El cultivo quimiostato como herramienta para estudios sobre

Transporte de azcar en Levaduras

Todas las levaduras conocidas actualmente son capaces de utilizar una o ms
azcares como fuente principal de carbono y energa (3-5). Muchas cepas de
levadura que se utilizan comnmente en los procesos biotecnolgicos han sido
obtenidos a partir de sus hbitats naturales con altas concentraciones de azcar,
en el que rpidamente se convierten los azcares disponibles a etanol. En estos
ecosistemas, la tasa de crecimiento de las levaduras como Saccharomyces
cerevisiae (levadura de panadera, levadura de cerveza) puede estar limitada por
la disponibilidad de nutrientes distintos de la fuente de carbono de azcar. En
tales condiciones, su competitividad no est determinada por afinidad por el
sustrato de azcar o de la eficiencia energtica de la utilizacin de azcar. Esto
se refleja en las caractersticas de sus sistemas de captacin de azcar, que
generalmente tienen un bastante pobre constante de saturacin del sustrato
para el sustrato de azcar: valores de Km son por lo general en el rango de 10-3
a 10-2 M. Sin embargo, al saturar las concentraciones de azcar, los flujos
glucolticas en estas levaduras pueden alcanzar valores muy altos. Las
levaduras Crabtree positivas, que incluyen S. cerevisiae, tienen una fuerte
tendencia a la fermentacin alcohlica. En estas levaduras, las altas tasas de
absorcin de azcar resultan en de la fermentacin alcohlica, incluso cuando el
oxgeno est presente en exceso (50, 79, 106). En los procesos modernos de
produccin a gran escala, por ejemplo, para la produccin de levadura de
panadera, protena unicelular, o protenas heterlogas, no se desea la
fermentacin alcohlica, ya que inhibe el crecimiento y reduce el rendimiento de
biomasa (49). En estos procesos, la fermentacin alcohlica se evita por la
alimentacin de azcar a los cultivos a una tasa baja en un modo de
alimentacin por lotes. Esto resulta en una baja concentracin de azcar en el
cultivo y, en consecuencia, en una baja tasa de absorcin de azcar. En estos
bajos ndices de aceptacin, el metabolismo del azcar es totalmente
respiratoria (79, 106). En consecuencia, altos rendimientos de biomasa se
obtienen y se evita la acumulacin de productos txicos.
Los altos valores de Km para el transporte de azcar que se encuentran
caractersticamente en cepas de S. cerevisiae no son tpicos de todas las
levaduras: muchas especies parecen estar bien equipado para el crecimiento a
bajas concentraciones de azcar y son capaces de sintetizar sistemas de
transporte con valores de Km de 10-5 menos de 10 'M. Transporte constituye el
primer paso en el metabolismo de una gran cantidad de azcares (una
excepcin notable es el metabolismo de algunos oligosacridos que son
hidrolizados fuera de la clula). Como tal, el transporte de azcar es probable
que tenga un impacto sustancial en la regulacin del flujo glucoltico en su
conjunto. A este respecto, se ha sugerido que la absorcin de azcar es un paso
limitante de la velocidad del gluclisis (24, 40, 56, 110). Debido a su impacto en
la ecologa y aplicaciones biotecnolgicas de levaduras, transporte de azcar por

las levaduras ha sido objeto de un gran nmero de estudios. La mayora de

estos se han realizado con muestras de cultivos de frasco de agitacin
cultivadas en la presencia de exceso de azcar. Desafortunadamente, estos
cultivos son sistemas modelo pobres, ya que presentan una serie de
inconvenientes inherentes a los estudios cuantitativos en el transporte de azcar
en levaduras. El objetivo de este trabajo es revisar la aplicabilidad de cultivo
quimiostato como una herramienta para los estudios sobre "aspectos
cuantitativos de transporte de azcar en levaduras. Particular atencin ser
"pagado a la relacin entre la cintica de transporte de azcar en suspensiones
celulares, como se determin en experimentos con azcares radiomarcados, y la
cintica de la utilizacin de azcar observado en cultivos en crecimiento.
MECANISMOS DEL TRANSPORTE DEL AZUCAR
Desde azcares son molculas altamente polares, la difusin libre a travs de la
bicapa lipdica de la membrana, probablemente, no contribuye significativamente
a su velocidad de entrada en la clula a concentraciones de azcar bajos (57).
Sin embargo, a altas concentraciones de azcar, como por ejemplo en el jugo de
uva, la difusin libre podra contribuir en cierta medida a la afluencia total de
azcar. sistemas de difusin facilitada, en la que la translocacin de la azcar
travs de la membrana est mediada por una protena de soporte, estn muy
extendidas entre levaduras (3, 4, 55). En el caso de la difusin facilitada, se
proporciona la fuerza motriz para la translocacin soluto exclusivamente por el
gradiente de concentracin del soluto sobre la membrana. Por lo tanto, la
absorcin de los azcares por difusin facilitada no requiere energa metablica.
Por lo tanto, la absorcin de los azcares por difusin facilitada no requiere
energa metablica. Puesto que la fuerza impulsora para la absorcin de azcar
se convierte en cero cuando las concentraciones de soluto internos y externos
son iguales, este proceso no permite la absorcin de azcares en contra de un
gradiente de concentracin.
En particular, durante el crecimiento en concentraciones muy bajas de azcar
extracelular, la acumulacin intracelular de azcares puede ser necesario para
permitir que las citoplasmticas quinasas de azcar y disacrido hidrolasas para
funcionar ptimamente. Esto se puede lograr mediante el acoplamiento de la
absorcin de una molcula de azcar a la absorcin de uno o ms protones a
travs de sistemas de protones symport. Por lo tanto, la fuerza motriz de
protones sobre la membrana de plasma se puede utilizar para conducir la
acumulacin intracelular de azcar. Esta fuerza motriz de protones se genera
principalmente por el complejo plasmamembrane H + -ATPasa, que acopla la
hidrlisis de ATP a ADP ms Pi a la translocacin hacia fuera de protones. En
muchas bacterias, la absorcin de azcar y la fosforilacin estn estrechamente
unidas. En los llamados sistemas de translocacin de grupo, no se produce el
azcar libre intracelular. Los primeros estudios sobre (desoxi) -glucosa
transporte en S. cerevisiae han indicado que cuando se aade azcar, azcarfosfato aparece ms rpido en la celda de glucosa libre lo hace, lo que sugiere
un mecanismo similar para el transporte de glucosa en levaduras. La aparicin
de un mecanismo de translocacin de grupo para la toma de azcares en

