de disociacin y la efectividad del agente qumico, pues a menor disociacin mayor
permeabilidad y mayor efectividad.
Antispticos
Alcoholes:
Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan protenas celulares. Desorganizan la
estructura fosfolipdica.
No destruyen esporas y tienen una accin germicida lenta.
Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga.
Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%.
Los ms utilizados son el etanol e isoproplico.
Iodo:
Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de protenas y cidos nucleicos. Inactiva protenas y
enzimas por oxidacin de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar tambin grupos amino, indoles, etc.
Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol),
aunque es irritante.
Es efectivo contra esporas en una concentracin de 1600 ppm de iodo libre.
Agentes inicos y anfteros:
Son sustancias que lesionan la membrana celular debido a que desordenan la disposicin de las protenas y
de los fosfolpidos, por lo que se liberan metabolitos desde la clula, se interfiere con el metabolismo
energtico y el transporte activo.
No son esporicidas ni tubercolicidas an en altas concentraciones.
Su principales ventajas se hallan en que son inodoros, no tien, no son corrosivos de metales, estables, no
txicos y baratos.
Catinicos: Sales de amonio cuaternarias. Tienen mayor actividad a pH alcalino y los Gram + son ms
susceptibles.
Aninicos: Jabones y cidos grasos. Tienen mayor actividad a pH cido y son eficaces contra Gram +.
Anfteros: Actan como catinicos o aninicos segn el pH.
Organo Mercuriales:
Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las protenas, inactivando enzimas.
Dentro de los mercuriales orgnicos se encuentran el metafen y el mertiolate.
Perxido de Hidrgeno:

Es un antisptico dbil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres.

Actualmente, el perxido de hidrgeno gaseoso se est utilizando como desinfectante de superficies o
descontaminante de gabinetes biolgicos debido a que no posee las propiedades txicas y cancerigenas del
xido de etileno y formaldehdo.
Colorantes:
Interfieren en la sntesis de acidos nucleicos y protenas (acridina) o interfieren en la sntesis de la pared
celular (derivados del trifenilmetano).
La acridina se inserta entre dos bases sucesivas del DNA separndolas fsicamente. Esto provoca errores en
la duplicacin del DNA.
Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde brillante) bloquean la
conversin del cido UDP-acetilmurmico en UDP-acetilmuramil-pptido.
-R:
HSO4-: Verde Brillante
Cl-: Verde de Malaquita
Desinfectantes y/o Esterilizantes
Cloro:
El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actan sobre protenas y cidos nucleicos de
los microorganismos.
Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina.
El producto clorado ms utilizado en desinfeccin es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo
sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y adems es efectivo en un amplio rango de temperaturas.
La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al cido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman
cuando el hipoclorito es diluido en agua. La actividad germicida del ion hipocloroso es muy reducida debido a
que por su carga no puede penetrar fcilmente en la clula a travs de la membrana citoplamtica. En
cambio, el cido hipocloroso es neutro y penetra fcilmente en la clula, mientras que el Cl2 ingresa como
gas.
El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro activo), a pH alcalino
y en envases oscuros que favorecen su estabilidad, pero es inactivo como desinfectante. A causa de sto, es
que deben utilizarse soluciones diluidas en agua corriente (que tiene un pH ligeramente cido), con el objeto
de obtener cido hipocloroso. Generalmente, se utilizan soluciones con una concentracin del 0.1-0.5% de
Cloro activo.
Su actividad est influida por la presencia de materia orgnica, pues puede haber en el medio sustancias
capaces de reaccionar con los compuestos clorados que disminuyan la concentracin efectiva de stos.
Aldehdos:
Son agentes alquilantes que actan sobre protenas, lo que provoca modificacin irreversible de enzimas e
inhibicin de la actividad enzimtica (Adicin nucleoflica de grupos -NH2 y -SH).
Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes.
Destruyen esporas.
El glutaraldehdo es el nico esterilizante efectivo en fro.
El formaldehdo como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes, etc. El formaldehdo gaseoso se
obtiene por calentamiento del paraformaldehdo (OH (CH2O)n-H), lo que produce las despolimerizacin de
este compuesto y la liberacin de formaldehdo.
El formaldehdo tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes refrigerados.
Compuestos Fenlicos:
Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmtica porque desordenan la disposicin
de las protenas y fosfolpidos. Esto causa filtracin de compuestos celulares, inactivacin de enzimas y lisis.
El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable, por ser muy irritante y por el

resido que queda luego de tratar las superficies.

Los derivados del fenol ms utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenlico) y los cresoles (alquil
fenoles). Estos son muy efectivos a bajas concentraciones contra formas vegetativas de bacterias.
No son efectivos contra esporas.
Oxido de Etileno:
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los que tienen grupos
carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica. Sirve para esterilizar
material termosensibles como el descartable y plstico, equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, etc.
Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y adems cancerigeno.

3. culticos celulares

Otro trabajo

Mtodos individuales
En esta seccin, algunos de los mtodos comnmente utilizados virolgico se
discutir con ms detalle
1

Aislamiento del virus

Microscopa Electrnica

Fijacin del complemento

Prueba de hemoaglutinacin inhibicin

Inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA)

La hemlisis radial simple

Inmunofluorescencia

Neutralizacin

Avidez de los anticuerpos IgG

10

Los mtodos moleculares

1. Aislamiento del virus

Los virus son parsitos intracelulares obligados que requieren clulas vivas para
reproducirse. Cultivos celulares, huevos y animales de laboratorio puede ser
utilizado para el aislamiento del virus. Aunque los huevos embroyonated y
animales de laboratorio son muy tiles para el aislamiento de ciertos virus, los
cultivos celulares son el nico sistema de aislamiento del virus en la mayora de
los laboratorios. El desarrollo de mtodos para el cultivo de clulas animales ha
sido esencial para el progreso de la virologa animal. Para preparar cultivos de
clulas, son los primeros fragmentos de tejido disociado, por lo general con la
ayuda de la tripsina o colagenasa. La suspensin celular se coloca en un vaso de
fondo plano o recipiente de plstico (placa de Petri, un frasco, una botella, tubo
de ensayo), junto con un medio lquido adecuado. por ejemplo, del guila, y un

suero animal. Despus de un perodo variable, las clulas se adhieren y

propagacin en la parte inferior del recipiente y luego comience a dividirse,
dando lugar a un cultivo primario. El apego a un soporte slido es esencial para
el crecimiento de las clulas normales.
Culturas de Primaria y Secundaria
Los cultivos primarios se mantienen al cambiar el lquido de 2 o 3 veces a la
semana. Cuando las culturas se vuelven demasiado lleno de gente, las clulas se
separan de la pared del vaso ya sea por la tripsina o EDTA, y las partes se utilizan
para iniciar cultivos secundarios. En las culturas primarias y secundarias, las
clulas conservan algunas de las caractersticas del tejido del que se derivan.
Las cepas de clulas y lneas celulares
Las clulas de los cultivos primarios a menudo pueden ser transferidos en serie
varias veces. Entonces, las clulas pueden continuar multiplicndose a un ritmo
constante durante muchos sucesivas transferencias. Finalmente, despus de una
serie de transferencias, las clulas se someten a la senescencia y la cultura no
puede ser transferido por ms tiempo. De cultivos de clulas diploides humanas,
la tasa de crecimiento disminuye despus de aproximadamente 50
repeticiones.Durante la multiplicacin de la cepa de clulas, algunas clulas se
alteran en el que adquieren una morfologa diferente, crecen ms rpido, y sean
capaces de iniciar un cultivo de clulas de un nmero menor de clulas. Estas
clulas se inmortalizan y tienen una vida til ilimitada. Sin embargo, conservan
la inhibicin por contacto.
Cultivos Celulares
Los cultivos celulares se dividen en 3 tipos: 1

Las clulas primarias - preparados directamente a partir de tejidos

animales o humanos y se pueden subcultivar mono slo una o dos veces
por ejemplo, primaria o renal mandril

Semi-continuo clulas diploides - que se derivan de tejido fetal humano y

se puede subcultivar 20 a 50 veces por ejemplo, los fibroblastos diploides
humanas como MRC-5

Clulas continua - derivadas de tumores de tejido humano o animal, por

ejemplo Vero, Hep2

Cultivos celulares varan grandemente en su susceptibilidad a diferentes virus. Es

de suma importancia que los cultivos de clulas ms sensibles son utilizados por
un archivo sospechoso en particular. Las muestras para cultivo celular debe ser
transportada al laboratorio tan pronto como sea posible despus de que se estn
adoptando. Los hisopos se ponen en un frasco con medio de transporte de
virus. Fluidos corporales y tejidos deben ser colocados en un recipiente estril.
Tras la recepcin, la muestra se inocula en diferentes tipos de cultivo de clulas
en funcin de la naturaleza de la muestra y la presentacin clnica. Los medios de
comunicacin de mantenimiento se debe cambiar despus de 1 hora o, si ello no
fuera posible, a la maana siguiente. Los tubos inoculados se incuban a 37 C de
35 en un tambor giratorio. La rotacin es ptimo para el aislamiento de los virus
respiratorios y provocar una aparicin ms temprana de la CPE para muchos
virus. Si los tubos fijos se utilizan, es fundamental que los tubos de cultivo se
colocar de manera que la monocapa celular se baa en medio nutriente.
Los tubos inoculados se debe leer por lo menos cada dos das durante la
presencia del efecto citoptico. Algunos especmenes, como la orina y las heces,
pueden ser txicos para los cultivos celulares que pueden producir un efecto
similar al CPE. Si los efectos txicos son extensas, puede ser necesario para el
paso de las clulas inoculadas. Los cultivos de clulas que estn contaminados
por bacterias o bien debe ser puesto de nuevo o pasar por un filtro de
bacterias.Los cultivos celulares deben mantenerse por lo menos una o dos
semanas (ms tiempo en el caso del CMV). Los cultivos celulares deben ser
realimentado con medio de mantenimiento fresco a intervalos regulares o si se
requiere que el medio de cultivo se vuelven demasiado cidos o
alcalinos. Cuando el ECP se ve, puede ser aconsejable el paso fluido de cultivo
infectado en un medio de cultivo fresco de el mismo tipo celular. De clulas
asociadas a los virus como el CMV y VZV, es necesario trypsinize y el paso de
las clulas infectadas intactas. Otros virus como el adenovirus puede subcultivar
despus de la congelacin y descongelacin de las clulas infectadas.

Efectos citopticos del enterovirus 71, VHS y CMV en cultivo celular: tenga en
cuenta la dilatacin de las clulas. (Linda Stannard, Universidad de Ciudad del
Cabo, Laboratorio de Virologa, Universidad de Yale-New Haven Hospital)

Efectos citopticos de la parotiditis y virus del sarampin en cultivos celulares:

nota de la formacin de sincitios. (Cortesa de Linda Stannard, Universidad de
Ciudad del Cabo, SA)
Virus de la influenza y parainfluenza normalmente no inducen CPE, sin embargo
poseen hemaglutininas y por lo tanto la capacidad de absorcin de los glbulos
rojos conejillo de indias, ya que brotan de la clula. Este fenmeno se conoce
como hemoadsorcin. Comnmente empleados son cultivos de clulas de rin
de mono primaria, LLC MK2 y MDCK. Los cultivos celulares se incubaron con
una suspensin de glbulos rojos de cerdo de Guinea a 4 C o temperatura
ambiente durante 30 minutos. Los glbulos rojos no absorbido se retira y la capa
celular observada al microscopio para detectar la presencia de hemadsorcin.La

identificacin presuntiva de aislamientos de virus por lo general se pueden hacer

sobre la base del tipo de CPE, hemadsorcin, y la susceptibilidad selectiva de
cultivo celular. Para la identificacin final, inmunofluorescencia, neutralizacin,
inhibicin de la hemoadsorcin, la microscopa Lectron, o las pruebas
moleculares se lleva a cabo normalmente.
Ventajas del cultivo de clulas para el diagnstico del virus incluyen la facilidad
relativa, de amplio espectro y sensibilidad. Est limitada por la dificultad en el
mantenimiento de cultivos celulares, la variabilidad de los cultivos celulares. La
contaminacin por agentes endgenos virales tales como SV40, micoplasmas y
bacterias pueden ocurrir. Otro de los problemas en el aislamiento de ciertos virus,
especialmente myxo y virus paramixovirus es la presencia de sustancias
inhibidoras o anticuerpos en el suero de ternera utilizado en los medios de cultivo
celular. El uso de suero de ternera fetal reduce este problema, pero suma a los
gastos.
Tcnicas rpidas Cultura por ejemplo, prueba DEAFF
Uno de los aportes ms significativos para el diagnstico rpido ha sido la
aplicacin de las culturas de centrifugacin para el diagnstico viral. Por varios
aos, se ha reconocido que la baja velocidad de centrifugacin de las muestras en
monocapas de clulas aumenta la infectividad de ciertos virus, as como la
clamidia.El cultivo celular se tie con anticuerpos monoclonales para detectar la
presencia de antgenos vricos especficos 24-48 horas ms tarde. El ejemplo ms
conocido de esta tcnica es la prueba DEAFF utilizados para el diagnstico
precoz de la infeccin por CMV. En la prueba de DEAFF, la muestra se inocula
en los fibroblastos humanos embrionaria y luego girar a baja velocidad. Despus
de un perodo de 24-48 horas, las clulas se tien con anticuerpos monoclonales
contra el antgeno CMV desde los primeros. Por lo tanto, un diagnstico rpido
de infeccin por CMV se puede hacer sin tener que esperar 1-3 semanas para el
CPE a aparecer.

Izquierda: hemadsorcin de glbulos rojos en la superficie de una lmina de

clulas infectadas por el virus de las paperas. Tambin tenga en cuenta la
presencia de sincitios que es indistinguible de la del virus sincitial respiratorio
(Cortesa de Linda Stannard, Universidad de Ciudad del Cabo). Derecho
Positivo: CMV DEAFF. (Laboratorio de Virologa, Universidad de Yale-New
Haven Hospital)
Lneas susceptibles celular
1

Herpes simple Vero Hep-2, clulas diploides humanas (HEK

y HEL), amnios humano

VZV diploides humanas (HEL, HEK)

CMV fibroblastos diploides humanas

Adenovirus Hep2, HEK,

MK poliovirus, BGM, LLC-MK2, diploides humanas, Vero,

Hep-2, Rhadomyosarcoma

Coxsackie B MK, BGM, LLC-MK2, Vero, HEp-2

Echo MK, BGM, LLC-MK2, diploides humanas, Rd

Influenza A MK, LLC-MK2, MDCK

Influenza B MK, LLC-MK2, MDCK

10

Parainfluenza MK, LLC-MK2

11

Las paperas MK, LLC-MK2, HEK, Vero

12

RSV Hep-2, Vero

13

Rinovirus diploides humanas (HEK, HEL)

14

Sarampin MK, HEK

15

La rubola Vero, RK13

2. Microscopa Electrnica
El diagnstico del virus por microscopa electrnica se basa en la deteccin e
identificacin de los virus sobre la base de su morfologa caracterstica. Una
ventaja importante de diagnstico del virus de EM es la capacidad de visualizar
el virus. Al identificar el virus directamente, es posible llevar a cabo un examen
sin una idea preconcebida de que el agente etiolgico, en contraste con los
ensayos que requieren una investigacin viral especfica. La velocidad es otra de
las ventajas de la EM como la muestra pueden ser procesados en cuestin de
minutos siguientes a la recepcin y por lo tanto EM puede ser utilizado como un
mtodo de diagnstico rpido. Por otro lado, la principal desventaja de la EM es
su incapacidad para examinar varias muestras por casualidad. En segundo lugar,
debe haber un nmero mnimo de partculas de virus presentes (alrededor de
10 6 partculas de virus por ml para la deteccin) Algunos virus, como SRSV
puede dar un aspecto morfolgico no diferenciadas que pueden hacer muy difcil
la deteccin. Por ltimo, EM es un servicio muy caro para proporcionar y
requiere de personal altamente cualificado. EM ha encontrado un nicho en
particular en la deteccin de los virus de la gastroenteritis exigentes como
rotacin, adenovirus, astro, Norwalk y calicivirus. Tambin se utiliza para el
diagnstico rpido de infeccin por virus del herpes. En ocasiones se utiliza para
el diagnstico de las infecciones por virus del papiloma humano y las infecciones
por miembros de la familia de los poxvirus. Adems de EM se puede utilizar para
confirmar los resultados del aislamiento del virus en cultivo celular, como los
virus parainfluenza.
Hay dos tipos de mtodos de EM, - microscopa directa o immunoelectron
(IEM). Con los mtodos directos, tincin negativa se utiliza normalmente, que
requiere un equipo especial poco, en contraste con las tcnicas de corte fino. Las
muestras se puede utilizar directamente o las partculas del virus pueden
concentrarse antes de la tincin negativa. Hay varios mtodos disponibles para la
concentracin, incluida la centrifugacin diferencial, la precipitacin persulfato
de amonio, y el mtodo de difusin en agar. Redes de cobre recubierto Fomvar se

utilizan. Inmunomicroscopa es un medio para aumentar la sensibilidad y la

especificidad de la EM y es particularmente til en las situaciones siguientes: 1

El nmero de partculas del virus actual es pequea.

Muchos virus tienen diferentes herpesvirus por ejemplo, la morfologa y

los picornavirus. IEM para identificar el virus

En una situacin de brote, donde los patgenos responsables ha sido

identificado de manera que puede ser til volver a examinar las muestras
negativas de nuevo con IEM.

Hay dos tipos de IEM, IEM simple, donde se incuba la muestra con un
anticuerpo especfico antes de la tincin con la esperanza de que el anticuerpo se
aglutinan la muestra, y en fase slida IEM (SPIEM), donde est cubierta la red de
copia con un anticuerpo especfico que se utiliza para capturar las partculas del
virus de la muestra.

Electronmicrographs de virus comnmente encontrado en muestras de heces de

pacientes que sufren de gastroenteritis. De izquierda a derecha: rotavirus,
adenovirus, astrovirus, virus parecidos al Norwalk. (Cortesa de M. Linda
Stannard, Universidad de Ciudad del
Cabo,http://www.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/emimages.html )
3. Fijacin del complemento
La prueba de fijacin del complemento (CFT) se utiliza ampliamente en la
serologa de la sfilis despus de haber sido introducido por Wasserman en
1909.Tom varias dcadas antes de que el CFT fue adaptado para el uso rutinario
de la virologa. CFT cumplir los siguientes criterios, es conveniente y rpida de
realizar, la demanda de equipos y reactivos es pequeo, y una gran variedad de
antgenos de prueba estn disponibles. Sin embargo, ahora hay una tendencia a
sustituir el CFT, con las tcnicas ms directa, sensible y rpida, tales como
aplicaciones RIA y EIA. A pesar de CFT es considerada como una prueba

relativamente simple, que es un procedimiento muy exigente, ya que 5 variables

involucradas. En esencia, la prueba consta de dos reacciones antgeno-anticuerpo,
uno de los cuales es el sistema de indicadores. La primera reaccin entre un
antgeno del virus conocido y un anticuerpo especfico se lleva a cabo en
presencia de una cantidad predeterminada del complemento. El complemento se
quita o se "fija" por el complejo antgeno-anticuerpo. La segunda reaccin
antgeno-anticuerpo consiste en hacer reaccionar ovejas RBC con
hemolisina. Cuando este sistema de indicadores se aade a los reactivos, los
glbulos rojos sensibilizados slo lisis en presencia de complemento libre. Los
antgenos utilizados para el CFT tienden a ser los antgenos de grupo en lugar de
tipo de antgenos especficos. Para que el CFT que se ha configurado
correctamente, la concentracin ptima de suero hemoltico, se complementan, y
el antgeno debe ser determinado por titulacin. A continuacin se presenta un
protocolo para el establecimiento de una prueba de fijacin del complemento.
a. La titulacin de suero hemoltico y se complementan
Diluciones de complemento con el 20% de diferencia en la concentracin se
realizan de 1:30 a 1:279. Las siguientes diluciones de suero hemoltico se hacen:
1:400, 1:800, 1:1600, 1:2000, 1:2400, 1:2800, 1:3200.
Los controles son necesarios los siguientes:
1

control de clulas - clulas no sensibilizadas slo

control del complemento - complemento a diferentes concentraciones y las

clulas no sensibilizadas

control de suero hemoltico - slo las clulas sensibilizadas a diferentes

concentraciones de suero hemoltico

La concentracin ptima de sensibilizacin (OSC) de suero hemoltico es la

dilucin que da la mayora de lisis con la mayor dilucin del complemento. Una
dosis hemoltica del complemento (HD 50) es la dilucin que da 50% de lisis de la
OSC de suero hemoltico. 3 HD 50 del complemento se utiliza para el CFT
b. La titulacin de antgeno y anticuerpo
Antgeno a una dilucin de 1:02 a 1:512 se valora en contra del control de suero
positivo. Los controles se incorporan los siguientes:

control de antgeno - a diferentes concentraciones de antgeno,

complemento y las clulas sensibilizadas

control del anticuerpo - antisuero a diferentes concentraciones,

complemento y las clulas sensibilizadas

clula de control, as - slo las clulas sensibilizadas

complemento de nuevo la titulacin

La dosis ptima del antgeno es la dilucin ms alta del antgeno que da un 75%
o ms de la fijacin con la mayor dilucin de anticuerpos.
c. CFT adecuada
En el propio CF, el suero hemoltico se utiliza en la concentracin ptima de
sensibilizacin, el complemento a 50 3HD, y cada antgeno individual en la dosis
ptima. Los sueros de los pacientes deben ser inactivados a 56 C durante 30
minutos antes. La deteccin se llev a cabo en alrededor de 1:10 en VBS, si es
positivo, el suero de una nueva prueba con diluciones de 1:10 a 1:80. Las placas
de control deben estar preparados con todos los antgenos utilizados incluida.Los
siguientes controles deben estar presentes; 1

Control de suero - suero y complemento nico, para detectar cualquier

actividad anticomplementaria en el suero

Control de antgeno - antgeno y complemento nico, para detectar

cualquier reaccin no especfica entre el antgeno y el complemento.

