Determinacin de alcaloides en orina

Granados J.1, Malpica L.2, Ordoez E.3, Suarez N.4

Grupo 2752. Toxicologa. Equipo 5. 1,2,3,4. Estudiantes de Bioqumica Diagnstica.
Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de Estudios Superiores Cuautitln. Departamento
de ciencias biolgicas. Seccin de bioqumica y farmacologa humana
Av. 1 de Mayo, Col. Sta. Mara las Torres Cuautitln Izcalli, Estado de Mxico CP.54740.

RESUMEN
Los alcaloides son bases orgnicas, su variedad estructural es muy grande, tanto en su
esqueleto carbonado como en el tipo y nmero de sustituyentes. El nitrgeno, que debe
estar presente para que una molcula sea catalogada como alcaloide, se encuentra como
amina primaria, secundaria, terciaria o sal cuaternaria. Algunos alcaloides poseen actividad
fisiolgica, principalmente a nivel de sistema nervioso, algunos se han manifestado como
altamente txicos, y otros en dosis apropiadas, son utilizados en la industria farmacutica; el
uso inadecuado de los alcaloides como drogas de abuso representa un problema de salud
en la sociedad actual. En el laboratorio se han creado diversos mtodos para la extraccin
de alcaloides de muestras biolgicas, la mayora se basan en el aprovechamiento de las
propiedades qumicas de los compuestos, en este estudio se utilizaron solventes como
cloroformo y ter etlico. Asimismo existen tcnicas de reconocimiento de alcaloides, stas
se fundamentan en la capacidad de los alcaloides para combinarse con el yodo y metales
pesados como bismuto, mercurio, tugsteno; con los cuales forman precipitados. Algunos de
los reactivos empleados para el reconocimiento de alcaloides son: Reactivo de Mayer,
Dragendorff, Bouchardat y Mandelin. En el presente reporte se muestran los resultados
obtenidos con la realizacin de las tcnicas antes mencionadas adems de la
determinacin por inmunoensayo de alcaloides en orina obteniendo como resultado la
presencia de THC en la muestra analizada.
PALABRAS CLAVE
Alcaloides, Dragendorff, Mayer, Bouchardart, Inmunoensayo
ABSTRACT
Alkaloids are organic bases, structural variety is very large, both in its carbon skeleton and
the type and number of substituents. The nitrogen, which must be present for a molecule to
be classified as alkaloid, is found as primary, secondary, tertiary or quaternary salt. Some
alkaloids have physiological activity, mainly at the level of the nervous system, some have
proven to be highly toxic, and others in appropriate doses, are used in the pharmaceutical
industry; improper use of the alkaloids as drugs of abuse is a health problem in today's
society. In the laboratory have created various methods for the extraction of alkaloids from
biological samples, most are based on the use of the chemical properties of the compounds
in this study were used solvents such as chloroform and ethyl ether. Also there alkaloids
recognition techniques, these are based on the ability to combine with alkaloids iodine and
heavy metals as bismuth, mercury, tungsten; with which form precipitates. Some of the
reagents used for the recognition of alkaloids are: Mayer reagent, Dragendorff, Bouchardat
and Mandelin. In this report the results obtained by performing the above techniques well
immunoassay determination of alkaloids in urine resulting in the presence of THC in the
sample.
KEY WORDS
Alkaloids, Dragendorff, Mayer, Bouchardat, Immunoassay

