Informe Lab I Anríquez-Canavez - León Avanzado

Universidad de Santiago de Chile
Facultad Tecnolgica
Departamento de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos
Ingeniera de Alimentos
INGENIERIA DE BIOPROCESOS - LABORATORIO
Crecimiento celular
Laboratorio I
Francisca Anrquez Jorge Canaves Patricio Len
Profesor: Sergio Aguilera

Ayudante:

Facultad Tecnolgica
1
INTRODUCCIN
En un sistema biolgico se define al crecimiento como el aumento ordenado de

las estructuras y los constituyentes celulares de un organismo, al sembrar
microorganismos en un medio de cultivo apropiado, stos comienzan a dividirse
activamente empleando los nutrientes que les aporta el medio de cultivo
(pumarola, 1999).
Estas variaciones que experimentan los microorganismos en el tiempo siguen un
perfil definido, llamado curva de crecimiento que es caracterstico para cada
microorganismo (aguilera, 2013). sta curva muestra distintas fases, cuyos
tiempos son variables y debe establecerse para cada medio y microorganismo;
debido a ello se han desarrollado una variedad de mtodos fsicos y qumicos para
cuantificar las modificaciones que experimenta una poblacin dada (scott, 2001).
En la presente experiencia de laboratorio, .

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2
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
Monitorear el crecimiento de un cultivo de levaduras (Saccharomyces cereviseae)

en un medio de laboratorio por medio del uso de mtodos directos e indirectos.
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Caracterizar la curva de crecimiento de la levadura S. cereviseae

Determinar la viabilidad del cultivo durante su crecimiento
Relacionar el cultivo de sustrato con el crecimiento del microorganismo
Medir el consumo de glucosa por el uso del kit GOD PAP.

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3
DATOS Y RESULTADOS
Construccin
de
la
curva
de
crecimiento
por
medio
de
espectrofotometra
Tabla 1: Mediciones de absorbancia a 600 nm de Saccharomyces cereviceae.
Tubo
Tiempo
[h]
Abs600
Fd
Abs600
corregid
a
0,002
0,002
0,023
0,023
vaci en una cubeta y se utiliz como blanco
0,021
0,021
en el espectrofotmetro
0,192
0,192
10
0,970
0,970
14
0,774
1,548
16
0,984
1,968
20
0,760
3,04
24
0,858
3,432
3-4 ml del medio de cultivo sin levadura se
3-4 mL del cultivo se vaci en una cubeta y

se midi su absorbancia a 600 nm.
La
absorbancia
corregida
se
obtuvo
multiplicando la absorbancia por el factor de

dilucin.
Al confeccionar un grfico con los valores de la tabla 1 se puede observar las

distintas fases de crecimiento para el microorganismo en estudio.
Grafico 1: Curva de crecimiento para cultivo de Saccharomyces cerevisiae.

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4
3.5
3
Fase estacionaria
2.5 Fase post-diuxica

Absorbancia 600 nm
Cambio1.5
diuxico
1
0.5Fase log
0
0
Fase lag
10
15
20
25
30
Tiempo [h]
La levadura Saccharomyces cerevisiae

muestra 5 fases de crecimiento
claramente definidas cuando es cultivada en medios lquidos con glucosa como
fuente de carbono, estas son: la fase lag, la fase logartmica, el cambio diuxico, la
fase post-diuxica y la fase estacionaria. (Folch-Mallol y col, 2004).
Para el caso de la muestra inoculada para efectos experimentales, permite
identificar explcitamente cada una de las fases mencionadas con anterioridad.
Determinar la viabilidad y la concentracin celular de levaduras

(Saccharomyces cerevisiae) mediante recuento directo.
El mtodo de recuento directo consiste en la utilizacin de una cmara de

Neubauer, en la cual se vierte un volumen de muestra con tincin. Utilizando un
microscopio, se cuenta el nmero de clulas presentes en un determinado nmero
de campos escogidos al azar. Conociendo el rea del campo microscpico y las
diluciones realizadas, se puede determinar tanto la densidad celular como el
porcentaje de viabilidad.

