Tesis Joilyneth Ferreira R PDF

UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

COORDINACIN DE POSTGRADO EN BIOLOGIA
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLGICAS
TESIS DOCTORAL
IDENTIFICACIN DE NUEVOS ANTGENOS DE Anaplasma marginale

MEDIANTE VACUNOLOGA INVERSA
Por
Joilyneth Ferreira Reyes
Noviembre 2013
ii

COORDINACIN DE POSTGRADO EN BIOLOGIA
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLGICAS
IDENTIFICACIN DE NUEVOS ANTGENOS DE Anaplasma marginale

MEDIANTE VACUNOLOGA INVERSA
Tesis Doctoral presentado a la Universidad Simn Bolvar por
Joilyneth Ferreira Reyes
como requisito parcial para optar al grado acadmico de
Doctor en Ciencias Biolgicas
Con la asesora de los profesores

Juan C. Martnez
Antonietta Porco
Noviembre 2013
iiiiii
iviv
vv
vi
DEDICATORIA
Este trabajo es dedicado a todas aquellas personas que deciden emprender un camino
desconocido para alcanzar una meta, que no creen en imposibles, que son constantes,
perseverantes y sobre todo para las que creen que Dios siempre est a su lado, apoyndolos,
sobre todo en los momentos ms difciles de nuestras vidas, abrindonos las puertas del xito y
colocando en nuestro caminos a ngeles de la guarda como lo son nuestros amigos y
familiares, quienes estn dispuestos a darnos lo mejor de s y andar con nosotros en ese
camino brindndonos su apoyo a travs de sus experiencias y conocimientos, los cuales son
las escaleras que nos ayudan a subir hasta lo ms alto de la cima para alcanzar la bandera del
xito.
vii
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar agradezco al Prof. Henry Caballero por abrir sus puertas del
laboratorio de Inmunologa y Bioqumica de Hemoparsitos para iniciarme en esta
investigacin. A la Prof. Antonietta Porco por ser como una madre acadmica, apoyndome y
dndome nimos para seguir adelante, aportndome conocimientos para facilitar mis estudios.
Al Prof. Jos Bubis a quien aprecio muchsimo por ser un gran apoyo en mi carrera,
ofrecindome su ayuda incondicional. A mi gran amigo y compaero en este arduo camino el
Dr. Juan Carlos Martnez a quien aprecio enormemente por su gran ayuda como jefe, tutor y
amigo, quien fue mi apoyo en los momentos ms difciles de mi carrera, brindndome su
ayuda para avanzar justo en el momento en que mas lo necesitaba; sin l este trabajo no
hubiese sido posible. De verdad que le estoy inmensamente agradecida, no hay palabras que
puedan describir todo el agradecimiento y cario que le tengo, es un excelente jefe, tutor y
amigo.
Les agradezco a todos mis compaeros y profesores del Grupo de Bioqumica e

Inmunologa de Hemoparsitos: Dra. Loly Rojas, Dra. Gladinex Prez, la Prof Mary Isabel
Gonzzati, el Prof. Pedro Aso, quienes en algn momento aportaron su valiosa ayuda; en
especial a la Lic. Vanesa Celma quien siempre atendi a mis llamados de emergencia. A mis
compaeros y grandes colaboradores del Bioterio de la Universidad Simn Bolvar, Lus
Hidalgo, Flix y Charito, junto con la Dra. Emilia Negron y su equipo de trabajo del bioterio
del IDEA, les estoy muy agradecida por su apoyo.
A todos mis compaeros de la USB (Dra. Daisy Perdomo, Dra. Liomary Carrasquel,
Lic. Ysvic Inojosa, Dra. Elena Milonas, Msc. Federico Picciani, Dr. Juan Giarrizo) y de la
Fundacin Instituto de Estudios Avanzados IDEA (Lic. Floritza Bustamante, Lic. Yuriani
Rodrguez, Lic. Ingrid, Lic. Isabel Arias, Dra. Deyanell Hernndez, Dra. Lisbeth Garca, Lic.
Jeismar Carballo, Dra. Liliana Casique; Dra. Marins Longart, Dra. Graciela Uzcanga; Dra.
Marisel de Luca, Dra. Caridad Malav; Dra. Noraida Zerpa y la Dra. Cecilia Castillo) quienes
viii
trabajaron conmigo y compartieron muchos momentos, tantos malos como buenos. A mi gran
amigo el Dr. Rafael Medinas, quien me dio muchos consejos acadmicos y a la vez muchos
motivos para reir y disfrutar de mis jornadas laborales. A mis grandes amigas, la Lic. Estluz
Mata y la Lic. Roco Camargo, por ayudarme en mi trabajo y llenarme siempre de energas
positivas a travs de sus travesuras, inundndome los da de risas, risas y mas risas; gracias
miguis por su apoyo y amistad.
A mis padres Nelly Reyes y Joao Ferreira, quienes con sus palabras de aliento me
apoyaron en mis decisiones y que juntos con mi hermano Jos Gabriel Ferreira me ayudaron a
cuidar a mi hijo mientras yo estaba realizando mis estudios, sin ellos no lo hubiese logrado. A
mi esposo William Castillo, quien supo esperar y soportar mis das de cansancio, tristeza y
mal humor apoyndome en todo lo que estuviera a su alcance. A mi hijo William Andrs
Castillo, quien con sus abrazos llenos de amor y ternura me haca ver que todo el malestar que
senta por el cansancio y la tristeza que a veces me embargaba, no tenan sentido porque
simplemente lo tena a l, dndome el nimo necesario para seguir adelante; TE AMO HIJO.
Al Fondo Nacional de Ciencias y Tecnologa (FONACIT),
por ser un apoyo
econmico en mi carrera , por un perodo de dos aos. A la Unidad de Protemica del Centro
de Biologa Estructural del Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas (IVIC) por su
colaboracin en el desarrollo de diversos ensayos necesarios para la culminacin de este
estudio.
Finalmente, le agradezco a Dios por haberme puesto a todas estas personas en mi

camino, importantes en mi vida profesional y personal quienes me ayudaron a alcanzar la
meta, sin ellas no hubiese sido posible la culminacin de este trabajo. Les estoy inmensamente
agradecida, que Dios los bendiga y les d mucha salud.
Gracias Dios.
ix

COORDINACIN DE POSTGRADO EN BIOLOGA
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLOGICAS
IDENTIFICACIN DE NUEVOS ANTGENOS DE Anaplasma marginale MEDIANTE
VACUNOLOGA INVERSA
Por: Ferreira Reyes, Joilyneth
Carnet N: 0383-464
Tutor: Juan Carlos Martnez
Antonietta Porco
Noviembre 2013
RESUMEN
En este trabajo se identificaron nuevos antgenos de A. marginale con la finalidad de evaluar
su inmunogenicidad para el desarrollo de vacunas contra la anaplasmosis. Se realiz un
anlisis in silico a 348 protenas hipotticas de su genoma basado en la bsqueda de
similitudes con otras protenas de membrana externa (OMP), secrecin (PS) o transporte (PT)
de otros patgenos y adems, que presentaran en su secuencia el pptido seal y/o hlices
transmembranas. El anlisis arroj 14 OMP, 5 PS, 2 protenas periplasmticas y 37 protenas
de membrana. Se escogieron siete por su mayor similitud a OMP, PS y PT de diversos
patgenos. Posteriormente, se comprob por RT-PCR la presencia de los transcritos en la
rickettsia correspondientes a los genes seleccionados. De este grupo, se evaluaron las protenas
AM202 (lipoprotena), AM244 (protena de translocacin) y AM573 (protena de transporte),
por presentar dominios relacionados con el mantenimiento de la integridad del patgeno. El
ADN de A. marginale fue aislado para amplificar por PCR los genes de inters, clonarlos,
expresarlos y purificar las protenas recombinantes, las cuales fueron utilizadas en ensayos de
inmunotincin para evaluar su inmunogenicidad en su forma nativa empleando sueros
inmunes de bovinos a A. marginale. Los ensayos demostraron que estas protenas no son
inmunognicas para los bovinos. Luego se inmunizaron ratones o conejos con las protenas
recombinantes para producir anticuerpos y utilizarlos en la identificacin de estas en la
rickettsia. Las protenas AM202 y AM573 no generaron anticuerpos en ratones, por lo que no
se logr su deteccin en A. marginale; la AM244 si produjo anticuerpos en conejo y fue
detectada en el patgeno. Se debera evaluar si estas protenas son capaces de inducir
proliferacin de linfocitos TCD4+ y secrecin de IFN en bovinos inmunizados con membrana
externa de A. marginale, respuesta caracterstica en la inmunidad protectiva contra la
anaplasmosis bovina.
Palabras claves: Anaplasma marginale, Anaplasmosis, Vacunologa inversa.
INDICE GENERAL
Pg
APROBACIN DEL JURADO.......
iii
ACTA DEL VEREDICTO
iv
DEDICATORIA.
vi
AGRADECIMIENTOS.
vii
RESUMEN.
ix
INDICE GENERAL..
INDICE DE TABLAS.......
xiv
INDICE DE FIGURAS.
xv
LISTA DE ABREVIATURAS..
xviii
INTRODUCCIN.
CAPTULO I: MARCO TERICO
1.1. Biologa del Anaplasma marginale..
1.1.1. Clasificacin Taxonmica.......
1.1.2. Morfologa del Anaplasma marginale.
1.2. Genoma de A. marginale..
1.3. Caractersticas de la Anaplasmosis Bovina..
1.3.1. Distribucin geogrfica e incidencia mundial de la enfermedad.
1.3.2. Transmisin de la Anaplasmosis.
10
1.3.3. Patogenia y patologa de la enfermedad..
11
1.4. Respuesta inmune del bovino.......
13
1.4.1. Inmunidad natural o innata.......
14
1.4.2. Inmunidad adquirida.
15
1.4.2.1. Inmunidad humoral
15
1.4.2.2. Inmunidad celular..
17
1.5. Control de la Anaplasmosis Bovina..
18
1.5.1. Mtodos de inmunizacin contra la anaplasmosis.......
18
xi
1.5.1.1. Inmunizacin con organismos vivos..
19
1.5.1.2. Inmunizacin con organismos inactivados
19
1.5.1.2.1. Inmunizacin con cuerpos iniciales inactivos de A. marginale...
19
1.5.1.2.2. Inmunizacin con A. marginale inactivo derivado de cultivo.
20
1.5.1.2.3. Inmunizacin con membrana externa de A. marginale...
21
1.5.1.3. Subunidades vacunales..
23
1.5.1.3.1. Inmunizacin con protenas nativas y recombinantes de A.

marginale.
1.5.1.3.2. Inmunizacin con ADN de A. marginale....
23
30
1.6. Vacunologa Inversa: del genoma al microorganismo.................................................
33
1.6.1. La Bioinformtica en el anlisis de genomas..
35
1.6.2. Del candidato al antgeno: inmunogenicidad y proteccin..
37
1.6.3. Aplicacin de la Vacunologa Inversa: potenciales candidatos vacunales..
38
1.7. Hiptesis.......
41
1.8. Objetivo general
41
1.9. Objetivos especficos
41
CAPTULO II: MARCO METODOLGICO...
42
2.1. Plan de Trabajo.
42
2.2. Metodologa..................
44
2.2.1. Seleccin de genes candidatos vacunales de A. marginale..................
44
2.2.2. Aislamiento del ADN genmico del A. marginale.......
44
2.2.3. Aislamiento del ADN plasmdico.
45
2.2.4. Aislamiento del ARN de A. marginale.
47
2.2.5. Reaccin en cadena de la polimerasa.......
47
2.2.6. Reaccin en Cadena de la Polimerasa por Transcripcin Reversa...
49
2.2.7. Clonacin de los genes seleccionados de A. marginale
50
2.2.8. Transformacin de las Escherichia coli
52
2.2.9. Electroforesis en geles de agarosa...
53
2.2.10. Cuantificacin espectrofotomtrica de cidos nucleicos
54
2.2.11. Anlisis de secuencias
54
2.2.12. Produccin de protenas recombinantes de A. marginale en la bacteria

E. coli..
55
xii
2.2.12.1. Determinacin de la solubilidad de las protenas AM202 y AM573 en

el vector de expresin pMal-p4x....
56
2.2.12.2. Determinacin de la solubilidad de la protena AM244 en el vector de

expresin pThioHisA.
58
2.2.13. Purificacin de las protenas recombinantes...
59
2.2.14. Aislamiento de cuerpos iniciales de A. marginale.
60
2.2.15. Aislamiento y solubilizacin de la membrana de la rickettsia
61
2.2.16. Cuantificacin de protenas por el mtodo de Bradford.
62
2.2.17. Electroforesis en SDS-PAGE.
62
2.2.18. Electrotransferencia de protenas
63
2.2.18.1. Inmuno-absorcin del suero contra las protenas de E. coli..
63
2.2.18.2. Protocolo para la Inmunotincin
64
2.2.19. Produccin de anticuerpos policlonales en el lquido asctico de ratones..
65
2.2.20. Produccin de anticuerpos policlonales en el suero de conejos.
66
2.2.21. Digestin en gel con tripsina para anlisis de Espectrometra de Masa.
67
2.2.22. Anlisis por Espectrometra de Masa en Tndem..
68
CAPTULO III: RESULTADOS.
70
3.1. Identificacin y seleccin de genes de A. marginale con dominios que sugieren la

codificacin de protenas de superficie o secrecin..
70
3.2. Expresin de los genes AM202, AM244, AM573, AM778, AM796, AM854 y
AM1097 en A. marginale..
73
3.3. Clonacin de los genes AM202, AM244 y AM573 en los vectores de expresin
pMal-p4x y pThioHisA.
77
3.4. Secuenciacin de los clones positivos de AM202, AM244 y AM573 de A.

marginale......................................................................................
80
3.5. Expresin de las protenas recombinantes AM202, AM244 y AM573
88
3.6. Purificacin de las protenas recombinantes AM202, AM244 y AM573
92
3.7. Reactividad serolgica del suero inmune de bovinos infectados experimentalmente

con A. marginale, contra las protenas recombinantes AM202, AM244 y AM573.
95
3.8. Aislamiento de cuerpos iniciales y membrana externa de A. marginale..
97
3.9. Verificar la presencia de las protenas AM202, AM244 y AM573 en A. marginale...
99
3.10 Anlisis de Espectrometra de Masa en Tndem de la protena Thio-AM244r...
106
xiii
CAPTULO IV: DISCUSIN..
110
CAPTULO V: CONCLUSINES Y RECOMENDACIONES...
125
REFERENCIAS.
127
ANEXOS.
142
Congresos...
170
Publicaciones.
179
xiv
NDICE DE TABLAS
Tablas
Pg.
1.1. Caractersticas generales del genoma de Anaplasma marginale..
2.1. Mezcla de reaccin para la amplficacin de los genes AM202 y AM244
49
2.2. Mezcla de reaccin para la amplificacin del gen AM573...
49
2.3. Parmetros de adquisicin de datos para huellas peptdicas
68
2.4. Parmetros de bsqueda de homologas del espectro de huella peptdica en la

base de datos Mascot...
69
3.1. Genes seleccionados para el estudio de sus protenas hipotticas como posibles
candidatos vacunales...
72
3.2. Secuencias de los pptidos trpticos de la protena Thio-AM244r...
108
3.3. Resumen del estudio realizado a las protenas AM202, AM244 y AM573 de
Anaplasma marginale...
109
6.1. Genes de A. marginale con dominios que codifican protenas de superficie...
142
6.2. Genes de A. marginale con dominios que codifican protenas de membrana

Interna...
147
6.3. Genes de A. marginale con dominios que codifican protenas del sistema de
secrecin tipo cuatro.
148
6.4. Genes de A. marginale con dominios que sugieren la codificacin de protenas

de superficie..
149

de membrana interna....
151

de secrecin..
157
xv
NDICE DE FIGURAS
Figuras
Pg.
1.1. Eritrocitos de bovinos infectados con A. marginale.
1.2. Esquema de la superfamilia msp2
1.3. Proceso de invasin de A. marginale en el eritrocito del bovino.
11
1.4. Comparacin de la metodologa y el tiempo entre la vacunacin convencional y

la inversa para el desarrollo de vacunas...
35
2.1. Plan de trabajo..
43
2.2. Vectores pMal-4...
45
2.3. Vector de expresin pThioHis para la expresin de protenas.
46
2.4. Esquema del proceso de clonacin de los genes de inters..
51
3.1. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica del ARN total extrado de

eritrocitos infectados con A. marginale......
74
3.2. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica de la RT-PCR del gen

completo de la msp1a......
75
3.3. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica de la RT-PCR con los

cebadores del marco de lectura abierto del gen msp1a......
75
3.4. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica de la RT-PCR de los siete

genes de A. marginale seleccionados....
76
3.5. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica para la verificacin de los

clones positivos del gen AM202 en pMal-p4x por medio de la digestin de
plsmidos con la enzima de restriccin Pvu II...
78
3.6. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica para la verificacin de clones

positivos del gen AM573 en pMal-p4x por medio de la digestin de plsmidos
con la enzima de restriccin Pvu II.
79
3.7. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica para la verificacin de clones

positivos del gen AM244 en pThioHisA por medio de la digestin de plsmidos
con la enzima de restriccin EcoR I.
79
3.8. Alineacin de las secuencias nucleotdicas del gen AM202 de A. marginale

cepa Zulia (en estudio) con las cepas St. Maries, Florida e Israel subespecie
centrale de A. marginale, por Clustal W2...
81
3.9. Alineacin de las secuencias aminoacdicas de la protena AM202 de

A marginale cepa Zulia (en estudio) con las cepas St. Maries, Florida e
xvi
Israel subespecie centrale de A. marginale por Clustal W2.
82

centrale de A. marginale, por Clustal W2.
83

A. marginale cepa Zulia (en estudio) con las cepa St. Maries, Florida e
Israel subespecie centrale de A. marginale, por Clustal W2.
85

centrale de A. marginale, por Clustal W2.
87

A. marginale cepa Zulia (en estudio) con las cepa St. Maries, Florida e
Israel subespecie centrale de A. marginale, por Clustal W2.
88
3.14. Inmunotincin de las protenas MBP-AM202 y MBP-AM573 expresadas

en el vector pMal-p4x a 16 C....
90
3.15. Inmunotincin de la protena AM244 expresada en el vector pThioHis A

a 16 C...........................................................................
91
3.16. Purificacin de la protena recombinante MBP-AM202
93
3.17. Purificacin de la protena recombinante MBP-AM573
94
3.18. Reactividad serolgica de los bovinos infectados experimentalmente con A.

marginale a la protena MBP-AM202
96
3.19. Reactividad serolgica de los bovinos infectados experimentalmente con

A. marginale a las protenas MBP-AM573 y Thio-AM244.......
97
3.20. Reactividad serolgica de bovinos infectados experimentalmente con

A. marginale a las protenas de esta rickettsia
98
3.21. Reactividad del lquido asctico de ratones BALB/c inmunizados con la

protena MBP-AM202 (+) y con adyuvante (-)..
101
3.22. Reactividad del lquido asctico de ratones BALB/c inmunizados con la

protena MBP-AM573 (+) y con adyuvante (-)..
102
3.23. Reactividad del suero de conejos Nueva Zelanda inmunizados con la protena
Thio-AM244 (SI) y el suero preinmune (SPI)...
103
3.24. Inmunotincin de la protena Thio-AM244 digerida con la enteroquinasa frente

al anticuerpo anti-Tiorredoxina..
105
3.25. Huella peptdica de la protena Thio-AM244r...
107
3.26. Alineacin de los pptidos trpticos de la protena Thio-AM244r con la

secuencia aminoacdica de la protena TolB de A. marginale cepa Sta Maries.
A. marginale cepa Zulia (en estudio) y de la cepa E. coli (Genbank)
108
xvii
por BLASTP
115
4.2. Alineacin de las secuencias aminoacdicas de la protena AM244 (TolB) de

A. marginale cepa Zulia (en estudio) y de la cepa E. coli (Genbank) por
BLASTP
122
6.1. Electroferograma de la secuencia sentido del gen AM202 en el vector de

Expresin pMal-p4x ........
158
6.2. Electroferograma de la secuencia antisentido del gen AM202 en el vector de