INTRODUCCIN
No existe una definicin exacta para los alcaloides, pero se puede considerar como: Un
compuesto orgnico de origen natural (generalmente vegetal), nitrogenado (el nitrgeno se
encuentra generalmente intracclico), derivados generalmente de aminocidos, de carcter
ms o menos bsico, de distribucin restringida, con propiedades farmacolgicas
importantes a dosis bajas y que responden a reacciones comunes de precipitacin
Y se clasifican en:
Alcaloides Verdaderos cumplen estrictamente con las caractersticas de la definicin de
alcaloide: son formados a partir de aminocidos, tienen siempre un nitrgeno intracclico,
son de carcter bsico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal.
Protoalcaloides son aminas simples con nitrgeno extracclico, de carcter bsico y son
productos del metabolismo de los aminocidos.
Pseudoalcaloides presentan algunas de las caractersticas de la definicin de alcaloide,
pero no son derivados de aminocidos.
Alcaloides imperfectos son derivados de bases pricas, no precipitan con los reactivos
especficos para alcaloides. (Galagovsky 2002)
No son alcaloides los aminocidos, las betalanas, los pptidos, los amino azcares, las
vitaminas nitrogenadas, las porfirinas, algunas bases como la tiamina ampliamente
distribuida en los seres vivos y los alkil aminas de bajo peso molecular. (Kukinskli 2000)
En cuanto a su estado natural, los alcaloides son esencialmente sustancias presentes en
todos los rganos de la planta, pueden encontrarse mayoritariamente en hojas (cocaina,
nicotina, pilocarpina), en flores (escopolamina, atropina), en frutos (alcaloides del opio,
peletierina, coniina), en semilla (piperina, arecolina), en corteza (quinina, tubocurarina), en
la raz (emetina y cefalina). (Galagovsky 2002)
La funcin de los alcaloides en las plantas no es an clara, existen algunas sugerencias
sobre el rol que juegan estas sustancias en los vegetales como:
Sirven como productos de desecho o almacenamiento del nitrgeno sobrante, esta funcin
es equivalente a la del cido rico o de la urea en los animales.
Debido a que en su mayora, los alcaloides son asociados con cidos orgnicos que le
facilita el transporte en la planta, pueden servir como productos de almacenamiento del
nitrgeno no metabolizado o para transporte del mismo; en el caso de las Solanaceas
midriticas, los steres del tropano se forman en las races y son transportados a las partes
areas donde pueden ser hidrolizados.
La microqumica ha permitido mostrar en forma general, que los alcaloides son localizados
en los tejidos perifricos de los diferentes rganos de la planta, es decir en el recubrimiento
de las semillas, corteza del tallo, raz o fruto y en la epidermis de la hoja; esto nos permite
pensar que los alcaloides cumplen una importante funcin como es la de proteger a la
planta, por su sabor amargo de estos, del ataque de insectos.
Los alcaloides pueden servir de reguladores del crecimiento, se ha demostrado que los
alcaloides derivados de la putrescina se incrementan notablemente durante la germinacin
de algunas plantas como la cebada, cuando se encuentran en suelos deficientes de potasio.
(Kukinskli 2000)
Las tcnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en
estado de sal (extractos cidos), de combinarse con el yodo y metales pesados como
bismuto, mercurio, tugsteno formando precipitados; estos ensayos preliminares se pueden
realizar en el laboratorio o en el campo. (Galagovsky 2002)
MATERIALES Y MTODOS

A 25 mL de orina se le realizaron tres extracciones distintas, la primera se realiz

adicionando HCl 1N hasta llegar a un pH=4. Se continu con tres extracciones con ter
etlico obteniendo as el extracto etreo #1; posteriormente a la fase acuosa restante se
alcalinizo con hidrxido de amonio hasta conseguir un pH=9 y se procedi nuevamente a
realizar tres extracciones con ter etlico obteniendo as el extracto etreo #2 la fase acuosa
se reextrajo con cloroformo (tres extracciones) obteniendo as el extracto #3 Cloroformico.
Una vez obtenidos los tres extractos se les aadi sulfato de sodio anhidro a cada uno. Se
procedi a evaporar los extractos casi a sequedad para as poder realizar por separado a
cada extracto las pruebas presuntiva Dragendorff, Mayer Bouchardart y Madelin, en placa
de porcelana. Finalmente se realiz un inmunoensayo que permite detectar la presencia de
anfetaminas, metanfetaminas, morfina/opiceos, cocana y THC utilizando una prueba de
uso comercial (Instan- view)
RESULTADOS
Tabla 1. Pruebas presuntivas para alcaloides
Equi
po

Dragendorff
(+/-)

Mayer (+/-)

Bouchardat
(+/-)

Mandelin (+/-)

Alcaoloide
identificado

#1

#2

#3

#
1

#
2

#
3

#1

#2

#3

#1

#2

#3

Sin identificar

Sin identificar

Sin identificar

Sin identificar

Sin identificar

TCH

TCH

Tabla 2: Inmunoensayo realizado a la orina

EQUIPO

RESULTADO
(+/-)

