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Seleccin y cuidado de

columnas de HPLC

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L.Q. Irma Carolina Bedolla


Amndola

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Parmetros de seleccin de columna


Tamao de poro
Tamao de partcula
Longitud
Dimetro interno
Fase estacionaria

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Seleccin del Tamao de Poro


Tamao de las molculas que sern analizadas.
Las molculas pequeas (PM menor a 2000) pueden
distribuirse fcilmente en poros de 80-120
Las molculas mas grandes (PM mayores a 2000)por ej.
protenas y pptidos, requieren un tamao de poro mayor 300

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Por qu elegir columnas de 300?


(A,B) Entran al poro
A

C
(C) Ser excluda

Las molculas deben entrar al poro para interactuar con la fase.


La molculas deben entrar y salir del poro libremente para maximizar la
eficiencia.
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Mejor forma de pico para molculas grandes


en disolucin
Columnas: 4.6 x 150 mm, 5 m Fase Mvil : 60% MeOH: 40% Agua 0.1% TFA
Flujo: 0.75 mL/min
Temperatura:Ambiente
Deteccin: UV 282 nm
Muestra: Tylosin (MW 916)
O
CH3

SB-C3 (80)
H3C
O

HO

O
OCH3

OCH3

CH2

HC
HO 3
N
O
O

H3C
O

CH2

OH

300SB-C3 (300)

CHO
CH2
CH3
O
CH3

HO
O

CH3

CH3

CH3
OH

CH3

Pw1/2 = 0.442

Pw1/2 =0.125

5
Time (min)

10

5
Time (min)

10

El tamao de la molcula en disolucin determina el tamao de poro de la


columna.
Un pico estrecho indica acceso libre a los poros.
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Tamao de partcula
Para anlisis convencionales de molculas grandes y
pequeas, el tamao de partcula ms usado es de 5 micras.
Mientras ms pequeo sea el tamao de partcula, mayor es
la eficiencia y la resolucin
Tamaos de partcula disponibles (en micras)
10
5
3.5
3
1.8

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Seleccin de longitud de la columna


El tiempo de anlisis es proporcional a la longitud de la
columna
Columnas de 250mm tienen tiempos de corrida ms largos
Preferir columnas cortas de tamao de partcula pequeo para
disminuir el tiempo de anlisis

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Para disminuir el tiempo de anlisis

disminucin proporcional en el
tiempo de anlisis (tiemp~long, L)

Disminuir la longitud de columna


disminucin proporcional en el
uso de disolventes (~L)

disminucin de N, platos~ L y as N

+
Disminucin en el tamao de part. =

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mantiene la resolucin, R

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Seleccin del dimetro interno


El dimetro interno define cunto del analito se puede inyectar
en la columna.
Las columnas de i.d. pequeo, incrementan la sensibilidad, por
lo que son muy usadas en tcnicas como LC/MSD
Mientras menor sea el i.d., requiere de menor cantidad de
disolvente

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Seleccin de la fase

Analitos de inters
pH

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Qu fase debo usar?*


C18 ofrece la mayor retencin, puede ser ms de lo deseado para
algunas muestras; recomendada para analitos moderadamente polares
C8 tiene menor retencin que C18, pero su selectividad es parecida en la
mayora de los casos; recomendada para analitos polares,
moderadamente polares y no polares
Fenil tiene una retencin significativamente menor para compuestos no
polares , pero retiene los compuestos polares, por lo que reduce el
tiempo de anlisis para mezclas de compuestos polares y no polares
CN es la de menor retencin, muestra cambios en la selectividad, buena
para reducir los tiempos de anlisis de los compuestos que tardan en
eluir lo cual evita el uso de gradientes. Buena para separaciones de
compuestos polares y moderadamente polares.
* Ms de 20% orgnico

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Qu fase debo usar?*

Fases mviles con alto contenido de agua


C18 pocas veces ofrece ventajas en la retencin y la selectividad puede
no ser la ptima con tan baja retencin
C8 generalmente la retencin es un poco mayor que en la C18 con
similar selectividad
Fenil es la de mayor retencin con cambios en la selectividad
C3 es similar a la Fenil en cuanto a retencin, pero hay cambios en la
selectividad de C18, C8 y Fenil
CN es la de menor retencin, cambios en la selectividad, buena
resolucin

* Menos de 20% Orgnico


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pH Un parmetro importante en el
desarrollo de mtodos
La retencin de los compuestos ionizables es
fuertemente influenciada por el pH
Los compuestos ionizables (cidos y bases) pueden
ser analitos o compuestos de matriz
Un control preciso del pH mejora la reproducibilidad
del mtodo
El intervalo de pH de 1 12 provee la mxima
flexibilidad para el desarrollo de mtodos

