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F AC U L D AD E D E C I N C I AS F AR M A C U T I C AS
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM FRMACO E
MEDICAMENTOS
REA DE INSUMOS FARMACUTICOS
Re b e ca L e ite d e Al m e id a
Orientadora:
Profa. Tit. Silvia Berlanga de Moraes Barros
Verso corrigida
So Paulo
2011
Comisso Julgadora da
Tese para obteno do grau de Doutor
_____________________________________
Profa. Dra. Silvia Berlanga de Moraes Barros
orientadora/presidente
_____________________________________
1. examinador
_____________________________________
2. examinador
_____________________________________
3. examinador
_____________________________________
4. examinador
So Paulo, ________________ de 2 0 1 1
[Almeida,R.L., 2011]
AGRADECIMENTOS
Agradecer....
uma oportunidade que temos de retribuir os dias de conselhos,
de trabalho intenso, de resultados inesperados, de tristeza, desabafo .... e
tambm de alegrias, companheirismo e finalizao de projetos!!!
Agradeo por cada pessoa que colaborou seja de forma direta, indireta,
imediata, tardia e at mesmo sem saber, com o desenvolvimento deste
projeto.
Meu sincero agradecimento Universidade de So Paulo em particular
Faculdade de Cincias Farmacuticas pelo suporte cientfico e FAPESP pela
concesso da bolsa.
velha guarda, agradeo os direcionamentos, o tempo de Iniciao
Cientfica (escraviria!) e todos os protocolos que aprendi, e me deram o
empurro inicial para a escolha pela pesquisa.
Os colegas que com o dia-a-dia se tornaram amigos e amigas!!!
Recebam o meu agradecimento com muito carinho!!
Meu enorme agradecimento Profa Silvia Berlanga, que durante todos
estes anos sempre se mostrou solicita, mesmo quando eu estava em pnico!!
sua
capacidade
oportunidade
mim
de
escutar
concedida
idias
de
poder
encontrar
desfrutar
alternativas,
este
perodo
a
de
[Almeida,R.L., 2011]
NDICE
1 . I N T R O D U O ...................................................................................
01
2 . O B J E T I V O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . ... . ......
23
3 . M A T E R I A IS E M T O D O S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
24
3 . 2 . O b ten o d o e xt ra t o hi dro al co l i co d e r ai z de
P . u mbe l lat a ... . .. . .. .. .. .. .. .. . .. ... .. . .. . .. . .. .. .. .. . .. . .. .. .. .. . .. . .
24
3 . 3. I s o l a m e n t o d o 4 - n e r o l i d i l c a t e c o l ( 4 - N C ) . . . . . . . . . . .. . . ..
25
presso
M P L C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...
25
25
3 . 3. 3 An l i se d o 4 -N C p o r re sso n nci a ma gn t i c a
n u c l e a r R M N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
3 . 3. 4 C ro ma t og ra fia L iquida d e
Alta
Eficincia
26
26
lquido /lquido
do
27
e xt ra t o
h i d r o a l c o l i c o d e r a i z d e P . u m b e l l a t a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......
27
[Almeida,R.L., 2011]
29
acoplado
ao
alta eficincia
sist e ma
de
deteco
E l e t r o q u m i c o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...............
3 . 7. 2 Cro ma t o gr afia l quida d e
alta eficincia
lquida de
alta eficincia
29
HP L C a co pl a do a o si st e ma d e d et e c o u l tra vi ol e ta
( U V ) .................................................................................................
3.7.3 C r o m a t o g r a f i a
29
29
H P L C a c o p l a d o a o s i s t e m a d e d e t e c o de diodo (DAD)
3 . 8 . S u b - f r a c i o n a m e n t o d a f r a o n - b u t a n l i c a - N B U T....
30
30
31
32
32
3 . 1 0 . D e t e r m i n a o d e f l a v o n i d e s t o t a i s . . . . . . . . . . . . . . . . ...
33
3 . 1 0 . 1 D e t e r m i n a o d e f l a v o n a s e f l a v o n i s t o t a i s.......
33
3 . 1 0 . 2 D e t e r m i n a o d e f l a v a n o n a s t o t a i s . . . . . . . . . . . . . ......
34
34
3 . 1 1 . 1 M t o d o D P P H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .....
34
3 . 1 1 . 2 M t o d o O R A C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .....
35
3 . 1 1 . 2 . 1 H i d r o f l i c o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .....
35
3 . 1 1 . 2 . 2 L i p o f l i c o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....
36
[Almeida,R.L., 2011]
36
3 . 1 2 . 1 T r a t a m e n t o d o s a n i m a i s ...............................................
36
38
3 . 1 2 . 3 A v a l i a o d a a t i v i d a d e a n t i o x i d a n t e . . . . . . . . . . . ......
38
39
39
39
40
40
42
42
43
homogenato de pele
44
d o co n tro l e d a e xp re s s o p ro t i c a d o
h o m o g e n e i z a d o d e p e l e p o r W e s t e r n B l o t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....
44
3 . 1 7 A n l i s e e s t a t s t i c a d o s r e s u l t a d o s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....
45
4 . R E S U L T A D O S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....