ALCALOIDES
IDENTIFICADOS

-----------

-----------

-----------

-----------

THC

THC

ANALISIS DE RESULTADOS

El consumo de sustancias alcaloides en el mundo va cada vez en aumento. Los alcaloides

se pueden encontrar en diferentes fluidos biolgicos dependiendo de su metabolizacin, por
lo cual se cuantific en un orina.
Los alcaloides tienen propiedades caractersticas entre las que destaca que la mayora de
ellos son poco insolubles o insolubles en agua pero se disuelven bien en solventes como el
cloroformo o el ter. La otra caracterstica es que al tener caractersticas bsicas que le
confiere el nitrgeno en su estructura, al estar en medio cido se forman sales las cuales
son muy solubles en agua y poco solubles en otros solventes.
La cualidad de formar sales en medio cido de los alcaloides, permite formar sales dobles
con compuestos con mercurio, oro, platino, bismuto o iodo. Estas sales dobles suelen
obtenerse como precipitados y muchas son caractersticas desde el punto de vista
cristalogrfico.Todo lo anterior posibilita realizar pruebas presuntivas en dicha cualidad.
La mayora de los alcaloides son insolubles o muy poco solubles en agua, y solubles en
alcohol, ter, cloroformo u otros solventes orgnicos.
Se combinan con cidos para dar sales, comportndose entonces como bases. El carcter
bsico de los alcaloides est dado por la presencia de un nitrgeno amnico o como tomo
trivalente en su estructura. Las sales de los alcaloides son bastante solubles en agua e
insolubles en solventes orgnicos. Para la investigacin de txicos alcaloidicos en la
muestra biolgica se requiere de ciertos procesos como extraccin, y la aplicacin de
metodologas de identificacin.
El objetivo de la extraccin es el aislamiento de los alcaloides de la muestra problema. Si la
muestra constituye un material slido se proceder con el mtodo de extraccin continua.
En caso de ser una muestra lquida se tiene el mtodo clsico, por lo que se emple esta
metodologa que sigue el principio de la solubilidad del lquido problema en ciertos solventes
orgnicos, basndose en el carcter bsico de los alcaloides y en el hecho de su existencia
como sales de cidos orgnicos o como recombinaciones solubles en otras sustancias. En
este tipo de mtodos la presencia de protenas en la orina puede ser una interferencia a la
hora de realizar las pruebas presuntivas, ya que las protenas facilitan la formacin de
emulsiones entre el agua y los solventes de extraccin, que dificultan la separacin de los
alcaloides. Por esta razn se procede a obtener filtrados libres de protenas si se requiere.
Debido a que los alcaloides son compuestos de carcter bsico, la solubilidad de estos en
diferentes solventes va a depender del pH, esto de acuerdo a la forma en que se
encuentren, ya sea en forma de base o sal; en forma de bases son solubles en solventes no
polares como benceno, ter etlico, cloroformo, mientras que en forma de sales son solubles
en solventes polares como el agua.
Es por esto que se realizaron varias extracciones, el procedimiento de extraccin de
alcaloides en orina se inicia con la acidificacin de la muestra. Este procedimiento tiene dos
objetivos: 1) Precipitacin de protenas que puedan interferir con la extraccin y separar a
los alcaloides que pueden estar unidos a ellas y 2) La formacin de las sales de los
alcaloides, lo que propiciar una mayor disolucin en la muestra ( que mayoritariamente es
acuosa) para su posterior extraccin.
La primera extraccin fue una extraccin etrea cida, a este pH la mayora de los
alcaloides quedan en la fase acuosa por estar en forma de sales (solubles en agua pero no
son bien solubilizadas en solventes orgnicos), por lo que solo algunos alcaloides quedaran
en la fase orgnica dependiendo de sus composicin qumica pero siendo una minora.
La segunda extraccin se llev a cabo en un pH bsico, como se ha mencionado
anteriormente, los alcaloides son compuestos que actan como bases y su solubilidad vara
de acuerdo al pH. As, al imponer un pH bsico se desplaza a los alcaloides de sus

combinaciones salinas; las bases liberadas son en seguida solubilizadas en el solvente