Complemento de nuevo la titulacin - para comprobar que el complemento

se utiliza en la concentracin correcta

Control de clulas - clulas sensibilizadas slo para comprobar que las

clulas eran adecuados para su uso.

Todos los controles deberan mostrar una lisis completa y en el complemento de

copia de la titulacin, la lectura debe ser 0 en el segundo pozo y 1 a 2 en la
tercera tambin. La mayor dilucin del suero del paciente que an muestra una
lectura de 3 o 4 es el ttulo de CF. El diagnstico de una infeccin reciente se
hace generalmente por la deteccin de un aumento de cuatro veces o ms en el
ttulo o por la deteccin de un alto ttulo de anticuerpos de una sola muestra (1:80
o superior). Donde los antgenos utilizados han sido cultivadas de yolf saco, debe

ser probado el suero contra el control de la yema de antgeno de salida con el fin
de excluir la posibilidad de reaccin no especfica.

Fijacin del complemento en la placa de microtitulacin. Filas 1 y 2exhibit de

fijacin del complemento obtenidos con muestras de fase aguda y convaleciente
de suero, respectivamente. (2 diluciones de suero se utiliza) La observ aumento
de 4 veces es significativo e indica una infeccin.
Ventajas de la LFT
1

Capacidad de defender contra un gran nmero de infecciones virales y

bacterianas, al mismo tiempo.

Barato

Desventajas de los CFT

1

No es sensible - no puede ser utilizado para la deteccin de la inmunidad

Tiempo y mano de obra intensiva

A menudo no especficos por ejemplo, la reactividad cruzada entre el VHS

y VVZ

4. Prueba de hemoaglutinacin inhibicin

Una amplia variedad de diferentes virus poseen la capacidad de aglutinar los
eritrocitos de las especies de mamferos o aves. Las especies de animales reales
que podran ser los eritrocitos aglutinados depende del virus actual. Algunos
ejemplos de virus que podra haemagglutinate incluyen influenza, parainfluenza,
adenovirus, rubola, alfavirus, bunyavirus, flavivirus y algunas cepas de los
picornavirus. Anticuerpos contra la protena viral responsable de la
hemaglutinacin puede prevenir hemoaglutinacin, esta es la base detrs de la
prueba de inhibicin de la hemaglutinacin (HAI). La especificidad de la prueba
de HAI vara con los diferentes virus. Con algunos virus como la gripe A, el

antgeno de la hemaglutinacin es el mismo que el antgeno responsable de la

adsorcin del virus y por lo tanto de neutralizacin del virus, y por lo tanto la
prueba de HAI es altamente especfico para las diferentes cepas del virus. Con
otros virus, la prueba de HAI es decir, menos especficas. flavivirus, donde los
anticuerpos contra un flavivirus HAI reaccin cruzada con otros flavivirus
relacionados. Las pruebas de HAI son ms sensibles que las pruebas de fijacin
del complemento, pero son menos sensibles que los EIA y los acuerdos de
integracin regional.
La prueba de HAI es fcil de realizar y requiere de un equipo de bajo costo y
reactivos. Diluciones seriadas de suero de los pacientes se les permite reaccionar
con una dosis fija de la hemaglutinina viral, seguido por la adicin de eritrocitos
aglutinacin. En la presencia de anticuerpos, la capacidad del virus para aglutinar
los eritrocitos se inhibe. La prueba de HAI se pueden complicar por la presencia
de inhibidores inespecficos de la hemaglutinacin viral. y naturalmente
aglutininas de la erthrocytes. Por lo tanto, el suero debe ser tratado antes de su
uso o resultados falso-positivos o negativos pueden surgir. Las pruebas de HAI
son ampliamente utilizados para el diagnstico de las infecciones de virus de la
rubola y la influenza. La siguiente es una breve descripcin de la prueba de HAI
para la rubola.
Para la prueba de la rubola HAI, un da pollito o eritrocitos de ganso se
utilizan. Buffer albmina bovina veronal (BAVB) se utiliza como diluyente. La
prueba de HAI debe llevarse a cabo con 4 unidades de hemaglutinacin del
antgeno de la rubola. La concentracin de antgeno requerida debe establecerse
antes de cada prueba de HAI, llevando a cabo una titulacin del antgeno de la
rubola de 1:2 a 1:1024. Una unidad HA se define como la mayor dilucin del
antgeno que da hemaglutinacin completa de las clulas.
En la prueba de HAI real, los sueros de los pacientes se diluyen en BAVB de 1:8
a 1:1024. Ya sea en forma de V o en forma de U de 96 pocillos placa de
microtitulacin pueden ser utilizados. Inhibidores inespecficos de la
hemaglutinacin viral puede ser removido por el tratamiento de los sueros antes
de la prueba por caoln, RDE, potasio peryodato (KIO) o por la inactivacin por
calor. Aglutininas no especficas para los eritrocitos puede ser eliminado
mediante la adicin de los eritrocitos de los sueros antes de la prueba para
permitir que los eritrocitos de absorber el aglutininas no especficas. Este
procedimiento puede llevarse a cabo para cada suero antes de la prueba, o puede
llevarse a cabo para los sueros que haba mostrado la aglutinacin en el suero de
los pozos de control (suero y eritrocitos nicamente) en una prueba de HAI
anterior. 4HA de antgeno contra la rubola se aade a cada uno de los sueros
problema y que contienen diluida con excepcin de los pozos de control de

suero. Una titulacin de antgeno rubola deben ser incorporados en la prueba de

4 unidades HA de 0,25 unidades HA. La placa se deja reposar a temperatura
ambiente durante 60 minutos despus de que, o bien 0,5% de clulas de gallina o
un 0,4% las clulas de pollo se aaden a cada pocillo y se incub a 4 C durante
60 minutos. La placa se lee.
Los eritrocitos de control slo debe mostrar un botn en la parte inferior del
pozo. Los controles de suero de cada suero debe mostrar la ausencia de
aglutinacin. La titulacin de hemaglutinina debe mostrar aglutinacin en las
unidades de HA 4, 2 y 1. Un aumento de cuatro veces o mayor en los anticuerpos
HAI entre los sueros de fase aguda y de convalecencia es indicativo de una
infeccin por rubola reciente.
Las ventajas de las pruebas de HAI es que son relativamente fciles y baratos de
realizar. Las desventajas son que las pruebas de HAI no son tan sensibles como
los EIA o acuerdos de integracin regional, la lectura real de los resultados es
subjetivo y los reactivos deben ser frescos o patrones de aglutinacin otra
anomala que pueda surgir hace que la lectura e interpretacin de la prueba muy
difcil. Como resultado de la prueba de HAI de la rubola ha sido reemplazado
por las pruebas EIA y RIA ms sensible y fiable para la rubola IgG en muchos
de diagnstico del virus de laboratorio
5. ELISA
ELISA fue desarrollado en 1970 y se convirti rpidamente aceptada. Una amplia
variedad de principios ensayo se puede usar en las tcnicas de ELISA. En la
actualidad los ms importantes son: 1

Mtodos competitivos

Mtodos de Sandwich

Mtodos de captura de anticuerpos

Mtodos competitivos
Uno de los componentes de la reaccin inmune se insolubiliza y el otro marcado
con una enzima. El analito puede ser cuantificada por su capacidad para prevenir
la formacin del complejo entre el insolublized y el reactivo de la etiqueta. Las
ventajas de este enfoque es que slo un paso de incubacin es necesaria y que el
"efecto prozona" en las concentraciones de analito alta no puede ocurrir. Las
desventajas son que el rango de concentracin en la que puede ser el analito

cuantificar sin dilucin de la muestra es bastante estrecha y que el antgeno o el

anticuerpo (en los casos en que pueden estar presentes en una muestra por
ejemplo la hepatitis B) producen la misma respuesta, y por lo tanto puede no
puede ser distinguido en un ensayo de un solo paso.
Sandwich (indirectos) los mtodos de
1

El mtodo que se utiliza el mismo componente de la reaccin inmune (por

ejemplo, los anticuerpos) en la forma insolubiliza y etiquetado de la
enzima. El otro componente, el analito (es decir, el antgeno en la muestra
constituye un puente entre los dos reactivos.)

El mtodo que se utiliza un componente (por lo general el antgeno) en

una forma de vincular a la insolubiliza analito de la muestra (el
anticuerpo), que posteriormente se determina mediante la adicin de un
segundo anticuerpo marcado en contra de la misma clase de anticuerpos,
los anticuerpos o analitos protena A.

En principio, la cuantificacin se puede lograr a travs de una gama muy amplia

concentracin del analito en los mtodos de sndwich tales. El "efecto prozona"
se puede evitar de la siguiente manera: - (i) usando los pasos secuenciales de
incubacin de la muestra y la etiqueta, o (ii) mediante el uso de anticuerpos
monoclonales. Modificacin de la prueba en (2) por lo que los anticuerpos de una
clase especfica, tales como IgM, pueden dar resultados falsos si los anticuerpos
de las clases de inmunoglobulinas estn tambin presentes en la
muestra. Tambin RF (factor reumatoide) es conocido por ser un factor
potencialmente interferentes.
Mtodos de inhibicin de Sandwich
La muestra que contiene el analito (por lo general de anticuerpos) se preincubaron con una cantidad fija de su pareja de unin (es decir, el antgeno),
despus de que la cantidad restante del antgeno se determina en un ensayo de
tipo sndwich. Estos mtodos por lo general son complicados y tienen un rango
de medicin limitados. El mtodo permite la deteccin simultnea de anticuerpos
o antgenos, si cualquiera de estos dos analitos presentes en la muestra.
Mtodos de captura de anticuerpos
Estos mtodos utilizados para detectar anticuerpos de las subclases de
inmunoglobulinas especficas, por primera reaccin de la muestra con el ejemplo
insolubiliza anti-IgM y, posteriormente, ya sea con el antgeno marcado con

enzima seguido de anticuerpo ligado a enzimas. Ni los anticuerpos de las

subclases de inmunoglobulinas ni de factor reumatoide interferir de manera
significativa en estos ensayos. Son ampliamente utilizados para el diagnstico de
infecciones agudas por la deteccin de IgM. Estos ensayos se pueden utilizar
para la deteccin de IgG e IgA. Teniendo en cuenta las tendencias hacia la
simplificacin de las pruebas y la cuantificacin de los analitos en un amplio
rango de concentraciones. Se debe esperar que los mtodos de inhibicin
competitiva y sndwich disminucin de la importancia y los mtodos de captura
de sandwich y de anticuerpos sern los principios del ensayo principal en el
futuro.
Caractersticas del ensayo
El uso de anticuerpos monoclonales ha dado lugar a muchas mejoras en los
sistemas de ELISA.
1

Una mayor sensibilidad, - ya sea por la seleccin de anticuerpos con una

afinidad muy alta, o por reduccin de la altura y la variabilidad de la
reaccin de fondo, lo que hace muy bajas concentraciones de analito ms
fcilmente detectable.

Mayor especificidad, - evitando la presencia de anticuerpos en el sistema

de ensayo con reactividad especfica contra los no-analito eptopos, y
mediante la seleccin de combinaciones de anticuerpos monoclonales que
pueden aumentar an ms la especificidad.

Mayor practicidad, - por ejemplo mediante la introduccin de incubacin

simultnea de la etiqueta, en fase slida y la muestra sin riesgo de "efecto
prozona".

La etiqueta de la enzima; - La mayora de los ensayos emplean peroxidasa de

rbano picante, fosfatasa alcalina, o BD-galactosidasa. Los desarrollos recientes
ms interesantes ha sido en nuevos mtodos para detectar estas enzimas en lugar
de la utilizacin de nuevas enzimas. Fluormetros se introdujeron en 1984 para la
deteccin de la fosfatasa alcalina y de BD-galactosidasa. Se dispone de mtodos
para detectar la peroxidasa de rbano picante por medio de
chemilumininescence. Mtodos fluorimtrica y luminomtrica ofrecen una mayor
sensibilidad y un rango de medicin ms amplia que la espectrometra de
convencionales. TMB est reemplazando gradualmente substratos mutagnicos
como OPD, lo que lleva a una mayor sensibilidad y seguridad.

Microplacas ELISA: color pozos indican reactividad. Cuanto ms oscuro sea el

color, mayor es la reactividad
6. La hemlisis radial simple
Hemlisis radial simple (SRH) se utiliza habitualmente para la deteccin de la
rubola IgG especfica. Muchos sueros se pueden examinar de forma simultnea
para comprobar su inmunidad mediante esta tcnica. Salud sexual y reproductiva
ha demostrado ser sensible, especfico y confiable. Placas de salud sexual y
reproductiva se suelen preparar en el laboratorio utilizando reactivos disponibles
en el mercado, ya que la corta vida de anaquel de los geles que hace difcil la
distribucin comercial. Los sueros se colocan en los pozos de una placa que
contiene agar con antgeno de rubola recubierto de glbulos rojos y se
complementan. La presencia de IgG especfica contra la rubola se detecta por la
lisis de la rubola antgeno recubierto de RBC. La zona de la lisis de todo el bien
depende del nivel de anticuerpos presentes especficas. Adems de la deteccin
de la inmunidad, la salud sexual y reproductiva tambin pueden ser utilizados
para el diagnstico de infeccin aguda que puede ser un aumento en el tamao de
la zona de hemlisis demostrado entre los sueros agudos y convalecientes. Salud
sexual y reproductiva tambin ha sido desarrollado para otras infecciones virales
como las paperas. Sin embargo, su uso principal sigue siendo en la deteccin de
la inmunidad contra la rubola.
Placas de salud sexual y reproductiva se preparan como sigue. 1% de agarosa
fundida se utiliza. La rubola sensibilizados al antgeno eritrocitos de oveja se
aade a la placa de la prueba y los glbulos rojos sensibilizados de oveja a la
placa de control. Complemento se aade a los platos y la agarosa fundida se deja
fraguar. Las placas se almacenan a 4 C hasta su uso. Wells se cortan en la

prueba y las placas de control y el suero se aade a un pocillo de la placa de

prueba y un pocillo correspondiente en la placa de control. Un control negativo,
un control de 15 UI / ml, y un control positivo alto se utilizan. Las placas se
incuban en una cmara hmeda a 37 C durante la noche.
El tamao de la zona de hemlisis alrededor de un suero de prueba y que
contiene es comparada con la de los 15 IU / ml de control. Si el tamao de la
zona es mayor que el 15 UI / ml de control, entonces la persona se considera
inmune. No hay zona de no-especficas hemlisis deben estar presentes en la
placa de control. Hazy zonas de hemlisis tambin puede ocurrir cuando los
sueros de fase aguda se ponen a prueba debido a la presencia de anticuerpos de
baja avidez. Algunas mujeres dejan de producir el nivel de anticuerpos superior a
15 UI / ml, incluso despus de varias vacunas, por lo tanto, muchos laboratorios
de considerar a las mujeres con una historia bien documentada de ms de una
vacuna que es inmune, si los anticuerpos se detectan mediante otro anlisis.
Adems de salud sexual y reproductiva, otras pruebas como ELISA y de
aglutinacin del ltex tambin son ampliamente utilizados para la deteccin de
anticuerpos contra la rubola. Los sueros de los pacientes cuyo estado
inmunitario es difcil de determinar por la salud sexual y reproductiva puede dar
un resultado claro con ELISA. Pruebas de aglutinacin en ltex tienen la ventaja
de la velocidad y la sencillez y la tcnica es tambin muy sensible. Por lo tanto,
LA se utiliza ahora como la prueba de deteccin de anticuerpos contra la rubola
en muchos laboratorios con preferencia a la SSR.

Hemlisis radial simple para detectar anticuerpos contra la rubola. Prueba de la

placa (L), placa de control (R). El pozo en el centro de la placa contiene el 15
miu / ml suero control. Nota de la zona despejada de lisis que rodea el pozo de la

placa de prueba que no est presente en la placa de control. Las muestras que
ofrece una zona de lisis igual o superior a los 15 miu / ml de control y se
consideran positivas para anticuerpos contra la rubola. En caso de una zona de
tamao similar est presente en la placa de control, entonces el resultado no es
vlido.
7. Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia (IF) es ampliamente utilizado para el diagnstico rpido de
infecciones por el virus de la deteccin del antgeno del virus en muestras
clnicas, as como la deteccin de virus especficos de anticuerpos IgG o IgM o
IgA. La tcnica hace uso de un anticuerpo marcado con fluorescena para teir
las muestras que contienen antgenos especficos del virus, por lo que la
fluorescencia las clulas teidas con luz UV. En el caso de IF directa, la muestra
se sonde directamente con un anticuerpo especfico marcado contra un antgeno
del virus en particular. En el caso de IF indirecta, la muestra es primero probaron
con un anticuerpo especfico no marcado, seguido por un anticuerpo marcado
contra el primer anticuerpo. Directa o indirecta SI se puede utilizar para la
deteccin del antgeno del virus, mientras que la IF indirecta es casi siempre
utilizada para la deteccin de anticuerpos. Indirecta si poseen la ventaja de un
paso de amplificacin adicional para la seal, sin embargo, se requiere un paso
adicional en comparacin con IF directa.
La deteccin de antgenos virales
SI se usa ms comnmente para la deteccin de virus respiratorios en muestras
respiratorias. Aspirados nasofarngeos son los mejores ejemplares de usar y que
normalmente se los bebs de menos de 12 meses de edad. Sin embargo, no hay
razones por las cuales aspirados nasofarngeos no se pueden recoger de los nios
mayores y adultos. Una serie de virus respiratorios pueden ser detectados por
contacto directo o indirecto SI, incluyendo el VRS, influenza A y B, adenovirus y
virus parainfluenza. Sin embargo, la sensibilidad vara mucho entre diferentes
virus. El mtodo es muy til en el caso de la RV en el tratamiento antiviral est
disponible para los bebs gravemente enfermos. SI es tambin ampliamente
utilizado para la deteccin de infecciones por VHS, de las lesiones vesiculares y
lesiones cerebrales, infecciones de VZV y CMV. Sin embargo, en el caso de la
infeccin por CMV, la sensibilidad de la SI en muestras clnicas directamente es
baja, con la posible excepcin de la prueba de antigenemia CMV.
Una indirecta tpico procedimiento de IF para la deteccin de antgenos virales es
el siguiente: - las clulas de la muestra clnica se encuentran inmovilizados en los
distintos pozos en una diapositiva. Sueros policlonales o monoclonales

especficos se aade a cada pocillo y la diapositiva se incuba a 37 C durante 30

a 60 minutos. La diapositiva se lava tres veces durante 5 minutos cada uno con
PBS anticuerpos y fluorescena contra el primer anticuerpo, se aade. La
diapositiva es ms incubadas a 37 C durante 30 a 60 minutos y se lava de
nuevo. La diapositiva se prepara para la microscopa. Sueros especficos
monoclonales o policlonales contra el antgeno viral se puede utilizar. Sueros
monoclonales ofrecen la ventaja de una mayor sensibilidad y especificidad. Sin
embargo, uno debe estar seguro de que es capaz de detectar todas las diferentes
cepas del virus.
SI depende en gran medida la calidad de la muestra. En muchos casos, ha
demostrado ser ms sensibles que los EIA equivalente. Esto se debe a un
diagnstico de certeza se puede hacer en la identificacin de unas pocas clulas
que contienen slo la fluorescencia del color adecuado y con la distribucin del
antgeno correcta. Una de las crticas de SI es que es mucho trabajo y requiere de
personal altamente cualificado para la lectura de la muestra.

