SECRETARA DE EDUCACIN PBLICA

TECNOLGICO NACIONAL DE MXICO.

INSTITUTO TECNOLGICO DE ROQUE

TTULO :

PRATICA 4 : TINCION DE GRAM

INGENIERA EN INOVACION AGRICOLA.
5to. SEMESTRE
GRUPO U

ALUMNO (A):
SAMUEL CANUTO NORIEGA
PROFESOR (A) :
MARIA BERTHA SANCHEZ GARCIA

INTRODUCCION.
De gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes grupos
de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El fundamento
radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias
Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las
bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa
lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se
efecta un lavado conetanol que arrastrar al colorante slo en las Gram (-),
mientras que en lasGram (+) elcolorante queda retenido y las clulas permanecern
azules. Las clulas Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste
(safranina) para que puedan observarse.
OBEJETIVO.

El presente trabajo practico tiene por objetivo brindar al alumno

herramientas bsicas en la confeccin y el manejo de extendidos y la
tincin de los mismos de acuerdo a la observacin que se desee
realizar.

MARCO TEORICO

Tincin:
Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben a una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los microorganismos y
poder realizar la observacin en microscopio ptico. Dado que las bacterias son casi
incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas
y no pueden observarse claramente sin algn tratamiento previo. De acuerdo a la
reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:
a) Tincin simple:

El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa celular. Forma de

vara: se llaman Bacilos Dos bacilos juntos: Diplobacilos Cadenas de bacilos:
Estreptobacilos Empalizadas, Bacilos lado con lado o en figuras en X, V o Y
Divisin a lo largo del mismo plano, formando cadenas cortas Divisin a lo
largo de 3 planos forma esfrica: se llama Coco 2 cocos juntos: Diplococos 4 20 en cadenas: Estreptococos Divisin a lo largo de 2 planos diferentes:
Ttradas regularmente: Sarcinas irregularmente: Estafilococos
b) Tincin diferencial:
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre clulas bacterianas
o entre partes de una misma clula. Estas tcnicas utilizan mas de un
colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tincin. Ejemplos:
Tincin de Gram, Tincin de Ziehl-Neelsen, etc.
Colorantes
Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son
catinicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados
negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacaridos cidos (las
envueltas externas de los microorganismos estn por lo general cargadas
negativamente).
Tincin diferencial de Gram:
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram,
quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de
Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y
gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada
que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos
morfolgicos distintos de bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de
la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta
Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 - 2 min. y
se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona.
Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min. Lavar y
secar. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta
debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes

celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al

organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared
celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la
clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de
peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la
pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente
de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de
fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de
la clula gram-negativa es peptidoglicano. Descripcin de la tincin de GRAM:
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de
azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro
potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el
I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua
con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las
gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus
la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que
es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos)
no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia
esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la
decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el
caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un
solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y
tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une
peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el
de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas
grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms
peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente, provocando

que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared

celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava
azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las
clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente
es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus
de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras
que las grampositivas permanecen azules. Bacillus anthracis (Gram positivo)
Pseudomonas aeruginosa (Gram negativo) Deben destacarse algunos
aspectos cruciales de la tincin de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta
debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad
con las clulas. 2) EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un
clculo preciso del tiempo para evitar que pierdan la tincin las clulas
grampositivas. 3) Cultivos de ms de 24 horas de teidos pueden perder su
habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo.
Tincin diferencial:
Mtodo cido resistente (ZIEHL-NEELSEN) Las paredes celulares de ciertos
parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena
larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos.
Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. El frotis se tie durante unos
5 min con Fucsina fenicada aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar
con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante
30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar. 2.5.
Tincin diferencial para revelar estructuras celulares. Mtodo de Wirtz.
Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,
producen en su interior formas de resistencia denominadas esporas. Se
producen

cuando

(agotamiento

de

las
los

condiciones
nutrientes,

ambientales

temperaturas

son

extremas,

desfavorables
radiaciones,

compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa.
Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la
espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina

generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura

durante aos. La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes: 1.Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2.- Safranina:
colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas, tras la
primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn
las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.
Descripcin de la tincin de GRAM:
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de
azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro
potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el
I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua
con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las
gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus
la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que
es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos)
no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia
esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la
decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el
caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un
solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y
tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une
peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el
de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas
grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms
peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente, provocando
que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared
celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava
azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las

clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente

es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus
de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras
que las grampositivas permanecen azules.
MATERIALES.
- Pizeta con alcohol , H2O.
- Cristal violeta.
- Lugol.
- Alcohol.
- Safranina / Fucsina acida.
- Cultivo bacteriano.
- Pinzas.
- Asa de platino.
- Mechero .
- Microscopio compuesto.

METODOS.
-

Esterilizar un portaobjeto y dejar enfriar. (FIGURA 1.)

Colocar una gota de H2O en el porta objeto. (FIGURA 2.)
Pasar el porta objeto por el mechero varias veces hasta que se impregne

la gota.
Esterilizar el asa de platino.
Con el asa previamente esterilizada tomar una porcin del cultivo
bacteriano (FIGURA 3) y extender en el portaobjeto (FIGURA 4), pasarla

por el mechero nuevamente hasta que seque. (FIGURA 5)

Colocar crisol violeta y dejar por 1 min. (FIGURA 6)
Lavar con H2O destilada. (FIGURA 7)
Colocar lugol y dejar 1 min. (FIGURA 8)
Lavar con alcohol cetona. (FIGURA 9)
Colocar fucsina y dejar 1 min.
Lavar con H2O destilada.
Secar con papel absorbente dando pequeos golpes si frotar el

portaobjeto.
Colocar 1 gota de aceite de inmersin y observar en el microscopio.

(FIGURA 10)
Anotar lo que se observa y definir si es GRAM(-) O GRAM(+).(FIGURA 11)

RESULTADOS Y DISCUSIONES.

FIGURA1. Esterilizacin del

portaobjeto.

FIGURA 2. Aplicacin de H2O

en el portaobjeto

FIGURA 3. Toma de
muestra bacteriana del

FIGURA 4. Dispersin de
muestra en el portaobjeto.

FIGURA5. Fijacin de la
muestra atraves de calor

FIGURA6. Aplicacin del

cristal violeta .

FIGURA 7. Lavado de
portaobjeto despus de haber
aplicado el crisol violeta .

FIGURA 8. Aplicacin de
lugol.

FIGURA 9. Enguaje de
portaobjeto con alcohol
cetona , despus de aplicar
lugol .

FIGURA 10. Aplicacin de

aceite de inmersin .

FIGURA 11. Imagen que se

observ en el microscopio
despus de todo el proceso .
GRAM (-)

CONCLUSIONES.
-

Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las

rodea, difieren mucho qumicamente esta diferencia qumica es
los

que

permite distinguir

las

bacterias

por Tincin,

pues

generalmente, el colorante reacciona con la clula bacteriana,

pero no reacciona con su medio exterior.

LITERATURA CITADA.

http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.mx/p/tincion-de-gram_20.html
(consulta , 13-10-16)
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecno
logia/practico4.pdf (consulta , 13-10 16 )