UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA

FACULTAD DE MEDICINA
CARRERA DE TECNOLOGA MDICA

Efecto del Plano de Nutricin sobre la Expresin

de los Receptores de Estrgeno y Progesterona
en Endometrio de Ovejas de la Raza Criolla
Araucana

Tesis presentada a la Universidad de La Frontera,

Facultad de Medicina, para obtener el Grado de
Licenciado en Tecnologa Mdica, con Mencin en
Laboratorio Clnico, Hematologa y Banco de Sangre.

Autores:
Eduardo Barrientos Vargas
Yoselyn Olmazbal Seguel

TEMUCO CHILE
2009

UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA
FACULTAD DE MEDICINA
CARRERA DE TECNOLOGA MDICA

Efecto del Plano de Nutricin sobre la Expresin de

los Receptores de Estrgeno y Progesterona en
Endometrio de Ovejas de la Raza Criolla Araucana

Tesis presentada a la Universidad de La Frontera,

Facultad de Medicina, para obtener el Grado de
Licenciado en Tecnologa Mdica, con Mencin en
Laboratorio Clnico, Hematologa y Banco de Sangre.

Autores:
Eduardo Barrientos Vargas
Yoselyn Olmazbal Seguel
Docente Gua:
Dr. Marco Paredes Honorato
Dra. Adriana Vasconcellos Costa

TEMUCO CHILE
2009
2

Esta Tesis fue financiada mediante el Convenio de

DIUFRO 107- 007 Direccin de Investigacin y
Desarrollo, Universidad de La Frontera.

AGRADECIMIENTOS
A Dios, que en todo momento nos entrego la fuerza
y perseverancia necesaria para lograr este sueo.
A nuestros Padres, por creer en nosotros, por todo
el apoyo confianza y comprensin que nos han brindado
incondicionalmente a lo largo de esta etapa. Decirles
que este logro mas que nuestro es suyo.
A nuestras familias, por su preocupacin e inters
en todos los logros acadmicos que hemos logrado da a
da.
A nuestros profesores guas el Dr. Marcos Paredes
H. y la Dra. Adriana Vasconcellos C. por permitirnos ser
parte de este proyecto y por su excelente disposicin a
colaborarnos y entregarnos las herramientas esenciales
para el desarrollo de este trabajo cientfico.
A

todos

los

integrantes

del

Laboratorio

de

Biotecnologa Animal (LINBA) de la Universidad de la

Frontera, especialmente al Sr. Mg. Eduardo Gutirrez
D`afforno y a la Srta. Daniela Nuez R. por todos sus
conocimientos

y ayuda brindada durante nuestro

trabajo prctico.
A Juan Carlos Lpez por su paciencia, tolerancia y
estar siempre dispuesto a ayudarnos en nuestro trabajo
diario.
4

Y como no agradecer a todos nuestros grandes

amigos que hemos arraigado a lo largo de estos aos,
los que siempre nos animaron e incentivaron a ser
mejores cada da, mostraron inters, entusiasmo y
apoyo durante todo este proceso.

A todos ustedes Muchsimas Gracias!

Eduardo - Yoselyn
NDICE
INTRODUCCIN.................................................................................................08
MARCO TERICO..............................................................................................10
1. Hormonas sexuales......................................................................................10
1.1 Estructura................................................................................................10
1.2 Sntesis Estrgeno y Progesterona........................................................12
1.3 Funcin hormonas sexuales ..................................................................15
2. Receptores de Estrgeno y Progesterona...................................................17
2.1 Receptor de Estrgeno...........................................................................17
2.1.1 Estructura.......................................................................................17
2.1.2 Mecanismo de accin....................................................................19
2.2 Receptor de Progesterona......................................................................21

2.2.1 Estructura.......................................................................................21
2.2.2 Mecanismo de accin....................................................................23
2.3 Distribucin de los receptores de Estrgeno y Progesterona en sistema
reproductivo..................................................................................................25
2.4 Receptores esteroidales y nutricin ......................................................27
HIPOTESIS..........................................................................................................28
OBJETIVOS.........................................................................................................29
MATERIAL Y METODO.......................................................................................30
1. Diseo del proyecto......................................................................................30
2. Animales y material biolgico.......................................................................32
2.1 Obtencin del material biolgico............................................................32
2.2 Preparacin de cortes histolgicos.........................................................33
2.3 Anlisis inmunohistoqumico de cortes histolgicos...............................34
3. Obtencin y diseo de partidores para RT-PCR..........................................35
4. RNA total de rganos reproductivos de ovejas............................................36
4.1 Extraccin...............................................................................................36
4.2 Cuantificacin y evaluacin de la integridad del RNA extrado..............37
5. Preparacin DNA complementario (cDNA)..................................................38
5.1 Sntesis...................................................................................................38
5.2 Amplificacin del cDNA por PCR convencional......................................39

5.3 Electroforesis en geles de agarosa........................................................41

6. Evaluacin de los niveles de expresin de receptores de estrgeno y
progesterona por medio de RT-PCR en tiempo real........................................42
RESULTADOS.....................................................................................................43
1. Cuantificacin de las concentraciones del RNA del cuerno extrado..........43
2. Evaluacin de la expresin de los productor PCR.......................................44
3. Evaluacin semicuantitativa de los trascritos de receptores de estrgeno y
progesterona mediante RT-PCR en tiempo real..............................................45
4. Anlisis de la expresin y distribucin de receptores de estrgeno y
progesterona en endometrio de ovejas adultas...............................................49
DISCUSIN.........................................................................................................54
ANEXO................................................................................................................59
1. Protocolo inmunohistoqumica.....................................................................59
2. Protocolo extraccin RNA total (mtodo de Chomczynki)...........................62
3. Protocolo preparacin gel agarosa/formaldheido para RNA total...............65
4. Protocolo sntesis de cDNA.........................................................................66
5. High capacity ma-to-cDNA kit......................................................................68
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS....................................................................70

INTRODUCCIN

Si bien el efecto del plano nutricional sobre la prolificidad de ovejas ha

sido ampliamente estudiado, aun existen pocos reportes que vinculen el efecto
de la alimentacin sobre la expresin de receptores de hormonas esteroidales,
cuya presencia en las clulas de diversos rganos del sistema reproductor es
clave para el desarrollo de

respuestas fisiolgicas apropiadas (Figura 1)

(Meikle et al., 2004).

Algunos datos relacionados con planos nutritivos y expresin de
receptores han sido aportados por Sosa et al, (1997), los cuales indican que la
baja nutricin se relaciona de forma significativa con la disminucin del efecto
de la progesterona a nivel endometrial, lo que se debe posiblemente a una
disminucin en la cantidad de receptores. Generalmente los estudios han sido
hechos en ovejas sub-nutridas utilizando controles alimentados de forma
apropiada, no obstante, no se han comparados el efectos de planos
nutricionales con elevados niveles de carbohidratos y protena sobre la
capacidad reproductiva en ovejas (Sosa et al., 2003).
Se sabe que los receptores de progesterona (RP) tienen una gran
importancia en el estado reproductivo del animal adulto. Pero en animales prepberes, como caninos, ratones y otros mamferos se ve una expresin muy
leve o imperceptible a diferencia de los ovinos (Vasconcellos, 2005). Segn
Meikle et al, (2004), los rumiantes difieren de otros mamferos en la distribucin
de receptores sexuales esteroidales a lo largo del tracto reproductivo. Tambin

existen evidencias que indican una elevada expresin de este receptor en tero
y oviducto de ovejas hembras pre-pberes (Garfolo y Tasende, 1996). Cabe
considerar que la expresin de RP en diversos tipos de clulas del sistema
reproductor de mamferos es inducido por estrgeno mediante la unin de esta
hormona a un receptor intracelular especifico (Rollerova y Urbancikova, 2000).
De este modo, la elevada expresin de receptores de estrgeno (RE) descrita
por Garfolo y Tasende, (1996) podra inducir en estos rganos la presencia
prematura de RP en ovejas pre-pberes. La presencia de RP en sistema
reproductivo de animales pre-pberes sugiere la posibilidad que progesterona
module algn tipo de funcin pre-reproductiva en ovejas (Vasconcellos et al,
2005)

Figura 1. Sistema reproductor de oveja (www.sheepandgoat.com)

MARCO TERICO

1. Hormonas sexuales

1.1 Estructura
Las hormonas esteroidales, progestgenos y estrgenos son derivados
qumicos del

ciclo pentanoperhidrofenantreno, esteroides formados por 3

anillos ciclo hexanos (A, B, C), y un anillo de ciclo pentano (D), con 18 tomos
de C. De los estrgenos naturales, el ms potente es el 17- - estradiol, que es
a su vez el principal producto de la secrecin endocrina del ovario. El estradiol
tiene 3 dobles ligaduras en el anillo A, un OH en C3, y otro OH en C 17, en
posicin beta (Devlin, 2004).
El estriol, es un producto de oxidacin del estradiol, incorporando una
funcin cetona en C17. El

estriol,

es un producto de la hidratacin del

estradiol, ya que posee un OH adicional en C16. Estos 3 agentes son hormonas

naturales (Devlin, 2004).
El principal progestgeno es la progesterona y junto a sta secretan
pequeas cantidades de otro progestgeno como la 17--hidroxiprogesterona,
que tienen esencialmente los mismos efectos (Guyton, 1990) (Figura 2).

