U.N.A.M.

FES IZTACALA

Dr. Vctor Manuel Rosales Cedillo

2008

Recoleccin de la Muestra

UROCULTIVO

Muestras incorrectas y
contaminadas

TECNICA

ADECUADA

E. coli

LA TINCIN DE GRAM
La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin
empleada en microbiologa para la visualizacin de bacterias.
Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que
desarroll la tcnica en 1884.
Es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas,
tamaos, morfologas celulares y reaccin Gram (color). A nivel
del laboratorio es til como test para un rpido diagnstico
presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en
cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la
calidad de la muestra clnica. Las bacterias se tien gram
positivas (+), gram negativas () o no se tien debido a sus
diferencias en la composicin de su pared y arquitectura celular.

LA TINCIN DE GRAM
Se le adiciona cristal violeta por un minuto,
Se le agrega lugol por un minuto, despus se lava
suavemente con un chorro de agua
Se le agrega alcohol-cetonico durante 10 o 15
segundos,
Se le agrega safranina por un minuto, despus se lava
suavemente con un chorro de agua hasta que el agua
salga sin colorante.
Una vez que la preparacin esta totalmente seca,
observar en los objetivos de 10, 45, y 100x, poniendo en
este ltimo el aceite de inmersin.

LA TINCIN DE GRAM
Un toque del asa sobre la colonia bacteriana se debe disolver sobre una
gota de agua y extender como una capa fina sobre un portaobjetos. Se deja
secar la preparacin, se fija al calor suave y se trata como sigue:
Paso 1. Tincin con cristal violeta.
Paso 2. Fijacin con una solucin de yodo. Estabiliza el cristal violeta, todas
las bacterias en la preparacin permanecen de color prpura o azul.
Paso 3. Extraccin con alcohol u otro solvente. Decolora algunas bacterias
(las Gram negativas) y no otras (las Gram positivas).
Paso 4. Tincin de contraste con safranina. Las bacterias gram positivas ya
estn teidas con cristal violeta y permanecen de color prpura. Las
bacterias gram negativas se tien de color rosa.

Tcnicas de tincin. Fundamentos.

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles
de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el
contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para
distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas,
paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes
de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor
es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas
como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade
el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el
protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido
fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y
siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce
habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario,
hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de
manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no
pueden realizarse con mucha precisin.

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que

tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares.
Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el
azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros
colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y
se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes
incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo
de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de
este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la
clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las
gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudn.

Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada
con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia
se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr
atacar el colorante.

PRUEBAS BIOQUIMICAS

Pruebas BIOQUIMICAS
Medio de Kligler

Es un medio solid color rojo ladrillo

Inoculacin : Puncin y Estra
Identifica: Bacterias fermentadoras de glucosa( fondo)

Lactosa( Superficie)
Produccin de H2S ( Negro)
Produccin de Gas ( burbuja)
Vira a Amarillo

CITRATO DE SIMMONS

MEDIO: SOLID

COLOR: VERDE

INOCULACIN : ESTRIA

IDENTIFICA: BACTERIAS, QUE

UTILIZAN CITRATO
COMO FUENTE UNICA
DE CARBONO.

VIRA A AZUL TURQUESA

SIM
MEDIO: SLIDO
COLOR: AMARILLO

INOCULACIN: PUNCIN
IDENTIFICA: Produccin de H2S
(precipitado negro a
lo largo de la lnea
de inoculacin).
MOVILIDAD: Crecimiento difuso a
los lados de la lnea
de inoculacin.
PRODUCCION DE INDOL: Al
agregar 5 gotas de reactivo de
KOVAC
Anillo color FUCSIA

UREA

MEDIO: LIQUIDO ( caldo)

COLOR: CANELA
INOCULACION : ASA CARGADA
IDENTIFICA: HIDRLISIS DE UREA
POR PRESENCIA DE
UREASA
VIRA : ROSA FUERTE

VOGES PROSKAUER
MEDIO: LIQUIDO ( CALDO)
COLOR: AMARILLO PLIDO

INOCULACIN:
ALCALINIZACIN.
DEL MEDIO POR LA
PRODUCCIN DE ACETOINA
O ACETILMETILCARBINOL,
PARA ELLO SE AGREGAN
DESPUES DE INCUBAR 0.6
ML DE ALFA NAFTOL AL 5 % Y
0.2 ML DE KOH AL 40%,
AGITAR EL TUBO Y REPOSAR
DE 10 A 15 MINS
VIRA: COLOR ROJO

ROJO DE METILO

MEDIO: COLOR AMARILLO

INOCULACION : ASA CARGADA
IDENTIFICA: ACIDIFICACION DEL
MEDIO POR PRODUCCION DE
ACIDOS ( FRMICO, LCTICO,
ACETICO).
DESPUES DE INOCULAR
SE AGREGAN 5 GOTAS DE ROJO
DE METILO.
VIRA: ROJO ESTABLE EN LA
SUPERFICIE

ANTIBIOGRAMA

ANTIBIOGRAMA
El antibiograma es la prueba microbiolgica que se realiza para
determinar la sensibilidad de una colonia bacteriana a un antibitico o
grupo de antibiticos.
Un antibitico ha sido definido como una sustancia qumica
producida por un microorganismo capaz de inhibir el desarrollo de
otros microorganismos.
Los antibiticos modificados por manipulaciones qumicas aun se
consideran como tales.
Un agente antimicrobiano es activo contra los microorganismos y
puede ser producido en forma natural por microorganismos o
sintticamente en el laboratorio.

ANTIBIOGRAMA
El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad
de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una
infeccin a uno o varios antibiticos. En efecto, la sensibilidad in vitro
es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un
tratamiento antibitico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para
orientar las decisiones teraputicas individuales.

El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolucin

de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento
epidemiolgico, a escala de un servicio, un centro de atencin
mdica, una regin o un pas, es como puede adaptarse la
antibioterapia emprica, revisarse regularmente los espectros clnicos
de los antibiticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el
establecimiento de programas de prevencin en los hospitales.

SIEMBRA DEL ANTIBIOGRAMA

LECTURA DEL ANTIBIOGRAMA

REPORTE DE LA LECTURA DEL

ANTIBIOGRAMA

Que tengan buen da