46
46
46
[Almeida,R.L., 2011]
a tcnica
de
a co pl a da
a u m s i s t e m a d e d e t e c o E l e t r o q u m i c o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .....
4.4
Fra cio na me n t o
l q u i d o /l q ui d o
do
53
e xt ra t o
55
56
58
4 . 6 . 1 A n l i s e d a s f r a e s p o r H P L C e l e t r o q u m i c o.....
58
4 . 6 . 2 A n l i s e d a s f r a e s p o r H P L C U V . . . . . . . . . . . . . . ......
61
4 . 6 . 3 A n l i s e d a s f r a e s p o r H P L C U V D A D . . . . .....
63
67
4 . 7.1 I s o l a m e n t o d o s c o m p o s t o s d a f r a o N B U T . ........
69
72
4 . 9 A v a l i a o d a c o n c e n t r a o d e f l a v o n i d e s t o t a i s . . . . ...
74
76
4 . 1 0 . 1 M t o d o D P P H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .....
76
3 . 1 0 . 2 M t o d o O R A C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......
78
4 . 11 A v a l i a o d e a t i v i d a d e a n t i o x i d a n t e ( i n v i v o ) n a
p e l e d e c a m u n d o n g o s s e m p l o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
[Almeida,R.L., 2011]
80
81
81
83
85
87
89
4.13 Avaliao da
a t i v i d a d e d e metaloproteinases de matriz
(M M P s) ( i n v i t r o) p o r z i m o g r a f i a a p s e x p o s i o
r a d i a o U V B ............................................................................................
91
92
95
5 . D I S C U S S O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .....
96
6 . C O N C L U S O .........................................................................................
114
116
8 . A N E X O S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..................................
13 5
[Almeida,R.L., 2011]
LISTA DE FIGURAS
Figura
pgina
12
16
17
18
19
28
Figura 7. Fluxograma do processo de sub-fracionamento da frao Nbutanlica (NBUT) por MPLC. Fase estacionria slica gel RP18 e fase
mvel gradiente metanol: gua (5 100% metanol).
31
47
47
48
282 nm.
Figura 1 2. Espectro do 4-NC por RMN H1.
13
49
50
52
54
[Almeida,R.L., 2011]
56
(70:30).
Figura 18. Cromatogramas HPLC-EQ. (a) 4-NC 10 g/mL, (b) P.umbellata
e (c) HEX. Fase estacionria C8 (3 m) e fase mvel metanol:gua (9:1),
KCl 2 mM e LiClO4 20 mM, fluxo 1mL/min. Amostras de 100 g/mL.
59
60
61
Figura 21. Cromatogramas HPLC-UV (a) 4-NC, (b) HEX, (c) NBUT e (d)
AQ. Amostras de 250 g/mL. Fase mvel MeOH:H2O (9:1). Leitura em
62
282 nm.
Figura 22. Cromatogramas em 282nm do (a) 4-NC (TR= 30,087 min),
(b) frao HEX, (c) frao NBUT e (d) frao AQ. Fase mvel
gradiente ACN:H2O (5 -100% ACN).
63
65
utilizado
no fracionamento d a
67
68
[Almeida,R.L., 2011]
70
71
74
3 4.
Curva padro
de Naringenina
para
avaliao
de
flavanonas totais
75
77
79
80
[Almeida,R.L., 2011]
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
[Almeida,R.L., 2011]
94
[Almeida,R.L., 2011]
95
LISTA DE TABELAS
Tabela
pgina
37
41
46
51
53
54
55
58
61
69
71
72
75
76
[Almeida,R.L., 2011]
78
LISTA DE ABREVIATURAS
AAPH
2,2-Azobis-2-methyl-propanimidamide dihydrochloride
AcOEt
Acetato de etila
AQ
Frao aquosa
CCD
CDK
CPD
DAD
DCM
Diclorometano
DNPH
2,4-dinitrophenyldrazine
DPPH
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
ERNs
EROS
FPS
GTP
HEX
Frao hexnica
HPLC
HT1080
Clulas de fibrosarcoma
IC50
M1
-(3,4-diidroxifenil)--valerolactona
M2
-(3-metoxi-4-hidroxifenil)--valerolactona
MAPK
MAPquinase
MEC
Matriz extracelular
MED
MEOH
Methanol
MMP-2
Metaloproteinase 2
MMP-9
Metaloproteinase 9
MMPIs
Metalloproteinases inhibitors
MMPs
Metaloproteinases
MPLC
MS
Mass spectrometry
MT-MMPs
membrane-type metalloproteinases
NBUT
Frao n-butanlica
[Almeida,R.L., 2011]
NZB-MMPI
O2-
nion superxido
O3
Oznio
Oxignio singlete
ORAC
P.umbellata
Pothomorphe umbellata
PCNA
4-NC
4-nerolidilcatecol
RL
Radicais livres
RMN
TIMPs
TNF
TOF
time-of-flight
UV
Ultravioleta
UVB
Ultravioleta B
O2
Zn
2+
Zinco
[Almeida,R.L., 2011]
[Almeida,R.L., 2011]
RESUMO
A exposio radiao ultravioleta promove o desenvolvimento de efeitos
indesejveis, incluindo o fotoenvelhecimento e fotocarcinognese. Uma forma de
preveno a utilizao de antioxidantes de origem natural. O extrato de raiz de
Pothomorphe umbellata (PU) apresenta conhecida atividade antioxidante e
fotoprotetora, atividade esta atribuda, em parte, ao princpio ativo 4-nerolidilcatecol