levaduras ha, sin embargo, ha sido motivo de controversia durante muchos

aos. Estudios recientes sobre la captacin de glucosa por S. cerevisiae han
demostrado que el azcar libre puede introducir directamente la clula, lo que
indica que el transportador de glucosa cataliza difusin de azcar libre facilitado.
Es probable que la fosforilacin masiva del azcar, que tambin se observa con
los tiempos de incubacin en el intervalo por debajo del segundo, es causada
por el exceso de actividad de azcar quinasa en la clula o por una asociacin
funcional del transportador con quinasas intracelulares de azcar como se
sugiri anteriormente.
METODOS USADOS EN LOS ESTUDIOS DE TRANSPORTE DE AZUCAR
Los estudios de transporte con azucares radiomarcados
El mtodo ms ampliamente aplicado para el estudio de la absorcin de los
azcares por las suspensiones de clulas de levadura es el uso de azcares
radiactivos (1 C- o marcada con 3H). Un problema inherente en los estudios de
transporte con clulas intactas es la interferencia con el metabolismo posterior.
Casi siempre, una disminucin significativa de la tasa de absorcin aparente se
observa dentro de 15 s despus de la adicin de azcar radiomarcado. Este
efecto es ms probablemente causado por la produccin de 14CO2 y la
liberacin de otros metabolitos marcados como el etanol y cidos orgnicos. En
la prctica, este problema se puede reducir mediante el uso de tiempos de
incubacin muy corto (5 a 10 s). Estudios recientes que implican tcnicas de flujo
se inactiv indican que en las clulas de S. cerevisiae galactosa-crecido
hambrientos, a 5 s captacin de hecho da una buena indicacin de la velocidad
de flujo inicial. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, por ejemplo, en presencia
de cianuro, el transporte ya estaba estabilizando despus de 0,2 s y mediciones
de flujo inicial se requieren tiempos de muestreo en la escala de tiempo por
debajo del segundo (118). Esto demuestra que el mtodo para medir la afluencia
mediante el mtodo 5-s debe utilizarse con cuidado y tiene que ser sustituido en
algunos casos por la tcnica de rpido enfriamiento.
La interferencia del metabolismo en estudios de captacin puede ser evitado por
el uso de anlogos de azcares no metabolizables, tales como anlogos de la
glucosa 6-desoxiglucosa (52, 90). El uso de estos compuestos slo puede
proporcionar informacin cualitativa, ya que los parmetros cinticos es probable
que sean diferentes de los de los sustratos naturales. Sin embargo, cuando se
incluyen controles adecuados, el uso de anlogos de azcares puede
proporcionar informacin importante sobre el mecanismo de captacin. Por
ejemplo, la absorcin de radiactivo 6-desoxiglucosa en contra de un gradiente de
concentracin puede ser considerado como un criterio fiable para la presencia
de un sistema de absorcin dependiente de la energa.
Un obstculo inherente para el transporte de los estudios con azcares
radiactivos es la unin no especfica del sustrato marcado a los componentes
celulares. De correccin para la unin no especfica es una necesidad, ya que,
especialmente en estudios de captacin de corto plazo, puede contribuir
significativamente a la radiactividad asociada a las clulas. Varios mtodos han

sido utilizados para determinar la contribucin de la unin a la cantidad total de

radiactividad retenida por las clulas. Estos se basan en la inactivacin de las
clulas (por ejemplo, por tratamiento trmico [96]) o en los experimentos de
control realizados a 0 C (10). Recientemente se demostr que la reduccin
significativa de la unin, al menos en S. cerevisiae, se logra mejor mediante el
lavado de las clulas a -5 C con una solucin que contiene azcar no radiactivo
500 mM. Otro inconveniente en estudios de transporte con azcares radiactivos
es la impureza qumica de muchos azcares radiomarcados. Por ejemplo, las
preparaciones comercialmente disponibles de D- maltosa [U-14C] pueden
contener hasta un 2% de glucosa. La adopcin de tales impurezas puede
contribuir en gran medida a la cantidad total de radiactividad que se transporta,
en particular cuando el Km para la captacin de la impureza es mucho menor
que la del azcar de inters.
LAS MEDICIONES DE FLUJO DE PROTONES
En el caso de los mecanismos de H + symport, transporte de azcar tambin se
puede determinar indirectamente por el uso de un electrodo sensible al pH para
medir la alcalinizacin de suspensiones de clulas dbilmente tamponadas con
la adicin de azcares (95). Una ventaja importante de este mtodo es que la
unin no especfica no interfiere con el ensayo de captacin. Una desventaja de
la medicin de los cambios de pH sugardependent es que estos ensayos no se
pueden realizar con los medios de crecimiento estndar, que por lo general se
han almacenado fuertemente. Adems, la interferencia del metabolismo con el
ensayo de transporte tambin puede ser problemtica ya que los movimientos
de protones pueden ser causados por diversos otros procesos metablicos, as,
como la actividad de ATPasa y la produccin de metabolitos cidos. Como se ha
mencionado anteriormente para estudios de captacin radiactivos, la
interferencia del metabolismo con estudios de alcalinizacin se reduce mediante
la medicin de las tasas iniciales. Si se llevan a cabo estudios de transporte
radiactivo y ensayos de alcalinizacin en condiciones idnticas, los flujos
obtenidos con estos dos mtodos pueden en principio ser utilizados para calcular
estequiometras azcar-protn.
ESTUDIO DE TRANSPORTE DE AZUCAR IN VITRO
La interferencia del metabolismo del azcar en los estudios de transporte se
evita mediante el estudio de la absorcin in vitro con vesculas de membrana
aisladas. Puesto que las enzimas citoplasmticos estn ausentes en vesculas
de membrana, el azcar transportado no se puede metabolizar, lo que facilita los
clculos sobre la cintica de absorcin y coeficientes de acumulacin.
membranas plasmticas aisladas de levadura, sin embargo, no forman vesculas
bien sellados (38), que es probablemente la razn por la que no exhiben
afluencia de azcar inicial mediado por portador. sin embargo, este tipo de
vescula de membrana se puede utilizar para medir contraflujo (53). Para
disminuir la permeabilidad de las vesculas de membrana, las membranas tienen
que ser fusionado con liposomas artificiales (38). De esta manera, las vesculas
de membrana con parmetros de transporte similares a las de las clulas

intactas se pueden obtener (71, 89). Los estudios sobre los procesos de
transporte dependiente de la energa en vesculas de la membrana plasmtica
de la levadura se complican por la ausencia de una cadena respiratoria de
protones translocacin. El sistema de membrana-energizar fisiolgica, el
complejo de la ATPasa de la membrana plasmtica, no puede ser utilizado para
energizar el transporte en vesculas del lado de salida a la derecha debido a que
su sitio cataltico no es accesible a ATP. Estas situaciones difciles pueden
eludirse mediante la introduccin de un sistema de protones translocadoras
heterloga. Esto se puede lograr por la fusin de vesculas de membrana
plasmtica de la levadura purificados con liposomas que contienen protones de
bombeo del corazn citocromo c oxidasa bovino (Fig. 2). En estas vesculas
fusionadas, una fuerza motriz de protones se puede generar mediante la adicin
del sistema redox artificial ascorbato-TMPD (N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenileno
diamina) -cytochrome c (105, 107, 108) , que puede ser utilizado para conducir el
transporte cuesta arriba de azcares como se muestra para la galactosa y el
transporte de lactosa en Kluyveromyces marxianus (74, 107) y el transporte de
maltosa en S. cerevisiae (105, 108). Aunque el mtodo de la vescula fundida
permite estudios detallados sobre el mecanismo molecular y acoplamiento de
energa de los sistemas de transporte, an no es posible relacionar
cuantitativamente en las actividades in vitro a las tasas de absorcin in vivo.
ANLISIS CINTICO DE COMPONENTES MLTIPLES SISTEMAS DE
TRANSPORTE
Los estudios sobre la cintica de la absorcin de azcar en muchos casos han
revelado no lineales representaciones Eadie-Hofstee o Hanes, lo que indica la
actividad de ms de un sistema de transporte. Cuando varios transportadores
estn activos, la tasa especfica de absorcin de azcar (v) se describe por la
ecuacin 1.

