UNIDADE 3: CINTICA DE REAES CATALISADAS POR

ENZIMAS

3.1 Cintica enzimtica

Nas unidades anteriores vimos que a clula constituda por
centenas de compostos qumicos. Para entender melhor a
complexidade das transformaes qumicas que ocorrem nos
seres vivos imprescindvel conhecer a essncia do processo
altamente especfico, controlado e eficiente das clulas
catalisado por enzimas. As enzimas so protenas globulares
com massa molecular variando entre 15.000 e vrios milhes
de

Daltons.

A poluio

exacerbadamente

devido

do

ambiente
liberao

est

crescendo

indiscriminada

de

substncias perigosas na biosfera pela ao antropognica.

Muitos

esforos

de

pesquisa

tm

sido

dedicados

ao

desenvolvimento tecnologias de remediao novas, de baixo

custo e eco-amigveis. Nos ltimos 15 anos a tecnologia vem
recebendo crescente ateno como uma alternativa s
tecnologias tradicionais. Nesta unidade sero abordados os
princpios catalticos bsicos que regem as reaes qumicas
nas clulas e de sua utilizao fora das mesmas.

3.2 As enzimas como catalisadores qumicos

De um modo geral, as enzimas so definidas como sendo
estruturas proteicas, formadas por sequncias de aminocidos
1

(vide seo 2.3 na Unidade 2) e que tm a funo de catalisar

(acelerar) reaes bioqumicas.
O aprofundamento do estudo de enzimas foi iniciado em 1897
quando, pela primeira vez, Bchner extraiu enzimas ativas de
clulas vivas. Seu trabalho proporcionou duas grandes
contribuies:
1. Mostrou que a catlise por meio de organismos vivos
poderia funcionar independentemente de qualquer
processo vivo;
2. Iniciou esforos para isolar e purificar enzimas
individuais.

A partir dessa descoberta, o nmero de enzimas conhecidas

tem aumentado rapidamente e atualmente o total excede
8.000. A Figura 3.1 mostra a ampla e crescente identificao e
caracterizao de novas enzimas.
Na maioria dos casos, a nomenclatura enzimtica realizada
adicionando-se o sufixo (-ase) ao nome do substrato, por
exemplo, a urease, uma enzima que catalisa a decomposio
da ureia em dixido de carbono e amnia. No entanto, existem
excees a esta nomenclatura como as enzimas pepsina e
tripsina presentes no trato digestivo humano.

20 20 20 20 20 20 20
01 03 05 07 09 11 13

N de Enzimas

1940
1618
1267
1115

3527
3029

5127
4582

8919
8154
7611
6912
6056

Figura 3.1. Aumento na descoberta de enzimas ao longo dos

anos. Fonte: http://www.metacyc.org/release-notes.shtml#2013.
Embora

esta

terminologia

(-ase)

tenha

simplificado

nomenclatura enzimtica, a grande quantidade de novas

enzimas levou necessidade da criao de um sistema de
diviso para os diferentes tipos de enzimas. Elas esto dividas
em seis classes principais, de acordo com o tipo de reao
qumica que catalisam.
Tal nomenclatura foi definida em 1961, por uma comisso
especializada, a Enzyme Commission (EC), que pertence
Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular
(International Union of Biochemistry and Molecular Biology,
IUBMB). Cada enzima recebe ento uma nomenclatura no
formato EC X.Y.W.Z por esta razo. A Comisso de
Nomenclatura da IUBMB (NC-IUBMB) a atual responsvel
pela nomenclatura de molculas e processos relacionados
3

Bioqumica e Biologia Molecular. A Tabela 3.1 relaciona os

diferentes grupos em que so classificadas as enzimas.
Tabela 3.1: Sistema de classificao resumido das principais
enzimas segundo a Comisso de Enzimas (EC).
1. Oxido-redutases (reaes de oxidao-reduo ou
transferncia de eltrons)
Desidrogenases e Oxidases)
1.1.atuando em CH-OH
1.2.atuando em C=O
1.3.atuando em CH-CH
1.4.atuando em CH-NH2
1.5.atuando em CH-NH1.6.atuando em NADH, NADPH
2.Transferases (transferem grupos funcionais como
amina,

fosfato,

acil,

carboxil

Quinases

Transaminases)
2.1.grupos com um carbono
2.2.grupos aldedo ou cetona
2.3.grupos acil
2.4.grupos glicosil
2.7.grupos fosfatos
2.8.grupos contendo enxofre
3.Hidrolases (reaes de hidrlise de ligao covalente)
3.1.steres
3.2.ligaes glicosdicas
3.4.ligaes peptdicas
3.5.ligaes C-N no peptdicas

3.6.anidridos cidos
4.Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e a
remoo de molculas de gua, amnia e gs carbnico
Dehidratases e Descarboxilases)
4.1. =C=C=
4.2. =C=O
4.3. =C=N5.Isomerases (reaes de interconverso entre ismeros
ticos ou geomtricos)
5.1.racemases e epimerases
6.Ligases (catalisam reaes de formao de novas
molculas a partir da ligao entre duas pr-existentes,
sempre s custas de energia - Sintetases)
6.1. C-O
6.2. C-S
6.3. C-N
6.4. C-C
Como pode ser visto na Tabela 3.1, cada classe divide-se, por
sua vez, em subclasses, tambm numeradas. As subclasses
definem em que tipo de grupo as enzimas atuam. Por exemplo,
um determinado grupo de enzimas pode pertencer subclasse
EC 2.1, que engloba "enzimas que transferem grupos
funcionais contendo um carbono". As subclasses dividem-se
ainda em sub-subclasses; continuando com o mesmo exemplo,
existe a classe EC 2.1.1, que engloba as metiltransferases, ou
seja, enzimas que transferem um grupo metila. Finalmente,
cada enzima recebe um quarto dgito especfico reao que
catalisa, como por exemplo EC 2.1.1.1 (nicotinamida N5

metiltransferase), que cataliza a reao nicotinamida em Nmetilnicotinamida.

