Revista Iberoamericana de Polmeros

Olivera et al.

Volumen 13(5), Noviembre 2012

Microesferas de quitosano

MICROESFERAS DE QUITOSANO COMO POTENCIALES

TRANSPORTADORES DE CIDOS NUCLEICOS Y OTROS BIOACTIVOS
Alvaro D. Olivera1, Mara F. Barreiro2, Mary Lopretti1,3,*
1) Facultad de Ciencias, Universidad de la Repblica, Igu 4225, 11400 Montevideo, Uruguay. Correo electrnico:
mlopre@fcien.edu.uy
2) Laboratrio de Processos de Separao e Reaco (LSRE), Laboratrio Associado LSRE/LCM, Instituto Politcnico
de Bragana, Campus Santa Apolnia Ap. 1134, 5301857 Bragana, Portugal.
3) Laboratorio de Tecnolgico del Uruguay (LATU), Avenida Italia, 6201 Montevideo, Uruguay

Recibido: Marzo 2012; Aceptado: Septiembre 2012

RESUMEN
En este trabajo se prepararon microesferas de quitosano cargadas con ADN comercial como
prototipo de sistemas de liberacin de cidos nucleicos. Para preparar las microesferas se utiliz una
metodologa basada en la preparacin de una emulsin agua en aceite (w/o) seguida de entrecruzamiento
con glutaraldehdo. Las microesferas producidas fueron caracterizadas desde un punto de vista
morfolgico (HRSEM), evaluadas en cuanto al tamao (SEM y citometra de flujo) y utilizadas para
determinar el perfil de descarga de ADN. Se obtuvieron microesferas con una estructura porosa y con
tamao entre 1 y 20 m de dimetro (SEM), destacndose una poblacin de partculas individualizadas
alrededor de 45% (en nmero) entre las 6 y 12 m, segn los datos aportados por la citometra de flujo.
En cuanto al perfil de liberacin en medio a valor de pH fisiolgico se observ una liberacin rpida,
siendo que durante la primera hora 85% del principio activo haba sido liberado alcanzndose 100% al
final de dos horas.
Palabras claves: quitosano, microesferas, liberacin controlada, ADN, cidos nucleicos
ABSTRACT
In this work chitosan microspheres loaded with ADN have been produced having in view the
development of nucleic acids prototype release systems. The microspheres have been formed by using a
methodology based on the preparation of a waterinoil emulsion (w/o) followed by crosslinking with
glutaraldehyde. The obtained particles were characterized in terms of morphology (HRSEM), size (SEM
and flow cytometry) and used to access the ADN release profile. The obtained results have shown
porouslike microspheres with a size ranged from 120 m, where 45% of the particles (in number) can
be described as individual elements with sizes comprised between 612 m, as indicated by flow
cytometry analysis. The determined release profile using a neutral medium pointed out an 85% release of
the active principle after one hour, whereas complete release was achieved just after two hours.
Keywords: chitosan, microspheres, controlled release, ADN, nucleic acids

