Bauhinia Forficata

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMCIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS
DETERMINAO QUMICA E BIOLGICA DE BAUHINIA FORFICATA LINK

SUBESPCIE PRUINOSA (PATA-DE-VACA LEGUMINOSAE)
ANA LCIA VARGAS ARIGONY

PORTO ALEGRE, 2005.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE FARMCIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS
DETERMINAO QUMICA E BIOLGICA DE BAUHINIA FORFICATA LINK

SUBESPCIE PRUINOSA (PATA-DE-VACA LEGUMINOSAE)
Dissertao apresentada por Ana Lcia

Vargas Arigony para obteno do GRAU
DE MESTRE em Cincias Farmacuticas.
Orientador: Prof. Dr. Jos ngelo da Silveira Zuanazzi

Co-orientadora: Profa. Dra. Elfrides Schapoval
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias

Farmacuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e aprovada em 30
de agosto de 2005 pela Banca Examinadora constituda por:
Profa. Dra. Flvia Vallado Thiesen
Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul
Profa. Dra. Mirian Anders Apel
Universidade de Santa Cruz do Sul
Prof. Dr. Pedro Eduardo Frehlich
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
A699d
Arigony, Ana Lcia Vargas

Determinao Qumica e Biolgica de Bauhinia forficata Link
Subespcie pruinosa (pata-de-vaca Leguminosae). / Ana Lcia
Vargas Arigony Porto Alegre : UFRGS, 2005.-160 p.: il. tab. graf.
Dissertao (mestrado). UFRGS. Faculdade de Farmcia.
Prgrama de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas.
1. Bauhinia forficata. 2. Pata-de-vaca. 3. Leguminosae. 4.
Validao. 5. Cromatografia lquida de alta eficincia. 6. Atividade
antioxidante. 7. Atividade antiedematognica. 8. Atividade
anticolinestersica. I. Zuanazzi, Jos ngelo da Silveira. II.
Schapoval, Elfrides Eva Scherman. III. Ttulo.
CDU: 615.322:582.736
Bibliotecria responsvel
Margarida Maria C. F. Ferreira-CRB10/480
Os procedimentos experimentais deste trabalho foram realizados nos

Laboratrios de Farmacognosia, Ensino e Pesquisa em Controle de Qualidade e
Central Analtica do Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas da
Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e no
Laboratrio de Produtos Naturais da Faculdade de Farmcia da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, com suporte financeiro do CNPq, aos quais expresso
meus agradecimentos imensurveis.
Que as palavras que tu vais dizer

sejam dignas do silncio que tu vais quebrar.
(Ghandi)
Aos meus pais,

dedico...
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Dr. Jos ngelo Silveira Zuanazzi, pela orientao, incentivo,
respeito e confiana, que resultaram em um crescimento profissional, mas acima
de tudo, pessoal.
Professora Dra. Elfrides Schapoval, pela co-orientao, pacincia e
carinho fundamentais na construo deste trabalho e da minha formao.
Aos meus eternos mestres Profa. Denise Milo, Prof. Josu Schostack e
Prof. Srgio Lamb (in memorian), pelo exemplo de amor e devoo s Cincias
Farmacuticas.
s Profa. Dra. Amlia T. Henriques, Profa. Dra. Edna Suyenaga, Profa. Dra.
Llian Auler Mentz, Prof. Dra. Roseli Bortoluzzi e principalmente a Profa. Dra.
Miriam Apel e a MSc. Ana Lcia Aboy pelas contribuies mais do que valiosas
ao longo da construo deste trabalho. Ao Prof. Dr. Fbio Menezes (UFRJ) pelo
auxlio nos experimentos de atividade antioxidante. Ao Prof. Dr. Cechinel pelas
amostras cedidas.
A todos os colegas, bolsistas, professores e funcionrios que de alguma
forma possam ter contribudo para a realizao deste trabalho.
Um agradecimento especial a Msc. Marina Scopel, pela pacincia,
solicitude e parceria em todos os momentos que precisei.
Aos queridos Msc. Tatiana Castilhos, quase Dr. Rogrio Petersen, Msc.
Paulo Artur Coelho, Vinicius Dorneles, Ana Paula Cappra Silva, Maribete
Holzschuh, Msc. rico Martini, Daniela Ghisleni e Letcia Colom por me
presentearem com a sua amizade e momentos de descontrao to necessrios.
Ao meu querido professor Msc. Cabral Pavei pela pacincia extrema, a
amizade sincera e inmeras contribuies de imensurvel relevncia na
construo deste trabalho.
A famlia Cestari e ao pessoal da Medicor Produtos Hospitalares e Riopasa

Distribuidora de Medicamentos, pela torcida e pela compreenso todas as vezes
que no pude ir trabalhar em nome do desenvolvimento da cincia.
Aos meus conterrneos Arquimedes e Mara Apratto por cultivarem com
todo carinho a minha pata-de-vaca. A minha Teacher Mrcia pelo incentivo e
apoio em diferentes momentos dessa batalha.
A todos os meus amigos do Colgio Bom Conselho e seus adereos, aqui
representados pela Beta, Carol, Juli, Lili e Lu; a turma da fronteira oeste, entre
eles, Carol A., Carol Pi, Micha, Joo, Maju, J e Su; aos colegas e amigos da
PUCRS, Clzinha, Matheus e R Leke; os cariocas, Nanda, Ju e Rafa; a turma da
gym, Dani, Lis e Ana; e os meus angels, Ren e Gabriel; a todos eles, agradeo
por inmeras vezes acreditarem em mim at mesmo quando eu mesma j no
mais o fazia.
A minha madrinha Maria Lcia Vargas e ao meu tio Jpiter da Costa
Vargas Filho, por todo o apoio e torcida. A minha tia Tnia Arigony por ter me
ensinado, quando criana, o significado da palavra biologia, por que foi mais ou
menos a que tudo comeou (e ao meu tio Roberto Arigony por ter se casado com
ela).
A famlia Clemens, V Carlos, V Caia, Ju, Diego, Carlinhos, Ana, B e
Isabela, pelo carinho, acolhida e incentivo essenciais na reta final.
Aos meus pais Maria do Carmo e Jos Narciso Arigony e meu irmo Jos
Mariano Arigony, por que sem eles, eu nada seria. E por que os amo a perder de
vista...
Ao Maurcio Corte, por de repente, ter acontecido na minha vida...
E obviamente, ao Cara l de cima, por ter me provado n vezes que at
mesmo a Sua aparente ausncia, sinal da Sua presena.
SUMRIO
Lista de Tabelas.............................................................................................
xv
Lista de Figuras..............................................................................................
xvii
Lista de Equaes..........................................................................................
xix
Lista de Abreviaturas......................................................................................
xxi
Resumo..........................................................................................................
xxiii
Abstract........................................................................................................... xxv
INTRODUO E RELEVNCIA DO TEMA .................................................... 1
1 OBJETIVOS GERAIS................................................................................. 7
2 REVISO BIBLIOGRFICA..................................................................... ...
11
2.1 Aspectos Botnicos..................................................................................
13
2.2 Aspectos Qumicos..................................................................................
15
2.3 Aspectos Farmacolgicos........................................................................
18
2.3.1 Atividade Antioxidante...........................................................................
18
2.3.2 Atividade Antiinflamatria......................................................................
18
2.3.3 Atividade Hipoglicemiante.....................................................................
19
2.3.4 Outras Atividades..................................................................................
20
3 DETERMINAO DE MTODO ANALTICO E ANLISE DO PERFIL

CROMATOGRFICO POR CLAE DE BAUHINIA FORFICATA.................... 23
3.1 Introduo................................................................................................
25
3.2 Objetivos especficos...............................................................................
26
3.3 Materiais e Mtodos.................................................................................
27
3.3.1 Material vegetal.....................................................................................
27
3.3.2 Preparao dos extratos.......................................................................
27
3.3.3 Hidrlise cida.......................................................................................
27
3.3.4 Anlise cromatogrfica..........................................................................
28
3.3.5 Condies cromatogrficas...................................................................
28
3.3.6 Otimizao da tcnica...........................................................................
29
3.3.6.1 Avaliao da influncia da proporo droga:solvente.....................
29
3.3.6.2 Avaliao do solvente empregado.....................................................
29
3.3.6.3 Avaliao dos mtodos de extrao................................................... 29

3.4 Resultados e Discusso...........................................................................
30
4 ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA QUMICA

MAJORITRIA (SQM)........................................... ........................................ 37
4.1 Introduo................................................................................................
39
4.2 Objetivos especficos................................................................................ 40

4.3 Materiais e Mtodo...................................................................................
40
4.3.1 Preparao do extrato...........................................................................
40
4.3.2 Isolamento.............................................................................................
40
41
5 VALIDAO DE MTODO POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA

EFICINCIA (CLAE) PARA DETERMINAO DE SQM............................... 45
5.1 Introduo................................................................................................. 47
5.2 Objetivos especficos................................................................................ 50
50
5.3.1 Preparao dos extratos.......................................................................
50
5.3.2 Anlise cromatogrfica..........................................................................
50
5.3.3 Condies cromatogrficas...................................................................
50
5.4 Validao..................................................................................................
51
5.4.1 Linearidade............................................................................................
51
5.4.1.1 Preparao da curva padro da substncia qumica majoritria

(SQM)............................................................................................................. 51
5.4.2 Repetibilidade........................................................................................
51
5.4.3 Preciso Intermediria..........................................................................
52
5.4.4 Exatido................................................................................................
52
5.4.5 Especificidade.......................................................................................
52
5.4.6 Limites de deteco e quantificao.....................................................
52
5.4.7 Robustez...............................................................................................
53
54
6 DETERMINAO DA ESTABILIDADE QUMICA....................................... 61

6.1 Introduo................................................................................................
63
67
67
6.3.1 Estudo de estabilidade acelerada.........................................................
67
6.3.2 Doseamento..........................................................................................
67
6.3.3 Clculos da velocidade de degradao (k), dos tempos de vida til

(t90%) e meia-vida (t1/2) ................................................................................... 67
68
7 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE..................................
73
7.1 Introduo................................................................................................
75
76
xii
76
78
8 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIEDEMATOGNICA IN VIVO......
81
8.1 Introduo................................................................................................
83
8.2 Objetivo especfico...................................................................................
84
8.3 Materiais e Mtodos.................................................................................
84
8.3.1 Material biolgico..................................................................................
84
8.3.2 Preparao do extrato...........................................................................
85
8.3.3 Edema em pata de rato.........................................................................
85
8.3.4 Mtodo de morte...................................................................................
86
8.3.5 Mtodo de descarte do material biolgico.............................................
86
86
9 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERSICA..................
91
9.1 Introduo................................................................................................
93
9.2 Objetivo especfico...................................................................................
94
94
9.3.1 Compostos isolados..............................................................................
94
9.3.2 Mtodo de Autobiografia.......................................................................
95
95
10 DISCUSSO GERAL................................................................................
97
11 CONCLUSES GERAIS...........................................................................
103
12 REFERNCIAS.........................................................................................
107
13 ANEXOS...................................................................................................
121
ANEXO 1: Espectro de massas de SQM, eletrospray negativo

ANEXO 2: Informaes complementares sobre o RMN
ANEXO 3: Resoluo do Comit de tica da UFRGS
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1. Parmetros para anlise cromatogrfica de Bauhinia forficata
subespcie pruinosa..............................................................................................28
Tabela 3.2. Sistema gradiente utilizado para a anlise por CLAE de Bauhinia
forficata subespcie pruinosa................................................................................29
Tabela 3.3. Avaliao da influncia da proporo droga:solvente na preparao
do extrato de Bauhinia forficata subespcie pruinosa...........................................31
Tabela 3.4. Avaliao do solvente empregado no processo de extrao de
Bauhinia forficata subespcie pruinosa.................................................................31
Tabela 5.1. Modificao no gradiente para a realizao do teste de robustez no
mtodo de CLAE....................................................................................................53
Tabela 5.2. Modificao no fluxo para a realizao do teste de robustez no
mtodo de CLAE....................................................................................................53
Tabela 5.3. reas absolutas dos picos do marcador SQM de Bauhinia forficata
subespcie pruinosa obtidas a partir de injees em CLAE..................................54
Tabela 5.4. Anlise de varincia dos resultados obtidos para determinao da
equao da reta e coeficiente de correlao de SQM...........................................55
Tabela 5.5. Resultados da anlise de regresso da SQM.....................................56
Tabela 5.6. Resultados da avaliao da repetibilidade e preciso intermediria da
soluo extrativa de Bauhinia forficata subespcie pruinosa por CLAE................57
Tabela 5.7. Resultados da anlise de exatido em CLAE para a amostra de
Bauhinia forficata subespcie pruinosa.................................................................57
Tabela 5.8. Avaliao do parmetro de robustez para extratos de Bauhinia
forficata subespcie pruinosa................................................................................59
Tabela 6.1. Quadro de definio das zonas climticas definidas pela Organizao
Mundial da Sade (WHO, 1996)............................................................................66
Tabela 6.2. Anlise de estabilidade acelerada para Bauhinia forficata subespcie
pruinosa.................................................................................................................69
Tabela 6.3. Valores experimentais obtidos no estudo de estabilidade acelerada de
Bauhinia forficata subespcie pruinosa, considerando-se diferentes ordens de
reao....................................................................................................................71
Tabela 7.1. Percentual de atividade antioxidante demonstrado pelos extratos
butanlico, etanlico e aquoso de Bauhinia forficata subespcie pruinosa...........78
Tabela 8.1. Formao do edema em pata de ratos induzido pela carragenina.....87
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1. Folhas de Bauhinia forficata. No detalhe se observa a presena de
espinhos.................................................................................................................14
Figura 2.2. Flor e legume de Bauhinia forficata.....................................................15
Figura 2.3. Flavonides presentes em Bauhinia forficata......................................17
Figura 3.1. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie pruinosa a 348nm de
acordo com o mtodo proposto e destacando SQM com seu respectivo
UV..........................................................................................................................30
Figura 3.2. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie forficata a 348 nm..32
Figura 3.3. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie forficata sobreposto
com subespcie pruinosa, a 348 nm.....................................................................33
Figura 3.4. Cromatograma de canferitrina, composto presente em Bauhinia
forficata subespcie forficata, cedido gentilmente pelo Prof. Dr. Cechinel (UNIVALI
Itaja/ SC), a 348 nm...........................................................................................33
Figura 3.5. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie pruinosa sobreposto
com canferitrina......................................................................................................34
Figura 3.6. Cromatograma de Bauhinia variegata, a 348 nm................................35
Figura 3.7. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie pruinosa com a
variao das estaes do ano, a 348 nm..............................................................35
Figura 3.8. Cromatograma demonstrando a formao de quercetina e canferol
aps hidrlise cida de Bauhinia forficata subespcie pruinosa, a 348 nm...........36
Figura 4.1. Cromatograma da substncia qumica majoritria (SQM) presente em
Bauhinia forficata subespcie pruinosa, a 348 nm................................................42
Figura 4.2. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie pruinosa sobreposto
com a substncia qumica majoritria (SQM) isolada a partir de extrato butanlico
de suas folhas, a 348 nm.......................................................................................42
Figura 4.3. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie forficata sobreposto
com a substncia qumica majoritria (SQM) isolada a partir de extrato butanlico
de Bauhinia forficata subespcie pruinosa, a 348 nm...........................................43
Figura 5.4. Representao grfica da reta e coeficiente de correlao para
SQM.......................................................................................................................55
Figura 5.5. Cromatograma comprovando a especificidade do mtodo em relao
ao composto majoritrio (SQM).............................................................................58
Figura 6.1. Perfil de decaimento do teor percentual de SQM obtido a partir das
anlises cromatogrficas das amostras provenientes do estudo de estabilidade
para Bauhinia forficata subespcie pruinosa.........................................................69
Figura 6.2. Cromatograma demonstrando o decaimento sistemtico dos
compostos presentes em Bauhinia forficata subespcie pruinosa no decorrer da
anlise de estabilidade...........................................................................................70
Figura 6.3 Representao grfica, de ordem zero, da curva de degradao
trmica de SQM.....................................................................................................71
Figura 6.4 Representao grfica, de primeira ordem, da curva de degradao

trmica de SQM.....................................................................................................71
Figura 6.5 Representao grfica, de segunda ordem, da curva de degradao
trmica de SQM.....................................................................................................72
Figura 7.1. Representao grfica da atividade antioxidante apresentada pelos
extratos de Bauhinia forficata subespcie pruinosa testados pelo mtodo do
DPPH.....................................................................................................................78
Figura 8.1. Aumentos dos volumes dos edemas em pata de ratos.......................88
Figura 9.1. Cromatograma de Bauhinia forficata, a 348 nm, demonstrando os
picos
das
substncias
valiadas
no
experimento
de
atividade
anticolinestersica..................................................................................................96
2xviii
LISTA DE EQUAES
Equao 5.1. Clculo para determinao do limite de deteco...........................52
Equao 5.2. Clculo para determinao do limite de quantificao....................52
Equao 5.3. Equao da reta calculada pelo mtodo dos mnimos quadrados
para SQM...............................................................................................................54
Equao 5.4. Equao da reta calculada pelo mtodo dos mnimos quadrados
para a soluo extrativa de Bauhinia forficata subespcie pruinosa.....................56
Equao 5.5. Clculo utilizado para determinao do percentual de recuperao
do marcador qumico, SQM...................................................................................57
Equao 6.6. Equao utilizada para o clculo da velocidade de degradao de
uma reao de segunda ordem.............................................................................68
Equao 6.7. Equao utilizada para o clculo do tempo de vida til (t90%) de SQM
de uma reao de segunda ordem........................................................................68
Equao 6.8. Equao utilizada para o clculo do tempo de meia-vida (t1/2) de
SQM de uma reao de segunda ordem...............................................................68
Equao 7.1 Frmula para a converso da medida em absorvncia em percentual
de atividade antioxidante.......................................................................................77
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA Anlise de varincia
ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
CLAE Cromatografia lquida de alta eficincia
DP Desvio padro
FDA Administrao de Frmacos e Alimentos, Estados Unidos
LD Limite de deteco
LQ Limite de quantificao
Rf Fator de reteno
SQM Substncia qumica majoritria
SM Soluo me
UV Espectrofotometria na regio ultravioleta e visvel
RESUMO
Bauhinia forficata, Leguminosae, conhecida popularmente como pata-devaca e seus principais constituintes qumicos so flavonides. comumente
usada como antidiabtica, mas existem relatos a respeito de suas atividades
antioxidante e antiedematognica. A fim de avaliar-se o comportamento de seus
constituintes qumicos frente a variaes de temperatura e umidade, realizou-se
estudo de estabilidade acelerada (50 C 2 oC e 90% 5% U.R.), onde a
substncia qumica majoritria (SQM) serviu como marcador para os devidos
clculos e,
portanto, o seu isolamento prvio tornou-se imprescindvel. Um
mtodo devidamente validado por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

(CLAE) foi utilizado para as anlises e atravs das mesmas pode-se predizer uma
reao de segunda ordem e, por conseguinte, um tempo de vida til de 2,63 dias
e um tempo de meia-vida de 23,65 dias. Avaliou-se, ainda, as atividades
antioxidante (DPPH), antiedematognica (edema em pata de ratos induzido pela
carragenina) e anticolinestersica (autobiografia). Para a atividade antioxidante,
dos extratos testados, o butanlico foi o que demonstrou maior ao (54,73 l/ml)
sendo, no entanto, inferior ao padro Ginkgo biloba (42,51 l/ml). Na avaliao da
atividade antiedematognica, o extrato aquoso testado demonstrou um mximo
de inibio de 76,5%. Ao testar-se a atividade anticolinestersica de produtos
isolados obtidos a partir de B. forficata, nenhuma ao significativa foi observada
exigindo estudos complementares.
Palavras-chave: Bauhinia forficata, CLAE, validao, estabilidade acelerada,
atividades antioxidante, antiedematognica, anticolinestersica.
ABSTRACT
Bauhinia forficata, Leguminosae, is popularly known as pata-de-vaca and
its main chemical constituents are flavonoids. It is used in the folk medicine as
anti-diabetes but there are, also, reports regarding its anti-oxidant and
antiinflammatory activities. In order to evaluate the behavior of its chemical
constituents under temperature and moisture variations, a study of accelerated
stability (50 C 2 oC and 90% 5% R.U.) was carried out. In this study, the major
compound was used as a tracer for the calculations and thus, its previous isolation
was
essential.
properly
validated
method
in
High
Pressure
Liquid
Chromatography (HPLC) was used in the analysis and from this, a second order
reaction was predicted. By this mean, the shelf life expectancy was determined to
be 2,63 days and the half-life was 81,44 days. The antioxidant (DPPH),
antiinflammatory (carrageenin inducing rat paw edema) and anticholinesterasic
(biographic) activities were also evaluated. Regarding the antioxidant activity, from
the extracts which were tested, the butanolic one presented the best activity
(54,73 l/ml). However, it was lower than Ginkgo biloba standard (42,51 l/ml).
Regarding the antiinflammatory activity, the aqueous extract showed an inhibition
maximum at 76,5%. When testing the anticholinesterasic activity of isolated
products obtained from B. forficata, no significant activity was observed and
further studies are required.
Key-words: Bauhinia forficata, HPLC, validation, accelerated stability, antioxidant,
antiinflammatory and anticholinesterasic activities.
INTRODUO E RELEVNCIA DO TEMA
INTRODUO E RELEVNCIA DO TEMA