10

Figura 2. Estructura qumica de hormonas sexuales. A) Estrgeno. B) Progesterona.

(Devlin, 2004)

11

1.2 Sntesis Estrgeno y Progesterona

El primer paso de la sntesis de hormonas esteroides comienza con la
desesterificacin del colesterol, mediada por la colesterol esterasa, y su
transporte a travs del citoesqueleto celular, mediante la SCP (protena
transportadora de esteroles), hasta la mitocondria. En la membrana interna de
la mitocondria se encuentra la primera enzima P450scc (side chain cleavage),
que oxida el carbono 20 y desprende la cadena lateral como cido isocaproico,
consumiendo NADPH+H y oxgeno en la reaccin. El producto que se forma, la
pregnenolona, es precursor necesario de todas las hormonas esteroides
(Daz, 2004).
Una vez sintetizada la pregnenolona,

sta puede tomar dos rutas,

protagonizadas por enzimas diferentes: la 3HSD (3--Hidroxiesteroide

deshidrogenasa), que la convierte en progesterona, o la 17--hidroxilasa
(P450c17), que la convierte en 17--hidroxi-pregnenolona. Tanto la 3HSD
como la 17--hidroxilasa estn en el retculo endoplsmico, por lo que la
pregnenolona debe salir de la mitocondria (Daz, 2004).
La pregnenolona se convierte en progesterona por dos actividades de un
solo enzima, la 3HSD: Primero se produce la oxidacin del grupo hidroxilo en
posicin C3 de la pregnenolona y segundo, como consecuencia de la oxidacin,
se produce la isomerizacin del doble enlace. La oxidacin requiere la
participacin de NADH+H (Daz, 2004).
Tanto la pregnenolona como la progesterona son sustratos de la
17--hidroxilasa, enzima del retculo endoplsmico que cataliza la formacin de
12

andrgenos C19. Esta enzima est compuesta por un citocromo especfico,

P45017C y la flavoprotena NADPH-citocromo P450 reductasa.
En el

caso de que el

sustrato de la 17--hidroxilasa fuera la

pregnenolona, el primer producto que aparece es la 17--pregnenolona, y el

segundo la dehidroepiandrosterona (DHEA), un andrgeno dbil, producido por
el ovario y las suprarrenales, un esteroide C19 precursor de andrgenos y
estrgenos.
Si

el

sustrato

es

la

progesterona,

el

producto

intermedio,

la

17--OH-progesterona, es segregada por el ovario a pesar de que la

17--hidroxilasa

constituye

un

solo

complejo

17--OH-progesterona es finalmente convertida

enzimtico.

La

en andostendiona tambin

conocida como androstenediona, precursor obligado de andrgenos y

estrgenos. La androstendiona es convertida en testosterona por la
17-hidroxi-esteroide-deshidrogenasa, un enzima que tambin convierte la
estrona a estradiol. Este proceso ocurre mayoritariamente en el ovario y
escasamente pasa a la granulosa (Daz, 2004) (Figura 3).

13

Figura 3. Esquema general de la esteroidognesis. (Daz, 2004)

14

1.3 Funcin hormonas sexuales

La

funcin de

la

progesterona

durante

los diferentes eventos

reproductivos es indiscutible: iniciacin de la pubertad, reconocimiento y

mantenimiento de la preez, recuperacin ovrica posparto, etc.
La secrecin de progesterona por parte del cuerpo lteo es esencial
para orquestar el ambiente histotrfico para el desarrollo del embrin. La
progesterona y el estradiol actan como reguladores sistmicos que conducen
a los eventos coordinados a nivel endometrial y oviductal programando al tero
para la regresin del cuerpo lteo si no hay comunicacin del embrin por va
de la secrecin de PGF2a determinando as la duracin del ciclo estral (Bez
et al, 2006).
Los estrgenos afectan el crecimiento, la diferenciacin y la funcin de
los tejidos del sistema reproductor, que incluye: las glndulas mamarias, los
ovarios y el tero, teniendo tambin funciones reguladoras en otros tejidos del
organismo.

Tienen una importante influencia en la secrecin de protenas

endometriales, siendo estas protenas necesarias para la proliferacin celular

endometrial, as como para la nutricin y desarrollo del vulo fertilizado a su
llegada al tero (Bez et al, 2006). Asimismo, inducen la formacin de RP
(Martne, 1996) y desempean un papel importante en la regulacin de la
contractilidad miometrial durante el embarazo y al parto,

promoviendo la

sincronizacin y la integracin ordenada de este fenmeno en el tero (Wen,

1996).
Para realizar estas funciones se necesita de la interaccin hormonareceptor. Los receptores

se han detectado en embriones

de mamferos
15

durante el desarrollo fetal, lo que sugiere que las hormonas esteroidales pueden
ser necesarias para el crecimiento y la diferenciacin de los tractos
reproductivos (Meikle, 1996). Estas hormonas actan a travs de sus
receptores intracelulares especficos, se unen a ellos e inician la respuesta
biolgica permitiendo el desarrollo del tracto genital y determinando su estado
morfo funcional (Vasconcellos et al, 2005).

16

2. Receptores de Estrgeno y Progesterona

2. 1 Receptores de Estrgeno.
2.1.1 Estructura
Los receptores estrognicos pertenecen a la sper familia de receptores
nucleares de factores de la trascripcin inducibles por ligandos, que incluye
tambin a los receptores para esteroides, hormona tiroidea, cido retinoico y
vitamina D (Teppa et al, 2005).
Hasta el momento se han identificado dos tipos de receptores
estrognicos, y . El subtipo fue clonado por Green y colaboradores en
1986, mientras que el lo descubrieron Kuiper y colaboradores

en 1996

(Teppa et al, 2005).

El receptor estrognico contiene 595 aminocidos y est constituido
por diferentes dominios: 1) un dominio regulador situado en las regiones A/B,
que contiene varios sitios de fosforilacin; 2) un dominio central de unin al ADN
(DBD; DNA binding domain) en la regin C, que es esencial para activar la
trascripcin y producir el cambio conformacional necesario para interactuar con
el elemento de respuesta a estrgenos; 3) un dominio en la regin D, que
participa en el movimiento del receptor estrognico al ncleo despus de su
sntesis en el citoplasma y 4) un dominio de unin al ligando que se ubica en la
regin D, en el extremo carboxilo terminal (LBD; ligand binding domain). Los
receptores especficos contienen dos diferentes dominios de activacin, el AF-

17

1, localizado en el extremo amino terminal (regin A/B), y el AF-2, localizado en

el extremo carboxilo terminal (regin E) (Teppa et al, 2005).
El receptor estrognico es algo ms pequeo, contiene 530
aminocidos y tambin tiene un dominio AF-2 que funciona en forma
independiente dentro del receptor y un dominio AF-1 en su extremo amino
terminal que, sin embargo, es dbil por estar asociado con un dominio represor
(Figura 4) (Teppa et al, 2005).
La estructura de estos receptores es muy similar, con mayor grado de
homologa en el dominio DBD (95%), moderada conservacin en el dominio
LBD (53%) y considerable divergencia en sus extremos amino terminales
(Teppa et al, 2005).

Figura 4. Comparacin estructural entre receptores de estrgeno alfa y beta (ER y

ER) (Prez, 2005).

