Separacin de protenas por electroforesis en gel de poliacrilamida.

Ochoa Poblano Apolinar Rafael

Laboratorio de Mtodos de anlisis

Prof. Fernando Hernndez Derramadeo

Grupo: 4IM1

Seccin: II

Fecha de entrega: 04-05-2016

Separacin de protenas por electroforesis en gel de poliacrilamida.

La electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida es una tcnica ampliamente
usada para caracterizar mezclas de protenas por ser un mtodo rpido y econmico a
nivel de muestra pues se requieren cantidades pequeas de protena.
Las protenas presentan una carga elctrica neta cuando estn en un medio que tenga
un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse
cuando se someten a un campo elctrico. La velocidad de migracin es proporcional a la
relacin entre las cargas de la protena y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de
masa ms rpida ser la migracin. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte
para este mtodo pues la migracin de las protenas es proporcional a la carga neta, al
tamao y forma de las protenas.
Los geles de poliacrilamida son qumicamente inertes, transparentes y estables en un
amplio rango de pH, temperatura y fuerza inica.
Algunas de sus caractersticas de la electroforesis en geles de poliacrilamida son:

Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de la acrilamida por

accin de un agente entrecruzador ('cross-linking'), el bis-acrilamida en presencia de un
iniciador y un catalizador.

La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bisacrilamida, siendo menor el poro cuanta ms bisacrilamida vs. acrilamida se use.
.
La mayora de las protenas se separan bien en el rango 5 a 10%. Un menor
porcentaje (mayor tamao de poro) es mejor para separar protenas de gran tamao.
.
En funcin del estado de las protenas en un proceso electrofortico se clasifican
en ; electroforesis nativas o desnaturalizantes.

una electroforesis desnaturalizante es la que somete a las protenas a migracin

asegurando la completa desnaturalizacin donde la migracin es proporcional a la carga
y al tamao de la molcula pero no a su forma.

una electroforesis nativa es la que somete a las protenas a migracin sin

desnaturalizacin. En esta situacin las protenas migran en funcin de su carga, de su
tamao y de su forma.

Objetivos.

Efectuar la separacin de protenas de varias muestras mediante la tcnica de

electroforesis en gel de poliacrilamida.
Determinar cul es el tamao ptimo del poro del gel, para la mejor separacin de
cada una de las muestras.

Mtodo experimental.
Armado de gel.

Sobre una placa de vidrio, formar marcos con postes y travesao de tefln.
Untar vaselina por ambos lados de los postes y travesaos, colocar por encima la
placa de vidrio de menor tamao.
Fijar las placas con clips grandes, presionando las placas.

Preparacin del soporte.

Mezclar las soluciones sealadas para el Gel separador.
Concentrac
in final de
poliacrilam
ida %T
Solucin A
(mL)
Solucin B
(mL)
Persulfato
de amonio
(mL)
Volumen
final (mL)

12.5

10.0

7.5

5.5

5.7

4.5

3.45

2.55

1.65

1.65

1.65

1.65

6.15

7.35

8.40

9.30

13.5

13.50

13.50

13.50

Gel empacador.

Ya polimerizado el gel separador, preparar el gel empacador.

Agregar hasta el borde el gel, colocar el peine, dejar polimerizar 10 a 40 min.
Marcar los puntos de los dientes, al trmino de la polimerizacin quitar los clips

Preparacin de la cmara.

Colocar las placas en la cmara de electroforesis, sellando las partes superior e

inferior.
Adicionar en la parte superior de la cmara el regulador, hasta el borde de las
placas.
En la parte de abajo agregar 100mL de solucin D.

Desarrollo Electrofortico.

Conectar la fuente de poder a la cmara, empezar en 100 v y subir lentamente

hasta 150
Dejar correr el electro 2 a 3 hrs. Apagar el equipo medir longitud antes de teir.

Fijacin de las muestras.

Colocar el electroferograma en un recipiente de plstico, que contenga ATC,

esperar a vire amarillo y lavar con agua.

Tincin de protenas con azul de coomassie G-250.

En el mismo recipiente despus de regresar el ATC, agregar el azul y dejarlo por 12

hrs.

Lavado del electroferograma.

Quitar el azul regresndolo a su envase, Lavar 3 a 4 veces con agua destilada.

Medir las longitudes despus de teir, distancia recorrida.

Resultados.
Tabla 1. Caractersticas de los electroferogramas a diferentes %T
Caractersticas
%T

Longitud del gel antes de teir , cm, (l)

Longitud del gel despus de teir.
Distancia recorrida por el colorante.
Suero
No. De bandas en :
Yogurt
clara

5.5

7.5

10

12.5

7.5
8.2
6.3
3
1
4

6.3
7.2
5.3
8
2
8

6.2
6.8
4.5
4
6
8

8
8.2
6.3
3
2
8

Tabla 2. Movilidad electrofortica relativa promedio

%T

5.5

7.5

10

12.5

Muestra
Suero
Yogurt
Clara
Suero
Yogurt
Clara
Suero
Yogurt
Clara
Suero
Yogurt
Clara

Valores de m de la protena
seleccionada (cm)
6.2
6.2
6
5.3
5.5
5.6
4.5
5.4
5.5
4
4.6
4.5

6.3
6.7
6.7
5.3
5.6
5.7
4.5
5.4
5.3
4.1
4.7
4.5

6.5
6.5
6.5
5.3
5.6
x
4.5
5.5
5.1
3.9
4.6
4.4

Valor
promedio
de m (cm)

Movilidad
electrofortic
a relativa. M

Log
(Mx100)

6.33
6.46
6.4
5.3
5.56
5.5
4.5
5.43
5.3
4
4.63
4.46

0.9184
0.9378
0.9291
0.8588
0.9
0.8912
0.9117
1.1001
1.0738
0.6144
0.717
0.6906

1.9633
1.9721
1.9681
1.934
1.9542
1.9499
1.95
2.0414
2.0309
1.7919
1.855
1.8392

2
1.95
1.9
log (MX100)

1.85

Suero
Yogurt

1.8

Clara

1.75
1.7
5

10

11

12

13

%T

Suero.