(4-NC). Artigos publicados sobre a atividade do extrato de raiz de PU, conhecida
popularmente como pariparoba e do princpio ativo, 4-NC, mostraram que o extrato
bruto de raiz mais ativo do que o 4-NC isolado como inibidor de metaloproteinases
(MMPs) e como antioxidante, sugerindo a presena de outros compostos com estas
atividades, alm de um possvel efeito sinrgico. O objetivo deste estudo foi o de
obter fraes do extrato de PU isentas de 4-NC e avaliar a atividade antioxidante,
fotoprotetora e inibitria de metaloproteinases 2 e 9 na pele. O extrato hidroalcolico
de raiz de PU foi submetido ao fracionamento lquido/lquido sucessivamente com
hexano e n-butanol, restando um resduo aquoso. As fraes n-butanlica (NBUT) e
aquosa (AQ) mostraram-se isentas de 4-NC. A avaliao da atividade antioxidante
por DPPH e ORAC das 3 fraes obtidas mostrou maior capacidade antioxidante
para a frao hexnica (HEX), seguido das fraes NBUT e AQ. O mesmo perfil foi
observado quanto presena de compostos fenlicos. Entretanto no foi detectada
a presena de flavonides nas fraes. O tratamento tpico com formulao gelcreme contendo o extrato de PU, a frao NBUT e a frao NBUT+4-NC, 2h antes
da exposio aguda radiao UVB (2 MED - 204.36 mJ/cm2), mostrou-se
[Almeida,R.L., 2011]
HEX,
sugerem que
a atividade inibitria de
MMPs
no
esteja
[Almeida,R.L., 2011]
ABSTRACT
treatment
containing PU root extract, NBUT fraction and NBUT+4NC, 2h before acute UVB
exposure (2 MED - 204,36 mJ/cm2), was insufficient to promote the normal
[Almeida,R.L., 2011]
conditions of basal level antioxidant system depleted approximately 20% after 12h of
the exposure compared with the control. The same treatment evaluated by
immunohistochemistry, was not able to reduce the CPD (cyclobutane pyrimidine
dimers) 2h after the exposure. In 12h reduction of SBC (sunburn cells) and PCNA
(proliferating cell nuclear antigen) in PU and NBUT mouse groups was observed. The
p53 and p21 proteins were reduced in PU and NBUT+4NC groups, respectively. The
activity of metalloproteinases 2 and 9 (MMPs) of mouse skin homogenates after 24h
acute UVB exposure, evaluated by zymography, was inhibited by the NBUT fraction.
The observed results for NBUT that showed lower antioxidant activity than HEX
suggest that the inhibitory effects of MMPs activity may not be related to the
antioxidant capacity. It has not been possible to identify the compound(s) that are
probably responsible for inhibitory activity of MMPs from the NBUT fraction.
[Almeida,R.L., 2011]
1. INTRODUO
desempenha
papel
importante
no
fotoenvelhecimento
na
mecanismos
independentes (1) via p53 por regulao positiva da transcrio da expresso das
[Almeida,R.L., 2011]
proteinas Bax e Fas e regulao negativa de Bcl-2 e (2) outro que independe da
funo transcricional do p53 mas dependente da interao proteina p53 e proteinas
celulares envolvidas na sntese de DNA (SANDER et al., 2004).
A proteina p53 (53 KDa), induzida por radiao UV atua ativando o gene para
proteina p21, que colabora com o bloqueio do ciclo celular por inibir a fosforilao de
quinases depedentes de ciclinas necessrias para a progresso do ciclo celular
(OUHTIT et al., 2000; MANGONE & FEDERICO, 2003).
O gene p53, que codifica esta mesma protena, foi descrito primariamente
como guardio do genoma (ZIEGLER et al., 1994) e responsvel por estabelecer a
parada do ciclo celular para reparo do dano ao DNA ou a ativao da apoptose em
casos de danos celulares severos ( MANGONE & FEDERICO, 2003).
[Almeida,R.L., 2011]
sua
expresso
utilizada
como
biomarcador
de proliferao
celular
(WARBRICK, 2007).
A exposio repetitiva ao sol causa acmulo de danos derme, podendo
resultar em rugas caractersticas e leses na pele (FISHER et al., 2002). O
fotoenvelhecimento cutneo caracteriza-se por espessura de epiderme varivel,
elastose, decrscimo ou fragmentao do colgeno, aumento de protenas de
degradao
(MMPs),
infiltrados
inflamatrios
vasodilatao
(YAAR
&
GILCHREST, 2007).
A radiao UV, ao
As
de
tumores
envelhecimento
prematuro
por
UV
(STETLER-
STEVENSON et al., 1993; CHANG & WERB, 2001; NAGASE et al., 2006;
DERYUGINA & QUIGLEY, 2006, FISHER et al., 1996, INOMATA et al., 2003). Em
condies normais as MMPs so pouco expressas e controladas pelas TIMPs.