18

2.1.2 Mecanismos de accin

El reconocimiento de cada receptor por su respectiva hormona es un
proceso altamente especfico en que la pequea molcula hormonal entra en
una cavidad hidrofbica de la molcula del receptor, formando una unin de alta
afinidad (Cano et al, 2006).
A pesar de la amplia similitud en los aminocidos claves del dominio de
unin a la hormona, los receptores estrognicos y tienen diferentes
afinidades por ligandos naturales y sintticos. Esto sugiere que las respuestas
en lo tejidos en que predomina uno y otro tipo de receptor sern muy distintas
(Cano et al, 2006).
Una vez en el interior de las clulas, los estrgenos se unen a sus
receptores especficos y establecen el complejo estrgenos-receptores. Luego,
los receptores estrognicos experimentan un cambio conformacional o
alostrico de su estructura, lo cual los convierte en una forma activa capaz de
interactuar con el sistema de trascripcin de los genes (Teppa et al, 2005).
Al unirse los RE con los estrgenos, desencadenan cambios en la
forma del receptor

que consisten en la disociacin de un complejo

co-represor del RE y la unin de ste con un complejo co-activador. Estos

ltimos son molculas que al interactuar con el receptor le confieren la
actividad regulatoria, resultando en la trascripcin de genes que contienen
elementos

de

respuesta

estrgenos

(ERE).

Por

el

contrario,

en

ausencia de estrgenos, los RE se asocian con los co-represores que

inhiben la actividad de trascripcin (Prez et al, 2005).

19

Si se compara la secuencia de aminocidos entre los RE y RE ,

ambos receptores presentan 96% de identidad en su secuencia de aminocidos
constituyentes, aunque no es una regla aplicable a todas las regiones del
receptor; ya que en las regiones DBD y LBD slo existe una similitud de 53% .
Aunque no se han demostrado experimentalmente, estos datos sugieren que
el RE puede reconocer y unirse a ERE similares a los que el RE reconoce y
une. Sin embargo, cada uno de ellos tiene una afinidad diferente por los
distintos ligandos (Rollerova, 2000).
El RE es importante en la proliferacin de clulas y el aumento de peso
del tero. El RE ejerce acciones similares a nivel uterino, pero requiere
concentraciones mayores del ligando que el RE (Rollerova, 2000).

20

2. 2 Receptores de Progesterona
2.2.1 Estructura
Los RP pertenecen a la sper familia de receptores nucleares de ligando
dependientes de factores de transcripcin.
Estos

receptores

se

expresan

en

dos

isoformas,

receptor

de

progesterona A (RP-A) y receptor de progesterona B (RP-B) que se plantean

por el uso alternativo de dos promotores de un solo gen (Boonyaratanakornki,
2008). Los receptores de progesterona contienen tres dominios funcionales
conservados, el dominio N - Terminal, una ubicacin cntrica del dominio ADN
vinculante (DBD), y el dominio C-Terminal ligando (LBD). El DBD contiene dos
dedos de zinc asimtrica, cada uno con un ion de zinc coordinado por cuatro
residuos conservados de cistena (Surez, et al 2008).
Las isoformas de RP-A y RP-B difieren en que la RP-B contiene una
secuencia adicional de aminocidos en su porcin amino terminal. Esta porcin
contiene dominios con funcin activadora (AF1 y AF3) que reclutan protenas
co-activadoras facilitando la remocin cromatnica y la formacin de complejos
iniciadores de la transcripcin en el promotor especfico. En el extremo carboxiterminal del dominio de unin al ADN (DBD), se ubica el ligando de unin al
dominio (LBD) que es la regin ms constante del receptor (Surez, et al 2008)
(Figura 5).
El RP-B codifica un dominio transactivation de tercera funcin (AF3), que
est ausente en el RP-A. Este dominio AF3 permite la unin de un subconjunto
de co-activadores a RP-B que no son eficientemente reclutados por RP-A. Por
lo tanto, cuando se expresan individualmente estos receptores, presenta
21

diferentes propiedades de transactivacin, siendo especficas para ambos tipos

de clulas y genes objetivos (Conneely et al., 2002).

Figura 5. Comparacin estructural de los receptores de progesterona (PR-A y PR-B).

(Mulac-Jericevic y Conneely, 2004)

22

2.2.2 Mecanismos de accin

Las dos isoformas presentan diferentes acciones. El RP-B ejerce su
accin sobre elemento de respuesta a progesterona, siendo un activador mucho
ms fuerte que RP-A. Sin embargo, RP-A puede ser un fuerte activador en
determinadas clulas y genes blanco. La activacin ms fuerte de RP-B es
causada

en

parte

por

la

existencia

de

un

tercio

de

activacin

de dominio (AF-3) dentro de la primera secuencia N-terminal de 164

aminocidos que es exclusivo de RP-B. Bajo ciertas clulas y objetivo RP-A
est inactivo como un factor de transcripcin y puede funcionar como un
ligando-dependientes de otros receptores de esteroides incluidos RP-B, el RE,
los receptores de andrgenos (RA) y receptores de mineralocorticoides
(Leonhardt et al, 2002).
Un inhibidor de dominio (ID) responsable de esta funcin transrepresora
ha sido asignada a los primeros 140 aminocidos del dominio N-terminal del
RP-A. ID es funcional y transferibles a otros receptores de esteroides tales
como RP y RE de pollos y humanos que no presentan este actividad
(Leonhardt et al, 2002).
El hecho de que dentro de la secuencia de identificacin est presente
en ambas isoformas de RP, pero slo est activa en el contexto de la RP-A,
propone que el domino especifico N-Terminal del segmento de PR-B juega un
papel importante en la represin del ID. Factores de transcripcin que albergan
tanto la activacin y represin de dominios o se expresan como formas capaces
de funcionar como transrepresores dominantes se han identificado en diferentes
familias de factores de transcripcin. Estos transrepresores naturales tienen
23

importantes funciones fisiolgicas en el cierre de activacin de respuestas en

momentos concretos durante el desarrollo y la diferenciacin, o en
determinadas condiciones fisiolgicas. El RP-A se ha sugerido que tienen un
papel similar a los receptores esteroides hormonales que pueden ser
particularmente pertinentes en el tero, donde la progesterona se conoce como
un

agonista

de la actividad de los estrgenos (Leonhardt et al, 2002)

(Figura 6).

Figura 6. Mecanismo esquemtico de accin de las hormonas

esteroides. El esteroide pasa a travs de la membrana celular y
entra al ncleo para unirse a su receptor (Botana, 2002)

24

2.3 Distribucin de los RE y RP en sistema reproductivo.

Las hembras ovinas son polistricas estacionales, es decir, se
reproducen en una determinada poca del ao, especficamente en otoo. Se
estima que la estacionalidad reproductiva obedece en general a necesidades de
conservacin de la especie, influenciada por

factores de tipo ambiental y

ecolgico (Botana, 2002).

El ciclo estral tiene una duracin de 17 2 das siendo 1 2 das ms
corto en las hembras jvenes. La duracin media del estro en ovejas adultas es
de aproximadamente 30 horas, siendo 10 horas ms corto en ovejas pberes,
la ovulacin tiene lugar hacia el final del estro (Botana, 2002).
El ciclo estral consta de dos etapas, dependiendo de las estructuras
ovricas predominantes: la fase folicular y la fase ltea. La fase folicular inicia
con la regresin del cuerpo lteo y finaliza con la ovulacin. Durante esta fase
ocurre la maduracin folicular, por lo que el esteroide gonadal dominante es el
estradiol. La fase ltea se refiere a la etapa del ciclo en la cual se forma y tiene
su mayor funcionalidad el cuerpo lteo, la hormona dominante en esta fase es
la progesterona (Vasconcellos et al, 2005).
Los receptores esteroides, han sido estudiados en el tracto genital de
distintas especies encontrndose altas concentraciones de RE y RP en tero y
oviducto de ovejas pre pberes, mientras que en perros los RP son en este
estadio del desarrollo bajos o indetectables tanto en el

tero como en el

oviducto (Vasconcellos et al, 2005).

Otro estudio realizado con ovejas pre pberes y perras mostraron, en
ambas especies, la presencia RE en tero y tubas uterinas durante el ciclo
25

estral siendo la reactividad en la clulas estromales ms marcada que en

epitelio (Vasconcellos et al, 2006).
En ovario tambin se detectaron receptores estrognicos, principalmente
en las clulas foliculares en los que la presencia de RP fue leve o ausente. La
expresin de RE y RP en endometrio de ovejas pre pberes fue siempre
detectable con reactividad epitelial y principalmente estromal, no as en el
endometrio de perras en igual estadio, donde no se detect (Vasconcellos et al,
2006).
La presencia de RE y RP es detectable en tero, oviducto y ovario de la
hembra canina adulta variando su expresin segn el estadio del ciclo estral,
siendo su presencia no evidenciable en hembras pre pberes (Vasconcellos et
al, 2008).
Esto demuestra que no todas las especies de mamferos expresan
receptores de hormonas esteroidales en una misma etapa y con la misma
intensidad, en un perodo determinado de su vida reproductiva.