Expresin pMal-p4x....
159

expresin pThioHisA...
163
6.4. Electroferograma de la secuencia antisentido del gen AM244 en el vector de

expresin pThioHisA. .............................................................................
163

expresin pMal-p4x. ...
164
6.6. Anlisis del uso frecuentes de codones por la bacteria E. coli para la expresin
del gen AM202 de A. marginale...
165
166
168
6.9. Gel de SDS-PAGE teido con plata de las fracciones de A. marginale...
169
6.10.Inmunizaciones de bovinos con el complejo de superficie indujo un subgrupo

de anticuerpos antgeno especficos en comparacin con la inmunizacin con
membranas externas..
169
xviii
LISTA DE SMBOLOS Y ABREVIATURAS

aa: Aminocidos
Ac: Anticuerpos
APC: Clulas Presentadoras de Antgenos
CSP: Complejo de protenas de superficie entrecruzadas
DC: Clulas dendrticas
EF-Tu: Factor de elongacin Tu
ESR: Protena receptora de solutos extracitoplasmticos
Flt3L: Ligando de la tirosina quinasa 3 del hgado fetal
GM-CSF: Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrfagos
HMP: Protena de membrana hipottica
HSP: Protena de secrecin hipottica
HTM: Hlices transmembranas
IMP: Protena de membrana interna
ISCOM: Complejo inmunoestimulatorio
OM: Membrana externa.
LC-MS-MS: Cromatografa lquida y espectrometra de masa en tndem
Linfocitos Th: Linfocitos T cooperadores
MBP: Protena de unin a la maltosa
MCS: Sitio de clonamiento mltiple
MLP: Protenas parecidas a la MSP1a
MSP: Protenas Principales de Superficie
OMP: Protena de membrana externa
ORF: Marcos de lectura abiertos
PAL: Lipoprotenas asociadas al pptidoglicano
PCR: Reaccin en Cadena de la Polimerasa
PS: Protenas de secrecin
xix
PT: Protena de Transporte
RT: Transcripcin Reversa
RT-PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa por transcripcin reversa
SP: Pptido seal
TFSS: Sistema de secrecin tipo IV
TRAP: Transporte periplasmtico independiente de ATP Tripartita
INTRODUCCIN
La anaplasmosis es una enfermedad infecciosa causada por la rickettsia intraeritroctica
Anaplasma marginale (orden Rickettsial, familia Anaplasmataceae) que afecta a bovinos y
otros rumiantes (Dumler y col., 2001). Los sntomas clnicos de la enfermedad son: anemia
progresiva, alteracin del sistema inmune, debilidad severa e ictericia lo cual conlleva a la
muerte del animal (Brock y col., 1965).
A. marginale puede transmitirse biolgicamente a travs de picaduras de garrapatas de

los gneros Boophilus y Dermacentor (Kocan, 1986); mecnicamente por moscas
hematfagas de la familia Tabanidae (Murphy y col., 1966; Hawkins y col., 1982) e
iatrognicamente, a travs de agujas hipodrmicas e instrumentos quirrgicos contaminados
(Rickey y Palmer, 1990).
La anaplasmosis es enzotica en aproximadamente la mitad de las reas ganaderas del

mundo, principalmente en las regiones tropicales y subtropicales, causa severas prdidas
econmicas debido a su incidencia negativa sobre la ganancia de peso y produccin de leche
del ganado (Palmer y col., 1986).
Debido al problema que ocasiona la anaplasmosis, ha sido de gran importancias

implementar medidas de control de las infecciones mediante el control de artrpodos por
aplicacin de acaricidas, la administracin de antibiticos y la inmunizacin (Kocan y col.,
2000). El control de artrpodos no es muy prctico en muchas reas geogrficas y por lo tanto
la prevencin de la transmisin de A. marginale se realiza de manera parcial (Kocan y col.,
2003). La quimioterapia es usualmente empleada en los Estados Unidos para la prevencin de
la anaplasmosis, pero en otros pases es poco frecuente debido a que es muy costosa y no es
aplicable a todas las variedades de ganado vacuno. Adems, el uso intensivo de antibiticos
podra originar cepas resistentes (Kocan y col., 2000; Kocan y col., 2003). Desde 1912, se ha
investigado en diferentes pases del mundo la posibilidad de la vacunacin como mtodo para
2
controlar la Anaplasmosis; sin embargo, an se carece de una vacuna efectiva. Uno de los
primeros intentos de prevencin contra esta enfermedad fue la premunizacin, que consiste en
inocular sangre de animales con cuadro clnico agudo de anaplasmosis en animales sanos
(Kieser y col., 1990). Otro mtodo que utiliz Theiler en 1912 para la vacunacin fue inocular
bovinos susceptibles con una cepa viva de A. centrale, que por lo general induce una infeccin
ligera asociada a la proteccin slida (Krigel y col., 1992). Estos primeros mtodos empleados
tienen la desventaja de transmitir otros agentes patgenos a travs de la sangre (Roger y col.,
1988).
En bsqueda de un blanco antignico que genere una inmunidad protectiva al

hospedador, diversos autores han inmunizado a los bovinos con membrana externa (OM, del
ingls Outer membrane) del patgeno, lo que gener una fuerte respuesta inmune humoral y
celular con un nivel variable de proteccin en los animales vacunados (Tebele y col., 1991;
Brown y col., 1998a). Por otro lado, el uso de sueros inmunes de conejos y anticuerpos
monoclonales que tienen actividad neutralizante sobre inculos infectivo de cuerpos iniciales
de A. marginale, reconocen seis polipptido sobre la membrana plasmtica de esta rickettsia,
denominadas Protenas Principales de Superficie (MSP, del ingls Major Superface Proteins)
y se les conoce como MSP-1a, MSP-1b, MSP-2, MSP-3, MSP-4 y MSP-5, con pesos
moleculares aparentes de 105, 100, 36, 86, 31 y 19 kDa, respectivamente (Palmer y McGuire,
1984). Estas protenas han sido centro de mucha atencin y se ha postulado que son blancos de
la respuesta inmune protectiva contra la rickettsia y en consecuencia son potenciales antgenos
vacunales (Palmer y col., 1999). La inmunizacin de bovinos con las forma nativas y
recombinantes de estas protenas genera una fuerte respuesta inmune que va desde una
proteccin total contra la rickettsemia y la anemia en algunos pocos animales, pasando por
proteccin parcial con bajos niveles de rickettsemia pero con cada significativas del
hematocrito, a ninguna proteccin (Palmer y McElwain, 1995). La alta variabilidad en la
respuesta inmune puede ser debido al carcter inmunodominante de las MSPs, el cual
probablemente sea un mecanismo de evasin del parsito a la respuesta inmune del hospedero,
por medio del cual las otras protena de superficie son enmascaradas hacindose muy poco o
no inmunognicas, pero que podran tener un papel esencial en la vida del patgeno y en
consecuencia no inducen ningn tipo de inmunidad capaz de bloquear o neutralizar la
3
infeccin. La bsqueda de antgenos alternativos a las MSPs se ha visto seriamente limitada a
consecuencia de su muy baja o ninguna capacidad inductora de anticuerpos o linfocitos T
reactivos, los cuales son indispensables para su posterior identificacin por algn tipo de
inmunoensayo (ELISA, Immunotincin, ensayos de proliferacin celular, entre otras) (Lpez
y col., 2005).
Es probable que existan protenas diferentes a las MSP sobre la membrana externa de
A. marginale que puedan ser utilizadas como inmungenos vacunales en forma recombinante
para inducir una fuerte respuesta inmune protectiva capaz de neutralizar o bloquear alguna
funcin celular que comprometa la viabilidad de la rickettsia. Con la finalidad de probar esta
hiptesis, objeto de este estudio, se propone la identificacin en el genoma de A. marginale de
genes con funciones desconocidas que tengan dominios que pudieran indicar que codifican
para protenas de superficie o excretadas, mediante un anlisis in silico de la secuencia
genmica de A. marginale, para clonarlos y expresarlos con la finalidad de evaluar su
potencial antignico como posibles inmungenos para el desarrollo de una vacuna contra la
anaplasmosis.
CAPITULO I
MARCO TEORICO
1.1. Biologa del Anaplasma marginale
1.1.1. Clasificacin Taxonmica
Anaplasma marginale es una bacteria intraeritroctica que pertenece al orden
Rickettsial, familia Anaplasmataceae (Oberle y col., 1988, Dumler y col., 2001). Los
organismos pertenecientes a este orden fueron reclasificados basados en las caractersticas
biolgicas y en los anlisis genticos de los genes 16S ARNr, groESL y aquellos genes que
codifican para las MSP. Los anlisis filogenticos establecieron cuatro gneros distintos de la
familia Anaplasmataceae: Anaplasma, Ehrlichia, Wolbachia y Neorickettsia. El gnero
Anaplasma, incluye tres especies que infectan a los rumiantes: Anaplasma marginale, agente
causal de la anaplasmosis bovina; la especie Anaplasma
marginale subsp. centrale
(Anaplasma centrale), el cual es un agente poco patognico, causante de una forma benigna
de la anaplasmosis en bovinos; y Anaplasma ovis, agente causal de la anaplasmosis en ovinos
y caprinos. Este gnero tambin incluyen las especies Anaplasma phagocytophilum
(formalmente llamado Ehrlichia equi), Ehrlichia phagocytophila (que es el agente causante de
la Ehrlichiosis granuloctica humana), Anaplasma bovis (formalmente llamada Ehrlichia
bovis) y Anaplasma platys (formalmente llamada Ehrlichia platys) (Dumler y col., 2001).
1.1.2. Morfologa del Anaplasma marginale
Anaplasma marginale es un coco Gramnegativo, cuyo tamao se encuentra entre 0,55

a 0,85 m de dimetro. Al infectar al eritrocito, se forma una vacuola parasitsfora que rodea
al patgeno, formndose el llamado cuerpo de inclusin, el cual puede tener de 1 a 8
microorganismos, llamados tambin cuerpos iniciales. Cada cuerpo inicial est rodeado por
una doble membrana (pared celular y membrana plasmtica) y estn formados de material
5
fibrilar y varios grnulos electrodensos que contienen ADN, ARN e hierro orgnico (Kreier y
Ristic, 1981) (Figura 1.1).
Figura 1.1. Eritrocitos de bovinos infectados con A. marginale. (A) Cuerpos de inclusin
(flechas) son localizados en la periferia de los eritrocitos en un frotis de sangre. (B)
Micrografa Electrnica de un cuerpo de inclusin de A. marginale que contiene tres
microorganismos. La Barra indica 10 m (A) y 0,5 m (B). (Tomado de Kocan y col., 2003).
1.2. Genoma de A. marginale.
El cromosoma de A. marginale est constituido por una molcula de ADN circular de

doble cadena, cuya tamao es de 1.197.687 pares de base (pb) y un contenido de G+C del 49
% (Alleman y col., 1993; Brayton y col., 2005). El genoma fue completamente secuenciado
(Brayton y col., 2005) y su anlisis demostr que tiene una alta densidad codificante (86 %) en
donde se han identificado 949 secuencias codificantes, las cuales involucran a los genes con
funciones conocidas y putativas, con un tamao promedio de 1.077 pb. De estas secuencias
codificantes, 62 fueron predichas ser protenas de superficie conocidas y putativas en las que
predominan dos superfamilias agrupadas por homologas de secuencias, llamadas
superfamilias msp1 y msp2 (Brayton y col., 2005). Adicionalmente, contiene un solo opern
de tres genes que codifican para ARN ribosomal, tpico del orden rickettsiales. Al mismo
tiempo, contiene 37 genes que codifican para los ARNs de transferencia que incorporan todos
los 20 aminocidos. Existen en el genoma de la rickettsia pseudogenes funcionales los cuales
juegan un papel integral en la variacin antignica de las protenas de superficie. Por su parte,
el origen de replicacin an no ha sido identificado, ya que los genes que generalmente se
6
encuentran frecuentemente agrupados en ese lugar (dnaA, gyrA, gyrB, rpmH, dnaN) estn
dispersos en todo el genoma (Tabla 1.1) (Brayton y col., 2005).
Tabla 1.1. Caractersticas generales del genoma de Anaplasma marginale

Tamao del genoma en pares de base
Porcentaje de guanina y citosina
Porcentaje de protenas codificadas
Genes codificadores de protenas
Protenas con funcin asignada
Protenas asignadas a Familia conservadas
Protenas hipotticas conservadas
Protenas hipotticas
Seudogenes funcionales
Marco de lectura abiertos de dominios divididos
Densidad gentica
Longitud media de los genes
ARN ribosomal
ARN de transferencia
1.197.687
49
86
949
567
107
126
151
14
8
0,79
1.077
3
37
(Brayton y col., 2005)

La superfamilia msp2 fue agrupada tomando en cuenta la identidad de secuencias entre
las protenas de superficie conocidas como la MSP2, MSP3 y MSP4, las cuales son la base de
la familia de protenas antignicas pfam 01617. Esta superfamilia contiene 56 miembros,
alguno de los cuales son pseudogenes, y contiene la mayora de los componentes
inmunodominantes (MSP2 y 3) de la superficie celular, los cuales no son buenos candidatos
vacunales por su habilidad para variar su repertorio de eptopes. Los genes msp2 y msp3 tienen
7 pseudogenes funcionales que pueden recombinarse por conversin gentica para crear
nuevas variantes antignicas, ya sea por completo o por segmentos en el sitio de expresin. La
MSP-4 es producto de un gen de una sola copia (Oberle y Barbet, 1993), parece estar
conservada y expresada en todos los aislados examinados (Oberle y col., 1993). Existen en
esta superfamilia otros genes relacionados, llamados opag 1-3, asociados al operon de la msp2
(Barbet y col., 2000). Opag1 parece no ser traducido, las protenas OpAG2 y MSP2 son
expresados por A. marginale en el eritrocito de bovinos, en el intestino medio y glndulas
salivares de garrapatas, mientras que OpAG3 es expresado solo en el eritrocito (Brayton y
col., 2005). Adicionalmente, se han encontrado en la superfamilia msp2 otras 15 protenas de
7
membrana externa
(OMP, del ingls Outer Membrana Protein) que son similares a la
secuencia de la msp2 o msp4. Estas omp 1-15 se encuentra en estructuras parecidas a operones
o en forma individual. La otra parte de la superfamilia corresponde a pequeos genes llamados
orfX (12 copias) y orfY (7 copias), pero hasta la fecha no hay evidencias de la funcin de estos
genes (Figura 1.2; Brayton y col., 2006).
Figura 1.2. Esquema de la superfamilia msp2. (A) La distribucin de varios miembros de la superfamilia en
una regin de 360 kb del genoma que comprende cuatro secuencias del cromosoma bacterial artificial (G11,
F7, E6 y 16D3). Los locus identificados en A son mostrados con ms detalles en B-F. (B) El opern de la
msp3 contiene orfX, orfY y msp3. (C) El locus mostrado contiene el opern de la msp2, varias OMPs y
pseudogenes, adems de orfX y un regulador transcripcional putativo (TR) que se encuentra en Ehrlichia
ruminantium, E. chaffensis y A. phagocitophilum. (D) Un opern putativo de cinco genes de OMPs. (E)
Otro opern putativo de genes OMP que est situado cerca de un pseudogen msp2. La regin de 95 kb
representada en F ilustra la posicin de los pseudogenes de msp2/3 con orfX/Y. OMP14 y msp4 tambin
estn en esta regin del genoma (Tomado de Brayton y col., 2005).
Por su parte, la superfamilia msp1 est formada por nueve miembros y est constituida
por genes cuya secuencia es similar a aquellos que codifican para dos protenas que conforman
el heterodmero MSP1, que son la MSP1a y MSP1b. La MSP1a es codificada por un nico
gen, msp1-. Su peso molecular aparente es de 105 kDa, pero puede variar, ya que posee
secuencias repetidas en tndem que codifican para un pptido de 28 a 29 aminocidos de
8
longitud (Brown y col., 2001b). Interesantemente, esta protena no tiene pptido seal a pesar
de que se ha demostrado que est expuesta en la membrana (Palmer y col., 1986). Se han
identificado 3 secuencias codificantes inmediatamente ro abajo del gen msp1- con una
estructura similar a la mitad de la regin C-terminal de la MSP1a, lo cual fue demostrado por
el anlisis de prediccin de protenas transmembranas y han sido llamadas protenas parecidas
a la MSP1a-2; 3 y 4 (MLP, del ingls MSP1a-Like Proteins) (Brayton y col., 2005). El resto
de los miembros de esta superfamilia son los cinco genes msp1, que incluyen dos genes de
longitud completa y tres genes parciales, los cuales pueden ser considerados como
pseudogenes (Brayton y col., 2006).
Las protenas de las superfamilias msp2 y msp1 representan una porcin significativa
de las molculas encontradas en la superficie del microorganismo (Brown y col., 2003). Por su
parte, la protena MSP5 no forma parte de ninguna de estas superfamilias, debido a que su
secuencia no tiene ninguna similitud con las protenas antes mencionadas. Esta protena es
codificada por un nico gen, lo que indica que debe tener una funcin importante en la
preservacin de la especie y est conservada en todos los aislados geogrficos (Munodzana y
col., 1998), por lo que se ha usado con xito en ensayos de diagnstico en diferentes partes del
mundo (Reyna-Bello y col., 1998; Torioni y col., 1998).
Adems, Brayton y colaboradores (2006) sealan que existen otras protenas de

membrana externa basndose en la similitud de las secuencias con las protenas de superficie
descritas previamente. Algunas de estas protenas estn bien descritas como protenas de
superficie (virB3, virB9 y OMA87), mientras que otras tienen una asignacin de protenas de
membrana externa mas tentativas como la AM778 y AM780, cuya ubicacin en la superficie
est basada por su similitud con la secuencia de la AM779, la cual es homloga a una protena
de membrana externa de Wolbachia endosymbiont.
El conocimiento de la composicin completa de la superficie de A. marginale, la cual

contiene algunas protenas que son variables antignicamente, es directamente aplicable tanto
para el entendimiento de la respuesta inmune como para el desarrollo de vacunas (Brayton y
col., 2006).
1.3. Caractersticas de la Anaplasmosis Bovina

1.3.1. Distribucin geogrfica e incidencia mundial de la enfermedad
La anaplasmosis es una patologa que est presente en reas tropicales y subtropicales
de todo el mundo y es la principal limitacin en la produccin de ganado en muchos pases, ya
que causa importantes prdidas econmicas, principalmente debido a la alta morbilidad y
mortalidad en rebaos de ganado vacuno susceptibles. Las prdidas debido a la anaplasmosis
son medidas por la prdida de peso, reduccin en la produccin de leche, abortos, costo del
tratamiento para la enfermedad y la mortalidad (Palmer y col., 1986).
En Estados Unidos, Amrica Central, en las islas del Caribe y en Latino Amrica, la
anaplasmosis es enzotica, con la excepcin de las reas desrticas o montaosas tales como
los Andes venezolanos. Estas regiones presentan una amplia distribucin de la enfermedad, la
cual puede ser debido al transporte incrementado de ganado vacuno, favoreciendo la
transmisin mecnica de la rickettsia desde un ganado infectado persistentemente,
asintomtico, a otro ganado susceptible (Guglielmone y col., 1996).
En los Estados Unidos se reporta una mortalidad anual que va desde 50.000 a 100.000
animales, con un costo aproximado de 300 millones de dlares, mientras que en Amrica
Latina las prdidas fueron calculadas en aproximadamente 800 millones de dlares (Palmer y
McElwain, 1995). Brown report en 1997 que la anaplasmosis y la babesiosis bovina fueron
las responsables de causar una prdida econmica de 875 millones de dlares en las naciones
de Amrica Latina.
En Venezuela, el impacto econmico atribuible especficamente a la anaplasmosis es

difcil de estimar, debido a que suele presentarse frecuentemente con otras hemoparasitosis y
adems, debido a las deficiencias del registro sanitario nacional o por la dificultad de obtener
cifras precisas al respecto (Cammilli, 2001). Sin embargo, James y colaboradores (1985)
detectaron una prevalencia de 57,7 % y 48,6 % de anaplasmosis en la regin Centro
Occidental del pas, mediante la tcnica de inmunofluorescencia y la tcnica de aglutinacin
10
en ltex, respectivamente. En Carora (Estado Lara) se ha conservado la prevalencia en el
tiempo, mantenindose en un 50 % (Reyna y col., 1998). En el estado de Gurico se ha
detectado una seroprevalencia del 97 % mediante la tcnica del ensayo inmunoenzimtico
indirecto y una prevalencia del 47 %, mediante la tcnica de tincin con naranja de acridina y
bromuro de etidio (Eleizalde y col., 2003). Adems de las prdidas econmicas directas, esta
enfermedad impide el desarrollo de programas de mejoramiento gentico, ya que los animales
importados son mas susceptibles a la enfermedad impidiendo el desarrollo de la ganadera en
Amrica Latina (Kocan y col., 2003).
1.3.2. Transmisin de la Anaplasmosis
El estudio de la transmisin de A. marginale es de fundamental importancia para

establecer un control efectivo de la enfermedad. Son amplias y muy variadas las formas en que
puede transmitirse el parsito y dependen de la presencia de vectores biolgicos y mecnicos,
de la existencia de animales susceptibles y de condiciones ecolgicas favorables (Palmer y
McElwain, 1995).
La transmisin de los cuerpos iniciales de A. marginale ocurre por la introduccin de

sangre fresca de un bovino enfermo o portador de la rickettsia a un bovino sano. En este
proceso de transmisin intervienen las garrapatas de los gneros Boophilus y Dermacentor
(transmisin biolgica) (Kocan, 1986), algunos dpteros hematfagos como los tbanos,
mosca brava y mosquito (transmisin mecnica) (Ristic, 1981), o a travs de la inoculacin
directa por agujas e instrumentos quirrgicos contaminados (transmisin iatrognica) (Rickey
y Palmer, 1990). Adems, la infeccin tambin puede ocurrir por va transplacentaria durante
el segundo o tercer trimestre de gestacin (Norton y col., 1983).
Se ha reportado que la infeccin de los bovinos por A. marginale es originada por un

solo genotipo de esta rickettsia (Palmer y col., 2001) debido a que ocurre una exclusin de la
infeccin en los eritrocitos infectados de bovinos, al igual que en las clulas de garrapatas
infectadas, es decir, no puede haber dos genotipos diferentes infectando a un mismo bovino o
11
garrapata (de la Fuente y col., 2002). Este suceso fue observado tambin en infecciones
experimentales de bovinos y garrapatas (de la Fuente y col., 2003).
1.3.3. Patogenia y patologa de la enfermedad
Kocan (1986) seal que el ciclo de vida del A. marginale est coordinado con el ciclo
de alimentacin de las garrapatas. Una vez que las garrapatas se alimentan de la sangre de un
bovino infectado con A. marginale, en las clulas intestinales de este arcnido, se desarrollan
las bacterias para infectar a otros tejidos, incluyendo las glndulas salivares, lo cual ocurre
dentro de una vacuola que est unida a la membrana de los tejidos infectados, donde se
observa la forma reticulada o vegetativa, que es la primera forma que se distingue en la
vacuola parasitsfora. Esta forma reticulada se divide por fisin binaria formando grandes
colonias que pueden contener cientos de microorganismos, luego cambia a la forma densa, la
cual es la forma infectiva y puede sobrevivir fuera de las clulas del hospedero. Por lo tanto, el
ganado es infectado con A. marginale una vez que la forma densa es transmitida por la
garrapata en el momento de su alimentacin, a travs de las glndulas salivares.
De esta manera, se inicia el ciclo de vida de A. marginale en el vertebrado (bovino)

donde la bacteria, una vez que es inoculada por la garrapata, invade a los eritrocitos del bovino
por endocitosis, formndose una vacuola parasitsfora que contiene la unidad infectiva de A.
marginale; en la cual la rickettsia se divide por fisin binaria; luego madura dentro de los
eritrocitos, produciendo poros en su membrana a travs de los cuales puede salir por
exocitosis, sin lisar al eritrocito hospedador e infectar nuevas clulas rojas (Simpson y col.,
1967 y Giardina y col., 1983) ocasionando as la anaplasmosis bovina (Figura 1.3).
Esta enfermedad se caracteriza por presentar un cuadro clnico que se divide en cuatro
perodos; un perodo de incubacin o prepatente, un perodo agudo o de desarrollo de la
enfermedad, un perodo de convalecencia y un estado de portador (lvarez, 2001).
12
Figura 1.3. Proceso de invasin de A. marginale en el eritrocito del bovino. (A) Invasin de la
rickettsia en el glbulo rojo mediante el proceso de endocitosis. (B) Formacin de la vacuola
parasitsfora. (C) Divisin del microorganismo por fisin binaria. (D) Salida del microorganismo del
eritrocito por medio del proceso de exocitosis (Tomado de Giardina y col., 1983).
El perodo de incubacin de la infeccin o perodo prepatente se define como el

tiempo transcurrido entre la exposicin de la infeccin y la primera aparicin de los cuerpos
marginales en los eritrocitos (Wanduragala y Ristic, 1993); esta fase depende del nmero de
microorganismos presentes en el inculo y de la raza del bovino, siendo la ms susceptible la
Bos taurus. Este perodo ocurre en un lapso de 7 a 60 das, con un promedio de 28 das. En
cuanto a los signos clnicos del animal, los valores de temperatura y hematocrito son muy
similares a los normales y, el porcentaje de eritrocitos infectados detectados en un frotis
sanguneo suele ser menor del 1 %.
Posteriormente, ocurre el perodo agudo donde el nmero de glbulos rojos parasitados

incrementa rpidamente, alcanzando una bacteriemia de 109 bacterias por mililitros de sangre
(Palmer y col., 1999; citado por Han y col., 2008). Este perodo tiene una duracin variable de
4 a 9 das, donde los eritrocitos infectados son posteriormente fagocitados por las clulas del
sistema retculoendotelial (bazo, hgado y ndulo linftico) del bovino, originndose las
principales manifestaciones clnicas como la fiebre, seguida de anorexia, depresin y debilidad
muscular, acompaada de una acidosis severa. La destruccin continuada de eritrocitos, sin
hemoglobinuria (presencia de hemoglobina en la orina), trae consigo palidez de la mucosa,
sangre acuosa y posteriormente ictericia, pudiendo aparecer anticuerpos antieritrocitarios, lo
que puede agravar la anemia. Luego de esta fase aguda, se presenta la hiperaguda, donde
ocurre una prdida dramtica de peso, abortos, fallo cardiopulmonar y muerte (Ristic y col.,
1972; Ajayi y col., 1978). Esta ltima fase ocurre con frecuencia de 24 a 36 horas despus del
13
pico de parasitemia, donde hay infectados hasta un 90% de los eritrocitos (Richey y Palmer,
1990).
El perodo de convalecencia de la anaplasmosis es de 1 a 2 meses y est acompaado

por incremento de la hematopoyesis y puede haber recurrencia de la parasitemia. Los
parmetros hemticos retornan a los normales, pero los organismos continan presentes en la
circulacin perifrica (Swift y Thom, 1983).
Si el animal sobrevive a la fase aguda, se inicia un estado conocido como portador, en

la cual el ganado permanece infectado persistentemente con bajos niveles de rickettsemia,
alrededor de 106 bacterias por mililitros de sangre, que flucta por largos perodos de tiempo
(Palmer y col., 1999; citados por Han y col., 2008). Durante este estado sirve de reservorio
para A. marginale, adems de ser una fuente de infeccin tanto para la transmisin mecnica
como para la biolgica (Richey y Palmer, 1990; Kieser, y col., 1990). El ciclo de parasitemia
posiblemente est asociado a la aparicin de nuevas variantes antignicas que dan lugar a
nuevos signos de invasin y multiplicacin (Palmer y col., 1999).
La severidad de la infeccin en el ganado depende de: factores genticos del animal