Durante um processo neoplsico ocorre aumento da expresso de MMPs
influenciando no remodelamento do microambiente tumoral e ativao de receptores
de superfcie celular, desencadeando cascatas de sinalizao (FINGER & GIACCIA,
2010).
so tambm observados em
enzimas
de
reparo,
antioxidantes
compostos
ativos
botnicos
10
[Almeida,R.L., 2011]
11
12
13
componente
no
leo
essencial.
apiol
(1-alil-2,5-dimetoxi-3,4-
14
Dos extratos hexnicos de raiz de P. umbellata foram isolados sitosterol, 4nerolidilcatecol (4-NC), e nerolidol (KIJJOA et.al., 1980, BASTOS, 1998). O 4-NC
tambm pode ser isolado a partir da P. peltata (MONGELLI et.al., 1999a, 1999b,
2002; NUNEZ et al., 2005; PINTO et al., 2006).
O extrato hidroalcolico das partes areas e de raiz de P.umbellata, coletadas
no estado de So Paulo, resultaram em reaes positivas para saponinas, taninos,
compostos fenlicos, esterides e mucilagens, e reaes negativas para alcalides,
derivados de antraquinonas e flavonides (MORAES, 1983). Extrato aquoso e
etanlico de folhas coletadas na Ilha de Maraj apresentaram triterpenos e
flavonides, este ltimo descrito somente no extrato aquoso (HAMMER &
JOHNS,1993).
Hidrocarbonetos sesquiterpenos e sesquiterpenos oxigenados foram descritos
(MESQUITA et al., 2005). Do extrato metanlico de folhas, cubebina e
dihidrocubebina foram encontradas, e determinada a estrutura do 5,7-dimetoxi-3,4metilenodioxi-flavonol. A via do cido chiqumico foi sugerida como rota biosinttica
para lignanas e flavonides das folhas (BASTOS, 1998). Os compostos Nbenzoilmescalina, wogonina, uvangoletina e -sitosterol glicosideo tambm foram
isolados das partes areas de P. umbellata (ISOBE et al., 2002).
Do extrato metanlico de folhas de P.umbellata foi identificado a isoasarona,
2-(4-metilfenil)-3-metil-5-propil benzofurano e 2,3-diidro-2-(4-hidroxi fenil)-3-metil-5propil benzofurano (AHMAD & TAWAN,2002) e 4 novos alcalides chamados de
piperumbelactamas A-D, alm do N-hidroxiaristolam II, N-p-coumaroil tiramina, 4nerolidilcatecol,
n-trans-ferruloiltiramina,
hidroxifeniletil]-2-propenamida,
neoesperidosideo,
acacetina
-amirina,
E-3-(3-4-dihidroxifenil)-N-2-[4friedelina,
6-C--d-glucopiranosideo,
[Almeida,R.L., 2011]
apigenina
-sitisterol,
8-C3-O--d-
15
glucopiranosideo
3-O--d-[6`-dodecanoil]-glucopiranosideo
(TABOPDA
et
5-hidroxi-7,3,4-trimetoxi-flavona,
velutina,
sesamina,
[Almeida,R.L., 2011]
16
[Almeida,R.L., 2011]
17
[Almeida,R.L., 2011]
18
[Almeida,R.L., 2011]
19
[Almeida,R.L., 2011]
20
extrato
de
P.umbellata
(0.1%
4-NC)
aplicado
topicamente
em
21
[Almeida,R.L., 2011]
22
[Almeida,R.L., 2011]
23
2. OBJETIVOS
1. Fracionar o extrato bruto hidroacolico de raiz de P.umbellata, de maneira a
obter fraes isentas de 4-nerolidicatecol.
2. Avaliar estas fraes quanto a capacidade antioxidante (in vitro) e atividade
inibitria de metaloproteinases 2 e 9 na pele de camundongos sem plo (in
vitro).
3. Estudar o efeito do tratamento tpico da frao isenta de 4-NC com maior
atividade antioxidante/inibitria de MMPs sob as alteraes induzidas por
exposio radiao UVB aguda.
[Almeida,R.L., 2011]
24
3. MATERIAIS E MTODOS
25
[Almeida,R.L., 2011]
26
[Almeida,R.L., 2011]
27
utilizada foi gradiente acetonitrila:gua (5-100% ACN) com fluxo 0,2 ml/min. Foi
utilizado para controle o software MASS LYNX Waters MS-TOF v.4.1.