INTRODUCCIN
El quitosano, (14)2amino2deoxiDglucosa o Dglucosamina, es un polisacrido con
excelentes propiedades biolgicas. La carga positiva que se produce en medio cido como resultado de
la protonacin del grupo amino presente en cada unidad glucosamina, le confiere solubilidad en medio
acuoso y es uno de los motivos de su actividad biocida [1]. Este polmero biocompatible y
biodegradable encuentra diversas aplicaciones en el rea biomdica como vehculo para la liberacin
controlada de frmacos [2, 3]. Estos sistemas son utilizados para distribuir o transportar frmacos dentro
del organismo, orientados a un rgano, tejido, o grupo de clulas, permitiendo programar un perfil de
descarga del componente microencapsulado, mientras llevan a salvo el agente teraputico para
alcanzar una concentracin efectiva en el sitio de accin especfico. Pueden cargar varios componentes
activos, beneficiando la distribucin, la retencin en el organismo, o incrementando la eficacia del
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tratamiento mientras suprimen los mecanismos sistmicos o celulares que pueden limitar la respuesta
teraputica. La presencia de grupos amino facilita la unin de distintos componentes permitiendo la
funcionalizacin de los microvehculos [4].
La adaptacin de esta tecnologa a la administracin de cidos nucleicos, tiene la capacidad de
superar las barreras extracelulares que limitan la terapia gnica. La liberacin controlada puede
mantener concentraciones elevadas de ADN en el microambiente celular, protegiendo el ADN contra la
degradacin mediada por nucleasas incrementando as la efectividad del tratamiento, a la vez que
permiten disminuir el nmero de dosis o la cantidad en gramos suministrados. Tambin permiten reducir
la generacin de efectos colaterales dainos para el organismo. Forman parte de las alternativas a los
clsicos vectores virales los cuales encuentran trabas frente a las normas que rigen su utilizacin en la
industria farmacutica. Otros vectores no virales como la poliLlisina, liberan su contenido de forma
concertada, lo que resulta en perodos cortos de expresin gnica y la necesidad de repetir la
administracin de la dosis [5]. Se ha reportado que plsmidos microencapsulados en quitosano, inducen
una muy alta actividad proteica durante perodos de 12 semanas post transfeccin [3].
Las molculas de ADN o ARN negativamente cargadas, potencialmente acomplejados con
protenas, polmeros o lpidos catinicos, interactan con los biomateriales polimricos a travs de
mecanismos no especficos, incluyendo interacciones hidrfobas, electrostticas y van der Waals.
Alternativamente, pueden introducirse interacciones especficas a travs de grupos funcionales
complementarios, tales como antgenoanticuerpo o biotinaavidina, que permiten controlar la unin del
vector al sustrato [4].
En la terapia con cidos nucleicos, existen numerosos ensayos clnicos para una variedad de
desordenes genticos que asocian distintas patologas. La mayora de estos ensayos no muestran eficacia
teraputica significativa debido a la baja tasa de transfeccin obtenida al inyectar cidos nucleicos
desnudos, prdida de estabilidad en la expresin gnica, accin del sistema inmune, o la expresin de
otro gen desde el vector o las clulas. Los complejos polielectrolito formados por el ADN cargado
negativamente y el quitosano, le brindan proteccin a los cidos nucleicos frente a la degradacin por
nucleasas, lo que se traduce en una mayor eficiencia de transfeccin [2]. Los sistemas de entrega de
genes basados en polmeros, pueden mejorar la entrega de estas macromolculas y extender la expresin
del transgene para sintetizar cantidad suficiente de protena que actuar en forma local o sistmica [6].

