Cultivo in-vitro como herramienta para la preservacin de

orqudeas.
Medina-Hernndez, J.D.1, Montilla-Alvarez, T.A.1, Muoz-Ramrez, J.S.*1 & Ramos-Sanabria,
F.L1.
1
Curso de metodologa de la Investigacin, Estudiante de Pregrado, Programa de Biologa,
Facultad de Ciencias, Universidad del Tolima, Tolima, Ibagu, Colombia.
* jsebas241@gmail.com
1. Introduccin:
El cultivo in vitro (trmino que literalmente significa en vidrio), incluye diferentes tcnicas
destinadas a multiplicar, entre otros, material vegetal o animal. El cultivo de tejidos
vegetales involucra a diferentes tcnicas para propagar material vegetal diverso, incluyendo
protoplastos (clulas desprovistas de su pared celular), clulas, tejidos, rganos y plantas
completas. Este tipo de cultivo consiste en tomar una porcin de la planta (explante) y
proporcionarle artificialmente un medio de cultivo nutritivo esterilizado, que permita
regenerar una o muchas plantas; las condiciones de asepsia y el poder controlar el
crecimiento de los explantes hacen de este mtodo una herramienta muy importante para la
propagacin masiva de plantas en vas de extincin, o plantas recalcitrantes o para clonar
individuos que tienen caractersticas agronmicas y ornamentales deseables (mejores frutos,
resistentes a las sequas, colores de la flores, etc.), donde las primeras experiencias
relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902 (Stewart & Kane, 2006).
Otras numerosas aplicaciones del cultivo in vitro en plantas han sido: la obtencin de plantas
libres de virus, produccin de semillas sintticas, conservacin de germoplasma, obtencin
de metabolitos secundarios, produccin de nuevos hbridos, mejora gentica de plantas,
entre otros.
Las aplicaciones del cultivo in vitro en orqudeas tiene como principal uso la conservacin
en germoplasma, adems, las plantas producidas de esta manera son de gran inters para los
programas de reintroduccin de especies nativas en reas de preservacin del medio
ambiente (Araujo, 2004). Por ejemplo, en 1922 que se logr el primer experimento exitoso
con germinacin in vitro de semillas de orqudeas (Knudson, 1922). Ya que la familia
Orchidiaceae es una de las ms diversas dentro del reino vegetal debido a su extensa
variedad de especies (Giovanny Giraldo, 2012), existen clculos aproximados de 26.000
especies de orqudeas a nivel mundial, de las cuales, Colombia alberga aproximadamente un
15% (Betancur, 1988); la diversidad de ecosistemas presentes en la geografa colombiana,
favorece la ecologa de las orqudeas dando lugar a especies exticas y endmicas.
Actualmente se cree que existen 4.030 especies, agrupadas en 260 gneros, distribuidos en
la regin Andina (87,2%), Pacfica y Amaznica (10,6%), Caribe y Orinoquia que presentan
los valores ms bajos en trminos de riqueza y abundancia (5% y 4%, respectivamente)
(Andrade-C, 2011).