(Starling, 1976), estatus nutricional (Ajayi y col., 1978), de los mtodos de manejo de la
ganadera, la cepa del parsito (Kreier y col., 1964) y la edad del animal (Jones y col., 1968),
siendo los becerros menos susceptibles a la infeccin. No obstante, al extraerles el bazo
(esplenectoma), los becerros se tornan ms susceptibles y la infeccin es frecuentemente mas
severa que aquella observada en el ganado adulto (Kocan y col., 2003).
1.4. Respuesta inmune del bovino
Debido a la importancia de la anaplasmosis, muchos investigadores se han dedicado al

estudio de los tipos de antgenos producidos por el patgeno y de la respuesta inmune del
bovino contra estos, ya que existen evidencias sobre la participacin de mecanismos
relacionados con la inmunidad humoral y celular en la proteccin contra la enfermedad
(Giardina y col., 1993).
14
1.4.1. Inmunidad natural o innata
La resistencia de los animales a la anaplasmosis, como en otras enfermedades, se

puede definir como inmunidad natural o innata, la cual est constituida por mecanismos que se
activan antes de que se desarrolle la infeccin capaces de establecer respuestas rpidas en
contra de los microorganismos y que reaccionan bsicamente de la misma manera en
infecciones repetidas (Abbas y col., 2002).
Este tipo de inmunidad probablemente dependa de la gentica del individuo, as como

de la raza y de la edad. Se conoce que la anaplasmosis, generalmente, es moderada en becerros
de hasta un ao de edad y aguda en animales de dos aos, siendo fatal en bovinos mayores de
tres aos de edad. Cabe destacar que las crisis agudas se presentan comnmente de manera
inesperadas, sin haber existido una evidencia previa de la enfermedad (Bautista, 1996). En
relacin a la raza, se ha considerado que animales cebunos (Bos indicus) puros y sus cruzas,
son mas resistentes a la infeccin por garrapatas, lo que da la impresin de resistencia a la
anaplasmosis (Rodrguez y col., 2003).
Los mecanismos que evitan la presentacin de los signos clnicos se desconocen. Sin
embargo, se ha propuesto la mediacin de factores solubles derivados de los linfocitos T de
terneras infectadas, pero estos factores no han sido caracterizados en detalle (Wyatt y col.,
1996). Posteriormente, se pens que la ausencia de los linfocitos T cooperadores CD4+
(Linfocitos Th CD4+, del ingls T helper lymphocytes) del bazo, ganglios linfticos y sangre
perifrica en bovinos timectomizados (eliminacin del timo) podra suprimir esta resistencia.
No obstante, animales con estas caractersticas no presentaron signos clnicos cuando fueron
infectados con la rickettsia en forma experimental (Valdez y col., 2002). Estos resultados no
eliminan la posibilidad de que otros mecanismos celulares, no caracterizados an, puedan
contribuir a la inhibicin de la presentacin de los signos como se ha observado para
babesiosis, donde la rpida estimulacin de Interlequina-12 (IL-12), Interfern- (IFN-) y
produccin de Oxido Ntrico (ON), contribuyen a la resistencia de la presentacin de signos
clnicos an cuando se presente la infeccin (Rodrguez y col., 2003).
15
1.4.2. Inmunidad adquirida
Adems de la inmunidad innata o natural, existen otros mecanismos de inmunidad que

son estimulados tras la exposicin de agentes infecciosos, cuya intensidad y capacidad
defensiva aumentan despus de cada exposicin. Este tipo de inmunidad recibe el nombre de
inmunidad adaptativa o adquirida, debido a que se desarrolla en respuesta a la infeccin. Se
caracteriza por tener una especificidad extraordinaria para macromolculas diferentes y su
capacidad para recordar y responder con mayor intensidad tras exposiciones repetidas al
mismo microorganismo (Abbas y col., 2002).
Hay dos tipos de inmunidad adaptativa, la inmunidad humoral y la inmunidad celular,

las cuales estn mediadas por diferentes componentes del sistema inmunitario y cuya funcin
es eliminar diferentes tipos de microorganismos (Goldsby y col., 2000).
1.4.2.1. Inmunidad humoral
En la inmunidad humoral participan molculas presentes en la sangre, denominadas

anticuerpos, que son protenas especializadas producidas por los linfocitos B, los cuales
reconocen especficamente a antgenos microbianos de origen extracelular y neutralizan su
actividad, dirigiendo su accin hacia los microorganismos para su eliminacin por medio de
diferentes mecanismos efectores (Goldsby y col., 2000).
Entre las evidencias relacionadas con la inmunidad humoral en la anaplasmosis

podemos mencionar la presencia de anticuerpos opsonizantes contra eritrocitos durante la
crisis anmica, lo cual puede estar relacionado con los marcados cambios fsicos y qumicos
que ocurren cuando el eritrocito es invadido por la rickettsia (Morris y col., 1971). Estos
eritrocitos infectados son removidos de la circulacin sin fragmentacin de las clulas rojas
(Ristic y col., 1972) y la recuperacin del bovino se caracteriza por una prolongada inmunidad
en la cual el bazo parece jugar un papel importante, ya que como se mencion anteriormente,
la esplenectoma resulta en una enfermedad ms intensa y recada de animales ya recuperados
(Jones y col., 1968).
16
Por otro lado, Murphy y colaboradores (1966) observaron un fuerte incremento de los
niveles de Inmunoglobulina M (IgM) durante la fase prepatente, que supera hasta en un 200 %
los valores de preinfeccin en los animales experimentales. Los anticuerpos fijadores de
complemento eran exclusivamente de tipo IgM y despus de 4 a 5 das apareca la
Inmunoglobulina G (IgG). Sin embargo, estos investigadores sugirieron que no existe un papel
protector por parte de IgM o IgG. No obstante, los niveles de parasitemia fueron menores en
aquellos becerros que alcanzaron un mayor nivel de anticuerpos antes de la crisis. Este hecho
fue confirmado por Corrier y colaboradores (1981), quienes demostraron mediante el uso de
supresores de la inmunidad humoral (Ciclofosfamida), que estos pueden suprimir
significativamente al mantenimiento de un equilibrio entre el agente etiolgico y el
hospedador, conduciendo a la agudizacin de la infeccin.
Palmer y McGuire (1984) demostraron que los anticuerpos anti A. marginale eran
capaces de inhibir la infeccin in vitro y por su parte, Brown y colaboradores (1998a),
revelaron que los becerros inmunizados con membrana externa de la cepa Florida de A.
marginale, fueron completamente protegidos contra el desarrollo de la infeccin despus del
desafo debido a que estos desarrollaron altos ttulos de anticuerpos IgG2. Sin embargo, se
demostr que el suero inmune contra A. marginale, obtenido de ganados infectados o
vacunados previamente contra la rickettsia, no confiere ninguna proteccin contra la
anaplasmosis cuando ste es transferido al ganado vacuno susceptible, lo que sugiere que los
anticuerpos per se no son protectivos contra la anaplasmosis (Gale y col., 1992). No obstante,
se ha observado la transferencia de anticuerpos maternales anti A. marginale a la descendencia
a travs del calostro en las primeras 12 horas, sugiriendo que probablemente la inmunidad
pasiva slo podra llevarse a cabo a travs del calostro (Reyna-Bello y col., 1998).
Estos resultados indican que la respuesta de anticuerpos inducida en el ganado no es

totalmente responsable de la inmunidad protectora y que los mecanismos celulares tienen una
gran participacin en el mantenimiento de la inmunidad para proveer una ptima proteccin.
Por tal motivo, se piensa que las respuestas inmune humoral y celular trabajan probablemente
17
en conjunto en el desarrollo de una inmunidad protectiva contra la anaplasmosis (Francis y
col., 1980).
1.4.2.2. Inmunidad celular
Se ha postulado que la inmunidad celular juega un papel muy importante en la

proteccin contra la anaplasmosis (Ristic y col., 1972), ya que se ha observado la presencia de
factores solubles productos de las clulas linfoides capaces de reducir la cantidad de eritrocitos
infectados por la rickettsia (Wyatt y col., 1996). Se han observado altos niveles de IFN- (Gale
y col., 1996; Brown y col., 1998b), una fuerte proliferacin de linfocitos en sangre perifrica
(Gale y col., 1996), e incremento del Factor de Necrosis Tumoral- (TNF-) e Interleuquina-4
(IL-4) (Brown y col., 1998b), lo que sugiere una probable implicacin de la respuesta inmune
celular en la inmunidad contra A. marginale (Gale y col., 1996).
Debido a la importancia de la inmunidad celular, la cual es mediada por los linfocitos T,

Brown y colaboradores (1998a) caracterizaron la respuesta de las clulas Th a las MSPs del A.
marginale en bovinos inmunizados con membrana externa del patgeno. Estos autores
observaron que todas las lneas celulares especficas contra la rickettsia presentaban el
fenotipo linfocitos T CD4+ productores de altos ttulos de IFN-, el cual favorece la activacin
de macrfagos y la produccin de IgG2; generando de esta manera la reduccin de la
rickettsemia (Palmer y col., 1999). Brown y colaboradores en el ao 2001(b), detectaron altos
niveles de IFN- por los linfocitos T CD4+ especficos de la MSP1a, pero no para la MSP1b en
el ganado inmunizado con la MSP1 nativa. Paradjicamente, observaron en los mismos
animales, una respuesta de IgG contra la MSP1a y la MSP1b, lo que les sugiri la posibilidad
de que los linfocitos T CD4+ pueden proveer una ayuda para las clulas B en la produccin de
anticuerpo contra la MSP1a y MSP1b, lo cual es de suma importancia para la generacin de la
inmunidad celular y humoral contra A. marginale.
Posteriormente, Brown y colaboradores (1998b; 2001a; 2001b; 2002) continuaron sus

estudios y demostraron la presencia de eptopes conservados de clulas Th entre MSP1,
MSP2, MSP3 y en antgenos no definidos, en cepas distintas de A. marginale. Alguno de los
18
epitopes hallados en la MSP2 estaban parcialmente conservados en la MSP3, lo que sugiri
que la respuesta de los linfocitos T a estos eptopes podran generar una repuesta rpida de la
clula Th de memoria favoreciendo la produccin de anticuerpos contra nuevas variantes
emergentes, adems de beneficiar la inmunodominancia de estas MSP, lo que contribuye al
control de la rickettsemia a niveles observables en la infeccin persistente (Brown y col.,
2004).
Por lo tanto, la inmunidad celular constituye una proteccin efectiva del bovino contra
A. marginale, una vez que este ha evadido los mecanismos innatos de defensa. Adems, ayuda
a la eliminacin del agente infeccioso y le confiere proteccin al ganado vacuno contra la
reinfeccin por el mismo agente, lo cual se garantiza por la existencia de una gran poblacin
de clulas de memoria. Por lo tanto, la inmunidad celular juega un papel preponderante en la
anaplamosis bovina.
1.5. Control de la Anaplasmosis Bovina
Las medidas de control no han cambiado marcadamente en los ltimos aos. Ellas
varan de acuerdo con la localizacin geogrfica e incluye el control de artrpodos por
aplicacin de acaricidas, administracin de antibiticos y la inmunizacin, siendo esta ltima
una va efectiva y econmica para el control de la anaplasmosis bovina en todo el mundo
(Kocan y col., 2000).
1.5.1. Mtodos de inmunizacin contra la anaplasmosis
La mayor parte de los programas de control, en aquellas reas geogrfica con una
prevalencia elevada y sostenida de anaplasmosis (enzootia), se basa en el incremento de la
resistencia de los animales mediante la inmunizacin, la cual ha sido una manera efectiva de
prevenir brotes y disminuir la incidencia clnica de casos de anaplasmosis (Contreras, 2000).
Los mtodos de inmunizacin se pueden agrupar en tres categoras: Inmunizacin con

organismos vivos, Inmunizacin con organismos muertos y subunidades vacunales.
19
1.5.1.1 Inmunizacin con organismos vivos.
Una de las ms comnmente usadas es la premunizacin, en la cual se emplea sangre

infectada proveniente de animales portadores o animales con infeccin aguda para exponer a
animales sanos. Este mtodo tiene la desventaja de carecer de un nmero adecuado de
eritrocitos infectados para inducir respuesta inmune en los animales inmunizados y de que el
perodo de infeccin sea tan extenso que los animales puedan sufrir la enfermedad en ausencia
de control mdico (Rogers y col., 1988; citados por Rodrguez y col., 2003). La inmunizacin
contra anaplasmosis tambin contempla el uso de cepas vivas atenuadas, sean de A. marginale
como las que se han preparado al pasar una cepa de A. marginale en ovinos (Vizcano y col.,
1980; citados por Rodrguez y col., 2003), en venados (Zaraza y Kuttler, 1971; citados por
Rodrguez y col., 2003) o especies diferentes como A. centrale, considerada como de menor
virulencia (Pipano, 1997), tcnica que an se utiliza en pases como Israel, Australia,
Sudfrica, Argentina y Uruguay (Krigel y col., 1992). Uno de los inconvenientes, en el caso de
la inmunizacin de A. centrale, es que existe el riesgo de ocasionar un cuadro clnico grave de
Anaplasmosis, sobretodo en zonas donde esa rickettsia es extica. Este tipo de inmuizacin
con organismos vivos tiene la desventaja de que existe la posibilidad de transmitir otros
agentes patgenos a travs de la sangre como Babesia, Brucella, Mycobacterium y virus como
el de la diarrea viral bovina o el de leucosis bovina, 1o que puede conducir a desastres
econmicos y sanitarios (Rogers y col., 1988; citados por Rodrguez y col., 2003).
1.5.1.2. Inmunizacin con organismos inactivados.
Se emplea la inmunizacin con antgenos provenientes de cuerpos iniciales inactivos

de A. marginale, con la rickettsia inactiva derivada del cultivo y con membrana externa de A.
marginale (Pipano, 1995; Schetters, 1995).
1.5.1.2.1. Inmunizacin con cuerpos iniciales inactivos de A. marginale.
La primera vacuna con organismos inactivos comercializada para el control de la

anaplasmosis, emple como antgeno a A. marginale provenientes de eritrocitos hemolizados,
20
las cuales fuero liofilizadas y combinadas con un adyuvante basado en aceite en el momento
de la vacunacin (Brock y col., 1965). Esta vacuna present el incoveniente de que contena
el estroma de los eritrocitos, lo que origin el desarrollo de anticuerpos antieritrocticos en
aquellos animales a los cuales se les aplic, provocando de esta manera una anemia hemoltica
(Dennis y col., 1970). Este problema fue posteriormente solucionado mediante la purificacin
de cuerpos iniciales de A. marginale de eritrocitos infectados, suplementados con saponina
Quil-A como adyuvante, mostrando una slida proteccin del ganado vacuno despus del
desafo con cepas homlogas y heterlogas, lo cual fue caracterizado por la eliminacin de la
rickettsia y la reduccin mnima del hematocrito (Montenegro-James y col., 1991).
Indudablemente, la inmunoprofilaxis con los cuerpos iniciales de Anaplasma

purificados podra ser una eficiente y rentable medida para el control de la anaplasmosis
(Montenegro-James y col., 1995). Sin embargo, otras vacunas basadas en cuerpos iniciales de
Anaplasma purificados mostraron fallas en la proteccin. Adicionalmente, se demostr que
algunos aislados de A. marginale no tenan proteccin cruzada y pareca que las vacunas eran
mas efectivas cuando estaban hechas de aislados locales (Kocan y col., 2003).
Aunque tales inmunizaciones no induzcan proteccin contra la infeccin, la prevencin

de la mortalidad y la considerable reduccin de la morbilidad podran ser el resultado de un
incremento de la respuesta inmune protectiva durante la infeccin adquirida naturalmente
(Montenegro-James y col., 1995).
1.5.1.2.2. Inmunizacin con A. marginale inactivo derivado de cultivo
Munderloh y colaboradores (1996) desarrollaron un sistema de cultivo celular para A.

marginale, en el cual la rickettsia fue propagada en cultivos de una lnea celular IDE8,
derivada de embriones de garrapatas Ixodes scapularis, siendo la rickettsia obtenida infectiva
tanto para el ganado como para la garrapata. Cuando estos microorganismos fueron empleados
como antgenos confiri una proteccin parcial en el ganado inmunizado (de la Fuente y col.,
2002 y Kocan y col., 2003). Esto fue posible, debido a que el ciclo evolutivo de A. marginale
en el cultivo en la lnea celular de garrapatas fue muy similar al descrito en las mismas
21
garrapatas cuando stas se alimentan directamente del bovino infectado con el
microorganismo. Adems, las seis protenas MSPs (MSP1-5) se encontraban conservadas en
A. marginale derivados del cultivo, al ser comparadas con los provenientes de eritrocitos de
bovino infectados. Por otro lado, se mantuvo la composicin de A. marginale despus de
varios pasajes sucesivos en el cultivo celular (Barbet y col., 1999) o despus de varios pasaje a
travs de las garrapatas (Barbet y col., 2001). De hecho, de la Fuente y colaboradores (2002),
al evaluar la inmunoproteccin desarrollada por el ganado inmunizado con A. marginale,
derivado del cultivo celular de garrapata y de eritrocitos de bovino, sugirieron que los
antgenos de A. marginale derivados de cultivos celulares podran reemplazar los antgenos
derivados de eritrocitos en el desarrollo de una vacuna para la anaplasmosis.
Estos resultados sugieren que el uso de las inmunizaciones con A. marginale derivado
de cultivos celulares podra ser una ventaja, ya que podra evitar problemas asociados con las
inmunizaciones previas derivadas de eritrocitos. Esta vacuna podra ser fcilmente
estandarizada; estara libre de estroma de eritrocitos de bovino; de la contaminacin de
patgenos y muy importante resaltar, es que no requiere del uso del ganado vacuno para la
produccin de antgenos. Sin embargo, esta preparacin requiere posteriores investigaciones
para evaluar el efecto de la combinacin con antgenos recombinantes para mejorar la eficacia
de la vacuna para conferir proteccin contra la infeccin con A. marginale y bloquear la
transmisin biolgica del patgeno (Kocan y col., 2003).
1.5.1.2.3. Inmunizacin con membrana externa de A. marginale.
En bsqueda de una mejor respuesta inmune por parte del hospedador, se ha inoculado
al ganado con membrana externa del patgeno, esto debido a que se han encontrado protenas
inmunodominantes en la superficie de la rickettsia, las ya mencionadas MSPs (Palmer y
McGuire, 1984; Tebele y col., 1991), las cuales pueden ser capaces de generar un respuesta
inmune, que incluye lisis de los cuerpos iniciales, bloqueo de receptores o fagocitosis mediada
por anticuerpos (Palmer y col., 1989). Por lo antes expuesto, Tebele y colaboradores (1991)
inmunizaron al ganado con membrana externa de A. marginale y observaron que induce
22
proteccin al ganado despus del desafo con la rickettsia, lo cual fue demostrado por los bajos
niveles de rickttsemia y de anemia.
Sin embargo, se desconoca el efecto que poda ejercer el marcado polimorfismo