As plantas medicinais e seus derivados constituram durante muito tempo a
base da teraputica. Atualmente, cerca de 25% dos frmacos utilizados so de
origem vegetal, e 50% daqueles de origem sinttica tm alguma relao qumica
com os princpios isolados de plantas medicinais. Isto se deve, em parte, grande
variedade de espcies (250-500 mil) de plantas existentes na flora mundial,
muitas com importantes propriedades teraputicas (SILVA e CECHINEL, 2002).
Motivada por inmeros fatores, tais como a necessidade de inovao e
carncia de novas drogas para o tratamento de patologias que permanecem
ainda sem tratamento adequado, presso entre as prprias indstrias e,
sobretudo por vantagens competitivas e declnio de produtividade, as indstrias
farmacuticas vm, ultimamente, investindo soma considervel de recursos,
visando o desenvolvimento de novos medicamentos (CALIXTO, 2001a).
Sendo assim, se tem verificado um aumento nos estudos que comprovam
alguns dos conhecimentos empricos, visto que a medicina popular rica em
exemplos de plantas utilizadas para diversos fins, que substituem, muitas vezes, a
prescrio mdica. Acredita-se, inclusive, que cerca de 80% da populao
mundial use plantas como primeiro recurso teraputico (SILVA e CECHINEL,
2002).
Entre as inmeras espcies vegetais de interesse medicinal, encontram-se
as plantas do gnero Bauhinia, pertencentes famlia Leguminosae, as quais so
encontradas principalmente nas reas tropicais do planeta, compreendendo
aproximadamente 300 espcies. Muitas destas plantas so utilizadas como
recurso teraputico na medicina popular em vrias regies do mundo, incluindo a
frica, sia e Amrica Central e do Sul. Pouco se conhece a respeito da atividade
farmacolgica das plantas do gnero Bauhinia. Dentre os relatos descritos na
literatura cientfica, este gnero freqentemente estudado quanto sua possvel
ao hipoglicemiante, uma vez que na medicina popular estas plantas so usadas
para o tratamento de diabetes (SILVA e CECHINEL, 2002).
Bauhinia forficata a espcie que apresenta maior nmero de estudos
referentes atividade hipoglicemiante, sendo considerada, muitas vezes, pela
3
comunidade rural, como pata-de-vaca verdadeira. Esta planta muito usada na

forma de chs e outras preparaes fitoterpicas, uma vez que se encontra
facilmente disponvel no mercado farmacutico (SILVA e CECHINEL, 2002).
Os ndios brasileiros, bem como os nativos de outros pases sulamericanos, usavam as folhas do vegetal como cicatrizantes, empregando-as em
banhos para feridas ou aplicando-as diretamente sobre os ferimentos. Usavamnas tambm como diurticas, digestivas e expectorantes. As atividades
analgsica e antiinflamatria tambm so mencionadas para B. forficata
(ALONSO, 2000).
B. forficata muitas vezes considerada como sendo a insulina natural
devido ao seu emprego no controle do Diabetes (MIYAKE et al., 1986). JULIANI
(1931) foi o responsvel pelo primeiro relato sobre a sua ao hipoglicemiante a
partir do qual se seguiram muitos outros estudos. RUSSO e colaboradores
(1990), no entanto, concluram que em casos de Diabetes do Tipo II, no h
nenhuma ao comprovada com o uso de infuso preparada a partir de B.
forficata. SILVA e colaboradores (2002), por sua vez, usaram uma pequena
frao n-butanlica da planta, e constataram uma significativa reduo nos nveis
glicmicos
dos
ratos
utilizados
no
experimento.
Segundo
PEPATO
colaboradores (2002), aparentemente, o efeito causado por B. forficata nos nveis

de glicemia maior em casos de diabetes moderada. Os diferentes e
inconclusivos resultados podem ser devido a vrios aspectos no levados em
considerao nestas investigaes, como os fatores ambientais (tipo de solo,
clima, etc) e sazonais (SILVA e CECHINEL, 2002).
A B. forficata vem sendo usada, principalmente, como um antidiabtico,
sem, no entanto, possuir um estudo apropriado sobre a sua estabilidade ou ao
menos, uma metodologia de anlise para um controle de qualidade adequado. A
proposta aqui apresentada tem como finalidade desenvolver um controle de
qualidade para a B. forficata Link em funo de sua estabilidade, mediante
variaes de temperatura e umidade de armazenamento.
Consideraes a respeito de atividades biolgicas, tais como antioxidante e
antiedematognica, tambm tornaram-se relevantes por serem citadas, mas no
estudadas cientificamente, por outros autores como BRACA e colaboradores

(2001) e MENEZES e colaboradores (2004) para atividade antioxidante; SILVA e
colaboradores
(2000),
OLIVEIRA
colaboradores
(2001)
SOSA
colaboradores (2002) para atividade antiedematognica e antiinflamatria, tanto

para B. forficata como para outras espcies de Bauhinia.
No que se refere atividade anticolinestersica, as especulaes cada vez
maiores em torno da Doena de Alzheimer e a capacidade dos flavonides em
contribuir para a integridade do tecido neuronal por diferentes mecanismos
(FRAGA et al., 2004) foram o principal motivo pelo qual decidiu-se verificar
alguma possvel relao entre B. forficata e este distrbio.
1 OBJETIVOS GERAIS
1 OBJETIVOS GERAIS
Este trabalho teve como principais objetivos a determinao da
estabilidade qumica de Bauhinia forficata subespcie pruinosa, bem como a
avaliao de atividades antioxidante, antiedematogncia e anticolinestersica
tanto de diferentes extratos como de produtos isolados da planta.
Para as anlises e validao do mtodo tornou-se imprescindvel o
isolamento da substncia qumica majoritria presente em B. forficata.
Os objetivos especficos encontram-se descritos nos prprios captulos.
2 REVISO BIBLIOGRFICA
2 REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 ASPECTOS BOTNICOS
O gnero Bauhinia Bentham apresenta aproximadamente 250 espcies
distribudas pelas regies tropicais, subtropicais e temperadas do mundo,
especialmente na Amrica e na frica (FORTUNATO, 1986). O nome do gnero
foi dado por Bentham em homenagem aos irmos Bauhin, mdicos e botnicos
suos que viveram no sculo XVII (OLIVEIRA et al., 2001).
A espcie Bauhinia forficata Link pertence seo Pauletia (Cav.) DC e
famlia Leguminosae (Fabaceae) Jussieu, contendo as subespcies pruinosa
(Vogel) Fortunato et Wunderlin e forficata (JUDD et al., 1999). A sinonmia mais
comumente encontrada para B. forficata Link B. candicans Bentham (OLIVEIRA
et al., 2001), mas, normalmente, B. candicans sinnimo da subespcie
pruinosa. Popularmente conhecida como Pata-de-vaca, Unha-de-vaca, Unhade-boi,
Casco-de-vaca,
Pata-de-boi,
Unha-de-boi-de-espinho,
Pata-de-toro,
Mahogani, Pata-de-chivo, Pezuna-de-vaca, Caub entre outros (COSTA, 1942;

CRUZ, 1979; LORENZI, 1982 e 1992; PIO CORREIA, 1984; OLIVEIRA et al.,
2001).
FORTUNATO (1986), ao estudar mais detalhadamente a espcie B.
forficata Link, observou que a subespcie pruinosa (Vog.) Fortunato et Wunderlin
cresce nos bordos de matas no Paraguai, sul do Brasil (incluindo o Rio Grande do
Sul), Uruguai e Argentina. Ocorre, ainda, na Bolvia e no Norte da Argentina. A B.
forficata Link subespcie forficata ocorre unicamente no Brasil, sendo sua
distribuio geogrfica desde o estado do Piau, passando por toda a regio
nordeste e sudeste, alcanando o estado de Santa Catarina.
No Brasil existem muitas outras espcies de Bauhinia nativas e
introduzidas. No Rio Grande do Sul, mais propriamente, pode-se citar uma
espcie introduzida que, por sua vez, comumente confundida com B. forficata, a
Bauhinia variegata Linn. No entanto, B. variegata no apresenta espinhos e pode
ser encontrada com flores tanto na cor branca como rsea, enquanto B. forficata
tem como principais caractersticas morfolgicas a presena de espinhos (Figura
2.1) e flores exclusivamente na cor branca (Figura 2.2).
13
B. forficata Link uma pequena rvore que atinge em mdia de 5-9 metros
(SILVA et al., 2002) e apresenta potencial para uso em recuperao de reas
degradadas, plantios mistos, sendo empregada, ainda, como planta ornamental
(ATROCH et al., 2001). O tronco geralmente tortuoso (LORENZI, 1982 e 1992)
recoberto por sber castanho amarronzado, apresentando sulcos mais ou menos
profundos e aspecto ligeiramente estriado no sentido longitudinal (OLIVEIRA et
al., 2001).
Em relao ao seu cultivo, de acordo com REIS e MARIOT (2003), deve
ser plantada em covas devido ao seu porte e adapta-se facilmente a situaes de
formaes secundrias.
As folhas medem geralmente, quando adultas, de 7 a 12 cm de
comprimento e apresentam-se divididas em dois lobos, os quais atingem o tero
superior ou, com mais freqncia, a metade do comprimento da folha. No vrtice,
entre os dois lobos pode-se observar a presena de um pequeno mcro. A base
foliar varia de arredondada a subcordiforme, apresentando nessa regio, no ponto
de insero do pecolo, a presena de pulvinos. Os pices dos lobos so agudos
ou acuminados e a margem foliar lisa. A lmina foliar apresenta consistncia
membrancea e a superfcie foliar lisa, glabra ou ligeiramente pubescente na
fase dorsal. A nervao palmada, sendo constituda de 9 a 11 nervuras que
curvam para o pice. O pecolo foliar de comprimento mediano e apresenta dois
espinhos em sua base, junto insero no caule (MIYAKE et al., 1986). Uma foto
ilustrativa das folhas de B. forficata pode ser observada na Figura 2.1.
Figura 2.1. Folhas de Bauhinia forficata. No detalhe se observa a presena de espinhos.
14
A inflorescncia encontra-se na forma pancula, sendo integrada por flores

grandes, brancas, de tamanhos variados e de pedculos germinados nos
pednculos comuns curtos e laterais s folhas. O clice tubuloso, caracterstico,
de 1,5 a 3 cm de comprimento, abrindo-se em lacnias de 3 a 5 cm de
comprimento, apresenta colorao verde-clara. As ptalas so brancas em
nmero de cinco, largo-lineares duas vezes mais longas que as spalas, obtusas
no pice e de base contrada em forma de unha (OLIVEIRA et al., 2001; Figura
2.2).
Os frutos so do tipo legume perfeito, de 15 a 25 cm de comprimento, de
colorao escura, amarronzada quando na poca da abertura. As sementes
possuem contorno subovalado, so achatadas, de colorao escura, providas de
uma linha esbranquiada que delimita sua forma. Em sua extremidade mais
afilada bem visvel a cicatriz denominada hilo, algumas vezes acompanhada de
um resqucio de funculo (OLIVEIRA et al., 2001; Figura 2.2).
Figura 2.2. Flor e legume de Bauhinia forficata.
2.2 ASPECTOS QUMICOS

Algumas espcies de plantas do gnero Bauhinia foram e esto sendo
estudadas qumica e farmacologicamente e, com isto, alguns dos seus compostos
foram isolados e identificados. Assim, diferentes classes de metablitos de
15
interesse medicinal existentes nessas espcies foram relatados, incluindo

lactonas, flavonides, terpenides, esteris, triterpenos, taninos e quinonas.
Predominando, em praticamente todo o gnero, a presena de flavonides.
Apesar de muitos dos compostos presentes em Bauhinia serem conhecidos,
pouco se sabe sobre a atividade farmacolgica da maioria das substncias
isoladas do gnero Bauhinia (SILVA e CECHINEL, 2002).
No que diz respeito composio qumica da B. forficata, pode-se citar a
presena de esterides, flavonides, alcalides, lcoois e polilcoois. SALATINO
et al.(1999) estudarem 9 espcies de Bauhinia, entre elas B. forficata, isolaram
derivados glicosilados de canferol, quercetina, isoramnetina e miricetina. Sendo
que para B. forficata eles relataram apenas a presena de canferol e quercetina
glicosilados.
SILVA e CECHINEL (2002) relatam para B. candicans a presena de
sitosterol, campesterol, estigmasterol, colesterol, canferol 3-O- -rutinosdeo,
canferol 3-O- -rutinosdeo 7-O--ramnopiranosdeo, trigonelina, triacontanol e 3O-metil-D-inositol (D-pinitol). Para B. forficata, os mesmos autores mencionam a
presena de canferol-3,7-dirhamnosdeo (canferitrina), canferol-3-O--diramnosdeo e
sitosterol.
PIZZOLATTI e colaboradores (2003), fracionando extratos das folhas de B.
forficata, isolaram -sitosterol, canferol [1], canferol 3,7-di-O--L-ramnopiranosdeo [3],
quercetina 3,7-di-O- -L -ramnopiranosdeo [4], canferol 3-O-[-D-glucopiranosdeo(16)--L-ramnopiranosdeo]-7-O--L ramnopiranosdeo [5] e quercetina 3-O-[ -Dglucopiranosdeo-(16)--L-ramnopiranosdeo]-7-O- -L-ramnopiranosdeo [6]. Os
mesmos autores obtiveram, a partir do extrato butanlico das flores, canferol 7-O--Lramnopiranosdeo [2]. Conforme Figura 2.3.
16
OH
OH
HO
HO
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
[1]
[2]
OH
HO
OH
O
OH
HO
OH
OH
O
O
OH
O
OH
[3] R=H
[4] R=OH
OH
HO
HO
HO
[5] R=H
[6] R=OH
O
OH
OH
HO
O
O
OH
HO
HO
Figura 2.3. Flavonides presentes em Bauhinia forficata.
Atravs de delineamentos fitoqumicos foi mencionada tambm a presena

de taninos e mucilagens, no sendo verificada a ocorrncia de antraderivados e
saponinas (MIYAKE et al., 1986).
Um estudo comparativo entre diferentes partes da planta (folhas, caule e
razes), realizado por SILVA e colaboradores (2000), indicou a presena de
esterides e terpenos em todas as partes, predominantemente nas folhas. No
entanto, canferol 3,7-di-O--L-ramnopiranosdeo (canferitrina) foi detectado
exclusivamente nas folhas de B. forficata. Este canferol poderia, portanto,
segundo os autores, ser considerado um marcador qumico para o controle de
qualidade em preparaes com as folhas de B. forficata, uma vez que no
encontrado em nenhuma outra parte do vegetal.
17
Os flavonides so considerados bons marcadores quimiotaxonmicos.

Esta caracterstica lhes conferida pela sua abundncia relativa em quase todo o
reino vegetal, especificidade em algumas espcies, relativa facilidade de
identificao, relativa estabilidade e seu acmulo com maior influncia do meio
ambiente (BRUNETON, 1991; ZUANAZZI e MONTANHA, 2003). Neste trabalho,
pretende-se utilizar o flavonide majoritrio, nas folhas, como marcador para fins
de padronizao do extrato vegetal de B. forficata por serem exatamente os
flavonides os principais compostos qumicos presentes em Bauhinia.
2.3 ASPECTOS FARMACOLGICOS

2.3.1 Atividade Antioxidante
Consideraes a respeito da atividade antioxidante de B. forficata tm sido
feitas em funo da presena marcante dos flavonides entre seus principais
constituintes.
BRACA e colaboradores (2001) testaram a atividade antioxidante de sete
produtos isolados a partir de folhas de Bauhinia tarapotensis. De acordo com os
resultados, puderam confirmar que trs dos compostos avaliados possuam
alguma atividade antioxidante.
MENEZES e colaboradores (2004) verificaram a atividade antioxidante de
espcies coletadas no estado do Paran e constataram que B. mycrostachya era
a mais potente de acordo com os modelos utilizados no estudo.
SOUSA e colaboradores (2004), por sua vez, testaram o potencial
antioxidante de um dos produtos isolados a partir da frao n-butanlica de folhas
de B. foficata, o canferol 3,7- O diraminosdeo. Eles demonstraram que o
composto possui uma atividade significativa frente metodologia empregada.
2.3.2 Atividade Antiinflamatria

B. forficata Link tem sido mencionada como possuidora de atividade
antinociceptiva e antiinflamatria (SILVA et al., 2000). Tais atividades so
freqentemente citadas para plantas do gnero. YADAVA e REDDY (2003), ao
avaliarem B. variegata, demonstraram atividade antiinflamatria vinculada ao
18
flavonide glicosilado 5,7,3, 4-tetrahidroxi-3-metoxi-7-O-raminopiranosdeo (1-3)O -galactopiranosdeo isolado a partir de razes da planta. SOSA e colaboradores
(2002) confirmaram a atividade antinflamatria para B. tarapotensis.
2.3.3 Atividade Hipoglicemiante

A ao hipoglicemiante da B. forficata, h muito observada empiricamente
em
seu
emprego
como
antidiabtico,
cientificamente
demonstrada
primeiramente por JULIANE (1931), no foi devidamente elucidada at os dias de

hoje. Desta forma, ainda no se sabe a qual dos princpios qumicos de B.
forficata se deve atribuir esta atividade e a mesma continua sendo discutida e
investigada.
RUSSO e colaboradores (1990) demonstraram que a infuso preparada
com as folhas de B. forficata no apresentou efeito hipoglicemiante em pacientes
com glicemia normal e em pacientes com diabetes Tipo II (no-insulino
dependente).
LEMUS e colaboradores (1999) avaliaram a atividade hipoglicemiante de
quatro plantas usadas na medicina popular chilena, entre elas B. candicans. As
infuses no alteraram os nveis glicmicos de ratos saudveis, mas em animais
diabticos o extrato de B. candicans reduziu em 39% a glicemia induzida pela
aloxona, tendo sido este efeito atribudo presena do alcalide trigonelina.
SILVA e colaboradores (2002) testaram um extrato n-butanlico, preparado
a partir das folhas de B. forficata, nos nveis sricos de glicose em ratos. A
administrao oral do extrato demonstrou uma diminuio considervel nos nveis
de glicose tanto nos animais saudveis quanto nos hiperglicmicos.
PEPATO e colaboradores (2002) tambm realizaram experimentos para
verificar a atividade hipoglicemiante de B. forficata. Administraram o decocto
cronicamente a ratos, durante 31 dias, via oral, e constataram uma reduo nos
nveis sricos de glucose e de uria presentes na urina.
Mais recentemente, SOUSA e colaboradores (2004) testaram o efeito
hipoglicemiante de um produto isolado a partir da frao n-butanlica de B.
forficata, o canferol 3,7- O diraminosdeo (canferitrina). A administrao
19
oral da canferitrina causou efeito hipoglicemiante nos ratos normais e naqueles

em que se induziu diabetes previamente.
2.3.4 Outras Atividades

De uma maneira geral, as atividades diurtica e hipoglicemiante,
relacionadas s preparaes feitas com as folhas de B. forficata, so as mais
reconhecidas.
COSTA (1942) menciona propriedades estimulantes, expectorantes e
adstringentes ligando-as muitas vezes s cascas do caule; propriedades
diurticas, antiblenorrgicas e vermfugas, s razes; e finalmente, propriedades
purgativas, s flores. Contudo, estas indicaes, so muito antigas, no havendo
confirmao em trabalhos recentes.
A ao diurtica, no entanto, foi observada por SILVA e CECHINEL (2002)
atravs do teste geral de atividades (TGA), no qual foi administrado o extrato
bruto da tintura da planta e dez minutos aps houve intensa diurese.
PIZZOLATTI e colaboradores (2003) relatam que a infuso das folhas de
Bauhinia forficata utilizada na medicina popular brasileira como agente diurtico,
hipoglicemiante, tnico, depurativo, no combate elefantase e na reduo da
glicosria.
MARTINS e colaboradores, em 1994, realizaram um estudo a fim de
demonstrar a atividade mutagnica de algumas plantas utilizadas popularmente,
entre elas, B. forficata, e constataram uma certa toxicidade que deveria receber
maior ateno.
NETO e colaboradores (2003) demonstraram uma possvel inibio da
peroxidase tireidea pelo extrato de B. forficata. Foi observada uma inibio de
50% na atividade de oxidao do iodeto da TPO in vitro na presena de 0,011%
de extrato da planta, sugerindo que o consumo crnico poderia levar ao
hipotireoidismo e formao de bcio.
20
Recentemente, HAEYOUNG e colaboradores (2005) comprovaram a

inibio da progresso do ciclo celular de clulas HeLa por um composto isolado
de B. forficata, chamado pelos autores de HY52.
OLIVEIRA e colaboradores (2005) verificaram que o extrato aquoso de
folhas de B. forficata capaz de neutralizar a coagulao induzida por veneno
das cobras Bothrops e Crotalus, demonstrando possuir atividades anticoagulante
e antifibrinognica.
Para o gnero Bauhinia ainda so descritas outras inmeras atividades
sendo que algumas j foram estudadas cientificamente. PANDA e KAR (1999),
em seus estudos, concluram que B. purpurea possui atividade estimulante sobre
a funo da glndula tireide. GONZALEZ-MUJICA et al. (2002) comprovaram
que o extrato aquoso de B. megalandra capaz de inibir, de forma dosedependente, a absoro de glicose intestinal. RAJKAPOOR e colaboradores
(2003), por sua vez, constataram que o extrato etanlico de B. variegata pode ser
um agente em potencial no tratamento do Linfoma de Dalton.
Na literatura encontram-se, ainda, relatos a respeito da atividade
anticolinestersica. TREVISAN e MACEDO (2003) avaliaram a atividade
anticolinestersica de vrias plantas, entre elas a Bauhinia chyilantha, que por
sua vez no demonstrou possuir propriedade. ISHIGE e colaboradores (2001)
realizaram experimento no qual testaram o efeito do canferol, que por sua vez
demonstrou pouca atividade.
21

