Universidad Nacional de Ingeniera

Microbiologa Sanitaria I
Facultad de Ingeniera Ambiental

Laboratorio N 5

ACCION
BACTERIOSTATICA
SELECTIVA DEL
CRISTAL VIOLETA
ACCION
OLIGODINAMICA DE
METALES PESADOS

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Laboratorio N 5

1.- Objetivos
Accion bacteriosttica selectiva del cristal violeta
- Aprender como es el comportamiento y a quienes afecta ms el cristal violeta.
- Definir lo que son los gram positivos y gram negativos.
- Comprobar a qu tipo de placas (definidas por sus concentraciones), afecta el
cristal violeta y a cules no.
Accin oligodinmica de metales pesados
- Reconocer como son las caractersticas en el comportamiento de los metales frente
a agentes bacterianos.
- Comprobar experimentalmente las zonas en donde hay desarrollo bacteriano.
- Fundamentar cuales son las principales razones por la cual puede haber mayor
crecimiento bacteriano y en otras menor.
2.- Fundamento Teorico
Cristal violeta
El cristal violeta es el colorante primario de la coloracin de gram que se adhiere a la
pared celular bacteriana, las bacterias gram positivas absorben este colorante
porque tienen mayor porcentaje de acido teicoico en su estructura y por eso
adquieren un color
violeta en el microscopio,
por lo tanto como
colorante
primario
cumple como funcin
permitir la identificacin
de bacterias cuya
estructura y composicin
de pared celular se
encuentre
mayor
proporcin
y
distribucin de cido
teicoico.

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Bacterias Gram positivos

Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tien
de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram. Esta caracterstica qumica est
ntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo
natural de organizacin bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias.
La envoltura celular de las bacterias Gram positivas comprende la membrana
citoplasmtica y
una pared
celular compuesta
por
una
gruesa
capa
de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana
citoplasmtica
mediante
molculas
de cido
lipoteicoico.
La
capa
de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable
de retener el tinte durante la tincin de Gram. A diferencia de las Gram positivas, las
Gram negativas presentan una segunda membrana lipdica externa a la pared
celular.
Incluyen
especies
tanto
mviles
como
inmviles
con
forma
de bacilo (Bacillus, Clostridium, Corynebacterium,Lactobacillus, Listeria)
o coco (Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas.
Algunas especies son fotosintticas, pero la mayora son hetertrofas. Realmente,
no todas las bacterias del grupo son Gram positivas (no se tien por la aplicacin de
ese mtodo), pero se incluyen aqu por su similitud molecular con otras bacterias
Gram positivas.
Las bacterias gram positivas contienen un porcentaje muy bajo de lpidos y sus
paredes celulares son mayores que las gram negativas, por su composicin diferente
(bajo contenido lipdico) se deshidratan durante el tratamiento con alcohol, los poros
disminuyen, la permeabilidad se reduce y no se logra extraer el complejo CV-1
(yodo).

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Las bacterias gram positivas difieren de las gram negativas en varias caractersticas
muy aparte de la tincin.
Por
ms

lo

general,

susceptibles a la penicilina y menos a la desintegracin por mtodos mecnicos o

exposicin a algunas enzimas que las bacterias gram negativas.

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Bacterias Gram negativos

Se denominan bacterias gram negativas a aquellas bacterias que no se tien
de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram, y lo hacen de un
color rosado tenue. Esta
caracterstica
est
ntimamente
ligada
a
la
estructura didrmica dada por la envoltura celular, pues presenta doble membrana
celular (una externa y la otra citoplasmtica), lo que refleja un tipo natural de
organizacin bacteriana. Son uno de los principales sper grupos de bacterias
Las bacterias Gram negativas presentan dos membranas lipdicas entre las que se
localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram
positivas presentan slo una membrana lipdica y la pared de peptidoglicano es
mucho ms gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tincin de
Gram.