3.4 - Determinao da concentrao de 4-NC do extrato de Pothomorphe
umbellata, empregando-se a tcnica de cromatografia lquida de alta eficincia
(HPLC) acoplada a um sistema de deteco Eletroqumico.
fase
estacionria
utilizada
foi
coluna
Luna
C8
(2)
3m (75x4,6mm)
28
29
3.7 - Anlise das fraes por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia - HPLC
[Almeida,R.L., 2011]
30
[Almeida,R.L., 2011]
31
fase mvel
32
[Almeida,R.L., 2011]
33
quantificao
de
flavonides
totais
foi
realizada
por
ensaio
[Almeida,R.L., 2011]
34
(DPPH)
em
50%
(BRAND-WILLIAMS
et
al,1995,
QIAN
&
[Almeida,R.L., 2011]
35
3.11.2.1 Hidroflico
As amostras das fraes obtidas, o 4-NC e o extrato hidroalcolico de
P.umbellata foram solubilizadas (1mg/mL) em soluo de acetona:gua 50% (v/v) e
diluda em 6 concentraes diferentes em tampo fosfato (75mM, pH 7.0). So
adicionados placa de 96 poos, 25L de amostra, 150L de soluo de
fluorescena 40 mM em tampo fostato (75 mM, pH 7.0) e a reao incubada por
30 minutos 37C. Adiciona-se 25L de AAPH 153 mM (em Tampo Fosfato pH
7.0) /poo. A placa foi agitada por 10 segundos e a leitura realizada em leitor de
placa modelo Synergy HT (BIOTEK, Bio Tek Instruments Inc.,Winooski, VT, USA) a
cada 1 minuto durante 1 hora. Excitao em 493 nm (filtro 485/20) e Emisso em
515 nm (filtro 528/20). A amostra branco e controle de reao foram constitudas de
200L de tampo fosfato 75 mM pH 7.0 e 25 L de tampo substituindo a amostra,
respectivamente.
O valor final calculado atravs da equao de regresso entre a
concentrao de Trolox e a rea sob a curva de decaimento de fluorescncia
[Almeida,R.L., 2011]
36
37
Tabela
1.
Composio
das
formulae s
gel-creme
(p/p) utilizadas
no
Gel-creme
P.umbellata
NBUT
NBUT 0.28% +
0.1% 4NC*
0.28%**
0.1% 4NC
Carbomero 940
0.3
0.3
0.3
0.3
Propilenoglicol
10
10
10
10
Trietanolamina
0.25
0.25
0.25
0.25
Cetiol V
1.5
1.5
1.5
1.5
Lanette N
2.5
2.5
2.5
2.5
Nipagin
0.15
0.15
0.15
0.15
Nipazol
0.15
0.15
0.15
0.15
Extrato PU
0.125
4-NC
0.1
Fracao NBUT
0.285
0.285
Agua destilada
100
100
100
100
qsp
* Concentrao estabelecida a partir do doseamento de 4-NC no extrato de P.
umbellata. * * Concentrao de frao n-b u tanlica equivalente ao de 0.1% 4NC no extrato de P.umbellata.
[Almeida,R.L., 2011]
38
[Almeida,R.L., 2011]
39
(375L
para
pele)
de
uma
soluo
7%
(p/v)
de
-ciclodextrina
[Almeida,R.L., 2011]
40
anticorpos
primrios
utilizados
foram:
anticorpo
anti-PCNA
rato
41
Tempo
Diluio
Concentrao do
Primrio
incubao (min)
Utilizada
Anticorpo 1ario
P21
10
12.5 g/ml
1 mg/ml
P 53
20
1:250
1.2 mg/ml
PCNA
30
1:50
525 mg/ l
[Almeida,R.L., 2011]
42
43
44
45
Empregou-se a Anlise de Varincia (ANOVA) seguida do teste de TukeyKramer para Mltiplas Comparaes, para a localizao dos contrastes. A
significncia utilizada foi p<0,05 para cada comparao.
[Almeida,R.L., 2011]
46
4. RESULTADOS
Raiz
4.114
100
Extrato seco
0.240
5,83
[Almeida,R.L., 2011]
13
C (Figuras 12
47
[Almeida,R.L., 2011]
mAU
48
Tempo (min)
em sistema HPLC
Tempo (min)
Tempo (min)
Figura 11. Espectro do padro 4-NC (250 g /mL) em sistema HPLC DAD. O
4-NC apresenta picos de absorbncia em 210 e 282 nm.
[Almeida,R.L., 2011]
49
[Almeida,R.L., 2011]
50
51
Literatura*
(270 MHz, CDCl3)
Literatura*
(22,5 MHz)
Experimental
(270 MHz,
CDCl3)
1
H
CH3 (3)
1,30 (s)
1,32 (s)
25,0
25,00
C (3)
----
43,8
43,82
CH3 (11)
1,51 (s)
1,51(s)
17,7
17,70
CH3 (11)
1,59 (s)
1,59 (s)
25,7
25,69
C (11)
----
131,4
131,33
CH3 (7)
1,67 (s)
1,67 (s)
15,9
15,93
C (7)
----
135,1
134,96
1,94 2,05
23,2
23,22
(m, 4H)
26,8
26,75
1,69 1,92
41,2
41,21
(m, 4H)
39,7
39,71
111,6
111,50
CH2 (5)
CH2 (9)
CH2 (4)
CH2 (8)
13
Experimental
(75,0 MHz)
13
CH2 (1a)
5,00
(dd, J=17,0 e 1,3 Hz)
4,98
CH2 (1b)
5,05
(dd, J=10,5 e 1,3 Hz)
5,04
CH (6)
CH (10)
5,08
124,5
124,7
124,41
124,60
5,97
147,1
147,10
6,77
119,3
119,09
6,75
114,4
114,26
6,84
143,2
143,23
C (3)
5,97
(dd, J=17,0 e 10,5 Hz)
6,78
(d, J=8,0 Hz)
6,73
(dd, J=8,0 e 2,0 Hz)
6,83
(d, J=2,0 Hz)
----
115,1
114,98
C (1)
----
141,1
140,87
C (4)
----
141,4
141,42
CH (2)
CH (5)
CH (6)
CH (2)
52
315,2318 g/mol
Massa calculada
315,2349 g/mol
Erro (ppm)
9,2291
[Almeida,R.L., 2011]
53
[Almeida,R.L., 2011]
54
Tabela
6.