A= 2.1109

B= -0.025

R= -0.992

Y= 2.1109-0.025X

Yogurt. A= 2.074

B= -0.017

R=-0.9904

Y=2.074-0.017X

Clara.

B= -0.019

R= -0.988

Y= 2.0816- 0.019

A= 2.0816

a) La protena con mayor peso molecular es el suero mientras que el menor peso es el
yogurt. La protena con mayor carga es el suero y la de menor carga es el yogurt.
b) Escriba la reaccin completa para la copolimerizacin de la acrilamida y la
bisacrilamida por radicales libres.
Qu funcin tiene el TEMED y el pesulfato de
amonio?

La funcin TEMED
como catalizador.

es ser el indicador de la reaccin el pesulfato de amonio servir

c) Mencione una aplicacin de la electroforesis preparativa y una de las electroforesis

analticas.

En la electroforesis analtica esta la separacin del DNA y en la electroforesis preparativa

los aminocidos de una protena.

d) Defina velocidad de migracin y movilidad electrofortica.

La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al producto de
su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e inversamente
proporcional al coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de la molcula, o sea,
a la resistencia que le ofrece el medio.
La movilidad electrofortica (Me) es un caso particular de la velocidad de migracin de
un in, cuando se aplica un campo elctrico de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga
de la partcula.
e) Defina el termino electroferograma.
Es un grfico realizado con los resultados de un anlisis por electroforesis.
Discusin.
La electroforesis es un mtodo que permite separar molculas biolgicas que presenten
alguna carga (+ -) al pasar por un campo elctrico. Las protenas utilizadas presentan
carga negativa por el pH al que estn sometidas y en la grfica de Ferguson se observa
que todas presentan una pendiente negativa y todas tienen una tendencia recta a las
diferentes concentraciones de acrilamida. Gracias a la ecuacin de cada recta de cada
protena se puede analizar su carga y su PM relativo. Se eliminaron los valores de log
(MX100) por su incremento lo cual indica que se presentaron errores al trabajar a esa
concentracin. Entre mayor sea el valor de la ordenada al origen mayor ser la carga,
por lo tanto el suero es la que presenta mayor carga, despus la clara y por ltimo el
yogurt, de la misma forma entre mayor sea la pendiente, mayor es el peso molecular,
por lo tanto el suero es el que presenta mayor peso molecular, seguida de la clara y del
yogurt. Este anlisis de cargas y PM permite saber cul de las 3 protenas utilizadas
tendr mayor movilidad electrofortica que es el suero.
La cantidad de bandas obtenidas en las diferentes concentraciones de acrilamida
muestran la concentracin a la cual es adecuada trabajar la electroforesis con las
protenas utilizadas ya que la concentracin de acrilamida (% T) representa el porcentaje
en peso del monmero total empleado y determina la longitud promedio de la cadena
del polmero. A una concentracin de 7.5 se obtienen mayor cantidad de bandas para el
suero, pero para el yogurt es mejor una concentracin de 10 porque ah hay ms
bandas. En el caso de la clara de huevo se obtienen la misma cantidad de bandas a una
concentracin de 7.5, 10 y 12.5, por lo cual cualquiera es adecuada para trabajar la clara
de huevo.
En la electroforesis la movilidad de las protenas se va a deber a diferentes factores
como valores de pH que proporciona le medio, la carga, PM, fuerza inica, etc. El pH del

medio va a afectar la carga de las protenas, como comparacin se sabe que la mayora
de las protenas presentes en la clara de huevo tienen un punto isoelctrico bajo y el pH
del regulador de trabajo es de 8.7 a 9.1, por lo tanto la carga de estas protenas ser + y
el arrastre ser del ctodo al nodo.
Conclusiones.

Las protenas del yogurt, clara y suero al presentar carga pueden ser separadas
por electroforesis en gel de poliacrilamida y su movilidad va a depender de la
magnitud de su carga y su PM relativo. Estos valores se pueden obtener por medio
de la grfica de Ferguson.
La concentracin de acrilamida ptima para trabajar las protenas es donde estas
presenten mayor cantidad de bandas y de buena resolucin. El suero es ptimo a
una concentracin de 7.5, el yogurt a una concentracin de 10 y para la clara de
huevo pueden ser a 7.5, 10, 12.5

Bibliografa.
http://www.bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.htm
https://books.google.com.mx/books?id=i_7RXUu44IC&pg=PT52&dq=electroforesis+de+proteinas&hl=es419&sa=X&ved=0ahUKEwiFy9qNsr_MAhWquIMKHb2cBZsQ6AEIGjAA#v=onepage&q=ele
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