Las pruebas de inmunofluorescencia positiva de antgeno HSV de clulas

epiteliales y del antgeno CMV pp65 de neutrfilos en la sangre perifrica.
(Laboratorio de Virologa, Universidad de Yale-New Haven Hospital). Derecha:
prueba de inmunofluorescencia positiva de antgeno del virus de la rabia (CDC)
La deteccin de anticuerpos virales
SI es probablemente el ms simple anlisis serolgico de
configurar. Simplemente se requiere clulas infectadas que expresan antgenos
virales y un antisuero marcado con fluorescena contra la inmunoglobulina
humana. SI puede ser usado para detectar anticuerpos IgG, IgM e IgA. Al ser
muy fcil de configurar, a menudo es el ensayo serolgico primera y nica
disponible para los virus recientemente descubiertos, en particular, los

arbovirus. SI se utiliza ampliamente para el diagnstico de las infecciones de

EBV y tambin es usado rutinariamente para otros virus como el VZV.
8. Neutralizacin
La neutralizacin de un virus se define como la prdida de la infectividad a travs
de la reaccin del virus con anticuerpos especficos. Virus y el suero se mezclan
en las condiciones adecuadas y luego inoculadas en cultivo celular, los huevos o
los animales. La presencia de virus no neutralizado puede ser detectado por
reacciones tales como CPE, hemoadsorcin / hemaglutinacin, la formacin de
placa, la enfermedad en los animales. La prdida de la infectividad se compra por
sobre la injerencia del Ab vinculado con alguno o los pasos que conducen a la
liberacin del genoma viral en las clulas husped.Hay dos tipos de
neutralizacin; Neutralizacin reversible - El proceso de neutralizacin se puede revertir
mediante la dilucin de la mezcla de Ab-Ag en un corto perodo de tiempo de la
formacin de los complejos Ag-Ac (30 minutos). Se cree que la neutralizacin
reversible se debe a la interferencia con la unin de los viriones a los receptores
celulares, por ejemplo. la unin de la protena HA del virus de la gripe de cido
silico. El proceso requiere la saturacin de la superficie del virus con Abs.
Neutralizacin estable - con el tiempo, complejos Ag-Ac suele ser ms estable
(varias horas) y el proceso no puede ser revertido por dilucin. Ni los viriones o
el ABS son cambiados permanentemente en la neutralizacin estable, sin
cambios de los componentes se pueden recuperar. El virus se puede reactivar
neutralizado por escisin proteoltica. Neutralizacin estable tiene un mecanismo
diferente a la de neutralizacin reversible. Se haba demostrado que el virus
neutralizado puede conectar y que los viriones ya instalada puede ser
neutralizada. El nmero de molculas de Ab necesarios para la neutralizacin
estable es considerablemente menor que el de la neutralizacin reversible,
pruebas cinticas muestra que incluso una sola molcula de Ab puede neutralizar
un virin.Neutralizacin se produce generalmente por las molculas de Ab que
establecen contacto con los dos sitios antignicos en diferentes monmeros de un
virin, aumentando considerablemente la estabilidad de los complejos. Un
ejemplo de neutralizacin estable es la neutralizacin de los poliovirus, el cual, la
fijacin de los anticuerpos contra la cpside viral se estabiliza la cpside e inhibe
la uncoating y la liberacin de cido nucleico viral.
La evolucin viral que tienden a seleccionar las mutaciones que cambian los
determinantes antignicos implicados en la neutralizacin. Por el contrario, otros
sitios antignicos que tienden a permanecer sin cambios debido a mutaciones que

afectan a ellos no seran seleccionados y podra incluso ser perjudicial. Un virus

de este modo se desarrollara a partir de un tipo original de una variedad de tipos,
diferentes en la neutralizacin (ya veces en IH), pero reteniendo algunos de los
mosaicos originales de los determinantes antignicos reconocidos por los
CFT. Debido a su alta especificidad inmunolgica, la prueba de neutralizacin es
a menudo el estndar contra el cual se evala la especificidad de las tcnicas
serolgicas otros.
Antes de la prueba de neutralizacin se lleva a cabo, los componentes conocidos
que se van a utilizar deben ser normalizados. Para identificar un aislamiento del
virus, un antisuero conocido pretitred se utiliza. Por el contrario, para medir la
respuesta de anticuerpos de un individuo a un virus, un virus conocido pretitred
se utiliza. Para titular un virus conocido, serial diluciones de la cepa se prepara y
se inoculan en un sistema husped susceptible, como cultivos celulares o
animales.El ttulo de virus de punto final es el recproco de la dilucin ms alta
de virus que infecta al 50% del sistema, por ejemplo de acogida. 50% de los
cultivos celulares desarrollar CPE, o el 50% de los animales desarrollan la
enfermedad. Esta dilucin de punto final contiene un cultivo de 50% del tejido
infectar dosis (DICT 50) o una dosis letal 50% (DL 50) de virus por unidad de
volumen. La concentracin de virus por lo general utilizados en la prueba de
neutralizacin es de 100 DICC 50 o 100 DL 50 por unidad de volumen.
El antisuero se valora en la prueba de neutralizacin en contra de su homlogo
del virus. Diluciones seriadas dobles del suero se prepara y se mezcla con un
volumen igual de virus que contiene 50 100TCID. Las mezclas de virus y el suero
se incuba durante 1 hora a 37 C. El tiempo y la temperatura de incubacin vara
con los diferentes virus. Las mezclas se inocula luego en un sistema husped
susceptible. La valoracin de punto final contiene una unidad de anticuerpos y es
el recproco de la mayor dilucin del antisuero proteccin contra los virus. Suele
ser de 20 unidades de anticuerpos del antisuero se utiliza en las pruebas de
neutralizacin.
9. Las pruebas de avidez de IgG
Reinfeccin rubola puede ocurrir, especialmente en aquellos cuya inmunidad
inducida por la vacunacin fueron ms que por la infeccin natural. Sin embargo,
la reinfeccin por rubola durante el primer trimestre del embarazo se piensa que
representan un riesgo mnimo para el feto. Casos de SRC que surgen de una
nueva infeccin de rubola rara vez han sido reportados y la interrupcin del
embarazo no se recomienda. Por lo tanto, es importante distinguir la reinfeccin
de la infeccin primaria por rubola durante el primer trimestre del embarazo. En

ausencia de datos fiables las pruebas confirmatorias, los abortos innecesarios

puede resultar.
IgM especficos contra la rubola pueden ser detectados despus de la enseanza
primaria y reinfeccin. Aunque en este ltimo caso, es probable que sean ms
transitorios y de un nivel ms bajo Una solucin para la diferenciacin de
primaria de la reinfeccin podra ser la medida de la avidez de unin al antgeno
de IgG especfica. La avidez de IgG es baja despus de la estimulacin antignica
primaria, pero madura lentamente en cuestin de semanas y meses.
Mtodos
1

Semi-cuantitativo de prueba; - Esto se basa en el reconocimiento de un

patrn caracterstico en la prueba de hemlisis radial. La zona de hemlisis
se evalu, las zonas hemoltica con mrgenes "suaves" difusa exterior se
producen los anticuerpos de baja avidez. Zonas hemolticas con un
discreto margen exterior (denominadas "normales") son producidas por
anticuerpos de alta avidez. Las zonas que no eran ni difusa ni discretas son
clasificados como dudosos.

Prueba cuantitativa "avidez ELISA", -

3
1

Principio de elucin - en esta prueba un agente de la protena ligera

desnaturalizacin como la urea o dietilamina (DEA), se aade el
anticuerpo - mezcla de antgeno. Los anticuerpos de baja avidez son
ms propensos a distanciarse de los complejos antgeno-anticuerpo
que los de mayor avidez. El resto de la prueba es que para una
normal de ELISA. Los resultados obtenidos en la presencia y la
ausencia del agente desnaturalizante se compara y un ratio de
deriva. Anticuerpos de baja avidez tendr una proporcin mucho
ms alta que los anticuerpos de alta avidez.

Los sueros a analizar se diluye en varias concentraciones en la

presencia y la ausencia de la DEA y ensayados para IgG1 e
IgG3. Las densidades pticas obtenidas fueron trazados. El ms alto
OD (V) se observ y reducido a la mitad (V / 2) y la distancia entre
las curvas de la DO a V / 2 fue medida como el valor de cambio de
la DEA.

Hedman et al (1989) midieron la avidez de IgG en 64 sueros. De acuerdo con su

avidez de IgG ELISA, 29 tenan baja avidez Ab, 29 tenan alta avidez Ab y 6
fueron dudosos. Comparacin con los conocidos expedientes clnicos mostraron
que todos los pacientes con baja avidez Ab tena infeccin primaria reciente.Las
personas con alta avidez haba sido inmune. En este grupo fue de 4 que se haba
originado a partir de las reinfecciones confirmado. De los sueros dudosos, 5 de
cada 6 se obtuvieron a los 2 meses de la infeccin primaria.
Thomas y Morgan-Capner (1988) midieron la avideces de IgG1 e IgG3
especfica contra la rubola. IgG3 rara vez se ha demostrado en la
reinfeccin. Los expertos evaluaron sueros de 24 pacientes que fueron vacunados
o infectados en el pasado distante, de 66 aos que la infeccin primaria de
rubola reciente, 11 de los que tienen una nueva infeccin sintomtica y 64 de los
que tienen una nueva infeccin asintomtica. Para IgG1 el valor de cambio DEA
fue <0,6 para los casos de rubola en el pasado distante, en comparacin con 0,8
para el primer mes despus de la infeccin primaria. El valor mximo de la DEA
de cambio para los sueros de los casos de reinfeccin fue de 0,65. No hay suero
de casos de rubola en el pasado distante contenidos IgG3 suficiente especfica
para estimar la avidez. Los sueros obtenidos dentro de un mes del inicio de la
rubola dio DEA cambiar los valores de 0,7 en comparacin con el suero de la
reinfeccin. En general, el ensayo de elucin de principio es ms sensible para la
infeccin por el pasado, pero menos sensibles para la infeccin reciente.Mientras
que la prueba de dilucin principio es ms sensible para la infeccin reciente.
10. Tcnicas Moleculares
Tcnicas de biologa molecular para la deteccin directa del genoma viral en la
muestra tendr un papel cada vez ms importante en el laboratorio de virologa
clnica en el siglo 21. Las tcnicas moleculares se pueden dividir en dos categoras:
los que no tienen que ver con la hibridacin de amplificacin es decir, con sondas
de cidos nucleicos, y los que implican por ejemplo, la amplificacin de PCR,
LCR, etc NASBA
Sondas de cido nucleico
Sondas de cidos nucleicos son segmentos de ADN o ARN que se han marcado
con enzimas, sustratos antignicos, moeities quimioluminiscente, o
radioistopos. Se puede unir con alta especificidad a secuencias complementarias
de cido nucleico. Las sondas se pueden dirigir a cualquiera de los objetivos de
ADN o ARN y puede ser desde 20 hasta miles de bases de longitud. La presencia
y la cantidad de hbridos despus de la hibridacin se determina por la deteccin

de la etiqueta. Las sondas suelen ser sintetizados por uno de los siguientes tres
mtodos.
1. Sondas de oligonucletidos - por lo general son menos de 50 bases de largo y
son sintetizados qumicamente
2. PCR - se producen las sondas de 50 a varios cientos de bases de largo
3. Clonacin - se produce sondas de varios miles de bases de la sonda por
ejemplo, mucho tiempo para completar el genoma del VHB
La alteracin de la severidad de la reaccin va a alterar la sensibilidad y la
especificidad de la hibridacin. Rigor se refiere al nmero de pares de bases
coincidentes que se puede tolerar que dos molculas de cido nucleico se unen
para formar una molcula de doble hebra. Rigor se ve afectada por diversas
variables, incluyendo la temperatura, concentracin de sal, y el pH de la reaccin
de hibridacin. Alto rigor se logra mediante el uso de tampones de baja
concentracin de sal o mediante la realizacin de la reaccin de hibridacin y
lavado de rigor a temperaturas ms altas. Cuanto mayor es la severidad de la
reaccin, menos probable es que los pares de bases coincidentes para permanecer
juntos.
La reaccin de hibridacin puede llevarse a cabo completamente en la fase de
solucin en la que tanto el cido nucleico diana y la sonda son libres de
interactuar en la mezcla de reaccin. Hibridacin solucin tiene la ventaja de ser
rpido al cargar y llevar a una mayor sensibilidad que la hibridacin en fase
slida. Este es el enfoque adoptado por Abbott con el HVB-cuantitativa del ADN
del ensayo. El cido nucleico unido a una superficie slida an estn disponibles
para participar en las reacciones de hibridacin. Sin embargo, la sensibilidad
tiende a ser menor que el de la hibridacin lquido. Sin embargo, esta tcnica
facilita enormemente el manejo de mltiples muestras. El dot-blot y ensayos
sndwich hibridacin se utilizan comnmente en este sentido. En los ensayos de
hibridacin in situ, en el que clulas enteras o cortes de tejido se introducen en el
proceso de hibridacin se ha convertido en una importante herramienta de
investigacin.
A pesar de haber sido por muchos aos, los ensayos de hibridacin no son
todava de uso comn en el laboratorio de virologa clnica. La razn principal es
que su sensibilidad no suele ser mayor que las tcnicas convencionales mucho
ms simple virolgico como el cultivo celular y la deteccin del antgeno viral.
Reaccin en cadena

La PCR permite la amplificacin in vitro de secuencias especficas de ADN diana

por un factor de 10 6 y por lo tanto una tcnica extremadamente sensible. Se basa
en una reaccin enzimtica que implica el uso de oligonucletidos sintticos que
flanquean la secuencia diana nucleico de inters. Estos oligonucletidos actan
como cebadores para la termoestable Taq polimerasa. Repetidos ciclos
(normalmente de 25 a 40) de la desnaturalizacin del ADN molde (a 94 C),
hibridacin de los cebadores a sus secuencias complementarias (50 C), y
extensin del cebador (70 C) como resultado la produccin exponencial de la
especfica objetivo de los fragmentos. Ms sensibilidad y especificidad se pueden
obtener por la tcnica de PCR anidada, por el que se amplifica el ADN de dos
pasos. En el primer paso, un par inicial de los cebadores se utiliza para generar
una secuencia de tiempo que contienen la secuencia de ADN diana. Una pequea
cantidad de este producto se utiliza en una segunda ronda de amplificacin, que
emplea primers al ADN diana final.

Esquemtica de la reaccin en cadena de polimerasa

La deteccin del producto la secuencia de ADN de la PCR se puede realizar de
varias maneras. El mtodo ms sensible y especfico es el tamao de fraccionar el
producto de reaccin en un gel de agarosa o de acrilamida y tincin del ADN con

bromuro de etidio. Una tcnica ms sensible implica la unin del ADN a una
membrana a travs de puntos o las tcnicas de slot blot-seguido de hibridacin
con una sonda marcada homloga de oligonucletidos. Por otra parte, el producto
de la PCR puede ser investigado directamente por hibridacin oligomricas
lquido. Sin embargo, estas tcnicas no proporciona ninguna informacin sobre el
tamao del producto amplificado y por lo tanto, no pueden excluir la posibilidad
de que el producto es originario de una regin del genoma humano que presenta
homologa con la secuencia diana CMV. La deteccin ms sensible y especfico
mtodos resultan de combinar la informacin del tamao de la electroforesis en
gel con la mejora de la sensibilidad y la especificidad de las tcnicas de
hibridacin. Esto puede lograrse mediante electroforesis en gel seguida de la
transferencia y el sur de la hibridacin, o por medio de la hibridacin
oligomricas lquido seguido por electroforesis en gel.
Ventajas de la PCR:
1

Sensibilidad muy alta, puede detectar hasta un genoma viral por volumen
de muestra

Es fcil de configurar

Tiempo de respuesta rpido

Desventajas de la PCR
1

Muy expuestos a la contaminacin

Alto grado de habilidad del operador requiere

No es fcil de cuantificar los resultados

Un resultado positivo puede ser difcil de interpretar, sobre todo con virus
latentes como el CMV, donde cualquier persona seropositiva tendr
presente el virus en su sangre, independientemente si tienen o no la
enfermedad.

Los tres primeros problemas estn siendo abordados por la llegada de los
sistemas comerciales cerrados, tales como el Amplicor Roche Cobas, que
requiere un tratamiento mnimo. El uso de sintticos objetivos internos
competitivos en estos ensayos comerciales ha facilitado la cuantificacin de los
resultados. De lo contrario, los mismos problemas que permanecen en casa con
los ensayos de PCR. El problema con la contaminacin es particularmente grave

en los ensayos de PCR anidada y se deben evitar en la prctica clnica lo ms

lejos posible. La sensibilidad sera suficiente si se utiliza una sola reaccin de
PCR seguido de hibridacin con una sonda de oligonucletidos especficos. Este
es el enfoque adoptado por los ensayos comerciales. El cuarto problema es ms
difcil de resolver pero en general se encontr que los pacientes con enfermedad
activa por CMV tiene una carga viral mucho ms altos que los que no lo
hacen. Por lo tanto, se trata simplemente de un caso de encontrar el corte
apropiado.
Otras tcnicas de amplificacin
Siguiendo los pasos de PCR, una serie de alternativas tcnicas in vitro de
amplificacin se han desarrollado, de los cuales algunos ya estn disponibles
comercialmente. Ejemplos de estas tcnicas alternativas incluyen la reaccin en
cadena de ligasa (LCR), la secuencia de cido nucleico basada en la
amplificacin / amplificacin isotrmica (NASBA), la amplificacin de
desplazamiento de cadena, el mtodo Q replicasa, y las sondas de ADN
ramificado.De estas tcnicas, LCR, NASBA y ADN ramificado ya estn
disponibles comercialmente en un formato automtico o semiautomtico. Un
ensayo NASBA se encuentra disponible para la cuantificacin de VIH-ARN
(Organon), y un ensayo de LCR se encuentra disponible para la deteccin de la
clamidia (Abbott).Los ensayos de ADN ramificado estn disponibles para la
deteccin de cuantificacin de VIH-ARN, ADN del VHB y el VHC-ARN
(Chiron).
Con la excepcin de la sonda de ADN ramificado, todas estas tcnicas implican
la amplificacin exponencial de cualquiera de los cidos nucleicos de destino o la
sonda. Por lo tanto, todos ellos son tan susceptibles a la contaminacin como la
PCR. El sistema de ADN ramificado en realidad es un intermedio entre las
tcnicas de hibridacin clsica y las nuevas tcnicas in vitro de amplificacin. No
es tan sensible como las tcnicas que implican la amplificacin exponencial, pero
es mucho ms sensible que las tcnicas de hibridacin clsica. A continuacin se
muestra un breve resumen de las caractersticas de los mtodos de amplificacin
disponibles.