En la ecuacin 1, Kmi es la constante de afinidad aparente del sistema de

transporte i, Vm., Es la capacidad mxima del sistema de transporte i, Cs es la
concentracin de sustrato, y N es el nmero de diferentes transportadores (103).
En principio, ms de dos transportadores pueden ser operativos de manera
simultnea. En la prctica, el ajuste de curvas no lineales por lo general de la
cintica asume la participacin de dos componentes cinticos con diferentes
valores de Km. De la ecuacin 1 se deduce que los diversos transportadores
contribuyen a la afluencia global en todas las concentraciones de azcar. Por lo
tanto, como se ha sealado recientemente (39), las constantes cinticas no se
puede obtener por un simple anlisis grfico de parcelas cinticos linealizados

pero debe ser obtenido por la diseccin de los diversos sistemas cinticos de
anlisis por ordenador. El caso ms estudiado de transporte de azcar en
levaduras es el de transporte de glucosa en S. cerevisiae (para una revisin
completa, vase la referencia 55). El anlisis de la captacin de glucosa
radiomarcada ha indicado que, dependiendo de las condiciones de crecimiento,
el transporte puede ser descrita por uno o dos componentes cinticos (43). Por
lo tanto, los sistemas de captacin de alta y baja afinidad pueden ser operativo
(10, 84). De alta afinidad la captacin de glucosa, que tiene una constante de
afinidad aparente de alrededor de 1 mM, se ms probablemente mediada por un
operador de difusin facilitada, posiblemente en estrecha asociacin con un
hexoquinasa (21). El componente de absorcin de baja afinidad ha sido un tema
de controversia. Originalmente fue estimado a partir de un anlisis directo de
bifsicos parcelas Eadie-Hofstee, que este componente tendra una Km de
alrededor de 20 mM (10). El anlisis por ordenador de estos datos ha, sin
embargo, se muestra que la parte de baja afinidad de la cintica de la captacin
de glucosa bifsicos o bien tiene una muy alta Km (en el intervalo molar) o
incluso puede no exhibir cintica de saturacin, lo que indicara la difusin pasiva
(39) . Walsh et al. (117) han demostrado recientemente que la mayor parte de
esta aparente de transporte de baja afinidad desaparece cuando las clulas se
enfriaron rpidamente con altas concentraciones de azcar no radiactivo. Esto
sugiere que el azcar radiactivo puede unirse firmemente a la superficie celular y
que el lavado inadecuado de las clulas deja parte del azcar unido a las
clulas, perturbando de este modo mediciones de transporte. Sin embargo,
incluso despus de la correccin apropiada para la unin, estos autores tambin
reportaron curvas de transporte bifsicos, para los que sugeran que las
desviaciones de la linealidad a alta concentracin de azcar fueron causadas por
difusin libre. Por otra parte, se inform que el transporte mediado por portador
exhibi dos valores diferentes Km, a saber, una en el rango de 5 mM y una en el
intervalo de 20 a 30 mM.
Se han aislado varios mutantes de S. cerevisiae con deficiencias en la actividad
de transporte de glucosa. Dado que ninguno de ellos carece por completo de la
capacidad de transporte de la glucosa, se espera que varios genes para codificar
los portadores de glucosa. De hecho, un nmero de candidatos han sido
identificados, incluyendo SNF3, HXTI a HXT4, y LGT1, de los cuales el ltimo es
probablemente idntica a HXT4 (Tabla 2). Cada uno de estos genes tiene
homologa de secuencia con los transportadores de glucosa de mamferos. Es
en la actualidad no est claro si todos estos genes en efecto el cdigo para un
transportador de azcar o si codifican para las protenas reguladoras, como
recientemente se ha sugerido para SNF3 (23). Identificacin de los genes
estructurales que codifican portadores de glucosa en S. cerevisiae
probablemente tendr que esperar la purificacin de sus productos de genes y
reconstitucin en sistemas in vitro.
Un tipo diferente de transporte de la glucosa, mediada por una symporter
glucoseproton, se ha demostrado en un nmero de levaduras no
Saccharomyces, incluyendo Candida spp. (83, 97), Rhodotorula spp. (46, 48), y

K marxianus (26, 41). En general, las aparentes constantes de saturacin de

sustrato de estos transportadores estn en el rango micromolar. Tales sistemas
de captacin de la glucosa alta afinidad son probablemente muy extendida entre
las levaduras. El segundo mejor estudiado sistema de absorcin de
monosacridos en levaduras es el transportador galactosa. En S. cerevisiae, la
galactosa puede ser transportado por dos sistemas, un sistema de baja afinidad
constitutiva con una Km de ms de 1 M y un transportador inducible alta afinidad
con una Km de aproximadamente 3 mM (89). Se ha informado de que la
galactosa tambin induce un portador con una afinidad aparente de 340 mM
(89). Sin embargo, es cuestionable si existe este inducible translocador de baja
afinidad o es similar a la portadora constitutiva antes mencionada con una Km
mayor de 1 M, ya que las constantes cinticas se obtuvieron por anlisis directo
de parcelas Eadie-Hofstee y puede ser espera que el verdadero valor de Km de
la inducible transportador de baja afinidad ser ms alto (39). transporte
galactosa inducible est mediada por el producto del gen GAL2. GAL2 codifica
una protena con un tamao predicho de 574 aminocidos (99), que ms
probablemente representa el soporte de la galactosa-difusin facilitada de alta
afinidad. En contraste con S. cerevisiae, el transporte galactosa en otras
levaduras puede implicar mecanismos symport de protones (26). Los datos
sobre la absorcin de galactosa en levaduras no-Saccharomyces son escasos,
como es el caso para otros soportes de monosacridos, y no se ver ms
adelante en este documento.
TRANSPORTE DISACRIDO
La glucosa es, con mucho, el sustrato ms comnmente utilizada en estudios
fisiolgicos fundamentales en el metabolismo del azcar en las levaduras. Sin
embargo, slo unas pocas aplicaciones industriales se basan en glucosa como
materia prima. sustratos industriales tales como melazas, suero de leche,
hidrolizados de almidn, y mosto todos contienen disacridos (sacarosa, lactosa
y maltosa, respectivamente) como el componente principal de azcar. En
contraste con el metabolismo de la glucosa, el metabolismo de disacrido en las
levaduras no necesariamente se inici por la absorcin de la molcula de azcar.
Por ejemplo, en la levadura marxianus K, la sacarosa es inicialmente hidrolizada
a glucosa y fructosa por la enzima extracelular inulinasa (91, 92).
Posteriormente, las hexosas componentes son transportados en la clula (Fig.
3). A la inversa, disacridos tambin pueden ser transportados sobre la
membrana de plasma antes de la hidrlisis por una hidrolasa intracelular (Fig. 3).
Este es el caso, por ejemplo, para la utilizacin de maltosa por S. cerevisiae. En
S. cerevisiae, la hidrlisis de la sacarosa puede ocurrir ya sea intracelularmente
o extracelularmente (65, 93). La vista general, sin embargo, es que la hidrlisis
extracelular es la va predominante por el que S. cerevisiae utiliza sacarosa (3, 4,
31, 100) y que la presencia de un sistema symport sacarosa-protn puede ser
una propiedad straindependent. En la mayora de los casos, la absorcin de los
disacridos por levaduras se ha informado que se producen a travs symport de
protones. Estudios recientes han demostrado que un transporte facilitado
maltosa putativo puede atribuirse a un artefacto experimental (7). sistemas

