Mosquitos

PESQUISA

TRANSGNICOS
Controle da transmisso de malria e dengue

Margareth de L. Capurro

Ph.D. Cincias Professor Doutor Depto

Parasitologia Instituto de Cincias
Biomdicas USP So Paulo
mcapurro@icb.usp.br

Paulo E. M. Ribolla

Ph.D. Cincias Professor Doutor Depto

Parasitologia Instituto de Biocincias
UNESP Botucatu pribolla@ibb.unesp.br

Antnio G. de Bianchi

Livre Docente Professor Convidado

Instituto de Cincias Biomdicas USP
So Paulo agdbianc@icb.usp.br

Mauro T. Marrelli

Ph.D. Cincias Ps-Doutorando Depto

Parasitologia Instituto de Cincias
Biomdicas USP So Paulo

palavra mosquito tem sido

utilizada popularmente
para indicar diferentes insetos de tamanho reduzido que causam incmodo aos seres
humanos. Entre esses insetos, os pertencentes famlia Culicidae so importantes transmissores de uma srie
de patgenos. O ciclo biolgico desses mosquitos compreende as seguintes fases: ovo, quatro estgios larvais,
pupa e adulto (figura 1). Durante esse
ciclo, os mosquitos adultos so alados, possuem pernas e antenas longas
e muitos so hematfagos, enquanto
as fases imaturas so aquticas.
No final do sculo XIX, surgiram
os primeiros relatos vinculando os
mosquitos com a transmisso de enfermidades ao homem. A primeira
evidncia foi obtida por Manson, em

Abrahim de S. Caroci

Mestrando, Biologia da Relao PatgenoHospedeiro Depto Parasitologia Instituto

de Cincias Biomdicas USP So Paulo

Marcela Magalhes

Mestrando, Biologia da Relao PatgenoHospedeiro Depto Parasitologia Instituto

de Cincias Biomdicas USP So Paulo

Fabiana M. Feitosa

Mestrando, Biologia da Relao PatgenoHospedeiro Depto Parasitologia Instituto

de Cincias Biomdicas USP So Paulo

Juliano P. Chinoca

Iniciao Cientfica - Depto Parasitologia

Instituto de Cincias Biomdicas USP
So Paulo

Bianca Burini

Iniciao Cientfica - Depto Parasitologia

Instituto de Cincias Biomdicas USP
So Paulo
Fotos/Ilustraes cedidas pelos autores

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Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 22 - setembro/outubro 2001

1877, que confirmou o desenvolvimento de filrias (Wuchereria bancrofti) causadoras de elefantase, no

mosquito Culex fatigans. Ross, trabalhando na ndia, em 1897, demonstrou o desenvolvimento de Plasmodium em mosquitos. A comprovao
definitiva da transmisso da malria
humana por Anopheles claviger foi
apresentada logo a seguir por Grassi,
em 1898. A transmisso do vrus da
febre amarela pela picada de mosquitos Aedes aegypti foi demonstrada em
Cuba, no ano de 1900, pela equipe
liderada por Reed (Christophers, 1960;
Foster, 1965; Clements, 1992; Mitchell,
1996) (figura 2).
Hoje, um sculo aps essas descobertas, sabemos que os mosquitos so
vetores das quatro espcies de Plasmodium que causam malria huma-