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Las bacterias gram negativas pierden el cristal violeta y por el contraste de la

safranina aparecen rojas. Contienen un porcentaje ms alto de lpidos que las
bacterias gram positivas. Las paredes celulares de las bacterias gram negativas son
tambin ms delgadas que de las gram positivas. Hay pruebas experimentales en el
sentido de que el tratamiento con alcohol extrae lpidos con lo cual se aumenta la
porosidad o permeabilidad de la pared celular gram negativa. As el complejo cristal
violeta yodo (CV-I) puede extraerse en los organismos gram negativos y de esta
manera se destien.
Los poros en el peptidoglucano de las bacterias gram negativas despus del
tratamiento con etanol quedan lo suficientemente grandes para permitir que se
extraiga el complejo CV-I.
Dentro del grupo de las bacterias Gram-negativas podemos distinguir dos
subgrupos: Eobacteria y Glycobacteria que se distinguen por la composicin de la
membrana externa. En los primeros, la membrana externa presenta solo simples
fosfolpidos, mientras que en los segundos adems presenta la insercin de
molculas complejas de lipopolisacridos.

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Estafilococos
Se dividen en tres planos irregulares, formando racimos de cocos. Morfolgicamente
los Staphylococcus son cocos gram positivos. Los estafilococos crecen fcilmente
sobre casi todos los medios bacteriolgicos, en cultivos su crecimiento es mejor en el
medio sal manitol y agar sangre.
Es un coco anaerobio facultativo, esto significa que puede crecer tanto en
condiciones con oxgeno como carente de ste. Su mayor velocidad de crecimiento
es a 5 - 25 C; pero tambin se puede ver en activa fisin binaria entre 30 y 27 C.
Adems, producen catalasa, lo que los diferencia de los estreptococos.

Estreptococos
Es un grupo de bacterias formado por cocos gram positivos, se dividen en planos
paralelos y quedan unidos para formar cadenas.
Los estreptococos se subdividen en grupos mediante anticuerpos que reconocen a
los antgenos de superficie. Estos grupos incluyen una o ms especies. Las
agrupaciones de estreptococos ms importantes son A, B, y D. Entre los grupos de
estreptococos, la enfermedad contagiosa es causada por el grupo A, el cul se
enfatiza aqu. Streptococcus pneumoniae (es la causa principal de pulmona
humana), Streptococcus mutans y otros estreptococos llamados viridans (entre las
causas de caries dental) no pertenecen a grupos antignicos.

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Despus del crecimiento de estreptococos en agar con sangre de oveja se observan

tres tipos de reaccin de hemlisis. La hemlisis alfa se refiere a una lisis parcial de
eritrocitos que produce una coloracin verde que se observa alrededor de las
colonias la hemlisis beta se refiere a un halo de hemlisis completamente claro y la
hemlisis gama se refiere a la ausencia de hemlisis. Los estreptococos del grupo A
y B son beta hemolticos.

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Estreptobacilos
Estreptobacilo describe una cadena de bacterias con forma de varillas unidas
de punta a punta. Esto da como resultado una vez ms clulas bacterianas que
fallan por completo en separarse despus de dividirse, como se ha visto con la
bacteria diplobacilo.

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Accin oligodinmica
Ciertos metales pesados. Su accin se denomina oligodinmica, es decir son activos
en muy bajas concentraciones (ppm). Inactiva especficamente enzimas claves al
reaccionar con grupos SH. Son muy txicos y su actividad disminuye con la
existencia de fluidos biolgicos.
Plata: Nitrato de plata. Antisptico. Lavan los ojos de recin nacidos, en casos
concretos, para evitar la ceguera, se usa cuando la madre est infectada de
Neisseria gonorrea.
Mercurio: Cloruro de mercurio. ste elemento es altamente txico y es inefectivo
con materia orgnica, pero afecta a muchos microorganismos. El mercurocromo es
menos txico pero menos efectivo con materia org- nica.

Cobre: Sulfato de cobre. Se usa como alguicida en piscinas. Se adiciona a pinturas

para evitar hongos.
Zinc: Cloruro de zinc en colutorios bucales. El oxido de zinc es antifngico en
pinturas. En general ocasionan problemas medioambientales.

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3.- Procedimiento

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Accin bacteriosttica selectiva del cristal violeta

Paso 1:
-

Preparamos el agar nutritivo fundido estril e introducirlo en los tubos de ensayo.