antignico y estructural de los polipptidos de superficie entre las cepas de A. marginale
(McGuire y col., 1984), afectando la habilidad que poda tener la membrana externa para
inducir proteccin contra cepas heterlogas. Palmer y colaboradores (1994a) demostraron que
la inmunizacin con membrana externa induce proteccin contra una cepa antignicamente
variable. Sin embargo, no hubo diferencia significativa en la severidad de la anemia entre el
ganado inmunizado con membrana externa y el grupo control, lo que les indic a estos autores
que una reduccin significativa de la rickettsemia no necesariamente se refleja en una anemia
menos severa. Por lo tanto, los autores sugirieron que sera necesario, la optimizacin de las
vacunas de membrana externa para inducir proteccin completa en un alto porcentaje de
animales, adems de la identificacin de antgenos de membrana capaces de generar
inmunidad protectiva, ya que facilitara el desarrollo de vacunas contra la anaplasmosis, en
vista de que estas protenas de superficie median funciones esenciales para la invasin y
colonizacin del patgeno en el hospedero (Tebele y col., 1991).
Noh y colaboradores (2008) trataron al proteoma de superficie de A. marginale con un

entrecruzador especfico para protenas de superficie, el cual forma puentes intermoleculares
entre protenas adyacentes. Posteriormente, emplearon cromatografa lquida y espectrometra
de masa en tndem (LC-MS-MS, del ingls Liquid Chromatography with tandem mass
spectrometric) para caracterizar la composicin de protenas especficas del complejo
resultante, obteniendo como resultado que el complejo de protenas de superficie de la
rickettsia aislada de hemates de bovinos estaba compuesto de mltiples protenas de
membranas (MSP2, MSP3, OMP7, AM854, OMP8, OpaG2, AM779, MSP1a, MSP4, OMP1,
OMP9, AM1011, AM780, OMP11, VirB10, AM1051, AM366, AM712) pertenecientes a la
familia pfam01617, la cual es conservada entre bacterias del gnero Anaplasma y
cercanamente relacionada con el gnero Ehrlichia. En contraste, el proteoma de superficie de
la rickettsia aislado de las clulas de la garrapatas fue mucho menos complejo y contena una
nueva protena, la AM778, no identificada dentro del proteoma de superficie de A. marginale
23
aislado de los eritrocitos de bovino. La inmunizacin con el complejo de superficie
entrecruzado (CSP, del ingls Cross-linked suface complex) indujo proteccin contra altos
niveles de bacteriemia y de anemia en el desafo con A. marginale y efectivamente recapitul
la proteccin inducida por la inmunizacin con toda la membrana externa de la rickettsia.
Estos resultados indican que un subgrupo de protenas de superficie es capaz de inducir
inmunidad protectiva y favorece el desarrollo de vacunas. Adicionalmente, sealan que existe
un remodelamiento del proteoma de superficie que acompaa la transicin entre el hospedero
mamfero y el artrpodo e identifica nuevos blancos para el bloqueo de la transmisin.
La inmunizacin con la membrana externa o con el CSP de A. marginale induce

proteccin contra la bacteriemia, sin embargo los componentes responsables de la proteccin
dentro de estos inmungenos complejos son todava desconocidos (Albarrak y col., 2012).
1.5.1.3. Subunidades vacunales.
Las subunidades vacunales estn conformadas por la inmunizacin con protenas

nativas, protenas recombinantes o de ADN.
1.5.1.3.1. Inmunizacin con protenas nativas y recombinantes de A. marginale
En 1984, Palmer y McGuire demostraron que los anticuerpos policlonales dirigidos

contra las MSPs en la superficie de los cuerpos iniciales de A. marginale eran capaces de
neutralizar la infeccin. Adems, Palmer y colaboradores (1986) sealaron que los anticuerpos
monoclonales inmunoprecipitaron con una protena de superficie radiomarcada de la
rickettsia, la cual fue aislada por inmunoafinidad y tena un peso molecular de 105 kDa y la
llamaron AM105, actualmente llamada MSP1. Esta protena fue utilizada para inmunizar el
ganado vacuno, el cual fue protegido parcialmente contra el desafo homlogo y heterlogo,
demostrado por la reduccin significativa de la rickettsemia y de la anemia, obtenindose altos
ttulos de anticuerpos los cuales fueron similares tanto para la MSP1a como para la MSP1b
(Palmer y col., 1986; Palmer y col., 1989; Brown y col., 2001b).
24
Estos experimentos claramente demostraron que la MSP-1 tiene un fuerte potencial
como inmungeno protectivo y que la produccin de MSP-1 recombinante era un paso
necesario para completar su estudio (Palmer, 1989). Por tal motivo, McGuire (1992) estudi la
inmunizacin del ganado vacuno con las recombinantes MSP1-a y MSP1-b por separado o en
combinacin (MSP-1a/b). Esta inmunizacin fall al proveer inmunidad protectiva a pesar de
los altos ttulos de anticuerpos obtenidos (trabajo no publicado; citado por Palmer y
McElwain, 1995). Se piensa que las posibles fallas incluyen el uso de un solo polipptido
MSP1b como inmungeno y la falta del enlace covalente entre las protenas MSP1a y MSP1b,
las cuales pueden ser necesarias para estimular una efectiva respuesta de linfocitos Th y de
esta manera desarrollar una vacuna recombinante o de ADN efectiva para la anaplasmosis
(Brown y col., 2001b).
En cuanto a la MSP2 (36 kDa), la cual es una protena de superficie inmunodominante

con eptopes similares entre A. centrale y A. marginale (Shkap y col., 1991), fue purificada
por inmunoafinidad y empleada para la inmunizacin del ganado vacuno, al cual le produjo
una respuesta inmune protectiva parcial contra el desafo con cepas homlogas y heterlogas
de A. marginale (Palmer y col., 1988), pudiendo ser considerada como un inmungeno
candidato para el desarrollo de vacunas. Sin embargo, hasta la fecha no se han realizado
inmunizaciones del ganado vacuno con la MSP2 recombinante, a pesar de que el gen de la
msp2 ha sido clonado y expresado (Palmer y col., 1994b).
La MSP3 (86 kDa) presenta un alto poder antignico tanto en la infeccin natural como
en la experimental (Palmer y col., 1986). Al igual que la MSP2, tiene eptopes conservados
entre A. centrale y A. marginale (Shkap y col., 1991). Asimismo, la MSP3 genera un retardo
en el inicio de la rickettsemia en el ganado inmunizado con la protena nativa, pero sin
diferencias estadsticamente significativas en el pico de la rickettsemia o en la severidad de la
anemia cuando se compara con el ganado control (McGuire trabajo no publicado, 1992; citado
por Palmer y McElwain, 1995). Adicionalmente, Tebele y colaboradores (1991), sealaron
que la MSP3 no parece ser inmunodominante en el ganado inmunizado con membrana
externa. No obstante, Brown y colaboradores (2004) sugirieron que la respuesta de los
linfocitos T a los eptopes conservados y parcialmente conservados hallados en la MSP2 y
25
MSP3 podran generar una repuesta rpida de la clula Th de memoria. De esta manera, se
favorece la produccin eficiente de anticuerpos contra nuevas variantes emergentes, adems
de beneficiar la inmunodominancia de estas MSPs y contribuir al control de la rickettsemia a
los niveles observables en la infeccin persistente, como se mencion anteriormente. A pesar
de que la MSP3 no ha sido bien caracterizada a nivel molecular, los resultados obtenidos hasta
el momento contribuiran al entendimiento de la regulacin gentica del polimorfismo de las
MSPs (Palmer y McElwain, 1995).
Por otra parte, el ganado inmunizado con la MSP4 nativa o recombinante indujo
proteccin parcial contra desafos homlogos, ocurriendo lo contrario con la MSP5 nativa o
recombinante, donde el ganado inmunizado no fue protegido contra el desafo al ser
comparado con el ganado control (Barbet datos no publicados, 1994; citados por Palmer y
McElwain, 1995).
En vista de que la inmunodominancia de las MSPs genera una proteccin parcial y en

algunos casos no genera proteccin, muchos autores se han enfocado en la identificacin de
protenas subdominantes, inmunognicas y conservadas en la membrana externa de A.
marginale (Lpez y col., 2005; 2008), incluyendo aquellas asociadas a la membrana
(Macmillan y col., 2008; Morse y col., 2012b). Probablemente se requiera de una vacuna
protectiva con mltiples protenas subdominantes o una combinacin de eptopes de linfocitos
T y B derivados de la misma protena de superficie o de varias protenas de superficie
asociadas dentro de la membrana, los cuales podran ser componentes importantes de una
vacuna de membrana externa protectiva contra la anaplasmosis (Morse y col., 2012b).
Han sido mucho los intentos para identificar nuevas protenas en A. marginale usando
varias preparaciones antignicas (Riding y col., 2003; Barigye y col., 2004), como en el
estudio realizado por Riding y colaboradores (2003), en el cual identificaron los antgenos de
A. marginale por un proceso de fraccionamiento del material del patgeno por punto
isoelctrico, pruebas de inmunizacin y desafos con el microorganismo, sin conocer la
localizacin y abundancia de estos antgenos en la rickettsia. La fraccin escogida estaba libre
de las bien conocidas MSPs y contena protenas con un punto isoelctrico entre un rango de
26
pH 7,7 a 9,6; en la cual se identificaron cinco protenas, las cuales han sido denominadas
como Ana43, Ana37, Ana32, Ana29 y Ana17, basado en sus pesos moleculares en kDa, las
cuales representan una porcin menor del proteoma de A. marginale. Estas protenas fueron
empleadas de forma individual en ensayos de inmunizacin en ganados, las cuales generaron
una inmunidad protectiva parcial contra desafos homlogos. Esto fue demostrado por una
disminucin significativa de la bacteriemia en comparacin con el grupo control, existiendo
correlacin significativa entre la bacteriemia y el hematocrito (Hto), siendo una caracterstica
principal de la Anaplasmosis la disminucin del Hto.
Debido a las dificultades asociadas con la obtencin de estos antgenos nativos en

suficientes cantidades para los experimentos de vacunacin y como parte del desarrollo de
vacunas, Hope y colaboradores (2004) consideraron necesario producirlos como protenas
recombinantes. Para ello, clonaron y secuenciaron el gen que codifica para la protena Ana29
de A. marginale, el cual ha sido expresado como una protena recombinante (Ana29r) y
purificado para su uso en ensayos de inmunizacin. Esta protena est clasificada por los
algoritmos de prediccin de protenas como una protena de membrana integral. Adems,
muestra un 99 % de identidad entre las secuencias de dos aislados australianos y uno
americano de A. marginale, al igual que con una cepa de A. centrale usada en la vacuna
comercial australiana. Los autores sealaron, que Ana29r, tuvo un nivel de proteccin
significativo en vista de que hubo una buena correlacin entre los niveles de anticuerpo IgG2 y
la rickettsemia en el ganado protegido y desafiado con A. marginale, siendo el nivel de
proteccin (50 % de reduccin de la rickettsemia) similar a aquellos obtenidos en previos
ensayos con el antgeno nativo. Esto es consistente con la hiptesis de que la inmunidad
protectiva contra A. marginale es dependiente de la secrecin del IFN- por los linfocitos T
CD4+, ya que este, como se mencion anteriormente, permite la activacin de macrfagos y la
produccin de IgG2; generando de esta manera la reduccin de la rickettsemia (Palmer y col.,
1999).
En vista de la secuenciacin y anotacin del genoma de A. marginale (Brayton y col.,

2005), se permiti un enfoque protemico y genmico para la identificacin de nuevas
protenas de membrana externa que se encuentran en menor proporcin en la superficie de la
27
rickettsia, denominadas por Lpez y colaboradores (2007) como Antgenos Subdominantes
y que por tal razn, no haban sido detectadas en estudios previos que carecan de sensibilidad
en los ensayos inmunolgicos y protemicos. De hecho, estos autores identificaron 24
protenas antignicas que fueron predichas ser de membrana externa, membrana interna o
protenas asociadas a la membrana. Esto incluy a las previamente caracterizadas MSP2,
MSP3, MSP5. Entre las nuevas protenas antignicas, 14 estn anotadas en el genoma de A.
marginale e incluyen un grupo de protena del sistema de secrecin tipo IV (TFSS, del ingls
Type Four Secretion System; VirB9-1, VirB9-2, VirB10), el factor de elongacin Tu (EF-Tu,
del ingls Elongation Factor-Tu), aminopeptidasa PepA citoslica, los miembros de la
superfamilia MSP2 (OMP4, OMP7, OMP10, OMP14, OMA87 y OpAG2) y las protenas
asociadas al apndice de Anaplasma (AM878, AM879, AM880).
Se ha demostrado que las protenas recombinantes VirB9-1, VirB9-2 y VirB-10 del

TFSS estimulan la proliferacin de linfocitos T, la secrecin de IFN- y son reconocidas por la
IgG2 presente en el suero de bovinos inmunizados con membrana externa de A. marginale
(Lpez y col., 2007). Resultados similares fueron obtenidos por Arajo y colaboradores
(2008), quienes demostraron que VirB9-2, VirB-10 y EF-Tu son inmunognicas en el ganado
infectado natural y experimentalmente, lo cual fue detectado por un ELISA con las protenas
recombinantes. Adems, se ha demostrado que los eptopes de VirB9-1, VirB9-2, VirB-10 y
EF-Tu son conservados entre aislados heterlogos de A. marginale, que tienen regiones
altamente conservadas y un alto promedio de similitud en la secuencia aminoacdica en
comparacin con las protenas ortlogas de patgenos rickettsiales muy cercanos como A.
phagocytophilum, E. canis y E. chaffeensis (Lopez y col., 2007; Arajo y col., 2008). Todas
estas caractersticas son muy importantes para el desarrollo de inmungenos protectivos, por
lo que los antgenos subdominantes conservados son de especial inters para el desarrollo de
vacunas (Lpez y col., 2007).
Existen otras protenas inmunognicas del TFSS, como la protena VirB2, formalmente
anotadas en el genoma de la rickettsia como OrfX, otras como VirB7, VirB11 y VirD4, las
cuales han estimulado la proliferacin de linfocitos T de memoria de una manera significativa
en el ganado inmunizado con membrana externa de A. marginale, pero que no generaron
28
anticuerpos, ya que no fueron detectadas por los sueros de estos animales. Esto pudo deberse a
que estas protenas no estn expuestas a las clulas B, siendo sus eptopes probablemente
presentados por las APC a los linfocitos T. Probablemente, estas protenas no estn expuestas
en la superficie, pero estn asociadas fsicamente con otras protenas del TFSS que si lo estn,
con el fin de estimular los linfocitos T colaboradores, los cuales participan en la activacin de
linfocitos B y en la sealizacin de antgenos para ayudar a mejorar la respuesta de
anticuerpos contra la protena que est expuesta en la superficie (Sutten y col., 2010).
El descubrimiento de estos nuevos antgenos justifica la evaluacin de estas protenas

que comprenden el complejo de protenas del TFSS como un candidato vacunal en contra de
A. marginale y otros patgenos Gram negativos, ya que estas han sido reconocidas por el
suero de animales infectados por va natural y por el suero de bovinos inmunizados con
membrana externa a partir de aislados homlogos de la rickettsia. Adicionalmente, estas
protenas del TFSS son altamente conservadas entre distintos aislados geogrficos de A.
marginale y presentan regiones muy similares con secuencias de protenas ortlogas de
patgenos rickettsiales muy cercanos, lo que indica su uso potencial en el desarrollo de
vacunas contra A. marginale y patgenos relacionados de animales y humanos (Lopez y col.,
2007).
Por otro lado, se ha observado que las protenas VirB9-1, VirB9-2 y VirB-10 estn
naturalmente asociadas en la membrana de la rickettsia (Morse y col., 2012a), como ocurre en
el caso de la MSP1a de A. marginale, que est enlazada con la MSP1b en su forma nativa en
la membrana externa, favoreciendo la produccin de IgG especfica para la MSP1b
(Macmillan y col., 2008). Por todos estos motivos, es posible que un complejo de protenas
con VirB9-1, VirB9-2 y VirB-10, las cuales son protenas altamente conservadas e
inmunognicas, pudiera ser evaluado en un futuro como una vacuna para proteger al ganado
contra la Anaplasmosis (Morse y col., 2012a).
Palmer y colaboradores (2012), inmunizaron al ganado con A. centrale y utilizaron el

suero de estos animales para identificar las protenas de membrana externa con eptopes
conservados en la cepa heterloga de A. marginale, obteniendo como resultado la
29
identificacin de tres protenas de superficie que incluyen a AM779, AM854 y una de las
OMPs 7/8/9, siendo clasificadas inmunolgicamente por los autores como antgenos
subdominantes.
Se conoce que la OMP9 estimula la respuesta proliferativa de linfocitos T en los

animales vacunados con membrana externa de la rickettsia, pero su capacidad protectiva
contra la anaplasmosis es desconocida (Palmer y col., 2012). En cuanto a la protena AM854,
Lpez y colaboradores (2005) sealan que esta protena fue reconocida por la IgG de bovino
en por lo menos un animal, demostrando as ser antignica, pero no se conoce si esta respuesta
genera proteccin contra la infeccin. Albarrak y colaboradores (2012), demostraron que la
protena AM779, la cual es altamente conservada, es inmunolgicamente subdominante en el
contexto de inmungenos de membrana externa y en el CSP, ya que mostr una dbil
respuesta de anticuerpos. Adicionalmente, observaron que esta subdominancia es superada al
referirse a la respuesta de los linfocitos T cuando se utiliza como la AM779r como
inmungeno, pero no para los linfocitos B, lo que quiere decir que la cantidad de inmungeno
es determinante para la respuesta de los linfocitos T, en vez de la estructura del eptope. Por
otro lado, esta protena recombinante, genera una respuesta inmunolgica anamnsica o de
memoria al desafo con A. marginale. Esto respaldara que, a pesar de ser un menor
componente de la membrana externa, hay suficiente antgeno en el contexto nativo para
estimular una respuesta anamnsica, la cual es un requerimiento de los antgenos
subdominantes para funcionar como vacunas. Sin embargo, la respuesta inmune generada por
la AM779r no promovi la proteccin contra la bacteriemia debido a que todos los animales
vacunados con AM779r se infectaron con la rickettsia.
Desde este punto de vista, los antgenos subdominantes pueden ser requeridos pero no
suficientes para inducir inmunidad protectiva. Puede ser necesario un incremento de la
protena de superficie especfica para superar la subdominancia atribuida a su baja cantidad o a
su carencia de epitopes y as poder inducir una proteccin uniforme entre animales vacunados
usando los inmungenos complejos tales como la membrana externa y el CSP.
Interesantemente, la inmunizacin con AM779 apoya la idea de que una vez que la dosis de
antgeno es incrementada, se genera la respuesta de memoria al desafo infeccioso. Esto apoya
30
a investigaciones posteriores sobre el rol de los antgenos subdominantes, individuales y
colectivos, en el desarrollo de vacunas contra A. marginale y patgenos relacionados
(Albarrak y col., 2012).
Todos estos estudios revelan que las protenas de membrana del A. marginale
presentan un alto potencial vacunal, ya sean nativas o recombinantes, debido a que sus
epitopes son capaces de ser reconocidos por el sistema inmunolgico y desencadenar una
respuesta especfica por parte del hospedador.
1.5.1.3.2. Inmunizacin con ADN de A. marginale.
La vacunacin constituye una de las ms efectivas intervenciones para reducir las

prdidas econmicas debido a las enfermedades infecciosas. Sin embargo, a pesar del xito en
el desarrollo de las vacunas contra un gran nmero de enfermedades infecciosas, hay
numerosos patgenos para los cuales no se ha desarrollado una vacuna efectiva. Esto
probablemente es una de las razones por la cual fue recibido el concepto de inmunizacin con
ADN o vacunas de la tercera generacin (van Drunen Little-van den Hurk y col., 2001).
Este tipo de inmunizacin se basa en la inoculacin de un plsmido de ADN de bacteria o un
virus por va intramuscular, el cual es capaz de codificar y expresar las protenas, causando
una respuesta inmune humoral y celular en el animal (Goldsby y col., 2000). Las vacunas de
ADN muestran una promesa para el desarrollo de vacunas debido a que ellas pueden producir
una inmunidad duradera y un amplio espectro de respuesta inmune, tanto humoral como
celular, pudiendo ser usada para inmunizaciones simultaneas contra mltiples patgenos (van
Drunen Little-van den Hurk y col., 2001).
Hasta ahora se sabe que la MSP1a de A. marginale induce inmunidad protectiva parcial
en animales infectados con cepas homlogas y heterlogas (Palmer y col., 1986; Palmer y col.,
1989; Brown y col., 2001b). Es por esta razn que McGuire y colaboradores (1994)
expresaron esta protena en virus vaccinia recombinantes con diferentes promotores y como
protenas hbridas. Sin embargo, los autores no pudieron concluir de manera contundente
acerca del uso de esta vacuna, pues los ttulos de anticuerpos obtenidos no corresponden con la
31
cantidad de MSP1a expresada. Adems, se evidenci que parte de la MSP1a expresada
quedaba retenida en el aparato de Golgi, sin contar con la gran mortalidad de ratones al ser
inoculados con el virus.
En vista de que McGarey y colaboradores (1994) mostraron que la MSP1a y la MSP1b