Um catalisador uma substncia que aumenta a velocidade
das reaes sem passar por mudanas qumicas permanentes,
ou seja, sem afetar o equilbrio da reao (Figura 3.1). As
concentraes de equilbrio podem ser calculadas usando
somente

propriedades

termodinmicas

de

reagentes

produtos, mtodo este que ser detalhado na Unidade 4.

Para

projetar

analisar

sistemas

reativos

de

forma

racionalizada, visando aplicaes prticas, se faz necessria a

utilizao de uma equao matemtica que relacione a
velocidade da reao com a composio, temperatura e
presso da mistura reacional.

Figura 3.1. Por meio da diminuio da energia de ativao (Ea),

um catalisador pode tornar possvel a reao de um substrato
com molculas de pouca energia interna de forma a manter
constante o G.
Existem dois tipos de catalisadores, os sintticos e os
biolgicos (enzimas). As semelhanas entre catalisadores
6

sintticos e enzimas vo alm do uso de tcnicas comuns para

a modelagem das reaes cinticas. As expresses de
velocidade de reao obtidas para os dois tipos so muito
similares ou, em alguns casos, idnticas. Isto acontece porque,
em ambos os casos, as molculas de reagente formam uma
espcie de complexo com o catalisador, seja ele sinttico ou
biolgico.
importante lembrar tambm as diferenas entre enzimas e
catalisadores sintticos. Alguns catalisadores sintticos no
so

especficos,

podendo

catalisar

reaes

similares

envolvendo diferentes tipos de reagentes. Apesar de algumas

enzimas no serem muito especficas, a maioria delas catalisa
somente uma reao envolvendo um substrato determinado.
Substrato todo composto qumico que submetido uma
reao catalisada, ou seja, o composto em que a enzima age
diretamente

transformando-o

em

produto

da

reao.

Geralmente, o grau de especificidade de uma enzima est

relacionado sua funo biolgica.
Outra caracterstica peculiar das enzimas a frequente
necessidade de cofatores acoplados a elas para que haja a
catlise. Um cofator um composto no proteico que se
combina com protenas inativas (apoenzimas) para formar um
complexo cataliticamente ativo (holoenzima). Como ilustrado
na Figura 3.2. Existem duas variedades distintas de cofatores:
os ons metlicos (listados na Tabela 3.2) e as coenzimas.
Estas

ltimas

normalmente

so

molculas

orgnicas

complexas, como NAD, FAD, CoA (coenzima A).

Figura 3.2. Enzima inativa (apoenzima) se une ao cofator noproteico formando um complexo cataliticamente ativo chamado
holoenzima.
Um exemplo ilustrativo da participao de cofatores o caso
que envolve a enzima glicose isomerase do Bacillus coagulans
que requer o cofator cobalto para sua atividade mxima na
isomerizao de glicose em frutose. J a glicose isomerase de
outros organismos pode catalisar essa mesma reao sem a
presena de cobalto (vide Tabela 3.2). importante citar que
enzimas com o mesmo nome, mas obtidas de diferentes
microrganismos tem, frequentemente, diferentes sequncias de
aminocidos (estrutura primria) e apresentam propriedades e
atividades catalticas diferentes.
Tabela 3.2: Algumas enzimas que contm ou requerem ons
metlicos como cofatores.
Cofator
Ca2+

Enzima
-amilase (pncreas porcino), colagenase, lipase e
nuclease

Co2+

Glicose

isomerase

(Bacillus

coagulans)

(precisa

2+

Cu2+(Cu+)
Fe2+ ou Fe3+
Mg2+
Mn2+
Na+
Zn

2+

tambm de Mg )
Galactose oxidase, Tirosinase
Catalase, Citocromos e Peroxidase
Desoxirribonuclease (pncreas bovino)
Arginase
ATPase da membrana plasmtica (tambm precisa de
K+ e Mg2+)
lcool
desidrogenase,

fosfatase

alcalina

carboxipeptidase

Observa-se frequentemente que as enzimas so mais ativas

que os catalisadores no-biolgicos. Em temperatura ambiente,
as enzimas possuem maior atividade, sendo capazes de
catalisar reaes mais rapidamente do que a maioria dos
catalisadores artificiais. Quando a temperatura da reao
aumentada, no entanto, catalisadores sintticos podem se
tornar to ativos quanto s enzimas. temperaturas maiores
ou iguais a 50C, salvo algumas excees, a maioria das
enzimas apresenta uma atividade baixa ou nula.

3.3 Complexo enzima-substrato e mecanismos de reao

A existncia de um complexo enzima-substrato durante uma
reao enzimtica tem sido demonstrada por meio de
investigaes cientficas experimentais envolvendo tcnicas
analticas

sofisticadas

como

cristalografia

de

raios-X,

espectroscopia, entre outras. A molcula de substrato se liga a

uma regio especfica da enzima denominada de stio ativo
(vide Figura 3.3), onde, por meio de interaes moleculares

complexas, a molcula de substrato com baixa energia de

ativao (Ea) consegue se transformar em produto.
O complexo formado quando o substrato se encaixa com a
enzima pelo mecanismo de ajuste induzido, em que a enzima
altera ligeiramente sua conformao a medida que o substrato
se liga a ela. Ligaes de hidrognio so formadas entre o
substrato e grupos amplamente separados na cadeia de
aminocidos da enzima. Os grupos reativos encontrados em
enzimas incluem o grupo R, Asp, Cys, Glu, His, Lys, Met, Ser,
Thr e as funes terminais amino e carboxil.