Pipeteamos 1 ml de cristal violeta 1:1000 de concentracin, para luego introducirlo a
9ml de agua destilada.
Ahora la concentracin es de 1:10000, pipeteamos 1ml y lo vertemos a un tubo de
9ml de agua destilada
Tenemos ahora una concentracin de 1:100000 hacemos el mismo paso anterior
pipeteando 1ml para introducirlo a otro tubo de 9ml de agua destilada
Luego tenemos una concentracin de 1:1000000.
Con las concentraciones obtenidas durante la dilucin 1:1000, 1:10000; 1:100000,
1:1000000 trabajaremos con las placas petri.

Paso 2:
-

Vertemos el agar nutritivo en las cuatro placas petri.

Dividimos en dos secciones las cuatro placas petri, sea A y B.
Con los cultivos A y B del anterior laboratorio (Hidrolisis del Almidn) inoculamos
una muestra del cultivo A y B, con el mtodo de estras lo esparcimos a la placa sin
colorante cada uno respectivamente.
Pipeteamos 1 ml de la concentracin de 1:10000 y lo vertemos a una placa petri para
ello se debe expandir uniformemente el lquido; inoculamos muestras de los cultivos
A y B. Luego con el mtodo de estras lo esparcimos.
Nuevamente pipeteamos 1 ml ahora de la concentracin de 1:100000 y lo vertemos a
otra placa petri (expandir uniformemente). Inoculamos de los cultivos A y B. Expandir
con el mtodo de estras cada cultivo con la seccin respectiva.
Luego del tubo de concentracin 1:1000000 pipeteamos 1ml y lo vertemos a una
placa petri expandimos e inoculamos de los cultivos A y B, por el mtodo de estras
expandimos en cada una de las secciones respectivamente divididas.
Finalmente invertir las placas e incubarlas a 37C por 48 horas.

Accin oligodinmica de metales pesados

-

Se sumerge la moneda en una solucin de 10% de cido Ntrico.

Lavar la moneda con agua destilada, con una pinza.
Colocar la moneda en el centro de una placa petri.
Inocular una o dos gotas de cultivo A en un tubo con agar nutritivo.
Rotar el tubo para obtener una distribucin uniforme.
Verter el agar inoculado dentro de la placa petri que contiene la moneda.
Dejar que solidifique.
Incubar la placa a 37C por 48 horas.

4.- Resultados

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Laboratorio N 5

Accin bacteriosttica selectiva del cristal violeta

Tabla N 1
Concentra
cin
1/10,000
1/100,000
1/1'000,00
0
Sin
colorante

Grupo N1
A
B
+
+
-

Grupo N2
A
B
+
+

Grupo
A
+
+

N3
B
+
+

Grupo N4
A
B
+
+

Grupo
A
+
+

N5
B
+
+

(+) Hay crecimiento

(-) No hay crecimiento
Tabla N 2
Grupo
N 1
N 2
N 3
N 4
N 5

Colonia "A" Colonia "B"

Gram (+)
Gram (+)
Estafilococo Estreptococo
Gram (+)
Gram (+)
Diplococos
Estreptococo
Gram(+)
Gram (+)
Estreptobacilo Estafilococo
Gram (-)
Gram (+)
Estafilococo
Diplococos
Gram (-)
Gram (-)
Bacilo
Estafilococo
Tabla N 3

CONCENTRA
CION

E. COLI (-)

E. SUBTILIS
(+)

1:10 000

(-)

(-)

1:100 000

(+)

(+)

1:1 000 000

(+)

(+)

SIN
COLORANTE

(+)

(+)