orgnico (ter). Por lo tanto esta vez la fase orgnica contendr la mayora de los alcaloides
de la muestra dejando en la fase acuosa solo unos cuantos adems de algunas impurezas.
Una tercera extraccin se realiz con el solvente no polar, cloroformo, donde se encontraran
en caso de haber, alcaloides tales como la morfina, atropina, brucina y estricnina debido a
las caractersticas fisicoqumicas de estos compuestos y a la polaridad del cloroformo ya
que posee una constante dielctrica mayor al ter de petrleo lo que lo hace ms polar por
lo que solubiliza en menor medida a los alcaloides en forma de bases.
Para la determinacin de alcaloides en orina se realizaron pruebas presuntivas como ya se
mencion, estas pruebas se basan en la capacidad que tienen los alcaloides de formar
sales dobles con los compuestos de mercurio, oro, platino, bismuto, yodo, etc. Estos
compuestos forman parte de los llamados reactivos de los alcaloides o reactivos de
precipitacin de alcaloides, aunque los precipitados pueden ser causados por protenas,
betanas, curcuminas y algunos polifenoles, lo que lleva a tener un falso positivo. Como la
ausencia de precipitado es indicativa de que no hay alcaloides, se usan estos reactivos
como prueba presuntiva de su presencia. El dato positivo no es definitivo y es
recomendable la realizacin de pruebas ms especficas para su determinacin y
caracterizacin. Debe tomarse en cuenta que los reactivos empleados en las pruebas
presuntivas se encuentran en una fase acuosa acidificada. Estas pruebas no pueden
realizarse directamente sobre las extracciones con solventes orgnicos (debido a la
redisolucin de los precipitados), por lo cual se evapor la mayor parte del solvente antes
de la realizacin de las pruebas y para concentrar la muestra anteriormente obtenida.
Los reactivos yodados que precipitan a los alcaloides en solucin acuosa cida bajo la
forma de pol-iodatos complejos son los siguientes:
Dragendorff
Reactivo de Dragendorff contiene Tetrayodo Bismuto de Potasio, este compuesto reacciona
con alcaloides dando lugar a la formacin de un compuesto de coordinacin en el que tres
molculas del alcaloide mantienen una interaccin de coordinacin electrosttica con el
tomo de bismuto del reactivo. El resultado de esta reaccin es la formacin de un
precipitado naranja-rojizo cuando se le adiciona este reactivo a una solucin cida de
alcaloides, por lo cual detecta alcaloides que forman sales de amonio estables en solucin
cida.

Imagen 3. Proceso de la reaccin en la prueba de Dragendorff

Mayer
El reactivo de Mayer se compone de yoduro de mercurio y potasio, este reactivo se utiliza
para identificar alcaloides dbilmente bsicos.

Imagen. 4 Proceso de la reaccin en la prueba de Mayer

Bouchardat
El reactivo de Bouchardat contiene yodo-yoduro de Potasio. La aparicin de un precipitado
floculento marrn o castao blanco es tomada como resultado positivo.
Segn lo sealado por Charles Stephenson el reactivo de Bouchardat (tambin conocido
como reactivo de Wagner) es til para la identificacin de atropina y cocana, ambas con
estructura semejante aunque con efectos diferentes.
La mayora de estas reacciones tienen una sensibilidad para reconocer alcaloides en
cantidades de entre 0.01-0.1g (siendo la reaccin de Dragendorff la ms sensible pero

tambin la que puede presentar ms falsos positivos) pero la sensibilidad puede variar
dependiendo del reactivo. Adems aunque estos reactivos pueden reconocer una gran
cantidad de alcaloides cada reactivo es ms sensible para determinadas estructuras de
estos y para reaccionar con diversos componentes que pueden generar interferencias. Por
ejemplo la reaccin de Dragendorff es ms sensible para interactuar con alcaloides que
contienen aminas terciarias, en cambio la reaccin de Bouchardart es ms sensible para
reaccionar con la morfina y sus derivados.
La prueba de Mandelin que contiene vanadato de amonio es una reaccin de oxidoreduccin entre el reactivo (VO2+V(IV)) y las aminas aromticas de los alcaloides en
medio cido, lo que proporciona diferentes coloresdependiendo del compuesto con el que
reaccione. Los colores que pueden obtenerse pasan por el azul, verde, anaranjado, rojo y
violeta. El color revelado al adicionar el cido nos ayuda a identificar presuntivamente el
alcaloide que se encuentra en una muestra.
En general cabe mencionar que las pruebas presuntivas son variables en cuanto a su
eficacia ya que dependen en gran medida de la percepcin y apreciacin de los colores de
los individuos que evalen las pruebas.