Los mtodos comnmente usados para los virus individuales

Mtodos virolgicos Slideset
A. Los virus de ADN

1. HSV
1

Aislamiento del virus - HSV es uno de los ms fciles de cultivar virus y

por lo general slo se tarda de 2 a 3 das para un ECP caracterstico a
aparecer.Una gran variedad de lneas celulares pueden ser utilizados
includinf Vero, Hep-2, clulas diploides humanas, rin de conejo, amnios
humano, rd.Escrito por IF (monoclonal Abs), la neutralizacin, REA.

IF directa de frotis de clulas vesiculares

EM de los frotis de clulas vescula - no se puede distinguir de las

partculas de VZV.

Serologa - infeccin primaria puede ser diagnosticada por el ttulo de

anticuerpos en aumento o la deteccin de IgM. La infeccin recurrente no
puede estar asociada con el ttulo de anticuerpos de subida o de IgM. Los
mtodos disponibles incluyen la neutralizacin CFT, IAHA, IF, ELISA y
RIA.

2. VZV
1

El aislamiento del virus - diploides humanas (HEL, HEK), tpico de

CPE. El virus es difcil de aislar, ya que es muy lbil y lquido de la
vescula deben inocularse lo antes posible despus de la recoleccin

IF directa de frotis de clulas vesiculares

EM de los frotis de clulas vescula

Serologa - CFT pueden ser utilizados para el diagnstico, pero no lo

suficientemente sensible para la deteccin de la inmunidad. IF y ELISA
puede ser utilizado para la deteccin de estado de inmunidad

3. CMV
1

El aislamiento del virus - HEL (fibroblastos de pulmn embrionario

humano, por ejemplo MRC-5 lnea celular) que se utiliza, tarda de 2 a 4
semanas para una characteritic CPE a aparecer. Mtodos rpidos de la
cultura, como la prueba DEAFF se puede utilizar que un resultado positivo
dentro de las 48 horas.

Antigenemia CMV - la expresin del antgeno pp65 del CMV entre los
neutrfilos se detecta. Un resultado cuantitativo (nmero de clulas

positivas) se dispone que es ms o menos predictivo de la gravedad de la

infeccin.
3

PCR para CMV-ADN - se observa una tendencia hacia el uso de ensayos

cuantitativos de PCR.

Serologa - CFT muy utilizados, pero pueden dar resultados falsos

negativos debido a la baja sensibilidad. ELISA y de aglutinacin del ltex
son las pruebas serolgicas ms sensibles y se pueden utilizar para la
deteccin de estado inmune.

4. EBV
1

El aislamiento del virus - la presencia de EBV puede ser demostrado por la

transformacin de los linfocitos del feto y el establecimiento de lneas de
clulas linfoblsticas permanentes que expresan antgenos EBV.

Las tcnicas moleculares como la hibridacin y PCR se puede utilizar para

demostrar la presencia de genomas EBV en muestras de biopsia.

Serologa - anticuerpos contra el VCA, EA y EBNA se puede

analizar. P3HR-1 o B-95 lneas de clulas se utilizan para las pruebas de
anticuerpos VCA. La lnea celular Raji se utiliza para EBNA, las pruebas
de EA se lleva a cabo en lneas celulares no productores inducida por la
expresin de la EA. Indirecta si se utiliza para pruebas de Ab VCA, y
anticomplemento IF indirecta debe ser utilizado para las pruebas EBNA
Ab.

Desde el perfil de los anti-VCA y anti-EBNA1

Susceptible si anti-VCA est ausente

La infeccin primaria si slo anti-VCA est presente. IgM anti-VCA se

puede utilizar para confirmar la infeccin primaria. El aumento de los
ttulos de IgG usualmente no se observan.

Inmune a la infeccin pasado si los dos anti-VCA y anti-EBNA-estn

presentes

Anti-VCA IgA es til para la deteccin de casos de la APN y, posiblemente, la

monitorizacin del tratamiento contra el cncer.
5. Los adenovirus

El aislamiento del virus - Hep2, HEK. CPE de 2 a 7 das, la identificacin

positiva de IF, escrito por neutralizacin

SI las muestras NPA

Serologa - CFT es la prueba de eleccin, sin embargo los nios pequeos

a menudo no responden con anticuerpos FC despus de la infeccin. HAI
con el mono (Grupo I), o la rata (Grupos 2 y 3) los eritrocitos puede ser
utilizado. Neutralizacin de micro-pruebas son las pruebas ms sensibles
disponibles y el tipo especfico.

6. Los virus del papiloma

Virus del papiloma humano puede ser detectado por EM, SI, la hibridacin y
tcnicas de PCR en hisopos, raspados o biopsias de las lesiones. La serologa no
tiene ningn papel en el diagnstico de la infeccin por VPH, porque la respuesta
Ab puede requerir varios meses para formar y los niveles de Ab son generalmente
bajos.
7. Poliomavirus
1

El aislamiento del virus - JCV requiere primaria clulas gliales fetales,

BKV crecer en HEK o las clulas de fibroblastos diploides.

El diagnstico de la LMP pueden ser realizadas por los estudios

citolgicos de las lesiones, la demostracin del antgeno JC, en las
lesiones, la demostracin de ADN JCV.

IU puede ser diagnosticadas por su apariencia citomorfolgico de las

clulas epiteliales de las vas urinarias.

La serologa es de poco valor ya que la mayora de personas estn

infectadas. Sin embargo, un resultado negativo sera una evidencia fuerte
en contra del diagnstico de la LMP.

B. RNA_Viruses
1. Los enterovirus
1

Aislamiento del virus

Poliomyelits - aislar fcilmente en una amplia gama de lneas

celulares por ejemplo, MK, BGM, LLC-MK2, diploides humanas,
Vero, Hep-2

Coxsackie A - algunos crecer en Rhadomyosarcoma (Rd) las lneas

celulares. De lo contrario ser necesario la inoculacin en ratones
recin nacidos

Coxsackie B - MK, BGM, LLC-MK2, Vero, HEp-2

Echovirus - MK, BGM, LLC-MK2, diploides humanas, Rd

El aislamiento puede ser identificado por la prueba de neutralizacin utilizando

mezclas de suero como el Lim Benyesh-Melnick piscina (AH piscina, se
identifican 42 serotipos de enterovirus). Si una identificacin nica que no se
puede hacer, entonces el aislamiento puede ser una mezcla.
1

Serologa - las pruebas de neutralizacin son las pruebas ms sensibles y

especficos. Ensayo de inhibicin del metabolismo (prueba de color) se
basa en el mismo principio y emplea a cantidades conocidas de la
suspensin celular que se aaden a los tubos de ensayo 1 hora despus de
la mezcla suero-virus. El continuo crecimiento de las clulas que reducen
el pH del medio de la cual ser indicada por un cambio de color. Otra
forma de la prueba de neutralizacin es la prueba de reduccin de la
placa. Otras pruebas serolgicas incluyen la fijacin del complemento,
HAI, EIA y RIA. El CFT tiene un valor limitado en trminos de
especificidad, debido a importantes reacciones cruzadas. HAI est limitada
por el hecho de que slo un tercio de los enterovirus conocido
haemagglutinate.

La rpida deteccin de enterovirus por PCR se ha convertido en ms

ampliamente utilizado especialmente para el diagnstico de meningitis por
enterovirus usando muestras de LCR

2. Influenzaviruses
1

El aislamiento del virus - MK, LLC-MK2, MDCK. Influenza B se produce

un ECP en las clulas MDCK. De lo contrario, la presencia del virus es
detectado por hemoadsorcin. Una mayor identificacin se realiza
mediante las pruebas IF y HAI

Deteccin del antgeno del virus por IF o EIA

Serologa - CF prueba se puede utilizar para los subtipos de virus nuevos,

mientras que HAI es subtipos especficos

3. Parainfluenza_viruses
1

El aislamiento del virus - MK, LLC-MK2

La deteccin directa del antgeno del virus de IF

Serologa - CFT, los nios pequeos no desarrollan anticuerpos CF y en la

infeccin inicial. Por otra parte, un cierto grado de reaccin cruzada est
presente. Las pruebas de HAI son ms especficos del tipo de la prueba de
FC, pero las reacciones cruzadas an estn presentes. Neutralizacin
(hemoadsorcin-inhibicin) las pruebas tienen la mayor especificidad. EIA
estn disponibles para el diagnstico serolgico

4. Paperas
1

El aislamiento del virus - virus de las paperas puede ser aislada de la orina,
saliva o muestras de LCR. MK, LLC-MK2, HEK, Vero. El CPE consiste
en la formacin sincitial. Hemoadsorcin debe llevarse a cabo ya que el
CPE no siempre ocurre en el primer paso. La confirmacin por SI o
inhibicin de la hemoadsorcin

Serodiagnstico - CFT es ampliamente utilizado para el diagnstico

serolgico. Anticuerpos contra el antgeno S aparece en unos pocos das
despus de la aparicin de los sntomas. Anticuerpos contra el antgeno V
rara vez aparece en las 2 semanas del inicio de los sntomas, pero estn
presentes en 4 semanas. Anticuerpos contra el antgeno S son transitorios,
en comparacin con aquellos contra el antgeno V. Mtodos disponibles
incluyen HAI, salud sexual y reproductiva, IF y EIA.

5. Sarampin
1

El aislamiento del virus - MK, las clulas de HEK se puede utilizar. CPE
toma una semana o ms en aparecer. Los cultivos celulares pueden ser
examinados por hemoadsorcin o SI. CPE se compone de clulas gigantes
multinucleadas. La identificacin definitiva requiere neutralizacin. El
sarampin puede ser aislado de hisopados farngeos, hisopados
conjuntivales, y la orina. La recuperacin del sarampin de especmenes
PEES requieren un procesamiento especial y tcnicas de co-cultivo.

La deteccin directa - tpico de las clulas gigantes multinucleadas se

puede encontrar mediante el examen directo de la secrecin nasofarngea o
hisopos conjuntivales. SI puede ser usado para teir frotis bucal,
sedimentos nasofarngeo, o el sistema urinario.

Serologa - CFT y HAI se utilizan ampliamente. La FQ es menos

especfica que la HAI. Los aumentos de anticuerpos CF y los picos a ms
tardar el anticuerpo HAI.

5. RSV
1

El aislamiento del virus - clulas Hep-2 son los ms sensibles. Una

caracterstica CPE se produce. Si CPE no est presente, si puede llevarse a
cabo

La deteccin directa - IF o ELISA puede llevarse a cabo en el Plan

Nacional de Accin

El diagnstico serolgico - CFT y ELISA puede ser utilizado. No es raro

encontrar en sueros de fase aguda. En los ms jvenes, estos representan
anticuerpos transplacentaria, en nios mayores, que son el resultado de una
infeccin previa por VSR.

6. Rabia
1

El aislamiento del virus - la inoculacin intracerebral de ratones de

laboratorio es el mtodo de eleccin. Virus de la rabia se propaga en una
variedad de cultivos de clulas incluyendo las clulas diploides humanas,
pero no han reemplazado el sistema de ratn

La deteccin directa - las muestras se examinaron para detectar la

presencia de cuerpos de Negri y el antgeno de la rabia por SI. Cuello de la
biopsia de piel y pruebas de la crnea son las muestras de eleccin. Cuello
de la biopsia de piel es ms sensible que la crnea desguaces.

El diagnstico serolgico - la prueba de neutralizacin del ratn es el

mtodo estndar. ELISA tambin estn disponibles. Suero o muestras de
LCR se puede utilizar.

7. Arbovirus
1

El aislamiento del virus - los arbovirus suele estar presente en la sangre

durante la fase febril aguda de la enfermedad. Para reducir el efecto de los

inhibidores de suero, los intentos de aislamiento debe hacerse no slo con

suero sin diluir, pero las diluciones de 1:05 o 1:10 o superior. El
aislamiento del virus no suele ser tratado a partir de biopsias de tejido con
la excepcin de tejido cerebral de pacientes con encefalitis. Tres sistemas
estn disponibles para el aislamiento del virus; 1

inoculacin intracerebral de ratones recin nacidos

por ejemplo, tejido cultural. LLC-MK2, las lneas de Vero, clulas

artrhopod

la inoculacin intratorcica de los artrpodos

La identificacin se realiza mediante tcnicas serolgicas con antisueros de

referencia para escribir. SI, Hawai o EIA puede ser utilizado.
1

El examen directo - si puede ser utilizado para demostrar antgenos de

arbovirus en los tejidos

Serologa - CFT y HAI son las pruebas ms comnmente usado para

detectar anticuerpos contra arbovirus. Otras pruebas que pueden ser
utilizados incluyen SI, RIA, EIA, y prueba de neutralizacin.

8. Arenavirus
1

El aislamiento del virus - el virus se puede aislar de la sangre durante la

fase febril aguda de la enfermedad. El procedimiento normal consiste en la
inoculacin de clulas Vero seguido de IF

La deteccin directa - estos mtodos son posibles pero no en forma

rutinaria debido a la necesidad de instalaciones de categora 4 de
contencin

El diagnstico serolgico - SI, CFT, la neutralizacin y ELISA puede ser

utilizado.

Vacunas virales

PRINCIPIOS DE LA VACUNACIN INMUNOLGICOS

Puntos generales
1

Las clulas B receptores de antgenos ve predominantemente en 3Dimensiones conformaciones.

Las clulas T antgeno procesado ve en asociacin con molculas MHC de

nuevo como una conformacin 3-D.

En una clula presentadora de antgeno, tales como los macrfagos, no

infecciosas protenas se endocitosis y degradacin en los lisosomas de los
pptidos (va endosomal), algunos de los cuales vinculado especficamente
a las molculas MHC II. En cambio, si un agente como un virus infect los
macrfagos, algunos antgenos virales recin sintetizados son igualmente
degradadas en el citoplasma de los pptidos (la va citoplasmtica), pero
estos estn asociados con molculas de clase I del MHC.

Los diferentes componentes de la respuesta inmune a la infeccin

Anticuerpo tiene tres funciones importantes: 1

Es el nico medio para prevenir una infeccin por la neutralizacin de la

infectividad viral. La generacin de Ab de proteccin por lo general ha
sido la respuesta slo se mide por los fabricantes de
vacunas. Generalmente neutralizar Ab reacciona con slo un unos pocos
eptopos en uno o dos antgenos de superficie del agente infeccioso. Es
ineficaz si los eptopos de proteccin estn sujetos a la deriva antignica
pronunciado.

Las clulas infectadas que expresan antgenos virales en su superficie

celular pueden ser lisadas por dos anticuerpos dependiente de los
mecanismos de - (a) va del complemento, o (b) la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos.

Anticuerpos puede facilitar la remocin de escombros (un mecanismo de

recoleccin de residuos)

La funcin principal de las clulas T efectoras, en particular, las clulas Tc, es

evidente una infeccin. A pesar de anticuerpos pueden contribuir a la
recuperacin de la infeccin, las clulas T son el principal mecanismo para lograr

esto. La caracterstica ms importante del CMI, en contraste directo con Ab, es

que responde a muchos pptidos de un agente. Algunos provienen de las
protenas que no estn sujetos a la variacin antignica. Esta amplia respuesta de
clulas T es un mecanismo importante para la superacin de la variacin
antignica de un agente y la variabilidad gentica de la poblacin de
acogida. Aunque este tipo de agente puede eludir la proteccin que ofrece un Ab
preformada despus de la vacunacin, la respuesta inmune mediada por clulas
permite que la mayora de las personas a recuperarse de una infeccin
aguda. Agentes infecciosos causantes de infecciones crnicas persistentes han
encontrado una manera de escapar de una respuesta inmune mediada por
clulas. Entre los mecanismos disponibles;
1

Generacin de clulas que escapan a una respuesta inmune mediada por

clulas.

Por la regulacin de la produccin de MHC en las clulas infectadas para

que no se reconocen y destruyen las clulas T.

Infeccin de las clulas en los sitios inmunoprivilegiadas como el cerebro.

Los eventos tpicos que se produce despus de una infeccin aguda por ejemplo,
virus. influenza murino es el siguiente: 1

El virus se replica en los pulmones, llega a los ttulos de mximo en 4 - 5

das, y disminuye despus. Virus unos 12 das ya no pueden ser
recuperados.

La actividad de clulas efectoras Tc alcanza un mximo de actividad

despus de 6-8 das, se vuelve indetectable despus de 14 das. Las clulas
Tc memoria alcanza su nivel ms alto 2 - 6 semanas despus de la
infeccin y se mantienen constantes o disminuyen muy lentamente.

El nmero de clulas productoras Ab, produciendo primero IgM despus

de IgG e IgA pico a las 6 semanas y luego declinen
sostenidamente. Mximo de la memoria de las clulas B se encuentra 10 a
15 semanas despus de la infeccin, pero disminuye a partir de entonces,
pero algunas estn presentes en 18 meses.

Tanto Ab-secretor y las clulas B de memoria estn presentes despus de la

infeccin. En la actividad de cambio Tc slo se genera mientras el virus
infeccioso est presente. Clulas T de memoria persisten, sino que requieren
mayor exposicin a virus infeccioso para la reactivacin.

Requisitos de una vacuna

Para ser eficaz la vacuna debe ser capaz de obtener lo siguiente: 1

La activacin de Clulas Presentadoras de Antgenos para iniciar el

procesamiento y produccin de antgenos interleucinas.

La activacin de los linfocitos T y B para dar un alto un alto rendimiento

de clulas de memoria.

Generacin de clulas Th y Tc a varios eptopos, para superar la variacin

en la respuesta inmunitaria en la poblacin debido al polimorfismo de
MHC.

La persistencia de antgeno, probablemente en las clulas dendrticas

foliculares en el tejido linfoide, donde las clulas B de memoria son
reclutados para formar las clulas secretoras de anticuerpos que se siguen
produciendo anticuerpos.

Las vacunas vivas cumplir con estos criterios de excelencia. Abs neutralizantes
son muy importantes. Las vacunas de subunidades inducir respuestas inmunes
pobres y varias dosis con adyuvante estn obligados a obtener una respuesta
adecuada. Las dos funciones principales del antgeno adyuvante para mantener el
antgeno en o cerca del sitio de la inyeccin y para activar clulas presentadoras
de antgeno para lograr el procesamiento de antgenos y la produccin de
interleucina efectiva. Las vacunas compuestas simplemente de un eptopo de
clulas T y una de las clulas B eptopo es poco probable que sea efectiva. Esto
es ejemplificado por los intentos de desarrollar una vacuna contra la malaria.
Principios Generales
Los programas de vacunacin ms exitosos han sido los dirigidos contra las
enfermedades virales como la viruela, la poliomielitis y el sarampin. Antes de
emprender cualquier programa de vacunacin, la necesidad de una vacuna en una
comunidad deben ser evaluados. Una evaluacin epidemiolgica de la incidencia
y la gravedad de una infeccin determinar si vale la pena evitar. No existe
ninguna vacuna es totalmente seguro y los posibles beneficios de la inmunizacin
debe ser sopesado contra el riesgo de efectos secundarios. Dos ingredientes son
necesarios para un programa de inmunizacin.
1

Una vacuna segura y efectiva

Una adecuada estrategia de cobertura de la vacuna adecuada

La estrategia que se necesita depende de si el objetivo del programa es la

erradicacin, eliminacin o contencin. La erradicacin es la extincin completa
del organismo en cuestin. En la eliminacin, la enfermedad desaparece, pero
sigue siendo el organismo. La contencin es el control de la enfermedad hasta el
punto en que ya no constituye un problema de salud pblica.
Cuando la erradicacin o la eliminacin es el objetivo, la inmunizacin masiva
en la vida temprana de ambos sexos suele ser necesario. En la prctica, es muy
difcil de lograr una cobertura del 100%, y el xito del programa depende de la
capacidad de la vacuna para interrumpir la transmisin del virus salvaje,
protegiendo as a los no vacunados. Cuando el objetivo es la contencin, la
vacunacin selectiva de las personas con mayor riesgo es normalmente
suficiente.Las indicaciones habituales para la inmunizacin selectiva de viaje,
riesgos laborales, control de brotes y para las personas con especial riesgo de
enfermedad grave. La inmunidad de grupo tiene muy poco, ya que el virus
contina circulando ampliamente entre los no vacunados. En teora, la
vacunacin selectiva es menos costosa que la inmunizacin masiva. En la
prctica, no siempre es fcil de identificar y vacunar a aquellos en mayor riesgo y
la vacunacin masiva puede ser una opcin ms fcil.
Poltica de vacunacin
1

Vara entre los diferentes pases

Los anticuerpos maternos presentes hasta 6 meses despus del nacimiento,

lo cual puede interferir con la induccin de una respuesta inmune efectiva
contra la vacuna del beb. Esto debera tenerse debidamente en cuenta en
la formulacin de una poltica de vacunacin.

