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columnas de HPLC
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C
(C) Ser excluda
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SB-C3 (80)
H3C
O
HO
O
OCH3
OCH3
CH2
HC
HO 3
N
O
O
H3C
O
CH2
OH
300SB-C3 (300)
CHO
CH2
CH3
O
CH3
HO
O
CH3
CH3
CH3
OH
CH3
Pw1/2 = 0.442
Pw1/2 =0.125
5
Time (min)
10
5
Time (min)
10
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Tamao de partcula
Para anlisis convencionales de molculas grandes y
pequeas, el tamao de partcula ms usado es de 5 micras.
Mientras ms pequeo sea el tamao de partcula, mayor es
la eficiencia y la resolucin
Tamaos de partcula disponibles (en micras)
10
5
3.5
3
1.8
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disminucin proporcional en el
tiempo de anlisis (tiemp~long, L)
disminucin de N, platos~ L y as N
+
Disminucin en el tamao de part. =
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mantiene la resolucin, R
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Seleccin de la fase
Analitos de inters
pH
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pH Un parmetro importante en el
desarrollo de mtodos
La retencin de los compuestos ionizables es
fuertemente influenciada por el pH
Los compuestos ionizables (cidos y bases) pueden
ser analitos o compuestos de matriz
Un control preciso del pH mejora la reproducibilidad
del mtodo
El intervalo de pH de 1 12 provee la mxima
flexibilidad para el desarrollo de mtodos
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10
Pyridine
pka 5.2
Codeine
pKa 8.0
Procainamide
pKa 9.2
Amphetamine
pKa 9.9
Caffeine
pKa 14
4
Mobile Phase:
45% MeOH:
55% 20 mM Phosphate Buffer
0
pH 2.5
pH 6.5
pH 8
pH 11.5
pH
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pH bajo
Los cidos estn protonados para mxima retencin
Los grupos silanol estn protonados por lo que las
interacciones de intercambio inico con compuestos
bsicos son mnimas
Reproducibilidad de largo plazo
Excelente para la eleccin de fases mviles
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R
O
Si
R
OH
R
O
Si
R
OH
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R
O
Si
R
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pH medio
Los compuestos de inters son inestables a bajos
pH
Se mejora la solubilidad de los analitos a pH
medios
Incrementar la retencin de los compuestos
bsicos
Puede existir una mejor selectividad en el
intervalo de pH de 3 a 8
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CH3
O
ase
b
ca da
i
l
S jora
me
Si
CH3
CH3
Si
CH 3
CH 3
CH3
O
Doble
endcaped
mejorado
Si
CH3
CH3
Si
CH3
CH 3
CH3
O
Si
CH3
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1.
2.
3.
Famotidine
Cimetidine
Pirenzipine
N=7800
TF: 1.05
N=7800
TF: 1.00
8
10
12
14
16
18
min
18
min
10
N=4300
TF: 1.74
12
14
16
Alta eficiencia con partculas de 3.5um que se obtiene fcilmente con Eclipse Plus
No se requiere modificador para lograr este perfecto desempeo
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pH alto
Los compuestos de inters pueden no ser solubles a pH
bajos
Los compuestos de inters pueden no ser estables a pH
bajos
Obtener un incremento en la retencin de compuestos
bsicos analizndolos en su forma no cargada
Mejorar la selectividad
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Extend-C18
Si
Estructura Bidentada O
C18
Si
O
Soporte de Slice
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160
Eclipse XDB-C8
Eclipse XDB-C18
Extend-C18
140
Columnas:
Purga:
Flujo:
1.5 mL / min
120
100
Temperatura: 25C
80
Deteccin:
Concentracin de silicato
por reaccin colorida del silicomolibdato
60
40
20
0
0
10
12
14
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Colapso de la fase
C18 extendida en silica
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pH 1-6 hasta 90 C
pH 2-9 hasta 60 C
pH 2-9 hasta 60 C
pH 2-11 hasta 60 C
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Resumen
Las fases C18 y C8 son las mejores para iniciar el desarrollo de
mtodos con muestras tpicas.
Tener en cuenta que el pH juega un papel crtico en la separacin y
puede ser agresivo para la columna; buscar la columna adecuada.
Elegir la fase estacionaria ms adecuada para la muestra e particular.
Usar fases especiales como la SB-Aq para muestras polares, difciles
de retener para disminur los tiempos de desarrollo.
