CRISPR PROPORCIONA RESISTENCIA ADQUIRIDA CONTRA LOS VIRUS EN

PROCARIOTAS
Los bacterifagos son las ms abundantes entidades biolgicas en el planeta. Su
distribucin y abundancia ha sido importante en el impacto en la ecologa de los
microbios y la evolucin del genoma bacteriano.
Es por ello que las bacterias tambin han desarrollado mecanismos que les
ayuden a defenderse de los bacterifagos. Ellas lo hacen en diversos blancos de
la ciclo de vida de fago: bloqueando la absorcin, previniendo la inyeccin de
ADN, restringiendo la entrada al DNA.
Muchas bacterias domesticadas usadas para la industria son susceptibles al
ataque de los fagos. Por lo que se han desarrollado modificaciones de ingeniera
gentica en estas bacterias que les permitan aumentar su inmunidad contra estos.
El streptococcus thermophilus es una bacteria gram negativa usada para la
produccin de yogurt y queso. En esta cepa ha sido previamente revelada la
existencia de repeticiones palindrmicas cortas agrupadas y regularmente
interespaciadas (CRISPR). Son loci de ADN que consiste en repeticiones directas
no contiguas, separadas por estiramientos de secuencias variables llamadas
espaciadores.
Estos espaciadores han revelado secuencias homologas con elementos
extranjeros; como secuencias de bacterifagos y plsmidos.
Han existidos varias hiptesis que proponen que CRISPR y los genes cas proveen
a la bacteria de inmunidad contra elementos genticos externos, basados en
mecanismos como el ARN de interferencia.
En este artculo los investigadores quisieron analizar la secuencias CRISPR de
varias cepas de S. thermophilus; cepas relacionadas a la industria y cepas con
resistencia a los fagos y dos fagos distintos pero relacionados con la industria
(fago 858 y 2972). Y ver si los elementos de CRISPR tenan una relacin estrecha
con la inmunidad en las bacterias. As que su primera hiptesis fue saber si
CRISPR estaba alterado durante la generacin de resistencia a los fagos.

9 mutantes resistentes a los bacterifagos fueron generados independientemente

del reto de la cepa WT. Y estimulados con los fagos 858 y 2972 o ambos.
Se observa que el WT es altamente sensitiva al ataque de los fagos 558 y 2972
En los mutantes se observar nuevos espaciadores adquiridos (cajas blancas s1s14) se observa que algunas cepas son resistentes a ambos fagos, mientras que
otras solo son resistentes a uno y en su mayora tienen mayor resistencia al fago
2972. Las cepas que fueron estimuladas con ambos fagos y que adquirieron
nuevos espaciadores (S9-S14) representaron una mayor resistencia al ataque de
los fagos. As que el perfil de resistencia esta correlacionado con espacios
contenidos.

Anlisis de secuencia de los espacios adicionales insertados en el locus CRISPR1

de varios mutantes resistentes a los fagos demuestran secuencias similares.
Situacin que demuestra que el sistema CRISPR-CAS capturar al ADN invasor y
lo integra en un locus CRISPR como parte de su respuesta inmune.

Ahora los investigadores queran saber si eran los espaciadores lo que definan la
resistencia a los fagos. Para hacer esto agregaron o borraron espaciadores.
En la imagen se observa que cuando los investigadores borrar todos los
espaciadores del WT858+S1S2-CRISPR1 se volvi sensitivo a los fagos. Luego
en la versin que contena nicamente los espaciadores S1 y S2 (IV) fueron
probados para valorar la sensibilidad y remarcablemente hubo una resistencia al
fago 858. Esto nos sugiere que los dos espaciadores tiene la habilidad de proveer
resistencia a los fagos.
Para ver si los genes CASP estaban implicados en la inmunidad se inactivaron
dos genes cas; cas 5 y 7. En la grfica se muestra que los genes CAS5 mostro
una prdida de la resistencia en ambos fagos. Y la inactivacin del gene cas7 no
altera la resistencia al fago.