Adems, algunas especies de orqudeas han sido catalogadas como bioindicadores del nivel
de la fragmentacin o integridad de las comunidades vegetales de las que forman parte,
especialmente las que poseen un hbito terrestres (Daz, 2009) puesto que son sensibles a
los cambios ambientales, la destruccin del hbitat, la contaminacin y las aplicaciones de
plaguicidas, debido a que requieren condiciones especiales como la Microbiota del suelo y
la permanencia de la flora autctona para su supervivencia (Janeckova et al., 2006) y varias
especies de esta familia de plantas presentan gran importancia ornamental y comercial
debido a la diversidad de formas, tamaos y colores de sus flores; adems, algunas tienen
gran importancia industrial, como lo es Vanilla planifolia cuyas cpsulas son utilizadas en
la fabricacin de licores, bebidas, cosmticos y aromatizantes (Beltrn & Martnez, 1996) y
los gneros Bletia y Cyrtopodium cuyos pseudobulbos son usados para la creacin de
pegamentos (Vinccon & Cetzal, 2013); incluso, a algunas especies de la familia
Orchidiaceae se les han atribuido propiedades curativas debido a sus fragancias por medio
de tcnicas de aromaterapia. (Beltrn & Martnez, 1996)
No obstante, la germinacin de las orqudeas en estado silvestre necesitan de agentes
externos como son los hongos, especialmente de la especie (Rhizoctonia sp.) para obtener
un porcentaje alto de germinacin determinando una relacin simbitica semilla-hongo
(jijn- meristemo de orqudea), esto debido a la ausencia de e endospermo en sus semillas,
que es un factor limitante para su desarrollo y supervivencia in vivo (Salazar-Mercado,
2012).
Aun cuando algunas especies sean abundantes localmente, la familia Orchidiaceae tiene el
mayor nmero de especies amenazadas o en peligro de extincin, ocupando el primer lugar
en las plantas; pese que se encuentran prcticamente en todos los ecosistemas naturales y en
muchos de ellos hay gran nmero de especies, por particularidades en sus ciclos de vida
varias orqudeas se encuentra con rangos de distribucin geogrficos y altitudinales
reducidos, por lo que pueden estar gravemente amenazadas (Caldern-Senz 2007).
Por lo anterior, se ha optado por desarrollar como herramienta para la conservacin de las
orqudeas su cultivo in vitro. Con el fin de conocer un poco ms sobre esta herramienta de
conservacin de orqudeas, en el presente trabajo se busca recopilar informacin bsica
sobre el cultivo in vitro de estructuras como semillas, meristemos y pices en la familia
Orchidiaceae.
2.

Cultivo in vitro:
El cultivo de tejidos vegetales comprende un conjunto de tcnicas ampliamente usadas para
propagacin in vitro, sus resultados en tasas de germinacin son ms elevadas en
comparacin con el de germinacin en condiciones naturales (Arajo, 2004). Sin embargo,
una desventaja es el alto costo de componentes utilizados para el medio de cultivo, entre
stos, el agar (solidificante ms utilizado), pues la demanda ha elevado su precio (MartnGordo et al. 2012). Se ha probado que la implementacin de almidones o gomas como

agentes gelificantes alternativos permite la disminucin en los costos de los medios de

cultivo para tejido in vitro de hasta el 70% comparados con los del agar, fisiolgicamente
hablando los mejores resultados se obtienen en las sustituciones parciales que se han
estudiado (Martn-Gordo et al. 2012; Mengesha et al., 2012).
Debido a que la formulacin del medio de cultivo es esencial para la propagacin in vitro
dado que este suministra los nutrientes necesarios (minerales, vitaminas, regula- dores del
crecimiento, etc.) para el desarrollo de la planta, este deber prepararse con diferentes
combinaciones de nutrientes de acuerdo con los requerimientos de cada especie y parte a
propagar ya que existen diferentes partes de las que se puede desarrollar una planta por el
cultivo in vitro como lo son semillas, de meristemos (pices y yemas), protoplastos y
nodos(Faria et al., 2002).
2.1.

Asepsia en el cultivo in vitro.

Es comn el encontrar que los medios de cultivo preparados son repartidos en los
recipientes que permiten la entrada de luz y de un tamao adecuado para la planta a sembrar
en dicho medio (frascos de vidrio regularmente), se tapan con papel aluminio y
posteriormente se envuelven en papel peridico, se marcan lotes con la fecha y finalmente
se llevan al autoclave donde son esterilizados con vapor hmedo bajo presin a 15 libras por
20 minutos (Botero et al. 2008), esto debido a que dichos medios no slo presentan
condiciones ptimas para el crecimiento de las orqudeas, existe un sin fin de hongos y
bacterias que pueden crecer con gran facilidad.

3.

