RESUMEN AYUDA PARA EL TP DE ENZIMAS.

A CONTINUACIN SE DESCRIBE UN PROTOCOLO PARA REALIZAR El TP CON AMILASA

(PUDES UTILIZARSE AMILASA FUNGICA O BIEN AMILASA SALIVAL)

Introduccin
El almidn est presente en la mayor parte de la dieta humana y de otros animales. Son
sintetizados naturalmente en una variedad de plantas, como por ejemplo: papa, maz, arroz, sorgo o
trigo. A partir del almidn los animales obtienen todos los carbohidratos derivados ms simples. La
estructura del almidn es similar a la de la celulosa, aunque presenta monmeros de glucosa unidos
por enlaces alfa-1,4 y alfa-1,6 glucosdicos en lugar de los enlaces beta-1,4 glucosdicos (celulosa).
Para poder aprovechar la energa almacenada y los tomos de carbono presentes en este
polisacrido, el sistema digestivo humano, con la ayuda de enzimas amilasas, debe primero romper
el polmero a azcares pequeos asimilables, que eventualmente son convertidos en las unidades
bsicas de glucosa.
Debido a la existencia de dos tipos de uniones, las alfa-1,4 y las alfa-1,6, varias estructuras son
posibles para las molculas de glucosa. Una versin no ramificada, de cadena simple con 500 a
2000 monmeros de glucosa con solo enlaces alfa-1,4 se denomina amilosa. Otra variante
ramificada con enlaces alfa-1,6 glucosdicos se conoce como amilopectina. El grado de
ramificacin es de aproximadamente una ramificacin por cada 25 monmeros de glucosa. Por
ltimo existe una variante presente en las clulas animales conocida como glicgeno que presenta
una ramificacin por casa 12 unidades de glucosa.
La glucosa es insoluble a temperatura ambiente. Debido a esto se almacena dentro de las clulas
(cuyo componente citoplasmtico es mayoritariamente agua) en pequeos grnulos los cuales
pueden ser vistos a escala microscpica. Los grnulos de almidn son resistentes a la penetracin de
agua y enzimas hidrolticas debido a la formacin de puentes de hidrgeno intracatenarios ente los
monmeros de glucosa y entre molculas de almidn. Aunque estos enlaces intra- e inter- catenarios
pueden debilitarse al aumentar la temperatura y as, favorecer la solubilidad de la molcula en agua.
Cuando se aumenta la temperatura, el agua penetra en los grnulos y estos se hinchan, el proceso se
conoce como gelatinizacin del almidn.
Cuando se digiere almidn los productos pueden variar de acuerdo al sitio desde donde se ataque o
degrade la molcula. Estos pueden ser: dextrina, maltotriosa, maltosa y glucosa. Las dextrinas son
segmentos de almidn cortos, que fueron rotos en la degradacin, que se produjeron como resultado
de la digestin al azar de enlaces glucosdicos internos. Una molcula de maltotriosa se produce si
se corta el tercer enlace al final de la molcula de almidn, una de maltosa se produce si el ataque se
produce en el anteltimo enlace, una glucosa se produce si se corta el ltimo enlace de la molcula.
El primer paso para la despolimerizacin es la ruptura de la molcula principal en pequeas
subunidades de diversos tamaos. La ruptura de partculas grandes reduce drsticamente la
viscosidad de la solucin gelatinizada, en un proceso conocido como liquefaccin. El paso final
de la despolimerizacin consiste en la formacin de mono-, di- y tri-sacridos como se describi
con anterioridad. Este proceso se conoce como sacarificacin por la formacin de sacridos.
Como una gran variedad de organismos, incluyendo a los humanos, pueden digerir el almidn, la
alfa-amilasa esta ampliamente distribuida en la naturaleza, en contraposicin con la celulosa que es
difcil de digerir y solo organismos determinados pueden hacerlo. Por ejemplo la saliva humana y la
secrecin pancretica contienen un gran nmero de alfa-amilasa para la digestin. La especificidad
del enlace atacado por la enzima depende de la fuente de esta. En la actualidad dos variedades de
alfa amilasa son comercializadas, se producen por medio de fermentacin microbiana. Se clasifican

de acuerdo al punto de ataque en el la cadena polimrica de glucosa: Liquefactantes y