Cabe sealar que no son pruebas que confirmen la existencia como tal de alcaloides
totalmente especficos y segn algunos autores sugieren que la forma de reportar los
resultados para alcaloides de una forma ms correcta es manejar un sistema que va de
cuatro + a para conocer de forma relativa la cantidad de alcaloide presente en la muestra.
En el laboratorio de toxicologa, una vez que se cuenta con la muestra de orina se realiza el
test de antidoping o determinacin de alcaloides haciendo uso de una tcnica fcil, rpida,
barata y altamente especfica llamada inmunocromatografa en placa.
Este mtodo se basa en la reaccin inmunolgica que se realiza en una membrana
cromatogrfica.
La Prueba MultiDrogas en Orina INSTANT VIEW es un inmunoensayo cualitativo para
detectar la presencia de drogas y/o sus metabolitos en orina humana de acuerdo a puntos
de corte especficos, en un solo ensayo. La Prueba MultiDrogas INSTANT VIEW provee
nicamente un resultado analtico preeliminar. Un Mtodo qumico alterno ms especfico
debe utilizarse para obtener un resultado analtico confirmatorio. Cromatografa de Gases /
Espectrometra de Masas es el mtodo confirmatorio preferencial. Consideracin clnica y
juicio profesional debe aplicarse a cualquier resultado de prueba de drogas, particularmente
al manejar resultados positivos.
Los inmunoensayos en orina para deteccin de drogas se han convertido en uno de los
mtodos ms aceptados para rastreo examinacin preeliminar. Estos ensayos permiten a
los laboratorios eliminar una gran cantidad de especmenes negativos y enfocarse en una
cantidad menor de muestras inicialmente positivas
La prueba Instant-View es un inmunoensayo cromatogrfico de flujo lateral de un paso con
tiras reactivas que incluyen 1) Una almohadilla conjugada color vino que contiene
anticuerpos antidrogas y 2) una membrana de nitrocelulosa que contiene una Lnea T (Test
Line o Lnea de Examen) y Lnea C (lnea de control). La lnea T es revestida con el
antgeno de droga; La lnea C es revestida con Anticuerpo IgG. Esta prueba es un
inmunoensayo de uniones competitivas.

La droga o el metabolito de droga en el espcimen de orina compite con el Antgeno

cubierto en la membrana de nitrocelulosa para los sitios de unin limitada de los anticuerpos
conjugados.
Cuando una cantidad de orina adecuada es aplicada a la almohadilla de muestra en el
dispositivo, la orina emigra por accin capilar a travs de las tirillas reactivas. Si el nivel de
droga en la muestra es inferior al punto de corte, la lnea color vino tendr que unirse con
los antgenos revestido en la membrana de nitrocelulosa y formar una Lnea T color vino
indicando un resultado negativo. Si el nivel de droga en la orina es igual o mayor al punto de
corte del examen, se unir con los anticuerpos conjugados de manera que ninguna Lnea T
se forme, indicando as un resultado positivo. La Lnea C deber formarse
independientemente si hay o no presencia de la droga a examinar.
Tetrahidrocanabinol (THC, -9-THC, -1-THC), es el ms activo de los principales
componentes, as como el principal metabolito de canabinides, tales como marihuana y
hashish.
Los canabinides se han utilizado como un depresivo del sistema nervioso central. La
sobredosis y el uso continuo de canabinides pueden llevar al abuso de la sustancia, lo cual
puede causar dao severo y/o permanente al sistema nervioso humano. La deteccin de
THC en orina humana ha sido mayormente utilizado para encontrar el abuso de
canabinides.
CONCLUSIONES
Se realizaron extracciones (etrea cida, etrea bsica y clorofrmica) para la extraccin de
alcaloides en una muestra de orina, la extraccin etrea bsica da una mayor cantidad de
alcaloides ya que el pH bsico permite que los alcaloides dejen su forma de sales y pasen a
su forma bsica, la cual es completamente soluble en solventes orgnicos. Esta extraccin
se diferencia de la extraccin clorofrmica que tambin se encuentra a pH bsico ya que el
ter es menos polar que el cloroformo, las bases de los alcaloides se disuelven mejor en
solventes que son menos polares.
Las pruebas presuntivas no arrojaron resultados concluyentes ya que en general estas
dependen de la apreciacin de los colores de los individuos que evalen las pruebas. Para
ello se realiz la prueba de Mandelin pudiendo determinar parcialmente, la presencia de
algunos alcaloides, pero se debe tomar en cuenta que esto no demuestra la presencia
como tal de alcaloides ya que pudiera haber otras sustancias que interfieran con el
resultado. Para ello se realiz la prueba de inmunoensayo la cual confirm la presencia de
THC, resultando lgico debido al tratamiento (infusin) que se le dio a la muestra.
REFERENCIAS
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laboratorio, Eudeba. Espaa. Pp. 78-82
* Kukinskli.C. (2000) Farmacognosia, estudio de las drogas y sustancias medicamentosas
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* BARRIETO, D.(2010).Alcaloides.Universidad Nacional Federico. Villareal. Lima, Per.
* DREISBACH, R. 2003. Manual de toxicologa clnica de Dreisbach:prevencin,
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Trujillo. Per.
* LOOMIS, T. (1993.) Fundamentos de toxicologa. Espaa:Acrivia.