PARTE EXPERIMENTAL
1. Preparacin de las microesferas. En este trabajo fueron preparadas microesferas de
quitosano utilizando una tcnica basada en el trabajo de Thanoo et al. y modificada por Dhawan et
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al. [7]. La misma se basa en la formacin de una emulsin agua en aceite (w/o) con la posterior
adicin de un agente entrecruzante (glutaraldehdo) que coagula las microgotas formadas por la fase
dispersa. Para preparar la fase dispersa se disolvi quitosano al 2,0% (p/v) en cido actico al 5,0%
(p/v) en agitacin continua durante 24 horas utilizando un agitador magntico. Esta solucin se
filtr con bomba de vaco utilizando un filtro de MN 640 w MachereyNagel con una capacidad
promedio de retencin de entre 7 y 12 m. Para preparar la fase continua se mezclaron 125,0 mL de
aceite de girasol y Span 80 (HLB = 4,3) al 0,5% (p/v) como tensioactivo.
En condiciones de agitacin constante (1.100 rpm), se agregaron 3,0 mL de la fase dispersa
por goteo lento a una tasa de 5 mL/minuto, a 125,0 mL de la fase continua. Luego se adicion por
goteo, glutaraldehdo en solucin acuosa (25%, v/v) en 4 aplicaciones (2,5 mL cada una) a los 15,
30, 45 y 60 minutos. Se mantuvo bajo las mismas condiciones de agitacin durante 2,5 horas. Una
vez finalizado este proceso, se dej decantar por 24 horas a temperatura ambiente. Para la
recoleccin de las microesferas se emple un sistema de filtracin con bomba de vaco utilizando
un filtro de 0,8 m (Gelman Sciences). Se descart el sobrenadante y se realizaron sucesivos
lavados, primero con ter de petrleo, a continuacin con agua bidestilada MilliQ, finalizando
nuevamente con ter de petrleo. Se dejaron secar a temperatura ambiente.
Para los ensayos de caracterizacin se prepararon microesferas sin principio activo mientras
para los ensayos de liberacin se produjeron microesferas contiendo ADN. En este caso se
agregaron 100 g de ADN de timo de vaca (GE Healthcare) diluidos en 100 L de agua MilliQ a
3,0 mL de la solucin de quitosano 2% (p/v) promoviendo la homogeneizacin por medio de
agitacin vortex. Se procedi con el protocolo descrito anteriormente.
2. Microscopa ptica. Se montaron muestras con medio sinttico. Se observaron y
capturaron imgenes con una cmara digital marca Samsung SDC310 acoplada a microscopio
marca Olympus BX40 y software de control ImageProexpress 4.01.
3. Microscopa electrnica de barrido (SEM). Se procesaron muestras metalizando a vaco
con oropaladio. Se observaron en un microscopio Jeol JSM5900 LV a una aceleracin de voltaje
de 20 kV en la unidad de microscopa electrnica de barrido de la Facultad de Ciencias de la
Universidad de la Repblica.
4. Microscopa electrnica de barrido de alta resolucin (HRSEM). Se metalizaron
muestras con oro y se observaron en una estacin de trabajo Fei Nova A200 Nanolab Dual Beam
Fib (FIB: focused ion beam) equipada con can emisor de campo. Se cortaron esferas con y sin
recubrimiento metlico utilizando el can emisor de iones (FIB). Este trabajo se realiz en el
laboratorio de microscopa electrnica de ultra alta resolucin (MELUAR) del Instituto Mexicano
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del Petrleo (IMP).

5. Citometra del flujo. Se resuspendieron esferas en agua MilliQ sometiendo estas a vortex
y sonicador. Se centrifug, se obtuvo el sobrenadante y se llev al citmetro FACSVantage BD
del Servicio de Clasificacin Celular y Citometra de Flujo (SECIF) del Instituto de Investigaciones
Biolgicas Clemente Estable (IIBCE). Para la clasificacin de tamao por poblaciones, se utilizaron
esferas estndar de 6 y 12 m.
6. Ensayos de liberacin. Se sigui un procedimiento basado en los ensayos de Dini et al.
[8]. Se pesaron 50 mg de microesferas cargadas con ADN y se prepar un batch resuspendiendo
estas microeferas en 15 mL de buffer de fosfato (pH = 7,4) manteniendo despus una agitacin
continua de 80 rpm con un agitador orbital (Labnet Intenational, Inc. Orbit 1000). Se retir, cada 10
minutos un mL del batch, que se centrifug durante 20 segundos, en una minicentrfuga Beckman
Microfugue E a 13.000 rpm. El sobrenadante se coloc en una cubeta de cuarzo y se midi la
absorbancia de la muestra en un espectrofotmetro Varian Cary 50 Tablet UVVisible
Spectrophotometer, a 260 nm. Luego de cada medida se devolvieron las muestras a su batch
original. Para realizar el calibrado del espectrofotmetro se prepar una solucin patrn de ADN
(0,01 g/L), obtenindose una absortividad de 111,77 L/gcm.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Se prepararon microesferas esferoidales individualizadas como se pude comprobar por
anlisis inmediata por microscopia ptica de los productos obtenidos en los distintos batchs
producidos. Se pude demostrar que el efecto de agregacin o clustering de las microesferas, tiene
mayor incidencia luego del proceso de secado de las mismas, siendo que mientras resuspendidas en
agua, se mostraran como unidades ms discretas (Figura 1). En futuros trabajos se estudiar
distintos procesos de secado que permitan obtener unidades en su mayora lo cual ampla el
espectro de aplicacin.
Por anlisis SEM fue posible comprobar que las microesferas presentaban un dimetro entre 1
y 20 m (Figura 2), destacndose una poblacin de partculas individualizadas alrededor de 45%
(en nmero) entre las de 6 y 12 m, segn los datos aportados por la citometra de flujo y realizados
con muestras de microesferas resuspendidas en agua. Por las condiciones en que se realiz la
tcnica de SEM, fue necesario asegurarse que el producto estuviese totalmente seco, observndose
claramente y a mayor aumento, el efecto de agregacin de las partculas.
La tcnica de HRSEM permiti analizar de forma ms clara la morfologa de las microesferas
pondo en evidencia una estructura porosa siendo que estas se parecen a una esponja donde se
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observan perfectamente los espacios que podrn ser ocupados durante la penetracin de lquidos as
como los caminos de escape para los componentes microencapsulados durante el proceso de
descarga (Figura 3).