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Cambios en la retencin por el pH para


compuestos ionizables depende del compuesto
12

retention time (min)

10

Acetylsalicylic acid pKa 3.5

Pyridine

pka 5.2

Codeine

pKa 8.0

Procainamide

pKa 9.2

Amphetamine

pKa 9.9

Caffeine

pKa 14

4
Mobile Phase:
45% MeOH:
55% 20 mM Phosphate Buffer

0
pH 2.5

pH 6.5

pH 8

pH 11.5

pH

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Comportamiento de un analito bsico en


funcin del pH

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pH bajo
Los cidos estn protonados para mxima retencin
Los grupos silanol estn protonados por lo que las
interacciones de intercambio inico con compuestos
bsicos son mnimas
Reproducibilidad de largo plazo
Excelente para la eleccin de fases mviles

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ZORBAX StableBond Bonding


Superior estabilidad a pH bajos de
hasta 1 (1-6)
No recubiertas non-endcapped
para la selectividad y duracin
Proteccin estrica enlazada
patentada

R
O

Si
R

OH
R
O

Si
R

OH

Diisopropil para C8, C3, CN y fenil,


diisobutil para C18
Ideal para las muestras que
requieren bajos pH

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R
O

Si
R

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pH medio
Los compuestos de inters son inestables a bajos
pH
Se mejora la solubilidad de los analitos a pH
medios
Incrementar la retencin de los compuestos
bsicos
Puede existir una mejor selectividad en el
intervalo de pH de 3 a 8

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ZORBAX Eclipse Plus

ZORBAX Eclipse Plus :


Usa slica ZORBAX mejorada
con tratamientos propios
patentados para mejor forma de
pico
Usa agentes ligantes y precesos
mejorados para mejorar la forma
del pico
Cuenta con especificaciones
ms estrechas para lograr una
reproducibilidad superior lote a
lote y un desempeo mucho
ms confiable

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CH3
O

ase
b
ca da
i
l

S jora
me

Si
CH3
CH3

Si

CH 3

CH 3
CH3
O

Doble
endcaped
mejorado

Si
CH3
CH3

Si

CH3

CH 3
CH3
O

Si
CH3

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Eclipse Plus Proporciona un desempeo superior


a pH intermedio sin modificador (TEA)
Conditions: Columns: As listed Mobile Phase.: 20% MeOH, 80% 20 mM phosphate pH 7.0 Flow Rate =1 mL/min.
Detection: UV 254 semi micro flow cell

Eclipse Plus C18 4.6 x 75 mm 3.5 m

1.
2.
3.

Famotidine
Cimetidine
Pirenzipine

N=7800
TF: 1.05

N=7800
TF: 1.00
8

10

12

14

16

18

min

18

min

Eclipse XDB-C18 4.6 x 75 mm 3.5 m


N=5700
TF: 1.12
0

10

N=4300
TF: 1.74
12

14

16

Alta eficiencia con partculas de 3.5um que se obtiene fcilmente con Eclipse Plus
No se requiere modificador para lograr este perfecto desempeo

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pH alto
Los compuestos de inters pueden no ser solubles a pH
bajos
Los compuestos de inters pueden no ser estables a pH
bajos
Obtener un incremento en la retencin de compuestos
bsicos analizndolos en su forma no cargada
Mejorar la selectividad

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Columnas Extend-C18 para pH altos


Diseo bidentado patentado C18-C18 enlazado para
una mayor estabilidad hasta pH 11.5
Mejor eficiencia que las columnas polimricas
Excelent forma de pico con doble recubrimiento
endcapping
LC/MS a pH altos (hidrxido de amonio) con alta
eficiencia
C18

Extend-C18
Si
Estructura Bidentada O

C18

Si
O

Soporte de Slice

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Tiempo de vida de columnas Extend-C18 pH altos


180

160
Eclipse XDB-C8
Eclipse XDB-C18
Extend-C18

Cantidad de Slice disuelta, mg

140

Columnas:

4.6 x 150 mm, 5 m

Purga:

50% ACN / 50% 0.02 M


K2HPO4, pH 11

Flujo:

1.5 mL / min

120

100

Temperatura: 25C
80

Deteccin:
Concentracin de silicato
por reaccin colorida del silicomolibdato

60

40

20

0
0

10

12

14

16

Volume of Eluent, Liters

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Compuestos altamente polares


Zorbax SB-Aq para fases mviles con alto contenido
acuoso
Buena retencin de compuestos polares en fases
mviles con alto contenido de agua
Retencin reproducible sin colapso de fase
Selectividad diferente vs. columnas convencionales C18
Gran estabilidad a pH bajos y alta temperatura (hasta
80C)

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Colapso de la fase
C18 extendida en silica