10

Figura 3.3. Representao da regio do stio ativo da enzima

acetilcolinesterase representada pelo contorno. O substrato
(acetilcolina) interage com o stio ativo para formar o complexo
enzima-substrato e, a seguir, os produtos colina e acetato.
As enzimas podem ter mais de um stio ativo. Muitos dos
aminocidos remanescentes determinam os dobramentos ao
11

longo da cadeia (estrutura secundria) e a disposio de uma

parte de um dobramento da cadeia prximo a outro (estrutura
terciria).
Sabe-se que para algumas enzimas a ligao com o substrato
determina a sua forma. Estudos da estrutura tridimensional das
enzimas lisozima e carboxipeptidase-A, com e sem substratos,
mostraram uma mudana na conformao enzimtica aps a
ligao do substrato, da o nome mecanismo do ajuste
induzido. O ajuste induzido ocorre sobre a influncia da ligao
do substrato com a estrutura enzimtica, possibilitando que a
induo do substrato mude a configurao do stio ativo.

3.4 Cintica enzimtica simples com um substrato.

Partindo-se da reao: S P, onde S o substrato e P o
produto, a velocidade da reao V, em um determinado perodo
de tempo t, definida por:

V=

-dS dP
=
dt
dt
(1)

A unidade de V dada em mols por unidade de volume por

tempo (mol (volume tempo)-1). A velocidade da reao uma
quantidade de produto formado ou substrato consumido em
cada ponto ao longo do tempo da mistura reacional. Por essa
razo os estudos experimentais de cintica normalmente so
12

realizados

em

reatores

bem

misturados

visando

uma

concentrao uniforme de substrato, enzima e produto durante

a reao.
Um experimento tpico para medir a cintica enzimtica pode
ser o seguinte: no tempo zero, solues do substrato e de uma
enzima purificada apropriada so misturados em recipiente
fechado isotrmico (reator agitado) contendo uma soluo
tampo para controlar o pH. O substrato e/ou a concentrao
dos produtos so monitorados em vrios intervalos de tempo.
Frequentemente, na obteno de dados de cintica enzimtica,
utiliza-se medidas de velocidade inicial de reao. Isso
significa que uma vez conhecidas as condies da reao,
incluindo as concentraes de enzima e substrato no tempo
zero (t=0), a inclinao inicial (ou velocidade inicial) da curva de
concentrao de substrato ou produto em funo estimada
pelos dados:

dP
dS

V t 0
dt t 0
dt t 0

(2)

Na gerao de dados cinticos, normalmente a quantidade de

catalisador enzimtico dada em termos de unidades de
atividade cataltica e no como massa ou moles. Unidades de
atividade cataltica representam a quantidade de enzima que
gera certa quantidade de atividade cataltica sob uma srie de
condies padronizadas (temperatura, pH, fora inica, etc.) de

13

uma enzima em particular. Como por exemplo, a hidrlise do

amido, em que uma unidade da enzima glicoamilase definida
como a quantidade de enzima que produz 1mol de glicose por
minuto, numa soluo com 4% de amido, a pH 4,5 e 60 C.

3.4.1 A Cintica de Michaelis-Menten

Imagine-se como um engenheiro precisando de informaes
cinticas de uma reao enzimtica para poder projetar um
sistema de tratamento de um efluente industrial contendo
componentes (substratos) que podem ser degradados por
enzimas disponveis comercialmente (ex: lacases) a custos
baixos. As informaes cinticas, como comumente acontece
na prtica, estariam dadas como se mostra na Figura 3.4.
Quais seriam suas primeiras dedues com relao :
1. Velocidade de reao (V) baixas concentraes de
substrato. V aumenta quase linearmente com o aumento de S?
2. Velocidade de reao (V) altas concentraes de
substrato. V aumenta com S ou aproximadamente constante?
3. Como varia a velocidade com o aumento da concentrao
de enzima? V constante ou aumenta proporcionalmente?

14

Figura 3.4. Dados cinticos para reaes catalisadas por

enzimas. (a) A concentrao de enzima tomada como
constante quando se estuda a dependncia da concentrao
de substrato. (b) A concentrao de substrato mantida
constante para investigao da influncia da concentrao de
enzima.
Perguntas como essas foram respondidas pelo fsico-qumico
francs Victor Henri, em 1902, que props a seguinte equao
para a velocidade:

Vmax S
Km S

(3)

onde:

V max = E0

(4)

Embora Henri tenha dado uma explicao terica usando

mecanismos hipotticos de reao, Michaelis e Menten
15

propuseram outra equao para a velocidade de reaes.

Como ponto de partida, assumiu-se que a enzima E e o
substrato S se combinavam para formar o complexo ES, que
se dissociava a seguir para formar um produto P e liberar uma

enzima E:

k1
S + E ES
k 1

(5)

k2
ES
P+ E

(6)

Henri, Michaelis e Menten assumiram que a primeira reao

um equilbrio que, em conjunto com a lei de ao das massas
para a cintica de eventos moleculares d:

Km

k 1 S E

k1
ES

Constante de dissociao

(7)

onde S, E, ES so as concentraes de substrato, enzima e

complexo respectivamente.
A reao de dissociao do complexo ES para produzir enzima
livre lenta e irreversvel, portanto, a velocidade da reao
dP/dt pode ser expressa assim:

V=

dP
=k 2 ES
dt

(8)

Temos que: E0 = E + ES, onde:

16

E0 = concentrao total de enzima (inicial)

E = concentrao de enzima livre
ES = concentrao de enzima complexada

Km

k 1 S E

k1
ES Henri, Michaelis e Menten assumiram que a

primeira reao (equao 5) um equilbrio que, em conjunto

com a lei de ao das massas para a cintica de eventos
moleculares, resulta em:
(9)

ES

E S
Km

De onde pode-se obter ES:

(10)