na, alm de transmitirem filrias (Wuchereria bancrofti e Brugia malayi) e

muitos arbovrus, contribuindo, assim, de maneira expressiva, para os
atuais ndices de mortalidade e morbidade humana no mundo. Todos os
anos so relatados aproximadamente
250 milhes de novos casos de malria, filarioses e arboviroses relacionados diretamente, com a presena desses insetos (OMS, 2000).
Levantamentos recentes indicam
que a malria responsvel por aproximadamente 2,1 milhes de mortes
por ano no mundo, correspondendo a
4% da mortalidade mundial total (Guerrant & Blackwood, 1999). No Brasil,
so relatados aproximadamente 500
mil novos casos clnicos de malria a
cada ano. O nmero de casos de
dengue e dengue hemorrgica tem
apresentado um crescimento nos ltimos anos. Menos de 30 mil casos
foram reportados no mundo entre
1956 e 1980, porm esse nmero aumentou para 137 mil entre 1981 e 1985
e mais de 267 mil casos entre 1986 e
1990 (Guerrant & Blackwood, 1999).
Somente no Brasil, foram notificados
314.225 e 227.363 casos de dengue,
em 1998 e 2000, respectivamente. No
Estado de So Paulo, foram notificados 3.530 casos de dengue em 2000, e,
at 21 de junho de 2001 os casos
reportados j atingiram mais de 33.000
(Diviso de Zoonoses/CVE SUCEN).
Nas reas endmicas, programas
de preveno, combate e controle
dessas enfermidades esto comprometidos devido ao desenvolvimento

de resistncia mltipla s drogas pelas

formas parasitas, de resistncia a inseticidas dos insetos vetores, como tambm a interrupo dos programas de
controle do vetor devido aos custos
crescentes (Carlson et al., 1995). Frente a esse quadro, evidente a necessidade do desenvolvimento de novas
estratgias e o aprimoramento dos
programas atuais destinados ao controle da transmisso dessas enfermidades.
Uma hiptese que tem sido utilizada a de que mosquitos geneticamente manipulados ou transgnicos poderiam ser utilizados no bloqueio ou
na reduo da transmisso de doenas. O objetivo dessa estratgia aumentar a freqncia, em uma populao de mosquitos, de um gene que

interfira no desenvolvimento ou na
propagao de patgenos, resultando na reduo ou na eliminao de
sua transmisso ao homem. Ferramentas de biologia molecular esto
sendo utilizadas na sntese de genes
que, quando incorporados ao genoma do mosquito resultariam em mosquitos refratrios e/ou no transmissores dos patgenos. Esses genes
sero acoplados a transposons, de
forma tal que a introduo dos mosquitos geneticamente modificados
resultar na propagao e fixao
do transgene na populao do vetor
alvo. Como resultado da execuo
dessa estratgia, espera-se diminuio na transmisso e, conseqentemente, no nmero de casos da doena.
Para testar essa hiptese, no entanto, algumas tcnicas precisam
ser desenvolvidas em laboratrio
para serem aplicadas na produo
dos mosquitos transgnicos. Tambm precisamos de informaes sobre como novos transgenes, introduzidos no genoma dos mosquitos,
iro se fixar na populao alvo.
Essas informaes so de vital importncia, pois fornecem a base
cientfica para uma estratgia racional de modulao gentica da competncia dos vetores (Collins e James, 1996).
Um mosquito modificado geneticamente resistente a um patgeno
deve, necessariamente, ter em seu
genoma uma informao nova que
bloqueie a sua infeco pelo pat-

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 22- setembro/outubro 2001

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geno. A maneira mais eficiente de

introduzir desse transgene no mosquito atravs de elementos de transposio, os transposons (figura 3).
Transposon o conjunto de segmentos lineares de DNA capazes de mudar
de posio dentro do genoma, independentemente de homologia entre a
regio genmica onde se encontram
inseridos e o local para o qual se
movem. Os transposons possuem seqncias nucleotdicas muito similares em ambas as extremidades (repeties terminais), carregam gene(s)
que codifica(m) a enzima capaz de
transport-los (transposases) e criam,
ao se inserir no DNA, pequenas duplicaes no stio alvo da insero (repeties diretas do DNA alvo), podendo
existir em cpias mltiplas no genoma.
Construo dos
transgenes - malria
Um dos modelos que est sendo
utilizado para testes da construo do
transgene o da malria aviria, utilizando o mosquito vetor Aedes aegypti,
o hospedeiro vertebrado Gallus gallus
(galinhas e pintainhos) e o parasita
Plasmodium gallinaceum. Esses resultados serviro de base antes do
desafio maior, que o sistema da
malria humana, Plasmodium vivax e
Plasmodium falciparum e o seu inseto vetor Anopheles sp.
O ciclo de vida dos plasmdios
compreende fases sexuadas e assexuadas. Durante a tomada de sangue de
um hospedeiro infectado, o mosquito
ingere parasitas na forma de gametcitos, que permanecem no seu trato
digestivo por algumas horas, onde
ocorre a fertilizao. Aps a fertilizao, os parasitas sofrem modificaes
estruturais, resultando numa forma
mvel, o oocineto, que penetra pelo
epitlio do trato digestivo, alojando-se
entre as clulas epiteliais e a lmina
basal. O oocineto desenvolve-se atingindo a forma de oocisto, que entra
em processo de esporogonia, liberando na hemocele dos insetos milhares
de esporozotos. As formas livres esporozotas invadem as glndulas salivares, permanecendo nesse rgo at
o mosquito tomar outra alimentao
sangunea, infectando assim um novo
hospedeiro vertebrado (figura 4).
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Onde bloquear os parasitas