symport disacrido-protn en levaduras se caracterizan por tener una proporcin

relativamente alta constante de afinidad de 2 a 6 mM.
El sistema de captacin de disacrido ms ampliamente estudiado en levaduras
es el portador maltosa S. cerevisiae. En esta levadura, se requieren tres
productos de los genes para la utilizacin de maltosa: un transportador
maltosespecific, la enzima maltosa hidrolizante ot-glucosidasa, y un activador de
la transcripcin (18, 20, 22, 67). Las agrupaciones de los tres genes que
codifican estas protenas se producen en cinco loci diferente llamado centro
comercial para MAL4 y AML6, que presentan una alta homologa de secuencia
(66). Recientemente, van den Broek et al. (102) en comparacin con los perfiles
de protenas de membrana en S. cerevisiae cultivadas en cultivos chemostat
maltosa y glucosa-limitado. electroforesis en gel de poliacrilamida de membranas
plasmticas aisladas revel que el crecimiento en maltosa inducida dos
protenas asociadas a la membrana, que no estn presentes en las clulas de
glucosa-crecido, con masas moleculares aparentes de 64 y 59 kDa. la
secuenciacin de aminocidos parcial de la protena de 64 kDa revel la
identidad completa con las secuencias de aminocidos predichas de la
secuencia de ADN del gen MAL61, lo que indica que esta es la permeasa de
maltosa inducible de S. cerevisiae.
Otro sistema de transporte disacrido bien estudiado es el portador lactosa en
las especies de Kluyveromyces. Este transportador, con un valor Km de
alrededor de 1 mM, cataliza symport lactosa-protn (6, 32, 104). El gen que
codifica este transportador en K lactis ha sido identificado por la transformacin
de S. cerevisiae con LAC12, que codifica el presunto transportador, y LAC4,
codificacin, B-galactosidasa. La cepa de S. cerevisiae transformada podra
crecer en lactosa y, por otra parte, mostr transporte lactosa desacoplador
sensible (98). En combinacin con los hallazgos de que LAC12 codifica para una
protena homloga hidrfobo para la Escherichia coli xilosa-H + y arabinosa-H +
transportadores (17), esto demuestra que de hecho LAC12 cdigos para un
portador.
REGULACION
la absorcin de azcar por las levaduras est fuertemente regulada por las
condiciones ambientales, tanto a nivel de la sntesis de la enzima y en el nivel de
actividad de la enzima. Cuando una levadura posee varios sistemas de
transporte para un determinado azcar, su concentracin en el medio ambiente
es a menudo un factor clave en la regulacin de la sntesis de las portadoras
individuales. A altas concentraciones de azcar, las compaas de alta afinidad
son generalmente reprimidos, pero la represin es aliviado cuando la
concentracin de azcar en el entorno disminuye. Este tipo de regulacin est
bien documentado para el transporte de glucosa en, por ejemplo, las especies,
Candida y Kluyveromyces. Un mecanismo similar se ha sugerido para el
transporte de glucosa en S. cerevisiae (9, 55), pero en un estudio reciente de
este punto de vista fue cuestionado por lo que sugiere que el transportador (s)
de glucosa en esta levadura puede ser constitutiva (17). Por lo tanto, los

cambios observados en las constantes de afinidad aparentes implicara la

modificacin de la actividad de los portadores de glucosa existentes, en lugar de
represin / desrepresin de la sntesis de portador por conmutacin de apagado
y encendido de los genes portadores. Los estudios de expresin de los
transportadores de glucosa presuntos, sin embargo, no estn de acuerdo con
este punto de vista, ya que la expresin de Hxt1, HXT2, y Hxt3, medida
mediante el uso de protenas de fusin lacZ (51, 58) o anticuerpos contra partes
especficas de la protena (119), se demostr que era dependiente de la fase de
crecimiento. Una compleja regulacin del transporte se ha observado para los
portadores de disacridos tales como los de la maltosa y la lactosa. En estos
casos, la actividad de los transportadores de disacridos en una variedad de
levaduras (3) se rige por los mecanismos de induccin de la represin.
Existente capacidad de transporte para un azcar tambin se puede controlar
mediante la modificacin postraduccional de la protena portadora. Por ejemplo,
en ausencia de una fuente de nitrgeno para el crecimiento, la actividad de
transporte de glucosa en S. cerevisiae disminuye rpidamente (14, 56). La
inactivacin en presencia de altas concentraciones de glucosa o en ausencia de
una fuente de nitrgeno se ha observado para el transporte galactosa (29, 62) y
el transporte de maltosa (13, 44). Para maltosa, los estudios con anticuerpos han
indicado que la desaparicin de la actividad es de suponer que asocia con la
proteolisis de la portadora (60). Adems de la inactivacin irreversible, el
transporte de maltosa puede ser reversiblemente inactivada, dependiendo de las
condiciones de crecimiento (77). La necesidad fisiolgica para la regulacin a
corto plazo de la actividad de transporte se ilustra mediante los estudios sobre el
transporte de la maltosa con mutantes de S. cerevisiae defectuosos en la
represin de la glucosa (34, 35) y con clulas de tipo salvaje expuestos a un
cambio repentino en la concentracin de maltosa (86). absorcin de la maltosa
no controlado llevado a la muerte sustrato-acelerado, un fenmeno tambin se
sabe que se producen en las bacterias (81). Evidentemente, la concentracin de
azcar en el medio ambiente puede influir fuertemente en la cintica de la
absorcin de azcar. Como consecuencia, los mtodos de cultivo utilizados para
estudios de transporte deben implicar el control de la concentracin de azcar.
METODOS DE CULTIVO
Con la excepcin de ciertos disacridos, cuyo metabolismo se inicia por la
hidrlisis extracelular, la tasa especfica de absorcin de azcar (v) es igual a la
tasa especfica de consumo de azcar (q,) en cultivos en crecimiento. En
principio, varios mtodos de cultivo se pueden aplicar para estudiar la cintica de
la absorcin de azcar por las clulas en crecimiento. Los pros y los contras de
estos mtodos se evalan brevemente a continuacin.
CULTIVO POR LOTE (batch cultivation)
Para los estudios sobre la cintica de transporte en clulas en crecimiento, es
fundamental utilizar las condiciones de cultivo controlado. Esto permite la
manipulacin de los parmetros de crecimiento que afectan al transporte de
azcar. cultivos en matraz de agitacin no cumplen con este requisito, ya que el

pH y la tensin de oxgeno disuelto no pueden ser reguladas. Tanto estos

parmetros ejercen una fuerte influencia en la tasa de transporte de azcar.
lote de cultivo en fermentadores en la que el pH, la tensin dissolvedoxygen, y la
temperatura se controlan a primera vista puede parecer un mtodo de cultivo
adecuado para el estudio del transporte de azcar in situ. La concentracin de
azcar en el medio ambiente, aunque la disminucin continua (Fig. 4), puede ser
elegido de tal manera que no limita la velocidad de transporte y la tasa de
crecimiento especfico es constante (u= vmax).
durante el crecimiento exponencial, la tasa especfica de consumo de azcar (q,)
es constante y se describe por la ecuacin 2:

En la que Y.SX es el rendimiento de biomasa, expresada como cantidad de

biomasa formada por cantidad de azcar que se consume. Slo cuando la
concentracin de azcar en el cultivo ya no es suficiente para saturar la
capacidad de transporte existente, la tasa de crecimiento disminuye como
resultado de una disminucin en la tasa de transporte de azcar. Esto es slo si
la concentracin de biomasa que se obtiene al final de la fase exponencial se
determina nicamente por la concentracin de azcar inicial en el medio de
crecimiento. Si otros nutrientes (por ejemplo, la fuente de nitrgeno) son
limitantes, transporte de azcar y el crecimiento pueden llegar a ser desacoplado
como resultado de cambios en la composicin y la produccin de metabolitos de
desbordamiento de la biomasa, con lo que la relacin entre la absorcin y el
crecimiento mucho ms complicado. Una rpida transicin a un crecimiento cero
se produce al agotarse el azcar. En cultivos discontinuos, la expresin y las
propiedades de los sistemas de transporte de azcar en levaduras depender en
gran medida del momento de la cosecha.
La situacin representada en la Fig. 4 con respecto a la cintica de crecimiento y
el consumo de azcar es ms complicada cuando se forman subproductos que
afectan a la fisiologa celular. Esto ocurre, por ejemplo, en cultivos discontinuos
aerbicas de S. cerevisiae y otras levaduras Crabtree positivas, que muestran la
fermentacin alcohlica en presencia de concentraciones de azcar por encima
de 1 mM (115). Aparte de etanol, otros productos que afectan negativamente el
rendimiento de biomasa, tales como cido actico, se pueden formar.
EL CULTIVO DE ALIMENTACIN DISCONTINUA
Una desventaja intrnseca de lote de cultivo es que los datos que aporta sobre la
absorcin de azcar se pueden extrapolar ms que en situaciones en las que
est presente en exceso ("superior" se usa aqu para indicar las concentraciones
que no limitan la tasa de crecimiento) de azcar. Tales estudios tienen poca
relevancia para el cultivo industrial de levaduras en azcar limitada cultivos fed-