Cultivo de semillas
En condiciones naturales, las orqudeas se propagan a travs de la produccin y dispersin
de diminutas semillas, pero a pesar de que cada cpsula de orqudea puede contener entre
200.000 y 600.000 semillas dependiendo del gnero y la especie (Botero et al. 2008), slo
unas cuantas germinan y tienen la posibilidad de alcanzar la edad adulta, dificultando as su
produccin masiva (Caas, 1991). La germinacin de semillas de orqudeas en condiciones
naturales presenta algunas limitaciones ya que carecen de endospermo y en consecuencia
de la reserva de nutrientes necesarios para su desarrollo, esto hace indispensable la presencia
de un hongo formador de micorrizas para que se puedan desarrollar (Chugh et al., 2009;
Hossain et al., 2013; Pedroza - Manrique et al., 2010; Rosa Manzano et al., 2014). Debido
al poco conocimiento que se tiene de los hongos micorrizantes asociados, la germinacin
asimbitica es comnmente usada en la propagacin de orqudeas tropicales (Botero et al.
2008) y dichos medios artificiales se convirtieron en una manera de conservar diferentes
especies de orqudeas (chugh et al., 2009, Antonio, 2012; Mahendran et al, 2012).
Knudson (1922) demostr que en ausencia de hongos era posible la germinacin de
semillas de orqudeas, que dichas semillas eran capaces de desarrollarse en un medio rico
en minerales y azcares, dicha tcnica se catalog como germinacin asimbitica de
semillas; en trminos generales, el medio usado para la germinacin asimbitica es ms

complejo que para la germinacin simbitica, ya que todos los nutrientes orgnicos e
inorgnicos y los azcares deben estar disponibles para la orqudea en una forma apropiada,
puesto que no existe la intermediacin del hongo que facilite su nutricin (Botero et al.
2008). En este sentido existen varios mtodos y medios desarrollados con el fin de llevar a
cabo la conservacin mediante micropropagacin (chugh et al., 2009, Antonio, 2012;
Mahendran et al, 2012), algunos medios que salen a relucir son Morel (1965), MS (1962),
Vacin y Went (1949) y Knudson C (1946) (Rodrguez et al 2007).
La formulacin de sales Murashige y Skoog (1962), el cual fue desarrollado inicialmente
para el crecimiento de callos de tabaco y en la actualidad se emplea como medio de cultivo
basal para un grupo importantes de plantas de inters para la alimentacin y con fines
ornamentales como lo son las orqudeas (Faria et al., 2002).
Las cpsulas y/o semillas deben ser desinfectadas previa la siembra de semillas debido a que
estas pueden presentar gran cantidad de microorganismos que pueden proliferar en el medio
e inhibir el crecimiento de las semillas. Usualmente para las capsulas se usa un detergente
comercial (twin o detergente en polvo) en solucin por 20 minutos en agitacin constante,
seguidas de lavado con agua estril y posterior inmersin en hipoclorito al 0.5% por 10
minutos y enjuagadas tres veces con agua estril (Pedroza - Manrique et al 2010).
En todos los casos las semillas estriles se cultivan en recipientes de vidrio o plstico sobre
un medio de agar nutritivo que contiene los azcares y minerales necesarios para que las
semillas germinen y crezcan, adems se ajusta un pH especfico, que segn knudson (1951)
el rango de pH ptimo vara entre 4.5 y 5.5 (Bertolini et al, 2014). Sin embargo, el
conocimiento acerca de la mejor formulacin del medio de cultivo para cada especie todava
es limitado, esto debido a que un gran nmero de factores influye en la germinacin y el
crecimiento in vitro de orqudeas y estos son altamente dependiente de las especies (Arajo
et al 2006).
En resultados obtenidos con especies del estado de Tabasco (Catasetum integerrimun Hook,
Encyclia alata, Encyclia cordigera, Epidendrum flexuosum, Epidendrum chlocorymbos,
Epidendrum stamfordianum, Myrmecophila sp., Trichocentrum ascendens, Trichocentrum
car- thagenense, Oncidium sphacelatum, Prosthechea cochleata, Nidema boothii,
Trichocentrum lindenii), se han obtenido resultados aceptables con promedios de
germinacin de semillas de un 70 a 90% empleando los medios VW (Vacin y Went), MS, y
MS a la mitad de su concentracin, todos ellos adicionados con 0.1% de carbn activado
(Mayo Mosqueda et al, 2010).
3.1.

Hormonas y elementos para el cultivo de semillas

En muchos casos se recomienda el uso de hormonas vegetales tipo auxina tales como ANA
(cido naftalenactico) y el AIA (cido indol actico) en combinacin con hormonas tipo
citocinina, de las cuales la ms recomendada es la BAP (Bencil amino purina) ( Prez et al.,
2001; Botero et al., 2008).