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C18 Colapsada en silica

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Innovaciones de la tecnologa Zorbax


Fases para todos los usos
StableBond
Eclipse XDB
Eclipse Plus
Extend

pH 1-6 hasta 90 C
pH 2-9 hasta 60 C
pH 2-9 hasta 60 C
pH 2-11 hasta 60 C

Fases para aplicaciones especiales


Bonus-RP
SB-Aq
PAH
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Resumen
Las fases C18 y C8 son las mejores para iniciar el desarrollo de
mtodos con muestras tpicas.
Tener en cuenta que el pH juega un papel crtico en la separacin y
puede ser agresivo para la columna; buscar la columna adecuada.
Elegir la fase estacionaria ms adecuada para la muestra e particular.
Usar fases especiales como la SB-Aq para muestras polares, difciles
de retener para disminur los tiempos de desarrollo.
Buscar la columna que nos d resultados con el mnimo de problemas

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Cuidado y solucin de
problemas de columnas
de HPLC

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Componentes de HPLC

Bomba
Inyector/Automuestreador
Columna
Detector
Sistema de
datos/Integrador
Todas estas partes pueden presentar
problemas y requiren diagnosticarlos.

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Tipos de problemas en columna

A. Presin
B. Forma de pico
C. Retencin

5
1

2
6

Time (min)

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Problemas relacionados con la presin


Sntoma

Problema potencial

Presin alta

Frit de la columna tapado


Empaque tapado
Contaminacin de la columna
Columna incorrecta por error
(d.i. menor)

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Causa y solucin para corregir presin alta

Verificar la presin con y sin columna, muchos de esto


problemas pueden ser causados por obstrucciones en el
sistema
Si la presin de la columna es alta:
Lavar la columna Elimina la contaminacin de columna y
desbloquea el empaque
Compuestos de alto peso molecular o
adsorbidos
Precipitados de la muestra o del buffer
Voltear la columna Desbloquea el frit
Cambio de frit
Elimina el frit tapado

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Limpieza de la columna
Purgar la columna con disolventes ms fuertes que la fase
mvil.
Use al menos 26ml de cada disolvente para columnad analticas (4.6
mm)
Opciones de disolventes para columnas de fase reversa
(en orden de incremento de fuerza)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Fase mvil sin las sales del buffer


100% Metanol
100% Acetonitrilo
75% Acetonitrilo:25% Isopropanol
100% Isopropanol
100% Cloruro de metileno*
100% Hexano*
*Despus de usar hexano o cloruro de metileno la columna debe ser purgada con
Isopropanol antes de regresar a la fase reversa.

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Limpieza de la columna
Opciones de disolvente para la fase normal
(En orden de incremento de fuerza)

Use al menos 50 ml de cada disolvente


1. 50% Metanol:50% Cloroformo
2. 100% Acetato de etilo

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Es posible usar pequeas cantidades de cido, para


eliminar compuestos fuertemente retenidos, la
reequilibracin es muy larga.

Es ms fcil comenzar con columnas ciano y diol que con


columnas de slica cuando se va a comenzar a usar LC de
fase normal.

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Prevenir la presin alta

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Proteger la columna
- Pre columnas
- Filtros en lnea

Preparacin de la muestra

Purga apropiada de la columna

Filtrar los buffers

Cambiar frecuentemente los buffers y el agua (cada 12 das


max.)

Usar frascos ambar o forrados con papel aluminio para


minimizar la exposicin a la luz de las fases acuosas.

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Prevenir presin alta:


Accesorios en lnea

Fase mvil a la
bomba

Pre-Columna

Inyector

Guarda
Filtro Columna

Columna
Analtica

Tanto el filtro como el guarda-columna


actuan sobre la muestra, mientras que la
pre-columna lo hace sobre la fase mvil.

Al detector
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Problemas con la Forma de Pico

Picos divididos
Coleo
Ensanchamiento
Baja eficiencia

Muchos problemas de la forma de pico, son una combinacin de


problemas, esto es, ensanchamiento con coleo o coleo con
incremento en el tiempo de retencin

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Picos divididos

Pueden ser causados por:

Contaminacin de la columna
Frit parcialmente obstruido
Volmen muerto en la columna
Efectos del solvente de inyeccin
0.0

Page 38

2.5

5.0
Time (min)

7.5

10.0

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Picos divididos
Columna contaminada
Column: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm
Mobile Phase: 60% 25 mM Na2HPO4, pH 3.0 : 40% MeOH
Flow Rate: 1.0 mL/min
Temperature: 35C Detection: UV 254 nm Sample: Filtered OTC Cold Medication: 1. Pseudoephedrine 2. APAP 3. Unknown 4. Chlorpheniramine