La OMS ampli el programa de inmunizacin (PAI)

1

Dirigido a los pases en desarrollo y se inici en 1974.

Pretende controlar y no eliminar seis enfermedades comunes a travs de

programas nacionales de salud.

Las seis enfermedades son la tuberculosis, DPT, polio y el sarampin.

Diferentes tipos de vacuna

Las vacunas con virus. ya sea en vivo o muerto, constituyen la gran mayora de
las vacunas actualmente en uso. Sin embargo, avances recientes en biologa
molecular ha proporcionado mtodos alternativos para la produccin de
vacunas. A continuacin se enumeran las posibilidades; 1

Las vacunas con virus vivo

Vacunas de virus muertos todo

Las vacunas de subunidades, - purificado o antgeno viral recombinante

Las vacunas recombinantes del virus

Anticuerpos anti-idiotipo

Las vacunas de ADN

1. Las vacunas vivas

Vacunas de virus vivos son preparados a partir de cepas atenuadas que son casi o
totalmente desprovisto de patogenicidad, pero son capaces de inducir una
respuesta inmune protectora. Se multiplican en el husped humano y
proporcionar la estimulacin antignica continua durante un perodo de tiempo,
las fallas primarias vacuna son poco frecuentes y suelen ser el resultado de
inadecuadas de almacenamiento o de la administracin. Otra posibilidad es la
interferencia de virus relacionados, como se sospecha en el caso de la vacuna oral
contra la poliomielitis en los pases en desarrollo. Varios mtodos han sido
utilizados para atenuar los virus para la produccin de vacunas.
El uso de un virus relacionado con el de otro animal - el primer ejemplo fue el
uso de la vacuna para prevenir la viruela. El origen de los virus vaccinia
utilizadas para la produccin es incierta.
Administracin de patgenos o virus atenuados parcialmente por una va no
natural - de la virulencia del virus a menudo se reduce cuando se administra por
una va no natural. Este principio se utiliza en la inmunizacin de los reclutas del
ejrcito contra el sndrome de distrs respiratorio del adulto utilizando el tipo de
adenovirus en vivo entricamente recubiertas 4, 7 y (21).
El paso del virus en un "husped no natural" o de la clula husped - las
principales vacunas utilizadas en el hombre y los animales han sido obtenidos de
esta manera. Despus de repetidos pasajes, el virus se administra al husped
natural. Los pasajes iniciales se hacen en animales sanos o en cultivos celulares

primarios. Hay varios ejemplos de este enfoque: la cepa 17D de la fiebre amarilla
fue desarrollado por el paso en ratones y luego en embriones de pollo.Poliovirus
se pasaron en las clulas de rin de mono y el sarampin en fibroblastos de
embrin de pollo. Clulas diploides humanas son ampliamente utilizados, como
la WI-38 y MRC-5. Las bases moleculares de la mutacin gama de huspedes
est empezando a ser entendido.
El desarrollo de mutantes sensibles a la temperatura - este mtodo puede ser
usado en conjunto con el mtodo anterior.
2. Las vacunas inactivadas de virus enteros
Estos eran los ms fciles los preparativos para su uso. La preparacin se inactiva
simplemente. La capa externa del virin se debe dejar intacta, pero la funcin de
replicacin debe ser destruida. Para ser eficaz, no repeticin de las vacunas de
virus debe contener antgeno mucho ms que las vacunas vivas que son capaces
de replicarse en el husped. Preparacin de las vacunas muertas pueden tomar la
ruta de calor o productos qumicos. Los productos qumicos utilizados incluyen
formaldehdo o beta-propiolactona. El agente tradicional para la inactivacin del
virus de formalina. Tratamiento excesivo puede destruir la inmunogenicidad,
mientras que un tratamiento insuficiente puede dejar virus infeccioso capaz de
causar enfermedad. Poco despus de la introduccin de la vacuna contra la polio
inactivada, se produjo un brote de poliomielitis paraltica en el uso de EE.UU.
para la distribucin de la vacuna antipoliomieltica inactivada
inadecuadamente. Este incidente llev a una revisin del proceso de inactivacin
con formalina y otros agentes de inactivacin ya estn disponibles, tales como
beta-propiolactona. Otro problema fue que el SV40 fue encontrado en ocasiones
como un contaminante y se teme a la naturaleza potencial oncognico de los
virus.
LasvacunasvivascontraMuertos
CaractersticaLiveDead
Dosisbajasdealta
no. demltiplesdosisnica
necesarioparaeltratamientoadyuvantenos
Duracindelainmunidaddemuchosaosmenos

larespuestadeanticuerposIgG,IgAIgG
CMIbuenapobres
Reversinalavirulenciaposible,noesposible
Debido a que las vacunas vivas se replican en las clulas husped, los bits del
antgeno del virus se presentan en la superficie celular y reconocidas por las
clulas citotxicas
Problemas potenciales de seguridad
Las vacunas vivas
1

Underattenuation

Mutacin que conduce a la reversin a la virulencia

Preparacin de la inestabilidad

Virus contaminantes en cultivos de clulas

Labilidad de calor

No se debe administrar a pacientes inmunodeprimidos o embarazadas

Las vacunas muertas

1

Inactivacin incompleta

Aumento del riesgo de reacciones alrgicas debido a la gran cantidad de

antgeno involucrado

Problemas actuales con el desarrollo de vacunas incluyen

1

Falta de crecimiento de grandes cantidades de microorganismos en el

laboratorio

Preparaciones crudas de antgenos a menudo dan poca proteccin. por

ejemplo. Antgeno clave no identificadas, el desconocimiento de la
naturaleza de la proteccin o la respuesta inmune protectora.

Las vacunas vivas de ciertos virus puede (1). inducir la reactivacin, (2)
ser oncognicos en la naturaleza

Las vacunas 3._Subunit

En un principio, no repeticin de las vacunas se obtuvieron a partir de
preparaciones crudas de virus de los tejidos animales. A medida que la tecnologa
para el cultivo de los virus a ttulos altos en los cultivos celulares avanzados, se
hizo lo posible para purificar el virus y antgenos virales. Ahora es posible para
identificar los sitios pptido que abarca los sitios antignicos principales de
antgenos virales, a partir de que las vacunas de subunidades altamente purificado
se puede producir. El aumento de la purificacin puede conducir a la prdida de
inmunogenicidad, y esto puede hacer necesario el acoplamiento a una protena
portadora inmunognica o adyuvante, tal como una sal de aluminio. Ejemplos de
vacunas de subunidades purificadas incluyen las vacunas contra la HA de la gripe
A y B, HBsAg y derivados del plasma de los transportistas.
4. Protenas recombinantes virales
Protenas del virus se han expresado en bacterias, levaduras, clulas de
mamferos, y los virus. Las clulas de E. coli fueron los primeros en ser
utilizados para este propsito, pero las protenas expresadas no glicosilada, que
era una gran desventaja ya que muchas de las protenas inmunognicas del virus
como el glicoprotenas de la envoltura, glicosilada fueron. Sin embargo, en
muchos casos, se demostr que el esqueleto de la protena no glicosilada fue tan
inmunognica. La vacuna recombinante contra la hepatitis B es la nica vacuna
recombinante con licencia en la actualidad.
Una aplicacin alternativa de la tecnologa del ADN recombinante es la
produccin de vacunas de virus hbridos. El ejemplo ms conocido es la vacuna,
la secuencia de ADN que codifica el gen extrao se inserta en el vector
plasmdico con un promotor del virus vaccinia y vacuna secuencias de la timidina
quinasa.El vector de recombinacin resultante se introduce en las clulas
infectadas con el virus vaccinia para generar un virus que expresa el gen
extrao. La vacuna con virus recombinante puede multiplicarse en las clulas
infectadas y producir los antgenos de una amplia gama de virus. Los genes de
varios virus se puede insertar, por lo que existe la posibilidad de producir vacunas
vivas polivalentes. HBsAg, la rabia, el VHS y otros virus han sido expresadas en
la vacuna.
Las vacunas de virus hbridos son estables y estimular la inmunidad celular y
humoral. Son relativamente baratos y fciles de producir. Siendo las vacunas

vivas, pequeas cantidades son necesarias para la inmunizacin. Hasta el

momento, no hay marcadores de laboratorio aceptados de la atenuacin o la
virulencia del virus de la vaccinia para el hombre. Las alteraciones en el genoma
del virus vaccinia en la seleccin de recombinantes puede alterar la virulencia del
virus. El uso de la vacuna tambin conlleva el riesgo de reacciones adversas
asociadas con la vacuna y el virus puede propagarse a los contactos
susceptibles. En la actualidad, se estn haciendo esfuerzos para atenuar an ms
el virus vaccinia y la posibilidad de utilizar otros vectores recombinantes se est
estudiando, como poliovirus atenuados y el adenovirus.
5. Los pptidos sintticos
El desarrollo de pptidos sintticos que pueden ser tiles como vacunas depende
de la identificacin de sitios inmunognicos. Varios mtodos han sido
utilizados. El ejemplo ms conocido es la enfermedad de la fiebre aftosa, donde
la proteccin se logra mediante la inmunizacin de animales con una secuencia
lineal de 20 aminocidos. Las vacunas de pptidos sintticos que tienen muchas
ventajas. Sus antgenos estn definidos con precisin y libre de componentes
innecesarios que pueden estar asociados con efectos secundarios. Son estables y
relativamente barato de fabricar. Adems, menos de garanta de calidad se
requiere. Los cambios debidos a la variacin natural de los virus puede ser
fcilmente acomodado, lo que sera una gran ventaja para los virus inestables,
tales como la gripe.
Los pptidos sintticos no fcilmente estimular las clulas T. Se supona en
general que, debido a su pequeo tamao, los pptidos que se comportan como
haptenos y por lo tanto requieren de acoplamiento a una protena portadora que
es reconocido por las clulas-T. Ahora se sabe que los pptidos sintticos pueden
ser altamente inmunognica en su forma libre siempre que contengan, adems de
los eptopos de clulas B, clulas T eptopos reconocidos por las clulas Thelper. Como eptopos de clulas T puede ser proporcionada por las molculas de
protena transportadora, los antgenos extraos. o dentro de la molcula de
pptido sinttico s mismo.
Los pptidos sintticos no son aplicables a todos los virus. Este enfoque no ha
funcionado en el caso de poliovirus, porque los sitios antignicos importantes
fueron compuestos de dos o ms diferentes protenas de la cpside viral por lo
que era de forma concisa en 3-D conformacin.
Ventajas de definir antgenos virales o pptidos incluyen:
1

Produccin y control de calidad ms sencillo

No NA protenas virales o de otro tipo o externos, por lo tanto menos

txicos.

Ms seguro en los casos en que los virus son oncognicos o establecer una
infeccin persistente

Factible, incluso si el virus no puede ser cultivada

Desventajas:
1

Puede ser menos inmunognicas que las convencionales virus completo

inactivado, vacunas

Requiere adyuvante

Requiere por supuesto principal de las inyecciones seguidas de refuerzos

No para obtener CMI.

6. Anticuerpos anti-idiotipo
La capacidad de los anticuerpos anti-idiotipo que imitan antgenos extraos ha
dado lugar a su desarrollo como vacunas para inducir inmunidad contra los virus,
bacterias y protozoos en animales de experimentacin. Anti-idiotipos tiene
muchos usos potenciales, como las vacunas virales, sobre todo cuando el
antgeno es difcil de cultivar o peligrosos. Se han utilizado para inducir la
inmunidad contra una amplia gama de virus, incluyendo el VIH, la rabia, la
enfermedad de Newcastle y el virus de FeLV, reovirus y los poliovirus.
7. Las vacunas de ADN
Recientemente, los alentadores resultados fueron reportados por las vacunas de
ADN por el cual es directamente de ADN que codifica para el antgeno extrao
se inyecta en el animal para que el antgeno extrao est directamente producida
por las clulas del husped. En teora, estas vacunas es extremadamente segura y
carente de efectos secundarios ya que los antgenos extranjeros se veran
directamente producida por el animal husped. Adems, el ADN es relativamente
barato y fcil de producir que las vacunas convencionales y por lo tanto esta
tecnologa algn da podra aumentar la disponibilidad de vacunas para los pases
en desarrollo. Adems, el tiempo de desarrollo es relativamente corto, que puede
permitir la vacunacin oportuna contra las enfermedades infecciosas
emergentes. Adems, las vacunas de ADN, tericamente, puede dar lugar a ms

largo plazo la produccin de una protena antignica cuando se introduce en un

tejido relativamente no se dividen, como los msculos.
De hecho, algunos observadores han llamado la nueva tecnologa de la "tercera
revolucin" en el desarrollo de vacunas-a la par con Pasteur trabajo pionero con
el conjunto del organismo y el desarrollo de vacunas de subunidades. Los
primeros ensayos clnicos el uso de inyecciones de ADN para estimular una
respuesta inmune contra una protena extraa empez para el VIH en 1995. Otros
cuatro ensayos clnicos con vacunas de ADN contra la gripe, virus del herpes
simple, linfoma de clulas T, y un ensayo adicional para el VIH se iniciaron en
1996.
La tcnica que se est probando en seres humanos consiste en la inyeccin
directa de plsmidos - bucles de ADN que contienen genes de las protenas
producidas por el organismo siendo objeto de la inmunidad. Una vez inyectado
en el tejido muscular del husped, el ADN es captado por las clulas husped,
que luego comenzar expresando la protena extraa. La protena acta como un
antgeno que estimula una respuesta inmune y la memoria inmunolgica
protectora.
El entusiasmo por la vacuna de ADN en los seres humanos se ve atenuado por el
hecho de que la entrega del ADN a las clulas todava no es ptimo, sobre todo
en animales ms grandes. Otra preocupacin es la posibilidad que existe con la
terapia gnica, que el ADN de la vacuna ser integrado en los cromosomas de
acogida y se activan los oncogenes o desactivar genes supresores de
tumores. Otra desventaja potencial es que la inmunoestimulacin extendida por
el antgeno extrao en teora, podra provocar la inflamacin crnica o la
produccin de autoanticuerpos
Presentacin de las protenas y los pptidos inmunognicos
Protenas separadas a partir de partculas de virus son generalmente mucho
menos inmunognicas que las partculas intactas. Esta diferencia en la actividad
se suele atribuir a los cambios en la configuracin de una protena cuando se
libera de los requisitos estructurales de la partcula viral. Muchos intentos se han
hecho para mejorar la actividad inmunognica de las protenas separadas.
Adyuvantes
Se utiliza para potenciar la respuesta inmune

Funciones para localizar y liberar lentamente el antgeno en o cerca del

sitio de administracin.

Funciones para activar vehculos blindados para lograr el procesamiento

de antgenos eficaz o la presentacin

Los materiales que se han utilizado son: 1

Las sales de aluminio

Aceites minerales

Productos de micobacterias, por ejemplo. Adyuvantes de Freud

Complejos inmunoestimulantes (ISCOMS)

1

Un vehculo de la vacuna alternativa

El antgeno es presentado en un complejo de acceso, multimrica,

fsicamente bien definidos

Compuesto de adyuvante (Quil A) y el antgeno a cabo en una jaula como

la estructura

Adyuvante se lleva a cabo con el antgeno de los lpidos

Puede estimular el CMI

La media de 35 nm de dimetro

En el procedimiento de mayor xito, una mezcla de la planta de glucsido de

saponina, colesterol y fosfatidilcolina provee un vehculo para la presentacin de
varias copias de la protena en una estructura en forma de jaula. Este tipo de
presentacin multimrica imita la situacin natural de los antgenos de los
microorganismos. Estos complejos inmunoestimulantes tienen actividades
equivalentes a las de las partculas de virus del que se derivan de las protenas,
manteniendo as una gran promesa para la presentacin de las protenas de la
ingeniera gentica.
Consideraciones similares se aplican a la presentacin de pptidos. Se ha
demostrado que el pptido mediante la construccin en un marco de residuos de
lisina para que ocho copias en lugar de una copia estn presentes, la respuesta
inmune inducida fue de una magnitud mucho mayor. Un nuevo enfoque consiste

en la presentacin del pptido en una forma polimrica combinada con eptopos

de clulas T. La secuencia codificante para el pie y el pptido aftosa virus se
expresa como parte de una protena de fusin con el gen que codifica para la
protena central de la hepatitis B. La protena hbrida, que forma partculas
esfricas de 22 nm de dimetro, provoc niveles de anticuerpos neutralizantes
contra el virus de la fiebre aftosa que fueron por lo menos cien veces mayor que
las producidas por el pptido monomrico.
Vacunacin y la inmunidad de grupo
Las preguntas siguientes deben ser hechas en caso de vacunacin contra un virus
en particular se est desarrollando.
1

Qu proporcin de la poblacin deben ser vacunados para lograr la

erradicacin.

Cul es la mejor edad para vacunar?

Cmo es esto afectados por las tasas de natalidad y otros factores

Cmo la inmunizacin afecta a la distribucin por edades de los

individuos susceptibles, en particular los de las clases de edad con mayor
riesgo de enfermedad grave?

Qu importancia tienen las heterogeneidades genticos, sociales o

espaciales en la susceptibilidad a la infeccin?

Azada afecta esto a la inmunidad de grupo?

Un concepto bsico es el de la tasa bsica de la infeccin R 0. para la mayora de

las infecciones virales, R 0 es el nmero promedio de casos secundarios
producidos por un caso primario en una poblacin totalmente susceptible. Est
claro que una infeccin no se puede mantener o propagacin si R 0 es menor que
1. R 0 puede estimarse a partir de B / (AD), B = esperanza de vida, A = edad
media a la que la infeccin se adquiere, D = la duracin caracterstica de los
anticuerpos maternos.
Cuanto mayor sea el valor de R 0, ms difcil es erradicar la infeccin de la
comunidad en cuestin. Una estimacin aproximada del nivel de cobertura de la
inmunizacin requerida puede estimarse de la siguiente manera: la erradicacin
se lograr si la proporcin de vacunados supera un valor crtico pinc = 1.1 /
R 0.As, cuanto mayor sea el R 0, mayor es la cobertura se requiere para eliminar

la infeccin. As, la erradicacin mundial del sarampin, con su R 0 de 10 a 20 o

ms, es casi seguro que ser ms difcil de erradicar que la viruela, con su orden
de R 0 de 2 a 4. Otro ejemplo es la rubola y la vacunacin contra el sarampin
en los EE.UU.. La rubola (A = 9 aos) tiene un Ro aproximadamente la mitad
de sarampin (A = 5 aos) y de hecho la rubola ha sido efectivamente
erradicado en los EE.UU., mientras que la incidencia de sarampin se han
reducido ms lentamente.
Por qu no se requiere 100% de cobertura para erradicar una infeccin? La
inmunizacin tiene tanto un efecto directo e indirecto. La poblacin husped
susceptible se reduce la inmunizacin en masa para que la transmisin de la
infeccin se ha convertido en consecuencia menos eficientes y, finalmente, la
infeccin no podrn mantenerse.

