UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICAS DE LABORATORIO
IDENTIFICACION BACTERIANA II
Maye Bernal Rivera

PARTE II.
LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS
Para la lectura, interpretacin e identificacin del crecimiento bacteriano, primero que
todo se sigue un estudio cualitativo que comprende los siguientes parmetros:
1. Caractersticas Macroscpicas de las colonias
a. Medios Lquidos
i.
ii.
iii.
iv.

Enturbiamiento: parejo, en ondas, cordones suspendidos.

Capas superficiales.
Precipitados: polvoriento, granuloso, viscoso.
Pigmentos di fusibles.

b. Medios Slidos. Estudio de Colonias:

i. Tamao : puntiforme, pequeo, mediano, grande, extendidas en
velo, invadiendo toda la superficie del medio.
ii. Forma:
circular, alargada, irregular, filamentosa, rizoide,
fusiforme.
iii. Bordes: enteros, dentados, lobulados, rizoides.
iv. Superficie: lisa, rugosa.
v. Levantamiento: plana, convexa, acuminada, umbilical
vi. Consistencia: mucoide, friable, seca, viscosa
vii. Transparencia: transparente, traslucida, opaca
viii. Color: blanco, amarillo, gris, verde, rojo, etc.
2. Cambios Producidos en el medio
a. Pigmentos difusibles (bacterias pancromforas) que cambian el color del
medio: verde, amarillo, rojo, marrn, etc.
b. Olor: algunas bacterias emiten olores caractersticos, como a frutas,
chocolate, queso, etc.
c. Hemlisis: alfa, beta, beta prima y gamma o no hemolticas.
d. Metabolismo
3. Caractersticas Microscpicas de la Colonia

Las caractersticas microscpicas de las colonias se

estudian mediante la coloracin de Gram, una
coloracin compuesta, que permite clasificar las
bacterias en dos grandes grupos: Gram Positivas y
Gram Negativas.
La coloracin fue desarrollada en 1884 por Hans
Christian Joachim Gram, farmaclogo, patlogo y
eminente profesor de Medicina Interna. Esta coloracin
posiblemente es el procedimiento ms trascendental
para el diagnstico bacteriolgico jams desarrollado.
Adems de la afinidad, esta coloracin permite establecer:

Hans Christian Joachim

Gram. 1853 - 1938

a. Morfologa (cocos, bacilos, espirilos, cocobacilos, vibrios, etc.)

b. Agrupacin (en pares, cadenas, ttradas, racimo, sarcina, empalizada,
caracteres, etc.)
c. Afinidad: Gram positiva o Gram negativa
d. Otras estructuras: A veces la coloracin de Gram permite observar
cpsulas, pero hay coloraciones especficas para determinar la
presencia de otras estructuras bacterianas, como por ejemplo:
i.
ii.
iii.
iv.

Cpsula ( Tinta China, Hiss )

Esporos ( Shaeffer Fulton )
Flagelos ( Leiffson )
Grnulos metacromticos ( Van Stoltemberg, Loeffler )

Coloracin de Gram
Procedimiento:
1. Cristal Violeta
-

Lavar con agua corriente

2. Lugol
-

5 segundos

Lavar con agua corriente

4. Safranina
-

1 minuto

Lavar con agua corriente

3. Alcohol Acetona
-

1 minuto

30 segundos

Lavar con agua corriente

4. Pruebas bioqumicas
5. Pruebas Biolgicas
El uso de animales para el aislamiento y la identificacin de agentes
patgenos est limitado a laboratorios de experimentacin, ya que hoy en da
se cuenta con equipos automatizados y pruebas inmunolgicas y moleculares
para llegar al diagnstico etiolgico del agente infeccioso.
6. Pruebas Inmunolgicas

Se basan en la utilizacin de anticuerpos especficos para la deteccin de

antgenos presentes en las bacterias (polisacridos capsulares, protenas
flagelares y otros varios componentes de la pared celular). La deteccin puede
hacerse en la bacteria completa o libre, en antgenos solubles
7. Pruebas de Biologa Molecular
Estas pruebas se han convertido hoy en da en el criterio principal para la
clasificacin taxonmica, la identificacin bacteriana, el diagnstico etiolgico
en enfermedades infecciosas y estudios epidemiolgicos; basadas en el grado
de relacin entre las secuencias de los cidos nucleicos, mediante anlisis
bien sea del DNA o RNA de los microorganismos.