Dividindo a equao 8 pela quantidade total de enzima Eo = E

+ ES obtem-se:

V
k ES
2
E o E ES
(11)
onde:
Eo = concentrao total de enzima (ou inicial)
E = concentrao de enzima livre
ES = concentrao de enzima complexada

17

E S
V
Km

E
S
Eo
E
K m Substituindo a equao 10 na equao 11
k2

elimina-se ES e a equao resultante fica apenas funo de S:

(12)
Que ao ser simplificada resulta em:

V
k2 S

Eo
Km S
(13)
ou, melhor ainda:

V Vmax

S
Km S
(14)

Onde Vmax= k2.Eo= Velocidade mxima da reao

Km = constante de Michaelis Menten
Esta a equao de Michaelis-Menten, que corrrelaciona a
velocidade de reao com a concentrao de substrato. Este
modelo cintico seguido por muitas reaos enzimticas. Ao
mesmo tempo em que a equao de Michaelis-Menten
descreve

com

sucesso

cintica

de

muitas

reaes

catalisadas por enzimas, ela no universalmente vlida.

Existem outras variantes que sero discutidas mais adiante.

18

Com a expresso da velocidade de Michaelis-Menten, o tempo

de reao pode agora ser determinado analiticamente por
integrao de:

V S
dS
max
dt
Km S

(15)

com S(0) = S0
para se obter:

V max t=S 0S+ K m ln

( SS )
0

(16)

Esta expresso permite o clculo da concentrao de substrato

ao longo do tempo.
3.4.2 Avaliao de Parmetros da Equao de MichaelisMenten
A equao de Michaelis-Menten na sua forma original no
muito apropriada para estimar os parmetros cinticos V max e
Km.
Pelo rearranjo da equao (3), pode-se ter:
K
1
1
1

m
V Vmax Vmax S

(Lineweaver-Burk)

(17)

K
S
1 1
m

V Vmax Vmax S

(Hanes-Woolf)

(18)

19

V Vm ax K m

V
S

(Eadie-Hofstee)

(19)

Cada equao sugere uma representao linear apropriada.

Plotando as variveis da equao (17) como 1/V em funo de
1/S se obtm uma linha reta que permite o clculo fcil de K m e
de Vmax a partir do coeficiente linear e do coeficiente angular,
respectivamente. Este procedimento conhecido como mtodo
dos inversos ou de Lineweaver-Burk. De forma semelhante, a
equao 12 representa a linearizao de Hanes-Woolf, tendo
como variveis S/V em funo de 1/S. Os valores de V max e de
Km podem ser calculados a partir do coeficiente angular e do
coeficiente linear, respectivamente. Finalmente, a equao 13
representa a linearizao de Eadie-Hofstee, que correlaciona
as variveis V com V/S. O valor de Vmax e de Km podem ser
calculados a partir do coeficiente angular e do intercepto,
respectivamente.
Para o computo de valores de V max e Km confiveis por qualquer
um dos trs mtodos descritos recomenda-se a utilizao de
ajuste por mnimos quadrados. A experincia mostra que cada
mtodo

fornece

valores

diferentes

desses

parmetros

cinticos. Na Figura 3.5 so apresentados os trs tipos de

grficos que podem ser obtidos atravs da linearizao de
Michaelis-Menten.

20

Figura 3.5: Mtodos de linearizao. (a) Lineweaver-Burk, (b)

Hanes-Wolf e (c) Eadie-Hofstee.

3.5 Modulao e regulagem da atividade enzimtica

Outras espcies qumicas alm do substrato podem combinarse enzimas para alterar ou ajustar sua atividade cataltica.
Estas substncias, chamadas moduladores ou efetores, podem
ser constituintes naturais da clula. Em outros casos, eles

21

encontram-se no ambiente celular ou agem em enzimas

isoladas no laboratrio.
A combinao de uma enzima com um modulador uma
reao qumica propriamente dita e pode ser totalmente
reversvel, parcialmente reversvel ou totalmente irreversvel.
Um exemplo conhecido de substncia txica que atua como
inibidor irreversvel o on cianeto, que desativa a xantinaoxidase. Se o inibidor age irreversivelmente, a cintica de
Michaelis-Menten, que se assemelha cintica influenciada
pelo inibidor, no pode ser usada, visto que este mtodo
assume equilbrio entre as formas livre e complexa.
A modulao reversvel da atividade enzimtica um
mecanismo de controle empregado pela clula para conseguir
um uso mais eficiente dos nutrientes. Um exemplo de
regulagem enzimtica envolve cadeias interconectadas de
reaes com vrios laos de controle, tais como mostrado na
Figura 3.6. Nesse exemplo, a regulagem da sequncia
conseguida por meio de uma inibio por retroalimentao: o
produto final, L-isoleucina, inibe a atividade da primeira enzima
da sequncia. Assim, quando a concentrao desse produto
final atinge um valor satisfatrio, o processo de biossntese
cessa.
Visto que as reaes catalisadas pelas enzimas E2 at E5
esto essencialmente em equilbrio e a primeira reao
irreversvel sob condies celulares, a resposta para este
sistema de controle especialmente rpida. Por exemplo, se Lisoleucina esgotada por seu uso em sntese de protenas na
22

clula, a inibio da enzima E 1 deve ser rapidamente reduzida

de maneira que o estoque requerido do aminocido seja
renovado.

Figura 3.6. Neste sistema de inibio retroativa, a atividade da

enzima E1 (L-treonina deaminase) reduzida pela presena do
produto final, L-isoleucina.

Os inibidores podem ser classificados por sua influncia nos

parmetros Vmax e Km da equao de Michaelis-Menten:
1. Competitivos: sua presena aumenta o valor de Km, mas no
altera vmax. O efeito de tais inibidores pode ser revertido pelo
aumento da concentrao do substrato.
2. No-competitivos: Diminui o valor do Vmax, mas no altera o
valor de Km, devolvendo a atividade enzima ou ao
complexo

enzima-substrato

inativos.