Sarampin
La tos ferina
Paperas
Rubola
La difteria
Polio

Elpromediodeedad
delainfeccin
4-5
4-5
6-7
10.09
11-14
12-15

virology-online.com/general/Test1.htm

Epidemia
perodo
2
3-4
3
3-5
4-6
3-5

Crtico
cobertura
15-17 92-95
15-17 92-95
10-12 90-92
7-8
85-87
5-6
80-85
5-6
80-85
R0

Introduccin
Esta unidad describe los mtodos para la deteccin de la replicacin viral abortivo in vivo en un modelo
animal. El cultivo del virus ha sido considerado el "gold standard" para el diagnstico de laboratorio de las
infecciones respiratorias virales en los seres humanos y para el anlisis de la replicacin viral en modelos
animales. Con los aos, otras tcnicas como la PCR han demostrado ser los mtodos especficos y sensibles
para la deteccin de virus, en tiempo real de transcripcin inversa-PCR (QRT-PCR) especialmente adecuado
para el anlisis de las vas respiratorias los virus de ARN (Bustin y Mueller, 2005 ). La tasa de identificacin de
infecciones virales en los seres humanos mediante el cultivo viral es a menudo menor que el detectado por
PCR y QRT-PCR (Mackay y otros,. 2003 ;. Kraaij van et al, 2005 ). Este hallazgo es que normalmente se
atribuyen a una mayor sensibilidad de la tcnica de PCR, pero tambin puede reflejar los casos, cuando el
virus establece una infeccin abortiva en la cual se replica el material gentico viral, pero la produccin de
partculas virales infecciosas se ve afectada. Sin ser detectados por el cultivo viral, este tipo de replicacin
slo se puede documentar mediante la medicin de la expresin de genes virales y la replicacin del genoma
en los seres humanos infectados y los animales de laboratorio por PCR.
Uno de los virus para los que las infecciones productivas y abortivos se ha documentado es el Virus Sincitial
Respiratorio (RSV;. Boukhvalova et al, 2007 ). El RSV es un virus ARN negativo-que es la principal causa de
bronquiolitis y neumona viral en los nios (Shay et al., 2001 ). RSV establece efectivamente la infeccin
productiva del algodn en ratas ingenuo (Sigmodon hispidus), un modelo preferido de pequeos animales de
enfermedades humanas (RSV Niewiesk y Prince, 2002 ; Openshaw y Tregoning, 2005 ). Cuando las ratas de
algodn tienen el reto de RSV, por segunda vez, sin embargo, slo se desarrolla infeccin abortiva. La clave
para detectar todos los posibles tipos de replicacin del VSR en vivo es el anlisis de la infeccin en la
dinmica mediante la aplicacin de mtodos que permiten control de virus tanto en el microbiolgico
(generacin de virus infecciosos) y los niveles molecular (replicacin del material gentico viral). Este tipo de
anlisis que constituyen el mbito de esta unidad. Vamos a cubrir todas las etapas del proceso de supervisin
de la replicacin viral en vivo desde el diseo de los protocolos de infeccin de los animales (Planificacin
Estratgica) y de continuar con los mtodos para la recoleccin de muestras de pulmn para cultivo viral y la
extraccin de RNA ( Apoyo Protocolo 1 ).Vamos a describir los mtodos actuales de titulacin viral por ensayo
de placa ( Protocolo Bsico 1 ) y QRT-PCR mediciones de la replicacin del VSR ( Protocolo Bsico 2 ), y
discutir las maneras de analizar e interpretar los datos. Por otra parte, se describe un mtodo sencillo para la
infeccin por VRS de las clulas epiteliales in vitro ( Soporte del Protocolo 2 ) que se puede utilizar para
ajustar la placa de ensayo y QRT-PCR en el laboratorio de tcnicas del lector.

Planificacin Estratgica
Para detectar la replicacin viral abortivo, uno tiene que tener la capacidad de controlar la infeccin viral en la
dinmica y comparar la replicacin viral en los animales nave a la replicacin viral en animales inmunes a los
virus. La replicacin abortiva en el caso de infeccin por VRS se detecta en animales que se han vuelto
inmunes a la RSV por infeccin por el VSR antes. Por lo tanto, el experimento ha de incluir dos grupos de
animales: el primer grupo se compone de animales ingenuos que nunca han sido infectados con el VRS
antes. Estos animales encuentran RSV, por primera vez en el inicio del experimento (infeccin primaria). El
segundo grupo incluye a los animales que han sido cuestionadas por el VRS una vez y luego otra vez puestos
a prueba nuevamente 21 das despus (infeccin secundaria). Cuando las ratas de algodn se ven
desafiados por RSV dos veces durante el perodo de 21 das, el virus no es detectado por la cultura en los
pulmones de los animales despus de la segunda infeccin. A pesar de que no se detecta virus en los
pulmones de las ratas de algodn puestos a prueba nuevamente por el cultivo viral, la replicacin del virus se
lleva a cabo y se puede medir por QRT-PCR.

Las muestras deben ser recogidos para el anlisis de carga viral en diversos puntos temporales despus viral
desafo: el desafo de la primera y nica en infeccin primaria por VRS y el segundo desafo viral en
secundaria infeccin por VRS. Los animales son sacrificados y los pulmones son recogidas en un lapso de
tiempo que incluye el momento de la replicacin del virus en los animales nave mxima (el da 4 postinfeccin), as como los puntos de tiempo antes y despus del pico de la replicacin viral. Debido a que la
replicacin viral abortivo es ms rpida que la replicacin viral productiva, los puntos de tiempo temprano
despus de la infeccin deben ser incluidos en el anlisis. Nos encontramos con que la recoleccin de los
pulmones a los 6 y 12 h, y en los das 1, 2, 4, 7 y 14 post-infeccin que funciona mejor para la deteccin de la
replicacin del VSR en el fallido modelo de rata de algodn. Los mismos momentos se utilizan para la
infeccin primaria y secundaria para permitir un anlisis paralelo de muestras.
Dos mtodos diferentes para la deteccin de la replicacin viral abortivo son necesarios: el cultivo viral
( Protocolo Bsico 1 ) y el mtodo de QRT-PCR ( Protocolo Bsico 2 ). La replicacin es abortiva cuando hay
una discrepancia entre la cantidad de material gentico viral acumulado (detectado por QRT-PCR) y la
cantidad de virus de la progenie en libertad (detectada por cultivo viral). Por tanto, es importante ser capaz de
cuantificar el alcance de la carga viral de QRT-PCR y por ensayos de cultivo viral en la misma muestra y la
correlacin de los datos generados por las dos tcnicas.

Protocolo Bsico 1: formacin de placas de ensayo Unidad de Produccin

RSV
Este protocolo describe el mtodo para determinar la carga viral en los pulmones de los animales infectados
por RSV mediante un ensayo de la unidad de formacin de placas (la placa de ensayo). Monocapas de
clulas HEp-2 se inoculan con los homogeneizados de tejido pulmonar. Las monocapas infectadas se incuban
en un medio semislido de metilcelulosa durante varios das para permitir la formacin de placas. Debido a
medio semi-slido evita la diseminacin del virus (de lo contrario se ve en medio lquido), infeccin de las
clulas y el virus se localiza liberado de una clula infectada puede infectar a las clulas slo en el entorno
inmediato de la originalmente infectado, lo que produce una placa. Las placas se visualizan en el contexto de
las clulas sanas teidas con colorante cristal violeta.Una placa corresponde a una placa de unidades
formadoras de RSV, y el nmero total de placas refleja la cantidad de viriones infecciosos presentes en la
muestra de pulmn original.
NOTA: Todas las soluciones y equipos que tengan contacto con las clulas vivas debe ser estril y una tcnica
asptica se debe utilizar en consecuencia.
NOTA: Todas las incubaciones de cultivo celular debe llevarse a cabo en un 37 C, 5% de CO 2 humidificado
incubadora.
Materiales
1

Clulas HEp-2 (ATCC # CCL23)

HEp-2 de crecimiento medio (ver receta )

Homogeneizado de pulmn ( Soporte de protocolo 1 )

Medio esencial mnimo de Eagle (EMEM) con solucin salina balanceada de Earle (BSS)

Metil celulosa recubrimiento medio (ver receta )

Cristal violeta fijador / mancha (ver receta )

24 y placas de cultivo de tejidos

Microscopio de diseccin

Reactivos y equipos adicionales para las tcnicas bsicas de cultivo celular (UNIDAD 1.1 )

Prepare HEp-2 monocapas

Semillas de clulas HEp-2 en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos en el 1 10 5 clulas / ml en un medio de crecimiento H
por pozo.
1.

UNIDAD DE

1.1 proporciona protocolos de las tcnicas bsicas de cultivo celular.

Las placas se incuban hasta que las monocapas de clulas alcanzar la confluencia.
2.

Se tarda de 2 a 3 das para la monocapa de clulas HEp-2 para alcanzar la confluencia.

Preparar muestras para valoraciones

Homogeneizados de deshielo de pulmn (preparado como se describe en los pasos 13 a 15 de un soporte de protocolo ) a
3. temperatura ambiente.
4. Prepare 1:10 y 1:100 diluciones seriadas de muestras de homogeneizado en el EMEM con BSS de Earle.
Inocular HEp-2 monocapas
5. Aspirar la mitad del medio de cada pocillo de la cabeza de serie HEp-2 de 24 y placas de cultivo.
6. Inocular pozos con 50 ul de las diluciones limpio, 1:10, y 1:100 de cada muestra por duplicado.
7. Incubar los inoculados de 24 y placas de cultivo durante 1 hora.
8. Despus del perodo de incubacin, se aspira el medio restante de cada pocillo de las placas de cultivo.
9. Superposicin de cada pocillo con 1 ml del medio de metil celulosa superposicin a 37 C.
10. Las placas se incuban durante 4 das en la incubadora.
Mancha y leer la titulacin
11. Retire la plantilla de cada pocillo.

Aadir 0,5 ml de fijador de cristal violeta / mancha a cada pocillo. Permita que las placas se incuban a con colorante cristal viol
12. durante no menos de 20 min a temperatura ambiente.

Quitar manchas de un enjuague cada plato dos o tres veces con agua fra, llenando todos los pozos con agua, luego invirtiend
13. placa y tocndola en una toalla de papel.
Coloque el plato al revs secar al aire.
14.

Las placas tienen que estar completamente seco antes de la lectura.

Bajo un microscopio de diseccin contar el nmero de unidades formadoras de placas (ufp) por pocillo. Seleccione la dilucin d
15. muestra que se obtiene un nmero razonable de las placas (5 a 50 por pocillo).
16. Calcular el correspondiente ttulo de RSV en unidades formadoras de placas (ufp) por gramo de tejido mediante la siguiente
ecuacin:

donde el volumen de 0,1 ml total consta de 50 l de muestra inoculado en clulas por duplicado = 50 l + 50 l, y el factor de diluci

la tramitacin del tejido se mantiene a una temperatura constante de 10 aumentos. El lmite de la sensibilidad del ensayo es de
10 2 UFP / g de tejido pulmonar.
17. Determinar la media geomtrica SEM para todos los animales en un grupo en un momento dado

Protocolo Bsico 2: Real-Time PCR de transcripcin inversa (RTPCRq) Anlisis de la infeccin por VRS
Anlisis en tiempo real PCR se ha utilizado en el pasado para detectar la infeccin por VRS (Falsey et
al,. 2002 , 2003 ; Hu et al,. 2003 ;. Perkins et al, 2005 ). Sin embargo, este mtodo nunca ha sido usado para
monitorear la dinmica de la infeccin por VRS en la progresin. Hemos establecido las condiciones para
medir la expresin de genes y la produccin de RSV RSV genoma / antigenome in vivo e in vitro
(Boukhvalova et al., 2007 ). Este protocolo se describen los pasos necesarios para analizar la infeccin por
VRS en los pulmones de las ratas de algodn con QRT-PCR. ARN viral es extrado de los pulmones y la
transcripcin inversa. Expresin de cada uno de los genes virales se mide. RSV amplicones NS1, N, M, G, F,
M2, L y son objeto de cuantificacin. Todos los amplicones estn a menos de 100 nucletidos de tamao, con
los primers su definicin se muestra en la Tabla 26.6.1 .
Tabla 26.6.1 cebadores utilizados para el anlisis de PCR en tiempo real de RSV Amplicones

un

Primers fueron diseados utilizando software Primer Express (Applied Biosystems).

El nmero de nucletidos del primer nucletido del codn de inicio (A TG) al principio de la amplificacin.

La expresin de c

-Actina mRNA se mide en cada muestra para fines de normalizacin.

Materiales
1

RNeasy Midi kit (Qiagen), incluyendo:

RLT buffer

RNeasy columnas Midi

Reactivos para el tratamiento DNasa

RLT / ME bfer: RLT buffer del kit RNeasy suplementado con 10 l / ml de 2-mercaptoetanol

Tejido pulmonar congelado para su anlisis ( soporte de protocolo 1 ), incluyendo el tejido a partir de dos
animales sacrificados en el da 4 despus de la infeccin primaria por VRS para la construccin de la curva
estndar

70% de etanol

Tratada con DEPC H 2 O (ANEXO 2A )

0,5 mg / ml oligo (dT) primer

10 PCR buffer (sin MgCl2, Invitrogen)

50 mM MgCl 2 (Invitrogen)

10 mM dNTP mix (Invitrogen)

10

200 U / l SR II de la transcriptasa inversa (Invitrogen)

11

iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)

12

10 M avance y retroceso de PCR (Tabla 26.6.1 )

14 ml de polipropileno de fondo redondo de tubos

OMNI TH homogeneizador con 7 mm de acero inoxidable generador de la sonda (Omni International)

15 ml tubos de polipropileno cnico

Centrfuga con portadores de placas

96 y placas de PCR

Termociclador

Bio-Rad iCycler con iQ5 software

iQ-96 y placas de PCR (BioRad)

Sellos adhesivos 'B' Microseal (BioRad)

Extraer el ARN de los pulmones

1. Place 3.5 ml RLT / ME tampn en un tubo de polipropileno de 14 ml. Aadir un trozo congelado de pulmn a la solucin y
homogeneizar con un homogeneizador de la sonda en dos o tres rfagas cortas. Congelar de inmediato los pulmones
homogeneizados en hielo seco y traslado al -80 C congelador.
Este paso puede realizarse varios das antes de la actual extraccin de RNA.
El tamao de la pieza de pulmn suficiente para la extraccin de ARN debe ser mayor o igual a ~ 1/6o de todo el

pulmn.Normalmente se usan uno de los tres lbulos del pulmn derecho, o la mitad del lbulo superior del pulmn izquierd
la extraccin de RNA.

NOTA IMPORTANTE: El tejido pulmonar tiene que ser congeladas en nitrgeno lquido inmediatamente despus de la extra
(ver Apoyo Protocolo n 1 ). De lo contrario, la calidad de la preparacin de ARN puede verse comprometida.

Lave la sonda y entre las muestras para evitar la contaminacin cruzada. Nos encontramos con que los estallidos breves de

sonda homogeneizador en dos separados tubos de 50 ml con 50 ml de agua destilada en cada uno y una explosin adicion

30 ml RLT / ME separacin entre las muestras es suficiente para prevenir la contaminacin cruzada de muestras.
2. En el da de la extraccin de RNA, los pulmones homogeneizados de deshielo en el bao de agua 37 C durante 15 min.
3. Centrifugar el homogeneizado durante 10 min a 4000 g, la temperatura ambiente.
Pasar 2 ml de sobrenadante a un preparado de 15 ml tubo de polipropileno cnico con 2 ml de etanol al 70%.
4.

Evitar la fase superior al retirar el sobrenadante.

5. Mezclar invirtiendo el tubo con fuerza cinco a siete veces, a continuacin, cargar la mezcla en la columna RNeasy Midi.

Centrifugar la columna y proceder con el protocolo como se especifica en las instrucciones del kit RNeasy Midi. Incluyen la eta
tratamiento DNasa como se especifica en las instrucciones del kit RNeasy Midi.

La omisin de la etapa de tratamiento DNasa se traducira en una preparacin de ARN contaminados con ADN genmico, q
6.

puede comprometer la exactitud de los anlisis de QRT-PCR.

Eluyen ARN a partir de la columna RNeasy Midi con 150 l de agua destilada. Repetir la elucin con 50 l de agua destilada.Dete

la concentracin de ARN mediante la medicin de la absorbancia a 260 nm en un espectrofotmetro. Tambin determinar la re

7. entre los valores de absorbancia a 260 nm y 280 nm para calcular la pureza del ARN (un valor de relacin 1,8 es aceptable).
Preparar cDNA
Combine 1 g de ARN total con 1 l de 0,5 mg / l oligo (dT) primer volumen de 20 l de reaccin total en una placa de 96 pocillos

PCR.Establecer una transcripcin inversa (RT) de reaccin para cada animal. Use agua tratada con DEPC al alcanzar un volum
final de reaccin de 20 microlitros.
Oligo (dT) primer se debe utilizar para el anlisis de la expresin gnica y la RSV de las medidas de limpieza de genes

-A

mRNA. Para el anlisis de la cantidad de RSV genoma o antigenome, el uso manual de 5

y 5 imprimacin-GTCTTGATATCCTAGTTCATTG-3 respectivamente (1 l de solucin madre 10 mM). Las secuencias de l

ltimos dos cebadores corresponden a las cadenas positivas y negativas dentro de la regin intergnica entre los genes y S
8.

del virus sincitial respiratorio.

La creacin de dos adicionales como las reacciones de RT en el paso anterior, utilizando ARN de dos animales sacrificados en
4 despus de la infeccin primaria por VRS.

Estos dos cDNAs se utilizar para la construccin de la curva estndar. Animales sacrificados cuatro das despus de la infe
primaria por VRS son elegidos como la fuente de ARN para la curva estndar debido al alto nivel de replicacin del VSR se
9.

observa en ese da particular en el modelo de rata de algodn.

10. Cubrir la placa e incubar que a 70 C durante 10 minutos en un termociclador.

11. Retirar la placa de la termociclador. Aadir a cada pocillo:
10 PCR buffer para una concentracin final de 1
50 mM de MgCl 2, para una concentracin final de 2,5 mM
10 mM dNTP mix para una concentracin final de 0,5 mM de cada dNTP
TDT para una concentracin final de 10 mM
200 U / l de la transcriptasa inversa SR II de 200 U por reaccin, final.

Cubrir la placa y mezclar el contenido de la placa con el vortex.

Para realizar este paso, un cctel debe estar preparado para el nmero de reacciones necesarias ms dos o tres adicionale
dar cuenta de los errores de pipeteo.

En pocas palabras centrifugar la placa a 800 g para llevar la solucin a los fondos de los pozos, y devolverlo a la termociclad
12. durante 60 min a 42 C, seguido de 15 min a 70 C.
13. Al trmino de la sntesis de ADNc, aadir 80 l de agua destilada a cada pocillo.
Preparar la curva estndar de cDNA

Despus de la sntesis de ADNc se l completo y 80 de agua destilada a cada pocillo, combinar el contenido de las dos reaccion

adicionales que se crearon utilizando ARN de animales sacrificados cuatro das despus de la primaria, la infeccin por VRS e
mismo pozo (como resultado del volumen , 200 l).
14.

Este ser el cDNA primero de una serie de dilucin de las muestras de la curva estndar.

Serie diluir este cDNA 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, y 1:32 con agua destilada, y el uso de las diluciones de PCR en tiempo real para com
una curva estndar.
Guarde la placa de cDNA a -20 C durante su uso. Varios ciclos de congelacin y descongelacin son permisibles.
15.

Individuales curvas de nivel se debe construir para cada gen analizado.

Establecer en tiempo real las reacciones de PCR

Antes de comenzar a establecer en tiempo real las reacciones de PCR, se encienda el indicador de la iCycler Bio-Rad, ya que
16. tiempo para calentar para la carrera.
17. Obtener un iQ placa de 96 pocillos PCR.
Preparar una premezcla mediante la combinacin de (reaccin por):
12,5 l SYBR Green Supermix
1,25 l de cada cebador (en stock M 10) en un par de cebadores adecuados que figuran en la tabla 26.6.1
7 l destilada H 2 O.

Mezcle suficiente para todas las muestras de los animales que se realizaron por duplicado y de las reacciones de la curva est

que se realizan por duplicado, lo que permite de dos a tres reacciones extra. Alcuota de 22 l de premezcla en cada pocillo de u
placa de 96 pocillos PCR.
18.

Una amplificacin de 64 nucletidos en el

-Actina transcripcin se amplifica usando cebadores se muestra en la Tabla 26.

Aadir 3 l de cDNA a 22 l de premezcla en los pocillos correspondientes de la placa de 96 pocillos PCR.

19.

Use una pipeta multicanal para la transferencia de ADNc de la placa de cDNA a una placa que contiene premezcla de PCR.