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Tabla 2: Recuento de clulas en cmara de Neubauer, concentracin y porcentaje
de viabilidad.
Tub
o
Tiemp
o [h]
4
5
6
7
8
9
8
10
14
16
20
24
Clula
s
blanca
s
11
22
35
75
178
392
Clula
s
azules
Factor de
dilucin
Concentraci
n celular
Viabilidad
[%]
1
1
1
5
22
8
1
1
1
1
1
1
3,0x106
5,75 x106
9,0 x106
20,0 x106
50,0 x106
100,0 x106
91,67
95,65
97,22
93,75
89,0
98,0
Grafico 2: Concentracin celular v/s tiempo.
Concentracion celular
Mezclar 50uL de cultivo

+
50uL
de
azul
de
metileno.
Tomar 10uL de la mezcla
COncentracin celular
anterior y depositar en la
Cmara de Neubauer
Contar en el microscopio
120000000
100000000
f(x) = 543366.86 exp( 0.22 x )
80000000
R = 0.99
60000000
40000000
20000000
0
6 8 101214161820222426
Tiempo [h]

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Determinacin de la velocidad de crecimiento y el tiempo de

duplicacin
La velocidad de crecimiento se determinara a travs de dos mtodos: el modelo

biolgico y la ecuacin lineal.
La modalidad terica se determina utilizando el modelo biolgico que representa la
ecuacin 3:
ln
X
=t
X0
Donde:
X : Concentracin final de clulas [cel/ml]
X0
: Concentracin inicial de clulas [cel/ml]
: Velocidad de crecimiento [hr-1]

t: Tiempo de crecimiento exponencial [h]
Como la fase exponencial se determino entre las 8 y 10 horas (ver tabla 2) el
tiempo total de crecimiento exponencial fue de 2 horas, por lo tanto:
ln
5,75E6
=2
3E6

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=0,33[hr 1]
La modalidad experimental se determina utilizando la ecuacin de la recta:

ln X =t+ ln X 0
Para eso se grafican los datos de la siguiente tabla:

Tabla 3: Logaritmo natural de la concentracin y tiempo
Tiempo [h]
8
10
Concentracin
celular[cel/ml]
3,0x106
5,75 x106
Ln concentracin
14,91
15,56
Grafico 3: Logaritmo natural de la concentracin celular a travs del tiempo.

15.8
15.6
f(x) = 0.33x + 12.31
R = 1
15.4
15.2
Ln concentracin [cel/ml]
15
14.8
14.6
14.4
7.5
8.5
9.5
Tiempo [hr]
Del grafico se obtiene:
10 10.5

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ln X
[ ]
cel
=0,325t +12,31
ml
La pendiente de la recta corresponde a la velocidad especifica de crecimiento,

1
siendo igual a 0,325 [ h ]
El tiempo de duplicacin se determina a partir de la siguiente ecuacin:

td=
ln 2
Donde:
td: Tiempo de duplicacin [h]
: Velocidad de crecimiento [h-1]
El tiempo de duplicacin equivale al tiempo en que se tarda en duplicar la biomasa

celular.
Reemplazando los datos en la ecuacin 4, se obtiene:
h
0,325[ 1]
0,69
td =
td=2,12[h]

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El tiempo promedio que tardara la levadura en duplicar su biomasa ser de
aproximadamente 2,12 horas.
Determinacin de glucosa residual por el mtodo GOD-PAP
Tabla 4: concentracin de glucosa residual

Se verti 50uL de muestra en 1ml de
Tubo
YPD
Tiemp
o [h]
Abs500
Factor
de
dilucin
Abs500
corregid
a
[Glucosa]
0,4491
10
4,4914
33,33
0,2577
10
2,577
18,34
0,5732
2,2928
16,11
10
0,4263
1,7052
11,51
16
0,7423
0,7423
3,97
El blanco se elabor reemplazando
24
0,3821
0,3821
1,15
los 50uL de cultivo por 50uL de agua
reactivo GODPAP y se llev a

incubar por 5min a 37C.
Luego se vaci en 4 mL de agua se
homogeneiz y se vaci en una
cubeta
para
medirla
en
el
espectrofotmetro
destilada y se mezcl con el reactivo

y
se
incub
condiciones.
en
las
mismas

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35
30
25
20
[Glucosa] [g/L]
15
10
5
0
0
10
15
20
25
30
Tiempo [h]
Grafico 4: Variacin de glucosa residual a travs del tiempo
Grafico 5: Variacin de glucosa residual a travs del tiempo frente a la

absorbancia.

Facultad Tecnolgica
35
30
3.5
3
25
2.5
20
[glucosa] [g/L]
2
15
Abs 600
[Glucosa]
1.5
10
Abs 600
0.5
0
0
10
15 20
25 30
Tiempo [h]
Para calcular la cantidad de glucosa consumida, es posible calcularla mediante la

resta entre la concentracin inicial y las concentraciones a tiempo 6, 8, 10, etc.
Tabla 5: concentracin de glucosa consumida
Tiempo [h]
Concentracin Glucosa [g/l]
Glucosa consumida
33,33
18,34
14,99
16,11
17,22
10
11,51
21,82
16
3,97
29,36
24
1,15
32,18
Grafico 6: Variacin de glucosa consumida a travs del tiempo.