CROMATOGRFICO POR CLAE DE BAUHINIA FORFICATA

CROMATOGRFICO POR CLAE DE BAUHINIA FORFICATA
3.1 INTRODUO
Ao se estudar metablitos secundrios, observa-se que muitas amostras
contm compostos polares e no volteis, sendo que usualmente a cromatografia
lquida, combinada com um detector UV visvel, pode ser o sistema escolhido
para o isolamento e deteco dos metablitos de interesse. A cromatogrfica
lquida de alta eficincia (CLAE) uma tcnica analtica que compreende uma
grande variedade de modos de separao, os quais podem ser escolhidos
segundo a natureza qumica dos compostos a serem analisados (ZUANAZZI e
MONTANHA, 2003).
A dosagem conjunta dos flavonides bastante complexa em virtude do
comportamento dos heterosdeos das respectivas agliconas e pela dificuldade de
isolamento dessas substncias de outras classes de fenis (ZUANAZZI e
MONTANHA, 2003). O teor dos constituintes presentes nas plantas tambm varia
consideravelmente em funo de fatores externos, incluindo: temperatura,
umidade, luminosidade, nutrientes do solo, mtodo de coleta, secagem e
transporte, parte da planta usada, entre outros. Cada um desses fatores pode
afetar diretamente a qualidade da matria-prima vegetal e, conseqentemente, o
produto final e a eficcia clnica dos medicamentos fitoterpicos (CALIXTO,
2001b).
A necessidade do desenvolvimento de um mtodo analtico mais
especfico, exato e reprodutvel favorece a anlise dos extratos vegetais por
CLAE. Reconhecida como a tcnica mais adequada para a determinao
quantitativa de marcadores qumicos em preparaes vegetais, a CLAE pode ser
utilizada como um parmetro de comparao e de validao de outra metodologia
analtica, pois permite identificar e quantificar substncias mesmo na presena de
interferentes da matriz vegetal ou no analito (PAVEI, 2004).
A CLAE considerada um mtodo rpido e preciso, permitindo a
separao e doseamento de quantidades relativamente pequenas de material
(ZUANAZZI e MONTANHA, 2003).
25
Quando o objetivo da anlise o controle de qualidade do produto final, as

exigncias analticas incidentes devem considerar diversos fatores, como
especificidade, exatido, preciso e tempo de rotina analtica. Dessa maneira,
para fins de controle de qualidade, o mtodo analtico deve ser validado para uma
substncia ou grupo de substncias (PETRY, 1999). Recomenda-se, tambm,
que o mesmo possa ser utilizado em estudos de estabilidade, permitindo,
inclusive, a deteco de produtos oriundos da degradao das substncias ativas
ou dos marcadores qumicos (SONAGLIO et al., 2003).
A CLAE o mtodo de escolha para anlises de estabilidade de
componentes vegetais e seus possveis produtos de degradao. Respeitando a
composio qumica da droga vegetal, a CLAE permite separar um largo espectro
de UV de flavonides, alcanando desde os compostos polares at os apolares
(HEIGL e FRANZ, 2003).
Considerando-se que a CLAE bastante eficiente na anlise de extratos
vegetais, decidiu-se no somente avaliar o perfil cromatogrfico de B. forficata,
como tambm comparar diferentes subespcies e espcies do gnero.
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

a) estabelecer e otimizar um sistema de anlise por CLAE para Bauhinia
forficata;
b) avaliar o perfil cromatogrfico de B. forficata por CLAE.
c) comparar o perfil cromatogrfico entre diferentes subespcies de B.
forficata;
d) verificar as possveis alteraes na composio qumica de B. forficata
com a variao das estaes do ano.
e) comparar o perfil cromatogrfico de B. forficata e B. variegata.
26
3.3 MATERIAIS E MTODOS

3.3.1 Material vegetal
B. forficata foi coletada na regio da fronteira oeste do Estado do Rio
Grande do Sul, na cidade de Rosrio do Sul, no ms de outubro de 2003. Aps
identificao, realizada pelas Bilogas Botnicas Prof. Dra. Lliam Mentz e Dra.
Roseli Bortoluzzi, as folhas secaram em temperatura ambiente. Material
testemunho da planta encontra-se no Herbrio do Instituto de Cincias Naturais
da UFRGS, Departamento de Botnica, sob o registro de ICN 136705. Uma
duplicata do mesmo material encontra-se disponvel no Herbrio do Jardim
Botnico do Rio de Janeiro, includo na seo Registro Botnico (RB), sob o
cdigo de RB 398065.
3.3.2 Preparao dos extratos

O material vegetal, composto por folhas, foi pulverizado com o auxlio de
um moinho de facas IKA A11 basic (IKA-WERKE) e 150 mg, pesados em balana
analtica (BELMACK ENGINEERING), foram submetidas extrao por turblise,
com Ultra Turrax T8 S8N-5G (IKA-WERKE), durante 5 minutos, utilizando 5 ml de
soluo etanlica 80% como solvente. As amostras foram filtradas a vcuo por
papel filtro, em kitazato, com auxlio de funil de bchner e o seu volume foi
retomado em balo volumtrico de 5 ml com a mesma soluo etanlica 80%,
sendo posteriormente levadas anlise cromatogrfica descrita nos itens 3.3.4 e
3.3.5.
3.3.3 Hidrlise cida
Pesou-se aproximadamente cerca de 150 mg de planta pulverizada,
adicionou-se 4,0 ml de soluo hidroetanlica 80% e 1ml de cido clordrico
concentrado. Refluxou-se por 90 minutos a amostra. Aps, evaporou-se o
solvente em evaporador rotatrio por 30 minutos. A amostra foi ento,
ressuspendida em 5,0 ml de metanol grau analtico e posteriormente filtrada com
membrana apropriada para que se pudesse fazer a anlise por CLAE, conforme
os itens 3.3.4 e 3.3.5 (PIZZOLATTI et al., 2003).
27
3.3.4 Anlise cromatogrfica

Os extratos foram diludos, na proporo 5:1 (v:v) em metanol (grau
analtico para CLAE / VETEC). Estas amostras foram filtradas por membrana
filtrante hidrofbica (Millipore; 0,45m; 13 mm) e aps, se procedeu a injeo no
equipamento de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), sendo realizadas
trs determinaes.
3.3.5 Condies cromatogrficas

Procedeu-se a anlise cromatogrfica utilizando os parmetros descritos
na Tabela 3.1 a seguir.
Tabela 3.1. Parmetros para anlise cromatogrfica de Bauhinia forficata subespcie
pruinosa.
Caractersticas
Descrio
Cromatgrafo
Waters Alliance 2695
Detector
UV/Vis Waters 2487 ou Waters 996 (PDA)
Coluna
Nova-Pak C181
Pr-coluna
Lichrospher Merck2
Sistema de eluio
Gradiente
Fase mvel
A Acetonitrila:gua:cido Trifluoroactico (5:95:0,01; v/v/v)

B Acetonitrila:cido Trifluoroactico (100:0,01; v/v)
Fluxo
0,8 ml/min
Volume de injeo
Comprimento de
onda
Sensibilidade de
deteco
10 l
1
2
348nm
0,05 AUFS
Dimenses da coluna / Tamanho de partcula: 3,9 x 150 mm / 4m

Dimenses da pr-coluna / Preenchimento: 10x4mm / 37-55 m
A acetonitrila (grau analtico para CLAE / VETEC), gua ultrapura (Milli-Q)

e cido trifluoroactico (TFA) (NUCLEAR) foram filtradas previamente atravs de
membrana filtrante (HPLV 047 / Millipore) e desaeradas por 10 minutos em banho
de ultra-som. O sistema utilizado foi gradiente e encontra-se descrito na Tabela
3.2.
28
Tabela 3.2. Sistema gradiente utilizado para a anlise por CLAE de Bauhinia forficata
subespcie pruinosa.
Tempo (min)
Fase A (%)
Fase B (%)
0,00
10,0
13,0
100
59
0
0
41
100
3.3.6 Otimizao da tcnica

3.3.6.1 Avaliao da influncia da proporo droga:solvente
Pesaram-se analiticamente, em balana, 150, 250 e 350 mg de material
vegetal seco e pulverizado de B. forficata, submetendo-se, em duplicata,
extrao e posterior verificao cromatogrfica, em CLAE, conforme descrito nos
itens 3.3.4 e 3.3.5, com injees em triplicata. O resultado obtido foi observado
atravs da diferenciao mdia da integrao das reas do maior pico
demonstrado, considerado neste experimento como sendo o marcador, aps
sobreposio dos cromatogramas.
3.3.6.2 Avaliao do solvente empregado
Extratos aquosos, etanlicos e hidroetanlicos (20:80, 50:50, 80:20; V/V)
de B. forficata, foram submetidos anlise utilizando o resultado de quantidade
de planta ideal obtido no item 3.3.6.1 para preparao dos extratos e posterior
anlise cromatogrfica em triplicata, em CLAE. Os resultados obtidos foram
observados atravs da diferenciao da integrao da rea do maior pico
demonstrado, aps sobreposio dos cromatogramas.
3.3.6.3 Avaliao dos mtodos de extrao
Turblise e macerao esttica durante 7 dias, foram testadas utilizando
as condies pr-estabelecidas aps a realizao dos testes descritos nos itens
3.3.6.1 e 3.3.6.2 Os extratos feitos em duplicata foram submetidos a anlise e
verificao cromatogrfica com trs determinaes. Os resultados obtidos foram
observados atravs da diferenciao da integrao da rea do maior pico
demonstrado, aps sobreposio dos cromatogramas.
29
3.4 RESULTADOS E DISCUSSO

O perfil cromatogrfico dos flavonides de B. forficata, aps a extrao
descrita no item 3.3.1, analisado segundo o item 3.3.4 e de acordo com as
condies preconizadas em 3.3.5, pode ser observado na Figura 3.1. Sendo o
segundo pico (tempo de reteno em torno de 7,2 minutos) o flavonide
(constituinte) majoritrio, considerado neste trabalho, como sendo o marcador e
ao qual ser referido por substncia qumica majoritria (SQM) apresentando UV
mnimo 267,2 nm e mximo 348,1 nm.
Atravs da anlise em CLAE com detector PDA, foi possvel verificar-se
que o grau de pureza do pico majoritrio era satisfatrio para as anlises.
Figura 3.1. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie pruinosa a 348nm de acordo

com o mtodo proposto e destacando SQM com seu respectivo UV.
O cromatograma apresentado denota que o mtodo proposto parece

bastante adequado para a anlise de B. forficata considerando-se o perfil de
flavonides, pela anlise de seus UVs e a substncia qumica majoritria, SQM.
A otimizao da tcnica levou a inmeros resultados que contriburam para
a determinao do mtodo de anlise empregado no decorrer de todo o trabalho.
Ao se avaliar o item 3.3.3.1, referente influncia da proporo droga:solvente,
obteve-se as seguintes reas de marcador, descritas na Tabela 3.3.
30
Tabela 3.3. Avaliao da influncia da proporo droga:solvente na preparao do

extrato de Bauhinia forficata subespcie pruinosa.
Massa de planta (mg)
rea de marcador (mV.s)
100
150
250
350
452679
503901
504025
504176
Os resultados demonstram que a quantidade de planta utilizada no preparo

dos extratos no est vinculada, necessariamente, a uma maior concentrao de
marcador a partir do momento em que se atinge a saturao do solvente. No
caso, a saturao foi atingida em 150mg e, portanto, a partir deste ponto, as
alteraes na rea foram mnimas at 350mg se comparadas com a variao
entre 100 e 150mg.
As reas do maior pico, considerado o marcador, descritas na Tabela 3.4,
foram obtidas a partir das anlises para avaliao da melhor soluo extrativa.
Tabela 3.4. Avaliao do solvente empregado no processo de extrao de Bauhinia
forficata subespcie pruinosa.
Tipo de Sol. Extratoras
rea de marcador (mV.s)
Aquoso
Etanlico
Hidroetanlico
(20:80)
Hidroetanlico
(50:50)
Hidroetanlico
(80:20)
475283
539146
558677
512297
495386
Os flavonides so solveis em lcoois, portanto, considerando-se que os

constituintes de B. forficata so em sua maioria canferis glicosilados, pode-se
inferir que o melhor resultado esteja proporcionalmente vinculado a esta
caracterstica. De tal forma, a proporo da soluo hidroetanlica (20:80)
demonstrou ter solubilizado uma maior quantidade do canferol, por causa da
percentagem de etanol, bem como os acares ligados ao mesmo, solveis em
gua, por sua vez.
31
O ltimo experimento relacionado otimizao da tcnica foi o de

avaliao do mtodo de extrao mais adequado, turblise ou macerao esttica
durante 7 dias. Os valores de rea para o marcador foram respectivamente
554908 e 526179. O mtodo de turblise mostrou-se superior extrao esttica,
neste caso, possivelmente pela sua capacidade de agitao com diminuio de
partculas.
Partindo-se do mtodo proposto foi possvel fazer uma comparao entre o
perfil cromatogrfico de diferentes subespcies de B. forficata. Na Figura 3.2,
verifica-se o perfil da subespcie forficata proveniente da cidade de Itaja (SC) e
gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Cechinel (UNIVALI Itaja/ SC).
Figura 3.2. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie forficata a 348 nm.
Sobrepondo-se os cromatogramas das diferentes subespcies de B.

forficata (Figura 3.3) percebeu-se claramente as particularidades na composio
qumica de seus constituintes. De tal forma, pode-se considerar o fato de o
marcador, possivelmente, diferir entre as subespcies.
32
- B. forficata sub. forficata

- B. forficata sub. pruinosa
Figura 3.3. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie forficata sobreposto com

subespcie pruinosa, a 348 nm.
Na seqncia est apresentada a Figura 3.4 com o cromatograma da

substncia qumica majoritria, canferitrina, gentilmente cedida pelo Prof. Dr.
Cechinel (UNIVALI Itaja/SC) da subespcie forficata, onde se observa o tempo
de reteno em torno de 7,6 e os UV mnimo e mximo, 262,5 e 343,4 nm,
respectivamente.
Figura 3.4. Cromatograma de canferitrina, composto presente em Bauhinia forficata

subespcie forficata, cedido gentilmente pelo Prof. Dr. Cechinel (UNIVALI Itaja/ SC), a
348 nm.
O cromatograma exposto na Figura 3.5 demonstra que o marcador

presente em B. forficata subespcie forficata, por sua vez, no pode ser
33
considerado um marcador para a subespcie pruinosa pois pela anlise em UV

no foi detectada a sua presena.
- Canferitrina
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
8.00
Minutes
8.50
9.00
9.50
10.00
10.50
11.00
11.50
12.00
Figura 3.5. Cromatograma de Bauhina forficata subespcie pruinosa sobreposto com

canferitrina.
Considerando-se, ento, que a canferitrina no demonstrou ser um

marcador para a subespcie pruinosa, tornou-se necessrio o isolamento de
marcador (SQM) desta subespcie, cujo tempo de reteno menor do que
aquele verificado para o da sub. forficata, podendo variar conforme as condies
ambientais do dia da anlise e os UV. mn. e mx. so respectivamente 267,2 e
348, 1 nm (Figura 3.1).
Ainda, utilizando-se o mtodo cromatogrfico proposto, foi possvel verificar
o comportamento de outra espcie de Bauhinia bastante freqente no Rio Grande
do Sul, a Bauhinia variegata, uma espcie introduzida e muito utilizada como
ornamental.
A B. variegata comumente confundida com a B. forficata por tambm
possuir flores de cor branca, alm de cor lils. No entanto, convm ressaltar o fato
de que as diferenas entre ambas so extensivas sua constituio qumica,
como demonstra o cromatograma (Figura 3.6), ou seja, no se limita a aspectos
botnicos e morfolgicos. Os UVs apresentados por B. variegata foram distintos
daqueles observados para ambas as subespcies de B. forficata denotando as
diferenas qumicas entre as espcies.
34
Figura 3.6. Cromatograma de Bauhina variegata, a 348 nm.
Realizou-se, ainda, uma anlise sobre a variao no perfil cromatogrfico

de B. forficata sub. pruinosa conforme as diferentes estaes do ano. As coletas
foram realizadas sempre at o dcimo dia do segundo ms da estao em vigor e
as anlises foram feitas logo aps a coleta e secagem das folhas. Todas as
coletas foram provenientes da mesma rvore. possvel verificar-se as variaes
nos nveis dos compostos qumicos presentes na planta analisando-se a Figura
3.7 que segue.

0 .14 0
0 .13 0
0 .12 0
0 .11 0
0 .10 0
0 .09 0
AU
0 .08 0
0 .07 0
0 .06 0
0 .05 0
- primavera
- outono
- vero
- inverno
0 .04 0
0 .03 0
0 .02 0
0 .01 0
0 .00 0
5.0 0
5.20
5 .4 0
5 .6 0
5.80
6 .00
6 .2 0
6.4 0
6.60
6 .8 0
7.0 0
7.20
7 .40
7 .6 0
Minu tes
7.8 0
8 .00
8 .2 0
8.4 0
8.60
8 .80
9 .0 0
9.20
9 .40
9 .6 0
9.8 0
10 .00
Figura 3.7. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie pruinosa com a variao das
estaes do ano, a 348 nm.
O cromatograma evidencia variaes bastante significativas entre os

constituintes da planta. Sendo que no inverno todos os constituintes apresentam a
sua menor concentrao. A SQM tambm pode variar conforme a estao em
que a planta for coletada. Inclusive, a substncia que consideramos como sendo
35
SQM, somente a majoritria na primavera, justamente a estao em que foi feita

a coleta para este experimento. Provavelmente exista alguma relao de SQM
com a florao da B. forficata, pois na primavera que a planta comea a
florescer permanecendo florida durante o vero.
Por fim, realizou-se a hidrlise cida do extrato de B. forficata a fim de
verificar se os compostos presentes tratavam-se de fato do flavonol canferol
glicosilado. Obteve-se uma alterao visvel no perfil cromatogrfico do extrato
com a formao de dois novos picos com tempos de reteno em torno de 10 e
11 minutos (Figura 3.8). Ao analisar as absores mximas e mnimas destes
novos compostos, observou-se que as mesmas eram referentes s agliconas
quercetina (mn. 257,7 e mx. 370,6 nm) e canferol (mn. 267,2 e mx. 365,8 nm),
respectivamente. As devidas sobreposies com os compostos puros foram
realizadas e os tempos de reteno bem como os UVs eram correspondentes.
Figura 3.8. Cromatograma demonstrando a formao de quercetina e canferol aps

hidrlise cida de Bauhinia forficata subespcie pruinosa, a 348 nm.
Esta ltima anlise tambm auxiliaria no momento de se prever o que

possivelmente ocorreria durante o estudo de estabilidade acelerada. Se poderia,
de certa forma, predizer quais seriam os compostos de degradao que se
formariam mediante a exposio do material vegetal a variaes de temperatura e
umidade.
36

MAJORITRIA (SQM)

MAJORITRIA (SQM)
4.1 INTRODUO
O isolamento seguido de elucidao estrutural e identificao dos
constituintes mais importantes de um vegetal, responsveis ou no pela ao
biolgica do mesmo, permitem identificar a espcie vegetal e, conjuntamente com
ensaios de atividade biolgica, analisar e caracterizar fraes ou substncias
bioativas (SONAGLIO et al., 2003).
O estabelecimento de marcadores qumicos indispensvel para o
planejamento e monitoramento das aes de transformao tecnolgicas e para
os estudos de estabilidade dos produtos intermedirio e final. Marcador, de
acordo com a Resoluo n. 48 (BRASIL, 2004a) um componente ou classe de
compostos qumicos (ex: alcalides, flavonides, cidos graxos, etc.) presente na
matria-prima vegetal idealmente o prprio princpio ativo, e preferencialmente
que tenha correlao com o efeito teraputico, que utilizado como referncia no
controle de qualidade da matria-prima vegetal e dos medicamentos fitoterpicos.
Nesse sentido, o conhecimento da estrutura qumica tem especial
relevncia no caso de substncias facilmente degradveis por fatores tais como
luz, calor e solventes, atrelados ao processo tecnolgico. Tal o caso dos
polifenis ou taninos, assim como de inmeros compostos heterocclicos e
polifuncionais de distribuio abundante na natureza, como os flavonides.
Os mtodos analticos permitem a avaliao da qualidade do produto
fitoterpico, garantindo, assim, a constncia de ao teraputica e a segurana de
utilizao (SONAGLIO et al., 2003).
A avaliao quantitativa, semi-quantitativa ou qualitativa envolve a
utilizao de mtodos espectrofotomtricos, cromatogrficos, fsicos, fsicoqumicos e/ou qumicos. Nos casos em que os constituintes responsveis pela
atividade farmacolgica so desconhecidos, a anlise realizada utilizando-se
marcadores qumicos, selecionados segundo a sua abundncia, facilidade de
deteco e doseamento (SONAGLIO et al., 2003).
39

a) isolar a substncia qumica majoritria (SQM) de Bauhinia forficata,
detectada em cromatograma de CLAE ;
b) identificar a substncia qumica majoritria (marcador) empregando-se
tcnicas espectroscpicas;
c) quantificar a substncia qumica majoritria;
4.3 MATERIAIS E MTODO

4.3.1 Preparao do extrato
As folhas secas de B. forficata foram maceradas com soluo etanlica
80%, em ultra-turrax (T25 BASIC IKA-WERKE) por 15 minutos e permaneceram
sob macerao por mais 3 dias. Na seqncia filtrou-se o macerado, em algodo,
reservando-se o filtrado e colocando o remanescente novamente em macerao,
com soluo etanlica 80%, por mais 1 dia. Aps, ambos filtrados foram reunidos
e o solvente eliminado em evaporador rotatrio a 40 C (BCHI ROTAVAPOR
R114).
O material vegetal foi retomado em gua e lavado trs vezes com
diclorometano (QUIMEX; grau de pureza p.a.) para eliminar possveis
interferentes e compostos mais polares que no eram de interesse. A frao
aquosa foi novamente extrada trs vezes, porm, dessa vez, com lcool butlico
(QUIMEX; grau de pureza p.a.). Esse extrato butanlico foi seco em evaporador
rotatrio a 40 C.
4.3.2 Isolamento
Para a realizao de cromatografia em camada delgada, modo preparativa,
250 mg do extrato butanlico foram ressuspendidos em q.s. de metanol
(QUIMEX; grau de pureza p.a.) e aplicados, com o auxlio de capilares de vidro,
em placas de vidro recobertas com slica modo preparativa (MERCK) e
previamente
ativadas
em
estufa
(QUIMIS
APARELHOS
CIENTFICOS
MODELO317.B.122 N SRIE 905583) a 100 C durante 30 minutos a fim de
40
eliminar qualquer possvel presena de umidade que pudesse interferir no

desempenho do sistema.
As placas foram depositadas em cuba de vidro com sistema eluente
composto por acetato de etila:gua:cido actico:cido frmico (65:15:10:10)
(QUIMEX; grau de pureza p.a.). Aps a migrao foram observadas 5 manchas
em UV, sendo que apenas trs com suficiente resoluo. Estas foram removidas
cuidadosamente, com auxlio de esptula. A slica com a faixa de interesse (Rf =
0,3) foi lavada com metanol e filtrada com funil de vidro sinterizado G5. A amostra
foi concentrada em evaporador rotatrio e injetada em cromatgrafo a lquido de
alta eficincia (CLAE) (Waters Alliance 2695) para verificar sua pureza, de acordo
com os parmetros especificados anteriormente nos itens 3.3.4 e 3.3.5. A
determinao do comprimento de onda utilizado (348 nm) para a deteco e
anlise do marcador qumico foi feita utilizando-se o detector de fotodidos
Waters 996 PDA, onde foram observados os mximos de absoro do pico
cromatogrfico.
Dando-se seqncia investigao qumica, o composto dissolvido em
metanol teve sua massa determinada com injeo direta em equipamento
Micromass (Quattro LC, software Masslynk 3.5), eletrospray negativo. Alm disso,
foi encaminhado a anlises espectroscpicas de ressonncia magntica nuclear.