Durante a passagem dos plasmdios pelo interior dos mosquitos, vrios pontos so alvos potenciais para o
bloqueio do ciclo de vida do parasita
e a concomitante interrupo da transmisso. Ao ser ingerido pelos mosquitos, os gametcitos se desenvolvem
em gametas. Os sinais que desencadeiam esse processo esto intimamente ligados ao mosquito. Diminuio da temperatura do sangue ingerido pelos mosquitos e alterao no pH
esto envolvidos nesse processo. Alm
disso, uma substncia presente nos
mosquitos, chamada de GAF (fator
ativador de gameta), tambm faz parte do processo de ativao dos gametcitos masculinos.
Aps a formao do oocineto, este
precisa atravessar o epitlio digestivo
para formar o oocisto. A primeira
barreira encontrada pelo oocineto a
matriz peritrfica. Nos mosquitos, essa
matriz, constituda principalmente de
quitina e protenas, parece ter o papel
protetor do muco presente em nosso
intestino. Para atravessar essa barreira, o oocineto sintetiza uma enzima
capaz de hidrolisar a quitina, uma
quitinase. Essa enzima sintetizada
sob a forma de um zimgeno, ou seja,
uma pr-enzima sem atividade. Para
que o zimgeno se ative, necessrio
que ele seja clivado pelas tripsinas
presentes no trato digestivo dos mosquitos. As tripsinas so secretadas pelo

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 22 - setembro/outubro 2001

mosquito e esto envolvidas na digesto das protenas do sangue.

Na hemolinfa, os oocistos se
rompem e os esporozotos migram
em direo s glndulas salivares.
Os esporozotos so cobertos por
uma protena imunodominante, a
protena circumsporozota (CSP)
(Krettli et al., 1988). Vrios autores
tm demonstrado, tanto in vivo
como in vitro, que alguns anticorpos monoclonais obtidos contra a
protena CSP promovem o bloqueio
da transmisso da infeco (Warburg et al., 1992; Ramirez et al.,
1995). Em Plasmodium gallinaceum
foi demonstrado que o soro N2H6D5
eficiente no bloqueio da penetrao das glndulas salivares pelos
esporozotos (Warburg et al., 1992).
Obteno dos promotores
especficos
Um passo primordial na transgnese a utilizao de um promotor que dirija a expresso do gene
de interesse no local e no tempo
necessrios para o bloqueio do ciclo de vida do parasita. No adiantaria expressar uma protena letal
ao parasita em um rgo que ele
no se encontra. Como visto acima,
trato digestivo, hemolinfa e glndulas salivares so stios interessantes
para a expresso de protenas antiparasitas. A caracterizao de promotores especficos para esses dife-