El carbn activado tambin es un elemento ampliamente utilizado en cultivo de tejido de

plantas, normalmente a una concentracin del 0.5%, se usa para estimular enraizamiento en
propagacin de yemas puesto que puede absorber la citoquinina favoreciendo un balance
endgeno auxina/citoquinina que facilite la iniciacin de las races (Cheruvatour et al.,
2010)
Los resultados dados a los 53 das desde la siembra de la semilla de Comparettia speciosa,
demostraron que el 4,512% de semilla hinchada fue con el tratamiento Murashige con IBA 1
ppm BA 1 ppm siendo este el mejor (Molina Cabrera ,2012)
3.2.

Aditivos naturales
Actualmente, amantes de las orqudeas producen sus propias plantas en laboratorios caseros
a partir de germinacin asimbitica vitro, y para ello utilizan medios de cultivo constitucin
orgnica (Silva et al., 2002). Entre los extractos naturales utilizados en el cultivo de semillas
de orqudeas, se pueden encontrar la pulpa homogeneizada banano, agua de coco, peptona,
triptona, levadura, hidrolizado de casena, jugo de tomate, jugo de pia y extracto de papa
(Torres et al. , 2001). Estos aditivos contienen mezclas de vitaminas y aminocidos y
algunos actan como reguladores del crecimiento (Pierik, 1989).
Diversos aditivos tales como coco complejo (endospermo, agua, leche), peptona de pulpa de
banano (verde o maduro) han sido utilizados en medios de cultivo de tejidos y la
germinacin de la orqudea (George, 1993). Se puede encontrar informes de que el uso de
pulpa de banano sobre la germinacin de Cymbidium, Dendrobium, Phalaenopsis y
Paphiopedilum (Arditti y Ernst, 1993), pero segn Torres y Barbosa (2001), la pulpa de
banano puede promover efectos diferentes en cultivo in vitro, como espesante y/o
crecimiento de las races, dependiendo de la variedad y de la cantidad de pulpa utilizada.
El agua de coco, en general 3 a 15% (v / v) y el aditivo que ms se ha utilizado para un
nmero de especies en vitro, no slo para estimular el crecimiento de callo, sino tambin
para aumentar la formacin embriognesis somtica, inducir la divisin de granos de polen,
y en su primera aplicacin, en la induccin del desarrollo de embriones inmaduros (Caldas
et al., 1998). Knudson (1922) observ que la sacarosa, la fructosa y otros complejos 231
Quelato de hierro y agua de coco en la germinacin in vitro de Rossioglossum grande
(Orchidaceae), qumicos de extractos vegetales, favorecen la germinacin y promueven el
desarrollo de los protocormos. El endospermo lquido de la semilla de coco se ha usado a
varias concentraciones y varias especies establecidas in vitro, incluyendo las orqudeas, ya
que contiene vitaminas, enzimas, azcares, fuentes nitrogenadas, reguladores de crecimiento
y una fraccin de sales inorgnicas (Hicks, 2007). Los efectos promotores del agua de coco
se deben a la presencia de compuestos orgnicos como citoquininas, zeatinas, kinetinas y
purinas, que se consideran promotores del crecimiento vegetal (Yong et al., 2009; Hicks,
2007). Las citoquininas juegan un papel fundamental en la organognesis vegetal, ya que

inducen la formacin de hojas y brotes y aumentan la velocidad de desarrollo y la

germinacin de la semilla (Werner et al., 2001; Huan et al., 2004)
Arajo et al (2006) encontraron que la adicin de 100 g L-1 pulpa de banano promovi
mayor alargamiento del brote y raz, peso fresco, y mayor acumulacin de races para
plntulas de hbridos de semillas germinadas in vitro Cattleya loddigesii 'Gran' x Cattleya
loddgesii 'Alba'.
Para la iniciacin de la germinacin y formacin de plntulas de las especies Prosthechea
vespa y S. klotzscheana, con el medio MS+Jugo de Pia, se encontr el mayor porcentaje de
plntulas formadas de las especies objeto de estudio.(Salazar Mercado & Cansino, 2012).
De esto se puede inferir que la adicin adecuada de componentes orgnicos, como agua de
coco y jugo de pia al medio de cultivo MS in vitro, es un elemento importante para la
germinacin y desarrollo de plntulas, debido a que son ricos en energa y contienen iones
inorgnicos, aminocidos, vitaminas, reguladores de crecimiento y cidos orgnicos
necesarias para el desarrollo de las semillas de orqudeas (Kitsaki et al., 2004, Yong et al.,
2009; Abbas et al., 2011).
3.3.

