Laboratorio de separacin de clulas

Daniel Fernando Botia Snchez 2111982

Ricardo Galindo Rodrguez 2030087
Juan Carlos Hernndez Vargas 2143569
Diego Armando Vargas Mantilla 2142524
Mario Hernn Quintero Noguera 2160940

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

Facultad de Salud
Escuela de Medicina
Biologa celular Grupo PD

INTRODUCCION:

El PDGF se encuentra en el plasma y su nombre viene porque fue encontrado por

primera vez en las plaquetas, Entre los tipos celulares productores de los factores de
crecimiento estn los fibroblastos, osteoblastos, clulas endoteliales y leucocitos,
especialmente, monocitos y macrfagos. Adems existen lugares de almacenamiento,
como son las plaquetas (en los grnulos a) y el hueso (adheridos a la matriz sea).
Las plaquetas son pequeos fragmentos citoplasmticos presentes en sangre que
derivan del megacariocito, miden 3 m aproximadamente, actan en la coagulacin de
la sangre, en la retraccin y disolucin del coagulo y en los procesos de cicatrizacin.
Estas son las primeras clulas que actan cuando se produce un dao, y sufren
desgranulacin en los sitios de las heridas, liberando entre otros los factores de
crecimiento.
La forma biolgicamente activa de PDGF es un dmero formado por dos cadenas
polipeptdicas, unidas por puentes disulfuro. Puede estar presente como homodmero
o como heterodmero y dependiendo del tipo de dmero formado muestra actividad
diferencial. PDGF es el producto de cuatro diferentes genes que son ensamblados en
cinco isoformas distintas conocidas como: AA, AB, BB, CC y DD. El receptor de
PDGFR (PDGFR) se forma de la combinacin de las cadenas llamadas alpha () y
beta () en cualquier orden (, , ), el receptor dimrico se forma solamente luego
de la unin del ligando y se une con distinta afinidad a las diferentes isoformas de
PDGF. En el proceso de activacin del receptor, la isoforma se une de manera
especfica a dos monmeros en la membrana plasmtica, cercanos uno del otro
atrayndolos y provocando su dimerizacin, como consecuencia, el loop que obstruye
el sitio cataltico del dominio kinasa) es desplazado a causa de la autofosforilacin de
estos residuos de tirosina causando un cambio conformacional y la creacin de sitios
docking para protenas involucradas con la transduccin de seales, que conducen a
la expresin de genes y a la sntesis de protenas.
Sndrome de las plaquetas grises o Sndrome de Pool de Depsito-a
Se caracteriza por anormalidades morfolgicas en megacariocitos y en plaquetas que
aparecen grises en extendidos de sangre perifrica o en aspirados de mdula sea
cuando se colorean con colorantes Wright-Giemsa. Esto se debe a la ausencia de
grnulos a en megacariocitos y en el citoplasma plaquetario. Por tal motivo, las
plaquetas grises manifiestan ausencia y/o disminucin de las protenas sintetizadas en
ellas e incorporadas a ellas. Los otros grnulos plaquetarios estn en nmero normal.
La mielofibrosis medular que se presenta en esta patologa se atribuye a la
espontnea liberacin de factores de crecimiento PDGF y TGF-b-1 del megacariocito
maduro. La P-selectina est distribuida en forma anormal en membranas
intracelulares del megacariocito maduro. Estudios ultraestructurales han demostrado la
presencia de pequeos grnulos de alrededor de 0.1 mm de dimetro en el
megacariocito de plaquetas grises los cuales seran los precursores de los grnulosa y
la P-selectina estara localizada en las membranas de estos pequeos grnulos.
Las bases moleculares de este sndrome no se conocen pero podra involucrar a un
receptor de seleccin cuando dejan el aparato de Golgi. En las familias estudiadas, la
herencia es principalmente autosmica recesiva.
El mecanismo de sangrado en esta trombopata no est claramente definido desde el
nivel molecular. Se sugiere que puede estar asociado a la falta de protenas adhesivas
como FvW, trombospondina y fibronectina que son necesarias para el contacto celular,
la generacin de trombina y posteriormente la agregacin plaquetaria.
Los niveles plasmticos de Factor 4 plaquetario y b-tromboglobulina se encuentran
elevados indicando que el defecto no es la sntesis de stos en el megacariocito sino
el almacenamiento de los mismos en los grnulos a.
METODOLOGIA:

Se utilizaron dos cultivos celulares preparados previamente con una lnea celular de
aedes aegypty C6/36, a uno de las cuales se le agreg SBF y al otro no. Ambos
cultivos fueron observados en el microscopio invertido y se registraron las diferencias
entre ambos. Posteriormente se removieron las clulas de la pared inferior de la caja y
se homogeniz la solucin con una micropipeta, para luego tomar una muestra de 1
m a la que se le agreg 1 m de azul de metileno, seguidamente se tom suficiente
cantidad para llenar una de las cmara de nuebauer con la muestra de cada cultivo;
por ltimo se realiz el conteo de clulas en el microscopio (objetivo de 40x)
apoyndose en la cuadricula vista, y se registraron tanto las clulas vivas, como las
muertas para poder realizar una comparacin cuantitativa entre ambas muestras.