Resultados de validao da
metodologia
de
quantificao do 4-NC.
[Almeida,R.L., 2011]
55
HEX
5.4
10.8
NBUT
11.43
22.86
AQ
30.30
60.60
EM
1.82
3.64
TOTAL
48.95
97.9
[Almeida,R.L., 2011]
56
Figura 16. CCD do 4-NC do extrato bruto de P.umbellata (PU) e das fraes
hexnica (HEX), emulso (EM), n-butanlica (NBUT) e aquosa (AQ). Visualizao
em 254nm, 365 nm e soluo de DPPH para avaliao da atividade antioxidante.
Fase mvel DCM:MEOH (9 1:1) .
[Almeida,R.L., 2011]
57
Figura 17. CCD do 4-NC, do extrato bruto de P.umbellata (PU) e das fraes
hexnica (HEX), emulso (EM) n-butanlica (NBUT) e aquosa (AQ.
Visualizao em 254nm, 365 nm e soluo de DPPH para avaliao da
atividade antioxidante. Fase mvel H E X :A c O E t (70:30).
[Almeida,R.L., 2011]
58
P.umbellata
8.02 0.6810
HEX
38.35 2.9802
NBUT
AQ
[Almeida,R.L., 2011]
59
[Almeida,R.L., 2011]
60
Figura 19. Cromatogramas HPLC-EQ. (d) NBUT e (e) AQ. Fase estacionria
C8 (3 m) e fase mvel metanol:gua (9:1), KCl 2 mM e LiClO 4 20 mM,
fluxo 1mL/min. Amostras de 100 g/mL.
[Almeida,R.L., 2011]
61
62
Figura 21. Cromatogramas HPLC-UV (a) 4-NC, (b) HEX, (c) NBUT e (d) AQ.
Amostras de 250 g/mL. Fase mvel MeOH:H2O (9:1). Leitura em 282 nm.
[Almeida,R.L., 2011]
63
Figura 22. Cromatogramas em 282nm do (a) 4-NC (TR= 30,087 min), (b)
frao HEX, (c) frao NBUT e (d) frao AQ. Fase mvel gradiente ACN:H 2O
(5 -100% ACN).
[Almeida,R.L., 2011]
64
e
Figura 23. Cromatograma 4-NC (1mg/mL). Fase mvel gradiente ACN:H2O
(5 -100 % ACN). Leituras em (a) 240 nm, (b) 282nm, (c) 320nm, (d) 470nm e
(e) 254nm.
[Almeida,R.L., 2011]
65
e
Figura 24. Cromatograma frao NBUT (1 mg/mL). Fase mvel gradiente ACN:H 2O
(5 100% ACN). Leituras em (a) 240 nm, (b) 282nm, (c) 320nm, (d) 470nm e
(e) 254nm.
[Almeida,R.L., 2011]
66
d
Figura 25. Cromatograma frao AQ (1mg/mL). Fase mvel gradiente ACN:H 2O (5 100 % ACN). Leituras em (a) 240 nm, (b) 282nm, (c) 320nm e (d) 470nm.
[Almeida,R.L., 2011]
67
A frao NBUT, por no conter 4-NC, foi escolhida para o subfracionamento. A amostra (1g) submetida cromatografia lquida de mdia presso
MPLC - Buchi resultou em 30 sub-fraes (50 ml cada) (Figura 2 6 ). O subfracionamento foi realizado por 5 dias consecutivos com o objetivo de obter melhor
% solvente
rendimento.
As sub-fraes foram analisadas por CCD em fase mvel MEOH: H2O (4:6)
e reveladas em 254nm e 365 nm (Figura 27).
[Almeida,R.L., 2011]
365 nm
254 nm
68
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Figura 27. CCD das sub-fraes da frao NBUT. Visualizao em 254 e 365
nm. Fase estacionria slica gel 60 e fase mvel M E OH:H2O (4:6).
[Almeida,R.L., 2011]
69
Quantidade (g)
Rendimento (%)
2.01
40.2
1.30
26.0
0.27
5.4
0.12
2.34
0.10
2.03
0.03
0.58
TOTAL
3.83
76.55
Dentre as 6 sub-fraes submetidas a anlise qualitativa por HPLCDAD, as sub-fraes D e E (Figuras 29 e 30) foram as que apresentaram picos
de maior intensidade quando analisados em HPLC DAD entre 230-240 nm. A
partir dos cromatogramas e do resultado da CCD (Figura 28), foi desenvolvido a
melhor condio de isolamento para as sub-fraes D e E (Tabela 11). O
cromatograma do isolamento dos compostos da sub-frao D est representado
na figura 31.