recombinante, localizadas en la superficie de la bacteria Escherichia coli, diriga la adherencia
de esta bacteria a los eritrocitos bovinos, Arulkathan y colaboradores (1999), exploraron el uso
de la MSP1a en una vacuna basada en ADN para la anaplasmosis, obteniendo como resultado
la proliferacin de los linfocitos T en los ratones BALB/c y en el ganado inmunizado, en
respuesta al homogenato de A. marginale y la MSP1a purificada, de manera dosis
dependiente. Adicionalmente, la respuesta de anticuerpos a la MSP1a en el ganado fue
restringida al isotipo de IgG1. Estos datos son una base para la estrategia de inmunizacin
empleando vectores de ADN como vacunas, los cuales contienen uno o mltiples genes
codificantes de protena de superficie de A. marginale, dirigiendo de esta manera la respuesta
inmune del bovino.
Debido a los buenos resultados obtenidos, varios autores se han dado a la tarea de
mejorar la eficacia de las inmunizaciones con ADN contra la anaplasmosis bovina (Mwangi y
col., 2002 y Micheln y col., 2006).Se ha demostrado que los vectores empleados en las
vacunas de ADN pueden ser modificados mediante la inclusin de motivos CpG
estimulatorios o por la insercin de genes de citoquinas para que sean coexpresados con el
antgeno empleado en la vacuna. Esta modificacin genera un aumento dramtico en la
respuesta inmune dependiente de las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC, del ingls Major Histocompatibility Complex) de clase I y II, adems de conferir
proteccin contra desafos virulentos. Estas razones fueron suficientes para que Mwangi y
colaboradores (2002) propusieran que el ligando de la tirosina quinasa 3 del hgado fetal
(Flt3L, del ingls Fetal liver tyrosine kinase 3 ligand) y el factor estimulante de colonias de
granulocitos y macrfagos (GM-CSF, del ingls Granulocyte-Macrophage ColonyStimulating), incorporados en una vacuna de ADN, podan aumentar el reclutamiento de las
clulas dendrticas (DC, del ingls Dendritic cell) en el sitio de inmunizacin y de esta
manera, aumentar la respuesta inmune antgeno especfica en el ganado vacuno.
32
Para comprobar lo anterior, los autores antes mencionados, emplearon como antgeno
el gen que codifica para la MSP1a de A. marginale, ya que esta protena es un blanco para la
respuesta inmune protectiva, adems de que ya han sido identificados los eptopes de las
clulas T CD4+ y los eptopes restringidos a las MHC de clase II DR. Esto permiti evaluar si
el tratamiento con Flt3L/GM-CSF aumenta la respuesta de las clulas T a eptopes especficos
de la MSP1a en bovinos vacunados con los alelos MHC de clase II apropiados. De esta
manera, los autores demostraron que en efecto, el Flt3L y el GM-CSF incrementan el
reclutamiento de las DC en el sitio de inmunizacin y aumentan la respuesta de los linfocitos
T CD4+ para la MSP1a expresada en un vector de ADN empleado como vacuna. Estos
resultados constituyen un soporte para el uso de estos factores de crecimiento en la vacunacin
con ADN y especficamente indica su aplicacin para la evaluacin de vacunas en grande
animales (Mwangi y col., 2002).
Por otro lado, Michelon y colaboradores (2006) evaluaron la respuesta inmune humoral
y celular de los ratones BALB/c contra la MSP1a recombinante de A. marginale, cuyo gen fue
clonado en un plsmido de expresin micobacterial con el cual se transform la cepa BCG
Pasteur 1173P2 de Mycobacterium bovis y posteriormente inoculada en los ratones. Dicho
estudio fue basado en publicaciones previas, donde se demostr que la BCG del M. bobis es
una vacuna atenuada, la cual protege al ganado vacuno contra la tuberculosis, adems de ser
una vacuna estable y segura que ha demostrado excelentes propiedades como adyuvante.
Asimismo, induce una larga duracin de la respuesta inmune y un bajo costo de produccin.
Por tales motivos, Michelon y colaboradores (2006), emplearon esta cepa y el plsmido de
expresin micobacterial para la produccin MSP1a recombinante como antgeno, siendo esta
protena escogida por las mismas razones por la que Mwangi y colaboradores (2002) la
emplearon para sus estudios. Como resultado, los autores observaron que la cepa BCGr fue
capaz de inducir altos niveles de anticuerpos anti-MSP1a, los cuales reconocen la MSP1a
nativa de la rickettsia obtenida de eritrocitos infectados. Asimismo, la produccin de IFN-
especfica de la MSP1a, inducido por la cepa BCGr, sugiere que existe una respuesta inmune
celular Th1, indicando que el antgeno recombinante fue adecuadamente presentado al sistema
inmune. Estos resultados claramente demostraron que la cepa BCG de M. bobis es un vector
33
adecuado para expresar y presentar antgenos de A. marginale y por lo tanto puede ser usado
para posteriores estudios en la induccin de la inmunidad protectiva en el ganado vacuno.
Todos los estudios mencionados anteriormente revelan que las protenas de membrana
del A. marginale presentan un alto potencial vacunal, ya sean nativas, recombinantes o
codificadas en molculas de ADN, debido a que sus eptopes son capaces de ser reconocidos
por el sistema inmunolgico y desencadenar una respuesta especifica por parte del
hospedador.
En la actualidad, el desarrollo de una buena vacuna contra la anaplasmosis es de gran

importancia debido a las grandes prdidas econmicas generadas por esta enfermedad, pero
con las tcnicas convencionales, ste puede ser un proceso largo y tedioso, ya que
comnmente se realizan pruebas de ensayo y error hasta encontrar el candidato ms adecuado,
ello sin tomar en cuenta la facilidad de que pueda ser cultivado el microorganismo en el
laboratorio (Figura 1.4) (Rappuoli, 2001). Con la ventaja de la secuenciacin del genoma de A.
marginale y de la bioinformtica, el campo de las vacunas ha sido radicalmente cambiado,
proporcionando nuevas y mejores vacunas, lo que ha permitido descubrir nuevos antgenos
que no haban podido ser encontrados por las tcnicas convencionales. Por lo tanto, se podra
decir que este nuevo enfoque llamado por Rappuoli en el ao 2001 como Vacunologa
Inversa, es una poderosa herramienta para el desarrollo de nuevas vacunas.
1.6. Vacunologa Inversa: del genoma al microorganismo
El proyecto Genoma Humano permiti el desarrollo de tecnologas que conllevaron a

la secuenciacin de genomas de muchos microorganismos. Ello gener una gran cantidad de
datos donde la Bioinformtica entr a jugar un papel muy importante para el anlisis de los
mismos. La Bioinformtica, definida como el uso de tcnicas y herramientas computacionales
para el anlisis de la informacin biolgica, es una disciplina, nacida para cubrir la necesidad
de manejar las enormes cantidades de informacin provenientes, tanto de la secuenciacin de
las macromolculas (ADN, protenas y glcidos) como de las tcnicas de anlisis masivo del
comportamiento de genes y protenas. El auge de la Informtica junto con el establecimiento
34
de la Internet y de las bases de datos moleculares, han posibilitado en estos ltimos aos el
estudio de la informacin gentica con el desarrollo de programas que aceleran el anlisis de
numerosas variables (Lesk, 2002).
La posibilidad de determinar toda la secuencia del genoma de muchos

microorganismos de importancia en la salud humana y animal, permiti la idea de usar esta
informacin para descubrir nuevos antgenos que no han sido encontrados por las tcnicas
convencionales. Esta herramienta ha permitido el desarrollo de una tecnologa conocida como
Vacunologa Inversa (Figura 1.4), la cual involucra el anlisis in silico de la secuencia del
genoma microbiano (Rappuoli, 2001; Ferreira y Porco, 2008) para identificar nuevos
antgenos como potenciales candidatos vacunales, y fue por primera vez utilizada contra el
meningococo del serogrupo B (Pizza y col., 2000).
Una de las caractersticas de la Vacunologa Inversa es que no es necesario cultivar el

microorganismo, ya que el proceso comienza con la informacin del genoma en una base de
datos y no es necesario el instrumental de laboratorio, siendo aplicable tanto a microorganismo
cultivables como a los no cultivables. As mismo, los patgenos peligrosos de manipular
pueden ser estudiados fcilmente, comenzando el anlisis del catalogo virtual de todos los
posibles antgenos proteicos codificados en el genoma del patgeno, sin tener en cuenta de si
estos son expresados in vivo o in vitro. Este enfoque permite la identificacin de todos los
antgenos vistos por los mtodos convencionales y el descubrimiento de nuevos antgenos que
trabajan sobre un paradigma totalmente diferente; por lo tanto, permite el descubrimiento de
nuevos mecanismos de intervencin inmune (Rappuoli, 2001).
Desafortunadamente, en la Vacunologa Inversa es difcil hacer una buena correlacin

patgeno-hospedador debido al conocimiento limitado que se pueda tener de los candidatos
antignicos obtenidos por anlisis in silico, constituyendo ello un paso limitante. Asimismo,
presenta la incapacidad de identificar ciertos antgenos tales como polisacridos, los cuales
son componentes importantes de muchas vacunas logradas exitosamente y finalmente, este
enfoque tiene la dificultad de identificar antgenos restringidos CD1 tales como los
glicolpidos, los cuales representan futuros candidatos vacunales; sin embargo, no deja de ser
35
una herramienta poderosa en el desarrollo de nuevas vacunas (Rappuoli, 2001).
FIGURA 1.4. Comparacin de la metodologa y el tiempo entre la vacunacin convencional y la inversa para el
desarrollo de vacunas (Tomado de Ferreira y Porco, 2008).
1.6.1. La Bioinformtica en el anlisis de genomas.
Actualmente existen varios algoritmos para identificar protenas extracelulares o

secretadas, las cuales son ms accesibles a los anticuerpos que las protenas intracelulares,
representando candidatos vacunales ideales. Sin embargo, estos algoritmos no son siempre
capaces para predecir correctamente la localizacin celular de las protenas (Chakravarti y
36
col., 2001). Las estrategias basadas en la genmica para el desarrollo de vacunas dependen
altamente del criterio empleado para la seleccin de potenciales antgenos por anlisis in
silico. Varios enfoques pueden ser usados para obtener secuencias genmicas y la
combinacin apropiada de varios algoritmos, con la evaluacin crtica de la informacin
generada, son esenciales para la propia seleccin de los antgenos (Mora y col., 2003).
En sntesis, el anlisis in silico requiere de una primera evaluacin, la cual es llevada

sobre fragmentos de ADN o cntigos (clones adyacentes que tienen en comn parte de su
secuencia), usando bases de datos o programas computacionales para determinar la capacidad
codificante; un segundo paso es emplear todos los marcos de lectura abiertos (ORF, del ingls
Open Reading Frame) para buscar homologas en una base de datos con programas como el
BLASTX, BLASTN y TBLASTX (Altschul y col., 1997) para identificar fragmentos de ADN
con regiones potencialmente codificantes. Los ORFs que codifican protenas de funciones
citoplasmticas conocidas o antgenos conocidos son excluidos, mientras que las regiones
desconocidas son seleccionadas para posteriores anlisis. Un tercer paso es identificar
protenas putativas con hlices transmembranas.
Las bases de datos BLAST, MOTIFS, FINDPATTERNS y PSORT, adems de

ProDom, Pfam y Blocks, son usadas para predecir caractersticas tpicas de protenas de
superficie, tales como dominios transmembranas, pptidos lderes, homologas con protenas
de superficie conocidas, lipoprotenas, motivos de anclaje a la membrana externa y clulas
hospederas unidas a dominios RGD (Brennan y Shahin, 1996; citado por Mora y col., 2003).
En el genoma tambin se buscan protenas que sean homlogas a factores de

virulencias putativos, previamente caracterizados en otros organismos (Saunders y col., 1998;
citado por Mora y col., 2003). Finalmente, en el anlisis bioinformtico se incluye la bsqueda
de similitud en una base de datos de secuencias incompletas de genomas microbianos, adems
de las secuencias disponibles de genomas relacionados (Mora y col., 2003).
37
1.6.2. Del candidato al antgeno: inmunogenicidad y proteccin
Una vez realizado el anlisis in silico, cuyo resultado es la seleccin de un gran nmero
de protenas candidatas, lo siguiente que debe realizarse es probar la propiedad antignica de
las mismas. Por lo tanto, es necesario usar simples procedimientos que permitan clonar y
expresar los genes codificadores de estas protenas. Mediante mtodos moleculares
relativamente simples, se procede a obtener las protenas purificadas, las cuales son usadas
para inmunizar ratones. Los sueros post-inmunizacin son analizados para verificar su
localizacin predicha por la computadora y su habilidad para producir una respuesta inmune.
Para ello, el suero inmune es evaluado usando el anlisis de Inmunotincin con la protena
recombinante, vesculas de membrana externa y el extracto total del microorganismo, para
determinar en primer lugar si los anticuerpos son capaces de reconocer tanto a la protena
recombinante como a la protena del patgeno y en segundo lugar, confirmar la localizacin
de la protena. Para reafirmar la presencia de dichas protenas en la superficie del
microorganismo y evaluar su inmunogenicidad, los sueros son analizados por ELISA y por
citofluorometra (FACS), para medir los ttulos de anticuerpos y determinar la habilidad del
antisuero para unirse a la superficie del microorganismo vivo (Mora y col., 2003).
Segn Mora y colaboradores (2003), la forma directa de medir la eficacia protectiva de

los antgenos candidatos es evaluar los sueros inmunes en un modelo animal en el cual la
proteccin es dependiente del mismo mecanismo efector, como en el humano o en el animal
que se desee usar la vacuna. La falta de modelos animales fiables ha obstaculizado,
frecuentemente el desarrollo de vacunas, por ello se han desarrollado ensayos in vitro
alternativos
(ensayos
para medir actividad
bactericida
y opsonofagocitosis) para
correlacionarlos con la eficacia de la vacuna en humanos o animales.
De esta manera, la Vacunologa Inversa ha permitido identificar exitosamente nuevos

candidatos vacunales contra algunos patgenos humanos, as como para el desarrollo de
vacunas de inters veterinario.
38
1.6.3. Aplicacin de la Vacunologa Inversa: potenciales candidatos vacunales.
Uno de los primeros ejemplos en donde fue aplicada exitosamente la Vacunologa

Inversa para la identificacin de candidatos vacunales potenciales fue en el caso del patgeno
humano N. meningitidis serogrupo B (MenB). Esta bacteria es una de las principales causas,
en todo el mundo, de meningitis bacteriana, sepsis grave y shock sptico. Empleando los
enfoques tradicionales, se han desarrollado vacunas contra los serogrupos A, C, Y y W135,
(Gotschlich y col., 1969), pero a pesar de los esfuerzos realizados, no se haba podido
desarrollar una vacuna efectiva contra el MenB, debido a la variacin de la secuencia de las
protenas de superficie y la reactividad cruzada del polisacrido capsular de este serogrupo con
los tejidos humanos. No obstante, en vista de la ventaja de la secuenciacin del genoma de la
bacteria y de la bioinformtica, los autores hallaron un total de 350 antgenos candidatos, los
cuales fueron expresados en Escherichia coli, purificados y usados para inmunizar ratones.
Este suero les permiti la identificacin de las protenas de superficie que estaban conservadas
en varias cepas y que inducan una respuesta de anticuerpos con actividad bactericida, la cual
es una propiedad que se correlaciona con la eficacia de las vacunas en humanos (Pizza y col.,
2000).
La Vacunologa Inversa tambin ha sido utilizada para el desarrollo de vacunas contra

otras bacterias patgenas para humanos como Streptococcus pneumoniae (Wizemann y col.,
2001), Staphylococcus aureus (Etz y col., 2002), Mycobacterium tuberculosis (Betts, 2002),
Bacillus anthracis (Ariel y col., 2002), Chlamydia pneumoniae (Capo y col., 2005),
Porphyromonas gingivalis (Ross y col., 2001), entre otras.
En cuanto a las infecciones virales, la mejor manera de prevenirla es a travs de la

vacunacin, debido a que estas infecciones no pueden ser atacadas una vez que se encuentran
residiendo en el hospedador. Sin embargo, para algunos virus esto ha sido una tarea larga y
laboriosa, sin haberse conseguido an una vacuna efectiva. Tal es el caso del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), causante del Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
(SIDA), patologa que afecta gravemente al sistema inmune. Este virus presenta una amplia
variabilidad gentica distribuida en diversa regiones del mundo, lo cual ha obstaculizado el
39
desarrollo de una vacuna eficaz para el virus. Por tal motivo, De Groot y colaboradores
(2003), se dedicaron a emplear la Vacunologa Inversa, con la cual identificaron eptopes
conservados en varias secuencias del HIV-1 derivadas de diferentes aislados obtenidos en
Latino Amrica, frica, Asia, las Islas del pacfico, Europa y los Estados Unidos, con lo que
demostraron que este enfoque bioinformtico puede acelerar el desarrollo de una vacuna para
el HIV-1. Igualmente, estn en progreso el desarrollo de vacunas contra otros virus empleando
la Vacunologa Inversa, tal es el caso del coronavirus asociado al Sndrome Respiratorio
Agudo Severo (SARS), en donde la genmica ha jugado un papel crucial en la identificacin
de candidatos vacunales (Rota y col., 2003; Marra y col., 2003; Holmes y Enjuanes, 2003).
Otro ejemplo del uso de la tecnologa de la bioinformtica se puede observar en el caso

del Trypanosoma cruzi, hemoparsito causante de la enfermedad de Chagas, o tripanosomiasis
americana. Esta enfermedad es transmitida directamente por los hempteros triatominos,
mediante las transfusiones de sangre de donantes infectados o por va congnita al feto, a
travs de la placenta de madres infectadas. La infeccin suele provocar daos miocrdicos con
dilatacin cardiaca, arritmias y trastornos de la conduccin (que guardan estrecha relacin con
los casos de muerte sbita) (OMS, 2002). Las quimioterapias para el tratamiento de los
pacientes agudos y crnicos son limitadas debido a su alta toxicidad y pobre eficacia; as
mismo, se carece de vacunas contra este parsito (Bhatia y col., 2004). Por tal motivo, Bhatia
y colaboradores (2004) aplicaron una variedad de herramientas genmicas basadas en la Web
para el anlisis de aproximadamente 2.500 secuencias, de las cuales escogieron solo aquellas
que tuvieran caracterstica de protenas secretadas y/o con GPI asociada a la membrana. De
estas, solo escogieron 8 secuencias, las cuales una vez introducidas como vacuna de ADN en
ratones, generaron una respuesta de anticuerpos especfica del parsito y mostraron actividad
tripanoltica contra las formas tripomastigotes del parsito. Estos resultados validaron una vez
ms la aplicabilidad de la bioinformtica en el genoma, ya que genera la identificacin de
protenas asociadas a la membrana de T. cruzi que son potenciales candidatos vacunales.
Adems del uso de la Vacunologa Inversa para la identificacin de candidatos

vacunales contra patgenos que afectan humanos, ha sido de especial inters el uso de esta
aproximacin para el desarrollo de vacunas para animales. Tal es el caso de Theileria parva,
40
protozoario hemoparsito transmitido por garrapatas, causante de una enfermedad fatal que
afecta al ganado vacuno, denominada la fiebre de la costa oriental. Uno de los mtodos de
inmunizacin que ha sido empleado contra este protozoario es el denominado infeccin y
tratamiento, donde se simula la infeccin con el parsito en el estadio de esporozoito
infectivo proveniente de garrapatas infectadas y a la vez, se trata al animal con el antibitico
tetraciclina (Radley y col., 1975). A pesar de que esta forma de inmunizacin ha sido utilizada
exitosamente durante ms de dos dcadas, ya que genera inmunidad protectiva mediada por el
MHC de clase I, restringida a los linfocitos T CD8+ citotxicos (LTC), la elaboracin y
distribucin de esta vacuna viva ha resultado dificultosa.
Basndose en la secuencia del genoma de Theileria parva, reportada por Gardner y

colaboradores (2005); Graham y colaboradores (2007) se propusieron desarrollar una vacuna
de ms fcil obtencin y acceso mediante Vacunologa Inversa. Mediante el uso de los
programas GlimmerM y Phat, identificaron en el genoma de este organismo secuencias que
pudieran corresponder a genes. Adems, empleando programas tales como BLAST y SignalP,
identificaron cuales podran codificar para protenas de membranas o secretadas. De 55
candidatos, lograron clonar y expresar 36 mediante transfeccin transitoria en una lnea celular
de fibroblastos de piel de bovino. Evaluaron in vitro los productos de la expresin empleando
LTC especficos de T. parva, lo que permiti la identificacin de un antgeno (Tp2) con
mltiples eptopes, que adems result ser protectivo. Este antgeno es un atractivo candidato
vacunal el cual est siendo actualmente evaluado para su uso en un futuro cercano como
vacuna potencial.
La disponibilidad de las secuencias de genomas completos de muchos patgenos junto

con el uso de las herramientas bioinformticas, ha revolucionado el desarrollo de nuevas
vacunas. As mismo, la Vacunologa Inversa ha permitido acortar el tiempo para la
identificacin de candidatos vacunales y en un corto plazo se tendr una nueva generacin de
vacunas basadas en las predicciones por los anlisis in silico de aquellos patgenos donde la
vacunologa convencional no ha sido exitosa. Esto nos lleva a pensar que la aplicacin de este
enfoque en el genoma de A. marginale ayudara a encontrar diversos antgenos alternativos
para el desarrollo de nuevas y mejores vacunas contra este hemoparsito.
41
1.7. HIPTESIS
Si en la superficie del A. marginale se expresan otras protenas diferentes a las bien

conocidas MSPs, estas protenas pueden ser utilizadas como inmungenos vacunales en forma
recombinante para generar una respuesta inmune protectiva en el ganado vacuno, por lo cual
se pueden considerar futuros candidatos vacunales.
1.8. OBJETIVO GENERAL
Identificar nuevos inmungenos de A. marginale mediante el anlisis in silico de su

genoma para clonarlos, expresarlos y purificarlos, con la finalidad de evaluar su
inmunogenicidad como candidato vacunal.
1.9. OBJETIVOS ESPECFICOS
1.9.1. Identificar en el genoma de Anaplasma marginale genes con funciones desconocidas

que tengan dominios que pudieran indicar que codifican para protenas de superficie o
excretadas.
1.9.2. Seleccionar los genes que tengan mayor similitud con protenas de superficie o de
excrecin de otros patgenos relacionados, para demostrar su expresin en la rickettsia
A. marginale.
1.9.3. Amplificar tres de los genes expresados en A. marginale para clonarlos, expresarlos y
purificarlos en sistemas de expresin bacterianos.
1.9.4. Evaluar si las protenas recombinantes son reconocidas por sueros de bovinos
infectados experimentalmente.
1.9.5. Inmunizar ratones o conejos con las protenas recombinantes, y de obtenerse
anticuerpos, verificar la presencia de dichas protenas en la rickettsia.
42
CAPITULO II
MARCO METODOLGICO
2.1. Plan de Trabajo
En la bsqueda de candidatos vacunales potenciales contra A. marginale se procedi
segn el plan de trabajo indicado en la Figura 2.1. En primer lugar, se realiz el anlisis del
genoma de este microorganismo que se encuentra en la base de datos pblica GenBank (N de
Acceso: CP000030) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para seleccionar los genes candidatos para
el estudio, tomando en cuenta en primer lugar, la mxima similitud de la protena putativa con
otra protena de superficie o de excrecin conocida en otros microorganismos y en segundo
lugar, la presencia del pptido seal y de hlices transmembranas. Luego se procedi al diseo
de cebadores para la amplificacin de los ORF de estos genes mediante la tcnica de la
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, del ingls, Polymerase Chain Reaction), con la
finalidad de clonarlos y secuenciarlos para expresar y purificar las protenas recombinantes.
Asimismo, se demostr si estas protenas se expresan en A. marginale mediante la tcnica de
la reaccin en cadena de la polimerasa por transcripcin reversa (RT-PCR, del ingls Reverse
Transcription-Polimerase Chain Reaction) y una vez detectada su expresin, se procedi a
realizar los ensayos de Inmunotincin con la protena recombinante purificada para evaluar su
reconocimiento por el suero inmune de bovinos. Paralelamente, se procedi a inmunizar
ratones con cada una de estas protenas recombinantes para producir anticuerpos contra ellas y
utilizarlos para verificar su ubicacin en A. marginale mediante Inmunotincin, empleando
como antgenos la protena recombinante, la membrana externa y el extracto total de la
rickettsia.
43
Brayton y col., 2005
Seleccin y Anlisis de la secuencias

