1.

Fotosinteza in vivo
Uvod:
Proces fotosinteze moe se pratiti in vivo, u celoj intaktnoj biljci. Postoje razliite
nedestruktivne metode za praenje intenziteta fotosinteze. Kada se radi sa intaktnom biljkom
mora se imati u vidu da se paralelno odvijaju dva suprotna procesa fotosinteza (asimilacija
CO2 koju prati sinteza organske materije i oslobaanje kiseonika) i respiracija (koju prati
potronja kiseonika i oslobaanje CO2), kao I fotorespiracija. Tokom fotosinteze se takoe
javlja i fotorespiracija.
Fotosinteza se moe direktno pratiti merenjem koncentracije kiseonika i ugljen
dioksida. Za praenje promene CO2 koristi se IRGA (Infra Red Gas Analyzer , infracrveni
gasni analizator) koji meri koncentraciju CO2 na osnovu njegove apsorbance u infracrvenom
delu elektromagnetnog spektra. Moe se pratiti i oslobaanje kiseonika - ili bojenom
reakcijom (kvalitativno) ili merenjem parcijalnog pritiska kiseonika (polarografski, slino kao za
kiseoninu elektrodu za tene uzorke).
Jo jedan nain za merenje intenziteta fotosinteze je praenje fluorescencije hlorofila.
Naime, in vivo oko 3% svetlosne energije koja dospe do reakcionog centra biva emitovano u
vidu fluorescencije. Na osnovu talasne duine emitovane svetlosti moe se proceniti od kog
fotosistema (reakcionog centra) potie fluorescencija. Razliiti procesi utiu na fluorescenciju,
pa se uporednom analizom razliitih parametara fluorescencije hlorofila, apsorpcije i rasipanja
svetlosti u intaktnoj biljci, usvajanja CO2 i oslobaanja O2mogu razluiti specifine promene
koje su vezane za fotosintezu od nespecifinih.
Demonstracija oslobaanja kioseonika u celoj biljci moe se pratiti tako to se biljka
dri cela potopljena u rastvor koji sadri neki indikator prisustva kiseonika. Organske boje
(kao to su indigo-karmin, metilen-plavo i druge) su molekuli sposobni da se reverzibilno
redukuju i oksiduju (reverzibilni oksido-redukcioni sistemi) i u dva oksidaciona stanja imaju
razliite spektralne karakteristike. Tako je indigo-karmin u redukovanom obliku bezbojan, a u
oksidovanom je plave boje. Kada se intaktna biljka dri u hermetiki zatvorenoj posudi sa
rastvorom redukovanog indigo-karmina, na mestima gde se oslobaa kiseonik doi e do
spontane oksidacije i pojave plave boje u rastvoru.
Kako je oslobaanje kiseonika posledica aktivnosti kompleksa koji oslobaa kiseonik
koji je vezan za fotosistem II, inhibicija transporta elektrona e dovesti i do prestanka
oslobaanja kiseonika. Tako herbicid DCMU (dihlorfenil dimetilurea) prekida transport
elektrona tako to se vezuje za plastohinon-vezujue mesto na fotosistemu II. Na taj nain je

spreen prenos elektrona sa fotosistema II, to zaustavlja i prenos elektrona sa vode na P680
pa time i osobaanje kiesonika.
Cilj vebe:
Odrediti na kojim delovima biljke i u kojim uslovima dolazi do oslobaanja kiseonika.
Materijal i pribor:
o Menzura
o Erlenmajer od 250 ml
o Tri erlenmajera od 100 ml sa irokim grlom
o Gumeni zatvarai za erlenmajere, celofan I aluminijumska folija
o 1% rastvor indigo-karmina
o 10% rastvor Na2S2O4 (ditionita)(mora biti sve jer je supstanca nestabilna)
o Rastvor DCMU (1mM)
o Mlade biljke (najbolje stabljike graka stare 7-10 dana)
Nain rada:
U erlenmajeru od 250 ml napraviti 150 ml 0.01% rastvora indigo-karmina. Rastvor
redukovati postepenim dodavanjem rastvora ditionita, kap po kap, uz blago meanje nakon
svake dodate kapi, do obezbojenja rastvora. Vano je da se ditionit ne doda u viku jer bi
viak onemoguio oksidaciju boje u prisustvu kiseonika. Zatim 1-2 mlade biljke uneti u
erlenmajer od 100 ml, erlenmajer napuniti rastvorom boje do samog vrha, zatvoriti gumenim
zatvaraem tako da u erlenmajeru ne ostane ni mehur vazduha, i zamotati parafilmom,
celofanom ili samolepljivom trakom, tako da vazduh ne moe da ulazi u erlenmajer. Na isti
nain pripremiti tri erlenmajera; jedan umotati u aluminijumsku foliju (tako da biljka u njemu
bude u potpunom mraku), drugi ostaviti na svetlosti, a u trei u rastvor indigo-karmina dodati 1
ml DCMU, a zatim zatvoriti kao i druga dva i ostaviti na svetlosti.
Nakon 10-30 min pogledati erlenmajere i utvrditi u kom erlenmajeru je dolo do oksidacije
boje, i na kojim mestima se to desilo (ne mukati erlenmajere da bi videli na kojim delovima
biljke je dolo do pojave plave boje) .