A substncia qumica majoritria (SQM) foi devidamente isolada e
analisada por CLAE, conforme os parmetros descritos nos itens 3.3.4 e 3.3.5
(Figura 4.1).
Pode-se verificar a sobreposio do cromatograma da SQM ao
cromatograma da B. forficata sub. pruinosa na Figura 4.2.
A sobreposio da SQM com a B. forficata sub. forficata refora ainda
mais as diferenas na composio qumica das subespcies j analisadas no
Captulo 3 (Figura 4.3).
41
Figura 4.1. Cromatograma da substncia qumica majoritria (SQM) presente em

Bauhinia forficata subespcie pruinosa, a 348 nm.
- SQM
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
11.00
12.00
13.00
Minutes
Figura 4.2. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie pruinosa, sobreposto com a

substncia qumica majoritria (SQM) isolada a partir de extrato butanlico de suas
folhas, a 348 nm.
42
- SQM
- B. forficata sub. forficata
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
11.00
12.00
13.00
Minutes
Figura 4.3. Cromatograma de Bauhinia forficata subespcie forficata sobreposto com a

substncia qumica majoritria (SQM) isolada a partir de extrato butanlico de Bauhinia
forficata subespcie pruinosa, a 348 nm.
Os UV mn. e mx. so respectivamente 267,2 e 348, 1 nm, como citados

anteriormente no item 3.4 dando indcios de se tratar possivelmente de um
canferol glicosilado.
Pela anlise do espectro de massas, em anexo (ANEXO 1), verifica-se um
sinal de fragmentao pertencente aglicona canferol em torno de 284 associado
a outro em m/z 739 eletrospray negativo, correspondendo a uma massa de 740 e
que por sua vez, pode corresponder aos acares presentes no composto. Desta
forma, pode-se sugerir que SQM trata-se de um canferol glicosilado. No entanto,
para uma afirmao mais precisa a respeito de sua estrutura, exigem-se
espectros de RMN que infelizmente, apresentaram problemas e devem ser
refeitos. Informaes mais detalhadas sobre os equipamentos utilizados e os
laboratrios onde os experimentos de RMN foram realizados encontram-se no
ANEXO 2.
At o presente momento, a partir desta anlise e de pesquisa na literatura
(MARFAK et al. 2003; MARCH e MIAO, 2004; MARCH et al., 2004;
MONTSERRAT et al. 2004), foi proposto para SQM a estrutura do canferol 3 robinosdeo 7 rhamnosdeo, cuja massa igual de SQM e os UV mnimo e
mximo
so
263,4
346,6
nm,
43
respectivamente,
muito
prximos.
5 VALIDAO DE MTODO POR CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA

EFICINCIA (CLAE) PARA DETERMINAO DE SQM
5 VALIDAO DE MTODO POR CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA

EFICINCIA (CLAE) PARA DETERMINAO DE SQM
5.1 INTRODUO
A validao de metodologia analtica est ligada ao desenvolvimento de
mtodos e permite assegurar que o mesmo seja adequado para obter resultados
confiveis.
Os mtodos analticos podem ser de quatro tipos (ICH,1993), descritos a
seguir.
Testes de identificao: os quais visam assegurar a identidade do

analito presente na amostra. Geralmente realizado atravs de
ensaios comparativos das propriedades da amostra e um padro.
Testes para a quantificao de impurezas: permitem conhecer as

caractersticas de pureza da amostra.
Testes para o controle do limite de impurezas.
Testes para a quantificao da substncia ativa presente em

amostra da substncia pura ou de produtos acabados, ou de
componentes que fazem parte da formulao.
Segundo o tipo de mtodo analtico desenvolvido, o analista escolhe quais

parmetros especficos devem ser avaliados para assegurar que o mesmo esteja
validado. Estes parmetros encontram-se descritos a seguir (USP 28, 2005; ICH,
1996; BRASIL, 2003).
a) Exatido: mede a proximidade entre o valor de referncia (aquele aceito

como valor real ou convencional) e o valor encontrado.
Pode ser determinada atravs de:
anlise de misturas elaboradas com componentes do produto

farmacutico, as quais foram adicionadas quantidades conhecidas
da substncia ativa de interesse;
47
quando no for possvel adquirir todos os componentes da

formulao admissvel adicionar quantidades conhecidas da
substncia ativa ao produto ou formulao original, ou comparar os
resultados obtidos com outro mtodo cuja validade j tenha sido
comprovada;
na determinao da exatido deve-se utilizar um mnimo de nove

determinaes de trs concentraes que estejam dentro da faixa
de linearidade do mtodo. A exatido deve expressar-se como
percentagem de recuperao da quantidade de substncia ativa
adicionada na amostra ou como a diferena entre o valor mdio e o
valor real, junto com os intervalos de confiana.
b) Preciso: expressa o grau de acerto entre uma srie de medidas

obtidas de mlitiplas medies de uma amostra homognea. A preciso tem trs
nveis: repetibilidade, preciso intermediria e reprodutibilidade e se expressa em
termos de varincia, desvio padro relativo ou coeficiente de variao de uma
srie de medidas.
A repetibilidade ou preciso intra-dias se refere preciso do mtodo
quando se utilizam as mesmas condies operativas, num curto perodo de
tempo. Este parmetro se avalia utilizando um mnimo de nove (9) determinaes
com concentraes dentro da faixa de linearidade do mtodo, ou com um mnimo
de seis (6) determinaes com 100% da concentrao esperada da amostra.
A preciso intermediria mede as variaes que podem ocorrer dentro do
laboratrio, tais como dias diferentes de anlise, diferentes analistas, diferentes
equipamentos.
A reprodutibilidade expressa a preciso entre laboratrios diferentes e
testada atravs de estudos colaborativos.
A Farmacopia Americana (USP 28, 2005) estabelece a repetibilidade
como o parmetro a ser tomado em considerao para a anlise regular dos
dados, enquanto a reprodutibilidade e a preciso intermediria precisam ser
48
demonstradas quando os mtodos so avaliados para a sua incluso em

compndio oficial.
c) Especificidade: indica a capacidade do mtodo de avaliar sem

equvoco o analito de interesse, ainda em presena de outras substncias
(impurezas, produtos de degradao, excipientes). Este termo pode relacionar-se
seletividade, mas este ltimo reservado para designar mtodos que detectam
qualitativamente o analito na presena de outras substncias (SHARP, 2000; ICH,
1993). A especificidade de mtodos de identificao se comprova mediante a
comparao dos resultados obtidos com amostras do analito e os obtidos com
amostras nas quais no est presente o analito. Em mtodos cromatogrficos a
especificidade comprovada pela resoluo dos componentes.
d) Limite de quantificao: refere-se quantidade mnima de amostra

que pode ser quantificada com a preciso e exatido adequadas; utiliza-se
sobretudo em determinao de impurezas e de produtos de degradao. Este
parmetro determinado atravs de clculos matemticos, e recomendvel
validar, experimentalmente, estes dados mediante anlise de uma quantidade
apropriada de amostras preparadas de modo tal que contenham concentraes
perto do limite de quantificao calculado.
e) Limite de deteco: a menor quantidade da substncia ativa na

amostra que pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada. Pode
ser determinado atravs de clculos matemticos.
f) Linearidade: a capacidade do mtodo de obter resultados que so

diretamente proporcionais concentrao ou quantidade do analito na amostra,
dentro de um intervalo determinado. A linearidade avaliada mediante anlise da
reta gerada por um grupo de sinais como funo da concentrao do analito.
Deve-se utilizar um mnimo de concentraes, e apresentar-se o coeficiente de
correlao, o intercepto da ordenada, a inclinao da linha de regresso e a soma
residual dos quadrados, assim como o grfico obtido e o desvio padro.
g) Intervalo de linearidade: a faixa entre a maior e a menor

concentrao do analito na amostra para a qual possvel demonstrar que o
mtodo apresenta preciso, exatido e linearidade apropriadas. O intervalo de
49
linearidade estabelecido confirmando se o mtodo apresenta linearidade,

exatido e preciso ao ser aplicado anlise de amostras com concentraes
entre 80-120% da substncia ativa presente na formulao.
h) Robustez: a capacidade do mtodo de manter-se inalterado diante de

pequenas variaes controladas de alguns parmetros. Esta qualidade
indicativo da confiana que se pode esperar do mtodo durante seu uso cotidiano.
A validao de mtodos analticos visa garantir a insero da tcnica
desenvolvida na rotina de anlises laboratoriais assegurando, atravs do uso de
ferramentas estatsticas e segundo critrios e parmetros pr-estabelecidos,
linearidade, exatido, reprodutibilidade, limites de deteco e quantificao,
especificidade e robustez frente s metodologias analticas propostas (ICH, 1996;
SWARTZ e KRULL, 1997; FDA, 2001; PAVEI, 2004).

a) validar o mtodo analtico empregando SQM como referncia;
b) verificar se o mtodo demonstra linearidade, repetibilidade, preciso,
exatido, especificidade e robustez.

5.3.1 Preparao dos extratos
Os extratos foram preparados conforme descrito no item 3.3.2.
5.3.2 Anlise cromatogrfica

A anlise cromatogrfica seguiu as especificaes citadas no item 3.3.4.
5.3.3 Condies cromatogrficas

As condies cromatogrficas foram as mesmas citadas anteriormente no
item 3.3.5.
50
5.4 VALIDAO
Os parmetros utilizados para a validao do mtodo por CLAE foram
fundamentados nas normas estabelecidas pela Conferncia Internacional de
Harmonizao (ICH, 1996), HONG & SHAH (2000), USP (2005) e pela Agncia
Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) Resoluo de n. 899 (BRASIL, 2003) e
esto descritos a seguir:
5.4.1 Linearidade
5.4.1.1 Preparao da curva padro da substncia qumica majoritria (SQM)
A partir de uma soluo referncia (SR) do marcador SQM, na
concentrao de 1 mg/ml em metanol, foram feitas sucessivas diluies obtendose concentraes tericas de 10, 30, 60, 120, 250, 350, 500 g/ml. Para cada
concentrao foram preparadas trs amostras sendo as anlises realizadas em
triplicata.
A linearidade do mtodo proposto foi verificada atravs da anlise das
reas totais do pico de interesse (marcador) utilizando o mtodo dos mnimos
quadrados e anlise de varincia (ANOVA).
5.4.2 Repetibilidade
Pesou-se exatamente cerca de 1,5 g de matria-prima vegetal e submeteuse extrao com 50 ml de soluo etanlica 80%, conforme descrito no item
3.3.2, constituindo-se a soluo me (SM).

A verificao da repetibilidade apresentada pelo mtodo foi realizada
mediante a anlise de nove diluies, preparadas a partir da SM, de mesma
concentrao terica (5,02 mg/ml) e situada na faixa de concentrao da curva
padro da substncia qumica majoritria. Os resultados foram expressos como
desvio padro relativo (DPR %).
51
5.4.3 Preciso Intermediria

Seguindo o procedimento de preparao da amostra descrito no item 3.3.2,
foram preparadas e analisadas trs diluies, na mesma concentrao, a partir de
SM para a determinao do teor de marcador no extrato, durante cinco dias
consecutivos. A preciso foi expressa atravs do DPR dos resultados obtidos.
5.4.4 Exatido
Foi determinada atravs do teste de recuperao de SQM adicionando-se
concentraes crescentes de marcador soluo extrativa. Os resultados foram
expressos como percentagem de recuperao. Cada diluio foi preparada em
triplicata e injetada trs vezes em CLAE.
5.4.5 Especificidade
A especificidade do mtodo foi comprovada pela anlise do cromatograma
por CLAE com detector de fotodido pelo fato destas amostras serem
consideradas matrizes complexas.
5.4.6 Limites de deteco e quantificao

Os limites de deteco e quantificao foram calculados matematicamente
a partir da curva padro da SQM usando a Equao 5.1 e Equao 5.2,
respectivamente.
Equao 5.1. Clculo para determinao do limite de deteco.
LD = dp. 3,3
i
Equao 5.2. Clculo para determinao do limite de quantificao.
LQ = dp. 10
i
Onde: dp ou S = desvio padro do coeficiente linear (intercepto);
i = inclinao da curva padro.
52
5.4.7 Robustez
A robustez do mtodo foi testada atravs de variaes no gradiente da fase
mvel e no fluxo do mesmo em relao a determinao quantitativa de marcador
qumico.
Tabela 5.1. Modificao no gradiente para a realizao do teste de robustez no mtodo
de CLAE*.
Tempo (min)
Fluxo (ml/min)
Fase A (%)
Fase B (%)
0,00
10,0
13,0
0,8
0,8
0,8
100
70
0
0
30
100
*Gradiente original verificar Tabela 3.2
Tabela 5.2. Modificao no fluxo para a realizao do teste de robustez no mtodo de

CLAE*.
Tempo (min)
Fluxo (ml/min)
Fase A (%)
Fase B (%)
0,00
10,0
13,0
0,7
0,7
0,7
100
59
0
0
41
100
*Fluxo original = 0,8, conforme Tabela 3.1
53

Na Tabela 5.3 so mostradas as reas absolutas dos picos de SQM
obtidos para a construo da curva padro para o mtodo por CLAE.
Tabela 5.3. reas absolutas dos picos do marcador SQM de Bauhinia forficata
subespcie pruinosa, obtidas a partir de injees em CLAE.
Concentrao (g/ml) *
rea (mV.s) mdia d.p.
DPR %
10
55453,5 614,47
1,11
30
116101,5 1059,95
0,91
60
228733 5002,07
2,18
120
460704,5 5534,52
1,20
250
926623 2469,22
0,26
350
1227307 17594,23
1,43
500
1714841,5 70989,98
4,13
* todas as determinaes foram feitas em triplicata.
A equao da reta calculada pelo mtodo dos mnimos quadrados est

demonstrada na Equao 5.3.
Equao 5.3. Equao da reta calculada pelo mtodo dos mnimos quadrados para
SQM.
x = y - 19333, 40
3443132,69
Onde: x = concentrao do marcador em mg/ml

y = mdia das reas obtidas a partir de 3 injees consecutivas
Esta equao utilizada para quantificao de SQM nas amostras e para
auxiliar na validao do mtodo proposto. O coeficiente de determinao linear
r2= 0,9986 (Figura 5.4).
54
Figura 5.4. Representao grfica da reta e coeficiente de correlao para SQM.

2000000
y = 3443132,69x + 19333,40
2
R = 0,9986
1800000
1600000
rea (Mv.s)
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
concentrao (mg/ml)
Os resultados da anlise de varincia (ANOVA) so mostrados na Tabela
5.4 e os resultados da anlise de regresso linear da curva do SQM, na Tabela

5.5.
Tabela 5.4. Anlise de varincia dos resultados obtidos para determinao da equao
da reta e coeficiente de correlao de SQM.
ANOVA
Regresso
Resduo
Total
Gl
SQ
MQ
1
5
6
2,38747x1012
3434129719
2,39091x1012
2,38747x1012
686825943,9
F de
significao
3476,095139*
6,61
F
* significativo p < 0,05; G l= grau de liberdade; SQ = soma dos quadrados das mdias; MQ =
mdia quadrada da soma dos quadrados.
A partir dos resultados demonstrados na Tabela 5.4, de ANOVA, obtida da

curva padro de SQM, constata-se pelo valor de F que a regresso apresenta-se
linear e com inclinao igual a 1, assegurando que com o aumento das
concentraes do analito tem-se uma resposta crescente e proporcional nas
reas encontradas.
55
Tabela 5.5. Resultados da anlise de regresso da SQM.

Parmetros
Interseco (a)
Inclinao (b)
Coeficiente Erro padro

19333,40
3443132,69
14901,27
58399,34
LCinferior
LCsuperior
Valor-p
- 18971,46 57638,26
0,2512
3293012,66 3593252,73 2,65605x10-8
LC: limite de confiana; gl: n-2
Analisando a Tabela 5.5 que dispe os resultados da anlise de regresso

de SQM, pode-se inferir a ausncia de erro sistemtico em funo dos limites de
confiana da curva conterem o zero. Os coeficientes presentes nesta tabela
constituem a equao obtida para SQM.
Concomitantemente, a linearidade foi avaliada na soluo extrativa a fim de
confirmar a inexistncia de substncias que viessem a interferir no sinal principal
quando presentes em uma matriz complexa. A partir deste ensaio, verificou-se a
manuteno da integridade do pico referente a substncia qumica majoritria,
SQM, sendo obtida a curva com coeficiente de regresso satisfatrio (r2 = 0,9857),
representada na Equao 5.4.
Equao 5.4. Equao da reta calculada pelo mtodo dos mnimos quadrados para a
soluo extrativa de Bauhinia forficata subespcie pruinosa.
x = y + 137454,77
4710,88
Onde: x = concentrao do marcador em mg/ml
y = mdia das reas obtidas a partir de 3 injees consecutivas
A preciso do mtodo foi avaliada mediante a determinao dos
parmetros repetibilidade e preciso intermediria da soluo extrativa. O desvio
padro foi determinado e analisado atravs da medida das reas de SQM
presente na amostra, de um total de 10 injees e est apresentado na Tabela
5.6.
56
Tabela 5.6. Resultados da avaliao da repetibilidade e preciso intermediria da

soluo extrativa de Bauhinia forficata subespcie pruinosa por CLAE.
Sol. extrativa
Repetibilidade;
mdia* d.p. (DPR%)
Preciso Intermediria;
mdia* d.p. (DPR%)
558677,1 4748,2 (0,85)
556304,2 3043,2 (0,55)
* os valores mdios (n=10) correspondem a rea de marcador em mV.s.
Analisando-se os resultados pode-se dizer que o mtodo demonstra

repetibilidade e preciso em suas anlises.
Os resultados obtidos aps a realizao dos testes de exatido foram
submetidos a Equao 5.5 que expressa o percentual de recuperao do
marcador qumico adicionado as solues de referncia (SR).
Equao 5.5. Clculo utilizado para determinao do percentual de recuperao do
marcador qumico, SQM.
R% =
[(CF CA )] 100
CP
Onde: CF = concentrao do extrato adicionado de subst. referncia (mg/ml);

CA = concentrao do extrato determinado neste mtodo (mg/ml);
CP = concentrao da soluo padro adicionada (mg/ml).
O mtodo por CLAE mostrou ser exato quanto ao teor de SQM recuperado
exibindo um valor mdio de 96,4% para a anlise realizada com Bauhinia forficata
(Tabela 5.7).
Tabela 5.7. Resultados da anlise de exatido em CLAE para a amostra de Bauhinia
Amostras*
SR 1
SR 2
SR 3
Concentrao
Adicionada
Recuperada
(mg/ml)
(mg/ml)
0,039
0,027
0,012
0,037
0,026
0,012
Recuperao (%)
Mdia (%)
94,4
94,8
99,9
96,4
*n=3
O cromatograma da amostra para a anlise de especificidade

apresentado na Figura 5.5 com os respectivos espectros de UV de SQM.
57
Avaliando-se cuidadosamente o pico referente ao marcador encontrado no

cromatograma da especificidade, pode-se considerar o mtodo proposto
especfico, pois em todas as faixas analisadas o pico majoritrio, SQM, no
apresentou variao nos seu mximo de absorvncia indicada no CLAE/PDA.
Figura 5.5. Cromatograma comprovando a especificidade do mtodo em relao ao

composto majoritrio (SQM).
O limite de deteco (LD) e quantificao (LQ) obtidos para SQM foram de

14,28 g/ml e 43,28 g/ml. No entanto, observa-se que tanto LD quanto LQ esto
inseridos nos valores utilizados para a construo da curva do marcador, todavia,
tal fato no comprometeu os valores de DPR% obtidos indicando que o mtodo
cromatogrfico utilizado apresenta boa sensibilidade.
58
Os resultados dos testes de robustez do mtodo constam na Tabela 5.8.