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5.- Discusiones

Laboratorio N 5

- Los resultados obtenidos en las diferentes concentraciones de los grupos tuvieron

algunas incongruencias ya que por ejemplo en la concentracin de 1:100000 solo
afecta a los gram positivos mas no a los gram negativos y durante el laboratorio la
mayor cantidad de grupos obtuvo crecimiento (+), lo cual no debera haber ya que el
cristal violeta no deja desarrollar a las bacterias gram positivas lo que no permite su
desarrollo.
- Cuando se escogi la placa petri con mayor desarrollo se complet la tabla N 2,
donde tambin hubo incongruencias ya que durante la observacin en el microscopio
hubo grupos que colocaron a los estafilococos en el grupo de los gram negativos, lo
cual segn algunas investigaciones los estafilococos son del grupo gram positivos.
- Tambin se vio que se colocaron cocos en la observacin del microscopio lo cual
no viene a ser una agrupacin.
- En la Accin oligodinmica de metales pesados hubo grupos en la cual no se
observ las zonas establecidas en las instrucciones del laboratorio como la zona de
crecimiento, zona de estimulacin y zona oligodinmica.

6.- Conclusiones

Accin bacteriosttica selectiva del cristal violeta

- Los cristal violeta afecta ms a los gram positivos, ya que debido a su estructura
qumica de la superficie y a la diferencia de permeabilidad entre los dos grupos de
bacterias estas se tien de color purpura violeta, cuando se realiza la tincin de
Gram.
- Las bacterias gram positivos y gram negativos difieren en su composicin de la
pared celular, susceptibilidad a la penicilina inhibicin a colorantes como el cristal
violeta, necesidades nutritivas y a la resistencia a la desintegracin por medios
fsicos, estos son algunos parmetros de estas dos tipos de bacterias.
- Por las concentraciones obtenidas durante la dilucin se obtuvo lo siguiente:
1:10000 afecta a ambos sean gram positivos o gram negativos.
1:100000 solo afecta a los gram positivos.
1:1000000 no afecta a ninguno.

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Accin oligodinmica de metales pesados

- En los metales se puede decir que depende de su composicin para que pueda
darse su accin frente a las bacterias.
En nuestro caso los grupos utilizaron diferente moneda en la cual la moneda ms
antigua debi tener una zona oligodinmica observable y tener mayor concentracin
de bacterias en la zona de estimulacin como tambin caracterizarse por la zona de
crecimiento normal.
- Para el crecimiento de las bacterias, en la Accin oligodinmica de metales
pesados, se debe tener en cuenta diversas razones para un futuro crecimiento
bacterial, como: la aleacin de los metales que lo conforman, la antigedad del
metal, la forma en cuanto est contaminada, su forma de desinfeccin entre otras.
7.- Recomendaciones

- Durante la tincin de Gram, cuando inoculamos la bacteria de nuestra muestra, se

debe esparcir bien la bacteria para que cuando se observe en el microscopio, se
pueda dar un buen reporte.
- Para la deteccin de bacterias en el microscopio se debe realizar una buena tincin
de Gram, por la cual en el anlisis se darn buenos resultados.
- Durante el proceso de elaboracin de las placas petri con los cultivos A y B se
recomienda realizar la inoculacin con el mtodo de estras para que se pueda
observar un mejor desarrollo bacterial.
- Para que haya mejores resultados en la accin oligodinmica se tiene que cumplir
algunos pasos que se dieron en el laboratorio como la desinfeccin de la moneda
con cido ntrico.
- Durante la accin oligodinmica de los metales pesados, para que haya un mejor
crecimiento se debi haber hecho un mejor esparcimiento de la muestra del liquido
bacterial es por ello que habr una mejor zona oligodinmica, de estimulacin y de
crecimiento normal.

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8.- Referencia biblografica

Laboratorio N 5

Biologa de los microorganismos Brock. 10ma edicin.

Microbiologa Richard A. Harvey, Pamela C. Champe, Bruce D. Fisher. 2 da

edicin

Bacteriologa A.J. Salle. Version de la 4ta edicin norteamericana.

Microbiologa Clnica Prctica Pedro Garca Matos, Fernando Paredes

Salino, Mara Fernndez del Barrio.

Anexos
Resultados del grupo N 2

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Accin oligodinmica de los metales pesados

Grupo N 1

Grupo N

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Grupo N 3

Grupo N 4

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Grupo N 5

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

Laboratorio N 5:
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Curso: Microbiologa Sanitaria

Alumno: Valenzuela Contreras Luis Edwardo
Cdigo: 20132654B