Buscar la columna que nos d resultados con el mnimo de problemas
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Cuidado y solucin de
problemas de columnas
de HPLC
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Componentes de HPLC
Bomba
Inyector/Automuestreador
Columna
Detector
Sistema de
datos/Integrador
Todas estas partes pueden presentar
problemas y requiren diagnosticarlos.
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A. Presin
B. Forma de pico
C. Retencin
5
1
2
6
Time (min)
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Problema potencial
Presin alta
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Limpieza de la columna
Purgar la columna con disolventes ms fuertes que la fase
mvil.
Use al menos 26ml de cada disolvente para columnad analticas (4.6
mm)
Opciones de disolventes para columnas de fase reversa
(en orden de incremento de fuerza)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
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Limpieza de la columna
Opciones de disolvente para la fase normal
(En orden de incremento de fuerza)
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Proteger la columna
- Pre columnas
- Filtros en lnea
Preparacin de la muestra
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Fase mvil a la
bomba
Pre-Columna
Inyector
Guarda
Filtro Columna
Columna
Analtica
Al detector
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Picos divididos
Coleo
Ensanchamiento
Baja eficiencia
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Picos divididos
Contaminacin de la columna
Frit parcialmente obstruido
Volmen muerto en la columna
Efectos del solvente de inyeccin
0.0
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2.5
5.0
Time (min)
7.5
10.0
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Picos divididos
Columna contaminada
Column: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm
Mobile Phase: 60% 25 mM Na2HPO4, pH 3.0 : 40% MeOH
Flow Rate: 1.0 mL/min
Temperature: 35C Detection: UV 254 nm Sample: Filtered OTC Cold Medication: 1. Pseudoephedrine 2. APAP 3. Unknown 4. Chlorpheniramine
Inyeccin 1
Inyeccin 30
1. Inyeccin despus
de lavar la columna
con 100%ACN
2
4
1
1
4
4
3
3
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Time (min)
10
15
Time (min)
10
15
Time (min)
10
15
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Picos divididos
Efectos del disolvente de inyeccin
Column: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 m
Mobile Phase: 82% H2O : 18% ACN
Injection Volume: 30 L
Sample: 1. Caffeine 2. Salicylamide
1
A. Disolvente de inyeccin
100% Acetonitrilo
H3C
CH3
OH
2
O
B. Disolv. de inyeccin
Fase mvil
NH2
O
O
CH3
10
Time (min)
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10
Time (min)
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No TEA
2
USP TF (5%)
1. 1.29
2. 1.91
3. 1.63
4. 2.35
5. 1.57
0.0
10 mM TEA
3
2
3
4
5
2.5
5.0
TIme (min)
0.0
2.5
USP TF (5%)
1. 1.19
2. 1.18
3. 1.20
4. 1.26
5. 1.14
5.0
Time (min)
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pH 3.0
USP TF (5%)
pH 7.0
USP TF (5%)
1
2
4. 1.33
4. 2.35
4
5
4
0.0
2.5
5.0
Time (min)
0.0
2.5
5.0
Time (min)
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Plates
1.
2.
3.
4
7629
12043
13727
13355
TF
2.08
1.64
1.69
1.32
Plates
1.
2.
3.
4
7906
12443
17999
17098
TF
Plates
1.43
1.21
1.19
1.25
1.
2.
3.
4
2.5
Time (min)
5.0
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1.06
1.21
1.11
1.17
4
1
0.0
7448
12237
15366
19067
TF
0.0
2.5
Time (min)
5.0
0.0
2.5
Time (min)
5.0
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Ensanchamiento, divisin
Volmen muerto en la columna
El no ajustar el pH
de la fase mvil,
ocasiona disolucin
de la slica
Multiples cambios en la forma del pico pueden ser causados por el mismo
problema. En este caso, el elevado pH disolvi la slica y form un volumen en la
columna.
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30
Time (min)
20
30
Time (min)
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1%
1% tr
Temp.
1C
1 - 2% tr
%Orgnico 1%
5 - 10% tr
pH
0 - 1% tr
0.01
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Conclusiones
Los problemas en columnas de HPLC son:
Presin alta
Forma de pico indeseable
Cambios en la retencin/selectividad
La mayora de estos problemas se resuelven lavando la columna
Frecuentemente estos problemas no estn asociados con la
columna y pueden ser causados por el instrumento y condiciones
experimentales.
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Informacin tcnica
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