rentes locais vem sendo realizada por

diferentes vias. No trato digestivo, os
promotores das enzimas digestivas
parecem ser timos candidatos para
esse fim. Uma vez que a expresso de
algumas dessas enzimas est relacionada com a tomada de sangue pelas
fmeas dos mosquitos, esses promotores seriam timos candidatos para a
expresso de genes que matem o
parasita no lmen do trato digestivo. A
cintica de expresso das enzimas
presentes aps a tomada de uma refeio de sangue pelas fmeas foi verificada para os anofelinos neo-tropicais
transmissores
(An.darlingi,
An.aquasalis e An.albitarsis) e foi
possvel observar que a tripsina a
enzima majoritria aps a tomada de
sangue, sendo que a atividade dessa
enzima comea a aumentar logo aps
o repasto (Caroci et al., 1999).
Na hemolinfa dos mosquitos, a
lipoforina a protena majoritria responsvel pelo transporte de lipdeos
nos insetos (Capurro et al., 1994; van
Heusden, 1997). Encontramos tambm vitelogenina e hexamerinas, as
quais so protenas sintetizadas pelos
corpos gordurosos dos mosquitos e
secretadas para a hemolinfa. As seqncias promotoras correspondentes a essas protenas esto sendo avaliadas em estudos utilizando-se mosquitos transgnicos quanto sua capacidade de produo de genes antiparasitas sem interferncia no prprio
metabolismo dos mosquitos. Os corpos gordurosos esto sendo alvo de
muitos estudos na caracterizao dos
promotores que possam regular a produo de protenas anti-parasitas que
tenham como alvo os esporozotos da
hemolinfa dos mosquitos.

(Whitlow & Filpula, 1991). O resultado um gene relativamente pequeno

(750 - 800 nucleotdeos), que traduz
uma protena de, aproximadamente,
30 kDa. Se diminuirmos o peptdeo
(Gly3Ser)4 para (Gly3Ser)1, o resultado
um Fv de cadeia dupla (Fv2) (figura
5.C). O cDNA que corresponde
poro Fv da imunoglobulina N2H6D5
foi produzido na forma de scFv com
sucesso (N2scFv) e capaz de reconhecer a CSP de P.gallinaceum (Capurro et al., 2000).
Para testarmos a capacidade bloqueadora da penetrao dos esporozotos nas glndulas salivares do mosquito, foi utilizado o sistema transiente de expresso de vrus Sindbis (Jiang
et al., 1995). Foi construdo um gene
que tem a poro promotora do vrus
Sindbis (Higgs et al., 1997), um peptdeo sinal, que o descrito para a

protena Maltase-like I (Mal I) de glndula salivar de Aedes aegypti (James et

al., 1989) e o cDNA N2scFv, resultando em vrus Sindbis recombinante, o
qual expressa o transgene MalI-N2scFv
(figura 6). O peptdeo sinal MalI
reconhecido pelas clulas de insetos o
qual faz com que o anticorpo recombinante N2scFv seja secretado para a
hemolinfa dos mosquitos. Mosquitos
foram infectados pelo vrus recombinante MalI-N2scFv, por inoculao
intratorxica e, aps 48 horas, os
mosquitos sobreviventes foram expostos pintainhos infectados por P.
gallinaceum. Aps 14 dias, as glndulas salivares das fmeas alimentadas
com sangue infectado, foram recuperadas e o nmero de esporozotos nas
glndulas salivares determinados por
contagem dos parasitas, em microscopia de fase. Os resultados mostraram

Obteno de genes anti-parasita

(transgenes)
Os cDNAs que codificam o fragmento Fv da IgG-N2H6D5 foram clonados (figura 5). Tipicamente o cDNA
obtido por amplificao gnica da
regio varivel da cadeia pesada da
imunoglobulina (VH), o qual acoplado regio varivel da cadeia leve (VL)
por uma seqncia de nucleotdeos
que codifica um peptdeo (Gly3Ser)4 o
qual permite a juno das duas cadeias, formando um fragmento scFv (single chain Fragment variable antibody)
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 22- setembro/outubro 2001