[Almeida,R.L., 2011]
70
[Almeida,R.L., 2011]
71
Tabela 1 1 . Fase mvel utilizada no isolamento dos compostos das subfraes NBUT D.
T (min)
% MEOH
% H2O
0-5
60
40
5.1 - 20
75
25
20.1-25
60
40
[Almeida,R.L., 2011]
72
[Almeida,R.L., 2011]
73
[Almeida,R.L., 2011]
74
[Almeida,R.L., 2011]
75
[Almeida,R.L., 2011]
76
IC50 (g/mL)
P.umbellata
232.50
299.67
HEX
67.43
1033.25
NBUT
466.50
149.35
AQ
1446.04
48.18
4NC
27.42
2541.40
TROLOX
17.44
[Almeida,R.L., 2011]
77
[Almeida,R.L., 2011]
78
[Almeida,R.L., 2011]
79
[Almeida,R.L., 2011]
80
4.11
[Almeida,R.L., 2011]
81
Figura 38. Porcentagem de clulas marcadas para CPD, 2h aps a irradiao UVB
(2 MED) em relao ao grupo controle. Mdia de 3 campos por lmina (n=3) por
grupo. * p < 0.5, ** p<0.01 e ***p<0.001.
[Almeida,R.L., 2011]
82
[Almeida,R.L., 2011]
83
Figura 40. Porcentagem de clulas marcadas para proteina PCNA, 12h aps a
irradiao UVB (2 MED) em relao ao grupo controle. Mdia de 3 campos por
lmina (n=3) por grupo. ** p<0.01 e *** p<0.001.
[Almeida,R.L., 2011]
84
Figura 41: Fotomicrografias das marcaes para PCNA aps 12h da exposio
radiao UVB 2 MED (aumento 400X). (C) - controle sem tratamento e sem
irradiao; (IR) irradiado sem tratamento; (V) veiculo tratado com gel-creme
irradiado; (PU) tratado com gel-creme contendo extrato de P.umbellata na
concentrao de 0,1% de 4-NC e irradiado, (NB) tratando com gel-creme contendo
a frao N-butanlica na concentrao 0,28% e irradiado, e (NB4NC) tratado com
gel-creme contendo frao N-butanlica adicionada de 0,1% de 4-NC e irradiado.
[Almeida,R.L., 2011]
85
Figura 42. Porcentagem de clulas marcadas para SBC, 12h aps a irradiao
UVB (2 MED) em relao ao grupo controle. Mdia de 3 campos por lmina (n=3)
por grupo. *p<0.5, **p<0.01 e *** p<0.001.
[Almeida,R.L., 2011]
86
Figura 43. Fotomicrografias das marcaes para SBC aps 12h da exposio
radiao UVB 2 MED (aumento 400X). (C) - controle sem tratamento e sem
irradiao; (IR) irradiado sem tratamento; (V) veiculo tratado com gel-creme
irradiado; (PU) tratado com gel-creme contendo extrato de P.umbellata na
concentrao de 0,1% de 4-NC e irradiado, (NB) tratando com gel-creme contendo
a frao N-butanlica na concentrao 0,28% e irradiado, e (NB4NC) tratado com
gel-creme contendo frao N-butanlica adicionada de 0,1% de 4-NC e irradiado.
[Almeida,R.L., 2011]
87
Figura 44. Porcentagem de clulas marcadas para proteina p53, 12h aps a
irradiao UVB (2 MED) em relao ao grupo controle. Mdia de 3 campos por
lmina (n=3) por grupo. ** p<0.01 e ***p<0.001.
[Almeida,R.L., 2011]
88
Figura 45: Fotomicrografias das marcaes para p53 aps 12h da exposio
radiao UVB 2 MED (aumento 400X). (C) - controle sem tratamento e sem
irradiao; (IR) irradiado sem tratamento; (V) veiculo tratado com gel-creme
irradiado; (PU) tratado com gel-creme contendo extrato de P.umbellata na
concentrao de 0,1% de 4-NC e irradiado, (NB) tratando com gel-creme contendo
a frao N-butanlica na concentrao 0,28% e irradiado, e (NB4NC) tratado com
gel-creme contendo frao N-butanlica adicionada de 0,1% de 4-NC e irradiado.
[Almeida,R.L., 2011]
89
Figura 46. Porcentagem de clulas marcadas para proteina p21, 12h aps a
irradiao UVB (2 MED) em relao ao grupo controle. Mdia de 3 campos por
lmina (n=3) por grupo. *** p<0.001.
[Almeida,R.L., 2011]
90
Figura 47. Fotomicrografias das marcaes para p21 aps 12h da exposio
radiao UVB 2MED (aumento 400X). (C) - controle sem tratamento e sem
irradiao; (IR) irradiado sem tratamento; (V) veiculo tratado com gel-creme
irradiado; (PU) tratado com gel-creme contendo extrato de P.umbellata na
concentrao de 0,1% de 4-NC e irradiado, (NB) tratando com gel-creme contendo
a frao N-butanlica na concentrao 0,28% e irradiado, e (NB4NC) tratado com
gel-creme contendo frao N-butanlica adicionada de 0,1% de 4-NC e irradiado.