Facultad Tecnolgica
35
30
25
20
Concentracin de glucosa consumida
15
10
5
0
0
5 10 15 20 25 30
Tiempo [hr]
Clculo del rendimiento de la glucosa por medio de

Y x=
s
Yx
s
X
S
Donde:
Yx
s
= Rendimiento de glucosa
= Diferencia de la concentracin celular en un tiempo determinado (Xf -
X0). S
=Consumo de glucosa (S0 Sf).

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Por lo tanto considerando el tiempo inicial y final de incubacin, de 6 y 24 horas
respectivamente, se tiene:
Tabla 6: relacin entre concentracin de glucosa consumida y la concentracin de clulas.
Tiempo
Concentracin celular
Concentracin Glucosa consumida
[h]
[cel/ml]
[g/ml]
3,0 x106 *
0,015
24
100,0 x106
0,032
*se utiliza para tiempo 6hrs la concentracin celular inicial de la fase exponencial
de la levadura ya que segn el grafico N2 no habra gran diferencia a tiempo 8 hr
y 6 hr.
Reemplazando:
Y x=
s
Y x=
s
X
S
( 1003 ) x 10 6
(0,0150,032)
Y x =
s
5,7x109 (cel/g)

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DISCUCIONES
Mtodos directos
Curva de crecimiento mediante turbidimetra

La turbidimetra es un mtodo directo de estimacin del nmero de bacterias en un
cultivo. Se realiza en un espectrofotmetro donde se transmite un haz de luz a
travs de una suspensin bacteriana a una clula fotoelctrica. Cuando menor es
la cantidad de luz transmitida mayor es la cantidad de bacterias en la muestra. La
medicin logartmica del equipo se denomina absorbancia (tortora, 2007)
En el grafico N1 se observan 5 fases de crecimiento claramente definidas cuando
es cultivada en medios lquidos con glucosa como fuente de carbono, estas son: la
fase lag, la fase logartmica, el cambio diuxico, la fase post-diuxica y la fase
estacionaria. (Folch-Mallol y col, 2004), esta ltima fase se caracteriza por la
produccin de productos que inhiben la reproduccin de las levaduras. La fase de
ms importancia en procesos productivos es la fase logartmica, en esta etapa
Mientras se consumen nutrientes se van acumulando productos inhibitorios lo que
provoca que la velocidad de crecimiento se iguale a la velocidad de muerte,
llegando a un equilibrio celular. Esta etapa es importante pues es aqu donde se
producen los metabolitos secundarios (Hernndez, 2003).
Mtodos directos
Recuento celular; viabilidad, velocidad especfica de crecimiento y tiempo de
duplicacin
En la experiencia se utiliz azul de metileno. Segn Tabla 2, los datos existentes
hablan del crecimiento en la fase de crecimiento exponencial, se observaron
valores de viabilidad sobre 90% estos datos fueron entregados despus de la
experiencia, segn en el grafico N1 se espera luego de la hora 25 un
decrecimiento en la viabilidad de las clulas ya que en fase estacionaria las

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clulas producen en grandes concentraciones productos txicos para la
reproduccin y su crecimiento.
La velocidad especfica de crecimiento es la velocidad de aumento de
concentracin celular por unidad de tiempo. Se obtiene de la fase de crecimiento
exponencial, pues ah se mantiene constante. Se calcul por pendiente ( = 0,325
[h-1]) siendo similar a la velocidad mxima de Saccharomyces cerevisiae de 0,27
[h-1] con alimentacin de glucosa y 28C (Albiol et al., 2010)
El tiempo de duplicacin es el tiempo necesario para que la poblacin de clulas
se duplique y al igual que permanece constante durante la fase de crecimiento
exponencial (Hernndez, 2003). El td se calcul por pendiente (td = 2,12 [h])
Mtodos indirectos
Consumo de glucosa y rendimiento del sustrato
El consumo de glucosa se estima a travs de la concentracin residual de glucosa
(fase exponencial) que se determina despus de la oxidacin enzimtica en
presencia de glucosa oxidasa (GOD-PAP). El perxido de hidrgeno formado
reacciona bajo la catlisis de la peroxidasa con fenol y 4-amino-fenazona
produciendo un complejo rojo-violeta usando la quinoneimina como indicador que
absorbe a 500 nm (Ficha GOD-PAP; Human, Alemania). El comportamiento lgico
es que la concentracin residual de glucosa disminuya en el tiempo conforme los
microorganismos se multiplican, y que tienda a estabilizarse a medida que la tasa
de crecimiento decrece a medida que el sustrato comienza a escasear o es
consumido en su totalidad (Acevedo, 2004). Este comportamiento fue el
observado. Adems, para el rendimiento del sustrato de determin que se
producan 5,7 x 109 [cel] por gramo de sustrato (glucosa) consumido.
5
CONCLUSIONES

Facultad Tecnolgica
6
REFENCIAS BIBLIOGRFICAS
-
Pumarola A. Microbiologa y Parasitologa Mdica . Masson S.A. 1999.
Pginas 62-63.
Folch-Mallol J., Garay-Arroyo A., Lledas F., Covarrubias A. La respuesta a
estrs en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Revista Latinoamericana
de Microbiologa. Vol. 46. No. 1-2. 2004. Pginas 24 46.