Figura 1. Microscopia ptica de las microesferas producidas: (A) despus del proceso de
secado (200X), y (B) despus de ser resuspendidas en agua (100X).

Figura 2. Micrografa SEM mostrando microesferas de quitosano cargadas con ADN.

El perfil de liberacin realizado sobre una muestra de 50,0 mg de microesferas cargadas con
ADN, se muestra en la Figura 4. Se puede verificar una buena eficiencia de incorporacin de lo
principio activo prototipo as como una liberacin rpida, siendo que durante la primera hora 85%
del ADN haba sido liberado alcanzndose 100% al final de dos horas. De notar que la
concentracin mxima terica, suponiendo que se logr microencapsular la totalidad del ADN
utilizado en el ensayo de encapsulacin es de 0,0056 g/L. Los tiempos estudiados son aptos para
un tipo de retencin de sustancias y transito adecuado en aplicaciones teraputicas. En el caso de
requerirse mayores tiempos de permanencia se debera incluir un tipo de enlace permanente, en
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determinadas condiciones o usar polielectrolitos de enlace. En todos los casos se requerir para
futuros trabajos estudios in vivo, determinar la permanencia, tiempo de llegada al destino final, etc.

Figura 3. Microscopa de HRSEM de las

microesferas: (A) (14.000X) pone en evidencia la
estructura interior de una sola esfera, y (B) (120.000X)
donde se destaca el detalle de la superficie (S) y el interior
de la matriz (I).

Figura 4. Perfil de liberacin del ADN microencapsulado.

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CONCLUSIONES

Se mostr que estos sistemas son aptos para la microencapsulacin de cidos nucleicos.
Adems de la proteccin fsica que otorga la microencapsulacin contra la degradacin del
componente cargado, el empleo de un polmero con actividad biocida incrementa la proteccin de
los bioactivos y del sistema completo, protegiendo contra bacterias de los instrumentales y sistemas
utilizados. Las caractersticas de retencin de estas matrices permiten obtener nuevamente en forma
libre, todo el agente microencapsulado, posibilitando as la programacin de dosis de accin
teraputica. La conjuncin de estas propiedades viabiliza su desarrollo y aplicacin en la industria
farmacutica.
Si bien este tipo de encapsulacin biocompatible permite obtener una liberacin gradual del
bioactivo en un organismo vivo, fue nuestro objetivo controlarlo en tiempos no muy prolongados,
con el fin de estudiar el comportamiento del sistema prototipo. En futuros trabajos, basados en estos
resultados, se ensayar la liberacin de bioactivos especficos en sus sitios de accin. El uso de
metodologas de radiotrazadores ayudar a deliberar adems, la dispersin de las cpsulas en
rganos y tejidos no especficos por medio de la distribucin biolgica in vivo.
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