batch. En este ltimo sistema, con frecuencia se inicia con una fase de proceso
por lotes, el azcar se suministra al cultivo a una tasa de crecimiento de
limitacin (es decir, la tasa de crecimiento que se permite por la velocidad de
adicin de azcar es menor que umax (miumax).
En los sistemas de lotes alimentados, una tasa de crecimiento especfico
constante se puede lograr una tasa de alimentacin en aumento exponencial
que tiene en cuenta el aumento de volumen de cultivo y la concentracin de
biomasa. En la prctica, los cultivos discontinuos alimentados no se hacen
funcionar a una tasa de crecimiento constante, sino que implican una perffl de
alimentacin que conduce a una disminucin continua de la tasa de crecimiento.
Este perfil se rige por una variedad de factores, incluyendo la transferencia de
oxgeno y la capacidad de refrigeracin de biorreactores industriales (8, 27).
Adems de su complejidad experimental, el uso de cultivo de alimentacin por
lotes para estudios fundamentales sobre el transporte de azcar adolece del
peligro potencial de un cambio en las condiciones de crecimiento relacionados
con el aumento de la biomasa. Por ejemplo, la formacin de muchos
subproductos txicos es linealmente proporcional a la cantidad de biomasa,
mientras que los efectos adversos pueden ser exponencialmente relacionadas
con la concentracin de subproductos. Incluso en la ausencia de la formacin de
subproductos, las condiciones de crecimiento que resultan en una tasa de
crecimiento constante (submxima) se pueden mantener por slo un periodo
relativamente corto (horas en lugar de das). Despus de este perodo, la
acumulacin de biomasa conduce a una situacin en la que las propiedades de
transferencia de oxgeno del fermentador establecer los lmites para la
alimentacin del medio.
CULTIVO DE QUIMIOSTATO
Cultivo quimiostato no sufre de las desventajas de cultivo por lotes y de
alimentacin por lotes y por lo tanto ms adecuada para los estudios de
transporte es. En un quimiostato, los nutrientes se alimentan continuamente al
cultivo. El volumen de cultivo se mantiene constante por retirada continua, a la
misma velocidad, de fluido de cultivo que contiene la biomasa, los productos, y
los nutrientes no empobrecido (Fig. 4). El medio que se alimenta en la cultura
est diseado de tal manera que un nutriente de eleccin (por ejemplo, el
azcar) determina la concentracin de biomasa en el cultivo. Como resultado,
este nutriente limitante est casi completamente consumido y su concentracin
residual en el cultivo es muy baja. El rendimiento de biomasa (Ys,) en el
nutriente limitante se da por la ecuacin 3, en la que Cj, es la concentracin de
depsito el nutriente limitante y Cs y C, son la concentracin de sustrato residual
y la concentracin de biomasa en el cultivo, respectivamente:

La velocidad de flujo en la que se alimenta el medio a la cultura (litros por hora)

dividido por el volumen del cultivo (litros) es igual a la tasa de dilucin, D (horas
recprocas) (ecuacin 4):

El valor recproco de la velocidad de dilucin es igual al tiempo requerido para un

cambio de volumen. Por lo general, aproximadamente cinco cambios de
volumen despus de un cambio en las condiciones de crecimiento, se alcanza
una situacin de estado estacionario, en el que la tasa de crecimiento, u (MUI)
es igual a la tasa de dilucin D, segn la ecuacin:

en la que Cs es la concentracin residual del nutriente que limita el crecimiento y

Ks es la constante para el crecimiento en este nutriente (64) de afinidad. En este
estado de equilibrio, la concentracin de todos los nutrientes, incluyendo el
sustrato de crecimiento limitativo, es constante en el tiempo.
Como resultado de las condiciones de crecimiento constantes, la fisiologa del
microorganismo tambin permanece constante. Esto incluye el contenido de
portador de azcar de las clulas y la cintica de transporte de azcar, que no
son dependientes del momento de la cosecha. Por lo tanto, las culturas
chemostat en estado estacionario son ideales como fuente reproducible de
suspensiones de clulas para estudios de transporte de azcar. El uso de cultivo
quimiostato es particularmente ventajoso en los estudios de transporte con S.
cerevisiae. lote de cultivo aerbico de esta levadura en azcares conduce a un
patrn caracterstico. En la primera fase, el azcar se fermenta a alcohol, como
un resultado de la represin de diversas enzimas respiratorias. Cuando se agota
el azcar, se observa una fase de latencia, durante la cual la levadura se adapta
a una segunda fase de crecimiento en etanol. Muchas diferencias en la literatura
con respecto a las propiedades de transporte de azcar en S. cerevisiae
probablemente se pueden atribuir a la condicin fisiolgica de la levadura, que
es fuertemente dependiente de la fase de crecimiento y, en consecuencia, en el
momento de la cosecha. quimiostato cultivo permite la evaluacin de los efectos
de los parmetros ambientales especficas sobre el transporte de azcar en
cultivos en crecimiento. Por ejemplo, el efecto de la temperatura de crecimiento

puede ser estudiada de forma independiente de los efectos de la tasa de

crecimiento. En los cultivos discontinuos, esto no es posible, ya que un cambio
en la temperatura de crecimiento tambin dar lugar a un cambio en la tasa de
crecimiento. Como resultado, no es posible concluir si las diferencias observadas
en el transporte de azcar se deben a un cambio en la temperatura, un cambio
en la tasa de crecimiento, o ambos. Los principios generales del cultivo
quimiostato y los mtodos utilizados se han revisado ampliamente (47, 80). A
continuacin, se describen brevemente algunos aspectos que son de particular
relevancia para los estudios de absorcin de azcar.
LOS MTODOS UTILIZADOS PARA EL CULTIVO EN QUIMIOSTATO EN
RELACIN CON LOS ESTUDIOS DEL TRANSPORTE DEL AZCAR
LA COMPOSICION DEL MEDIO
Dado que la absorcin de solutos por cultivos en crecimiento depende en gran
medida de las condiciones ambientales, estas condiciones deben ser constantes
y definidas. La base para el cultivo chemostat fiable, es decir, por las condiciones
de crecimiento definidas, es un diseo apropiado del medio de crecimiento, en
las culturas chemostat azcar limitado, todos los nutrientes inorgnicos y
vitaminas debe estar presente en exceso. Optimizacin de los medios de
crecimiento con respecto a los principales nutrientes se ve facilitada por el uso
de balances macroscpicos. Por ejemplo, la formacin de S. cerevisiae biomasa
en cultivos chemostat aerbicas, glucosa-limitado crecido a una tasa de dilucin
de 0,10 h-1 se puede describir por la ecuacin 6:

A partir de esta ecuacin, es evidente que para obtener una concentracin de

biomasa de 5 g litro-1, por lo menos (5/100) x 0,54 = 27 x 10-3 mol de amonio
literalmente 'debe estar presente en el medio de crecimiento. Si esta
concentracin de amonio no est presente, el crecimiento ya no estar limitada
por el suministro de azcar y la cultura de nitrgeno ser limitado. Esto puede
resultar en la acumulacin de azcar en el cultivo. En tales condiciones, las
levaduras en general no expresan los sistemas de captacin de alta afinidad que
estn presentes en los cultivos de azcar limitado.
Adems de los principales nutrientes, micronutrientes (oligoelementos y
vitaminas) deben estar presentes en exceso. En cultivos anaerbicos, la mezcla
de vitamina debe incluir ergosterol y cidos grasos insaturados (1, 2). Una
escasez en el suministro de un nutriente esencial se puede detectar mediante el
aumento de C51; limitacin por un compuesto que no sea el azcar dar lugar a