Existiendo

ciertas especies que, ya al nacer, presentan dichos receptores desarrollados, y

otras especies que slo los expresan ms tardamente, en la pubertad, o
cuando ya existe actividad cclica hormonal con niveles hormonales ms
elevados (Caird et al, 1984).
Las hormonas esterodeas regular el patrn de contraccin miometrial
durante el ciclo estral en la oveja. Los estrgenos provocan una alta frecuencia
de las contracciones con grandes amplitudes, mientras que la progesterona
inhibe la fuerza de contracciones (Caird et al, 1984).

26

2.4 Receptores esteroidales y nutricin

La relacin que pudiera existir entre la expresin, ya sea aumentada o
disminuida, de los receptores de esteroides con la alimentacin en ovejas no ha
sido muy estudiada. Sin embargo algunos estudios han relacionado los efectos
de una baja nutricin con las posibles causas de fracaso reproductivo
incluyendo anormalidades del vulo o del embrin, insuficiencia ltea y el
fracaso de la oferta de progesterona para el tero, como tambin, los
mecanismos que participan en el reconocimiento materno del embarazo. La
desnutricin puede actuar a travs de cambios en la distribucin de la
progesterona en el endometrio, proporcionando un vnculo entre la conocida
funcin de la progesterona en la supervivencia del embrin por la modulacin
de la funcin uterina y la mayor prdida de embriones en ovejas (Abecia, 2006).
De este modo, la evaluacin del efecto de la nutricin sobre la expresin de
receptores

endometrial

es

un

tema

susceptible

de

ser

abordado

experimentalmente, con el objetivo de aportar datos y conocimientos que

permitan aclarar la importancia de la expresin de estos receptores en sistema
reproductor y su relacin con el estado nutricional del animal. En este contexto
nosotros proponemos como investigacin evaluar la expresin de la protena
receptora a nivel inmunohistoqumico y a nivel transcripcional en el endometrio
de ovejas tratadas con alimentacin normal y ovejas sobrealimentadas.

27

HIPTESIS DE TRABAJO

El plano nutricional suplementado con elevados niveles de carbohidratos

y protenas, aumenta el nivel de expresin de los receptores de estrgeno y
progesterona en el endometrio de ovejas de la raza Criolla Araucana.

28

OBJETIVOS

Objetivo General
Evaluar el efecto del plano nutricional con elevados niveles de
carbohidratos y protenas sobre la expresin de los RE y RP

en sistema

reproductor de ovejas de la raza Criolla Araucana.

Objetivos Especficos
Determinar la expresin inmunohistoqumica de RE y RP en endometrio
de ovejas sometidos a alimentacin con elevados niveles de carbohidratos y
protenas.
Evaluar la expresin transcripcional de los RE y RP en ovejas de la raza
Criolla Araucana

sometidas a

alimentacin con

elevados niveles de

carbohidratos y protenas, mediante RT-PCR en tiempo real.

.

29

MATERIAL Y MTODOS

1. Diseo del Proyecto

Investigacin de tipo semi cuantitativa y cualitativa que consiste en una

investigacin

experimental

animal.

Este

estudio

fue

realizado

en

el

departamento de ciencias bsicas, edificio Hernn Herrera, de la Universidad

de la Frontera en el Laboratorio de investigacin en biotecnologa animal
(LINBA), a cargo del Dr. Marco Paredes Honorato.
Para este tipo de investigacin se utilizaron dos grupos de ovejas adultas
de la raza Criolla Araucana (un grupo experimental y un grupo control), los
cuales se describen a continuacin:

Grupo 1 (control): Ovejas no suplementadas con elevados niveles de

carbohidratos y protenas.
-

Ovejas cuya alimentacin fue en base a una pradera mixta con

ballica perenne trbol blanco.

La edad de las ovejas era de un ao y medio.

Tabla 1. Caractersticas fsicas de las ovejas no suplementadas al momento

inicial del estudio y en su sacrificio.

30

Nmero de Autocontrol
Peso vivo inicial (kg)
Peso vivo al sacrificio
Condicin corporal (C.C.)

708
45,0
47,5
2,0

720
44,8
46,0
1,5

Grupo 2 (experimental): Ovejas suplementadas con elevados niveles

de carbohidratos y protenas.
-

Ovejas cuya alimentacin fue en base a una pradera mixta de

ballica perenne trbol blanco y que adems recibieron desde
el 7 de enero del 2009, 250 g/da de grano de avena (cuyo
aporte es de 0,7 Mcal de energa metablica y 30g de protena

cruda.
La edad de las ovejas era de 4 aos.

Tabla 2. Caractersticas fsicas de ovejas suplementadas al momento inicial del

estudio y en su sacrificio.
Nmero de Autocontrol
Peso vivo inicial (kg)
Peso vivo al sacrificio (kg)
Condicin corporal (C.C.)

418
59,6
57,6
2,5

515
59,2
52,0
2,5

807
25,0
28,0
1,5

Nota: El peso vivo inicial se midi el 07 de enero y el peso vivo final al igual que
la condicin corporal se midieron el 01 de abril.

31

2. Animales y material biolgico

2.1 Obtencin del material biolgico

Este proyecto fue sometido al Comit de tica de la Facultad de
Medicina de la Universidad de la Frontera (Resolucin Interna N 200/006), para
la obtencin de muestras de origen animal, el cul fue conformada por los
acadmicos: Seor Dr. Carlos Vallejos Vallejos, Seor Dr. Enrique Olave Riffo,
Sra. Dra. Ana Mara Alarcn Muoz, Seor Dr. Luis Silva Fuentes y presidida
por el Seor Dr. Ramn Fuentes Fernndez, Vicedecano de la Facultad,
informan que el proyecto: Efecto del plano de Nutricin sobre la expresin
de los receptores de estrgeno y progesterona en endometrio de ovejas
de la raza Criolla Araucana se aprueba en cuanto no se opone a la normativa
de biotica vigente.
Se utilizaron ovejas adultas de la raza Criolla Araucana de entre 2 a 4
aos de edad, mantenidas hasta su sacrificio en el predio experimental
Maquehue de la UFRO (Regin de la Araucana).
Inmediatamente despus de su sacrificio se extrajo muestras del sistema
reproductor, las cuales fueron seccionadas longitudinalmente en dos partes
iguales. Una de las partes se congel inmediatamente en nitrgeno lquido
para

extraccin de

RNA y la otra se fij en Bouin acuoso

para anlisis

inmunohistoqumico.

32

2.2 Preparacin de cortes histolgicos

Los cortes

histolgicos se obtuvieron a partir de rganos del sistema

reproductivo de ovejas adultas recin sacrificados. Los tejidos se fijaron en

Bouin acuoso (cido pcrico saturado 7%, formalina 2,5%, y cido actico
glacial 0,5%) por 48 horas.
Posteriormente se deshidrataron e infiltraron con parafina fundida. Los
bloques de parafina slida se procesaron para cortes histolgicos de 0,5 m.
Posteriormente los cortes se montaron sobre portaobjetos gelatinizados y se
procesaron para anlisis de inmunohistoqumica (IHQ). Para esto, inicialmente
los cortes fueron desparafinados sumergindolos en xilol dos veces por 20
minutos y luego se re hidrataron sumergindolos en una batera decreciente de
etanol (100, 96, 90, 80, 70, 60 y 50%) por 10 min en cada uno. Luego se
dejaron en PBS (phosphate buffer saline) por algunos minutos hasta su
procesamiento Inmunohistoqumico.

33

2.3 Anlisis inmunohistoqumico de los cortes histolgicos

Los cortes histolgicos hidratados fueron procesados comenzando con la
eliminacin de la actividad de peroxidasas endgenas incubando con H 2O2 3%
en metanol por 10 min. Luego se lav dos veces con PBS por 5 min cada vez y
se procedi a incubar en solucin de bloqueo (PBS; Albmina 1%; Triton X-100
0,3%; Leche 5%) a temperatura ambiente por 30 min. Se incub a continuacin
con un anticuerpo anti-RP y anti-RE diluido 1:100 y 1:500 respectivamente, en
solucin de bloqueo durante toda la noche (15 h aprox.) a temperatura
ambiente en cmara hmeda. Posteriormente los cortes se lavaron 3 veces por
5 min cada vez con PBS.