Tabela 5.8. Avaliao do parmetro de robustez para extratos de Bauhinia forficata
subespcie pruinosa.
Parmetro
Tempo de Reteno (min.)
Alterao de Gradiente
6,231
Alterao de Fluxo
7,622
Em relao ao teste de robustez, as mudanas estabelecidas no

alteraram significativamente o cromatograma, observando-se somente ligeira
alterao no tempo de reteno do marcador qumico, permanecendo, os teores
do mesmo, semelhantes aos encontrados para as anlises de preciso. Assim,
possvel afirmar que o mtodo desenvolvido capaz de suportar mudanas no
gradiente e no fluxo da fase mvel.
Ao findar-se a anlise de todos os parmetros propostos para a validao
do mtodo para a quantificao da substncia qumica majoritria, SQM, de
Bauhinia forficata subespcie pruinosa, pode-se inferir que o mtodo em questo
est validado, garantindo confiabilidade aos resultados obtidos.
59
6 DETERMINAO DA ESTABILIDADE QUMICA
6 DETERMINAO DA ESTABILIDADE QUMICA

6.1 INTRODUO
Um importante pr-requisito para a qualidade de um medicamento a
garantia de sua qualidade durante a sua vida til. Estabilidade definida como
sendo a manuteno da qualidade e integridade at o fim da vida til estabelecida
para determinado medicamento (FEIDEN, 1994).
Drogas de origem vegetal e preparaes de origem vegetal obedecem aos
mesmos regulamentos oficiais que regem os medicamentos qumicos definidos
como substncias que respeitam qualidade, eficcia e segurana (LOWEN et al.,
1999). No entanto, na maioria das monografias no so relatados estudos de
estabilidade para os compostos farmacologicamente ativos ou marcadores
qumicos das mesmas. Por esta razo, torna-se cada vez mais imprescindvel se
obter informaes sobre a estabilidade destes componentes (BILIA et al. 2001 e
2002; HEIGL e FRANZ, 2003). De qualquer forma, se os constituintes com
atividade teraputica no so conhecidos, um limite de variao 10 % do valor
do ensaio inicial aceito (NUDELMAN, 1976; LACHMAN et al., 2001; HEIGL &
FRANZ, 2003) e 5% para condies aceleradas de estabilidade, segundo a
Resoluo n. 398 da ANVISA (BRASIL, 2004b; WHO, 1996).
O teste de estabilidade tem como finalidade avaliar o comportamento dos
frmacos ou medicamentos que se alteram com o tempo, por influncia de uma
variedade de fatores ambientais, tais como: a temperatura, a umidade e a luz.
Alm disso, pretende estabelecer um perodo de contraprova ou a vida til para
os medicamentos e condies de armazenamento recomendadas.
Os estudos de estabilidade acelerada so destinados a aumentar a
velocidade de degradao qumica e modificao fsica de uma substncia e/ou
alteraes de caractersticas de forma farmacutica, usando condies foradas
de armazenamento, com o propsito de monitorar as reaes de degradao e
prever o prazo de validade nas condies normais de armazenamento. Os dados
assim obtidos, juntamente com aqueles derivados dos estudos de longa durao,
podem ser usados para avaliar efeitos qumicos prolongados em condies no
aceleradas e para avaliar o impacto de curtas exposies a situaes fora
63
daquelas estabelecidas no rtulo do produto, que podem ocorrer durante o

transporte.
Os ensaios de estabilidade acelerada permitem estabelecer um perodo de
vida til provisrio. Os mesmos devem ser complementados com estudos de
longa durao, realizados nas condies de armazenamento determinadas para o
medicamento. Estudos de estabilidade de longa durao, por sua vez, so
validaes dos experimentos em relao s caractersticas fsicas, qumicas e
biolgicas do medicamento, durante e depois do prazo de validade.
A necessidade de se realizar testes de estabilidade surge no momento em
que o empirismo verificado at ento foi, na sua maioria, substitudo por princpios
mais cientficos na avaliao da estabilidade baseando-se em princpios fsicos e
qumicos mais apropriados para caracterizar o envelhecimento de um
medicamento.
O plano de estudo de estabilidade deve contemplar avaliaes fsicas,
qumicas, fsico-qumicas e microbiolgicas, quando for o caso. Deve-se avaliar
tambm a presena ou formao qualitativa e quantitativa de subprodutos e/ou
produtos de degradao utilizando metodologia adequada e validada. Estudos
adicionais, tais como: fotoestabilidade e outros que se faam pertinentes de
acordo com as propriedades do produto em questo, podero ser necessrias
para a comprovao da estabilidade de produtos farmacuticos (BRASIL 2004b).
De
fato,
aplicao
de
alguns
princpios
fsico-qumicos
no
desenvolvimento de estudos de estabilidade tem provado ser muito vantajosa no

desenvolvimento de formas farmacuticas estveis. S atravs do uso desta
metodologia possvel extrapolar os resultados obtidos a partir das condies de
armazenamento exageradas com o intuito de prever a estabilidade para perodos
de tempo prolongado de armazenamento em prateleira.
As reaes de degradao nos medicamentos ocorrem a velocidades
definidas e so de natureza qumica, podendo ser aceleradas pelo aumento, por
exemplo, da temperatura (NUDELMAN, 1976). Estas reaes dependem de
vrias condies, tais como, a concentrao dos reagentes, da temperatura, do
pH, da radiao ou da presena de catalisadores, alm de estarem relacionados,
64
muitas vezes, ao prprio produto como as propriedades fsico-qumicas de

substncias ativas e excipientes farmacuticos, forma farmacutica e sua
composio, processo de fabricao, tipo e propriedades dos materiais de
embalagem (LACHMAN et al., 2001; BRASIL, 2004b).
A maioria dos mtodos de estudo de estabilidade acelerada fundamentamse na medida da velocidade de degradao a temperaturas superiores que a
normal, para logo fazer inferncias do que aconteceria a temperatura ambiente.
Esto embasados em princpios fsico-qumicos e para tanto se torna necessrio
conhecimentos bsicos em cintica qumica a fim de poder interpretar os
resultados (NUDELMAN, 1976).
A avaliao da estabilidade de cada forma farmacutica que est disponvel
no mercado necessria a fim de assegurar a identidade, efetividade, potncia,
segurana e pureza do medicamento at o momento de seu uso. Est
perfeitamente estabelecido que durante o perodo de vida til de um medicamento
devem conservar-se, em geral, uma concentrao de droga ativa no inferior a
90%, a eficcia teraputica, a segurana, as caractersticas farmacotcnicas e os
caracteres organolpticos (NUDELMAN, 1976).
Os fatores que podem alterar um produto com o tempo so: temperatura,
radiaes, umidade, oxignio ou outros gases atmosfricos, presso, solventes,
variaes de pH, interaes, contaminao microbiana, etc. Todos os mtodos
para estudar a estabilidade devem levar em conta estes fatores.
Atualmente, uma das exigncias para o registro de medicamentos
fitoterpicos o prazo de validade dos mesmos, onde devem constar resultados
do estudo de estabilidade acelerada acompanhados dos estudos de estabilidade
de longa-durao em andamento ou j concludos (BRASIL, 2004a).
O teste de estabilidade foi projetado exatamente para que se possa obter
informaes sobre a estabilidade de produtos farmacuticos visando definir seu
prazo de validade e perodo de utilizao em embalagem e condies de
armazenamento especificadas.
65
A zona climtica um dos fatores que deve ser observado no momento de

se realizar o teste de estabilidade, pois o tempo de conservao de um frmaco
deve ser estabelecido levando-se em considerao a regio em que um produto
encontra-se disponvel para a comercializao (WHO, 1996). Quatro diferentes
zonas climticas so especificadas pela Organizao Mundial da Sade e esto
descritas na Tabela 6.1 (WHO, 1996). Entende-se por zona climtica o espao ou
zona geograficamente delimitada de acordo com os critrios de temperatura e
umidade aplicvel quando da realizao de estudos de estabilidade. O Brasil
situa-se na Zona Climtica IV (quente/mida) (BRASIL, 2004b).
Tabela 6.1. Quadro de definio das zonas climticas definidas pela Organizao
Mundial da Sade (WHO, 1996).
Zona
Descrio
Temperatura Umidade Relativa (U.R.)
Zona I
Clima Temperado
21 C 2 C
45% 5%
Zona II
Mediterrneo
25 C 2 C
60% 5%
Zona III
Quente e Seco
30 C 2 C
35% 5%
Zona IV
Quente e mido
30 C 2 C
70% 5%
Os testes para o estudo de estabilidade acelerada devem ser conduzidos

para a zona IV nas condies de temperatura de 40 C 2 C e 75% 5% de
umidade relativa (U.R.) em 6 meses e como alternativa 50 C 2 C e 90% 5%
em 3 meses (BRASIL, 2004b).
Para que se possa realizar estudos de estabilidade acelerada em uma
droga vegetal, antes de mais nada, necessrio a identificao de um marcador.
Os flavonides, grupo de compostos vegetais largamente distribudo e presente
em B. forficata, conhecido pela sua diversidade fisiolgica e suas atividades
farmacolgicas. O interesse neste grupo de substncias tem crescido nos ltimos
anos. Entretanto, poucos estudos de estabilidade sobre este importante grupo de
compostos naturais so encontrados na literatura.
B. forficata uma planta bastante utilizada popularmente e vendida
deliberadamente em estabelecimentos diversos. Portanto, torna-se cada vez mais
necessria uma anlise mais precisa relacionada aos seus constituintes qumicos
e, principalmente, a estabilidade dos mesmos.
66

a) Avaliar a estabilidade qumica acelerada de Bauhinia forficata
subespcie pruinosa;
b) Analisar fsico-quimicamente os resultados, determinando a ordem da
reao, a velocidade de degradao (k), o tempo em que a concentrao de SQM
90% do inicial (t 90%) e o tempo de meia vida (t1/2).

6.3.1 Estudo de estabilidade acelerada
Foram submetidas anlise, em triplicata, cerca de 10 g de folhas de B.
forficata dispostas em embalagens de papel. As condies preconizadas para
este tipo de estudo, segundo a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria - ANVISA
- na Resoluo de n. 398 do ano de 2004 (BRASIL, 2004b), so temperatura de
50 C 2 C e 90% 5% de umidade relativa, avaliando-se os pontos P0, P1, P2
e P3, respectivamente, inicial, 30, 60 e 90 dias em cmara climtica (NOVA
TICA, MODELO 420 LCD).
6.3.2 Doseamento
Injetando-se as respectivas amostras de cada ponto em CLAE, foi possvel
verificar se houve ou no degradao do marcador qumico com o surgimento de
outros compostos antes no observados pela quantificao de SQM e posterior
anlise fsico-qumica. Os extratos foram todos devidamente preparados e
analisados conforme descrito no Captulo 3.
6.3.3 Clculos da velocidade de degradao (k), dos tempos de vida til

(t90%) e meia-vida (t1/2)
Com base na anlise dos coeficientes de correlao, calculados atravs de
regresso linear dos dados obtidos para o tratamento, possvel se identificar se
a reao de zero, primeira ou segunda ordem. Por conseguinte, torna-se vivel
calcular a velocidade de degradao (k) e os tempos de vida til (t90%) e meia-vida
(t1/2). As equaes utilizadas para os devidos clculos esto descritas a seguir e
67
referem-se a uma reao de segunda ordem e foram extradas de NUDELMAN

(1976).
Equao 6.6. Equao utilizada para o clculo da velocidade de degradao de uma
reao de segunda ordem.
K = 1/t (1/C 1/Co)
Onde: Co = Concentrao inicial da substncia ativa

C = Concentrao da substncia ativa no tempo t
k = Constante de velocidade de reao
t = tempo, em dias
Equao 6.7. Equao utilizada para o clculo do tempo de vida til (t90%) de SQM de
uma reao de segunda ordem.
t90% = 1/(9k.Co)
Equao 6.8. Equao utilizada para o clculo do tempo de meia-vida (t1/2) de SQM de
uma reao de segunda ordem.
t1/2 = 1/k.Co

As amostras de B. forficata sub. pruinosa foram analisadas de acordo com
as condies preconizadas pela Resoluo n. 398 (BRASIL, 2004b) para estudos
de estabilidade acelerada para concesso de prazo de validade provisrio (50 C
2 C e 90% 5% U.R.).
Todas as amostras submetidas s variaes de temperatura e umidade
apresentaram modificaes de colorao, passando de verde marrom e, o odor
que era levemente acre, acentuou-se significativamente.
Os resultados da quantificao da anlise de marcador no extrato das
amostras submetidas ao estudo de estabilidade, utilizando-se metodologia
68
validade por CLAE, encontram-se descritos na Tabela 6.2. Os fatores de diluio

utilizados para o clculo do teor de marcador foi igual a 6 para o P0, j para as
amostras relativas aos pontos 1, 2 e 3 de B. forficata este valor foi de 3 pelo fato
dos valores das reas obtidas inicialmente no fazerem parte da faixa linear
obtida com a curva de linearidade.
Tabela 6.2. Anlise de estabilidade acelerada para Bauhinia forficata subespcie
pruinosa.
Amostras
Concentrao de SQM
(mg%) d.p.*
DPR %
P0
P1
P2
P3
3,22 0,037
1,28 0,009**
0,76 0,011**
0,67 0,009**
1,15
0,70
1,46
1,44
* Para cada ponto da anlise foram tomadas trs amostras e feitas trs determinaes para cada, totalizando
9 determinaes.
** Diluio diferenciada, fator de diluio = 3.
Teor do marcador qumico (mg/ml)
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
30
60
90
Tem po de tratam ento (dias)
Figura 6.1. Perfil de decaimento do teor percentual de SQM obtido a partir das anlises
cromatogrficas das amostras provenientes do estudo de estabilidade para Bauhinia
Os resultados apresentados na Tabela 6.2 bem como a visualizao da
Figura 6.1 denotam o decaimento no teor de marcador, SQM, presente em B.

forficata com o aumento do perodo de permanncia na cmara climtica.
Ao calcular-se os percentuais mdios de degradao do teor do marcador,
em funo das condies propostas de temperatura e umidade, foi possvel
constatar uma abrupta reduo de 60,25% nos nveis do marcador aps os
69
primeiros 30 dias de anlise. E aps 60 dias, a reduo atingiu valores de 76,4%.

No final do tempo de tratamento, a reduo mxima percentual foi de 79,8% em
relao ao P0.
No momento em que todos os picos passveis de anlise foram
devidamente integrados nos respectivos cromatogramas referentes aos pontos
zero, 30, 60 e 90 dias, pode-se notar que todos apresentaram seus valores de
rea mdia alterados. Os picos sofreram decaimento gradual com o aumento da
permanncia na cmara climtica (Figura 6.2).
0.080
0.070
- P0
- P1
- P2
- P3
0.060
AU
0.050
0.040
0.030
0.020
0.010
0.000
5.00
5.20
5.40
5.60
5.80
6.00
6.20
6.40
6.60
6.80
7.00
7.20
7.40
7.60
Minutes
7.80
8.00
8.20
8.40
8.60
8.80
9.00
9.20
9.40
9.60
9.80
10.00
Figura 6.2. Cromatograma demonstrando o decaimento sistemtico dos compostos

presentes em Bauhinia forficata subespcie pruinosa no decorrer da anlise de
estabilidade.
Ao verificar os resultados da hidrlise cida, realizada no Captulo 3,
Figura 3.8, pode-se observar claramente o surgimento de dois novos picos, que
por sua vez correspondem, de acordo com os UV mximos apresentados,
quercetina (370,6 nm) e ao canferol (365,8 nm) portanto, era de se esperar que
ocorresse o mesmo durante o estudo da estabilidade acelerada.
No entanto, ao analisar o cromatograma verifica-se que mesmo com a
reduo gradual na concentrao dos compostos nenhum pico formado a partir
da linha de base. Tal fenmeno poderia ser explicado pelo fato de tratar-se de um
produto de origem vegetal onde outros metablitos, possivelmente no
detectados por CLAE, estariam envolvidos.
70
A Tabela 6.3 apresenta os valores mdios dos dados obtidos

experimentalmente para as amostras submetidas ao estudo de estabilidade
acelerada considerando-se diferentes ordens de reao.
Tabela 6.3. Valores experimentais obtidos no estudo de estabilidade acelerada de
Bauhinia forficata subespcie pruinosa, considerando-se diferentes ordens de reao.
Temp
o
(dias)
Reao de ordem zero

Teor de SQM (mg/ml)(1)
Reao de primeira
ordem log C(2)
Reao de segunda
ordem 1/C(3)
0
30
60
90
3,22
1,28
0,76
0,67
0,5083
0,1091
-0,1192
-0,1767
0,3102
0,7778
1,3160
1,4848
(1)
coeficiente de correlao (r) = -0,887152
(2)
coeficiente de correlao (r) = -0,946229
(3)
coeficiente de correlao (r) = 0,981153
Teor de marcador
qumico (mg/ml)
Ordem zero
y = -0,0273x + 2,7119
r = -0,887152
4
3
2
1
0
0
30
60
90
120
Tempo de tratamento (dias)
Figura 6.3 Representao grfica, de ordem zero, da curva de degradao trmica de

SQM.
Teor do marcador
qumico (log C)
Primeira ordem
0,6
0,4
0,2
0
-0,2 0
-0,4
y = -0,0076x + 0,4219
r = -0,946229
30
60
90
120
Figura 6.4 Representao grfica, de primeira ordem, da curva de degradao trmica

de SQM.
71
Teor de marcador
qumico (1/C)
Segunda ordem
y = 0,01313x + 0,3629
r = 0,981153
2
1,5
1
0,5
0
0
30
60
90
120
Figura 6.5 Representao grfica, de segunda ordem, da curva de degradao trmica

de SQM.
Com base na anlise dos coeficientes de correlao, calculados atravs de

regresso linear dos dados obtidos para o tratamento apresentado na Tabela 6.3
foi possvel a determinao da respectiva ordem de reao. Os valores foram
indicativos de uma reao de segunda ordem, com um r = 0,981153.
A constante da velocidade de degradao (k) apresentou o valor de
0,01313 dias-1. A equao utilizada para a obteno deste dado est indicada
segundo a Equao 6.6.
A partir do valor de velocidade de degradao e do conhecimento da
respectiva ordem de reao, calculou-se o tempo de vida til (t90%) e o tempo de
meia-vida (t1/2) de SQM de B. forficata. Os valores encontrados foram 2,63 dias e
23,65 dias, respectivamente. As frmulas utilizadas para a obteno destes dados
esto indicadas segundo as Equaes 6.7 e 6.8.
72
7 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
7 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

7.1 INTRODUO
O oxignio o elemento mais abundante na biosfera e as oxidaes
biolgicas realizadas atravs do oxignio molecular representam a principal fonte
de energia utilizada pela grande maioria de plantas e animais (WILHELM et al.,
2001). Os radicais formados a partir destas oxidaes so conhecidos
globalmente como espcies reativas de oxignio e entre eles encontram-se os
radicais livres de oxignio (BOVERIS et al., 2000). A toxidade associada ao
consumo de oxignio poderia ser resumida como decorrncia do determinismo,
vinculado segunda lei da termodinmica, no qual a vida (organizao) mantida
s custas do gasto de energia, em ltima anlise, do seu poder redutor, enquanto
que a morte (desorganizao) constituiria os processos de oxidao (HENDRY e
CRAWFORD, 1994).
Por conseqncia, as plantas, ao longo do tempo evolutivo, assim como
tambm
os
organismos
animais,
foram
dotados
de
distintas
defesas
antioxidantes, para compensar os efeitos deletrios associados constante

formao de radicais livres oriundas da presena e utilizao do oxignio nos
seus tecidos (WILHELM et al., 2001).
O uso teraputico de plantas parece ser to antigo quanto prpria
espcie humana. Entretanto, o conhecimento das propriedades antioxidantes
relativamente recente. Nas duas ltimas dcadas observou-se um enorme
crescimento da investigao cientfica desta atividade, envolvendo desde o efeito
de extratos brutos, de fraes ou de componentes isolados e/ou modificados. Os
antioxidantes vegetais so de natureza muito variada, mas, indubitavelmente, os
flavonides constituem o grupo mais representativo (WILHELM et al., 2001).
Os flavonides protegem os constituintes alimentares contra danos
oxidativos, podendo tambm contribuir para a preveno de importantes
patologias, como doenas cardiovasculares, envelhecimento, cnceres, e outras.
Existem vrios relatos de que os flavonides exibem uma grande variedade de
efeitos biolgicos (WILHELM et al., 2001).
75
Considerando-se que os principais constituintes qumicos presentes em

Bauhinia forficata so os flavonides, associando-se tal dado a estudos realizados
em outras espcies de Bauhinia e na prpria B. forficata (item 2.3.1), tornou-se
bastante interessante que a avaliao da atividade antioxidante de seus
diferentes extratos.

a) Determinar a atividade antioxidante de Bauhinia forficata sub. pruinosa
pelo mtodo fotocolorimtrico do DPPH;
b) Testar o potencial antioxidante de diferentes extratos de B. forficata.

Todo o procedimento foi realizado de acordo com a tcnica descrita por
MENSOR e colaboradores (2001). Os reagentes utilizados foram de grau
analtico, obtidos da Merck. A atividade antioxidante dos extratos de B. forficata foi
determinada atravs do mtodo de doseamento fotocolorimtrico do radical 2,2difenil-1-picrilhidrazil-hidrato (DPPH), em processo guiado pela reduo e
descolorao deste em soluo alcolica na presena de agentes antioxidantes.
Como substncia controle foi utilizado padro de rutina (Merck) e o experimento
foi todo desenvolvido em colaborao com o Prof. Dr. Fbio Menezes do
Departamento de Produtos Naturais e Alimentos da Faculdade de Farmcia da
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Os extratos de B. forficata sub. pruinosa foram obtidos de maneiras
distintas, sendo o etanlico, segundo o mtodo descrito no Captulo 3 e o extrato
butanlico, conforme descrito no Captulo 4. O extrato aquoso, por sua vez, foi
obtido atravs de macerao, com ultra-turrax (5 minutos), de 250 mg de planta
pulverizada em gua, filtrado a vcuo e liofilizado para a obteno de uma
amostra isenta de gua (liofilizador SAVANT MICROMODULYO).
Preparou-se soluo amostra a partir dos diferentes extratos de Bauhinia
forficata na concentrao de 1 mg/ml. Em seguida, dilui-se em etanol (MERCK;
grau de pureza p.a.) nas concentraes: 5, 10, 25, 50, 125, e 250 g/ml.
76
Preparou-se, em paralelo, uma soluo de DPPH 0,3 mM em etanol.