diferentes valores de C,. Slo si C5 es independiente de Csi y la concentracin

de biomasa en el cultivo es linealmente proporcional a la concentracin depsito
del nutriente que limita el crecimiento (CJI) puede quimiostato culturas ser
asumido para seguir la cintica de Monod. Mediante el uso de los medios de
comunicacin equilibrados minerales y equipos de fermentacin adecuada,
condiciones constantes (tensin de oxgeno disuelto, temperatura, pH,
concentracin de biomasa, tasa de dilucin, etc.) son relativamente fciles de
lograr. discusiones detalladas sobre el control de la espuma, la eleccin del
equipo apropiado, los mtodos para el control de oxgeno disuelto, etc., estn
ms all del alcance de este documento.
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE AZCAR RESIDUAL
Un parmetro de importancia obvia para los estudios sobre el transporte de
azcar en cultivos chemostat es Cs, la concentracin de azcar residual en el
cultivo. En comparacin con estudios sobre la cintica de enzimas intracelulares,
los estudios de la relacin entre Cs y en la actividad portador situ parecen ser
relativamente sencillo. Para la medicin de C, preparacin de la muestra
comprende solamente la separacin de sobrenadante de cultivo de las clulas;
no se requiere la permeabilizacin de las clulas. Sin embargo, en las culturas
chemostat de azcares, y en particular las de Crabtree negativas levaduras, la
concentracin de azcar residual es generalmente muy baja (por lo general muy
por debajo de 1 mM [Tabla 1]). Por lo tanto, se requiere que el muestreo rpido y
la separacin de la biomasa del medio de crecimiento para prevenir el consumo
de azcar durante el muestreo. El siguiente ejemplo puede servir para ilustrar
esto. En un aerbico, la glucosa-limita quimiostato cultura de Candida utilis
crecientes a D = 0,3 h-1 con una concentracin de reserva de 5 g de glucosa
literalmente ', la produccin de biomasa y la concentracin de glucosa residual
son 0,5 g de biomasa g de glucosa' y 18, um, respectivamente (83). A partir de
estos datos, se deduce que la tasa especfica de consumo de glucosa (qs [ver
ecuacin 2]) es 3,33 mmol de glucosa g de biomasa 'h- Desde el depsito de
concentracin IS5 g litro-1 e Y, = 0,5 g de biomasa g de glucosa ", la tasa
volumtrica del consumo de azcar es igual a 0,5 x 5 x 3,33 = 8,33 mmol litro-h1 = 2,3, uM s- '. Si esta tasa de consumo de azcar fuera a continuar durante el
muestreo, un tiempo de muestreo de 8 s resultara en el agotamiento completo
del azcar inicialmente presente en la muestra.
En la prctica, los tiempos de muestreo de 1 a 3 s se pueden obtener mediante
el filtrado de muestras de cultivo a travs de un filtro de acetato de celulosa (33).
Un mtodo alternativo es transferir directamente una muestra de cultivo en
nitrgeno lquido (83, 84). Despus de que la muestra ha descongelado en hielo,
el sobrenadante libre de clulas se puede recuperar por centrifugacin o
filtracin a 0 C. Sin embargo, otra opcin es el muestreo por la inclusin de una
sonda de dilisis en el fermentador (85). Es obvio que para las mediciones de las
concentraciones de sustrato residuales en chemostat culturas, se prefieren
densidades de clulas pequeas, ya que esto reducir el consumo de sustrato
durante el muestreo. Este enfoque se ha seguido en los elegantes estudios
realizados por Egli et al. (33) sobre la cintica de crecimiento de E. coli, en los

que las concentraciones de sustrato residuales estaban en el rango nanomolar.

Es importante hacer hincapi en que la afinidad por el sustrato de crecimiento de
limitacin impone un lmite inferior en las concentraciones de biomasa en estado
estacionario que se pueden utilizar en cultivos chemostat; ecuacin 5 slo es
vlida cuando la concentracin de depsito del substrato de crecimiento limitante
(C5J) es al menos 2 rdenes de magnitud mayor que la concentracin residual
de sustrato (CQ) (80). Sea cual sea el mtodo de muestreo, debe ser validada
mediante la medicin de Cs a diferentes valores de Cj1. Cj, determina la
concentracin de biomasa en la cultura (ecuacin 3), pero no afecta a C, que
slo depende de la PU, Am., Y Ks (ecuacin 5).
Si se observan diferentes valores para C5 cuando C, j es variada, esto puede ser
indicativo de consumo de sustrato durante el muestreo y del mtodo no sea
adecuado. Alternativamente, se puede apuntar a limitacin por un nutriente que
no sea el sustrato de azcar. Usando la tcnica de muestreo de nitrgeno
lquido, Postma et al. (83) observaron la misma C5 a diferentes valores de C5i
en cultivos chemostat glucosa limitada de C. utilis. Adems, el clculo ofuwm. de
la ecuacin 5, utilizando mediciones de C5 a diferentes tasas de crecimiento, dio
el mismo valor para este parmetro como se observa en cultivos discontinuos.
Para la determinacin de la cintica in situ de consumo de azcar en chemostat
culturas, una serie de requisitos debe cumplirse. El fermentador debe tener
excelentes propiedades de mezcla para evitar gradientes de azcar.
Especialmente a bajas velocidades de dilucin, se debe tener cuidado para
evitar discontinua, la adicin del sustrato gota a gota como consecuencia de las
bajas tasas de bombeo. Este problema se puede evitar mediante el uso de
grandes volmenes de cultivo. Las matemticas de cultivo quimiostato, como se
describe brevemente en las ecuaciones 3 y 5, se aplican slo si la concentracin
de biomasa en el cultivo es idntica a la concentracin de biomasa en el efluente
de cultivo. En particular, cuando el efluente se retira continuamente de la
superficie de cultivo, se puede producir la eliminacin selectiva de cualquiera de
biomasa o el medio extracelular (70). Este fenmeno se puede evitar mediante la
eliminacin de efluentes + por debajo de la superficie del cultivo. El volumen de
cultivo puede entonces mantenerse constante, por ejemplo, mediante el
acoplamiento de la bomba de efluente a un sensor de contacto de la superficie.
crecimiento de la pared puede causar grandes problemas en los experimentos
chemostat. En particular, a bajas concentraciones de biomasa incluso un
crecimiento apenas visible en las paredes de los vasos fermentador puede hacer
una contribucin cuantitativa a la tasa global del consumo de azcar. crecimiento
de la pared puede por lo tanto dar lugar a una subestimacin de las
concentraciones de sustrato residual.
Un problema especial puede encontrarse con cepas de S. cerevisiae. En
respiratorio, los cultivos de azcar limitado de esta levadura, las sincronizaciones
espontneas del ciclo celular pueden ocurrir (75, 116), que se asocia con las
oscilaciones en el transporte de azcar y el metabolismo. En algunas cepas de
estas oscilaciones no amortiguar. Cuando se dispone de alternativas, las cepas
de levadura con una fuerte tendencia hacia el crecimiento de la pared o las

oscilaciones no deben elegirse como organismos modelo para estudios de

quimiostato.
MANIPULACIN DE FLUJOS METABOLICOS EN CULTIVOS DE QUIMISTATO
Dado que, en las culturas chemostat de sustrato limitada, la tasa de dilucin es
igual a la tasa de crecimiento especfico, la ecuacin 2 se puede reescribir como:

Esto implica que en chemostat culturas, la tasa especfica de consumo de

sustrato puede ser variada ya sea por manipulacin de la tasa de crecimiento o
por modificacin controlada de la produccin de biomasa. Una tercera opcin
para obtener una variacin controlada de los flujos metablicos es el crecimiento
en sustratos mixtos. Cada una de estas tres posibilidades se discutir
brevemente a continuacin.
VARIACIN DE LA TASA DE DILUCIN
En muchas levaduras, el rendimiento de biomasa a partir del sustrato es
prcticamente constante en una amplia gama de tasas de dilucin (80). En estos
casos, la ecuacin 7 predice una relacin lineal entre la tasa de dilucin y la tasa
especfica de consumo de sustrato. Esto implica que la tasa de consumo de
sustrato puede ser manipulado mediante la variacin de la tasa de dilucin. De
hecho, una relacin lineal entre la tasa de crecimiento y q, el limite de azucar en
el cultivo quimiostato del cultivo c. utilis tuvo una variacion entre 0.10 y 0.50 h-1.
Cabe destacar que la simple relacin lineal entre D y Q, se aplica slo cuando el
rendimiento de la biomasa no cambia con la velocidad de dilucin. A muy bajas
velocidades de dilucin, requerimientos de energa para los procesos de
mantenimiento afectan al rendimiento de biomasa (80), que por lo tanto no
puede considerarse una constante.
Esto har que la relacin entre D y q, a bajas tasas de crecimiento ms
compleja. Como veremos ms adelante, los cambios en el metabolismo del
azcar que se producen a altas tasas de crecimiento en algunas levaduras
tambin pueden complicar la relacin entre, u y QS.
VARIACIN DEL RENDIMIENTO DE BIOMASA
Variacin del flujo metablico mediante la manipulacin de la tasa de dilucin
est asociada inevitablemente con los cambios en la tasa de crecimiento. De
acuerdo con las ecuaciones 2 y 7, q, tambin puede ser manipulado de forma
independiente de la tasa de crecimiento mediante la modificacin del
rendimiento de biomasa en el sustrato de crecimiento limitativo. En levaduras,
esto se puede lograr de varias maneras. En levaduras fermentativas
facultativamente, el rendimiento de biomasa de chemostat culturas que respiran

azcar es mucho mayor que el rendimiento de los cultivos de fermentacin. Por

ejemplo, en aerbico, glucosa chemostat culturas limitadas de S. cerevisiae
crecido a D = 0,10 h-1, Y. = 0,5 g g- '. En cultivos anaerbicos cultivados a la
misma tasa de dilucin, YS = 0,1 g de biomasa (g de glucosa) 1, que se asocia
con una tasa de captacin de glucosa-cinco veces superior. Esto implica que q,
se puede variar por la manipulacin controlada de la velocidad de alimentacin
de oxgeno a chemostat culturas de azcares, (Fig. 7) (122). Una modulacin
bastante complejo de las tasas de transporte de azcar, causada por cambios
simultneos de e y. ,, Se produce en, culturas chemostat de glucosa limitada
aerbicas de S. cerevisiae. A bajas velocidades de dilucin, el crecimiento de
esta levadura es totalmente respiratoria y la tasa de absorcin de glucosa se
incrementa linealmente con el aumento de D (36, 50, 84). Sin embargo, por
encima de una cierta tasa de dilucin crtico, la respiracin y la fermentacin
alcohlica se producen de forma simultnea, lo que resulta en una disminucin
de YS, C. Por encima de la velocidad de dilucin crtico, el aumento simultneo
de D y la disminucin de Y, resultar en una tasa fuertemente mejorada de la
absorcin de azcar (Fig. 8).
Un enfoque experimental alternativa para mejorar la velocidad de transporte de
azcar a una velocidad de dilucin fija es la adicin de cidos dbiles no
metabolizables orgnicos (por ejemplo, cido benzoico) al medio de crecimiento
de azcar limitado quimiostato cultivo (112, 113).
Estos compuestos disipar el gradiente de pH transmembranal mediante la
difusin desde el entorno extracelular cido en el citosol casi neutro. Dentro de
las clulas, las molculas de cido se disocian. Para evitar la acidificacin del
citoplasma, los protones liberados deben ser expulsados de la clula por el
complejo de la ATPasa de membrana plasmtica. Como resultado del requisito
de ATP mejorado para la homeostasis del pH intracelular, menos ATP est
disponible para fines biosintticos. Esto a su vez resulta en una disminucin de
la produccin de biomasa (Y.,) y, en consecuencia, en un aumento de la tasa de
absorcin de azcar (Fig. 9).
EL CRECIMIENTO SOBRE SUSTRATOS MIXTOS
En los cultivos discontinuos, la utilizacin de mezclas de sustratos por levaduras
a menudo se produce a travs de un patrn secuencial (diauxic) (64) a causa de
los fenmenos de represin catablica. Por el contrario, las bajas
concentraciones de sustrato-residual en cultivos quimiostato de azcares,
permiten la utilizacin simultnea de mezclas de azcares o mezclas de
azcares y otros sustratos (33, 45). Por lo tanto, el cultivo en sustratos mixtos
ofrece otra posibilidad de manipular la tasa especfica de transporte de azcar
en cultivos quimiostato. Por ejemplo, la glucosa y el etanol se pueden utilizar de
forma simultnea en de doble sustrato limitada quimiostato cultivos de S.
cerevisiae (28, 42). En estos cultivos, las tasas especficas de la glucosa y el
consumo de etanol pueden ser manipulados no slo mediante la variacin de la
tasa de dilucin, sino tambin por el cambio de las concentraciones relativas de
glucosa y etanol en la alimentacin de un medio (Fig. 10).

REGLAMENTO DE TRANSPORTE DE AZCAR EN CULTIVOS DE

QUIMIOSTATO
Como se discuti anteriormente, el cultivo de quimiostato ofrece posibilidades
nicas para manipular la tasa de transporte de azcar en cultivos en crecimiento.
Hasta ahora, sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos utilizados por las
clulas de levadura para adaptar su cintica de transporte para dar cabida a
estas variaciones de flujo. Un ejemplo, el transporte de la glucosa en cultivos
chemostat glucosa limitada de C. utilis, se discute a continuacin.
En la mayora de las levaduras, ms de un sistema para la captacin de la
glucosa puede estar presente durante el crecimiento en este azcar. En tales
casos, la tasa especfica de consumo de azcar (q,) es igual a la suma de los
precios de transporte (V) de las portadoras individuales, de forma anloga a la
ecuacin 1. Las constantes cinticas de Km y mquinas virtuales, para las
portadoras individuales se pueden determinar mediante la medicin de las tasas
iniciales de la captacin de glucosa [ '4C] por muestras de cultivo a diferentes
concentraciones de sustrato. En tales casos, las parcelas cinticas no lineales se
pueden obtener (Fig. 11). Cuando tambin se conoce la concentracin de
glucosa residual en la cultura, la contribucin in situ de las diferentes portadoras
se puede calcular (Fig. 12). De la Fig. 12, es evidente que en las culturas
chemostat de glucosa-limitado de C. utilis, la contribucin de las diferentes
portadoras vara con la velocidad de dilucin. En las tasas de dilucin se acercan
Puma (0,59 h-1), la sntesis de las dos compaas areas de alta afinidad se
reprime y un vehculo de baja afinidad juega un papel predominante. Los
resultados anteriores ilustran la utilidad de cultivo chemostat: en cultivos
discontinuos, el crecimiento se produce en Tum. y los sistemas de alta afinidad
no son detectables. Slo durante la fase de transicin muy corta entre la fase de
crecimiento exponencial y la fase estacionaria es la sntesis de estos portadores
derepressed. Los estudios sobre el mecanismo y la cintica de transporte de
azcar de alta afinidad en levaduras son, por tanto, generalmente se realizan
con clulas de sustrato-privados o con clulas cultivadas en sustratos sobre los
que se derepressed sntesis de los portadores de alta afinidad. En general, los
sistemas de transporte de glucosa-difusin facilitada de levaduras Crabtree
positivas, como S. cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe, tienen una Km
mucho ms alto para glucosa que hacer los mecanismos de protones symport de
alta afinidad que son comunes en las levaduras Crabtree negativas ( Tabla 1). La
correlacin observada entre cintica de transporte y las concentraciones de
azcar residual en cultivos quimiostato de glucosa limitada (Tabla 1) sugiere que
las propiedades cinticas de la captacin de glucosa pueden en gran medida,
determinar la cintica de crecimiento. La importancia de la cintica de transporte
para el crecimiento de levaduras en condiciones de azcares, se hace
particularmente evidente cuando diferentes levaduras compiten por un nico
azcar que limita el crecimiento. Como se puede predecir a partir de la Tabla 1,
S. cerevisiae se outcompeted rpidamente en cultivos mixtos de la levadura C.
utilis Crabtree negativas durante el crecimiento aerbico, glucosa limitada (Fig.
13).