Se utiliz el sistema de deteccin

Ultravision

Detection System de Thermo Scientific (USA), el cual se basa en w

reconocimiento de un primer anticuerpo policlonal por un segundo anticuerpo
anti-IgG conjugado a biotina el cual es posteriormente es reconocido por el
complejo estreptoavidina conjugada a peroxidasa. El revelado se realiz
incubando en 40 ml de solucin de revelado (1ml PBS; 3lH2O230%; 300l DAB
10mg/ml)

a temperatura ambiente por 5 a 10 min. El portaobjeto con la

impronta o corte histolgico, se lav con PBS para luego teir para contraste
con hematoxilina previamente filtrada. Seguidamente, se deshidrat en una
batera creciente de etanol (50 a 100%), luego se diafaniz con xilol y
finalmente se mont para anlisis microscpico utilizando un microscopio
Olympus CX31.

34

3. Obtencin y diseo de partidores para RT-PCR

Los partidores que se utilizaron para el anlisis de RT-PCR convencional y

en tiempo real de los transcritos de los RE y RP, fueron diseados a partir de
secuencias genmicas obtenidas del banco de datos GenBank disponible en el
servidor Web del Instituto Nacional de Informacin Bioinformtica (NCBI, USA).
A partir de estas secuencias se disearon oligonucletidos partidores para
ambos genes utilizando el programa Primer 3 (Rozen y Skaletsky, 2000). Una
vez obtenida la secuencia stos fueron sintetizados en los laboratorios de
Genesys Ltda. Santiago, Chile.

35

4. RNA Total de rganos reproductivos de ovejas

4.1 Extraccin
La extraccin de RNA a partir de diferentes rganos de ovejas se efectu
de acuerdo a la metodologa descrita por Chomczynski y Sacchi, (1986) con
pequeas modificaciones. Los tejidos blandos se homogenizaron utilizando un
homogenizador ultraturrax (Tekmar Inc), aplicando 15.000 rpm por 20s.

En

ambos casos se homogeniz 1g de tejido recin extrado en 0.5 ml de tampn

de homogenizacin (tiocinato de guanidina 4 M, citrato de sodio 25 mM pH 7,
sarkosyl 0,5% y

-mercaptoetanol 0,1 M.). Luego se adicion, 0,05 ml de

acetato de sodio 2 M pH 4,0 ms 0,5 ml de fenol saturado en agua pH 4.5, y

0,1 ml de la mezcla cloroformo/alcohol isoamilico 49:1. La mezcla se agit por
inversin del tubo y posteriormente se centrifug a 1200 rpm por 10 min a 4C.
Luego de la centrifugacin, se transfiri 0,5 ml de fase acuosa a un tubo estril
de 1,5 ml. Se adicion 0.5 ml de isopropanol fro y se dej a -20C por 2h para
favorecer la precipitacin del RNA. El RNA precipitado se recuper
centrifugando a 6900 rpm por 5 min. Posteriormente, el sedimento obtenido se
lav dos veces agregando 1 ml de etanol 75% y centrifugando a 6900 rpm por
5 min. Finalmente el sedimento se sec a temperatura ambiente y
posteriormente se re suspendi en 35 l de agua ultra pura. El RNA extrado se
utiliz inmediatamente, de lo contrario este se conserva a -75C.

36

4.2 Cuantificacin y evaluacin de la integrida del RNA extrado

La concentracin del RNA, se estim midiendo la densidad ptica a 260nm
(OD260) y calculando la concentracin de acuerdo a la expresin [RNA] = OD 260
x FD x 40 g/ml, donde FD es el factor de dilucin utilizado y 40 g/ml es la
concentracin de RNA para un OD260 igual a 1 (Sambrook y Russell, 2001).
La integridad del RNA se evalu mediante electroforesis en gel de
agarosa/formaldehido. Para esto, se fraccion de 10 a 20 g de RNA en geles
de agarosa al 1,2% en tampn MOPS 1X (MOPS 20 mM pH 7, acetato de sodio
2 mM y EDTA 1mM pH 8,0) conteniendo formaldehido 10%. Las muestras de
RNA para la electroforesis se prepararon en una solucin de formaldehido 10%,
formamida desionizada 50%, tampn de carga 1X (glicerol 5%, EDTA 1mM pH
8,0

azul de bromofenol 0,025% y xylen cyanol 0,025%) ms 0,02 g de

bromuro de etidio. La corrida electrofortica se realiz a 100 volts. El RNA se

visualiz en el gel mediante un transiluminador de luz ultravioleta (Ultravision,
USA). La imagen del gel se captur digitalmente utilizando el sistema de
captura de imgenes Vilber Lourmat (USA).

37

5. Preparacin DNA complementario (cDNA)

5.1 Sntesis
Con el propsito de obtener el cDNA del RE y RP de endometrio de oveja,
se sintetiz la primera hebra mediante transcripcin reversa del RNA. Para esto
se desnaturalizarn 4 l de RNA total de cuerno de oveja adulta a 70C por 10
min. Inmediatamente despus se mezcl en hielo con tampn de transcripcin
1X (Tris-HCl 50 mM pH 8,3 KCl 75 mM, MgCl 2 3 mM), dNTPs 10 mM cada uno,
DTT 10 mM, 40 U de inhibidor de RNAsa (Promega),
transcriptasa reversa

200 unidades de

MMLV (Invitrogen) y 0,5 g de oligo-dT 20-tag

Posteriormente la mezcla de reaccin (25 l) se incub a 42C por 50 min.

Finalmente la enzima se inactiv calentando a 70C por 20 min. El producto
resultante fue utilizado inmediatamente, de lo contrario es conservado a -75C.

38

5.2. Amplificacin del cDNA por PCR convencional

Para el anlisis transcripcional de mRNA de los RE y RP se utilizaron los
siguientes partidores homlogos:

ESA1

5`-CTCCACGATCAAGTCCACCT-3

ESA2

5-ACGGAACCGAGACGATGTAG-3

PG1

5-TGTGCTGGAAGAAACGATTG-3

PG2

5-TAGGGCTTGGCTTTCATTTG-3

Estos partidores fueron utilizados para amplificar fragmentos de 200 pb

de las

regiones que codifican los dominios de unin al ligando de los

receptores de estrgeno y progesterona.

Como control endgeno en las reacciones de PCR se utilizaron los
partidores OBS y OBA los cuales permitieron amplificar una regin del gen de
-actina de 250 pb.

OBS

5-AACTCCATCATGAAGTGTGAC-3

OBA

5-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3

Estas amplificaciones se efectuaron en un volumen de 25 l conteniendo

tampn de amplificacin 1X (KCl 50 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,4), dNTPs 0,4
mM, MgCl2

2 mM, 1,5 U de Taq-polimerasa y 2 l del cDNA preparado

anteriormente a partir de 4 g de ARN total. La amplificacin se realiz

39

utilizando un termociclador programado para una denaturacin inicial a 94C

por 3 min, seguido de 35 ciclos cada uno conformado por denaturacin a 94C
por 30 s, apareamiento a 60 C por 30 s y extensin a 72C por 30 s. Luego de
finalizados los 35 ciclos se program una extensin final a 72C por 7 min.

40

5.3 Electroforesis en geles de agarosa

Los productos de RT-PCR

se fraccionaron en geles

preparados con

agarosa al 1,5% en tampn TAE 1X (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM). Se

utiliz un tampn de carga a concentracin final 1X, compuesto por azul de
bromofenol 0,03%, xylen cyanol 0,03%, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 50 mM,
pH 8 y glicerol 5%). La corrida electrofortica se efectu con un voltaje de 2
volts/cm en tampn de corrida TAE 1X. La deteccin del DNA fraccionado se
realiz incubando el gel con bromuro de etidio (0,5 g/ml) en tampn TAE 1X y
posterior visualizacin con luz ultravioleta. En paralelo con los productos de
PCR se fraccion un estndar de peso molecular conocido (100 pb ladder,
BioLabs) para estimar el tamao de los productos de PCR fraccionados.
Finalmente el gel se fotografi y la imagen se almacen digitalmente.