Inibidores

no-

23

competitivos comuns so ons de metais pesados, os quais

se combinam reversivelmente com o grupo sulfdrico (-SH)
dos

resduos

de

cistena.

A Figura

3.7

mostra

representao esquemtica da inibio competitiva e no

competitiva.

Figura 3.7. Tipos de inibio. (a) Competitiva, (b) No

competitiva.
Na Tabela 3.3 demonstrada a classificao de alguns
inibidores reversveis assim como sua influncia nos valores de
Km e Vmax.

Tabela 3.3. Classificao simplificada de inibidores reversveis

24

Ia

Ib

IIa

IIb

Tipo

Descrio

Resultado

Totalmente

Inibidor adsorve no stio de ligao do

Aumento no valor

competitivo

substrato

aparente de Km

Parcialmente
competitivo

No-competitivo

Inibidor e substrato combinam com

diferentes grupos; ligao do inibidor
afeta ligao do substrato.
Ligao do inibidor no afeta a afinidade
ES, mas o complexo ternrio EIS no se
decompe em produtos.
O mesmo que IIa, exceto que EIS se

No-competitivo

decompe em produto a uma velocidade

finita diferente de ES

III

Inibidor misto

Aumento no valor
aparente de Km
No muda Km,
diminui Vmax
No muda Km,
diminui Vmax
Afeta Km e Vmax

3.5.1 Mecanismos de modulao enzimtica reversvel

Muitos

inibidores

competitivos

conhecidos,

chamados

substratos anlogos, carregam afinidades aos substratos

normais. Deste modo, pensa-se que estes inibidores tm a
adequao molecular para modificar o stio ativo da enzima,
mas essa modulao no completamente efetiva, de modo
que no resulta em uma reao qumica. Por exemplo,
considere a inibio da desidrogenao do cido succnico pelo
cido malnico:

25

O cido malnico pode complexar com desidrogenase

succnica, mas no reage.
Outro mecanismo importante no metabolismo celular, chamado
controle alostrico, revela a ao tpica de inibio nocompetitiva e considerado o mecanismo dominante para a
ativao e a inibio no-competitivas. O nome alostrico (que
significa outra forma) foi originalmente inventado para este
mecanismo

porque

muitos

moduladores

da

atividade

enzimtica tm estruturas diferentes do substrato.

Deste fato conclui-se que moduladores se ligam a stios
regulatrios especficos, distintos dos stios que catalisam
reaes no substrato. Uma enzima que detm stios que
modulam to bem quanto catalisam chamada de enzima
alostrica. Como mostra a Figura 3.8, o controle alostrico
pode tambm ativar ou inibir a atividade cataltica da enzima.

26

Figura 3. 8. Na simetria do modelo para controle alostrico da

atividade da enzima, a ligao de um ativador A e substrato S
resulta numa enzima cataliticamente ativa de configurao R.
Por outro lado, a ligao de um inibidor muda as subunidades
na protena oligomrica para uma configurao T inativa.

3.5.2 Anlise do efeito modulador reversvel em cintica

enzimtica.
Uma grande contribuio da aproximao de Michaelis-Menten
para a cintica enzimtica a contagem quantitativa da
influncia dos moduladores. Para comear a anlise, devemos
assumir que a sequncia seguinte aproxima-se razoavelmente
das interaes de um inibidor competitivo e de um substrato
com a enzima. Aqui E e S tm o significado usual, I denotado
como inibidor e EI um complexo enzima-inibidor.
Etapas da reao em equilbrio:

27

E+ S ES K s
E+ I EI K i
Etapa lenta: ES E+ P k

(20)
(21)
(22)

Neste caso, as ligaes do substrato e do inibidor enzima so

mutuamente exclusivas. As constantes Ks e Ki representam
constantes de dissociao. Devido ao fato de que uma parte
da enzima limitada no complexo EI, nem toda a enzima est
disponvel para catalisar a converso do substrato, de modo
que a velocidade da reao diminuda pelo inibidor.
Usando o equilbrio indicado nas equaes 20 e 21 e um
balano global de massa para a enzima, temos:

E+ ES+ EI =E 0

(23)

Podemos escrever a velocidade da reao em termos da

concentrao total de enzima (E0) e das concentraes do
substrato e do inibidor livres (S e I, respectivamente):
V

k E 0 S
S K s 1 I K i

(24)

Comparando isto com a forma original de Michaelis-Menten,

temos que Vmax no afetado, mas a constante aparente de
app

Michaelis ( K m ) afetada pela presena do inibidor competitivo:

K app
m K s 1
K i

(25)
28

Em outras palavras, a reduo da velocidade causada por um

inibidor competitivo pode ser completamente compensada
aumentando a concentrao do substrato, de forma que se
possa atingir a mxima velocidade possvel da reao, como se
o efeito do inibidor competitivo fosse anulado.
Podemos obter um modelo til para a inibio no-competitiva
pela adio das seguintes etapas de equilbrio 26 e 27 na
sequncia de reaes 20, 21 e 22:

EI + S EIS K s
ES+ I EIS K i

(26)
(27)

Nesta situao, inibidor e substrato podem simultaneamente

ligar-se enzima formando um complexo ternrio designado
EIS. Assumimos que a ligao do inibidor ou do substrato no
influencia a afinidade de quaisquer espcies para complexar
com a enzima.
Consequentemente, Ks e Ki so idnticos s constantes de
dissociao correspondentes nas equaes 20 e 21. Alm disso,
assume-se que o complexo EIS no reage para formar o
produto P.
Usando o procedimento de escrever as concentraes em
termos de Eo, S e I, obtemos a seguinte expresso de
velocidade:

29

S k E 0 1 I K i
S Ks

(28)

A constante de Michaelis no afetada, mas a velocidade de

reao mxima que pode ser obtida reduzida a:

Vmappax
Na

presena

de

um

kE
1 I Ki

inibidor

(29)
no-competitivo,

nenhuma

quantidade do substrato adicionado mistura reacional pode

chegar velocidade mxima de reao que possvel sem o
inibidor.
Inibies

competitivas

no-competitivas

so

de

fcil

diferenciao em coordenadas de Lineweaver-Burk. Na Tabela

3.4 so mencionadas as possibilidades dos efeitos de inibidores
na

cintica

enzimtica.