PRACTICA DE LABORATORIO
PARTE II. LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS
Objetivos especficos
-

Observar el desarrollo bacteriano en los diferentes medios de cultivo

Estudiar las caractersticas macroscpicas de una bacteria en un medio de
cultivo
Estudiar los cambios producidos en los diferentes medios
Preparar frotis en lminas portaobjetos, a partir de cultivos bacterianos en
medio lquido y en medio slido
Aprender a realizar la coloracin de Gram
Conocer las diferentes caractersticas morfolgicas bacterianas
Conocer los diferentes tipos de agrupacin bacteriano
Diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.
Conocer cultivos mixtos
Aprender a distinguir los tipos de hemlisis

Materiales
- Cultivos bacterianos
- Lminas, asas, mecheros, marcador de vidrio, papel absorbente
- Colorantes para Gram
- Microscopio y aceite de inmersin
- Faringocultivo
Procedimiento
1. Estudio Macroscpico
Observar cada uno de los seis medios de cultivo sembrados:
a. Caldo: Estudiar las caractersticas, de acuerdo a las especificaciones
de arriba
b. Agar Nutritivo inclinado: Observar si hubo o no crecimiento en la
superficie
c. Agar semislido: Especificar si hubo o no crecimiento y si creci,
determinar si es mvil o inmvil
d. Agar Nutritivo: Observar si hubo crecimiento y si se produjo cambios en
el medio.
e. Agar Sangre: Observar si el cultivo est puro (un solo tipo de colonias) o
mixto (ms de un tipo de colonias). Escoger una colonia aislada y
estudiar sus 8 caractersticas macroscpicas, cambios producidos en el
medio (hemlisis), aspecto, olor, etc.
f. Agar Mac Conkey: Establecer si hubo o no crecimiento bacteriano. Si
hubo crecimiento, especificar si se trata de una bacteria lactosa positiva
o lactosa negativa.
2. Estudio Microscpico
Hacer frotis a partir del caldo y a partir de una colonia del agar sangre.

Procedimiento
1. Identificar la lmina: Destinar un tercio de la lmina para identificarla,
utilizando marcador de vidrio o cinta de enmascarar (si la lmina es
esmerilada, usar lpiz)

Solucin salina +
colonia del agar sangre

Caldo
Pedro Lpez
170305001
Gram

2. Hacer el frotis:
A partir de caldo: esterilizar el asa, enfriarla dentro del caldo,
sacudirla contra la pared del tubo, sacar una asada y distribuirla en
forma circular, cerca al sitio de identificacin de la lmina.
A partir de agar: colocar una gota de solucin salina estril en el
costado distal de la identificacin, esterilizar el asa, enfriarla en el
borde del agar, tocar la superficie central de la colonia y
homogenizar con la gota de solucin salina, en forma circular.
3. Dejar secar a temperatura ambiente
4. Fijar al calor: flamear unas dos o tres veces, controlando la temperatura
de la lmina en el dorso de la mano para evitar que se quemen las
clulas bacterianas
5. Colorear con Gram (ver tcnica arriba)
6. Secar con papel absorbente: secar el reverso de la lmina, colocar el
papel sobre la mesa de trabajo, voltear la lmina y hacerle una ligera
presin
7. Dejar secar completamente: colocar en posicin vertical hasta que est
completamente seca.
8. Adicionar aceite de inmersin: dejar caer una gota sobre el rea de la
preparacin.
9. Observar al microscopio: enfocar en 10X y observar en 100X
10. Dibujar e Informar la morfologa, afinidad y agrupacin en caso de ser
especfica y predominante.
3. Conocer y dibujar las diferentes morfologas, agrupaciones y diferenciar gram
positivos de gran negativos; para ello debe revisar las preparaciones
coloreadas de sus compaeros de mesa.
4. Faringocultivo: Lectura e interpretacin.
Mirar la superficie del agar sangre para determinar si es un cultivo mixto o
puro.
Observar a trasluz para buscar colonias beta hemolticas

Discutir con su profesor los hallazgos

Informar el resultado.
Actividad
1. Dibuje las diferentes morfologas, tipo de agrupacin y afinidad con respecto al
Gram, de las bacterias
2. Investigue por qu algunas bacterias no crecieron en Agar Mac Conkey y las
que crecen, por qu se diferencian en lactosa positivas y lactosa negativas?
3. Escriba 5 medios de cultivo utilizados en el Laboratorio de Microbiologa para
el aislamiento bacteriano en el diagnstico de enfermedades infecciosas y, la
utilidad de cada uno de ellos.
4. Defina qu es un portador sano