(Marcos de lectura abiertos, ORFs)
Funcin conocida
Funcin desconocida
N de Acceso Gen Bank:

CP000030
Pptido seal
(SignalP 3.0)
Hlices Transmembranas
(TMpred)
Deteccin de la expresin
de genes en la rickettsia
(RT-PCR)
Diseo de cebadores
Sueros de bovinos infectados

experimentalmente con A. marginale.
Determinar la antigenicidad
de las protenas nativas de
inters
Identificar Protenas de
superficie o excretadas
(BLAST)
Amplificacin ORF
(PCR)
Protena
recombinante
Produccin Ac
policlonales contra Pr
en ratones o conejos
Deteccin de las protenas recombinantes
en la superficie de A. marginale
Figura 2.1. Plan de trabajo
Clonar
Secuenciar
Expresar
Purificar
Cuerpos iniciales y
Membrana externa de
A. marginale
44
2.2. Metodologa
2.2.1. Seleccin de genes candidatos vacunales de A. marginale.
Los ORF fueron clasificados por homologa de secuencias empleando el programa
BLAST, de acuerdo a una base de datos de protenas de funciones conocidas (BLASTP), la
cual est disponible en la pgina web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Para la deteccin del
pptido seal se emple el programa SignalP versin 3.0, disponible en la pgina web
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/, el cual fue creado por Bendtsen y colaboradores
(2004). Las hlices transmembrana fueron identificadas por el programa TMpred, creado por
Hofman y Stoffel (1993) (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html).
2.2.2. Aislamiento del ADN genmico del A. marginale.
El ADN genmico del microorganismo fue aislado a partir de una muestra de sangre de
bovino infectada con A. marginale, empleando los reactivos de Wizard Genomic DNA
extraction kit (Promega, USA); el cual es diseado para el aislamiento de ADN de los
leucocitos (clulas blancas de la sangre), clulas de cultivo de tejidos, tejido animal, tejido
vegetal, levaduras, bacterias Gram positivas y Gram negativas. Este proceso de aislamiento
est basado en cuatro pasos: El primero es la lisis de los eritrocitos en la solucin de lsis
celular. El segundo es la lisis de los leucocitos y sus ncleos con la solucin de lisis nuclear.
Un paso opcional es la digestin con la enzima RNasa, el cual se puede incluir en el segundo
paso. El tercero es la remocin de las protenas celulares por precipitacin con sales, el cual
precipita las protenas pero permite que el ADN genmico de alto peso molecular est en
solucin. Finalmente, el cuarto paso es la concentracin y desalinizacin del ADN genmico
por precipitacin con isopropanol, quedando el ADN purificado ptimo para una variedad de
aplicaciones como la amplificacin, digestin con endonucleasas de restriccin e
hibridizaciones en membranas. La cantidad y calidad de la solucin de ADN extrado se
determin por electroforesis en gel de agarosa y espectrofotomtricamente.
45
2.2.3. Aislamiento del ADN plasmdico.
Los plsmidos que se emplearon en este estudio fueron los vectores de expresin
pMal-p4x (New England BioLabs, USA) (Figura 2.2) y pThioHis A (Invitrogen, USA)
(Figura 2.3). Estos vectores fueron aislados de la bacteria E. coli, cepa TOP 10 (F-mcrA
(mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 araD139 (ara-leu) 7697 galU galK
rpsL endA1 nupG), empleando el estuche QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAgen, USA) y una
Microcentrifuga (Eppendorf, USA).
Figura 2.2. Vectores pMal-4. pMal-c4X (6646 pares de base) tiene una delecin exacta en la secuencia seal del
gen malE. pMal-p4X (6721 pares de base) incluye la secuencia seal. Las flechas indican la direccin de la
transcripcin. Se indican los sitios nicos de restriccin utilizables para la clonacin (New England BioLabs, USA).
46
Figura 2.3. Vector de expresin pThioHis para la expresin de

protenas. Incluye una protena de fusin HP-Tiorredoxina en el Nterminal de la protena de inters. (Invitrogen, USA)
Este sistema consta de unas columnas que contienen una membrana de slica que une
hasta 20 g ADN en presencia de altas concentraciones de sal y permite la elucin en un
volumen pequeo de solucin tampn baja en sal. Este sistema elimina la extraccin con
fenol-cloroformo y la precipitacin con alcohol, tambin los inconvenientes asociados con la
prdida de resina. El ADN plasmdico de alta pureza es eludo de las columnas y listo para
usar, no hay necesidad de precipitar, concentrar o desalinizar. La purificacin del ADN
plasmdico por estas columnas, sigue un simple procedimiento de unin, lavado y elucin.
Primero el cultivo bacteriano es lisado y este lisado es aclarado por centrifugacin. El lisado
aclarado es luego colocado en la columna con la membrana de slica. Las impurezas son
eliminadas mediante lavados y el ADN puro es eludo en un volumen pequeo de tampn de
elucin o de agua. Este ADN plasmdico purificado es adecuado para el uso de PCR, digestin
con enzimas de restriccin, ligacin, transformacin y secuenciacin. Este protocolo se inici
con 5 ml de un cultivo bacteriano de 24 horas de E. coli cepa TOP 10, transformada por cada
vector, en caldo Luria-Bertani (LB) estril (10 g de triptosa, 5 g de extracto de levadura, 5 g de
cloruro de sodio para un litro de agua destilada) con Ampicilina a una concentracin final de
100 g/ml. Finalmente, se determin la concentracin del ADN aislado.
47
2.2.4. Aislamiento del ARN de A. marginale.
El ARN total fue extrado de eritrocitos del bovino infectado con A. marginale (aislado
Zulia 1999). La sangre fresca de bovino infectada fue centrifugada a 2.500 x g a temperatura
ambiente, durante 15 minutos. Posteriormente se extrajo el plasma y la capa blanca, dejando el
sedimento de glbulos rojos en el cual se encuentran los cuerpos iniciales de A. marginale.
Luego, este sedimento de clulas rojas se lav tres veces con PBS a pH 7,2. A continuacin, se
le agreg el reactivo TRIzol (Invitrogen, USA) en una relacin 1:3, es decir, por cada mililitro
de sedimento de eritrocitos se agregaron 3 ml del reactivo TRIzol. Los eritrocitos fueron
lizados mecnicamente pasando aproximadamente 10 veces la suspensin por una inyectadora
con aguja N 21 x 1/2. Se dej reposar por 10 minutos a temperatura ambiente y se le agreg
200 l de cloroformo, se agit fuertemente por inversin y se dej reposando por 5 minutos en
hielo para luego centrifugar a 14.000 x g durante 15 minutos en la cual se obtuvieron dos
fases, una acuosa (superior) y otra orgnica (inferior). Se extrajo la fase acuosa sin tocar la
fase orgnica y se transfiri a un tubo nuevo y estril, al que se le agreg igual volumen de
isopropanol. Luego se mezcl por inversin para dejar reposar por 15 minutos en hielo. Se
centrifug a 14.000 x g durante 15 minutos y se descart el sobrenadante. Posteriormente, se
le agreg 300 l etanol fro al 75 % y se centrifug a 7.500 x g durante 5 minutos a 4 C.
Seguidamente se descart el sobrenadante y se dej secar el sedimento para luego
resuspenderlo inmediatamente en 40 l de agua libre de RNasas. Luego se le agreg RQ1
DNasa libre de RNasa (Promega, USA) segn protocolo de la casa comercial para degradar el
ADN contaminante, dejndola actuar por 30 minutos a 37 C e inactivndola a 65 C por 10
minutos. Por ltimo, se almacen la muestra a 20 C.
2.2.5. Reaccin en cadena de la polimerasa.
Los ORF de los genes seleccionados fueron amplificados a partir del ADN genmico
de A. marginale mediante la tcnica de PCR, utilizando un termociclador PTC-200 (MJ
Research, USA). Para ello se disearon los cebadores con un programa online que ofrece la
casa comercial Invitrogen (USA) (http://tools.invitrogen.com/content.cfm?pageid=9716).
48
Estos cebadores se disearon tomando en cuenta la primera base del ORF del gen de inters
hasta la ltima base del mismo, obtenindose los siguientes cebadores:
ORF AM 202 para el vector pMal-p4x

Sentido: 5-ACTGAATTCATGAGGTGCAGGGCCTTGCTA-3 (EcoR I)
50% GC
Tm: 70 C
Antisentido: 5-ACTCTGCAGTTAGCGACGCAACTTGCTGTGT-3 (Pst I)

51.6% GC
Tm: 70.3 C
ORF AM 573 para el vector pMal-p4x

Sentido: 5-ACTGAATTCTTGGGGATAATGTACGCTACAAC-3 (EcoR I)
40.6% GC
Tm: 64 C
Antisentido: 5-ACTCTGCAGCTATTTCAACATGCCTACTTCTCTG-3 (Pst I)

45.2% GC
Tm: 64.6 C
ORF AM 244 para el vector pThioHis A

Sentido: 5-ACTGGTACCGCGGATTTTCTTCTTTGCTT-3 (Kpn I)
44.8% GC
Tm: 66.9 C
Antisentido: 5-ACTCTGCAGCTACTCGCGTAGTACAGGCGAC-3 (Pst I)

58.1% GC
Tm: 69.2 C
Adicionalmente, se les aadi un sitio de restriccin al extremo 5 terminal de cada

cebador (letras en negritas) para orientar correctamente la secuencia de la protena (inserto) en
el sitio de clonamiento mltiple (MCS, del ingls Multi Cloning Site) de los vectores de
expresin. La amplificacin por PCR fue realizada empleando la Taq Platinum (5U/l)
(Invitrogen, USA) con 100 ng de ADN de A. marginale, en una mezcla de reaccin de 25 l.
Todas estas reacciones de PCR tenan una concentracin final de (Tabla 2.1 y 2.2):
49
Tabla 2.1. Mezcla de reaccin AM202

y AM244
Tabla 2.2. Mezcla de reaccin para

AM573
Componentes
Cf
Componentes
Cf
Tampn
1X
Tampn
1X
dNTPs
0.2 mM
dNTPs
0.4 mM
MgCl2
1.5 mM
MgCl2
4 mM
Taq
0.02 U/ul
Taq
0.04 U/ul
Cebador S
0.2 mol
Cebador S
0.4 mol
Cebador A
0.2 mol
Cebador A
0.4 mol
Cf: Concentracin Final

dNTPs: Desoxirribonucletido trifosfato
MgCl2: Cloruro de Magnesio
Cebador S: Cebador Sentido
Cebador A: Cebador Antisentido
Cf: Concentracin Final

dNTPs: Desoxirribonucletido trifosfato
MgCl2: Cloruro de Magnesio
Cebador S: Cebador Sentido
Cebador A: Cebador Antisentido
La amplificacin se realiz en las siguientes condiciones: una etapa de

desnaturalizacin a 95 C por 5 minutos y luego 35 ciclos de desnaturalizacin a 94 C por 1
minuto, alineamiento de los cebadores a 57 C (AM202 y AM244) / 53 C (AM573) para cada
par a utilizar, por un lapso de 1 minuto, extensin de los cebadores a 72 C por 2 minuto, para
luego terminar con un ciclo de extensin a 72 C por 10 minutos (Lew y col., 2002;
modificado). Los productos fueron verificados por electroforesis en geles de agarosa al 0,8 %.
2.2.6. Reaccin en Cadena de la Polimerasa por Transcripcin Reversa.
Se realiz la Transcripcin Reversa (RT, del ingls Reverse Transcription) empleando

el protocolo (modificado) provisto por la enzima Transcriptasa Reversa M-MLV (M-MLV
RT; Promega, USA). En resumen, para la RT se usaron 2 g de ARN total tratado con RQ1
DNasa libre de RNasa. En un tubo de microcentrfuga, estril y libre de RNasas, se agregaron
0,5 g de una mezcla de cebadores al azar (random primers) (0,5 g/l; Promega, USA) en un
volumen final de 10 l en agua estril libre de RNasa. Se calent el tubo a 70 C por 5 minutos
para disolver las estructuras secundarias dentro del templado. Luego se agreg el buffer de
reaccin (1x), 0,5 mM de desoxinucletidos trifosfato (dNTPs, 10 mM), 8 U/l de la enzima
50
M-MLV RT (200 U/l), para un volumen final de 25 l. Luego fue mezclado suavemente y se
incub por 60 minutos a 37 C.
Una vez obtenido el ADNc por RT, se procedi a verificar si este ADNc estaba libre de
ADN genmico contaminante. Para ello se realiz la RT-PCR del gen completo de la msp1a,
empleando como cebadores: Sentido (Forward): 5- GTGCTTATGGCAGACATTTC-3, el
cual fue derivado de la secuencia ro arriba del sitio del inicio de la transcripcin (-110 hasta la
-91) y el cebador Antisentido (Reverse): 5- GACTCTATCAAAGACCGGAAACTC-3, que
representa la secuencia complementaria de las ltimas bases contenidas en el ORF. Estos
cebadores fueron publicados por Allred y colaboradores (1990) para la amplificacin de este
gen y fueron empleados como controles para verificar que la RT no tuviera ADN
contaminante, ya que estos hibridan en una regin no transcrita del gen. Adems, se amplific
el
ORF
de
la
msp1a
con
los
siguientes
cebadores:
Sentido
(Forward):
5-
ATTTCCATATACTGTGCAG-3, ubicado en la posicin -95 hasta la -70 relativo al sitio de

inicio
de
la
transcripcin
el
cebador
Antisentido
(Reverse):
5-
CTTGGAGCGCATCTCTCTTGCC-3, ubicado en la posicin 1881 hasta la 1862. Estos

ltimos cebadores tambin fueron publicados por los autores antes mencionados y se
utilizaron como un control positivo de la expresin. Esta numeracin fue basada en la
secuencia de la msp1a de la cepa Florida (Allred y col., 1990); nmero de acceso en el
GenBank M32871, M32872. Para la amplificacin de los ORF de los genes de inters por RTPCR, se emplearon las mismas condiciones de la PCR nombrada anteriormente.
2.2.7. Clonacin de los genes seleccionados de A. marginale.
Una vez que estos ORF fueron amplificados del ADN genmico de A. marginale;
mediante PCR utilizando un termociclador PTC-200 (MJ Research, USA), se purificaron los
amplicones empleando el kit ChargeSwitch PCR Clean-Up (Invitrogen, USA). Luego se
cuantific el ADN en un gel de agarosa al 0,8 %, teido con SYBR Safe y empleando el
programa de computacin llamado Quantity One (BioRad, USA). Posteriormente, los
amplicones fueron digeridos, al igual que los vectores de expresin pMal-p4x y pThioHisA,
con las respectivas enzimas de restriccin EcoR I - Pst I para pMal-p4x y Kpn I - Pst I para
51
pThioHisA (Promega, USA). Finalizada la digestin, tanto el producto de PCR como el
vector, fueron purificados empleando el kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega, USA), segn protocolo adjunto. Luego, ambos amplicones fueron ligados a los
vectores digeridos utilizando 3 U/l de T4 ADN ligasa (Promega, USA) (Figura 2.4).
Aislamiento del ADN de A. margianle
Aislamiento del ADN plasmdico de
E. coli TOP 10
(pMal-p4x y pThioHis A)
Digestin de los vectores con enzimas

de restriccin
Amplificacin de los genes

seleccionados de A. marginale por PCR
Digestin del amplicn con

enzimas de restriccin
Purificacin en gel
Ligacin
Transformacin de las diferentes cepas de

E. coli
Cultivo de los clones en agar LB con Ampicilina
Mapa de restriccin y secuenciacin de las

colonias crecidas
Figura 2.4. Esquema del proceso de clonacin de los genes de inters.
52
2.2.8. Transformacin de las Escherichia coli.
Una vez ligado los insertos con los vectores pMal-p4x y pThioHisA, se procedi a la
transformacin de las cepas de E. coli K12 TB1 (F ara (lac-proAB) [80dlac (lacZ)M15]
rpsL(StrR) thi hsdR), K12 ER2508 (F- ara-14 leuB6 fhuA2 (argF-lac)U169 lacY1
lon::miniTn10(TetR) glnV44 galK2 rpsL20(StrR) xyl-5 mtl-5 (malB) zjc::Tn5(KanR) (mcrCmrr)HB101) (New England BioLabs, USA) y BL21 Rosetta (F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal
[malB+]K-12(S)) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania; 2013), con los plsmidos
recombinantes AM202-pMal-p4x y AM573-pMal-p4x. Las bacterias E. coli BL21 Rosetta
tambin fueron transformadas con el plsmidos recombinante AM244-pThioHis A, al igual
que las TOP10. Estas cepas fueron escogidas para ser transformadas por las siguientes
razones: las E. coli K12 TB1 por ser la cepa hospedera original para el vector pMal-p4x. La
cepa E. coli K12 ER2508, se le ha eliminado el gen malE, el cual codifica para la MBP
endgena, junto con el gen malB, por lo que no van a producir MBP a partir de su cromosoma,
y adems, tienen una alta eficiencia de transformacin. Las E. coli K12 ER2508 carecen de
lon proteasas, lo que hace mucho ms estable la expresin de cualquier protena exgena.
Adicionalmente, son diez veces ms eficientes en la transformacin que las K12 TB1 (New
England BioLabs, USA). Las E. coli BL21 Rosetta son diseadas para mejorar la expresin de
protenas eucariotas que contienen codones raramente utilizados en E. coli. Estas cepas
suministra los ARNt para 7 codones (AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC, y CGG) en un
plsmido resistente al cloramfenicol. Los genes de ARNt son impulsados por sus promotores
nativos (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania; 2013).
Para la transformacin de cada una de las diferentes cepas de E. coli utilizadas, se

colocaron 200 l de cada cepa con 1 l del ADN del plsmido con el gen de inters. Se dej
en hielo por 30 minutos y se le dio un shock trmico a 42 C por 2 minutos. Se le aadi 1 ml
de medio SOC sin antibitico y se incub a 37 C por 1 hora. Luego se sembraron 100 l de
cada transformacin en una placa de agar LB con con su respectivo antibitico de seleccin y
se dej incubando a 37 C por 24 horas.
53
Las colonias transformantes se les aisl el plsmido empleando el estuche QIAprep
Spin Miniprep Kit (QIAgen, USA) y una Microcentrifuga (Eppendorf, USA) para ser
analizado mediante un mapeo de restriccin, utilizando enzimas que cortan dentro del inserto:
AM202-pMal-p4x y AM573-pMal-p4x con Pvu II (Promega, USA), y AM244-pThioHisA
con EcoR I (Promega, USA). Esta digestin se realiz como lo indica la casa comercial y
visualizando posteriormente el producto de la digestin en geles de agarosa al 0,8 % teidos
con SYBR Safe (Invitrogen, USA).
2.2.9. Electroforesis en geles de agarosa.
Con el fin de verificar la integridad del ADN genmico, ADN plasmdico, ARN total,
los amplicones de las PCR y RT-PCR realizadas, adems de los productos de digestin con las
enzimas de restriccin, se realizaron electroforesis en geles de agarosa con distintas
concentraciones, segn sea el caso. Para los ADN genmico y plasmdico, la concentracin de
agarosa fue del 0,8 %, para el ARN total fue del 1 % y para los productos de la PCR, RT-PCR
y digestiones se utiliz al 2 %.
La cmara de electroforesis se emple segn las especificaciones del fabricante