Medios combinados
Existen medios que combinan aditivos naturales como hormonas, ejemplo de esto tenemos:
La combinacin de 50 y 200 ml L-1 agua de coco y 100 g L-1 pulpa de pltano en medio
Knudsosn C, mostr una interaccin significativa para el nmero de races, dicha
interaccin proporciona mejores resultados en nmero de races y la masa fresca de los
brotes, respectivamente (Arajo et al 2006).
El medio C de Knudson adicionado con ANA (1 mg/lt) y 15% de agua de coco, promueve la
germinacin de manera eficiente en la especie Dendrobium chrysantum Wall.
(Orchidiaceae) (De et al., 2006). Adems, el agua de coco empleada en Cattleya mendelii
Dombrain (Orchidiaceae) ha dado resultados significativos en la germinacin, comparada
otros medios de cultivo combinados como lo es Knudson con jugo de pia, AIA y GA3
(Salazar-Mercado, 2012).

4.

Cultivo de meristemos y pices:.

El cultivo de meristemos es un mtodo efectivo para la eliminacin de infecciones virales y
es el material preferido para la conservacin de germoplasma. La razn principal por la cual
las clulas meristematica son resistentes a los virus es que el meristemo carece de tejidos
vasculares, que es por donde se propagan los virus que van contaminando a la planta, pero
esta no es la nica razn, existen otros factores: a) El meristemo apical tiene una mayor
velocidad de crecimiento y en consecuencia el virus "no alcanzan" al meristemo, b) en una
clula meristematica el virus tiene mayor dificultad de acoplamiento con los ribosomas,

debido a que estas clulas tienen un cdigo de trabajo muy definido, y adems, c) existe una
competencia por uso de algunos metabolitos entre clulas y virus. (Muoz, 2006).
En el caso de las orqudeas, es ms complejo la extraccin del meristemo, ya que se
comienza partir de la germinacin de la semilla y brotes en desarrollo. El proceso de
germinacin empieza cuando la semilla se hincha y toma un color verde, lo que origina una
estructura indiferenciada en forma esfrica denominada protocormo, este protocormo origina
la plntula completa despus de pasar por cinco etapas de desarrollo descritos por Seaton y
Ramsay (2005): (1) formacin del protocormo; (2) aparicin de los rizoides; (3) aparicin
del meristemo apical; (4) desarrollo de la primera hoja; y (5) aparicin de la primera raz
verdadera.
Despus de identificado el meristemo se procede a la eliminacin de hojas encontrando la
parte apical para reconocer y extraer el meristemo, este se siembra y se debe esperar que el
medio sea el adecuado para obtener un resultado positivo (Bertolini et al, 2014) como se
hablar ms adelante.
En el caso del corte del material vegetal antes de la siembra se recomienda, controlar el
pulso, no olvidar la posicin de los codos para contrarrestar las vibraciones de la cmara de
flujo, trabajar con agujas de insulina si desea ya que el corte es ms fino y pequeo y
eliminar en lo que ms pueda los primordios foliares ya que se obtendr mejores resultado
en la eliminacin de virus. (Cruz, 2011).
Como anteriormente se dijo, el cultivo de meristemos provee plantas libre de virus, pero
existen tcnicas que proveen un mayor grado de confianza para conseguir dichos resultados,
entre estas encontramos la termoterapia o la quimioterapia en combinacin con el cultivo de
meristemos donde: la termoterapia o tratamiento trmico consiste en elevar o bajar la
temperatura para eliminar bacterias, micoplasmas e inactivar los virus en plantas enteras,
rganos, tejidos o meristemos, cuando los virus son excesivamente dainos.(Salazar, 2013) y
la quimioterapia es la aplicacin de productos qumicos al medio de cultivo, lo que ocasiona
una mayor probabilidad de obtener plantas libres de patgenos ya que, cuando se aplican
diferentes productos quimioteraputicos de manera exgena al medio de cultivo, estamos
asegurando la obtencin de material sano (rivero, 2007) .
4.1. Medios utilizados para el cultivo de meristemos y pices:
Se han desarrollado distintos mtodos de propagacin por meristemos dependiendo del tipo
de explante, brotes vegetativos en crecimiento, los cuales debern ser esterilizados en
Hipoclorito de calcio o de sodio al 4% por 20-30 minutos. Luego se enjuagan en agua
destilada estril y se procede al aislamiento y siembra de los meristemos o de las yemas en
medio de cultivo.(Debora, 2009).
Donde, Cada medio utilizado para el cultivo in vitro de plantas tiene condiciones especiales
de nutrientes para un crecimiento ptimo de la especie, los cuales son especficos de