41

6. Evaluacin de los niveles de expresin de RE y RP por medio de

RT-PCR en tiempo real

Para evaluar el nivel de expresin de los mensajeros de los RE y RP se

utiliz anlisis de expresin relativa mediante RT-PCR en tiempo real utilizando
el equipo StepOne (Applied Biosystems, USA). Para este propsito se utilizaron
los mismos partidores diseados para los anlisis con RT-PCR convencional
descritos anteriormente. La evaluacin se realiz utilizando el programa
comparative delta-delta Ct proporcionado por el fabricante del equipo.
El anlisis se realiz utilizando reactivos proporcionas por Applied
Biosystems optimizados para ser utilizados en el equipo StepOne.
Las amplificaciones en tiempo real se efectuaron en un volumen de 10 l
conteniendo el tampn de amplificacin 2X (Applied Biosystems) el cual
contiene todos los reactivos necesarios para este propsito (dNTPs, MgCl 2, Taqpolimerasa y el fluorsforo intercalante SYBER-Green). Como templado se
utiliz 0.5 l del cDNA preparado a partir de de 4 g de ARN total. La
concentracin de los partidores homlogos fue de 1.5 pmoles/ul. Esta misma
concentracin de partidores se utiliz para la amplificacin del control endgeno
(-actina). Las condiciones trmicas del ciclado fueron: denaturacin inicial 10`
a 95C, seguida de 45 ciclos compuesto cada uno por una denaturacin inicial
de 95C por 20, hibridacin de los partidores (annealing) a 60C por 20, y una
extensin a 72C por 20. Al trmino de los 45 ciclos se program un anlisis de
fusin (melting) para evaluar la especificidad de la reaccin de amplificacin.

42

RESULTADOS

1. Cuantificacin de las concentraciones del RNA de cuerno extraido.

Las concentraciones de RNA fueron calculadas con la siguiente frmula:

[RNA] de la Mx= OD260 x FD x 40ul

FD= Vol. Total = 1004l = 251
Vol. Mx
4l

Tabla 3: La siguiente tabla muestra las concentraciones del RNA obtenidos de

ovejas con suplementacin a partir de un OD de 260 nm.
Nmero Autocontrol
Concentracin g/ul
260 nm
418
0.117
4.7
515
0.132
5.3
807
0.655
26.3
Tabla 4: La siguiente tabla muestra las concentraciones del RNA obtenidos de
ovejas sin suplementacin a partir de un OD de 260 nm.
Nmero Autocontrol
708
720

260 nm
0.211
0.214

Concentracin g/ul
8.5
8.6

43

2. Evaluacin de la expresin de los productos de PCR, obtenidos por

PCR convencional en geles de agarosa/formaldehido 1,2%.

Figura 7. En la figura, se muestran los productos de PCR obtenidos a partir de 4 g de RNA

total preparados de cuerno de ovejas adultas de la raza Criolla Araucana (flecha negra). Se
realiz en la misma reaccin de PCR y bajo las mismas condiciones un marcador.
RE708: Oveja sin alimentacin suplementada. RE418 y RE515: Ovejas con alimentacin
suplementada. Ambos grupos muestran los trascriptos de receptor de estrgeno; RP720: Oveja
con alimentacin suplementada. RP418 y RP515: Ovejas con alimentacin suplementada.
Ambos grupos muestran los trascriptos de receptor de progesterona.

44

3. Evaluacin semicuantitativa de los transcritos de RE y RP mediante

RT-PCR en tiempo real.

Tabla 5: Cuadro resumen del anlisis de expresin RE por RT-PCR en tiempo

real en endometrio de oveja de la Raza Criolla Araucana tratados con
alimentacin suplementada y de mantencin (normal).
Sample

(Mean)

(Std Dev)

(Mean)

(Std Err)

RQ

RQ

RQ

(Min)

(Max)

Target: ACT
CRN 4

25.2843

CRN 418*

22.302

CRN 515

36.6533

CRN 807

30.7048

Target: EST
CRN 4

27.9186

2.6343

0.1543

0.8986

CRN 418*

24.782

2.48

CRN 515

31.4788

-5.1745

-7.6545

201.4779

CRN 807

28.4898

-2.215

-4.695

25.9022

ACT: Control endgeno

45

Grfico 1.Representacin grfica de los resultados obtenidos por RT-PCR en tiempo real del
nivel de expresin comparativa del RE en ovejas adultas de la raza Criolla Araucana
alimentadas con dieta suplementada y alimentacin normal
CRN4: Oveja con alimentacin normal; CRN525: Oveja con alimentacin suplementada. (El
nivel de expresin del mRNA del ER se representa en el grfico con unidades arbitrarias
referidas a la expresin del gen reportero -actina amplificado bajo las mismas condiciones que
el gen ER)

46

Tabla 6: Cuadro resumen del anlisis de expresin RP por RT-PCR en tiempo

real en endometrio de oveja de la Raza Criolla Araucana tratados con
alimentacin suplementada y estndar.

Sample

(Mean)

(Std Dev)

(Mean)

(Std Err)

RQ

RQ

RQ

(Min)

(Max)

Target: ACT
CRN 4*

22.2724

CRN 418

21.0992

CRN 515

41.9015

CRN 807

31.4333

Target: EST
CRN 4*

24.3249

2.0525

-3.6546

-5.7071

52.2392

CRN 418
CRN 515

33.9239

CRN 807

27.7787

ACT: Control endgeno

47

Grfico 2: Representacin grfica de los resultados obtenidos por RT-PCR en tiempo real del
nivel de expresin comparativa del RP en ovejas adultas de la raza Criolla Araucana
alimentadas con dieta suplementada y alimentacin normal
CRN4: Oveja con alimentacin normal; CRN807: Oveja con alimentacin suplementada. (El
nivel de expresin del mRNA del PR se representa en el grfico con unidades arbitrarias
referidas a la expresin del gen reportero -actina amplificado bajo las mismas condiciones que
el gen PR).

48

4. Anlisis de la expresin y distribucin de RE y RP en endometrio de

oveja adulta mediante Inmunohistoqumica.
Con el propsito de localizar e identificar la expresin celular de RE y RP
en sistema reproductor, en los que previamente fueron detectados tanto el
transcrito

como

la

protena

por

medio

de

RT-PCR,

se

realiz

inmunohistoqumica en cortes histolgicos de cuerno del aparato reproductor de

ovejas adultas. Para este propsito se utiliz un anticuerpo policlonal
preparado originalmente contra RE y RP (NeoMearkers, Fremont, CA.)
La inmunorreactividad del anticuerpo fue demostrada al comparar cortes
histolgicos tratados sin el anticuerpo primario y con este anticuerpo. Las
seales

inmunorreactivas

tanto

para

receptores

de

estrgeno

como

progesterona se destacaron marcadamente en clulas de la zona caruncular y

glandular. Los cortes de cuerno con anti RP muestran la existencia de zonas
con inmunotincin discretas y relativamente bien definidas pero de menor
intensidad que las observadas en cortes de cuerno anti RE.

49

400X

B
C

400X
100X

400X

C
Figura 8. Anlisis Inmunohistoqumico para RE en endometrio de ovejas de raza Criolla Araucanas
adultas. En A, B y C se aprecia seal inunorreactiva tanto a nivel de glndula endometrial (flechas
rojas) como clulas del estroma (flechas azules), siendo A y B ovejas suplementadas y C ovejas no
suplementadas. En D se muestra un corte tratado sin el primer anticuerpo como control negativo.

400X
400X

400X

Figura

50

400X

100X

100X

100X

400X

Figura 9. Anlisis Inmunohistoqumico para RE en endometrio de ovejas de raza Criolla Araucanas

adultas. En A, B y C se aprecia seal inunorreactiva a nivel de la zona caruncular endometrial (flechas
rojas), siendo A y B ovejas suplementadas y C ovejas no suplementadas. En D se muestra un corte
tratado sin el primer anticuerpo como control negativo.

51

400X

400X

400X

400X

100X

400X

Figura 10. Anlisis Inmunohistoqumico para RP en endometrio de ovejas de raza Criolla Araucanas
adultas. En A, B y C se aprecia seal inunorreactiva tanto a nivel de glndula endometrial (flechas rojas)
como clulas del estroma (flechas azules), siendo A y B ovejas suplementadas y C ovejas no
suplementadas. En D se muestra un corte tratado sin el primer anticuerpo como control negativo.