20. Cubrir la placa con el sello adhesivo 'B' Microseal, asegurndose de que quede firme y uniformemente a lo largo de la placa ad
21. Vrtice de la placa y centrifugar brevemente a 800 g para que el contenido de los pozos hasta el fondo.
22. Colocar la placa en el iCycler BioRad.
23. Aplicar el siguiente programa:

(Desnaturalizacin inicial)
(Desnaturalizacin)
(Recocido)
(Extensin).

No hay necesidad de ejecutar las curvas de fusin de los pares de cebadores en la tabla 26.6.1 , ya que hemos completado

curvas de fusin de cada par de cebadores utilizados en este trabajo, y no hay amplificacin inespecfica se ha observado e
condiciones ensayadas.

Si la amplificacin de un producto determinado gen no se especifica aqu, el programa de la mquina de PCR para aadir u

curva de fusin al final de la reaccin de PCR para comprobar que el primer par en particular para un potencial para amplific
varios productos.
Analizar en tiempo real los resultados del ensayo de PCR
Los ciclos de referencia y ciclo umbral (Ct) se calcular de forma automtica por el software iQ5 en la Lnea
de Base PCR sustraccin modo Curve Fit.

24. Representar grficamente los valores medios de Ct de las muestras de la curva estndar con el log 10 el factor de dilucin de cD

Utilice esta curva para convertir el promedio de los valores de Ct obtenidos para diferentes muestras a las unidades de expresi
relativa. Normalizar estas unidades de expresin en relacin con el nivel de

-Actina mRNA (limpieza de genes) se expresa en

25. muestra correspondiente.

Calcular

-Actina los valores de normalizacin para cada animal:

Seleccionar el aumento

-Actina expresin relativa del valor unitario mediante la comparacin de las unidades obtenidas de

diferentes animales.
Divida el

-Actina de las unidades de expresin relativa obtenida para todos los animales por ms que

-Actina unidad de ex

relativa.
26.

Para el animal seleccionado en 26a etapa, el

-Actina valor de normalizacin sera igual a 1.

Divisin de las participaciones relativas de expresin obtenidos por otros genes que

-Actina por el

-Actina los valores de la

27. normalizacin.
Para los grupos de animales, expresan los niveles de ARNm como la media geomtrica SEM para todos los animales en un
en un momento dado.

Mayor normalizacin en relacin con el ms alto nivel de expresin del gen de inters (valor asignado en relacin de 1) se p
28.

hacer (ver comentario).

Compatibilidad con el protocolo 1: La infeccin de las ratas de algodn con

RSV y cosecha y el procesamiento de los pulmones
Varios modelos animales de enfermedad por VSR existen (Byrd y el Prncipe, 1997 ). Entre las ms fielmente
representan la manifestacin RSV enfermedad en los seres humanos son la rata del algodn, el mono verde

africano, y los modelos de cra de bovinos RSV. La rata de algodn es el modelo preferido de pequeos
animales de la infeccin por VRS (Siber et al,. 1994 ; Johnson et al,. 1997 ; Maggon y Barik, 2004 ). Ratas de
algodn son muy permisivas para la infeccin por VRS y mostrar las caractersticas histopatolgicas de la
enfermedad similar a la observada en los seres humanos (Prince et al., 1986 , 1999 ). En esta unidad se
describe un mtodo para establecer la infeccin por VRS de ratas de algodn y para la obtencin de muestras
para el anlisis de la replicacin del VSR en los pulmones. Para todos nuestros experimentos utilizamos ratas
de algodn S.hispidus de una colonia endogmica mantiene en los sistemas de virin, Inc.
NOTA: Todos los protocolos de uso de animales vivos debe ser revisado y aprobado por un animal de
Atencin Institucional y el empleo Comisin (IACUC) y cumplir con las regulaciones gubernamentales sobre el
cuidado y uso de animales de laboratorio.
Materiales
1

Ratas de algodn (S.hispidus, de 4 a 8 semanas de edad, de una colonia mantenida en los sistemas de virin,
Inc.)

RSV Una accin / solucin de largo (> 10 7 ufp / ml: cepa original se obtuvo de la ATCC (# VR26), el virus se
purificaron en placa en serie para reducir la interferencia de partculas defectuoso)

Tampn fosfato salino, pH 7,4 (APNDICE 2A )

Nitrgeno lquido

Medio de homogeneizacin (ver receta )

Cmara de anestesia con isoflurano (Davis, 2008 )

Jeringas de 1 ml

21-G agujas

Cmara de CO 2 (Donovan y Brown, 2006 )

Pinza de diseccin

Tijeras de diseccin

Estril Tenbroeck homogeneizadores de tejidos

Estril de poliestireno de fondo redondo de tubos con tapas, de 12 x 75 mm

Centrfuga, refrigerada

10

Estriles de 4 ml viales de vidrio con tapas de la muestra

Reactivos y equipos adicionales para la anestesia con isoflurano en roedores (Davis, 2008 ) y la eutanasia de
roedores por asfixia de CO 2 (Donovan y Brown, 2006 )

Inocular las ratas de algodn con RSV

Obtener jvenes (4 - 8 semanas de edad) ratas de algodn S.hispidus.

Los animales jvenes son necesarios para reproducir la dinmica de la replicacin viral se describe en el Comentario. Ratas

algodn de ms de 6 meses de edad, han retrasado la eliminacin del virus en los pulmones (Curtis et al,. 2002 ;. Boukhval
1.

al, 2007 ).

2. Solucin diluida de RSV acciones con PBS, pH 7,4. para obtener 10 6.6 ufp / ml. Mantenga virus diluido en hielo.
3. Anestesiar a las ratas de algodn en la cmara de isoflurano (ver Davis, 2008 ).

PRECAUCIN: Tome las precauciones necesarias cuando la captura de las ratas de algodn y colocarlas en la cmara de
anestesia. Ratas del algodn se comportan de manera muy diferente de ratones de laboratorio comn, en que las ratas de

algodn son ms agresivos y muy rpido. Asegrese de usar guantes gruesos al manipular ratas alerta de algodn para evi
picaduras. La rapidez de reflejos, en nombre de un investigador son una necesidad!
4. Dibuja una solucin viral con una jeringa de 1 ml con 21-G aguja.
Quitar el animal de la cmara de anestesia y se inoculan con una solucin de 100 l virus de la jeringa mediante el depsito de
de solucin en las aberturas de las fosas nasales, alternando las fosas nasales de cada gota consecutivos.
PRECAUCIN: Use gafas y ropa protectora.

Mantener al animal en una mano, colocndola boca arriba sobre una palma y el apoyo a la parte de atrs de su cabeza con
dedos. Utilice el dedo pulgar de esa mano para empujar hacia arriba en la mandbula del animal para asegurarse de que la

est cerrada. Esto obligar a los animales para aspirar solucin viral a travs de la nariz. Los animales tienen que estar bien

anestesiado antes de la inoculacin del virus. Si se despierta durante el proceso de inoculacin, el animal puede soplo la so
5.

viral a cabo, poniendo en peligro la eficiencia de infeccin y propagacin de virus en todo el rea de trabajo.

Despus de la infeccin, el lugar del animal dentro de la jaula, el seguimiento durante varios minutos para asegurarse de que e
animal con xito despierta de la anestesia.

Si se tarda ms de unos pocos minutos para que el animal se despierta, masajear suavemente los lados de la cavidad del p
6.

con una mano.

Para los estudios de secundaria infeccin por el VSR, infectar ratas de algodn 21 das despus de la misma manera como se
describe en los pasos 2 a 6.

Al realizar un experimento con infeccin por el VSR secundaria y primaria, no infectan a los grupos de animales para los es

de la infeccin primaria hasta 21 das en el experimento. Infectar a los animales para los estudios de infeccin secundaria e

das 0 y 21. Infectar a los animales para los estudios de la infeccin primaria el da 21. Todos los animales (para los estudio
ambas enfermedades, primaria y secundaria) debe ser la misma edad en el da 0. De esta manera, sern emparejados por
7.

en el momento del sacrificio.

Sacrificio de las ratas de algodn

Sacrificio de los grupos de animales a travs de la asfixia de dixido de carbono (Donovan y Brown, 2006 ) a las 6 horas, 12 ho
das 1, 2, 4, 7 y 14 despus de la inoculacin por VRS 4 animales por cada punto de tiempo).
Esta ser la primera inoculacin de RSV para el grupo de la infeccin primaria por VRS y la segunda inoculacin RSV para
8.

grupo de la infeccin secundaria por VRS.

9. Sacrificio de un grupo antes de la infeccin (0 horas) para servir como control.

Los pulmones de la cosecha
10. Retire los pulmones desde el trax con unas tijeras de diseccin y pinzas.
Separar el pulmn izquierdo del pulmn derecho.

El pulmn derecho se utilizar para el anlisis de QRT-PCR y el pulmn izquierdo se utilizar para la titulacin de RSV por l
11.

de ensayo.

Asignar los pulmones para la extraccin de RNA

Trisecar el pulmn derecho en lbulos individuales. Lugar de cada lbulo de una criotubo separado y complemento congelamie
los tubos en nitrgeno lquido. La transferencia de los tubos de hielo seco y luego a -80 C congelador.

Trabajar rpido. Minimizar el tiempo entre la extraccin del pulmn y la congelacin de las piezas de pulmn en nitrgeno lq
12.

es esencial para garantizar una buena preparacin, la calidad del ARN en el futuro.

Pulmones proceso para el ensayo de placa

Coloque el pulmn izquierdo en un homogeneizador de tejidos estriles Tenbroeck con 10 partes (w / v) de medio de
homogeneizacin. Homogeneizar en dos o tres rfagas cortas, y luego colocan los tubos en hielo.
13.

Todo el pulmn derecho o izquierdo pesa ~ 0,15 g, por lo que debe ser homogeneizada en un medio de 1,5 ml.

Despus de la homogeneizacin, se vierte en las muestras de fondo redondo etiquetadas individualmente poliestireno tubos es
14. con tapa y centrifugar las muestras 10 min a 770 g, 4 C.
Sobrenadantes de transferencia utilizando pipetas Pasteur estriles de vidrio en 4 ml frascos de vidrio estriles de muestras y
15. especmenes alcuota rpida congelacin en hielo seco. Muestras almacenar a -80 C hasta el ensayo.

Compatibilidad con el protocolo 2: La infeccin por VRS de las clulas

epiteliales A549
Las clulas epiteliales respiratorias son el principal objetivo de la infeccin por VRS en vivo. Debido a la
complicada naturaleza de los experimentos in vivo, los estudios de la infeccin por VRS se suelen llevar in
vitro en cultivos de clulas epiteliales. Estos experimentos proporcionan importantes pistas sobre el
mecanismo de accin de RSV, y tambin permite la produccin rpida y eficiente de RSV material
infectado. En este protocolo se describe el mtodo para la infeccin por VRS de las clulas epiteliales
alveolares A549, que ofrece una gran cantidad de muestras para la cuantificacin de RSV por ensayo de
placa y por PCR en tiempo real. Estas muestras se puede utilizar para afinar las tcnicas descritas en esta
unidad con el fin de la mejor forma de adaptarse a un entorno de laboratorio en particular.
Materiales
1

Humanos epiteliales alveolares tipo II celular (A549) cultura (ATCC # CCL185)

A549 de crecimiento a medio (ver receta )

RSV una solucin de reserva / largo (> 10 7 ufp / ml): cepa original se obtuvo de la ATCC (# VR26), el virus se
purificaron en placa en serie para reducir la interferencia de partculas defectuoso

Medio DMEM (sin suero, por ejemplo, Invitrogen)

RNeasy Midi kit (Qiagen), incluyendo:

RLT buffer

RNeasy columnas Midi

Reactivos para el tratamiento DNasa

RLT / ME buffer: tampn RLT de la RNeasy Midi kit (Qiagen), suplementado con 10 l / ml de 2-mercaptoetanol

70% de etanol

Los cebadores de PCR para los genes virales y

75 - a 175 cm 2 frascos de cultivo de tejidos

-Actina (Tabla 26.6.1 )

6 y placas de cultivo de tejidos

Reactivos y equipos adicionales para las tcnicas bsicas de cultivo celular (UNIDAD 1.1 ), la placa de ensayo
( Protocolo Bsico 1 ), y la preparacin / amplificacin por PCR de cDNA ( Protocolo Bsico 2 )
NOTA: Todas las soluciones y equipos que tengan contacto con las clulas vivas debe ser estril y una tcnica
asptica se debe utilizar en consecuencia.
NOTA: Todas las incubaciones de cultivo celular debe llevarse a cabo en un 37 C, 5% de CO 2 humidificado
incubadora.

Prepare las clulas A549 para la infeccin

Se propagan las clulas A549 A549 en medio de cultivo en un incubador humidificado en el 75 - a 175 cm 2 frascos de cultivo d
tejidos.
UNIDAD DE

1.1 proporciona protocolos de las tcnicas bsicas de cultivo celular. Las clulas deben ser sembrados en el 1

10 5clulas / ml en 12 o 25 ml por cada 75 - o 175 cm 2 frasco de cultivo de tejidos, respectivamente. Las clulas deben pasa

en promedio, dos veces por semana con tripsina para facilitar el desprendimiento de clulas del frasco original, con el nuevo
1.

medio a un matraz de nuevo sobre la terminacin de la divisin. A 1:3 a 1:5 para el corte se recomienda.

Diluir las clulas a 2 x 10 5 clulas / ml en medio de crecimiento A549 y la placa de 6 pocillos a 2 ml / pocillo (2 ml / pocillo de un
2. 10 5 clulas / ml de suspensin). Dejar la placa en la incubadora durante 2 das.
Infectar a las clulas A549 con RSV

Trypsinize las clulas en un pocillo, mezcle una parte alcuota de 20 l de clulas con un volumen igual de solucin de tinte azul
tripano, y el recuento de clulas viables mediante un hemocitmetro.
3.

Tripsinizacin de las clulas y el recuento de clulas viables por exclusin del azul tripano se describen en la UNIDAD de 1,1
Diluir el VRS en medio DMEM normal para producir diferentes MOI (0,001 a 0,1).

4.

Los clculos se basan en el hecho de que 500 l de solucin viral por pozo se utilizar para la infeccin.

Lavar las clulas dos veces con PBS, pH 7,4, mediante la adicin de 2 ml de PBS a cada pocillo, girando alrededor de la soluc
y aspirar PBS.

Lavar las clulas con PBS elimina los rastros de FBS presente en medio de crecimiento A549. FBS residual puede reducir la
5.

eficiencia de infeccin.

Aadir la solucin viral a los pozos de las clulas a la infeccin (cada tratamiento se debe hacer por duplicado) y se coloca la p

en la incubadora para un total de 1 hora. Durante esa hora, el rock de la placa cada 15 minutos para cubrir de manera uniforme
clulas con una solucin viral.
6.

Un pequeo volumen de solucin viral, apenas cubre la monocapa de clulas, es crucial para la infeccin eficiente.

7. Aspirar la solucin viral y reemplazarlo con 2 ml de medio de cultivo A549. Devolver la placa a la incubadora.
Recoger los sobrenadantes para valoraciones RSV por el ensayo de la unidad de formacin de placas
8. Sobrenadantes de recoleccin de clulas en tubos de microcentrfuga de 1,5 ml en varias ocasiones despus de la infeccin.

Sobrenadantes de microcentrfuga de 5 min a 500 g, 4 C, y la congelacin aclar sobrenadantes a -80 C para su posterio
9. anlisis.
Determine ttulo viral en el sobrenadante mediante el ensayo de la unidad de formacin de placas
Sobrenadantes de valorar como se describe en el Protocolo Bsico 1 con las siguientes modificaciones:
Prepare 1:10, 1:100, 1:1000 y diluciones de los sobrenadantes para la titulacin.
Utilizar la siguiente frmula para calcular los ttulos virales:

10.
Muestras de clulas para el anlisis de la replicacin del VSR en tiempo real de PCR

Recoger las clulas en los pozos de donde se recolectaron los sobrenadantes para la titulacin viral por la placa de ensayo pa
extraccin de RNA. Eliminar los restos del medio de los pocillos mediante aspiracin y aadir 400 l RLT / ME buffer por
pozo.Resuspender las clulas en la RLT / ME pipeteando arriba y abajo por lo menos siete a diez veces.

Considerable atencin se debe dar a pipeteo de clulas en RLT / ME buffer. Menos de siete a diez rondas que se realizan p

garantizar el xito de aislamiento de ARN en el futuro. Evitar la generacin de espuma en la solucin cuando la resuspensi

La placa se puede congelar a -80 C despus de RLT / ME tampn se aade a los pocillos. Deshielo de la placa a tempera
11.

ambiente en el da de la extraccin de RNA.

Aadir 400 l de etanol al 70% a cada pocillo. Mezclar con el contenido de un pozo pipeteando arriba y abajo dos o tres veces, a
12. continuacin, cargar la mezcla en una columna RNeasy Mini kit.

Proceder a la extraccin de ARN utilizando el kit RNeasy Mini. Incluyen la etapa de tratamiento DNasa como se especifica en l
13. instrucciones de RNeasy.
Analizar la replicacin del VSR en las clulas A549 en tiempo real de PCR
14. Preparar cDNA a partir de un ARN mg total como se describe en el Protocolo Bsico 2 .

El uso de ARN de las clulas infectadas por alto (por ejemplo, los pozos infectados con VRS en un momento de inercia de 24 h
15. para preparar cDNA para la curva estndar.
Amplificar los genes virales y

-Actina utilizando los cebadores descritos anteriormente (Tabla 26.6.1 ) y las condiciones de PC

describe en el Protocolo Bsico 2 .

Debido a la alta similitud de secuencia entre la rata humana y el algodn
16.

la

-Actina, el mismo conjunto de primers se utiliza p

-Actina de amplificacin en clulas A549 y en las muestras de pulmn de rata de algodn.

Use la curva estndar para obtener unidades relativas de expresin para todos los genes y la normalizacin de ellos por el
17. nivel de expresin de mRNA como se describe en el Protocolo Bsico 2 .
18. Expresar los niveles de ARNm como la media SEM de dos pozos de diferentes culturas.