acuerdo a la parte de la planta que se est cultivando y a la respuesta que se desea obtener
(Penacho, et al. sf).
por ejemplo, esta propagacin masiva a partir de meristemos permite la comercializacin de
orqudeas nativas y de gran valor a partir de unos pocos especmenes, ya que la
multiplicacin in vitro de orqudeas es alta y en periodos cortos de tiempo, donde, se han
evaluado diversos medios de cultivo, como en resultados obtenidos en Costa rica se
encontr que para la regeneracin de meristemos extrados, el medio de cultivo Murashige
Y Skoog (1062) suplementado con 0,5 mg/l de benciladenina (BA) fue el mejor medio de
cultivo, en el cual se obtuvo un 100% de regeneracin de los meristemos(MuozBustos,1998) y en otras investigaciones se ha encontrado que el pH adecuado para el cultivo
de meristemos es de 4.8 y 5.5 (tambin para semillas).(Arditti, 1993).
Tambin, segn Huang, 1984; Gutirrez y Chen-Han, 1999; Homes et al., 1972 citado por
Alvarado, 2000. El uso del agua de coco tambin es bastante comn en el cultivo de
meristemos de Cattleya, especialmente en la etapa de introduccin por su capacidad de
estimular la formacin de cuerpos protocrmicos en las clulas epidrmicas y por la
presencia de altos valores de aminocidos esenciales en el endospermo lquido del coco.
sin embargo, cuando se presenta casos de oxidacin en el cultivo de meristemos adems de
lavar los explantes con cido Ascrbico, Tiourea y L-Cistena, en trabajos como el
realizado con orqudeas C. skinneri y en el hbrido C. skinneri x C. maxima, se utiliz el
medio lquido para una mayor difusin de los fenoles y el uso Carbn Activado en medio
semislido de enraizamiento fueron prcticas para contrarrestar la oxidacin, que
produjeron una respuesta positiva, tambin es muy frecuente el uso de medio de cultivo
lquido en agitacin ya que promueve la divisin celular y mantiene disueltos los poli
fenoles que liberan los tejidos, la oxigenacin celular y el aprovechamiento de nutrientes es
mayor. (tesis de skinneri).
Por ltimo, otro aspecto importante son las intensidades de luz usadas para el cultivo de
semillas, de meristemos o yemas, que van desde la oscuridad hasta los 300 Lux,
generalmente obtenidos con lmparas fluorescentes y algunas veces complementados con
lmparas incandescentes. Los fotoperiodos ms adecuados para la germinacin de semillas y
cultivo de tejido de plntulas son tambin adecuados para el cultivo de meristemos (Arditti,
1993).
5.

Conclusin
Como vimos a lo largo de la revisin, son mltiples las metodologas y las estructuras que
se pueden usar para la propagacin in vitro de orqudeas como el cultivo de semillas y de
meristemos (pices y yemas) y as velar por su preservacin. Sin embargo, son procesos
complejos y con muchos desconocimientos en la fisiologa, fisonoma y respuestas de estas
plantas mediante este tipo de multiplicacin, no obstante, esto se debe a la gran variedad de
especies que presenta esta familia de plantas y los escasos esfuerzos en su estudio, por lo

anterior, es necesario seguir generando avances y estudios como los mencionados para que
esta frontera de conocimiento disminuya.

6.

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