Em

uma

inibio

parcialmente

competitiva, o inibidor e o substrato combinam com diferentes

grupos da enzima, e o inibidor afeta a afinidade da enzima por
substrato. Este caso pode ser descrito pela adio sequncia
de reao nas equaes 20, 21 e 22 das seguintes reaes que
so assumidas.
Em estado de equilbrio:

EI + S EIS K is

(30)

ES+ I EIS K si

(31)
30

Etapa lenta: EIS EI + P k

(32)

Neste caso Kis=KsKsi/Ki

Tabela 3.4. Parmetros cinticos obtidos pelas coordenadas de
Lineweaver-Burk na presena de um inibidor.
Caso

Tipo

Ia

Competitivo

Ib
IIa
IIb
Ib e IIa

Coeficiente linear Coeficiente angular

V max

Parcialmente

competitivo

V max
1+ I / K i
V max
1+ I / K i

No-competitivo
Parcialmente
competitivo
Misto

1
K s ( 1+ I / K i )
1+ I K s / K i K is
K s ( 1+ I / K i )
1
Ks

V max +k Eo /K i
1+ I K s / K i K s
V max

1
Ks
1+ I K s / K i K is
K s ( 1+ I / K i )

Em outra situao de inibio no-competitiva (caso IIb), o

exemplo acima, reao (20, 21, 22,26 e 27) alterada para
obter o valor da formao do produto pelo complexo EIS:

EIS EI + P k i

(33)

Um modelo de inibidor misto que combina inibio competitiva

pura com parcialmente competitiva obtido pelo cancelamento
da reao anterior (32) do modelo de competio parcial. O
resultado de todos estes casos pode ser escrito na forma de
Michaelis-Menten:

31

Vmappax S
S K app
m

(34)

app
app
Com parmetros aparentes Vmax e K max que dependem da

concentrao do inibidor, dos diferentes equilbrios e dos

parmetros de velocidade da reao como pode ser visto na
Tabela 3.4.
Um exemplo de ativao enzimtica por um modulador pode ser
descrita no caso IIb, no qual k i maior do que k (ou k2) .
Fisicamente, isto indica que o substrato complexado EI reage
para formar produtos mais rapidamente que o complexo ES.
Assim, I funciona como ativador da enzima.
A Figura 3.9 mostra esquematicamente como vrios tipos de
inibio afetam os grficos de dados cinticos.

32

Figura 3.9. Efeitos de vrios tipos de inibio em diferentes

grficos de velocidade de reao. De cima para baixo: na
primeira fila so apresentados os grficos de Michaelis-Menten;
na segunda os de Lineweaver-Burk, na terceira de Hanes-Woolf
e na quarta de Eadie-Hofstee.

3.6 Influncias de outros fatores na atividade enzimtica

33

Muitos outros fatores podem influenciar a atividade cataltica das

enzimas, provavelmente por afetarem o estado estrutural ou
qumico da enzima. Como fatores mais importantes esto:
1. pH;
2. Temperatura;
3. Foras no fluido (ex: foras hidrodinmicas, presso
hidrosttica e tenso interfacial);
4. Agentes qumicos (ex:lcool, ureia e perxido de hidrognio);
5. Irradiao (ex: luz, som e radiao ionizante).
Devido maior importncia, somente sero discutidos a seguir
de forma mais detalhada os itens 1 e 2.

3.6.1 O efeito do pH
As protenas, como visto anteriormente no item 2.3 da Unidade
2, so construdas a partir de aminocidos. Estas estruturas
bioqumicas possuem grupos bsicos, neutros e cidos.
Consequentemente, a enzima intacta pode conter ambos os
grupos carregados positiva ou negativamente a um dado pH.
Deste modo, grupos ionizveis so, muitas vezes, parte do stio
ativo, visto que a ao cataltica de cidos e bases est ligada a
vrios mecanismos enzimticos. Alm disso, variaes do pH
podem alterar a estrutura tridimensional das enzimas.

34

Por essas razes, as enzimas so ativas somente dentro de

uma certa faixa de pH. O pH do meio pode afetar a velocidade
mxima da reao, Vmax, e a estabilidade da enzima. Os efeitos
do pH na constante Km so normalmente insignificantes. Em
alguns casos, o substrato pode conter grupos inicos, e o pH do
meio influencia a afinidade do substrato com a enzima.
Convm lembrar que a previso do pH timo de uma enzima
requer o conhecimento das caractersticas dos seus stios
ativos, o que muito difcil de se obter. Assim, a determinao
do pH timo feita de maneira experimental, como mostra a
Figura 3.10.

Figura 3.10: Dependncia entre atividade e pH para a enzima

glicose-6-fosfatase. Em pHs abaixo de 6,0 e acima de 9,0 a
enzima se torna inativa.

