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Aislamiento, Caracterizacin y Anlisis del Potencial

Biotecnolgico de una bacteria nativa del Rio Chiguata


Anghela Arviri, Henry Alonso Mamani
Contreras, Kelly Evelyn Tejada Perfecto
Escuela
Profesional
de
Ingeniera
Sanitaria, Curso
de Microbiologa,
IV
semestre,
Universidad

Nacional de San Agustn


Resumen:
La presente investigacin tuvo como objetivo poder aislar, caracterizar e identificar el principal
potencial biotecnolgico de una nueva cepa bacteriana en lugares donde la actividad humana sea
poco frecuente, como lo son terrenos de cultivos y crianza de Ganado es as que se encontr la
cepa anloga al gnero AEROMONA de cdigo KHA122506UNSA-SANITARIA_27F, una vez
aislada y purificada mediante 5 repiques sucesivos, se realiz la extraccin de su ADN mediante
el mtodo del fenol - cloroformo, para luego realizar una electroforesis y comprobar la extraccin,
posteriormente la cepa bacteriana fue identificada por anlisis de la secuencia del gen rRNA
16S, finalmente se realiz un anlisis bioinformtico haciendo uso del BLAST de la base de datos
del NCBI, identificando que una de sus potenciales aplicaciones biotecnolgicas es:
_____________________
Palabras Clave: Chiguata, cepa bacteriana, Aeromona,Aeromona salmonicida extraccin de
ADN, bioinformtica, biosntesis.
Abstract:
This study aimed to isolate, characterize and identify the main biotechnological potential of a new
bacterial strain in places where human activity is rare, as are croplands and livestock breeding so
that the analogous strain was found to gender Aeromona of KHA122506UNSA-SANITARIA_27F
code, once isolated and purified by five successive rings, the extraction of the DNA was performed
by the method of phenol - chloroform to then perform electrophoresis and check extraction,
subsequently the bacterial strain was identified by sequence analysis of 16S rRNA gene, finally a
bioinformatic analysis using the BLAST of NCBI database, identifying that one of its potential
biotechnological
applications
is
performed:
_____________________________________________
Key words: Chiguata, bacterial strain, Aeromona, Aeromona salmonicida DNA extraction,
bioinformatics, biosynthesis.
Introduccin
En la naturaleza, los microorganismos se
encuentran formando poblaciones mixtas con
otros tipos de microorganismos. Los cultivos
de estas mezclas se llaman por ello cultivos
mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los
microorganismos se consigue mediante el
estudio de cepas aisladas, cultivadas en el

laboratorio en cultivos puros (o axnicos). En


ocasiones el estudio molecular conduce a la

caracterizacin de los microorganismos, an


en poblaciones mixtas. Sin embargo la
identificacin bacteriana y la caracterizacin
completa solo es posible tras el aislamiento
de la bacteria y la obtencin de cultivos
puros. Por ello el primer problema al estudiar
es posible obtener la bacteria de inters en
cultivo puro.
Aislamiento es la separacin de un
determinado microorganismo del resto de
microorganismos que le acompaan. El
mtodo ms usual es la siembra por estra
sobre un medio de cultivo slido adecuado
dispuesto en una placa de Petri.
El xito del aislamiento, de la separacin
sobre el medio de cultivo, depende de la
superficie sobre la que se ha distribuido la
muestra. Es muy importante realizar el mayor
nmero de estras posible. En las primeras
estras aparecern colonias confluentes o
una masa continua de microorganismos. En
las estras finales debern aparecer colonias
separadas unas de otras. El aislamiento
requiere un reducido inculo de partida. La
sucesiva disminucin del tamao de la
poblacin sobre el asa (por descarga sobre el
medio de cultivo) al recorrer el medio de
cultivo, debe asegurar que finalmente
algunas clulas queden suficientemente
separadas (aisladas unas de otras) sobre la
superficie.
Materiales y Mtodos
Obtencin
Muestra

de

la

Para la obtencin de las muestras nos


ubicamos en la zona con mayor efluente del
rio,teniendo las precausiones pertinentes una
ves ahi tomamos la muestra en el centro de
la corriente de agua y a una profundidad de
medio metro abriendo el envase dentro del
agua
para
no
contaminarlo
con
microorganismos del aire y asi obtener una
muestra pura del rio , luego conservamos en
un culer hasta llevarla al laboratorio.
Preparacin
muestras

de

las

De la muestras extradas se obtuvo 10 ul y


lo depositamos en un tubo Eppendorf con

una bacteria es su aislamiento del resto de


los microorganismos presentes (enn una
muestra patolgica, de agua, de suelo,
dealimentos, etc.). Una vez que se ha
logrado el aislamiento
1ml de solucin de Triton a 0.01%,El tubo
Eppendorf se le somete al vortex por 5
minutos.
Con un asa de Cole sembramos el
sobrenadante en una placa Petri en un
medio acondicionado para bacterias. Agar
Nutritivo.

Realizacin
Repiques

de

Se extrajo una colonia alejada de la primera


siembra. La depositamos en tubo Eppendorf
con 1 ml o 0.5 ml de Triton y se le llev al
vortex por 5 minutos, luego se sembr con
una asa de Cole a una nueva placa. Se
realiz un total de 6 repiques siguiendo el
mismo procedimiento.
Extraction de DNA
Disrupcin
celular

las protenas interferentes. La muestra se


llev al Vortex por 20 segundos.
Seguidamente se centrifug a 1200 rpm por 5
minutos, se recuper el sobrenadante
correspondiente al ADN, en un nuevo tubo
eppendorf.
Concentracin de DNA
Se aadi 800 L de Isopropanol para
concentrar el ADN disperso. Se centrifug 3
minutos, se elimin el sobrenadante
obteniendo finalmente un pellet.
Lavado

Con ayuda de un asa se extrajo una porcin


del cultivo de microrganismos del ltimo
repique realizado. La muestra fue colocada
en un Eppendorf con 0.1L de beads con
500L De buffer TE. Se llev al vortex por 5
minutos para que los beads destruyan la
pared celular y el ADN se extraiga
fcilmente.