52

C
C

Figura 11. Anlisis Inmunohistoqumico para RP en endometrio de ovejas de raza Criolla Araucanas
adultas. En A, B y C se aprecia seal inunorreactiva a nivel de la zona caruncular endometrial (flechas
rojas), siendo A y B ovejas suplementadas y C ovejas no suplementadas. En D se muestra un corte
tratado sin el primer anticuerpo como control negativo.

53

DISCUSIN

Los receptores esteroidales tienen primordial importancia en los

mecanismos reproductivos, siendo el tracto genital muy sensible a la accin de
las hormonas sexuales las que responden por medio de sus receptores
especficos modificando sus caractersticas estructurales. La respuesta celular
depende de distintos factores que afectan la sensibilidad y funcin de los
tejidos, como son el nmero y afinidad a sus receptores (tipos y subtipos de
ellos), el estado hormonal, la expresin selectiva en los rganos diana, la etapa
de desarrollo y el estadio reproductivo en que se encuentre el animal y la
diferencia entre las diversas especies (Meikle et al., 2004).
Tambin diversos estudios han descrito factores ambientales como la
foto sensibilidad, temperatura y nutricin que influyen en la reproduccin de los
mamferos en general, en el cual principalmente la deficiencia de micro o macro
nutrientes en rumiantes provoca una disminucin en su capacidad reproductiva
(T. G. Dunn & G. E. Moss., 1992).
La presencia de RE y RP ha sido estudiada en el tracto genital de
distintas especies y se han demostrado diferencias entre ellas. Mientras que en
las ovejas se encuentran altas concentraciones de RE y RP en el tero y
oviducto de animales pre pberes (Meikle et al., 2004) en perros (Lessey et al.)
los RP son en este estadio del desarrollo bajos o indetectables tanto en el tero
como en el oviducto. En primates y roedores la expresin de los receptores en
el oviducto es dependiente de las hormonas (Slayden et al., 1993) y su

54

regulacin seria en el oviducto similar a la del tero, aumentara con los

estrgenos y disminuira con la progesterona.
La expresin de RE y RP en animales pre pberes se ha detectado
anteriormente, en ovejas de la raza Corriedale (Garofalo & Tasende) y Romney
Marsh ( Vasconcellos et al., 2005).
El efecto del plano de nutricin sobre la expresin de estrgeno y
progesterona ha sido investigado con anterioridad, determinando algunos
estudios un mayor contenido de estradiol y progestgeno en sistema
reproductor de ovejas que recibieron una alimentacin suplementada que las
ovejas con alimentacin deficiente (J.-A. Abecia et al., 2006). Sin embargo,
tambin es necesario evaluar la expresin y distribucin de los receptores sobre
las que ellas actan. Adems su manejo podra modificar su comportamiento
reproductivo (Seplveda et al., 2007).
Se ha demostrado que ovejas adultas subnutridas contienen menores
niveles de expresin de receptores de estrgeno y progesterona en endometrio
que ovejas adultas con un plano nutricional normal (Sosa, et al., 2004).
El presente estudio demostr un efecto en la expresin de RE y RP
relacionados con la suplementacin de carbohidratos y protenas en ovejas
adultas de la raza Criolla Araucana, observndose un aumento de stos en el
endometrio, especficamente en tejido de cuerno del aparato reproductor.
La pared uterina de los ovinos funcionalmente puede ser dividida en
endometrio y miometrio. Normalmente el endometrio de los ovinos adultos
consta de un epitelio luminal (EL), epitelio glandular (EG), varios tipos de
estroma (estrato compacto y el estrato esponjoso), vasos sanguneos y clulas
55

inmunitarias.

En los ovinos, el endometrio tiene dos reas distintas una

aglandular caruncular y otra glandular intercaruncular (Taylor et al., 2000).

El rea caruncular presenta un EL y un estroma compacto y son los sitios
de implantacin y placentacin superficial. El rea Intercaruncular del
endometrio contiene una gran cantidad de glndulas uterinas que sintetizan y
secretan o transportan una variedad de enzimas, factores de crecimiento,
citoquinas, linfoquinas, hormonas, protenas de transporte, y otras sustancias
(Taylor et al., 2000).
Los resultados obtenidos mediante la tcnica de inmunohistoqumica,
demostraron una expresin de estos receptores, tanto en la zona caruncular
como en la zona glandular de tejido de cuerno en las ovejas que recibieron una
suplementacin en su plano nutricional de carbohidratos y protenas. Adems la
inmunorreactividad se encontr principalmente en el ncleo de las clulas
estudiadas, en el que el nivel de expresin obtenido de los receptores de
estrgeno fue mayor con respecto a los de receptores de progesterona
observados en este tejido, siendo esto comparable con otros estudios
realizados en este tipo de animales, en el cual la expresin de RP fue de menor
intensidad que para RE (Sosa et al., 2004). Adems algunos estudios
demostraron una marcada expresin de estos receptores en ovejas adultas, lo
que podra indicar que los animales se encontraban en la fase estro-metaestro
del ciclo, lo cual podra estar relacionado, con el periodo del ao (abril-otoo)
en que los animales fueron sacrificados teniendo en cuenta su estacionalidad
reproductiva ( Vasconcellos et al., 2009).

56

Esto nos permite evaluar de forma cualitativa una expresin marcada de

estas protenas en diferentes zonas de los tejidos evaluados, lo que induce
estudiar esta expresin de forma ms especfica mediante tcnicas de biologa
molecular.
Los resultados que se obtuvieron del RT-PCR en tiempo real evidencian
de forma semicuantitativa que la expresin que se observo en los resultados de
la tcnica histolgica

fue relevante, debido a que se demostr una mayor

expresin gnica de ambos receptores en el tejido de cuerno de las ovejas

suplementadas con alimentacin rica en carbohidratos y protenas que las
ovejas que no recibieron una alimentacin suplementada.
Una de las posibles explicaciones a la menor intensidad de los
receptores en ovejas no suplementadas se podra deber a diferencias en el
factor de crecimiento insulnico tipo I (IGF-I), que disminuye en ovejas
desnutridas. Se ha sugerido que el IGF-I estimula la produccin de RE en
funcin de una manera independiente de ligando y a su vez estos RE son el
principal inductor de la expresin de los RP, por lo que un bajo nivel nutricional
puede resultar en una menor cantidades de RP en endometrio, debido a que
IGF-I estimula el crecimiento y la diferenciacin de las clulas ovricas, y al
tener

una menor de concentracin de IGF-I producido por la privacin

nutricional podra dar lugar a depresin de la produccin de estradiol , y, por

consiguiente, una menor cantidad de RP (Sosa, et al., 2004).
Se concluye que la expresin de RE y RP es detectable en el endometrio
de las ovejas, variando la intensidad de su expresin segn su etapa de
desarrollo, estadio reproductivo y alimentacin, por lo cual este estudio permite
57

establecer que la alimentacin suplementada con carbohidratos y protenas si

estimula la expresin de receptores de estrgeno y progesterona en tejido de
cuerno de ovejas adultas de la raza Criolla Araucana, pudiendo adems tener
una relacin directa con la prolificidad de la oveja, sugiriendo as estudios
posteriores que podran evaluar este parmetro.

58

ANEXO

1. Protocolo Inmunohistoqumica
a) Eliminacin de la parafina:
1. Xilol1 20 minutos.
2. Xilol2 20 minutos.
2 Etanol 1 lavado (rehidratacin)
3. Etanol 100%1 10 minutos.
4. Etanol 100%2 10 minutos. Dejar secar al aire antes de continuar, esto
permite que la muestra se adhiera bien al portaobjetos.
5. Etanol 96% 10 minutos.
6. Etanol 90% 10 minutos.
7. Etanol 80% 10 minutos.
8. Etanol 70% 10 minutos.
9. Etanol 60% 10 minutos.
10. Etanol 50% 10 minutos.
11. Lavados con PBS 5 minutos X3.
(Rodear con lpiz hidrofbico)

b) Saturacin de las peroxidasas endgenas:

12. H2O23% en metanol 10 minutos. (solucin de bloqueo 1 punto 2 kit)
150ul x corte 10 minutos. (poner en bandejas de la estufa).

59

13. Lavados cortos con PBS (3 x 5 minutos)

c) Bloqueo sitios inespecficos:

14. Solucin de bloqueo (PBS; Albmina 1%; Triton X-100 0,3%; Leche 5%)
30 minutos. Punto 6 kit (ultra v block, una gota por corte).

d) Incubacin 1 anticuerpo: (especfico para c/hormona) 200ul x corte.