RESULTADOS

Figura 1. Muestras
Muestra 1
Clulas vivas en los cuatro cuadrantes: 14
Clulas muertas en los cuatro cuadrantes: 9
Promedio:

14 celulas vivas
=3.5 celulas vivas /cuadrante
4 cuadrantes
9 celulas muertas
=2.25 celulas muertas /cuadrante
4 cuadrantes

Factor de dilucin: 2
Factor de volumen: 0.1 mm * 0.1 mm * 0.01 mm =
Concentracin de clulas =

104

mm3

1
factor de volumen * promedio de clulas * factor de

dilucin
Concentracin clulas vivas:

1
4
10

* 3.5 * 2 = 70000 clulas vivas/ mm

Concentracin clulas muertas:

Tasa de proliferacin:

1
104

* 2.25 * 2= 45000 clulas muertas/ mm

celulas vivas
100 =
celulas totales

14 celulas vivas
100 = 60.86
23 celulas totasles

%
Tasa de mortalidad:

celulas muertas
100
celulas totales

9 celulas muertas
100 = 39.13 %
23 celulas totales

Muestra 2
Clulas vivas en los cuatro cuadrantes: 3
Clulas muertas en los cuatro cuadrantes: 15
Promedio:

3 celulas vivas
=0.75 celulas vivas/cuadrante
4 cuadrantes
15 celulas muertas
=3.75 celulas muertas /cuadrante
4 cuadrantes

Factor de dilucin: 2
Factor de volumen: 0.1 mm * 0.1 mm * 0.01 mm =
Concentracin de clulas =

10

mm

1
factor de volumen * promedio de clulas * factor de

dilucin
Concentracin clulas vivas:

1
104

Concentracin clulas muertas:

Tasa de proliferacin:

* 0.75 * 2 = 15000 clulas vivas/ mm

1
104

* 3.75 * 2= 75000 clulas muertas/ mm

celulas vivas
100 =
celulas totales

3 celulas vivas
100 = 16.66
18 celulas totasles

%
Tasa de mortalidad:
83.33%

celulas muertas
100
celulas totales

15 celulas muertas
100 =
18 celulas totales

Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 1.

Tabla 1
Clulas/
Muestra 1

mm3

70000 clulas
vivas/ mm

Tasa de proliferacin

Tasa de mortalidad

60.86 %

39.13 %

16.66 %

83.33%

45000 clulas
3

muertas/ mm
Muestra 2

15000 clulas
vivas/ mm

75000 clulas
3

muertas/ mm

CONCLUSIONES:

La muestra 1 contena los componentes necesarios para la supervivencia, ms

el factor de crecimiento derivado de plaquetas, mientras que la muestra 2 solo
contena los componentes necesarios para la supervivencia.
En el microscopio invertido, no fue posible diferenciar cual cultivo presentaba el
factor de crecimiento, presumiblemente debido al tiempo que tenan de
montada las muestras y por tanto no se apreciaba la proliferacin clula, luego,
se necesitan varias horas para poder diferenciar cualitativamente que cultivo
tena el factor de crecimiento.
Los resultados pueden estar expuestos a error, debido a la falta de experiencia,
por parte de los integrantes del grupo, lo que pudo haber conllevado a
equivocaciones durante la realizacin de la prctica.

DISCUSION
La diferencia entre los resultados obtenidos, se debe a que una de las muestras
estudiadas contena, aparte de los componentes necesarios para la supervivencia,
factor de crecimiento derivado de plaquetas, que inducia a la divisin celular, por el
contrario, con el paso del tiempo, los componentes necesarios para la supervivencia

no eran suficientes, lo que, sumado a la no adicin de factor de crecimiento, inducan a

la muerte celular.

REFERENCIAS

Del Valle, M. Maestro, A. Garca, O. Rodrguez, L. Medina, B. Vega, A. 2006.

Distribution of the platelet-derived growth factor receptors (PDGFR y
PDGFR) in the muscle-skeletal system. Vol. 4 N 2. MAPFRE Foundation.
Murakami, E. (2008) Sealizacion celular (Capitulo 3: Factores de crecimiento
pp 45-50). (Editorial desconocida).
Cataeda, Nadia. Castellanos, Jaime. Zapata, Angela. Bello, Felio. (2007)
AEGY-28 Cell Line of Aedes aegypti (Diptera Culicidae) is Infection
Refractory to Dengue 2 and Yellow Fever Virus. Acta bioi. Colomb., Vol. 12
No.2, 2007 47 58.
Lucha, V. Muoz, V. Garcia, M. 2008. La cicatrizacin de las heridas.
Enfermeria dermatolgica N 3.