La mejor adaptacin de varias levaduras Crabtree negativas para el crecimiento

a concentraciones bajas de azcar ofrece una explicacin de la ventaja
competitiva de los llamados levaduras salvajes cuando stas contaminan los
procesos de produccin de levadura de panadera industrial (82).
CULTIVO DE QUIMIOSTATO Y ENERGETICO DEL TRANSPORTE DE
AZUCAR
La cantidad de ATP necesario para symport azcar-protn est determinada por
dos estequiometras: la estequiometra de azcar-protn del portador symport
protn y la estequiometra ATP-protn de la membrana plasmtica ATPasa
complejo (Fig. 1). En principio, el requisito de ATP general para la absorcin de
azcar se puede calcular mediante la determinacin independiente de cada uno
de estos dos estequiometras, por ejemplo, a partir de experimentos in vitro. La
energa necesaria para symport de protones reduce la cantidad de energa
disponible para la formacin de biomasa y por lo tanto se puede esperar que
cause una disminucin en el rendimiento de la biomasa. La medicin de esta
disminucin se puede utilizar para la determinacin in vivo de la exigencia de
ATP para symport azcar-protn. Un requisito previo es que la etapa de
transporte consume una fraccin significativa de los equivalentes de ATP que se
forman en la desasimilacin del azcar. Este es el caso durante el crecimiento
fermentativo, cuando a nivel de sustrato de fosforilacin rendimientos solamente
2 moles de ATP por mol de azcar hexosa. La determinacin precisa de los
rendimientos de biomasa requiere, adems, que todas las condiciones de cultivo
que influyen en la eficiencia del crecimiento pueden controlar. Por lo tanto, el
cultivo quimiostato es el nico mtodo de cultivo aplicable a este tipo de
investigacin in vivo. El requisito de energa para symport maltosa-protn en S.
cerevisiae ha sido estudiada por la comparacin con la difusin facilitada de la
glucosa en los cultivos de azcar quimiostato limitado anaerbicas (121). S.
cerevisiae se cultiv en ambos azcares en condiciones de cultivo idnticas. El
rendimiento de biomasa, expresada como la cantidad de biomasa formada por
cantidad de unidades de hexosa consumidos, era 25% ms baja durante el
crecimiento en maltosa que durante el crecimiento en glucosa. Al parecer, el
25% de las cuatro molculas de ATP formados durante la fermentacin de
maltosa (es decir, una molcula de ATP por molcula de maltosa) era necesario
para la absorcin de este disacrido. Este aumento de la tasa de fosforilacin a
nivel de sustrato tiene que ser sostenido por un aumento de la frecuencia del
gluclisis. De hecho, etanol y dixido de carbono especfico rateswere
produccin sustancialmente ms altos durante el crecimiento en maltosa que
durante el crecimiento en glucosa (121). Para confirmar esta conclusin, S.
cerevisiae se cultiva en mezclas de glucosa y maltosa, que fueron alimentados
simultneamente a las culturas quimiostato azcar limitado. Las tasas de
rendimiento de biomasa y produccin de etanol y dixido de carbono variaron
con el aumento de las proporciones de maltosa en glucosa en el medios de
depsito segn lo predicho por un modelo metablico, que se basa en el
supuesto de que se requiere un equivalente ATP de la maltosa

absorcin (Fig. 14). La estequiometra ATP maltosa / de 1 determinado in vivo es

de acuerdo con una estequiometra de maltosa / protn para el cotransportador
de maltosa / protn de 1 (96, 108) y un protn estequiometra / ATP de la
membrana plasmtica de la ATPasa de 1 (61, 68, 78) como se determin en
experimentos in vitro.
PERSPECTIVAS DE FUTURO
Un nmero de genes implicados en el transporte de azcar se han clonado a
partir de levaduras y se secuenciaron (Tabla 2). Los productos de los genes
predichos son protenas altamente hidrofbicas, que comparten homologa con
los transportadores de azcar bacterianas y de mamferos. Todos los productos
de los genes putativos tener, potencialmente, 9 a 12 dominios que abarcan la
membrana, y muchos de ellos contienen posibles sitios de glicosilacin unidos a
N y sitios de reconocimiento para AMP cclico (cAMP) que dependen de la
protena quinasa. Esta ltima observacin sugiere que el AMPc puede estar
implicado en la regulacin de la capacidad de transporte de azcar en levaduras.
en muchos casos, la proposicin de que las secuencias de ADN representan un
gen estructural para un azcar trasnsport protena se basa en pruebas
circunstanciales. Por ejemplo, no ha sido inequvocamente demostrado que
cualquiera de los genes enumerados en la Tabla 2 cde para las protenas que
catalizan la translocacin de azcares sobre la membrana de plasma. los datos
ms convincentes sobre la participacin directa de cualquiera de estos genes en
el transporte de azcar se han obtenido con S. cerevisiae, esta levadura adquiri
la capacidad de transporte de la lactosa. Todava es concebible que los otros
genes enumerados en la Tabla 2 codifican una protena reguladora implicada en
el transporte de azcar, en lugar de el gen estructural para una protena de
transporte de azcar. El trabajo futuro, que implica la reconstitucin de los
productos de genes purificados en vesculas de membrana plasmtica, se
requiere para revelar la funcin fisiolgica exacta de estos productos gnicos.
quimiostato cultivo puede ser una herramienta importante para futuros estudios
sobre la biologa molecular del transporte de azcar. Bajo las condiciones de
crecimiento controladas del quimiostato, las levaduras pueden ser inducidas a
sintetizar cantidades mximas de un transportista en particular, facilitando de
este modo su aislamiento y caracterizacin. Los usos potenciales de esta
propuesta se ilustran mediante un trabajo reciente sobre el producto del gen de
S. MAL61 ceevisiae, cosa que, despus de un crecimiento en cultivos chemostat
limitados maltosa, podran ser observados directamente en dodecilsulfato de
sodio poluacrylamide electroforesis generacin de preparaciones de membrana
plasmtica.
En esta revisin hemos tratado de ilustrar la utilidad del cultivo quimiostato en los
estudios sobre el mecanismo y la cintica de transporte de azcar por las
levaduras en Relatin a las condiciones ambientales. para entender el papel de
las diferentes genes que han sido implicados en la absorcin de azcar en las
levaduras, es de importancia clave para estudiar su expresin diferencial en
funcin de las condiciones de crecimiento (concentracin de azcar, pH, y la

tasa de crecimiento). La determinacin cuantitativa de ARNm y los niveles de

protena en cultivos de chemostat cultivadas bajo condiciones definidas puede
ser una tcnica valiosa para este tipo de estudios. El cuerpo de rpida expansin
del conocimiento sobre la gentica molecular del transporte de azcar en
levaduras ofrece una serie de posibilidades interesantes. Tericamente, el modo
de modificacin gentica del transporte de azcar se puede utilizar para
aumentar el rendimiento de etanol sobre sustratos de azcar, que pueden ser
pertinentes fot la produccin de etanol a gran escala. estudios chemostat
comparativas de tipo salvaje y cepas mutantes con diferentes niveles de
expresin del gen portador de maltosa en S. cerevisiae resultaron en una cepa
con una mayor capacidad de la levadura que contiene maltosa masas. whethwe
y en qu medida otros portadores de azcar de manera similar ejercer un alto
grado de control sobre el flujo glucoltico habr que esperar a la identificacin de
estos portadores y la clonacin molecular de los genes responsables.