Aguilera S. , Contreras A. Gua de Laboratorio de Ingeniera en
Bioprocesos:
Crecimiento
Celular.
Laboratorio
de
Ingeniera
en
Bioprocesos. Facultad Tecnolgica. Ingeniera en alimentos. Universidad de

-
Santiago de Chile. 2013.

Scott H. Elementos de Ingeniera de las Reacciones Qumicas, Editorial
Pearson Educacin. Tercera Edicin. 2001. Pginas 395-396.
Hernndez, A., Microbiologa Industrial, Editorial Universidad Estatal A

Distancia, 2003.
Tortora, G., Introduccin a la microbiologa, 9na Edicin, Editorial Mdica

Panamericana, 2007.
Acevedo, F., Gentina, J., Illanes, A., Fundamentos de Ingeniera

Bioqumica, 2da Edicin, Ediciones Universitarias de Valparaso, Pontificia
Universidad Catlica de Valparaso, 2004.
Albiol, J., Barreiro, A., Beltrn, G., Chiva, R., Ferrer, P., Gniko, J.,
Gonzlez, R., Guillamn, J. M., Gutirrez, A., Martnez, R., Mas, A., Quirs,
M., Sancho, M., Vzquez, F., Lnea troncal metabolmica Saccharomyces
cerevisiae, 2010.

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En un sistema biolgico se define al crecimiento como el aumento ordenado de

En la presente experiencia de laboratorio, .

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Monitorear el crecimiento de un cultivo de levaduras (Saccharomyces cereviseae)

Caracterizar la curva de crecimiento de la levadura S. cereviseae

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vaci en una cubeta y se utiliz como blanco

3-4 ml del medio de cultivo sin levadura se

3-4 mL del cultivo se vaci en una cubeta y

multiplicando la absorbancia por el factor de

Al confeccionar un grfico con los valores de la tabla 1 se puede observar las

Grafico 1: Curva de crecimiento para cultivo de Saccharomyces cerevisiae.

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2.5 Fase post-diuxica

La levadura Saccharomyces cerevisiae

Determinar la viabilidad y la concentracin celular de levaduras

El mtodo de recuento directo consiste en la utilizacin de una cmara de

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Grafico 2: Concentracin celular v/s tiempo.

Mezclar 50uL de cultivo

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Determinacin de la velocidad de crecimiento y el tiempo de

La velocidad de crecimiento se determinara a travs de dos mtodos: el modelo

: Concentracin inicial de clulas [cel/ml]

: Velocidad de crecimiento [hr-1]

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La modalidad experimental se determina utilizando la ecuacin de la recta:

Para eso se grafican los datos de la siguiente tabla:

Grafico 3: Logaritmo natural de la concentracin celular a travs del tiempo.

Del grafico se obtiene:

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La pendiente de la recta corresponde a la velocidad especifica de crecimiento,

El tiempo de duplicacin se determina a partir de la siguiente ecuacin:

El tiempo de duplicacin equivale al tiempo en que se tarda en duplicar la biomasa

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Determinacin de glucosa residual por el mtodo GOD-PAP

Tabla 4: concentracin de glucosa residual

El blanco se elabor reemplazando

los 50uL de cultivo por 50uL de agua

reactivo GODPAP y se llev a

destilada y se mezcl con el reactivo

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Grafico 4: Variacin de glucosa residual a travs del tiempo

Grafico 5: Variacin de glucosa residual a travs del tiempo frente a la

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Para calcular la cantidad de glucosa consumida, es posible calcularla mediante la

Concentracin Glucosa [g/l]

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Clculo del rendimiento de la glucosa por medio de

=Consumo de glucosa (S0 Sf).

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Tabla 6: relacin entre concentracin de glucosa consumida y la concentracin de clulas.

Concentracin Glucosa consumida

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Curva de crecimiento mediante turbidimetra

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Pumarola A. Microbiologa y Parasitologa Mdica . Masson S.A. 1999.

de Microbiologa. Vol. 46. No. 1-2. 2004. Pginas 24 46.

Bioprocesos. Facultad Tecnolgica. Ingeniera en alimentos. Universidad de