[Almeida,R.L., 2011]
91
[Almeida,R.L., 2011]
92
4.14
[Almeida,R.L., 2011]
93
100 g/ mL
PM
HT1080
PU
IR24h
4NC
BUT
HEX
AQ
BUT+4NC AQ+4NC
106,9 kDa
93,6 kDa
52,2 kDa
160
MMP 2 ATIVA
% atividade
120
*
*
80
**
40
0
IR
PU
4-NC
HEX
NBUT
AQ
NBUT+4NC
AQ+4NC
MMP 9 ATIVA
% atividade
160
120
80
40
0
IR
PU
4-NC
HEX
NBUT
AQ
NBUT+4NC
AQ+4NC
94
100 g/ mL
PM
HT1080
PU
4NC
HEX
BUT
AQ
BUT+4NC
AQ+4NC
106,9 kDa
93,6 kDa
52,2 kDa
120
% atividade
90
60
MMP 2 ATIVA
**
**
**
30
0
HT1080
PU
4-NC
HEX
NBUT
AQ
NBUT+4NC
AQ+4NC
% atividade
120
90
***
60
***
***
30
0
HT1080
PU
4-NC
HEX
NBUT
AQ
NBUT+4NC
AQ+4NC
95
[Almeida,R.L., 2011]
96
5. DISCUSSO
2007).
[Almeida,R.L., 2011]
97
A forma de uso das plantas medicnais pode ser dividida em: (1)
constituintes puros isolados e (2) mistura complexa de vrios constituintes, como
as infuses, leos essenciais, tinturas, extratos ou material particulado em
diferentes preparaes galnicas (HAMBURGER & HOSTTETMANN, 1989).
Para a obteno de compostos naturais farmacologicamente ativos, o
processo de isolamento e identificao dos compostos naturais requer
padronizao para (1) garantir a dose efetiva do princpio ativo, (2) manuteno
do controle de composio e (3) estabilidade do princpio ativo (HAMBURGER &
HOSTTETMANN, 1989). A aplicabilidade destes objetivos depende da escolha
dos processos de obteno e anlise empregados.
As
metodologias
aplicadas
em
fitoqumica
abrangem
tcnicas
98
de
flavonides
glicosilados,
taninos,
saponinas e
carboidratos
99
100
101
[Almeida,R.L., 2011]
102
103
[Almeida,R.L., 2011]
104
105
comparao ao grupo irradiado (Figura 41). A marcao para a proteina p53 teve
reduo significativa (20%) para os grupos veiculo e PU, entretanto a marcao
para a proteina p21 mostrou reduo significativa (38%) apenas para o grupo
NBUT+4NC comparado ao grupo irradiado (Figuras 44 e 45).
106
ainda
desconhecidos,
que
pudessem
apresentar
atividade
107
108
109
[Almeida,R.L., 2011]
110
[Almeida,R.L., 2011]
111
112
113
[Almeida,R.L., 2011]
114
6. CONCLUSES
1. O fracionamento do extrato de raiz de P.umbellata resultou em 3 fraes:
hexnica (HEX), n-butanlica (NBUT) e aquosa (AQ), sendo as duas ltimas
isentas de 4-NC, satisfazendo o primeiro objetivo do projeto.
2. A avaliao da atividade antioxidante das fraes por DPPH e ORAC
demonstrou uma atividade significativa para a frao NBUT, embora inferior ao
da frao HEX, que contm o 4-NC, assim como a presena de compostos
fenlicos. Entretanto no foi detectada a presena de flavonides nas fraes
obtidas a partir do extrato bruto de raiz de P.umbellata.
3. Em relao ao experimento de avaliao da atividade fotoprotetora sob
exposio aguda radiao UVB, o sistema antioxidante da pele aps 12h
mostrou-se
insuficente
para
repor
os
nveis
basais
depletados
em
115
[Almeida,R.L., 2011]
116
7. REFERNCIAS
ABBAS,T., DUTTA, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat.
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Validao
de
metologias
analticas
para
[Almeida,R.L., 2011]
131
K.;
WLASCHEK,
M.;
BRENNEISEN,
P.;
[Almeida,R.L., 2011]
132
the
analysis
of
matrix
metalloproteinases
and
their
inhibitors.
133
expression
in
mouse
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J.
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Investigative
[Almeida,R.L., 2011]
134
Structure,
Function,
and
Biochemistry.
Circulation
JOHNSON,
K.J.;
VARANI,
J.
Matrix metalloproteinases in
acute
[Almeida,R.L., 2011]
135
8. ANEXO
[Almeida,R.L., 2011]
136
[Almeida,R.L., 2011]
137
Pot-pourri:
Entrei de gaiato no navio... entrei, entrei, entrei por engano.... .... shake, shake, shake..... .....eu s quero saber do que pode dar certo,
(Paralamas do sucesso)
(Paralamas do sucesso)
(Sergio Reis)
(Raul Seixas)
[Almeida,R.L., 2011]
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