Se agreg 500 L de Etanol al 75 % al pellet


conseguido. Se centrifugo por 1 minuto. Se
elimin el sobrenadante y se aadi 100 L
de Buffer TE al pellet obtenido, se almacen
la muestra en refrigeracin a 4C.

Eliminacin
protenas

se procedi a cargar el gel de agarosa con


nuestra muestra obtenida para as evidenciar
nuestra extraccin.

de

Se aadi 500 L del compuesto FenolCloroformo Alcohol Isoamlico para eliminar

Identificacin
Electroforesis

por

Preparacin de gel de agarosa al 1.5%


Se pes 0.3g de agarosa y se disolvi en 20
mL de buffer TAE 1x en un Erlenmeyer de
200 ml de capacidad, calentndolo hasta
ebullicin para lograr una disolucin
completa. Enfriar hasta aproximadamente 45
C, aadir
5 uL de SYBR safe ADN gel stain y se
vaci sobre un molde y en posicin
horizontal, finalmente se coloc una peineta
para formar los pocillos y se dej enfriar
durante 30 minutos.

Fig. 1.
Colonia
bacteriana aislada del suelo de MAJES.

Colocacin del ADN en el gel de Agarosa


Una vez que se mezcl el ADN con el Loding
Buffer, se sumergi la placa de agarosa en la
camara electrofortica y se aplic 120 V por
20 minutos para que los componentes corran
a lo largo del gel de agarosa. Despus se
observ en un cuanto oscuro con
transiluminacin en una lmpara UV.
Secuenciacin del gen rRNA 16s de la
bacteria 42-FER_27F
Una vez comprobada la extraccin de ADN,
se procedi a realizar una amplificacin del
gen RNA 16s por el mtodo de
PCR, el
producto obtenido se purific y se envi a
secuenciar.
La
empresa
Functional
Bioscience fue la encargada de secuenciar
el ADN.

Fig.2. Vista al microscopio de la colonia


bacteriana aislada
Anlisis Bioinformtico por BLAST del
NCBI
Luego de haber obtenido la secuencia y
realizado el anlisis bioinformtico por
BLAST, se determin que la cepa aislada
comparte un alto porcentaje de similitud
(99%) con aeromona salmonicida
La Fig. 4 presenta los resultados del anlisis.

Anlisis Bioinformtico por BLAST del


NCBI
Para el anlisis bioinformtico se hizo uso de
la base de datos BLAST del NCBI, insertando
la
secuencia
de
ADN
Obtenidas
anteriormente.
Resultados
Caractersticas
culturales

Morfolgicas

La bacteria aislada presento las siguientes


caractersticas: Forma Puntiforme circular,
Borde Redondo-Entero, Elevacin de la
colonia Convexa, Consistencia Cremosa,
Superficie Lisa, Pigmentacin Amarilla
Cremosa
El potencial de biorremediacin

Fig. 4. Anlisis por BLAST de la bacteria


asilada, se puede apreciar que nuestra
bacteria aislada comparte una alta homologa
con la bacteria aeromonad sp..

Es una bacteria que se encarga de degradar


herbicidas o pesticidas, y que adems soporta
altas temperaturas por haberse encontrado en
el desierto.

3.

El procedimiento que se va a realizar en el


proyecto

4. Todd
A.
Cameron,Peptidoglycan
Synthesis
Machinery
in
Agrobacterium
tumefaciensDuring
Unipolar Growth and Cell Division.
American
Academy
of
Microbiology.2014.

Segn los datos tomados como referencia de


un papper el mecanismo para la remediacin
de suelos contaminados con pesticidas sera
el siguiente:
Cultivar en agar nutritivo que contiene diurn
(20 mg ml -1 ) a 25 C durante 3 das. Las
clulas se suspendern en solucin mnima
sales, y 5 ml se aadi a 250 g (peso
hmedo) de suelo para producir una densidad
de inoculacin de 1,2 10 7 CFU g de suelo
-1.
Conclusiones
1.

Se aisl una nueva bacteria obtenida


de los suelos del distrito de Yura,
asignndole el cdigo 42-FER_27F.

2. Se
identific
mediante
la
secuenciacin
en
FunctionalBioscience
correspondiendo
al
Genero
Agrobacterium siendo su mayor
homlogo
al
99%
Agrobacteriumtumefaciens.
3.

Se reconoci uno de sus potenciales


biotencolgicos como una bacteria
sintetizadora de peptidoglicano.

Bibliografa
1. http://www.pomif.com/pages/practica
s/bacteriologia/aislamiento
2. Extraccion y purificacin de DNA
(mtodo fenol cloroformo) http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/
manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B
3n4.pdf

5.

Sook-Young Park, Agrobacterium


tumefaciens-Mediated
Transformation
ofthe
Lichen
Fungus,Umbilicariamuehlenbergii

Alberts, B., et al. Molecular Biology of


the Cell, 5th ed.,Garland Pub., 2007.
[Biologa molecular de la clula (4
ed.). Omega, 2004 (2002)].

6. Lodish, H., et al.Molecular Cell


Biology, 5th ed., W. H. Freeman,
2004. [Biologa celular y molecular (5
ed.). Editorial mdica panamericana,
2005 (2004)]