Reactivos y Soluciones

-A

El uso de agua desionizada, destilada en todas las recetas y los pasos del protocolo. Para las soluciones de
las acciones ordinarias, vase el ANEXO 2A , para los proveedores, consulte EL APNDICE PROVEEDORES .
A549 de crecimiento a mediano
1

Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado con:

10% (v / v) de suero fetal bovino (SFB)

100 UI / ml de penicilina

100 mg / ml de estreptomicina

2 mM L-GLUTAMINA

6
Almacenar hasta 2 meses a 4 C
Cristal violeta fijador / tincin
1

0,067% (w / v) de cristal violeta

1,25% (v / v) de glutaraldehdo

3
Almacenar hasta 1 ao a temperatura ambiente
HEp-2 de crecimiento a mediano
1

EMEM con BSS de Earle, complementado con:

10% (v / v) FBS

2 mM L-GLUTAMINA

50 mg / ml de gentamicina

2,5 mg / ml Fungizone

1 penicilina / estreptomicina

7
Almacenar hasta 2 meses a 4 C
Homogeneizacin medio
1

Solucin salina balanceada de Hanks (HBSS; ANEXO 2A )

0,218 M de sacarosa

4,4 mM de glutamato

3,8 mM KH 2 PO 4

7,2 mM K 2 HPO 4

6
Almacenar hasta 2 meses a 4 C
Metilcelulosa superposicin medio
1

EMEM que contenga:

0,75% (w / v) metil celulosa

1% (v / v) FBS

2 mM L-GLUTAMINA

50 mg / ml de gentamicina

2,5 mg / ml Fungizone

Almacenar hasta 2 meses a 4 C

Comentario
Antecedentes
El VRS es una envoltura, no segmentado, negativo captulo de virus ARN que pertenece a la
familia Paramyxoviridae. El genoma de RSV contiene 10 genes en el orden NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2,
L del extremo 3; estos genes dan lugar a 11 protenas (M2 ORF codifica dos protenas: M2- 1 y M22). Protenas de RSV incluyen tres protenas de la superficie transmembrana G, F, y SH, el virin matriz de
protena M, la nucleocpside protenas L, N, P, M2-1, y M2 de 2, y las dos protenas no estructurales putativo
NS1 y NS2. RSV genes se transcriben de forma secuencial desde el extremo 3 del genoma, con proximal
promotor de los genes transcritos con mayor frecuencia que los genes aguas abajo (Collins y
Wertz, 1983 ). Esto se traduce en una caracterstica pendiente de la transcripcin tambin mononegaviruses
otros. De la acumulacin de protenas expresadas de forma viral en las clulas infectadas, RSV comienza un
ciclo de replicacin en el cual se sintetiza una copia de cadena positiva del genoma, el antigenome, como
producto intermedio. Tanto el ARN genmico y antigenmico se empaquetan en viriones completado, en un
proceso dependiente de la sntesis de protenas virales en curso (Huang y Wertz, 1982 ).
El virus respiratorio sincitial (VRS) es la principal causa de bronquiolitis y neumona viral en los nios
pequeos, y la principal causa de muerte viral en nios (Shay et al,. 2001 ;. Thompson et al, 2003 ). La
bronquiolitis causada por VRS afecta a la mayora de los bebs durante sus primeros meses y el segundo de
la vida, pero la reinfeccin (a menudo ocurren con sntomas ms leves o asintomticos) es comn. A la edad
de 2, casi todos los nios han sido infectados con el VRS al menos una vez, y la mitad de los nios haban
sido reinfectados (Glezen et al., 1986 ). Infeccin por el VSR en nios se asocia con sibilancias recurrentes
posteriores de la vida, que apunta a un vnculo entre el VRS y el inflamatoria alrgica trastornos (Stein et
al,. 1999 ; Sigurs et al,. 2000 ;. Schauer et al, 2002 ). Los estudios en animales en el modelo de rata de
algodn indican que los cambios inflamatorios en el pulmn son provocados en animales inmunes al virus,
incluso en ausencia de produccin de virus detectable (Prince et al., 1986 ). Una probable explicacin para
ese fenmeno podra ser la replicacin viral abortivo desencadenar una respuesta inflamatoria en el pulmn.
La replicacin del virus sincitial respiratorio abortiva puede indicar que una nueva infeccin por el VRS es ms
frecuente que en la actualidad apreciada. Tpicamente, la infeccin por VRS se diagnostica por el aislamiento
del virus en las secreciones respiratorias de personas infectadas. Estos casos se representan los nios
infectados con el VRS, por primera vez, as como nios y adultos a infectarse con RSV despus de cierto
perodo de tiempo suficiente para la proteccin inmune contra el virus a disminuir. Sin embargo, nuestros
resultados sugieren que las reinfecciones tambin puede ocurrir poco despus de la exposicin anterior, y
pasar en un momento en que la respuesta inmune es lo suficientemente fuerte para suprimir la infeccin
productiva, pero la replicacin no abortivas del virus.Clnicamente, estos reinfecciones se caracteriza por la
expresin de antgenos virales en la ausencia de virus de la produccin, y puede pasar desapercibida si los
cultivos virales se utilizan para controlar la enfermedad. Cabe destacar que los resultados de varios estudios
en humanos recientes apoyan la posibilidad de infecciones frecuentes de "abortivo" RSV. Estos estudios, en la
que las secreciones respiratorias fueron analizadas para la presencia de RSV por el cultivo viral y RT-PCR,
revel que consistentemente ms muestras positivas para el VSR prueba de RT-PCR que por la cultura
(Falsey et al,. 2002 , 2003 ; Hu et al ., 2003 ; Perkins et al,. 2005 ). Estos resultados podran indicar que
algunos individuos con RSV detectado por RT-PCR, pero no por la cultura, podra haber recuperado
recientemente de RSV y actualmente estn siendo acompaados por una nueva infeccin abortiva replicacin
del virus.

Los parmetros crticos y resolucin de problemas

El parmetro crtico para la replicacin viral abortivo es establecer la inmunidad suficientemente fuerte como
para suprimir la replicacin del virus de la produccin en el pulmn. En la rata del algodn, la infeccin de
animales con menos de ~ 10 4 ufp RSV / animal slo produce una inmunidad parcial, y el virus se puede
recuperar de los pulmones de los animales de infectar con RSV 21 das despus. En este caso, la replicacin
del virus sincitial respiratorio abortiva sera enmascarado por la produccin y liberacin de viriones infecciosos
en el pulmn. Si esta situacin se produce despus de seguir los protocolos descritos aqu, un
experimentador debe volver a comprobar el ttulo de la accin del virus RSV utilizados en el laboratorio para
asegurarse de que la poblacin est en la concentracin correcta. Si el ttulo resulta ser menor que el valor
esperado, la cantidad de inculo viral es necesario aumentar la dosis de cebado y reexposicin en
consecuencia.
Si se utiliza un modelo animal que no sea rata del algodn para supervisar la replicacin del virus sincitial
respiratorio abortado, habra que determinar la cantidad de inculo viral estableciendo inmunidad esterilizante
(como se define por la ausencia de viriones infecciosos en los pulmones despus de la re-inclusin) en los
pulmones de los ese animal en particular. Con el fin de hacer eso, los animales deben ser inoculados con
diferentes dosis de RSV en el tiempo 0, a infectarse con el ~ 10 5 a 10 6 ufp RSV / animal 21 das despus, y
sacrificado en el momento del pico de la replicacin del VSR. La dosis del virus sincitial respiratorio causando
inmunidad esterilizante en el pulmn se debe utilizar en todos los experimentos con abortiva replicacin del
VSR.
Los parmetros crticos y resolucin de problemas relativos a los protocolos bsicos 1 y 2 y los protocolos de
soporte 1 y 2 se abordan en las secciones correspondientes.

Los resultados previstos

Cada par de cebadores en la tabla 26.6.1 se puede esperar que con xito amplificar el fragmento de ADN
correspondiente, con eficiencias entre pares de cebadores de ser casi idnticas (98% a 99%.
Fig. 26.6.1 A). Esto se demuestra cuando una curva estndar se desarrolla utilizando serie de 10 diluciones
de plsmido que contiene toda antigenome RSV (coeficientes de correlacin de 0,996 a 0,998). Cuando se
utiliza para el anlisis de la replicacin del VSR in vitro (ver Apoyo Protocolo n 2 ), el ensayo de QRT-PCR se
describe en el Protocolo Bsico 2 refleja con precisin la carga viral segn las estimaciones de la placa de
ensayo ( Protocolo Bsico 1 ). Hemos abordado este problema utilizando cultivos de clulas del epitelio
alveolar A549 infectados con el VRS (ver Protocolo de apoyo 2 ). Como se muestra en la figura 26.6.1 B, la
infeccin de las clulas A549 es lento, con las transcripciones de los genes de RSV que aparecen en 6 horas
y la acumulacin considerable de 24 horas despus de la infeccin, de acuerdo con informes de infeccin por
VRS de las clulas epiteliales medida por otros mtodos (Bermingham y Collins, 1999 ). Un gradiente
pronunciado de la expresin gnica RSV es evidente en las clulas infectadas A549, con las cantidades de
transcripciones disminuyendo drsticamente en el orden de NS1 a la transcripcin inversa L. con oligo dT
cartilla, que se utiliza en este y otros experimentos similares, los resultados en un grupo de cDNA que
contiene no slo la transcripcin inversa de copias de ARNm individuales producidas por VRS durante la
transcripcin, sino tambin copias de los antigenome RSV. Sin embargo, debido antigenome estara
representada de manera similar en las reacciones de diferentes genes RSV, las diferencias entre los niveles
de amplificacin medida por RT-PCR aqu se atribuyen a diferencias en los niveles de expresin gnica. Por lo
tanto, las fluctuaciones en los niveles de los diferentes amplicones RSV "se mide en oligo dT cDNA se puede
expresar como las diferencias de expresin gentica.

Figura 26.6.1 Establecer en tiempo real PCR de la replicacin del VSR. (A) La amplificacin de varios ge

RSV RSV antigenome insertado en un vector. Seis de 10 diluciones de antigenome-vector que contiene s
utiliza para generar una curva estndar. Los valores de Ct se trazan contra el registro de la cantidad

de 10antigenome utilizar como plantilla. Los coeficientes de correlacin (R 2) de la mejor opcin se muestra
a los smbolos correspondientes a los 7 genes analizados por VRS. Cada punto en este grfico incluye

smbolos para todos los 7 genes. (B) Expresin de los genes infectados por VRS en las clulas A549. La
clulas A549 fueron infectados con VRS en MOI 0,1. A los 6 puntos de tiempo y 24 horas despus de la
infeccin, el ARN total fue extrado de clulas infectadas y transcripcin reversa utilizando oligo (dT)
primer.Expresin de mRNA de cada gen RSV indicado se mide por QRT-PCR. El nivel relativo de cada
amplicn se normaliz

-Actina nivel de ARNm (tambin se mide por QRT-PCR) en la muestra

correspondiente, y expresada en relacin con el nivel de amplificacin de NS1 a las 24 horas. El inserto

muestra un gradiente de la expresin gnica del RSV, por 6 horas en un ajustado y escala para resaltar l

diferencias entre los niveles de amplicones diferentes. Los resultados representan la media SEM de do
pozos diferentes en cada punto de tiempo.
El ensayo RT-PCR de la replicacin del VSR se ha descrito anteriormente se puede esperar de cuantificar con
exactitud la carga viral en las clulas infectadas. Para verificar que se inocularon clulas A549 con RSV en las
MOI diversos (0,001 a 0,1). En un momento de tiempo de 48 horas despus de la infeccin, los
sobrenadantes celulares se recogieron de las titulaciones virales, mientras que los mismos se lisaron las
clulas para la extraccin de RNA. Rendimiento viral en el sobrenadante de las clulas A549 representado
con exactitud el nivel de infeccin (Tabla 26.6.2 ). Las clulas infectadas con la cantidad de 10 veces mayor
del virus de la liberacin de RSV en cantidades que tambin se diferencian por ~ 10 veces. Cuando el ARN
viral a partir de estas clulas es analizada por RT-PCR utilizando los cebadores para el VSR gen NS1, la
diferencia en la cantidad de amplicn NS1 detectada en las clulas A549 tambin difiere en ~ 10 veces entre
los cultivos infectados con el VRS en las MOI de 0,001, 0,01, y 0,1, respectivamente. El nivel de sentido
negativo (del genoma) y de sentido positivo (antigenome) ARN tambin se puede medir en las clulas
infectadas por RSV (Tabla 26.6.2). Para ello, el total de ARN de las clulas infectadas es la transcripcin
inversa utilizando adelante o invertir primer recocido a la cadena genmica del virus sincitial respiratorio o
antigenmico, respectivamente. La cantidad de la transcripcin inversa de producto puede ser medido por
PCR en tiempo real utilizando los cebadores especficos para el VSR amplicones G o M, prximo al inicio del
genoma o el fragmento antigenome a cargo, respectivamente. En las clulas A549 infectadas, la cantidad de
genoma y antigenome aumenta progresivamente entre las muestras infectadas con cantidades crecientes de
RSV, al igual que el patrn de expresin de los genes virales (Tabla 26.6.2 ), aunque con menos precisin que
refleja las diferencias entre las MOI de la infeccin viral y el rendimiento en las clulas infectadas. Anlisis en
tiempo real PCR de extractos de clulas infectadas por RSV indica que el genoma de RSV es ~ 3 - a 4 veces
ms abundante en las clulas infectadas que antigenome, de acuerdo con informes de otros paramixovirus,
en el que el antigenome constituye slo el 10% a 40% del genoma en las clulas infectadas (Robinson, 1970;
Kolakofsky et al,. 1974 ; Kolakofsky y Bruschi, 1975 ).
Tabla 26.6.2 Comparacin de la deteccin de VRS en el cultivo viral y QRT-PCR en RSV-clulas
epiteliales infectadas

MOI 0.001

2,24 0,06
0,004 0,001
0,0009 0,0002
0,0003 0,0002

un

A549 clulas epiteliales alveolares fueron infectados con VRS en MOI 0,001 a 0,1. En un punto de 48 horas

despus de la infeccin, los sobrenadantes celulares se recogieron para la cuantificacin del rendimiento viral por
ensayo de placa, mientras que las clulas se lisaron y se utiliza como una fuente de ARN para QRT-PCR y anlisis
de las transcripciones de RSV.
b

Expresin de RSV NS1 amplicn fue analizado por QRT-PCR, normalizado por la expresin de

-Actina en los

cultivos celulares correspondientes, y se presenta en relacin con la cantidad de amplificacin de NS1 en la cultura
0.1 MOI por el VIH (valor asignado en relacin de 1).
La expresin de c RSV genoma y antigenome fue analizada por QRT-PCR, normalizada por el nivel de

-Actina

en los cultivos celulares correspondientes, y se presenta en relacin con la cantidad de genoma en la cultura 0.1
MOI por el VIH (valor asignado en relacin de 1).

En la replicacin in vivo de la RSV tambin puede evaluarse con precisin de QRT-PCR. La infeccin de las
ratas de algodn ingenuo con el VRS (infeccin primaria por VRS) se traduce en la replicacin del virus
eficiente en los pulmones que llega a mximo en el da 4 post-infeccin y desaparece el da 7
(Fig. 26.6.2 A). Genoma y la sntesis de antigenome en infeccin primaria por VRS (Fig. 26.6.2 B) aumenta de
forma progresiva tras la exposicin RSV, alcanzando su pico en el da 4 post-infeccin y disminuir despus de
eso. Este patrn de genoma / antigenome produccin paralela a la cantidad de partculas virales infecciosas
detectadas en los pulmones de los animales con infeccin primaria por VRS (Fig. 26.6.2 A) los das que
corresponden. La nica diferencia es visto por el da 7, cuando el virus no se pueden recuperar de los
pulmones, y las hebras todava genmica y antigenmico de RSV todava puede ser detectado.

Figura 26.6.2 replicacin del VSR en vivo: evidencia de replicacin abortado en el modelo de una nueva

infeccin. Ratas del algodn fueron infectados con VRS, una vez para los estudios de la infeccin primar
dos veces (con un intervalo de 21 das) para los estudios de infeccin secundaria. En el tiempo indicado

despus de la final del concurso, los pulmones fueron recolectados para la determinacin del ttulo viral p

ensayo de placa (A) o para el anlisis de la replicacin del VSR de QRT-PCR (B, C, D). (A) los ttulos vira

pulmonares en ratas de algodn con infeccin primaria por VRS ("Prim", la luz barras grises) y el secund

infeccin por VRS ("SEC", el virus no detectados). Los ttulos virales se determina mediante el ensayo de

placa como se describi previamente (Prince et al,. 1978 ; lmite de deteccin de 2 log 10 ufp / g). (B) RSV

genoma y antigenome replicacin en la infeccin por RSV primaria y secundaria. ARN fue extrado de los

pulmones de los animales infectados y revertir transcritas utilizando primers complementarios a la cadena

genmica o antigenmico de RSV. Genoma relativa (y antigenome, insertar) est determinada por QRT-P
normalizado por la

-Actina mRNA nivel en la muestra correspondiente, y expres en relacin al nivel de

genoma (antigenome, para insertar) detect en los pulmones de los animales con infeccin primaria por V

el da 4. (C) La expresin de genes durante la infeccin por VRS RSV primaria y secundaria. ARN extrad

los animales descritos anteriormente fue inverso-transcrito utilizando oligo (dT) primer. Expresin de ARN
NS1 se midi mediante QRT-PCR, normalizado por

-Actina como se describi anteriormente, y expres

relacin con el nivel de NS1 ARNm detectados en los pulmones de los animales con infeccin primaria p
en el da 4. (D) Pendiente de la expresin gnica por VRS en 12 horas despus de la infeccin en la

enfermedad de RSV primaria y secundaria. NS1, M, L y los niveles de amplificacin se mide por QRT-PC
cDNA preparada con oligo (dT) primer. Expresin de cada amplicn se normaliz

-Actina, y expres en

relacin con el nivel de NS1 ARNm detectados en los pulmones de los animales con infeccin por el VSR
primaria. Los resultados representan la media SEM de cuatro animales por cada punto de tiempo para
infeccin primaria y secundaria.
Si los animales inoculados con VRS, una vez se mantienen durante 21 das y luego puestos a prueba
nuevamente con el VRS (secundaria infeccin por el VSR), no se detecta virus en los pulmones de los
animales, por el cultivo viral (Fig. 26.6.2 A). La expresin del ARN viral en secundaria infeccin por VRS, sin
embargo, es fuerte. Como muestra la Figura 26.6.2 muestra B, la infeccin por VRS secundaria de las ratas
de algodn se acompaa de sntesis eficiente de los hilos tanto genmica y antigenmico de RSV. Alcanza
mximo en 12 horas despus de la infeccin y disminuye posteriormente a un nivel indetectable el da 7. La
produccin de ARN genmico / antigenmico no se puede distinguir entre la infeccin por RSV primaria y
secundaria en 12 horas post-infeccin. Despus de eso, la cantidad de ARN viral en animales con infeccin
secundaria comienza a disminuir, y las diferencias entre el aumento de la infeccin primaria y secundaria en
magnitud con cada punto de tiempo posterior a medida que progresa la infeccin. Debido a que las escalas de
los cambios en el ttulo viral y RSV produccin de ARN en las figuras 26.6.2 y A 26.6.2 B se fija para ser
comparable (que abarca tres rdenes de magnitud cada uno), la gran discrepancia en cuanto al grado de
replicacin viral de ARN y la produccin de partculas virales infecciosas durante la secundaria infeccin por el
VSR puede apreciarse fcilmente. Por ejemplo, mientras que la cantidad de partculas virales infecciosas en
el da 1 en la infeccin primaria por VRS es de al menos 288 veces mayor que en secundaria la infeccin por
VRS (tomando 2 log 10 ufp / g lmite de deteccin en cuenta y teniendo en cuenta la posibilidad de la presencia
de un virus no detectable en los pulmones de los animales de una infeccin secundaria), la diferencia en el
nivel de ARN del VRS entre la infeccin primaria y secundaria es de slo 8 veces.
Expresin de los genes individuales RSV durante la infeccin por VRS en vivo tambin pueden ser analizados
durante la infeccin RSV primaria y secundaria de las ratas de algodn. La dinmica de los cambios de
expresin gnica por VRS se puede esperar a ser muy similares a las del genoma / antigenome variaciones
se seal anteriormente, y se ejemplifican los cambios en el nivel de amplificacin de NS1 muestra en la
figura 26.6.2 C. NS1 la expresin gnica en secundaria aumenta la infeccin por VSR entre los 6 y 12 horas, y
disminuye posteriormente, mientras que NS1 expresin en la infeccin primaria se incrementa
progresivamente ms all del punto de 12 horas de tiempo, alcanza un pico en el da 4 post-infeccin, y
disminuye despus. Amplicones M y L siguen patrones idnticos de cambios dependientes del tiempo
despus de la infeccin por VRS (datos no mostrados). De manera similar a los cambios del genoma /
antigenome, la expresin de genes entre la infeccin por VRS primaria y secundaria es muy similar a las 12
horas despus de la infeccin de cada gen en particular analizado. En general, este virus re-infeccin de los
animales infectados resultados 21 das antes de la expresin cada vez mayor de transcripcin viral y la
replicacin del genoma, pero no conduce a la produccin de progenie viral detectable. Este tipo de
replicacin, por lo tanto, puede denominarse como "abortiva", como el VSR es capaz de entrar en las clulas
en los pulmones de los animales inmunes, sin embargo, la produccin de virus de la progenie se ve

afectada. Esto es en contraste con la infeccin primaria por VRS, donde se detecta la acumulacin de ambas
material gentico viral y virus de la progenie en los pulmones.

Consideraciones de tiempo
Titulaciones virales de QRT-PCR y la placa de ensayo tome aproximadamente 1 semana cada uno, desde el
momento de la elaboracin de pulmn de la muestra a la hora de leer los resultados finales. Los experimentos
con animales son ms mucho tiempo parte de los protocolos descritos. Un perodo de 21 das se necesita
entre el reto RSV primaria y secundaria, y un adicional de dos semanas se necesitan para la recoleccin de
las muestras despus de la ltima inoculacin RSV.