(BioRad, USA). El gel de agarosa fue preparado de la siguiente forma: se realiz una solucin
de agarosa al 0,8 %, 1 % o 2 % p/v, segn sea el caso, en una fiola, disolvindola en solucin
TAE 1x pH 8 (0,8 g; 1 g o 2 g de agarosa en 100 ml de buffer). La solucin TAE 1x se obtiene
de una solucin madre de TAE 50x, que se prepar con 2 M de Tris acetato y 0,05 M de
EDTA. Para disolver esta solucin de agarosa en la solucin TAE 1x se calent en un horno
de microondas para fundirla. Al estar la solucin fundida se verti en el molde con el peine
colocado, eliminando toda burbuja presente, y se esper hasta que el gel solidifique
completamente antes de ser usado. Luego se retir el peine, se coloc el gel en la cmara de
electroforsis y se le agreg suficiente cantidad de TAE 1x para cubrir todo el gel.
Las muestras de ADN se colocaron en un tubo de microcentrifuga con solucin de

carga (azul bromofenol 0,1 %, glicerol 15 %), mezclndolos. Se corri a voltaje constante (70
V) hasta que el azul de bromofenol migrara hasta las tres cuartas partes del gel
54
(aproximadamente 30 minutos). Luego, se ti el gel con SYBR Safe (Invitrogen, USA)
diludo 1/10.000 en solucin TAE 1x, se visualiz colocndolo sobre un transiluminador de
luz azul (filtro de emisin a 470 nm) (SafeImagerTM Blue-Light Transilluminator, Invitrogen,
USA) y se le tom una fotografa al gel (cmara digital Kokak DC-240 y software Kodak
Digital Science 1D, version 2.0.1, Kodak, USA) para analizar y discutir los resultados.
2.2.10. Cuantificacin espectrofotomtrica de cidos nucleicos.
Una vez extrados el ADN o el ARN se verifica su pureza mediante espectrofotometra,

empleando el espectrofotmetro SmartSpecTM 3000 (BioRad, USA). La concentracin de
cidos nucleicos suele determinarse midiendo la absorbancia a 260 nm y comparando con un
blanco. La absorbanca a 260 nm igual a 1 corresponde aproximadamente a 50 g/ml de ADN
bicatenario, y 40 g/ml de ARN. La interferencia de contaminantes puede determinarse
calculando un cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el cociente
A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes respectivos del
ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0 respectivamente. Valores menores
indican contaminacin de la muestra con protenas y valores mayores contaminacin con fenol
(Rada y Taboada, 1998).
2.2.11. Anlisis de secuencias.
Para comprobar que el ORF clonado corresponde al ORF del gen de inters, este fue
secuenciado a partir del plsmido recombinante empleando los cebadores para secuenciacin
que ofrece la casa comercial de cada vector: para el plsmido recombinante en pMal-p4x se
utiliz el cebador Sentido M13/pUC (5-GTAAAACGACGGCCAG-3), el cual secuencia a
partir
del
terminal
del
inserto,
el
cebador
Sentido
pMal-p4x
(5-
GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC-3) que secuencia a partir del extremo 5 terminal

del
inserto.
Para
el
pThioHisA
se
utiliz
el
cebador
Sentido
Trx
(5-
TTCCTCGACGCTAACCTG-3) y el Antisentido Trx (5-TGTAAAACGACGGCCAGTGC3), todos recomendados por las casas comerciales. Estos plsmidos fueron secuenciados en la
Fundacin Instituto de Estudios Avanzados (IDEA) utilizando un Secuenciador Automtico de
55
4 capilares modelo 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA), utilizando el kit
BigDye v3.1 (Applied Biosystems, USA). Luego se aline la secuencia de nucletidos y de
aminocidos de la cepa Zulia (en estudio) de cada uno de los genes de inters con las
secuencias de A. marginale cepa St. Maries (n de acceso del genoma: gb|CP000030.1|),
Florida (n de acceso del genoma: gb|CP001079.1|) y la cepa Israel de A. marginale
subespecie centrale (n de acceso del genoma: gb|CP001759.1|), todas disponibles en la base
de
datos
pblica
del
GenBank;
empleando
el
programa
Clustal
W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/clustalw2/) y se realiz el anlisis del uso frecuente de

codones por E. coli para la expresin de las protenas AM202, AM244 y AM573,
mediante
el
programa
E.
coli
Codon
Usage
Analyzer
2.1
(http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm).
2.2.12. Produccin de protenas recombinantes de A. marginale en la bacteria E. coli.
Las protenas recombinantes fueron producidas en E. coli cepas K12 TB1, K12
ER2508 y BL21 Rosetta, para el vector de expresin pMal-p4x, y la cepa TOP10 y BL21
Rosetta con el vector de expresin pThioHisA de acuerdo a las instrucciones de las casas
comerciales.
Para la produccin de las protenas recombinantes es necesario conocer si estas son

citoplasmticas (se encontraran en el sobrenadante del lisado bacteriano), de membrana (se
iran al sedimento despus de centrifugar el lisado bacteriano) o estaran dirigidas al
periplasma bacteriano (en el caso del vector pMal-p4x), para determinar en qu condiciones se
va a realizar la purificacin de las mismas. El anlisis de la expresin de las protenas
recombinantes fue realizado sobre geles de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y teidos
con Azul de Coomassie. Una vez expresadas, las protenas recombinantes fueron purificadas
por cromatografa de afinidad con sus respectivas resinas, segn las recomendaciones de las
casas comerciales. La concentracin de protenas fue determinada por el mtodo de Bradford
(1976).
56
2.2.12.1. Determinacin de la solubilidad de las protenas AM202 y AM573 en el vector
de expresin pMal-p4x.
Se determin su solubilidad siguiendo el protocolo provisto por la casa comercial New
England BioLabs (USA) de la siguiente manera: se tom una colonia de la bacteria E. coli
cepa K12 TB1, K12 ER2508 o BL21 Rosetta, que contuviera el plsmido recombinante, y se
inocul en 5 ml de medio de cultivo LB-Glucosa (10 g Triptona, 5 g Extracto de levadura, 5 g
Cloruro de Sodio y 2 g Glucosa) el cual contena 100 g/ml de Ampicilina, incubndose a 37
C toda la noche. Posteriormente, se inocularon 80 ml del medio precalentado con antibitico
con 0,8 ml del cultivo anterior con agitacin vigorosa, hasta que alcanz una DO600 de 0,5.
Luego se tom 1 ml de la muestra antes de la induccin (control no inducido) y el
sedimento de clulas fue resuspendido en 50 l de buffer muestra SDS-PAGE 2X, que se
congel a 20 C hasta que se analiz por SDS-PAGE. A continuacin, se procedi a la
induccin de la expresin agregando isopropil--D-tiogalactopiranoside (IPTG; Sigma, USA)
a una concentracin final de 0,3 mM y se incub el cultivo por 24 horas adicionales para
recolectar 0,5 ml de la muestra (control inducido) por cada hora durante 3 horas y otra despus
de las 24 horas, para escoger cual es el mejor tiempo de induccin. Este proceso de expresin
se realiz a 37 C y a 16 C para estandarizar la temperatura de induccin. Posteriormente, se
dividi el resto del cultivo en dos alcuotas para realizar dos protocolos: el protocolo A, el cual
nos indica si est en el sobrenadante (soluble) o el sedimento (insoluble) y el protocolo B que
nos indica si est en el periplasma de la bacteria E. coli.
Protocolo A: Se agruparon las bacterias por centrifugacin a 4000 x g por 10 minutos,

se descart el sobrenadante y se resuspendi el sedimento con 5 ml de solucin tampn de
columna (20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA). Las clulas fueron congeladas por
24 horas a -20 C y luego descongeladas en un bao de agua a 37C. Posteriormente, la
muestra fue sonicada durante 2 minutos con pulsos cortos de 10 segundos, manteniendo el
lisado en hielo todo el tiempo, utilizando el sonicador de punta Ultrasonic Processor, modelo
CP750 (Cole Parmer, Venezuela). Luego se centrifug el lisado a 9.000 x g por 20 minutos a 4
C y se tom el sobrenadante (extracto crudo, protena soluble) el cual se guard en hielo. A
continuacin, se resuspendi el sedimento en 5 ml de solucin tampn de columna, siendo
57
esta la suspensin de la materia insoluble (protena insoluble). Posteriormente, se agreg 5 l
de solucin muestra SDS-PAGE 2X (0,09 M Tris-HCl a pH 6,8; 20 % glicerol; 2 % SDS;
0,02 % azul de bromofenol; 0,1 M DTT) a 5 l de extracto crudo y material insoluble. Por otro
lado, se colocaron 200 l de la resina Amilosa (New England BioLabs, USA) en un tubo de
microcentrifuga y se centrifug brevemente. Se removi el sobrenadante por aspiracin y se
aadi 1,5 ml de solucin tampn de columna a la resina para ser resuspendida, se volvi a
centrifugar brevemente y se descart el sobrenadante por aspiracin, este paso se repiti dos
veces para asegurar que la resina est libre de etanol. Posteriormente, se resuspendi la resina
en 200 l de solucin tampn de columna y se tom de esta mezcla 50 l a la cual se le
aadi 50 l del extracto crudo. Se incub en hielo por 15 minutos y se centrifug por 1
minuto, se removi el sobrenadante y se descart. Se lav el sedimento con 1 ml de solucin
tampn de columna, se centrifug por 1 minuto, se descart el sobrenadante y se
resuspendi la resina en 50 l de solucin muestra SDS-PAGE 2X, correspondiendo esta
muestra a la protena unida a la amilosa.
Protocolo B: Se agruparon las bacterias por centrifugacin a 4000 xg por 10 minutos,

se descart el sobrenadante y se resuspendi el sedimento en 10 ml de solucin Tris/Sucrosa
(30 mM de Tris-HCl, 20% de sucrosa, pH 8). Posteriormente, se aadi 5 l de 0,5 M EDTA
(concentracin final: 1 mM) y se incub a temperatura ambiente por 5 minutos con agitacin.
Luego se centrifug a 8.000 x g por 10 minutos a 4 C, se removi el sobrenadante y se
resuspendi el sedimento en 10 ml de 5 mM MgSO4 fro, para agitarse luego en un bao de
agua con hielo por 10 minutos. Despus se centrifug como se describi anteriormente y el
sobrenadante corresponda al fludo del shock osmtico donde se encuentran las protenas
periplasmticas. Posteriormente, se agreg 10 l de solucin muestra SDS-PAGE 2X a 10
l del fludo del shock osmtico.
Todas las muestras se colocaron en un bao de agua hirviendo por 5 minutos, se

centrifugaron 1 minuto a 15.000 x g y se cargaron 20 l de las muestras de clulas no
inducidas, inducidas y del sobrenadante de la resina amilosa (sin mover el sedimento), en un
gel de SDS-PAGE al 10%. Se hicieron dos geles para utilizar el otro en una Inmunotincin
58
con el anticuerpo anti-MBP2 (New England BioLabs, USA), el cual fue revelado por
quimioluminiscencia con el sustrato para peroxidada denominado West Pico (Pierce, USA).
2.2.12.2. Determinacin de la solubilidad de la protena AM244 en el vector de expresin

pThioHisA.
Se determin su solubilidad siguiendo el protocolo provisto por la casa comercial
Invitrogen con algunas modificaciones (Invitrogen, USA). Se tom una colonia de la bacteria
E. coli cepa TOP10 que tuviera el plsmido recombinante y se inocul en 1 ml de medio de
cultivo LB el cual contena 100 g/ml de Ampicilina, incubndose a 37 C toda la noche.
Posteriormente, se inocularon 10 ml del medio LB precalentado con antibitico con 0,5 ml del
cultivo anterior con agitacin vigorosa, hasta que alcanz una DO550nm de 0,5.
Posteriormente, se tom 1 ml de la muestra antes de la induccin (control no inducido)
y el sedimento de clulas fue almacenado a -20 C hasta que se analiz por SDS-PAGE. A
continuacin, se procedi a la induccin de la expresin agregando IPTG (Sigma, USA) a una
concentracin final de 1 mM y se incub el cultivo por 24 horas adicionales para recolectar
0,5 ml de la muestra (control inducido) por cada hora durante 4 horas y otra despus de las 24
horas, y as escoger cual es el mejor tiempo de induccin. Los sedimentos de clulas se
conservaron a -20 C hasta que se analiz por SDS-PAGE. Las muestras fueron descongeladas
y resuspendidas en 500 l de solucin de Lisis (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2.5 mM EDTA, 5
mM imidazole) a 4C. Se sonic cada muestra por dos minutos, con pulsos cortos de 10
segundos, se congel el lisado en hielo seco y se descongel en bao de Mara a 37 C. Este
ciclo de sonicar-congelar-descongelar se repiti 3 veces. En la ltima descongelacin, los
tubos fueron centrifugados a mxima velocidad por 5 minutos a 4 C y se almacen el
sobrenadante (porcin soluble) a -20 C. El sedimento (porcin insoluble) fue resuspendido en
la solucin de lisis y fue almacenado a -20 C. De cada muestra se tom 10 l para ser
mezcladas con 10 l de solucin de muestra SDS-PAGE 2X. Las muestras se hirvieron por
5 minutos y se cargaron en un gel de SDS-PAGE. Se realizaron dos geles para realizar la
tincin con Azul de Coomasie y una Inmunotincin con el anticuerpo anti-HP-Tiorredoxina
(Sigma, USA), la cual es la protena del vector que se fusiona a la protena de inters para
59
facilitar su deteccin y purificacin. La HP Tiorredoxina tiene un peso molecular aproximado
de 12.8 kDa.
2.2.13. Purificacin de las protenas recombinantes.
Para la purificacin de las protenas AM202 y AM573, expresadas en el vector pMalp4x, se procedi a inocular un litro de medio LB con glucosa y ampicilina (100 g/ml) con 10
ml de un cultivo de E. coli con el plsmido recombinante, previamente incubado a 37 C por
18 horas en agitacin. El litro de LB-Glucosa ya inoculado, se incub a 37 C, en agitacin,
hasta que las bacterias alcanzaron una DO600nm~0,5. Posteriormente, se les aadi IPTG a una
concentracin final de 0,3 mM y se incub a 16 C por 18 horas en agitacin. Luego, las
bacterias fueron cosechadas por centrifugacin a 4000 x g por 20 minutos y se descart el
sobrenadante. Las clulas se resuspendieron en 50 ml de solucin tampn de columna y se
congelaron a -20 C durante toda la noche. Luego se descongelaron en un bao de Mara a 37
C y se colocaron en hielo para ser sonicadas por 10 minutos, con pulsos cortos de 15
segundos. A continuacin, se centrifug a 9000 x g por 30 minutos y se guard el
sobrenadante (extracto crudo), el cual se diluy 1:5 con solucin tampn de columna.
Paralelamente, se equilibraron 15 ml de la resina Amilosa (New England BioLabs, USA) con
8 volmenes de solucin tampn de columna y una vez equilibrada, se le aadi el extracto
crudo dejndose en agitacin suave durante toda la noche a 4 C. Luego se centrifug la resina
con el extracto crudo a 113 x g por 15 minutos y el sobrenadante se almacen a -20 C, el cual
contiene las protenas que no se unieron a la resina de Amilosa. A continuacin, se empac la
resina en una columna de 2.5 x 10 cm y se lav con 12 volmenes de solucin tampn de
columna para luego eluir la protena con 8 volmenes de solucin tampn de columna
conteniendo 10 mM de Maltosa. Se colectaron fracciones de 3 ml y cada una se corri en un
gel de SDS-PAGE, para luego unir todas las fracciones que contenan la protena de inters
(pool). Este pool fue colocado en una bolsa de dilisis con un punto de corte de 3500 Da
(Sigma, USA) para concentrarlo con polietilenglicol (PEG8000, Sigma, USA) y la
concentracin de protenas fue determina por el mtodo de Bradford (1976).
60
En el caso de la purificacin de la protena AM244 expresada en el vector de expresin
pThioHisA, se procedi a inocular un litro de medio LB con ampicilina (100 g/ml) con 10 ml
de un cultivo de E. coli con el plsmido recombinante, previamente incubado a 37 C por 18
horas en agitacin. El litro de LB ya inoculado, se incub a 37C en agitacin hasta que las
bacterias alcanzaron una DO550nm~0,5. Posteriormente, se les aadi IPTG a una
concentracin final de 1 mM y se incub a 16 C por 18 horas en agitacin. Luego, las
bacterias fueron cosechadas por centrifugacin a 3000 x g por 10 minutos y se descart el
sobrenadante. Las clulas se resuspendieron en 160 ml de solucin de unin (50 mM Buffer
fosfato y 2,5 M NaCl) y se congelaron a -20 C durante toda la noche. Luego se descongelaron
en un bao de Mara a 37 C y se colocaron en hielo para ser sonicadas por 10 minutos, con
pulsos cortos de 15 segundos. A continuacin, se centrifug a 3000 x g por 15 minutos y se
guard el sobrenadante (extracto crudo). Paralelamente, se equilibraron 15 ml de la resina
ProBondTM (Invitrogen, USA) con 8 volmenes de solucin de unin y una vez equilibrada, se
le aadi la porcin soluble, dejndose en agitacin suave durante toda la noche a 4 C. Luego
se centrifug la resina con el extracto crudo a 800 x g por 15 minutos y el sobrenadante se
almacen a -20 C, el cual contiene las protenas que no se unieron a la resina ProBondTM. A
continuacin, se empac la resina en una columna de 2,5 x 10 cm y se lav con 12 volmenes
del solucin de unin conteniendo 10 mM de Imidazol para luego eluir la protena con un
gradiente de Imidazol que va desde 10 mM a 500 mM en la solucin de unin. Se colectaron
fracciones de 3 ml cada una, se corrieron en un gel de SDS-PAGE y se juntaron todas las
fracciones que contenan la protena de inters (pool). Este pool fue colocado en una bolsa
de dilisis con un punto de corte de 3500 Da (Spectrum Medical Industries INC, USA) para
concentrarlo con polietilenglicol 8000 kDa (PEG8000, Sigma, USA) y la concentracin de
protenas fue determina por el mtodo de Bradford (1976).
2.2.14. Aislamiento de cuerpos iniciales de A. marginale.
Para el aislamiento de los cuerpos iniciales de A. marginale se sigui el protocolo

descrito por Noh y colaboradores (2008). Se tomaron 25 ml del criopreservado de A.
marginale, aislado Zulia 1999, con una parasitemia del 22 % (1,34 x 109 bacterias/ml, donado
por el Laboratorio de Bioqumica e Inmunologa de Hemoparsitos, USB). Se colocaron 6 ml
61
en cada Tubo Oakridge de 50 ml y se lavaron las muestras de 5 a 6 veces con PBS para
remover la hemoglobina y los reactivos del criopreservado por centrifugacin a 35000 x g por
20 minutos a 4 C. Los eritrocitos lavados en dos tubos Oakridge (el equivalente a 12 ml del
criopreservado) fueron combinados y el volumen se llev hasta 15 ml con PBS para luego
sonicarlos. La sonicacin (Ultrasonic Procesor CP 750; Cole Parmer, USA) fue hecha al 70 %
de potencia por 4 minutos totales en intervalos de 30 segundos de sonicacin y 30 segundos de
descanso. Las muestras se llevaron a un volumen final de 50 ml con PBS y fueron
centrifugadas a 35000 x g por 20 minutos a 4 C. El sedimento resultante fue colocado en un
tubo de microcentrifuga de 1,5 ml y se centrifug a 15800 x g por 15 minutos a 4 C. La parte
superior, rosado plido, que es una porcin floja del sedimento (membranas de eritrocitos) fue
descartado, mientras que el rosado oscuro, la porcin inferior del sedimento (A. marginale) fue
guardado y lavado 2 3 veces con PBS por centrifugacin a 15.800 x g por 20 minutos a 4 C.
Los cuerpos iniciales de A. marginale aislados fueron resuspendidos en 0.5 ml de PBS,
divididos en alcuotas de 100 l y almacenadas a -80 C.
2.2.15. Aislamiento y solubilizacin de la membrana de la rickettsia.
El material de la rickettsia fue sujeto a sonicacin, 2 ciclos de sonicacin por 2 minutos

para romper los cuerpos iniciales de A. marginale. Posteriormente, se agregaron las
endonucleasa (DNasa y RNasa) a una concentracin de 2 U/ml y se incub a 4 C por 30
minutos. El material de la rickettsia se centrifug a 100.000 x g por 1 hora a 4 C. El
sedimento de la membrana de A. marginale se recolect y se resuspendi en Solucin A (TrisHCl 0,025 M a pH 7.4 fro, conteniendo 0,25 M de sucrosa, 2 mM EDTA y 50 uM de
AEBSF) y posteriormente, se centrifug en las mismas condiciones anteriores. El sedimento
de membrana fue resuspendido en Solucin B (Tris-HCl 0,025 M a pH 7,4 conteniendo 2 mM
de EDTA y 50 M de AEBSF) a un volumen de 100 l. El material de membrana se combin
con 100 l de 4 % de CHAPS (Sigma, USA) en Solucin B y se incub a temperatura
ambiente, con oscilacin, por 2 horas. Despus de incubar el material, ste fue centrifugado en
un rotor Beckman 42.2 Ti a 100.000 x g por 1 hora a 4 C en una ultracentrfuga Beckman L855 (Beckman, USA) y posteriormente, se recolect el sobrenadante y se guard a -80 C para
62
posteriores ensayos. El sedimento fue resuspendido en 200 l de Solucin B e igualmente
almacenado a -80C (Riding y col., 2003).
2.2.16. Cuantificacin de protenas por el mtodo de Bradford.
Para la cuantificacin de protenas se emple el mtodo de Bradford. Se prepararon

una serie de muestras de protenas para realizar la curva estndar con Albmina de Suero de
Bovino (BSA; Sigma, USA), partiendo de una solucin madre de 1mg/ml. De esta solucin, se
prepar una solucin stock de 100 g/ml y de all se prepar el primer patrn, el cual tena una
concentracin de 25 g/ml. A partir de este patrn se hicieron diluciones seriadas 1:2 para
obtener los otros patrones de 12,5 g/ml; 6,25 g/ml; 3,125 g/ml; 1,56 g/ml y 0,78 g/ml.
Todos estos patrones se prepararon con la solucin tampn que contena la protena
recombinante parcialmente purificada. Para realizar la curva estndar, se colocaron 150 l de
cada patrn por duplicado en una placa de 96 pozos de fondo plano y posteriormente se les
agreg 150 l del reactivo Quick StartTM Bradford Dye Reagent 1X (BioRad, USA). Las
muestras fueron diluidas 1:20 y 1:40 y se colocaron 150 l de cada dilucin por triplicado,
para luego aadirles 150 l del reactivo de Quick StartTM Bradford Dye Reagent 1X. La placa
se agit por 5 minutos y la absorbancia a 595 nm fue leda en el equipo Synergy HT (Biotek,
USA).
2.2.17. Electroforesis en geles de SDS-PAGE.
Con el fin de verificar la expresin de las protenas recombinantes, se realizaron

electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida al 10 %, en condiciones disociantes (SDSPAGE) (Laemmli, 1970). A las muestras se les aadi la solucin de muestra de SDSPAGE 2X (0,09 M Tris-HCl a pH 6,8; 20 % glicerol; 2 % SDS; 0,02 % azul de bromofenol;
0,1 M DTT) y se calentaron por 5 minutos en bao de Mara a 95C.
La cmara de electroforesis (Mini PROTEAN
Tetra cell) se utiliz segn las
especificaciones del fabricante (BioRad, USA). Las muestras se colocaron en los bolsillos del
peine con una inyectadora Hamilton (Espaa), la cmara se conect a una fuente de poder y se
63
aplic una diferencia de potencial constante de 80 V por 1 hora, luego se aplic 120 V hasta
que el frente del colorante lleg al borde inferior del gel.
El gel fue retirado de la cmara para ser teido toda la noche en agitacin constante en
una solucin de Azul de Coomasie (Sigma, USA) (Coomasie Blue 0,25 %; Metanol 25 %;
cido actico glacial 10 %). Posteriormente, se decolor el gel con una solucin decolorante
(propanol 20%, cido actico glacial 10 %), revelndose as las bandas de protenas
coloreadas.
2.2.18. Electrotransferencia de protenas.
Una vez realizada la electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida en condiciones

disociantes como se describi anteriormente (Seccin 2.2.16), se utiliz el protocolo descrito
por Cloeckaert y colaboradores (1996) para la transferencia de las protenas del gel de SDSpoliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa. Para ello se utiliz un equipo de transferencia
semiseca (Trans-Blot SD Cell, BioRad, USA), y el tampn de transferencia (39 mM Glicina,
48 mM Tris, 0,0375 % SDS, 20 % metanol). Se conect el equipo de transferencia a 20 V
durante una hora y el papel de nitrocelulosa fue sumergido en una solucin de Rojo Ponceau
(2% rojo Ponceau, en cido actico al 1%) (Sigma, USA) por 10 minutos. Se hizo un lavado
con agua destilada para eliminar el exceso de coloracin, y se evidenciaron las bandas
transferidas.
2.2.18.1. Inmuno-absorcin del suero contra las protenas de E. coli.
Con el fin de evitar interacciones entre las protenas endgenas de E. coli y el suero de
los bovinos y conejos, los cuales pudieron haber estado expuestos naturalmente a infecciones
con esta bacteria, se les realiz una inmuno-absorcin contra las protenas de E. coli, las cuales
podran generan falsos positivos por inespecificidad. Esta inmunoabsorcin fue realizada de
acuerdo al protocolo de Rybicki y colaboradores (1990), el cual consiste en sembrar una
colonia de E. coli en 100 ml de medio LB lquido que se dej incubar en agitacin toda la
noche a 37 C. Posteriormente, se centrifug a 3000 x g por 30 minutos, el sedimento se
64
resuspendi en 10 ml de PBS a pH 7. Se sonic en hielo 3 veces por 30 segundos con pausas
de 30 segundos. A continuacin, la muestra se coloc en un recipiente que contena papel de
nitrocelulosa humedecido con agua destilada y se dej incubar por 4 horas en agitacin
constante a temperatura ambiente. Luego, el papel se lav 3 veces con TBS-T por 5 minutos y
se incub a 4 C toda la noche con solucin bloqueadora (Tris Base 20 mM, NaCl 500 mM,
0,05% Tween 20 a pH 7,5 y 5% leche descremada). Posteriormente, se volvi a lavar 3 veces
bajo las mismas condiciones anteriores, y se agreg el suero diluido en solucin bloqueadora
(anticuerpo primario) segn su titulacin. Se incub durante 1 hora en agitacin a temperatura
ambiente y se recolect el suero absorbido para ser utilizado inmediatamente.
2.2.18.2. Protocolo para la Inmunotincin.
Las membranas de nitrocelulosa que contienen las protenas ya transferidas