Inyeccin 1

Inyeccin 30

1. Inyeccin despus
de lavar la columna
con 100%ACN
2

4
1
1
4

4
3
3

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Time (min)

10

15

Time (min)

10

15

Time (min)

10

15

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Picos divididos
Efectos del disolvente de inyeccin
Column: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 m
Mobile Phase: 82% H2O : 18% ACN
Injection Volume: 30 L
Sample: 1. Caffeine 2. Salicylamide
1

A. Disolvente de inyeccin
100% Acetonitrilo

H3C

CH3

OH

2
O

B. Disolv. de inyeccin
Fase mvil

NH2

O
O

CH3

10
Time (min)

Page 40

10
Time (min)

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Coleo del pico


Interacciones secundarias
Column: Alkyl-C8, 4.6 x 150 mm, 5m
Mobile Phase: 85% 25 mM Na2HPO4 pH 7.0 : 15% ACN
Flow Rate: 1.0 mL/min
Temperature: 35C
Sample: 1. Phenylpropanolamine 2. Ephedrine 3. Amphetamine 4. Methamphetamine 5. Phenteramine

No TEA
2

USP TF (5%)
1. 1.29
2. 1.91
3. 1.63
4. 2.35
5. 1.57

0.0

10 mM TEA

3
2

3
4
5

2.5

5.0

TIme (min)

0.0

2.5

USP TF (5%)
1. 1.19
2. 1.18
3. 1.20
4. 1.26
5. 1.14

5.0
Time (min)

El coleo se elimina agregando un modificador a la fase mvil


(TEA) en pH 7
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Coleo del pico


Interacciones secundarias
Column: Alkyl-C8, 4.6 x 150 mm, 5m
Mobile Phase: 85% 25 mM Na2HPO4 : 15% ACN
Flow Rate: 1.0 mL/min
Temperature: 35C
Sample: 1. Phenylpropanolamine 2. Ephedrine 3. Amphetamine 4. Methamphetamine 5. Phenteramine

pH 3.0
USP TF (5%)

pH 7.0
USP TF (5%)

1
2

4. 1.33

4. 2.35

4
5
4

0.0

2.5

5.0
Time (min)

0.0

2.5

5.0
Time (min)

Reduciendo el pH de la fase mvil, se reducen las interacciones


con los silanoles que causan el coleo.

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Coleo del pico


Contaminacin en la columna
Column: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5m
Temperature: R.T.
Detection: UV 254 nm

Plates
1.
2.
3.
4

7629
12043
13727
13355

TF
2.08
1.64
1.69
1.32

Plates
1.
2.
3.
4

Mobile Phase: 20% H2O : 80% MeOH


Flow Rate: 1.0 mL/min
Sample: 1. Uracil 2. Phenol 3. 4-Chloronitrobenzene 4. Toluene

7906
12443
17999
17098

TF

Plates

1.43
1.21
1.19
1.25

1.
2.
3.
4

2.5
Time (min)

5.0

QC test direccin normal

Page 43

1.06
1.21
1.11
1.17

4
1

0.0

7448
12237
15366
19067

TF

0.0

2.5
Time (min)

5.0

QC test columna invertida

0.0

2.5
Time (min)

5.0

QC test despus de limpiar con


100% IPA, 35C

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Ensanchamiento, divisin
Volmen muerto en la columna

El no ajustar el pH
de la fase mvil,
ocasiona disolucin
de la slica

Fase mvil: 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA


(~ pH 11)
Initial
Despus de 30 inyec.

Multiples cambios en la forma del pico pueden ser causados por el mismo
problema. En este caso, el elevado pH disolvi la slica y form un volumen en la
columna.

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Cambios en la fase mvil


Cambios en la retencin

60% MeOH: 40% 0.1%TFA

30
Time (min)

TFA nuevo aadido a la


fase mvil

20

30

Time (min)

El TFA se evapor de la fase mvil.


El reemplasarlo, se resuelve el problema.

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Cambios en las condiciones, pueden causar


cambios en la retencin*
Flujo

1%

1% tr

Temp.

1C

1 - 2% tr

%Orgnico 1%

5 - 10% tr

pH

0 - 1% tr

0.01

* Troubleshooting HPLC Systems, J. W. Dolan and L. R. Snyder, p 442.

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Conclusiones
Los problemas en columnas de HPLC son:
Presin alta
Forma de pico indeseable
Cambios en la retencin/selectividad
La mayora de estos problemas se resuelven lavando la columna
Frecuentemente estos problemas no estn asociados con la
columna y pueden ser causados por el instrumento y condiciones
experimentales.

La columna se comporta de acuerdo a cmo la tratemos

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Informacin tcnica

Irma C. Bedolla Amndola


Tel. 52-55-9171-5505
irma_bedolla@agilent.com
www.agilent.com/chem

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