15. AntiX de A diluido en solucin de bloqueo Toda la noche a 20C en
cmara hmeda.
16. Lavados con PBS 5 minutos X3.
Incubacin con el 2 anticuerpo: (unido a la peroxidasa)
17. AntiFc de A de B en solucin bloqueo 30 minutos a 20 en cmara
hmeda (punto 10 kit) Reactivo Amarillo.
18. Lavados con PBS 5 minutos X3.
Incubacin con el 3 anticuerpo:
19. Peroxidasa-AntiPeroxidasa (PAP) de A en solucin de bloqueo 30
minutos a 20C en cmara hmeda.
20. Lavados con PBS 5 minutos X3.

e) Revelado:
21. Solucin revelado (1ml PBS; 3ul H 2 O2 30%; 300ul DAB 10mg/ml) 10
minutos. (aplicar al corte 150ul).
22. Lavados con PBS 5 minutos X3.
60

f) Tincin de los ncleos:

23. Agregar sobre los cortes Hematoxilina 1 minuto mximo,

Montaje:
24. Etanol 80% 2 minutos.
25. Etanol 96% 2 minutos.
26. Etanol 100% 2 5 minutos.
27. Etanol 100% 1 10 minutos.
28. Xilol 2 20 minutos.
29. Xilol 1 20 minutos.
30. Agregar Entellan Merck y montar sobre este un cubre objeto Incubar
toda la noche a 37C.
31. Mirar y disfrutar.

61

2. Protocolo extraccin RNA total (Mtodo de Chomczynski)

I) Extraccin RNA:
1) Homogeneizar 1 a 2g en 0.5 ml de solucin de homogeneizacin (D)
(D) - tirosinato de guanidina 4M
- citrato de sodio 25mM pH 7.0
- sarcosil 0.5%
- 2-Bmercaptol 0,5M
*Todo esto en agua estril (aproximadamente 100ml)
2) Agregar al microtubo
-

0.05 ml de acetato de sodio 2M pH4

0.5 ml de fenol saturado cido pH 4.5

0.1 ml de cloroformo/alcoholisoamilico 49:1

*Se agita por inmersin varias veces.

3) Centrifugar a 1200 rpm por 10` a 4C
4) Transferir la fase acuosa con micropipeta a un tubo estril y fro.
5) Agregar la fase recuperado 0.5 ml de isopropanol frio y dejar a -20C por
2h.
6) Centrifugar a 10000 por 5.
7) Desechar al sobrenadante y tomar el precipitado con 1ml de etanol 75%
por 5 (0.5 ml por 3)
8) Centrifugar a 10000 por 5
9) Repetir el paso 7 y 8
10)Dejar secar para que se vaya el etanol a 50C por 5.

62

11) Resuspender el RNA en 30 l de agua estril a 4C hasta el otro da

II) Cuantificar por Espectrofotometra el RNA:

1) Preparar una dilucin de 4ul de RNA ms 1000ul de agua ultra pura.
Mezclar en eppendorf de 1.5 ml.
2) Transferir a una cubeta de cuarzo y registrar OD 260 y OD280 en Shimadzu.
3) [RNA] de la Mx= OD260 x FD x 40l
FD= Vol. Total = 1004l = 251
Vol. Mx

4l

III) Estimacin de Pureza:

1) OD 260 = 1.8 2.0 RNA relativamente puro. Si da + o -, est
contaminado.
OD 280
2) En el caso que estuviese muy contaminado hacer una re extraccin
desde el punto 2 en adelante y en vez de solucin de homogeneizacin
se usa stock de RNA.
3) Mantener a -80C.

IV) Re-extraccin de RNA:

1) Agregar - 0.5 ml de fenol cido pH 5
- 0.5 ml cloroformo/alcoholisoamlico 49:1
- Agitar por inmersin
2) Centrifugar a 12000 rpm por 10
63

3) Recuperar la fase acuosa

4) Realizar la precipitacin con isopropanol
5) Realizar los lavados en etanol.

64

3. Protocolo preparacin gel agarosa/formaldehdo para RNA total

I)

Gel para 1%, 1.2%. 1.3%

1%
30 ml
0.3 g
3.0 ml
5.0 ml
19.0 ml

Agarosa
Mops 10X
Formaldehido 37%
Agua

1,2%
40 ml
0.5 g
9.6 ml
7.9 ml
22.5 ml

1,3%
40 ml
0.4 g
8.0 ml
6.6 ml
25.3 ml

*Disolver la agarosa en 19 ml de agua y luego agregar el resto de los

componentes.
*Calentar a 60C (microonda o mechero)

II) Muestra
RNA

4.5 l 5.0 l

Mops 10X

2.0 l 2.0 l

Formamida

10 l 9.0 l

Formaldehido 37% 3.5 l 3.5 l

*Incubar a 60 C por 15
Bromuro de etidio 1 l a 10g/ml o 2 l a o.5g/ml
Buffer de carga 3 a 4 l
Correr a 100 Volt y 50 mA o 50 Volt y 30mA

65

4. Protocolo sntesis de cDNA

I) Sntesis de cDNA
-

4l RNA

Oligo taq 10mM 2l

H20 5 l

*Incubar a 65C por 10`

*Poner en hielo

Adiciones:
-

Buffer RT 5X

4l

DTT 0.1 g

2l

dNTPS 10 mM

1l

Inhibidor de RNAsa

1l

Transcriptasa Reversa

1l

Volumen total= 20l

-

Incubar a 42C por 50`

Inactivar a 70C por 10`

Almacenar -20C

II) Sistema de extraccin con el Kit

-

Usar 2 a 4g de RNA por 20l de reaccin.

Colocar los componentes del Kit en Hielo

66

*Referido a la tabla, calcular el volumen de componentes necesarios para

preparara el numero de reacciones necesarias.

Componente
2X RT Buffer
20X Mix Ez
RNA
Nucleasas H20
TOTAL x Rx

Componente/Vol/Rvo
(+) RT Reactivo
10
1.0
Sobre 9l
0.5* l20
20l

Componente/Vol/Rvo
(-) RT Control
10
--Sobre 9l
0.5* l20
20l

*Cant. Suficiente

III) Obtener los valores de 4g de Mx

-

Ver el cuadrado para hacer el mix para la reaccin de cDNA y dejar a

-20C

Incubar la Reaccin a 37C por 60`

Parar la Reaccin a 95C por 5` y luego a 4C

Dejar a -20C Utilizar en termociclador

67

5. HIGH CAPACITY RNA-TO-CDNA KIT

(50 x 20 l reacciones)

Contenidos del Kit.

1 tubo RT Buffer Mix 2X (50 x 20 l reacciones)
1 tubo RT Enzyme Mix 20X (50 x 20 l reacciones)

Informacin importante de almacenamiento y conservacin:

-

High capacity RNA-to-cDNA Kit debe almacenarse a -15 C a -25 C

durante su vida til.

RT Enzyme Mix 20X debe almacenarse a -15C a -25C.
RT Enzyme Mix 20X puede ser almacenado a 2C a 8C para un mximo
de 6 meses para la facilidad de uso.

Procedimiento breve:
1. Usar hasta 2 g de RNA total por 20 L de reaccin.
2. Dejar descongelar los componentes del kit en hielo
3. Refirindose a la siguiente tabla, calcular el volumen de los componentes
necesarios para preparar el nmero de reacciones requeridas.

68

Componentes

Volmen de componente/Reaccin
+ RT reaccin

-RT control

2X RT Buffer

10.0

10.0

20X Enzyme Mix

1.0

----

RNA Sample

Sobre 9L

Sobre 9L

H2O

Hasta 20L

Hasta 20L

20.0

20.0

Total por Reaccin

4. Alicuotar el mix de reaccin en placas o tubos

5. Sellar las placas o tubos adecuadamente
6. Centrifugar brevemente las placas o tubos para eliminar las burbujas de
aire.
7. Colocar la placa o tubos en hielo hasta que est listo para iniciar la
reaccin de transcripcin reversa
8. Incubar la reaccin a 37C por 60 minutos. Detener la reaccin por
calentamiento a 95 C durante 5 minutos y mantener a 4 C. Por
conveniencia, la incubacin puede ser realizada en un termociclador.
9. El cDNA est listo para su uso en aplicacin en PCR en tiempo real o en
almacenamiento a largo plazo en un congelador (-15C a -25C).

69

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