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esporozotos e oocineto, respectivamente. Apesar de apresentarem uma

estrutura bem diferente, a mesma
seqncia de peptdeos apresentou
alta afinidade por essas duas clulas.
Alm disso, esse peptdeo foi eficiente no bloqueio da invaso por
oocinetos e por esporozotos (Gosh
et al., 2001).
Dengue

que os mosquitos que expressam o

gene MalI-N2scFv reduzem em 99.8%
o nmero de parasitas na glndula
salivar quando comparado com os
controles (Capurro et al., 2000).
As linhagens transgnicas
O cDNA, MalI-N2scFv foi inserido
em dois plasmdeos, os quais diferem
somente no promotor. O primeiro
contm o promotor da vitelogenina
(Vt) (ativado por repasto sanguneo)
de Ae.aegypti, e o segundo contm o
promotor de ubiquitina (Ub) (promotor constitutivo) de Drosophila melanogaster. O elemento de transposio
utilizado foi o mariner de
D.melanogaster, e o gene reprter foi
o promotor de Actina 5 (Act5C) de
D.melanogaster acoplado protena
fluorescente EGFP (figura 7). Os primeiros resultados dessas linhagens
transgnicas mostraram que os mosquitos que expressaram o gene N2scFv no transmitem malria aos pintainhos com 10 dias de vida, sendo,
portanto, linhagens refratrias (Anthony James, comunicao pessoal).

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Essas linhagens foram produzidas na

Universidade da Califrnia, Irvine, e
esto sendo estudadas quanto a sua
capacidade refratria e o quanto esse
novo transgene poder interferir na
prpria fisiologia dos mosquitos.
Outra metodologia empregada para
a obteno de protenas que bloqueiem o ciclo de vida do plasmdio no
mosquito foi a utilizao de bibliotecas de fagos contendo peptdeos aleatrios. Uma biblioteca de fagos expressando peptdeos aleatrios (phage display random peptides library)
consiste de uma mistura de vrios
fagos, cada um deles expressando um
peptdeo em seu capsdeo. A biblioteca utilizada apresenta uma insero
de um peptdeo aleatrio de 8 aminocidos flanqueados por duas cistenas
na poro aminoterminal da protena
VIIII do capsdeo do fago M13. Essa
mistura de fagos foi utilizada para a
seleo de peptdeos com afinidade
para as glndulas salivares de
An.stephensi e com afinidade para o
epitlio luminal do trato digestivo.
Essas duas regies so invadidas por
diferentes formas de plasmdio, por

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 22 - setembro/outubro 2001

O principal inseto vetor da transmisso da dengue o mosquito

Aedes aegypti, o qual vive nas reas
urbanas juntamente com o hospedeiro humano (Gubler & Kuno, 1997).
A primeira tentativa de uma molcula efetora ser a construo de um
anticorpo recombinante (scFv), estratgia essa que j foi obtida com
sucesso no projeto malria (Capurro
et al., 2000).
O anti-dengue recombinante scFv
est sendo desenvolvido a partir de
linhagens de anticorpos monoclonais que j esto descritos na literatura. O monoclonal, 3H5-1-21 (Henchal et al., 1982), neutraliza fortemente o vrus dengue-2. Outro monoclonal, 4G2 (Henchal et al., 1985)
reconhece epitopos de envelope nos
quatro sorotipos de vrus da dengue
(DEN vrus). Um terceiro monoclonal, H27.37, (Cecilia & Gould, 1991)
neutraliza os quatro sorotipos da
dengue e tambm outras flaviviroses
como West Nile, febre amarela, e a
encefalite japonesa. Os monoclonais
9A3D-8, 1A1D-2 e 1B7 reconhecem
a protena de envelope dos vrus da
dengue e 2H2 reconhece a protena
precursora M (Roehring et al., 1998).
Concluses
Existem inmeros entraves para
a execuo de um projeto dessa
amplitude, onde muitas informaes
bsicas so necessrias e ainda no
disponveis, tal como dados sobre
ecologia e dinmica de populaes
das diferentes espcies de mosquitos.
Apesar dessas dificuldades, acreditamos que, conjuntamente com
outras tcnicas de controle da malria e da dengue, tais como o uso de
inseticidas, prticas agrcolas que levam diminuio das populaes

dos vetores e outras, levaro a um

controle efetivo dessas doenas.
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