3.6.2 O efeito da temperatura

35

A velocidade das reaes catalisadas por enzimas cresce at

um certo limite. Acima de uma determinada temperatura, a
atividade da enzima diminui devido sua desnaturao. A
Figura 3.11 mostra a variao da atividade de uma enzima com
a temperatura, mostrando um ponto timo de operao. A parte
ascendente da curva conhecida como ativao pela
temperatura, ou ativao trmica. Nesta regio, a velocidade da
reao varia de acordo com a equao de Arrhenius (25.b):

V =k 2 E

(25 a)

k 2= A eE / RT

(25 b)

onde Ea a energia de ativao (kcal/mol), A o fator de

frequncia e R a constante dos gases e T a temperatura
absoluta. Um grfico de ln(V) em funo de 1/T resulta numa
reta de inclinao Ea/R.

36

Figura 3.11. Efeito da temperatura na atividade de uma enzima.

A parte ascendente da curva corresponde a ativao trmica. A
parte descendente da curva devida a desnaturao causada
pelo aumento da temperatura.
A parte descendente da curva da Figura 3.11 conhecida como
desativao pela temperatura ou desnaturao trmica. A
cintica da desnaturao trmica pode ser expressa por:

d [ E ]
=k d E
dt

[ E ] =[ E0 ] ek

(26 a)ou

(26 b)

onde kd a constante de desnaturao pela temperatura. Este

parmetro tambm varia com a temperatura de acordo com a
equao de Arrhenius:
E d / RT

kd = Ad e

(27)

Ed = energia de desativao da enzima (kcal/mol)

Consequentemente, V varia com a temperatura assim:

V = A eE / RT E 0 ek t
a

(28)

As energias de ativao de reaes catalisadas por enzimas

situam-se, geralmente, entre 4 a 20 kcal/mol. As energias de
desativao Ed variam entre 40 e 130 kcal/mol (a maioria ao
redor de 70 kcal/mol). A desnaturao de uma enzima pela
temperatura muito mais rpida que sua ativao, um
aumento na temperatura de 30 at 40 C pode resultar num
37

aumento de 1,8 vezes na atividade da enzima, mas tambm

pode causar um aumento de 41 vezes a desnaturao.

3.7 Estratgias para estabilizao das enzimas.

$Alm de tentar identificar enzimas que so mais estveis, h
muitos

mtodos

disponveis

para

melhoramento

da

estabilidade da enzima:
1. Adicionar compostos estabilizantes para a armazenagem;
1. Modificao qumica da protena solvel;
2. Imobilizao da protena fora ou dentro de um slido
insolvel ou matriz.
Aditivos qumicos que podem estabilizar as protenas incluem
substratos, solventes orgnicos e sais. Desde que o stio ativo
de uma enzima possa ser ao menos sua regio estvel, a
presena do substrato pode estabilizar a enzima segurando
algumas das protenas na forma de complexos enzimasubstrato.
Uma importante ferramenta em bioqumica proteica a
modificao qumica de protenas, que tambm aplicada com
sucesso para melhorar a estabilidade da enzima. Uma das
estratgias de modificao qumica envolve a adio ou
modificao de grupos R de certos resduos de aminocidos.

3.8 Imobilizao de enzimas

38

A restrio da mobilidade de uma enzima a um espao fixo

denominada imobilizao. Este processo oferece muitas
vantagens do ponto de vista tcnico-econmico, tais como a
reutilizao da enzima e eliminao dos processos de
recuperao

purificao

da

mesma.

Alm

disso,

imobilizao pode oferecer um ambiente mais adequado

atividade

da

enzima.

Pelo

fato

das

enzimas

serem

relativamente caras, a reutilizao delas pode ser crtica em

muitos processos.
Os principais mtodos de imobilizao de enzimas sero
descritos a seguir; na Figura 3.12 encontrada uma
representao de cada tipo de imobilizao. A escolha de um
ou outro mtodo depende basicamente do processo e suas
condies de operao, estrutura da enzima e custos.

39

Figura 3.12. Representao dos principais mtodos de

imobilizao de enzimas.

3.8.1 Imobilizao por aprisionamento

Consiste em confinar fisicamente a enzima num pequeno
espao. O aprisionamento em matrizes ou membranas,
incluindo o microencapsulamento, so dois exemplos desse
mtodo.

Para

isso,

geralmente

utilizam-se

materiais

polimricos, tais como alginato de clcio, gar, poliacrilamida

ou colgeno. Entretanto, algumas matrizes slidas como
carvo ativado, cermicas porosas e diatomitos tambm
podem ser utilizadas para esse fim.

3.8.2 Imobilizao por adsoro

Consiste na reteno das enzimas sobre uma superfcie de um
suporte por meio de foras relativamente fracas, tais como as
foras de van der Waals. Os stios ativos das enzimas so
muito pouco afetados e, portanto, a enzima imobilizada por
esse mtodo apresenta atividade praticamente igual enzima
livre. Entretanto, a dessoro indesejada da enzima um
problema frequente, principalmente na presena de foras
mecnicas externas (Exemplo: agitao).
Geralmente,

empregam-se

suportes

inorgnicos

como

adsorventes, entre eles alumina, slica, cermicas, bentonitas,

etc. Tambm so utilizados suportes orgnicos, como celulose,
40

carvo ativado e resinas de troca inica. As superfcies dos

suportes, sejam eles orgnicos ou inorgnicos, devem ser
tratadas adequadamente antes da imobilizao.

3.8.3 Imobilizao por ligao covalente

Este mtodo caracteriza-se pela reteno da enzima em um
suporte pela formao de ligaes covalentes (fortes). As
enzimas prendem-se aos suportes por meio de certos grupos
funcionais de sua estrutura (Exemplos: grupos amino; carboxil;
hidroxil ou sulfdrico). Estes grupos, por sua vez, no podem
estar localizados nos stios ativos da enzima. Os grupos
funcionais dos suportes geralmente so pr-ativados com
agentes qumicos (brometo de cianognio, carbodiimida,
glutaraldedo). Nesse tipo de imobilizao, o escape de enzima
reduzido. Entretanto, sua atividade diminuda em relao
forma livre.