Adicionou-se 1ml da soluo de DPPH em 2,5 ml das diferentes concentraes
da soluo amostra. Deixou-se reagir em temperatura ambiente por 30 minutos.
Utilizou-se 1,0 ml de etanol mais 2,5 ml de soluo amostra como branco e
soluo de DPPH (1,0 ml; 0,3mM) mais 2,5 ml de etanol como controle negativo.
Os controles positivos foram as solues padro de Ginkgo biloba e rutina
preparadas usando o mesmo procedimento de diluio utilizado para as
amostras. A rutina foi solubilizada em metanol (MERCK; grau de pureza p.a.).
Aps, foi possvel verificar as medidas de absorvncia em 518 nm,
convertendo-se tais valores em percentual de atividade antioxidante (AA) usando
a frmula descrita na Equao 7.1.
Equao 7.1. Frmula para a converso da medida em absorvncia em percentual de
atividade antioxidante.
AA% = 100 {[(AAM AAB) x 100] / AC}
Onde: AAM = Absorvncia da amostra;

AAB = Absorvncia do branco;
AC = Absorvncia do controle.
A concentrao efetiva para se obter 50% do mximo da atividade
estimada em 100% dita CE50, sendo calculada por regresso linear das curvas
construdas das concentraes dos extratos testados, onde a abscissa (x)
representa a concentrao do extrato vegetal testado e a ordenada (y) a mdia
de 3 anlises do percentual de atividade antioxidante.
77

Os ensaios mostraram as seguintes atividades antioxidantes: CE50 de
54,73 l/ml para o extrato butanlico, CE50 de 283,9 g/ml para o extrato aquoso
e CE50 de 308,1 g/ml para o extrato etanlico, enquanto a CE50 para o extrato de
Ginkgo biloba de 42,51 l/ml e para o padro rutina 14,16 l/ml. O percentual
da atividade antioxidante e o desvio padro percentual de cada extrato de B.
forficata est demonstrado na Tabela 7.1. E a representao grfica dos mesmos
pode ser verificada na Figura 7.1.
Tabela 7.1. Percentual de atividade antioxidante demonstrado pelos extratos butanlico,
etanlico e aquoso de Bauhinia forficata subespcie pruinosa.
Concentrao do
extrato (g/ml)
Extrato butanlico
Extrato aquoso
Extrato etanlico
5
10
25
50
125
250
4,13 1,36
7,52 0,24
19,16 0,53
36,61 0,43
80,06 0,33
89,66 0,18
1,31 0,24
1,82 0,09
5,13 0,68
6,98 0,45
20,40 0,52
44,9 0,45
1,5 0,55
2,9 0,22
4,64 0,25
8,45 0,28
20,75 0,41
40,79 0,43
Atividade Antioxidante* DP (%) de B. forficata
* Mdia para trs determinaes.
Atividade Antioxidante (%)
100
90
Extrato etanlico
80
Extrato butanlico
70
Extrato aquoso
60
50
40
30
20
10
0
5
10
25
50
125
250
Concentrao do extrato (g/ml)
Figura 7.1. Representao grfica da atividade antioxidante apresentada pelos extratos

de Bauhinia forficata subespcie pruinosa testados pelo mtodo do DPPH.
78
Analisando-se a Tabela 7.1 e a Figura 7.2, verifica-se que os extratos

butanlico, aquoso
etanlico
demonstraram possuir alguma atividade
antioxidante, sendo o extrato butanlico o que mais se aproxima do extrato de

Ginkgo biloba, considerado padro para este ensaio. O extrato aquoso
demonstrou ser superior ao etanlico.
Segundo MENSOR e colaboradores (2001), o lquido extrator influencia o
potencial antioxidante do extrato originado, onde aqueles de maior polaridade tm
demonstrado possuir maior atividade antioxidante.
DPPH um radical livre, estvel temperatura ambiente, que produz uma
soluo violeta em etanol. Sua reduo ocorre na presena de molculas
antioxidantes, tornando-se uma soluo descolorida. O uso de DPPH proporciona
uma forma rpida e fcil de se avaliar o potencial antioxidante (MENSOR et al.,
2001).
A interao do potencial antioxidante com DPPH depende da conformao
estrutural. O nmero de molculas de DPPH que so reduzidas parece estar
correlacionado com o nmero de hidroxilas livres (BRAND WILLIANS et al.,
1995). Pode-se inferir que o radical livre DPPH extrai o hidrognio fenlico da
molcula doadora de eltrons e este, por sua vez, pode ser o mecanismo geral de
alimentao dos flavonides antiperoxidantes, por exemplo (RATTY et al., 1988).
Considerando-se o mecanismo de reduo da molcula de DPPH
extensivamente descrito na literatura (TOUVAY et al., 1986; TAKAO et al., 1994;
NANJO, et al., 1996; COTELLE et al., 1996; SREEJAYAN e RAO, 1996; BASNET
et al., 1997; BURMISTROV et al., 1997; FAUCONNEAU et al., 1997;
KOROUNAKIS, et al., 1997; TSENG et al., 1997), que se correlaciona com a
presena de grupos hidroxila presentes na molcula antioxidante, pode-se inferir
que a atividade apresentada pelo extrato mais polar provavelmente devida a
presena de substncias com hidroxilas livres (fenlicas ou no). Essa exigncia
estrutural pode estar vinculada presena de flavonides, que ocorrem, entre
outras, em plantas pertencentes famlia Leguminosae e na espcie Bauhinia.
79
De fato, substncias como os flavonides j tm sido estudadas como

antioxidantes e demonstrado possuir potencial atividade (GORDON, 1996;
RAPTA et al., 1995; YOKOZAWA et al., 1997; MARFAK et al., 2003).
A atividade antioxidante apresentada pelos extratos de B. forficata
satisfatria, porm, no superior a de Ginkgo biloba denotando a presena de
seqestradores de radicais livres, como os flavonides, conhecidos antioxidantes.
80
8 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIEDEMATOGNICA IN VIVO
8 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIEDEMATOGNCIA IN VIVO

8.1 Introduo
Os flavonides tm sido amplamente estudados por possurem atividade
antiinflamatria e antiedematognica (MASCOLO et al., 1988; EMIM et al., 1994;
RECIO et al., 1995; PELZER et al., 1998; HARBONE e WILLIANS, 2000). Ao
considerar-se que um dos principais efeitos adversos dos antiinflamatrios noesterides o desenvolvimento de problemas gastrintestinais, principalmente na
ulcerognese, decorrente da inibio da enzima cicloxigenase-1 e o crescente
interesse da populao mundial em terapias alternativas e possivelmente menos
agressivas, aprofundar os estudos a fim de comprovar atividades empricas
relacionadas aos flavonides tornou-se fundamental.
O processo inflamatrio, apesar de ser um fenmeno complexo,
caracteriza-se fundamentalmente por manifestar-se de maneira estereotipada.
Trata-se de uma cadeia complexa de eventos, os quais representam respostas de
defesa do organismo contra as injrias. Dependendo da intensidade e do tempo
de durao, a reao inflamatria pode no ocorrer como evento meramente local
e, alm de estar ajustada intensidade e persistncia do estmulo nocivo,
passvel de ser influenciada por mecanismos gerais de defesa, que podem ser
alterados por circunstncias que afetam
organismo
como
um
todo
(SCHAPOVAL, 1974; GARCIA LEME, 1981).

A atividade dos flavonides pode ser explicada por diversos mecanismos
de ao, entre eles inibio da cicloxigenase (COX). Para MORONEY e
colaboboradores (1988) alguns flavonides inibem seletivamente a enzima 5lipoxigenase, envolvida na formao dos leucotrienos a partir do cido
araquidnico. Substncias derivadas do canferol atuam inibindo as COX e 5lipoxigenase
concomitantemente
(SERTI
et
al.,
1990).
Outro
possvel
mecanismo de ao a inibio da sntese das prostaglandinas PGE2 e PGE2a e

prpria atividade antioxidante (GARG et al., 2001).
Popularmente, atividades analgsica, antiedematognica e antiinflamatria
bem como antioxidante (discutida no Captulo 7) so relacionadas s Bauhinias,
83
possivelmente, por serem, justamente, os flavonides os seus principais

constituintes qumicos.
MEYRE-SILVA e colaboradores (2001) realizaram estudos com Bauhinia
microstachya a fim de verificar sua atividade analgsica. Estes autores testaram
seu extrato metanlico e flavonides isolados da prpria planta confirmando o seu
uso popular como analgsica. Enquanto SOSA e colaboradores (2002)
demonstraram que Bauhinia tarapotensis possui propriedade antiinflamatria
tambm confirmando o seu emprego popular.
Bauhinia forficata dita popularmente como possuidora de propriedades
antiinflamatria e antiedematognica (ver Captulo 2), mas, infelizmente, no
existem estudos mais aprofundados relacionados a tais atividades descritos na
literatura. Para se verificar a atividade antiinflamatria segue-se normalmente
modelos in vitro, como a quimiotaxia, e in vivo, edema de pata de ratos, pleurisia
e microcirculao in situ. Decidiu-se, ento, neste trabalho, avaliar a atividade
antiedematognica de B. forficata a partir do seu extrato aquoso, uso comumente
relatado, atravs do mtodo de edema em pata de ratos.
8.2 OBJETIVO ESPECFICO

a) Determinar a atividade antiedematognica do extrato aquoso de
Bauhinia forficata sub. pruinosa atravs do mtodo de edema em pata de ratos
induzido pela carragenina.

8.3.1 Material biolgico
Para a realizao deste experimento, foram utilizados 23 animais
fornecidos pela Fundao Estadual de Pesquisa e Produo em Sade (FEPPS).
Para tanto, ratos da raa Wistar machos pesando de 180 a 200 g, foram mantidos
em caixas plsticas contendo, no mximo, cinco animais, com livre acesso gua
e rao. Os mesmos passaram por um perodo de adaptao de 48 horas no
Biotrio da Faculdade de Farmcia UFRGS, com temperatura controlada (23
2 C), controle de claro/escuro de 12 horas (7 h 19 h) e umidade monitorada.
84
A manipulao animal foi realizada seguindo princpios ticos relatados por

GOLDIM (1995) para a experimentao animal. O projeto foi submetido
avaliao do Comit de tica desta Universidade tendo sido aprovado sob o
registro CEP 23078.034044/03-15, na reunio n. 27, ata n. 48, no dia 27 de maio
de 2004, por estar adequado tica e metodologicamente e de acordo com a
Resoluo 196/96 do Conselho Nacional de Sade (ANEXO 3).
8.3.2 Preparao do extrato

O extrato aquoso de B. forficata foi preparado pelo mtodo de infuso
seguido de macerao esttica, por ser esse, freqentemente, o seu preparo
popular. A fim de se obter uma concentrao terica em torno de 100 mg/ml
verteu-se 200 ml de gua fervente sobre, cerca de, 20 g de planta seca. O infuso
permaneceu em repouso 24 horas, caracterizando a macerao esttica, e aps
este perodo, foi filtrado vcuo.
8.3.3 Edema em pata de rato

A atividade antiedematognica foi avaliada de acordo com metodologia
descrita por WINTER e colaboradores (1962), na qual foi utilizada carragenina
para induo de edema em pata de rato. A reao inflamatria desenvolvida em
edema de pata de rato, com adio prvia de agente flogstico pode ser
transformada em teste quantitativo pela medida do dimetro da pata ou pela
medida do volume da pata atravs de pletismmetro (SUYENAGA, 2002).
Como controle positivo foi utilizada a indometacina (SIGMA) na dose de 10
mg/kg, por via oral. E como controle negativo foi empregada soluo salina. Os
animais foram tratados com extrato aquoso, preparado conforme descrito no item
8.3.2, por via oral, na dose de 500 mg/kg, uma hora antes da induo do edema.
Tal dose foi definida com base em experimentos realizados com extratos de B.
forficata por outros autores, entre eles SILVA e colaboradores (2002) e
DAMASCENO e colaboradores (2004), principalmente em estudos de sua
atividade hipoglicemiante. Aps, os animais foram anestesiados, pela via
intraperitoneal, com pentobarbital sdico, na dose de 40 mg/kg de peso corporal,
e mantidos sedados durante as medidas.
85
O edema foi induzido na aponevrose subplantar da pata traseira esquerda

dos ratos, atravs de injeo de 0,1 ml de soluo de carragenina (SIGMA) em
salina (5 mg/ml). As patas direitas serviram de controle, atravs da injeo de 0,1
ml de soluo salina. O volume das patas foi medido em triplicata, nos tempos 1,
2, 3, 4 horas aps a injeo do agente flogstico, utilizando o plestimmetro Ugo
Basile. O lquido utilizado no aparelho foi uma soluo contendo 4 ml (m/V) de
laurilssulfato de sdio e 0,4 g de NaCl, dissolvidos em um litro de gua.
Os resultados de reduo de edema foram calculados em relao ao
aumento percentual do volume das patas traseiras de 6 animais controles
positivos, de 7 animais controles negativo e de 10 animais tratados. Os resultados
dos volumes mdios das patas foram analisados estatisticamente pelo teste t de
Student.
8.3.4 Mtodo de morte

Imediatamente aps os experimentos os animais foram sacrificados por
atordoamento com ter etlico, em capela de exausto, e posterior deslocamento
cervical.
8.3.5 Mtodo de descarte do material biolgico

O material biolgico foi armazenado em sacos plsticos, em freezer com
temperatura de 20 oC, destinado especialmente para este fim, at a coleta pelo
Centro de Controle de Zoonoses da Prefeitura Municipal de Porto Alegre.

Os efeitos da administrao oral do extrato aquoso de B. forficata na
inibio da formao do edema em pata de ratos induzido pela carragenina,
podem ser observados na Tabela 8.1. Os aumentos dos volumes dos edemas
das patas de ratos esto ilustrados na Figura 8.1. Os resultados foram expressos
como mdia desvio padro (d.p.) e analisados estatisticamente pelo teste t de
Student.
86
Tabela 8.1. Formao do edema em pata de ratos induzido pela carragenina.
Tratamento
Controle
Indometacina
(10mg/kg)
Extrato
(500mg/kg)
Vol. do edema de pata (ml) d.p. (% de inibio)
1h
0,63 0,17
0,54 0,13
(14,28%)
0,48 0,09
(23,80%)
2h
0,73 0,09
0,60 0,09
(17,80%)
0,37 0,07*
(49, 32%)
3h
2,0 0,23
0,33 0,01*
(83,5%)
0,47 0,12*
(76,5%)
4h
2,64 0,49
0,75 0,36*
(71,59%)
0,71 0,18*
(73,20%)
* significativo p < 0,05 em relao ao controle.
Na Tabela 8.1 esto os resultados obtidos a partir da administrao v.o. do

extrato aquoso de B. forficata em relao ao controle negativo e indometacina.
Pode-se observar que o extrato demonstrou atividade antiedematognica
significativa, para um = 0,05, a partir da segunda hora (49,32%). Enquanto o
controle positivo s demonstrou atividade significativa a partir da terceira hora
(83,5%).
O extrato demonstrou atividade significativa ao longo de trs horas.
Inclusive, j na primeira hora, apesar do seu percentual de inibio ainda no ser
significativo, demonstrou-se superior ao da indometacina (controle positivo). E na
segunda hora, sua inibio j era estatisticamente significativa enquanto o
controle positivo ainda demonstrava-se inativo. Na terceira hora, atingiu seu
mximo de inibio (76,3%) e na quarta hora manteve-se com um percentual de
inibio bastante elevado (73,20%) e novamente superior ao da indometacina.
Considerando-se que o extrato aquoso de B. forficata possui como
constituintes majoritrios canferol e quercetina glicosilados, sugere-se que a
atividade demonstrada esteja relacionada a um possvel sinergismo entre os
compostos. Pode-se, ainda, relacionar a atividade ao grupamento catecol ou
presena da hidroxila no carbono 3. ALCARAZ e FERRANDIZ (1987), ao estudar
o canferol, sugeriram a inibio seletiva da enzima COX (cicloxigenase), devido
presena do grupamento catecol no anel A ou B e, tambm que a presena da
hidroxila na posio 3 seria suficiente para inibir esta enzima.
RECIO e colaboradores (1995) verificaram que os flavonis foram ativos
contra a resposta vascular primria mediada pelas aminas e prostaglandinas,
87
destacando-se a aglicona quercetina, que inibiu a fosfolipase A2 dos leuccitos

humanos, bem como a liberao de histamina dos basfilos.
controle
indometacina
Aumento do volume (ml)
3,5
B.forficata
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1
Tempo (horas)
Figura 8.1. Aumentos dos volumes dos edemas em pata de ratos.
Ao analisar-se a Figura 8.1 evidencia-se claramente que o comportamento

do extrato de B. forficata aproxima-se bastante ao do controle positivo
(indometacina). Sendo que nos tempos 2 e 4, o efeito do extrato demonstra-se
superior, pois o aumento do volume menor do que aquele observado para o
animal tratado com indomentacina, demonstrando, assim, que o extrato aquoso
de fato possui atividade antiedematognica.
A atividade antiinflamatria relacionada aos flavonides bastante
conhecida e estudada. Explica-se, em parte, como sendo devido inibio da
cicloxigenase (COX) onde o canferol, por exemplo, atuaria inibindo as enzimas
COX e 5-lipoxigenase, ou ainda, inibindo a granulao tecidual. A quercetina
atuaria inibindo seletivamente a enzima 5-lipoxigenase, envolvida na formao
dos leucotrienos a partir do cido araquidnico (MORONEY et al., 1988; SERTI
et al., 1990).
Considerando-se que o gnero Bauhinia caracteriza-se pelo acmulo de
flavonides livres e glicosilados (PIZZOLATTI et al., 2003), pode-se perfeitamente
julgar que B. forficata seja capaz de demonstrar atividade antiinflamatria em
ensaios apropriados (ex. pleurisia).
88
Corroborando para a obteno de tal resultado positivo em B. forficata,

tem-se ainda, a presena de -sitosterol, substncia tida como antinociceptiva, e
que de certa forma, pode justificar e reforar esse tipo de atividade (OLIVEIRA et
al., 2001). A presena de -sitosterol, por sua vez, foi demonstrada por SILVA e
colaboradores (2000) em experimento com B. forficata. Embora no constem na
literatura, at o presente momento, trabalhos cientficos que possam comprovar a
atividade antiinflamatria do -sitosterol, este composto bastante comum em
produtos naturais e apresenta importantes atividades farmacolgicas (HANDA et
al., 1992).
89
9 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERSICA
9 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERSICA

9.1 INTRODUO
A Doena de Alzheimer uma das causas mais comuns de demncia senil
em idosos. uma doena degenerativa que destri as clulas do crebro, lenta e
progressivamente, afetando o funcionamento mental (pensamento, fala, memria,
etc). Estima-se que mais de 4 milhes de pessoas sofram deste mal nos Estados
Unidos (MARSTON et al.,2002).
Os inibidores da acetilcolinesterase, enzima responsvel pela degradao
da acetilcolina cerebral, tm sido a base da terapia dos mais novos medicamentos
disponveis no mercado contra o Mal de Alzheimer. Tais inibidores agem
corrigindo a deficincia do neurotransmissor acetilcolina nas sinapses do crtex
cerebral. Fisostigmina (alcalide obtido da Fava de Calabar, Physostigma
venenosum; Leguminosae) um excelente inibidor da acetilcolinesterase, mas
pouco absorvido pelo trato gastrintestinal em humanos. Por esta razo, anlogos
como a rivastigmina, tem sido introduzida na teraputica (FORETTE et al., 1999).
Galantamina, alcalide isolado de plantas da familia Amaryllidaceae, tambm tem
sido utilizada no tratamento do Mal de Alzheimer (FULTON e BENFIELD, 1996;
CALIXTO 2001b).
Os flavonides por sua vez, podem atuar de diferentes formas, contribuindo
para a integridade do tecido neuronal: a) inibindo a atividade das enzimas
superxido-dismutase e monoamina-oxidase, que contribuem para a gerao de
radiais livres no crebro e no corpo; b) seqestrando radicais livres que poderiam
causar dano aos neurnios e, conseqentemente, retardar as mudanas
associadas idade no crebro e c) reduzindo a liberao de cido araquidnico,
um co-produto txico do metabolismo lipdico, que aparece no crebro logo aps
o episdio isqumico (ISHIGE et al., 2001; GRUNDMAN e DELANEY, 2002;
FRAGA et al., 2004).
ISHIGE e colaboradores (2001) ao estudarem os mecanismos pelos quais
os flavonides protegem as clulas neuronais, concluram que, se o estresse
oxidativo responsvel por inmeros distrbios, entre eles o Mal de Alzheimer, os
93
flavonides bem como os alimentos que os contm podem ter muitos efeitos
benficos no tratamento dessa doena.
Novamente, a presena de flavonides como constituintes majoritrios em
Bauhinia forficata contribuem para que se realize um ensaio autobiogrfico a fim
de se verificar uma possvel atividade anticolinestersica. No entanto, na literatura
encontram-se relatos em que os resultados no foram positivos, como os citados
no Captulo 2, no item 2.3.4.
Tendo-se em vista o potencial de plantas para a descoberta de novos
inibidores da acetilcolinesterase, o ensaio de autobiografia por cromatografia em
camada delgada (CCD) foi introduzido para screening de extratos provenientes de
plantas. O mtodo de CCD foi escolhido, pois permite um acesso rpido
informao considerando tanto a atividade como a localizao da ao no
complexo material vegetal. Os constituintes separados podem ser diretamente
detectados na placa de CCD. O teste consiste na clivagem do 1-naftil acetato pela
acetilcolinesterase em 1-naftol, o qual reage com o reagente Fast Blue B salt
formando um diaznio de colorao prpura. As regies da placa que contm os
inibidores da acetilcolinesterase apresentam uma mancha branca contra o fundo
prpura.
9.2 OBJETIVO ESPECFICO

a) avaliar uma possvel atividade anticolinestersica de 3 compostos
isolados de Bauhinia forficata sub. pruinosa com o auxlio da tcnica de
autobiografia por CCD.