Sacarificantes.
La amilasa fngica pertenece a la categora de las sacarificantes, ataca el anteltimo enlace en el
extremo no reductor de la molcula de almidn, se genera la separacin de dos unidades de glucosa
al mismo tiempo, es decir, un disacrido, llamado maltosa. La ruptura de enlaces es ms extensiva
en las enzimas sacarificantes que en las liquefactantes, en este tipo de enzimas las cadenas de
almidn son literalmente cortadas en pequeas subunidades rpidamente. Finalmente la
amiloglucosidasa (tambin conocida como glucoamilasa) selectivamente ataca y corta los ltimos
enlaces en los extremos no reductores. Amilasa fngica y la amiloglucosidasa pueden ser utilizadas
juntas para convertir almidn en azcares pequeos. La aplicacin prctica de esta mezcla de
enzimas incluye a la produccin de jarabe de maz (muy utilizado en la industria alimenticia) y la
conversin del cereal apisonado en azcares en la industria de la destilera.
Es importante especificar el origen de las enzimas utilizadas cuando se comparan sus actividades y
propiedades cinticas. Las modificaciones o cambios que se pueden introducir en un anlisis de
actividad enzimtica son: pH, temperatura y concentracin del sustrato.
El lugol (I2 en KI(aq)) es un reactivo que reconoce especficamente almidn, cambiando su
coloracin de rojo a azul intenso. Se utilizara como colorante en la reaccin de degradacin de
almidn ya que la intensidad de la coloracin es proporcional a la concentracin del almidn. Por
otro lado el reactivo de Biuret (CuSO4(aq)-[OH]-) se asocia irreversiblemente a los enlaces peptdicos
entre aminocidos de una protena, cambiando el color a violeta, la coloracin depende de la
concentracin de la protena en solucin. Con los datos de coloracin mencionados anteriormente se
puede calcular la concentracin de la enzima y del sustrato en una determinada solucin.
Materiales:
1-Amilasa fngica

7-Agua destilada

2-Amilasa salival

8-Reactivo de Biuret

3-Vernier LabQuest

9-Lugol

4-Colormetro y cubetas

10-Vaso de precipitados

5-Pipeta y Propipeta

11-Balanza

6-Soluciones de Almidn 0.1 g/100ml

12-Mechero y trpode

Mtodos:
Curva de Calibracin de almidn:
El objetivo de una curva de calibracin de almidn es el de poder averiguar la concentracin de
almidn desconocida en una solucin, con solo muestrearla en un colormetro e interpolar en la
mencionada curva. La curva debe armarse a partir de una solucin de almidn de concentracin
conocida, la que luego se diluye y se calcula la absorbancia para cada una de las diluciones. En
primer lugar se toman varias cubetas (6 o 7 en este caso) en las cuales se coloca la misma cantidad
de reactivo (lugol) y luego se agregan volmenes crecientes de solucin de almidn, luego se
agrega agua destilada hasta llevar las soluciones a un volumen final determinado. Es decir se
obtiene una batera de cubetas con una concentracin creciente. Se muestrean las cubetas con el
colormetro y se grafica concentracin de Almidn vs. Absorbancia. Los resultados se ajustan por
cuadrados mnimos a una funcin lineal.

En el experimento de actividad de alfa-amilasa se obtienen diversos valores de absorbancia en

funcin del tiempo, estos valores se convierten en valores de concentracin de almidn utilizando la
siguiente curva de calibracin:
Y= 3,3 X

(R2=0.96)

Donde:
Y= Absorbancia de la solucin incgnita
X= Concentracin de almidn (g/L)
1.Cmo mido la actividad enzimtica de la amilasa?
Observando el cambio de coloracin que ocurre en el almidn cuando se encuentra junto con la
enzima.
2.Cmo cuantifico el cambio de coloracin?
Utilizando un colormetro que mide la densidad ptica de una muestra coloreada a determinada
longitud de onda. En este caso a 635 nm dado que el color de la muestra es azul.
3.Cmo determino el valor del cambio, es decir qu cantidad de sustrato (almidn) fue convertido
en maltosa por efecto de la enzima?
Utilizando la funcin de la curva de calibracin de la cual obtengo la concentracin del almidn que
se encuentra en la muestra despus de determinado tiempo.
PROTOCOLO
Medicin de la actividad de la amilasa salival (Absorbancia en funcin del Tiempo)
(Este protocolo puede ser utilizado con amilasa fngica en este caso solicitar la amilasa comercial al
ayudante el resto es idntico)
1-Recolectar 10 ml de saliva aproximadamente (perteneciente slo a una persona o varias
dependiendo de su pregunta de investigacin) en un vaso de precipitados de 50ml.
2- Colocar la muestra en un bao trmico a 20C
3-Colocar la luz verde del colormetro en 635 nm.
4-Setear el colormetro con una frecuencia de muestreo de un dato cada 20 segundos y una duracin
de 10 minutos. Abrir la pestaa correspondiente a la Tabla de Datos y dejarla abierta.
5-Preparar una cubeta con 3ml de agua destilada y una gota de lugol. Esta ser la cuba blanco,
colocarla en el colormetro y apretar el botn Cal hasta que este titile, en ese momento el
colormetro estar calibrado para realizar esta experiencia.
6-Preparar otra una cubeta con una gota de lugol y 2,7 ml de solucin de almidn (pH = 7)
7-Diluir la saliva 1:2 en agua destilada y colocar 0.3ml de la solucin diluida dentro de la cubeta del
punto 6 inmediatamente despus mezclar por inversin dos veces y colocar dentro del
colormetro. Apretar el botn de Collect y muestrear durante 10 minutos, durante este perodo de
tiempo ir anotando en el cuaderno los datos que se van generando en la tabla de datos que se dej
abierto en el punto 4

La introduccin se sac del trabajo citado abajo (busc el link correspondiente para armar tu propia introduccin). Parte
del protocolo fue cambiado as que no es necesario citar el trabajo para los procedimientos
STARCH HYDROLYSIS BY AMYLASE

Prepared by
Nam Sun Wang
Department of Chemical & Biomolecular Engineering
University of Maryland
College Park, MD 20742-2111
ENCH485