3.9 Consideraes finais

Esta unidade permitiu o entendimento das enzimas como
catalisadores biolgicos. Verificou-se sua estrutura molecular
do stio ativo e como isto se reflete no seu desempenho como
catalisadores eficientes, especficos e versteis. Tambm foi
possvel estabelecer contato com os conceitos bsicos de
cintica enzimtica, obtendo-se a equao de MichaelisMenten e outras influenciadas por inibidores reversveis.
41

Identificou-se tambm os fatores mais importantes a serem

considerados

para

conseguir

uma

atividade

cataltica

otimizada, como temperatura, pH, foras de fluidos, etc. Esses

estudos estabelecem as bases de como um engenheiro
ambiental pode proceder na utilizao prtica racionalizada
desses catalisadores, seja na forma solvel, ou na forma
imobilizada.

3.10 Exerccios Resolvidos

1) A partir de um grfico dos inversos, ou grfico de
Lineweaver-Burk dever ser obtida uma reta de cujo coeficiente
linear e coeficiente angular, pode-se calcular os parmetros
cinticos Vmax e Km.
Tabela 1. Dados cinticos e sua transformao para clculo de
parmetros cinticos de Michaelis -Menten
V (molesL-1min-1) 106

S (molL-1)

1/V (Lminmol-1)

1/S (Lmol-1)

177

4,110-3

5649,71

243,90

173

9,510-4

5780,34

1052,63

125

5,210-4

8000

1923,07

106

1,0310-4

9433,96

9708,73

80

4,910-5

12500

20408,16

67

1,0610-5

14925,37

94339,62

43

5,110-6

23255,81

196078,43

42

A partir dos valores das ltimas duas colunas preparou-se o

grfico de Lineweaver-Burk e se calcularam os parmetros
cinticos atravs de uma regresso linear com os dados
dessas duas colunas. Os resultados esto mostrados no
grfico, a seguir:
25000
20000

f(x) = 0.08x + 7624.93

15000
1/v

10000
5000
0
0

50000 100000 150000 200000 250000

1/s

Da equao da reta obtida por regresso linear e apresentada

no grfico pode-se deduzir que:

1
K 1
1
m
V Vmax S Vmax

como

Y a X b

Vmax =1/b = 1/7624,93

Vmax = 1,3110-4 molesL-1min-1
- Coeficiente angular ou Km/Vmax = 0,080 min
- Km= 0,080 1,31 10-4 = 1,048 10-5 molesL-1

43

2) Um engenheiro ambiental recebeu um relatrio de

laboratrio sobre a presena de um pesticida na gua
consumida pela populao de uma regio suspeita de
contaminao. Sabendo que o pesticida suspeito inibe a
atividade de uma enzima conhecida, esta foi utilizada para
confirmar a presena do pesticida obtendo-se os resultados a
seguir:
S (molL-1)
3,310-4
510-4
6,710-4
1,6510-3
2,2110-3

V (molL-1min-1) 106
Sem inibidor
Com 10-5 M de inibidor
56
37
71
47
88
61
129
103
149
125

Note que o valor de velocidade inicial na tabela est

multiplicada por 106. Ou seja, para obter o valor de V tem que
se dividir o valor numrico da tabela por 106.
a) Seguindo os critrios de inibio do item 3.5.2 do material do
mdulo 3, utilize regresso linear para construir os grficos de
Lineweaver-Burk e descubra os valores dos parmetros de
Michaelis-Menten para a reao inibida e para a reao no
inibida.
b) De acordo com os valores obtidos com os parmetros diga
que tipo de inibio a mais provvel de ser provocada pelo
pesticida.
Tabela 1. Dados obtidos experimentalmente para comparao
da cintica com e sem inibidor e seus respectivos clculos de
inversos para elaborao dos grficos de Lineweaver-Burk.
44

V (molL-1min-1)

1/VSI

10
Com 10-5 M
-1
S (molL ) Sem inibidor
1/S (Lmol-1)
de inibidor
3,310-4
56
37
3030,30
510-4
71
47
2000
6,710-4
88
61
1492,53
1,6510-3
129
103
606,06
2,2110-3
149
125
452,48

1/VCI
-1

(Lminmol )
Sem inibidor

(Lminmol-1)
Com 10-5 M de

17857,14
14084,50
11363,63
7751,93
6711,40

inibidor
27027,02
21276,59
16393,44
9708,73
8000

Com os dados da Tabela 1 foram elaborados os grficos de

Lineweaver-Burk como se mostra no grfico a seguir:
30000
25000 f(x) = 7.46x + 5169.01
20000
Com inibidor
Linear (Com inibidor)
f(x) = 4.32x + 5003.35
15000
1/v
10000
5000
Sem inibidor
Linear (Sem inibidor)
0
0
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
1/S

Resposta: Pode-se observar neste grfico que as duas retas

coincidem no eixo de inverso da velocidade. Isto significa que
as duas reaes apresentam aproximadamente o mesmo valor
de Vmax. Como o coeficiente angular Km/vmax das duas retas
bem diferente significa que o valor de Km das duas reaes
diferente.
De acordo com o material o inibidor totalmente competitivo Ia
modifica o valor de Km e no altera o valor de Vmax. Pode-se
notar que o valor de Vmax o mesmo para a reao inibida e
45

no inibida e o Km diferente, o que caracteriza uma inibio

competitiva.

3.11 Estudos complementares

Para leitura adicional, consultar:
Bailey, J.

E.

Ollis,

D.

F.,

Biochemical

Engineering

Fundamentals, 2 ed., McGraw-Hill, New York, 1986.

Shuler, M. L. e Kargi, F. Bioprocess Engineering, Prentice Hall,
Englewood Cliffs, 1992.
Para exerccios didticos e visualizao de imagens:
http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/ener
gy_enzymes_catalysis/01q.html

46