9.3.1 Compostos isolados
Durante o processo de isolamento de SQM, descrito no Captulo 3, foi
possvel visualizar outras 2 bandas cromatogrficas em CCD com bastante
nitidez, as quais tambm foram isoladas pelo mesmo mtodo e avaliadas,
juntamente com SQM, no experimento de autobiografia. Os produtos isolados
foram diludos em uma soluo metanlica na concentrao de 1 mg/ml e 10 l
foram aplicados sobre a placa de CCD.
94
9.3.2 Mtodo da Autobiografia

O experimento foi desenvolvido segundo mtodo descrito por MARSTON e
colaboradores (2002).
Preparou-se uma soluo estoque dissolvendo-se acetilcolinesterase (1000
U) em 150 ml de tampo Tris-cido clordrico 0,05M a pH 7,8. Adicionou-se
albumina de soro bovino (150 mg) a soluo para estabilizar a enzima durante o
bioensaio. A soluo de estoque foi mantida a 4 C.
As trs solues metanlicas, contendo as substncias puras isoladas de
B. forficata, foram devidamente depositadas (aplicadas) sobre a placa de CCD,
que foi seca imediatamente para a completa remoo do solvente.
A placa foi, ento, nebulizada com a soluo estoque e seca novamente.
Na seqncia, para que ocorresse a devida incubao da enzima, deitouse a placa sobre um suporte em um tanque contendo um pouco de gua, a uma
temperatura de 37 C durante 20 minutos. Desta forma, a gua no entrou
diretamente em contato com a placa, mas a atmosfera permaneceu mida. A
enzima apresentou uma estabilidade satisfatria nestas condies.
Para deteco da enzima, uma soluo de 1-naftil acetato (250 mg) em
etanol (100 ml) e de Fast Blue B salt (400 mg) em gua destilada (160 ml) foram
preparadas imediatamente antes do uso (a fim de prevenir decomposio).
Aps a incubao da placa de CCD, 10 ml da soluo de 1-naftil acetato e
40 ml da soluo de Fast Blue B salt foram misturadas e, em seguida, aspergidas
na placa, ocorrendo o desenvolvimento de colorao prpura no decorrer de 1-2
minutos. Em caso de atividade anticolinestersica, uma mancha branca contra o
fundo prpura deve ser formada nos pontos de aplicao da substncia avaliada.

No ensaio autobiogrfico realizado, o resultado apresentado pelas trs
solues metanlicas preparadas a partir de compostos isolados de B. forficata,
95
estando entre eles SQM (Figura 9.1), foi negativo, pois nenhuma mancha branca
contra o fundo prpura foi visualizada.
O resultado pode ser atribudo ao fato de uma possvel atividade
anticolinestersica, se existente, estar vinculada a um sinergismo entre os
diferentes compostos presentes em B. forficata. De maneira que, ao se
analisarem 3 dos cinco produtos isoladamente, todos demonstraram no possuir
qualquer atividade. O extrato puro no foi analisado em um primeiro momento
pois buscava-se identificar uma possvel atividade j vinculando a mesma a um
composto puro presente na planta e devidamente isolado. Considerando-se o
resultado obtido, pode-se sugerir a anlise do extrato para novas concluses.
Outra explicao plausvel seria relacionada ao fato de que os compostos
testados tratavam-se, possivelmente, de canferis com diferentes glicosdeos
ligados e a atividade colinestersica, por sua vez, pode estar associada somente
a agliconas livres.
Figura 9.1. Cromatograma de Bauhinia forficata, a 348 nm, demonstrando os picos das
substncias avaliadas no experimento de atividade anticolinestersica.
96
10 DISCUSSO GERAL
10 DISCUSSO GERAL
A utilizao de plantas como fonte de medicamentos para o tratamento das
mais diversas doenas que acometem o homem, remonta aos primrdios da
humanidade. Muito provavelmente, a teraputica moderna no teria atingido o
grau de desenvolvimento atual se no fosse o auxlio das plantas.
Apesar do vasto uso de preparaes de origem vegetal como
medicamentos, poucas foram estudadas cientificamente para comprovao de
sua eficcia clnica e para a avaliao de sua segurana. De tal forma, raramente
os princpios ativos so conhecidos.
O controle de qualidade, a padronizao e a estabilizao dos
medicamentos fitoterpicos constituem uma tarefa bastante complexa, embora
possvel, atualmente, em funo dos avanos crescentes alcanados nos
mtodos analticos de alta resoluo.
Considerando as dificuldades para garantir a qualidade e a estabilidade
dos medicamentos fitoterpicos, a tendncia vigente o cultivo das plantas
medicinais, fator crucial para manter a qualidade da matria-prima e,
conseqentemente, do produto final acabado.
No Brasil, as plantas so usadas em grande escala como medicamentos.
Considerando-se a vasta riqueza natural, ainda sem estudo, e as possibilidades
que observamos para o desenvolvimento de novos fitoterpicos, torna-se cada
vez mais imprescindvel a pesquisa e o estudo aprofundados sobre as mesmas e
suas propriedades.
Bauhinia forficata uma das tantas plantas da flora brasileira, usada
deliberadamente pela populao sem qualquer controle especfico. No decorrer
deste trabalho foi possvel constatar as inmeras ambigidades relacionadas
identificao de B. forficata que persistem. Concomitantemente, as diferenas
qumicas entre as diferentes subespcies contriburam ainda mais para que se
reconsidere a nomenclatura e a sinonmia utilizadas atualmente.
Ao analisar-se B. forficata quimicamente, foi possvel estabelecer que o seu
emprego correto est diretamente relacionado com diferentes etapas, desde o
99
seu cultivo, passando pela estao da sua coleta e a correta identificao da

espcie e subespcie.
Muito provavelmente, as variaes nas atividades biolgicas estejam
ligadas s variaes qumicas da planta. Corroborando para que muitos estudos,
at ento vinculados s suas possveis atividades, fossem inconclusivos. Somase ainda, o fato de os constituintes qumicos presentes em B. forficata subespcie
pruinosa serem extremamente sensveis e degradarem com certa facilidade, o
que pode ser observado no experimento de estabilidade acelerada realizado.
Refora-se ento, a necessidade de um controle de qualidade adequado para B.
forficata com um nmero maior de amostras e um perodo de anlise de longa
durao.
Alm disso, como ter certeza a respeito das atividades biolgicas relatadas
at ento para B. forficata se a subespcie dificilmente informada? Se elas
apresentam diferenas qumicas ntidas, por que no poderiam ter efeitos
teraputicos distintos tambm?
Em ensaios de estabilidade acelerada, poucas plantas resistem s
condies preconizadas para os medicamentos, gerando dificuldades no
momento de se sugerir um prazo de validade at mesmo provisrio para as
mesmas. A exigncia de estudos mais aprofundados e de longa durao torna-se
fundamental para o correto uso de plantas medicinais. Na anlise de B. forficata
subespcie pruinosa, os tempos de vida til e meia-vida encontrados
demonstraram valores bastante reduzidos, sugerindo assim uma altssima
sensibilidade da planta frente s variaes de temperatura e umidade as quais a
mesma foi exposta.
A embalagem bastante simples utilizada no experimento, com o intuito de
se aproximar das comerciais, serve como subsdio para que se reconsidere as
apresentaes encontradas no mercado atualmente e refora a importncia do
material de acondicionamento e embalagem na garantia de produtos naturais.
Sendo assim, como garantir o uso correto de fitoterpicos pela populao
em geral, uma vez que os mesmos no tm os devidos estudos de estabilidade,
validao e controle de sua qualidade?
100
Muitos estudos j desmistificam as propriedades populares e tornaram-nas

cientficas vinculando ou no as mesmas a um determinado componente ou grupo
de presentes na planta. Por isso, comprovar a integridade qumica da mesma
durante um determinado perodo de tempo cada vez mais coeso frente ao
posicionamento tanto dos estudiosos, que se dedicam e interessam pelas plantas
existentes na flora mundial, como da populao que consume e confia na eficcia
de medicamentos provenientes de plantas.
Para que as anlises de estabilidade fossem realizadas e devidamente
validadas, a identificao de uma substncia qumica majoritria responsvel ou
no por possveis propriedades teraputicas de B. forficata foi crescente.
Importante ressaltar que, em um primeiro momento, o isolamento de
compostos qumicos no fazia parte dos objetivos desta Dissertao, uma vez
que diferentes substncias j haviam sido devidamente elucidadas para B.
forficata. Alm disso, um marcador foi sugerido para a espcie B. forficata por
SILVA e CECHINEL (2002) chamado de canferitrina, um heterosdeo de canferol.
Este metablito no foi identificado na planta estudada neste trabalho.
Aprofundando as anlises foi verificado que as subespcies forficata e pruinosa,
apresentam perfil qumico diferenciado. Desta forma, ao analisar e comparar
estas subespcies, o isolamento da substncia qumica majoritria (SQM) tornouse praticamente vital para que os estudos fossem de fato realizados. At o
presente momento, pode-se apenas sugerir que SQM seja o canferol 3robinosideo 7 rhamnosideo identificado atravs de espectrometria de massas e
ultravioleta.
A validao do mtodo, geralmente aplicada a medicamentos sintticos,
uma exigncia crescente nos ltimos anos a fim de assegurar que as
especificaes tcnicas dos produtos possam ser mantidas indistintamente do
lugar de fabricao ou do tempo/distncia de transporte. Sendo assim, com o
intuito de se obter resultados confiveis na anlise da estabilidade acelerada de
B. forficata sub. pruinosa, a validao do mtodo por CLAE empregado foi
fundamental.
101
No que diz respeito s atividades biolgicas estudadas no presente

trabalho, pode-se inferir que algumas das propriedades relatadas pela populao,
foram elucidadas para B. forficata subespcie pruinosa.
A atividade antioxidante, j bastante vinculada aos flavonides, foi
demonstrada, in vitro, para diferentes extratos de B. forficata e corroborou para
que se realizassem, ento, outros experimentos, como o edema em pata de ratos
para a atividade antiedematognica e a autobiografia para a atividade
anticolinestersica. Considerando-se, desta forma, que o mecanismo de ao
demonstrado pelos flavonides para a atividade antioxidante pode estar, de fato,
bastante relacionado com os mecanismos de ao das outras duas atividades. E
ainda, a presena de substncias antioxidantes pode estar de alguma forma
relacionada, at mesmo, com a atividade antidiabetes largamente estuda para B.
forficata.
O teste do edema em pata de ratos, por sua vez, demonstrou uma
atividade significativa para o extrato aquoso da planta, confirmando o seu
emprego popular como antiinflamatria e antiedematognica. Enquanto a
autobiografia apresentou um resultado negativo, mas considerando-se que
nenhum extrato foi testado, sugere-se que estudos complementares sejam
realizados antes que se faam afirmaes mais precisas.
Ao se estudar e valorizar o desenvolvimento da qumica de plantas
medicinais, a sua importncia torna-se evidente, no s como embasamento
cientfico de uma medicina alternativa, mas como fonte de novos e potentes
frmacos.
Convm recordar que existe uma tendncia mundial em implementar a
qualidade de vida e, por isso, as exigncias a tratamentos menos agressivos ao
organismo ou que causem efeitos adversos mais suaves so crescentes.
justamente esse um dos principais motivos que impulsiona a poderosa indstria
farmacutica em busca de novos frmacos. Sendo assim, a pesquisa e propostas
de controle de qualidade viveis tornam-se extremamente necessrias e
valorosas na rea cientfico-tecnolgica relacionadas aos fitoterpicos.
102
11 CONCLUSES GERAIS
11 CONCLUSES GERAIS
Analisando-se o perfil cromatogrfico de Bauhinia forficata pode-se verificar

que a anlise por CLAE foi bastante valiosa e que o mtodo estabelecido
demonstrou-se satisfatrio para o estudo desta espcie.
Pode verificar tambm, que o comportamento qumico entre diferentes

subespcies distinto, bem como na mesma subespcie, com a variao
nas estaes do ano.
Observou-se distines qumicas entre B. forficata subespcie pruinosa e

a espcie Bauhinia variegata, frequentemente confundida pela populao
com a primeira em funo de semelhanas morfolgicas.
Para a completa elucidao e identificao da substncia qumica

majoritria (SQM) isolada a partir do extrato butanlico de B. forficata
tornam-se imprescindveis anlises complementares; podendo-se, at o
presente momento, inferir que, segundo anlises espectromtricas de
massas e UV, trata-se do canferol 3 robinosdeo 7 rhamnosdeo.
A partir dos resultados obtidos para a validao de metodologia analtica

empregada pode-se afirmar que o mtodo de CLAE foi devidamente
validado apresentando linearidade, repetibilidade, preciso, exatido,
especificidade e robustez.
Com a anlise da estabilidade qumica pode-se verificar que a reao

demonstrou comportamente caracterstico de uma reao de segunda
ordem e a velocidade de degradao foi de 0,01313 por dia.
Pode-se, ainda, inferir que o tempo de vida til e o tempo de meia-vida de

B. forficata, nas condies propostas foram de 2,63 e 23,65 dias,
respectivamente, sugerindo que estudos de establidade de longa durao
sejam realizados para concluses mais precisas.
Ao determinar-se a atividade antioxidante de diferentes extratos de B.

forficata pode-se observar que apenas o extrato butanlico apresentou
uma atividade efetiva quando comparado ao padro usado no ensaio; no
105
entanto estudos mais detalhados sobre a composio qumica desses

extratos, bem como outros modelos, do tipo peroxidao lipdica e ensaios
in vivo, so essenciais para caracteriz-los como antioxidantes biolgicos
alm de poder inferir sobre os possveis mecanismos de captura dos
radicais livres pelas molculas de B. forficata.
Analisando-se
os
resultados
de
determinao
de
atividade
antiedematogncia pode-se dizer que o extrato aquoso de B. forficata

apresentou
um
efeito
bastante
significativo
frente
ao
controle
indomentacina.
Ao testar-se a atividade anticolinestersica constatou-se que os compostos

testados
no
demonstraram
atividade
complementares sejam realizados.
106
sugerindo
que
estudos
12 REFERNCIAS
12 REFERNCIAS
ALCARAZ, M.J.; FERRNDIZ, M.L. Modification of arachidonic metabolism by
flavonoids. Journal of Ethnopharmacology, v. 21, p. 209-229, 1987.
ALONSO, J.R. Tratado de Fitomedicina: bases clnicas e farmacolgicas.
Buenos Aires: ISIS ediciones, 2000. p. 805-806.
ATROCH, E.M.A.C.; SOARES, A.M.; ALVARENGA, A.A.; CASTRO, E.M.
Crescimento, teor de clorofilas, distribuio de biomassa e caractersticas
anatmicas de plantas jovens de Bauhinia forficata LINK submetidas a diferentes
condies de sombreamento. Cincias Agrotcnicas, Lavras, v.25, n.4, p.853862, 2001.
BASNET, P.; MATSUMO, T.; NEIDLEIN, R. Potent free radical scavenging activity
of propol isolated from Brazilian propolis. Zeitschrift fur Naturforshchung, v. 51,
n. 11-12, p. 828-833, 1997.
BILIA, A. R.; BERGONZI, M. C.; MORGENNI, F.; MAZZI, G.; VINCIERI, F. F.
Evaluation of chemical stability of St. Johns wort commercial extract and some
preparations. International Journal of Pharmaceutics, v. 213, p. 199-208, 2001.
BILIA, A. R.; BERGONZI, M. C.; GALLORI, S.; MAZZI, G.; VINCIERI, F. F.
Stability of the constituents of Calendula, Milk-thistle and Passionflower tinctures
by LC-DAD and LC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
n. 30, p. 613-624, 2002.
BOVERIS, A.; ALVAREZ, S.; ARNAIZ, S.A.; VALDEZ, L. Handbook of
Antioxidant., Cadenas, E., Packer, L., Eds.,2000. p. 351.
BRACA, A.; TOMMASI, N.; BARI, L.; PIZZA, C.; POLITI, M.; MORELLI, I.
Antioxidant Principles from Bauhinia tarapotensis. Journal of Natural Products,
v. 64, p. 892-895, 2001.
BRAND WILLIANS, W.; CUVELIER, M.E.; BERSET, C. Use of a free radical
method to evaluate antioxidant activity. LWT Food Science and Technology. v.
28, p. 25-30, 1995.
BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.
Resoluo n. 899 de 29 de maio de 2003: Guia para a Validao de Mtodos
Analticos. Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 2003.
109
BRASIL, Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia Sanitria. Resoluo n. 48,

de 16 de maro de 2004. Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil,
Braslia, 2004a.
BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.
Resoluo n. 398 de 12 de novembro de 2004. Guia para a Realizao do Estudo
de Estabilidade. Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil, Braslia,
2004b.
BRUNETON, J. Elementos de fitoquimica y farmacognosia. Zaragoza: Acribia,
1991.
BUSMISTROV, S.O.; OPARINA, T.I.; PROKOPENKO, V.M.; ARUTIUNIAN, A.V.
Antioxidant activity of the blood serum in pregnant and nonpregnant women: a
comparision of various detection methods. Klin. Lab. Diagnosys., v.11, p.1417,1997.
CALIXTO, J. B. Estudo Farmacolgico pr-clnico de Plantas Medicinais. In:
YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Plantas Medicinais: sob a tica da Qumica
Medicinal Moderna. Chapec: Argos, 2001a. 500 p.
CALIXTO, J. B. Medicamentos Fitoterpicos. In: YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B.
Plantas Medicinais: sob a tica da Qumica Medicinal Moderna. Chapec: Argos,
2001b. 500 p.
COTELLE, N.; BERNIER, J.L.; CATTEAU, J.P.; POMMERY, J.; WALLET, J.C.;
GAYDOU, E.M. Antioxidant properties of hydroxy-flavones. Free Radical Biology
Medicine, v.21, p. 35-43, 1996.
CRUZ, G.L. Dicionrio das plantas teis do Brasil. Rio de Janeiro: Civilizao
Brasileira, 1979.
COSTA, O. A. Estudo farmacodinmico da unha-de-vaca. Revista da Flora
Medicinal, Rio de Janeiro, v. 12, n. 4, p. 179-189, 1942.
EMIM, J.A.D.S.; OLIVEIRA, A.B.; LAPA, A.J. Pharmacological evaluation of the
antiinflamatory activity of citrus bioflavonoid, hesperidin and the isoflavonoids,
duartin and claussequinone, in rats and mice. Journal of Pharmacy and
Pharmacology, v.46, p. 118-122, 1994.
110
FAUCONNEAU, B.; WAFFO TEGUO, P.; HUGUET, F.; BARRIER, L.; DECENDIT,
A.; MERILLON, J.M. Comparative study of radical scavenger and antioxidant
properties of phenolic compounds from Vitis vinifera cell cultures using in vitro
tests. Life Science, v.61, p. 2103-2110, 1997.
FEIDEN, K. (ed.). Arzneimittelprufrichtlinien.
Verlagsgesellshaft, 1994.
Stuttgart:
Wissenschaftl.
FOOD AND DRUG ADMINISTRATION.

Center for Drug Evaluation and
Research. Review Guidance: Validation of Chromatographic Methods. Rockville:
1994.
FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. Guidance for Industry: Bioanalytical
Method Validation, Rockville: 2001.
FORETTE, F.; ANAND, R.; GHARABAWI, G. A phase II study in patients with
Alzheimers disease to assess the preliminary efficacy and maximum tolerated
dose of rivastigmine. European Journal of Neurology, v. 6, p. 423-429, 1999.
FORTUNATO, R. H. Revision del genero Bauhinia (Cerdideae, Calsalpinioidea,
Fabacea para la Argentina). Darwiniana, v. 27, n. 1-4, p. 527-557, 1986.
FRAGA, C.A.M.; BARREIRO, E.J.; VIEGAS, C.; BOLZANI, V.S.; FURLAN, M.
Produtos naturais como candidatos a frmacos teis no tratamento do Mal de
Alzheimer. Qumica Nova, v.27, n. 4, p. 655-660, 2004.
FULTON, B.; BENFIELD, P. Galanthamine. Drugs Aging, v. 9, p. 60-65, 1996.
GARCIA-LEME, J. Regulatory mechanisms in inflammation: new aspects of
autopharmacology. General Pharmacology, v. 12, p. 15, 1981.
GARG, A.; GARG, S.; ZANEVELD, L.J.D.; SINGLA, A.K. Chemistry and
pharmacology of the citrus bioflavonoid hesperidin. Phytotherapy Research, v.
15, p. 655-699, 2001.
GOLDIM, J. R. Pesquisa em Sade e Direito dos Animais. Porto Alegre: HCPA,
1995. 28 p.
GONZALEZ-MUJICA, F.; MOTTA, N.; MRQUEZ, A.H.; CAPOTE-ZULUETA, J.
Effects of Bauhinia megalandra aqueous leaf extract on intestinal glucose
111
absortion and uptake by enterocyte brush border membrane vesicles. Fitoterapia,

n. 74, p. 84-90, 2002.
GORDON, M.H. Dietary antioxidants in disease prevention. Natural Products
Report, v.13, p. 265-273, 1996.
GRUNDMAN, M.; DELANEY, P. Antioxidant strategies for Alzheimers disease.
Proceedings of the Nutrition Society, v. 61, p. 191 202, 2002.
HAEYOUNG, L.; KIM, M.K.; LIM. Y.; CHO, Y.; LEE,C. Inhibition of cell-cycle
progression in HeLa cells by HY52, a novel cyclin-dependet kinase inhibitor
isolated from Bauhinia forficate. Cancer Letters, v. 20, p. 1-9, 2005.
HANDA, S.S.; CHAWLA, A.L.; SHARMA, A.K. Plants with anti-inflammatory
activity. Fitoterapia, v. 63, p. 3-31, 1992.
HARBONE, J.B.; WILLIAMS, C.A. Advantages in flavonoid research since 1992.
Phytochemistry, v. 55, p. 481-504, 2000.
HEIGL, D.; FRANZ, G. Stability testing on typical flavonoid containing herbal
drugs. Die Pharmazie, v. 12, p. 881-885, 2003.
HENDRY, G.A.; CRAWFORD, R.M.M. Proceedings of the Royal Society of
Edinburgh, n.102B, p.1, 1994.
HONG, D. D.; SHAH, M. Development and Validation of HPLC Stability-Indicating
Assays. In: CARSTENSEN, J. T.; RHODES, C. T. (Ed). Drug Stability: principles
and practices. 3rd ed. New York: Marcel Dekker, 2000. 773p.
INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONIZATION. Text on Validation of
Analytical Procedures. Switzerland: ICH, 1993.
INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONIZATION.
Analytical Procedures: Methodology. London: ICH, 1996.
Validation of
ISHIGE, K.; SCHUBERT, D.; SAGARA, Y. Flavonoids protect neuronal cells from
oxidative stress by three distinct mechanisms. Free Radical Biology e Medicine,
v. 30, p. 433 446, 2001.
112
JUDD, W. S., CAMPBELL, C. S., KELLOGG, E. A., STEVENS, P. F. Plant

Systematics: a phylogenetic approach. Massachusetts: Sinaver Associates,
1999.
JULIANI, C. The hypoglicemic action of unha-de-vaca. Review of Medicine,
Pharmacy, Chemistry and Physics, v. 2, n. 1, p. 165-169, 1931.
KOROUNAKIS, A.P.; REKKA, E.A.; KOROUNAKIS, P.N. Antioxidant activity of
guaiazulene and protection against paracetamol hepatotoxicity in rats. Journal of
Pharmacy and Pharmacology , v. 49, p. 938-942, 1997.
LACHMAN, L.; DELUCA, P.; AKERS, M. J. Testes de Estabilidade e
Fundamentos de Cintica Qumica. In: LACHMAN, L..; LIEBERMAN, H. A.;
KANIG, J. L.. Teoria e Prtica na Indstria Farmacutica. Lisboa: Fundao
Calouste Gulbenkian, 2001. v. 2, cap. 256.
LEMUS, I.; GARCIA, R.; DELVILLAR, E.; KNOP, G. Hypoglycaemic Activity of
Four Plants Used in Chilean Popular Medicine. Phytotherapy Research, v. 13, p.
91-94, 1999.
LORENZI, H. Plantas daninhas do Brasil. Nova Odessa: Plantarum, 1982.
LORENZI, H. rvores do Brasil. Nova Odessa: Plantarum, 1992. v. 1.
LOWEN, D.; HABS, M.; KLIMM, H.D.; TRUNZLER, G. Phytopharmakareport. 2
ed. Darmstadt: Steinkopff-Verlag, 1999. p. 1.
MARCH, R.; MIAO, X. A fragmentation study of kaempferol using electrospray
quadropole time-of-flight mass spectrometry at high mass resolution.
International Journal of Mass Spectrometry, n. 23, p. 157-167, 2004.
MARCH, R.; MIAO, X.; METCALFE, D. A fragmentation study of a flavone triglycoside,
kaempferol-3-O-robinoside-7-O-rhamnoside. Rapid Communications in Mass
Spectrometry, v. 18, n. 9, p. 931-934, 2004.
MARFAK, A.; TROUILLAS, P.; ALLAIS, D.; CHAMPAVIER, Y.; CALLISTE, C.;
DUROUX, J. Radiolysis of kaempferol in water/methanol mixtures and evaluation
of antioxidant activity of kaempferol and products formed. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, v. 51, p. 1270-1277, 2003.
113
MARSTON, A.; KISSLING, J.; HOSTETTMANN, K. A Rapid TLC Bioautographic

Method for the Detection of Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase
Inhibitors in Plants. Phytochemical Analysis, v. 23, p. 51 54, 2002.
MARTINS, M.T.; SANCHEZ P.S.; SATO M.I.Z.; COELHO, M.C.L. Genotoxicity
Assessment Through the Ames Test of Medicinal Plants commonly Used in Brazil.
Enviromental Toxicology and Water Quality: an international journal, v. 9, p.8793, 1994.
MASCOLO, N.; PINTO, A.; CAPASSO, F. Flavonoids, leucocyte migration and
eicosanoids. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 40, p. 293295, 1988.
MENEZES, P.R.; SCHWARZ, E.A.; SANTOS, C.A.M. In vitro antioxidant activity of
species collected in Paran. Fitoterapia, v. 75, p. 398-400, 2004.
MENSOR, L. MENEZES, F. LEITO, G. REIS, A. SANTOS, T. COUBE, C.
LEITO, S. Screning of Brazilian Plant Extracts for Antioxidant Activity by Use of
DPPH Free Radical Method, Phytotherapy Research, v. 15, p. 127-130, 2001.
MEYRE-SILVA, C.; YUNES, R.; MONACHE, F.; SANTOS, A.; SCHMELING, L.;
GADOTTI, V.; LIZ, F.; CECHINEL, V. Phytochemical and Pharmacological
Anlisis of Bauhinia microstachya (Raddi) Macbr. (Leguminosae). Zeitschritf fur
Naturforschung, v. 56, p. 939 942, 2001.
MIYAKE, E.T.; AKISUE, G.; AKISUE, M.K. Pharmacognostic characterization of
pata-de-vaca Bauhinia forficata. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.1,
p.58-68, 1986.
MONTSERRAT, D.; ESTRELLA, I.; HERNNDEZ, T.; Occurence of phenolic
compounds in the seed coat and the cotyledon of peas (Pisum sativum L.).
European Food Research and Technology, n. 219, p. 116-123, 2004.
MORONEY, M-A.; ALCARAZ, M. J.; FORDER, R.A.; CAREY, F.; HOULT, J.R.S.
Selectivity of neutrophil 5-lipoxygenase and cyclo-oxigenase inhibition by na antiinflammatory flavonoid glycoside and related aglycone flavonoids. Journal of
Pharmacy and Pharmacology, v. 40, p. 787-792, 1988.
NANJO, F.; GOTO, K.; SETO, R.; SUZUKI, M.; SAKAI, M.; HARA, Y. Scavenging
effects of tea catechins and their derivatives on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
radical. Free Radical Biology Medicine, v.21, p. 895-902, 1996.
114
NETO, J.C.; FERREIRA, A.C.F.; KUSTER R.M.; AMORIN, M.B.; CARVALHO,

D.P. Inibio da Peroxidase Tireidea pelo Extrato de Pata-de-vaca e de
Pedra Hume Ka. Rio de Janeiro: Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho e
Ncleo de Pesquisa de Produtos Naturais, UFRJ, 2003. Disponvel em:
<http://tiroides2000.org/p121.htm> Acesso em 27 jul. 2003.
NUDELMAN, N. S. Estabilidad de Medicamentos. Buenos Aires: El Ateneo,
1976. 187 p.
OLIVEIRA, C.; MAIORANO, V.; MARCUSSI, S.; SANTANA, C.; JANURIO, A.;
LOURENO, M.; SAMPAIO, S.; FRANA, S.; PEREIRA, P.; SOARES, A.
Anticoagulant and antifibrinogenolytic properties of aqueous extract from Bauhinia
forficata against snake venoms. Journal of Ethnopharmacology, v. 98, p. 213216, 2005.
OLIVEIRA, F.; KATO, E. T. M.; RODRIGUES; R. F.; BASSO, S. L. Mitos e
Verdades sobre Pata-de-vaca Bauhinia forficata LINK Uma Reviso. Revista
Lecta, v. 19 p. 07-20, 2001.
PANDA, S.; KAR, A. Withania somnifera and Bauhinia purpurea in the regulation
of circulating thyroid hormone concentrations in female mice. Journal of
Ethnopharmacology, v. 67, p. 233-239, 1999.
PAVEI, C. Desenvolvimento de mtodos analticos e tecnolgicos aplicados
frao saponosdica presente nos frutos de Ilex paraguariensis A. St. Hil.
Porto Alegre: Curso de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas da Faculdade
de Farmcia da UFRGS, 2004. Dissertao de Mestrado.
PELZER, L.E.; GUARDIA, T.; JUAREZ, A.O.; GUERREIRO, E. Acute and chronic
antiinflammatory effects of plant flavonoids. Il Farmaco, v. 53, p. 421-424, 1998.
PEPATO, M.T.; KELLER, E.H.; BAVIERA, A.M.; KETTELHUT I.C.; VENDRAMINI,
R.C.; BRUNETTI, I.L. Anti-diabetic activity of Bauhinia forficata decoction in
streptozotozin-diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology, v. 81, p.191-197,
2002.
PETRY, R.D. Desenvolvimento e validao de mtodos de doseamento de
flavonides de Passiflora edulis Sims. (maracuj). Universidade Federal do
Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 1999. Dissertao de Mestrado.
115
PIO CORREA, M. Dicionrio das plantas teis do Brasil e das plantas

exticas cultivadas. Rio de Janeiro: Imprensa Nacional IBDF, 1984. v.5.
PIZZOLATTI, M.G.; CUNHA, A.J.; SZPOGANICZ, B.; SOUSA, E. Flavonides
glicosilados das folhas e flores de Bauhinia forficata (LEGUMINOSAE). Qumica
Nova, v.26, n. 4, p. 466-469, 2003.
RAJKAPOOR, B.; JAYAKAR, B.; MURUGESH, N.Antitumor activity of Bauhinia
variegate on Daltons ascitic lymphoma. Journal of Ethnopharmacology, n. 89,
p. 107-109, 2003.
RAPTA, P.; MISIK, V.; VRBEL, I. Redox intermediates of flavonoids and caffeic
acid esters from propolis: an EPR spectroscopy and cyclic voltammetry study.
Free Radical Biology Medicine, v. 18, p.901-908, 1995.
RATTY, A.K.; SUNAMOTO, J.; DAS, N.P. Interaction of flavonols with 1,1
diphenyl picrylhydrazyl free radical, liposomal membranes and soybean
lipoxygenase-1. Biochemical Pharmacology, v. 37, p. 989 995, 1988.
RECIO, C.; GINER, R.M.; MANEZ, S.; TALENS, A.; RIOS, J.L. Antiinflammatory
activity of flavonol glycosides from Erytrospermum montocolum depending on
single or repeated local TPA administration. Planta Medica, v.61, n.6, p. 502-504,
1995.
REIS, M.S.; MARIOT, A. Diversidade e Domesticao de Plantas Medicinais. In:
SIMES, et al (org.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5 ed. Porto
Alegre/Florianpolis: Editora da Universidade UFRGS/Ed. da UFSC, 2003. cap. 3,
p. 45 -74.
RUSSO, E.M.K.; REICHELT, A.A.J.; DE-S, J.R.; FURLANETTO, R.P.; MOISS,
R.C.S.; KASAMATSU, T.S.; CHACRA, A.R. Clinical trial of Myrcia uniflora and
Bauhinia forficata leaf extracts in normal and diabetic patients. Brazilian Journal
of Medicine and Biology Research, v.23, p.11-20, 1990.
SALATINO, A.; BLATT, C.T.T.; DOS SANTOS, D.Y.A.C.; VAZ, A.M.S.F. Foliar
flavonoids of nine species of Bauhinia. Revista Brasileira de Botnica, So
Paulo, v. 22, n. 1, p.17-20, 1999.
116
SERTI, J.A.A.; BASILE, A.C.; PANIZZA,S.; MATIDA, A.K.; ZELNIK, R. Antiinflammatory activity ans sub-acute toxicity of artemetin. Planta Medica, v.56, p.
36-40, 1990.
SHAPOVAL, E.S.S. Influncias neuro-endcrinas no desenvolvimento de
reaes inflamatrias agudas no rato. Faculdade de Ribeiro Preto,
Universidade de So Paulo / USP, 1974. Tese de Doutorado.
SHARP, J. Quality in the manufacture of medicines and other halth products.
London: Pharmaceutical Press, 2000. cap. 17, p.309-321.
SILVA, F. R.; SZPOGANICZ B.; PIZZOLATTI, M.G.; WILLRICH, M.A.V.; DE
SOUZA, E. Acute effect of Bauhinia forficata on serum glucose levels in normal
and alloxan-induced diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology, v.83, p.3337, 2002.
SILVA, K.; BIAVATTI, M.W.; LEITE, S.N.; YUNES, R.A.; MONACHE, F.D.;
CECHINEL, V. Phytochemical and Pharmacognostic investigation of Bauhinia
forficata Link (Leguminosae). Zeitschrift fur Naturforschung, v. 55c, p. 478-480,
2000.
SILVA, K.; CECHINEL, V., Plantas do gnero Bauhinia: composio qumica e
potencial farmacolgico. Qumica Nova, v. 25, n. 3, p. 449-454, 2002.
SONAGLIO, D.; ORTEGA, G.; PETROVICK, P.; BASSANI, V. Desenvolvimento
tecnolgico e produo de fitoterpicos In: SIMES, et al (org.). Farmacognosia:
da planta ao medicamento. 5 ed. Porto Alegre/Florianpolis: Editora da
Universidade UFRGS/Ed. da UFSC, 2003. 1102 p.
SOSA, S.; BRACA, A.; ALTINIER, G.; DELLA LOGGIA, R.; MORELLI, I.;
TUBARO, A.; Topical anti-inflammatory activity of Bauhinia tarapotensis leaves.
Phytomedicine, v. 9, p. 646-653, 2002.
SOUSA, E.; ZANATTA, L.; SEIFRIZ, I.; PASA, T.B.; PIZZOLATTI, M.G.;
SZPOGANICZ, B.; SILVA, F.R. Hypoglycemic Effect and Antioxidant Potential of
Kaempferol 3,7- O dirhamnoside from Bauhinia forficata Leaves Journal
of Natural Products, v. 67, p. 829-832, 2004.
SREEJANYAN, N.; RAO, M.N. Free radical scavenging activity of curcuminoids.
Arzneimittelforschung, v. 46, p. 169-171, 1996.
117
SUYENAGA, E.S. Avaliao da atividade antiinflamatria de flavonides por

ensaios in vivo e in vitro. Porto Alegre: Programa de Ps-Graduao em
Cincias Farmacuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul / UFRGS,
2002. p. 79-81. Tese (Doutorado).
SWARTZ, M.E.; KRULL, I.S. Analytical Method Development and Validation.
New York: Marcel Dekker, 1997.
TAKAO, T.; KITATANI, F.; WATANABE, N.; YAGI, A.; SAKATA, K. A simple
screening method for antioxidants and isolation of several antioxidants produced
by marine bacteria from fish and shellfish. Bioscience Biotechnology
Biochemistry, v. 58, p. 1780-1783, 1994.
TOUVAY, C.; VILAIN, B.; ETIENNE, A.; SIROIS, P.; BORGEAT, P.; BRAQUET, P.
Characterization of platelet activating factor (PAF)-acether-induced contractions of
guinea pig lung strips by selected inhibitors of arachidonic acid metabolism and by
PAF-acether antagonists. Immunopharmacology, v. 12, p. 97-104, 1986.
TREVISAN, M.; MACEDO, F. Seleo de plantas com atividade
anticolinestersica para tratamento da Doena de Alzheimer. Qumica Nova, v.
26, p. 301 304, 2003.
TSENG, T.H.; KAO, E.S.; CHU, C.Y.; CHOU, F.P.; LIN WU, H.W.; WANG, C.J.
Protective effects of dried flower extracts of Hibiscus sabdariffa L. against
oxidative stress in rat primary hepatocytes. Food Chemistry Toxicology, v.35,
p.1159-1164, 1997.
USP. The United States Pharmacopeia. NF 23. 28 ed. Rockville: United States
Pharmacopeial Convention, 2005. 3187p.
VIANA, E.P.; SANTA-ROSA, R.S.; ALMEIDA, S.S.M.S.; SANTOS, L.S.
Constituents of the stem bark of Bauhinia guianensis. Fitoterapia, v. 70, p.111112, 1998.
WILHELM FILHO, D.; SILVA, E. L.; BOVERIS, A. Flavonides Antioxidantes de
plantas Medicinais e Alimentos: Importncia e perspectivas teraputicas. In:
YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Plantas Medicinais: sob a tica da Qumica
Medicinal Moderna. Chapec: Argos, 2001. 500 p.
118
WINTER, C.A.; RISLEY, E.A.; NUSS, G.W. Carragenin-induced oedema in hind

paw of the rat as an assay for anti-inflamatory drugs. Proceedings of the Society
for Experimental Biology and Medicine; v. 111, p. 244-247, 1962.
WHO. Stability testing of pharmaceutical products containing well established drug
substances in conventional dosage forms. World Health Organization: Tecnical
Report Series. n. 863, annex 5, 1996. Disponvel em: <www.who.gov> Acesso em
21/07/2004.
YADAVA, R.N.; REDDY, V.M.S. Anti-inflammatory activity of a novel flavonol
glycoside from the Bauhinia variegata Linn. Natural Product Research, v. 17, n.
3, p. 165-169, 2003.
YOKOZAWA, T.; DONG, E.; WU LIU, Z.; SHIMIDZU, M. Antioxidant activity of
flavones and flavonols in vitro. Phytotherapy Research, v.11, p.446-449, 1997.
ZUANAZZI, J. A. e MONTANHA, J. A. Flavonides. In: SIMES, et al (org.).
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5 ed. Porto Alegre/Florianpolis:
Editora da Universidade UFRGS/Ed. da UFSC, 2003. 1102 p.
119
13 ANEXOS
ANEXO 1: Espectro de massas de SQM, eletrospray negativo.
Os experimentos de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) foram

realizados nos laboratrios listados abaixo, com suas respectivas informaes
complementares:
1. Instituto de Qumica da Universidade de Santa Maria, sob a
responsabilidade do Professor Ademir Morel
Equipamento: BRUKER (1H - 400 MHz e 13C 100 MHz)
Solventes: CD3OD e DMSO-d6
2. Departament de Productes Naturals, Biologia Vegetal i Edafologia,

na Faculdade de Farmcia da Universidade de Barcelona, sob a
responsabilidade do Professor Jaume Bastida
Equipamento: VARIAN (1H - 200 MHz e 13C 50 MHz)
Solventes: CD3OD e DMSO-d6
Condies Gerais:
Temperatura ambiente;
Solventes deuterados;
Tetra-metil-silano (TMS), como referncia.
ANEXO 2: Informaes complementares sobre o RMN.
ANEXO 3: Resoluo do Comit de tica e Pesquisa da UFRGS.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

DETERMINAO QUMICA E BIOLGICA DE BAUHINIA FORFICATA LINK

ANA LCIA VARGAS ARIGONY

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

DETERMINAO QUMICA E BIOLGICA DE BAUHINIA FORFICATA LINK

Dissertao apresentada por Ana Lcia

Orientador: Prof. Dr. Jos ngelo da Silveira Zuanazzi

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias

Arigony, Ana Lcia Vargas

Os procedimentos experimentais deste trabalho foram realizados nos

Que as palavras que tu vais dizer

Aos meus pais,

A famlia Cestari e ao pessoal da Medicor Produtos Hospitalares e Riopasa

2.1 Aspectos Botnicos..................................................................................

2.2 Aspectos Qumicos..................................................................................

2.3 Aspectos Farmacolgicos........................................................................

2.3.1 Atividade Antioxidante...........................................................................

2.3.2 Atividade Antiinflamatria......................................................................

2.3.3 Atividade Hipoglicemiante.....................................................................

2.3.4 Outras Atividades..................................................................................

3 DETERMINAO DE MTODO ANALTICO E ANLISE DO PERFIL

3.2 Objetivos especficos...............................................................................

3.3 Materiais e Mtodos.................................................................................

3.3.1 Material vegetal.....................................................................................

3.3.2 Preparao dos extratos.......................................................................

3.3.3 Hidrlise cida.......................................................................................

3.3.4 Anlise cromatogrfica..........................................................................

3.3.5 Condies cromatogrficas...................................................................

3.3.6 Otimizao da tcnica...........................................................................

3.3.6.1 Avaliao da influncia da proporo droga:solvente.....................

3.3.6.2 Avaliao do solvente empregado.....................................................

3.3.6.3 Avaliao dos mtodos de extrao................................................... 29

4 ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA QUMICA

4.2 Objetivos especficos................................................................................ 40

4.3.1 Preparao do extrato...........................................................................

4.4 Resultados e Discusso...........................................................................

5 VALIDAO DE MTODO POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA

5.3.1 Preparao dos extratos.......................................................................

5.3.2 Anlise cromatogrfica..........................................................................

5.3.3 Condies cromatogrficas...................................................................

5.4.1.1 Preparao da curva padro da substncia qumica majoritria

5.4.3 Preciso Intermediria..........................................................................

5.4.6 Limites de deteco e quantificao.....................................................

5.5 Resultados e Discusso...........................................................................

6 DETERMINAO DA ESTABILIDADE QUMICA....................................... 61

6.2 Objetivos especficos...............................................................................

6.3 Materiais e Mtodo...................................................................................

6.3.1 Estudo de estabilidade acelerada.........................................................

6.3.3 Clculos da velocidade de degradao (k), dos tempos de vida til

7 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE..................................

7.2 Objetivos especficos...............................................................................

7.3 Materiais e Mtodo...................................................................................

7.4 Resultados e Discusso...........................................................................

8 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIEDEMATOGNICA IN VIVO......

8.2 Objetivo especfico...................................................................................

8.3 Materiais e Mtodos.................................................................................

8.3.1 Material biolgico..................................................................................

8.3.2 Preparao do extrato...........................................................................

8.3.3 Edema em pata de rato.........................................................................

8.3.4 Mtodo de morte...................................................................................

8.3.5 Mtodo de descarte do material biolgico.............................................

8.4 Resultados e Discusso...........................................................................

9 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERSICA..................