(electrotransferencia) fueron bloqueadas con leche descremada al 5 % en TBS-T (solucin
bloqueadora) por 1 hora, aadiendo suficiente volumen para cubrir las membranas
completamente. Se descart la solucin bloqueadora y se incub con el anticuerpo primario,
que corresponde a los sueros de los bovinos infectados experimentalmente con A. marginale
(1:200), el lquido asctico de los ratones BALB/c (1:100), el suero de los conejos y los
anticuerpos anti-MBP (1:10000, Sigma, USA) y anti-HP Tiorredoxina (1:20000; Sigma,
USA), los cuales fueron diluidos segn sus respectivas titulaciones. Estos anticuerpos
primarios fueron incubados por 1 hora en agitacin a temperatura ambiente en solucin
bloqueadora. Se descart esta solucin y se lavaron las membranas 3 veces por 5 minutos cada
vez con TBS-T. A continuacin se descart el TBS-T y se incub la membrana en solucin
bloqueadora con el anticuerpo secundario, que en este estudio se utilizaron anti-IgG de bovino
(1:10000, Jackson Immuno Research Laboratories, USA), de ratn (1:3000; Thermo
Scientific, USA) y de conejo (1:10000, Pierce Biotechnology, USA) unido a la enzima
peroxidasa. Se incub por 1 hora en agitacin y se descart la solucin anterior para luego
lavar las membranas 3 veces por 5 minutos cada vez con TBS-T. Posteriormente, se descart
el TBS-T y se procedi a revelar la reaccin por quimioluminiscencia, empleando el reactivo
Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, USA).
65
2.2.19. Produccin de anticuerpos policlonales en el lquido asctico de ratones.
Los ratones fueron tratados y dispuestos segn las tcnicas descritas por Morton y
colaboradores (2001). El procedimiento realizado fue el descrito por Tung (1983), modificado
para incrementar los ttulos de anticuerpos en etapas tempranas mediante la preinmunizacin
del ratn bajo condiciones que no involucre la formacin de lquido asctico. El mejor mtodo
desarrollado hasta la fecha es preinmunizar al ratn dos veces, una cuando tengan siete
semanas de edad y la otra cuando tenga nueve, para entonces comenzar con el mtodo de
Tung (1983), cuando el ratn tenga diez semanas de edad. Vale la pena destacar que el
antgeno MBP-AM202r se extrajo del gel de poliacrilamida para separarlo de protenas
inespecficas; por lo tanto, al emulsificar las muestras, es probable que se haya perdido
protena porque no se logro emulsificar todo el gel, quedando trozos del mismo sin inocular.
Preinmunizacin: La inyeccin contena 125 g/ml de Cefalexina (Genven,

Venezuela), 50 g de Muramil dipptido (MDP; Sigma, USA), 19 g y 17 g del antgeno
MBP-AM202r y MBP-AM573r respectivamente, y 50 l de Adyuvante Incompleto de Freund
(AIF; Sigma, USA). Se emulsific la muestra con vortex. Posteriormente, se inyectaron 100 l
de la emulsin anterior a cinco ratones BALB/c hembras por va Intraperitoneal (IP), en la
semana siete y nueve posterior a su nacimiento. Despus de la segunda preinmunizacin, se
prosigui con la inmunizacin. A los cinco ratones utilizados como control negativo se les
coloc lo mismo, excepto la protena recombinante, cuyo volumen fue sustituido por PBS.
Inmunizacin: La inyeccin contena una relacin 9:1 v/v de Adyuvante Completo de

Freund (ACF; Sigma, USA) y el antgeno (19 g de MBP-AM202r y 17 g de MBPAM573r). Se le aadi 2 l de Cefalexina (125 g/ml). Se emulsific la muestra con vortex.
Se inyectaron 200 l por va IP a cinco ratones BALB/c, hembras a partir de la semana diez, y
se continu con la inmunizacin semanalmente hasta la semana veinte. A los ratones
utilizados como control negativo se les coloc lo mismo, excepto la protena recombinante,
cuyo volumen fue sustituido por PBS.
66
Los lquidos ascticos obtenidos, fueron centrifugados a 3000 x g por 5 minutos a 4C,
para eliminar la maya de fibrina. Se tom el sobrenadante y se alicuot para almacenarlos a 80 C para posteriores ensayos.
2.2.20. Produccin de anticuerpos policlonales en el suero de conejos.
Los conejos fueron tratados y dispuestos segn las tcnicas descritas por Morton y
colaboradores (2001). Se trabaj con 2 conejos Nueva Zelanda (Oryctologus cuniculus),
hembras de la misma camada, de dos meses de edad, con un peso aproximado de 2.5 kg cada
uno. Previo a las inmunizaciones, se les realiz una extraccin de 30 ml de sangre por puncin
intracardaca a ambos conejos para obtener el suero preinmune. La emulsin se inyect por va
subcutnea distribuyndose por todo el lomo del conejo, colocando 5 inyecciones de 200 l
cada una, para un volumen total de 1 ml. Primero se preinmuniz a los conejos con la protena
(0,2 mg) emulsificada 1:1 con ACF y posteriormente, se realizaron tres refuerzos o
inmunizaciones con el mismo antgeno (0,2 mg), pero esta vez emulsificado 1:1 con AIF cada
15 das. A su vez, se realizaron tomas de muestras de sangre de 10 ml cada 15 das por
puncin intracardaca para obtener el suero inmune. La sangre se recolect en tubos de 15 ml
sin anticoagulante, se dejaron a temperatura ambiente durante 30 minutos para facilitar la
formacin del cogulo y se centrifugaron durante 40 minutos a 2.700 x g a 4 C. El suero se
dividi en alcuotas de 2 ml cada una, se almacen en tubos de microcentrifuga de 2 ml y se
guardaron a 4 C hasta su uso y a 20 C para prximos ensayos (Padilla-Londoo y col.,
2008; modificado). Vale la pena mencionar que el antgeno Thio-AM244 se proceso como el
antgeno MBP-AM202r, descrito anteriormente; es decir, que fue separado de las protenas
inespecficas mediante un gel de SDS-PAGE y se extrajo la banda de inters del gel de
poliacrilamida, por lo que se piensa que al emulsificar las muestras es probable que se haya
perdido protena porque no se logr emulsificar todo el gel, quedando trozos del mismo sin
inocular.
67
2.2.21. Digestin en gel con tripsina para anlisis de Espectrometra de Masa.
Con el fin de confirmar que la protena Thio-AM244r es la protena AM244 (TolB) de

A. marginale, se le realiz una Espectrometra de Masa en tndem gracias a la colaboracin de
la Unidad de Protemica del Centro de Biologa Estructural del Instituto de Investigaciones
Cientficas (IVIC). Para ello, se realiz una SDS-PAGE para separar la protena de inters (no
purificada) del resto de las protenas inespecficas empleando un gel de poliacrilamida al 10
%, el cual fue teido con Azul de Coomasie para extraer la banda donde se encontraba la
protena de inters. Esta banda se decolor con 1 ml de solucin que contena acetonitrilo (30
%) y bicarbonato de amonio (250 mM), dejndola en agitacin por 10 minutos, hasta que se
decolor el fragmento de gel de poliacrilamida. Luego se lav la banda dos veces con 1 ml de
agua, en agitacin, y se cort en cubos de aproximadamente 1 mm3. Se colocaron los
fragmentos de gel en un tubo de microcentrifuga de 0,5 ml y se deshidrataron agregando 0,5
ml de una solucin de acetonitrilo (90 %) y agua (10 %), agitando por 5 minutos. Se descart
la solucin y se eliminaron las trazas por secado al vaco (Vacufuge Basic Concentrator,
Eppendorf, USA) durante 2 a 5 minutos. Se rehidrataron los fragmentos de gel en un volumen
mnimo de tripsina 12,5 ng/l (Sequencing Grade Modified Trypsin; Promega, USA) disuelta
en 50 mM de bicarbonato de amonio, evitando que quedara solucin circundante y se incub a
37 C por 16 horas. Luego se centrifug brevemente la digestin y se aadi 30 l de agua
dejando en agitacin por 45 minutos. Seguidamente, se aspir la solucin de digestin con el
zip-tip (resina C18) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) previamente acondicionado, de 15 a
20 veces sin descartar la solucin. Despus se lav el zip-tip con 20 l de agua, los cuales se
descartaron en un papel absorbente (2 veces) y se coloc en un vial que contena 20 l de agua
hasta que fue utilizado en el prximo paso. Posteriormente, se aadi 1 l de cido frmico
puro a la solucin de digestin y se dej en agitacin por 45 minutos. Se carg y descarg la
solucin con el zip-tip de 15 a 20 veces, sin descartar la solucin y luego se lav con agua
como se explic anteriormente. En estas condiciones se puede conservar el zip-tip a -20 C o a
-80 C hasta los prximos ensayos. Para eluir la mezcla de pptidos del zip-tip y realizar el
anlisis por Espectrometra de Masa, se lav el zip-tip con cido frmico al 5 %, cargando 20
l de la solucin y descartndola en un papel absorbente (repetir 10 veces). Luego se tomaron
5 l de una solucin de acetonitrilo (60 %), agua (39 %) y cido frmico (1 %), los cuales se
68
colocaron en un vial y porteriormente se carg y descarg el zip-tip por 15 a 20 veces, sin
descartar la solucin, y por ltimo se cargaron los 5 l en el capilar para realizar el anlisis por
Especrometra de Masa.
2.2.22. Anlisis por Espectrometra de Masa en Tndem.
Para realizar el anlisis de Espectrometra de Masa en Tndem a la protena ThioAM244r, se emple el espectrmetro de masa MALDI-TOF-TOF (modelo AutoflexTM III
SmartBeam, Bruker, Mxico) de la Unidad de Protemica del Centro de Biologa Estructural
del Instituto de Investigaciones Cientficas (IVIC), empleando los parmetros indicados en la
Tabla 2.3 para la adquisicin de la huella peptdica (Tabla 2.3).
Tabla 2.3. Parmetros de adquisicin de datos para huellas peptdicas.

Espectrmetro
Deteccin
Proceso
Instalar
Fuente Ion 1
Fuente Ion 2
Lente
Reflector 1:
Reflector 2:
Extraccin pulsada del in
Rango de Masa
Reflector
Frecuencia de muestreo
Ganancia electrnica
Tiempo real
Algoritmo del pico detectado
Umbral Seal de ruido
Umbral Intensidad relativa
Mximo nmero de picos
Ancho del pico
Altura
Sustraccin de lnea base
Laser
19,00 kV
16,71 kV
9,04 kV
21,12 kV
9,90 kV
0 ns
500-4300 Da
3,3 x
(reflector detector voltages 1583V,
Monitor 1590V)
2 GS/s
100 mV
Apagado
Centroide
1
0
1000
0,2 m/z
80 %
TopHat
200.0 Hz
69
Una vez obtenida la huella peptdica, esta fue procesada en el programa online Mascot
(http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF) para la
bsqueda de homologas con protenas de otros patgenos empleando los parmetros
indicados en la Tabla 2.4.
Tabla 2.4. Parmetros de bsqueda de homologas del espectro de huella peptdica en la

base de datos Mascot.
Base de datos
Enzima de digestin
Omisin de cortes
Taxonoma
Modificaciones fijas
Modificaciones variables
Tolerancia de masa del pptido
Tolerancia de la Espectrometra de
masa en tndem
Valores de masa
Masa de la protena
Formato de los datos
Instrumento
Nmero de homologas por bsqueda.
NCBI (nr)
(Fecha de la bsqueda: 16.08.2013)
(31601460 secuencias; 10937649309 residuos)
SwissProt
(Fecha de la bsqueda:16.08.2013)
Tripsina
1
Todas las entradas
Propionamidacin de la Cistena
Deamidacin de la Asparagina y la Glutamina
Oxidacin de la Metionina
0,6 Da
0,3 Da
Monoisotpico
No restringido
BRUKER (.XML)
MALDI-TOF-TOF (modelo AutoflexTM III
SmartBeam)
10
Mascot: http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF
70
CAPTULO III
RESULTADOS
3.1. Identificacin y seleccin de genes de A. marginale con dominios que sugieren la
codificacin de protenas de superficie o secrecin.
El primer paso en la bsqueda de protenas inmunognicas de A. marginale fue la
revisin del trabajo de Brayton y colaboradores (2005). Estos autores secuenciaron y
clasificaron el genoma completo de A. marginale cepa St. Maries (1.197.687 bp) y sealaron,
entre otras cosas, la presencia de 107 genes que codifican protenas hipotticas asignadas a
familias conservadas, 126 genes que codifican protenas hipotticas conservadas y 151 genes
que codifican protenas hipotticas sin asignar, resultando en un total de 384 protenas de
funcin desconocida. Con esta informacin, se procedi entonces al anlisis in silico de dichas
protenas, basado en la bsqueda de similitudes con protenas de otros patgenos en cuanto a
su ubicacin en la membrana externa y/o presencia de seales de secrecin o periplasmticas,
caractersticas esenciales de una protena para ser considerada como un candidato vacunal. El
mismo anlisis in silico fue realizado para las protenas de membrana externa, protenas de
secrecin o protenas periplasmtica, cuyas funciones ya han sido predichas (funcin
conocida), con la finalidad de comparar los resultados con los reportados por Brayton y
colaboradores (2005). Una vez identificadas las protenas con similitud a protenas de
membrana externa, de secrecin o periplasmticas de otros patgenos, se procedi a
determinar la expresin en la rickettsia, de aquellas con mayor porcentaje de similitud, para
luego escoger de este grupo a tres genes que se expresen en A. marginale con la finalidad de
clonarlos, secuenciarlos, expresarlos y purificar las protenas recombinantes para determinar si
estas son capaces de producir una respuesta humoral en el bovino en su forma nativa
(estructura tridimensional de la protena en condiciones fisiolgicas), o en ratones o conejos en
su forma recombinante.
En el anlisis in silico de las protenas de funcin conocida se obtuvo 21 protenas de

membrana externa pertenecientes a la superfamilia msp2, 9 protenas de membrana externa
71
pertenecientes a la superfamilia msp1, 3 protenas de membrana externa que no pertenecen a
ninguna de estas superfamilias (TolC, OMA87 y MSP5), 3 protenas de membrana interna y 8
protenas relacionadas con el sistema de secrecin tipo IV (ver anexos, Tablas 6.1, 6.2 y 6.3),
resultados similares a los obtenidos por Brayton y colaboradores (2005). En el caso del
anlisis in silico realizado a las 348 protenas de funcin desconocida reportadas por estos
autores, se identificaron 14 protenas de membrana externa, 5 protenas de secrecin, 2
protenas periplasmticas y 37 protenas de membrana interna (Tabla 3.1; ver anexos, Tablas
6.4, 6.5 y 6.6).
De las protenas con funcin desconocidas se escogieron siete, AM202, AM244,

AM573, AM778, AM796, AM854 y AM1097, por tener el mayor porcentaje de similitud con
protenas de membrana externa, protenas de secrecin o de transporte de diversas bacterias
patgenas (Tabla 3.1). Vale la pena destacar, que la protena AM244 denominada TolB por
Brayton y colaboradores (2005), fue seleccionada por estar involucrada en el proceso de
infeccin de E. coli (Rigal y col., 1997). Hasta la fecha no se han encontrado estudios
relacionados con la inmunogenicidad de la protena TolB de A. marginale como posible
candidato vacunal.
Al alinearse las secuencias de aminocidos de estas siete protenas de A. marginale con

otras cepas, se observ que en el caso de la protena AM202 presenta un 99% de similitud con
una lipoprotena de A. centrale, adems de presentar un sitio de clivaje del pptido seal y una
hlice transmembrana (Tabla 3.1). Asimismo, posee un 73% de similitud con una protena
inducible osmticamente de A. phagocytophilum, un 62% con una protena transportadora de
Ehrlichia chaffeensis y un 64% con una protena que contiene un dominio asociado al
transporte en E. canis.
Por su parte, se encontr que la protena AM244, que como se mencion fue
denominada TolB por Brayton y colaboradores (2005), presenta pptido seal, pero no posee
mtivo de hlices transmembranas (Tabla 3.1). Esta protena tiene un 91 % y 49 % de
similitud con la protena TolB de A. centrale y de A. phagocytophilum, respectivamente.
72
Tabla 3.1. Genes seleccionados para el estudio de sus protenas hipotticas como posibles
candidatos vacunales.
Locus/Gen
AM202
AM244tolB
AM573
AM778
No. Acceso
GenBank
Hlices
transmembranas
(TMpred)
Sitio de clivaje
del pptido seal
(SignalP 3.0)
Alineacin
(Blastp)
Lipoprotena
de A. centrale
Protena de
No tiene helices
translocacin
YP_153606.1
Entre los aa 25-26
transmembranas
TolB de A.
marginale
Protena
No tiene hlices No tiene pptido
YP_153839.1
transportadora
transmembranas
seal
de A. centrale
Protena
Del aa 52 al 73
exportada de
YP_153969.1 Del aa 258 al 279 Entre los aa 24-25
Ehrlichia
Del aa 298 al 321
ruminantium
AM796
YP_153982.1
AM854
YP_154026.1
AM1097
YP_154208.1
Del aa 31 al 50
No tiene hlices
transmembranas
No tiene helices
transmembranas
No tiene pptido
seal
Entre los aa 23-24
Entre los aa 25-26
PHM de A.
centrale
OmpA de A.
centrale
OmpH de A.
centrale
*Identidad
(%)
99%
100%
88%
30%
87%
79%
86%
aa: Aminocidos
PHM: Protena hipottica de membrana
Omp: Protena de membrana externa
TMpred: http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html
SignalP 3.0: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
Blastp: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
*Identidad (%): Similitud existente entre las protenas de A. marginale con protenas de otros patgenos
relacionados.
Se determin que la protena AM573 tiene un 88 % de similitud con una protena de

transporte de A. centrale y no posee pptido seal ni motivo de hlices transmembranas (Tabla
3.1). Asimismo, se determin que posee 61 %, 45 % y 42 % de similitud con protenas
inmunognicas de A. phagocytophilum, E. chaffeensis y E. canis, respectivamente.
En cuanto a la protena AM778, sta tiene un 30 % de similitud con una protena

hipottica exportada de E. ruminantium, presenta un sitio de clivaje del pptido seal y tres
73
motivos de hlices transmembrana (Tabla 3.1). Adicionalmente, esta protena tiene un 30 % y
25 % de similitud con una protena de membrana externa de Wolbachia endosymbiont y con
una protena de superficie (P55) de A. phagocytophilum, respectivamente.
La otra protena seleccionada es la AM796, la cual tiene un 87 % de similitud con una

protena de membrana hipottica de A. centrale, no presenta pptido seal pero si tiene un
motivo para una hlice transmembrana (Tabla 3.1). Adems, posee un 39 % y 41 % de
similitud con la protena de secrecin HlyD de E. canis y E. chaffeensis respectivamente.
Tambin tiene un 43 % de similitud con una protena de membrana de A. phagocytophilum
perteneciente a la familia RND, cuyos miembros estn involucrados en el transporte de
metales pesados, compuestos hidrofbicos, anfiflicos, factores de nodulacin y en la
excrecin de protenas (SecDF) (Osborne y col., 1998; citados por Marrero-Coto y col., 2010).
La protena AM854, tiene un 79 % de similitud con una protena de membrana externa

putativa (OmpA) de A. centrale, no tiene pptido seal pero si tiene una hlice transmembrana
(Tabla 3.1). Tambin posee un 59 % con una OmpA de A. phagocytophilum, y un 46 % y 43
% de similitud con una protena que contiene un dominio OmpA/MotB de E. canis y E.
chaffeensis, respectivamente. La protena MotB se encarga de la motilidad y de la secrecin
celular (Sharp y col., 1995).
Finalmente, la protena seleccionada AM1097, tiene un 86 % similitud con una

protena de membrana externa putativa (OmpH) de A. centrale, tiene pptido seal pero no
tiene motivos de hlices transmembrana (Tabla 3.1). Por otro lado, presenta un 48 % de
similitud con la protena OmpH de E. chaffeensis y un 31 % de similitud con una protena de
membrana externa de W. endosymbiont.
3.2. Expresin de los genes AM202, AM244, AM573, AM778, AM796, AM854 y AM1097
en A. marginale.
Una vez seleccionadas las protenas candidatas, se procedi a investigar si los genes
que las codifican se expresan en la rickettsia A. marginale, determinando si stos son
transcritos mediante la deteccin de sus ARNm. Para ello se procedi al aislamiento del ARN
74
total a partir de eritrocitos de bovino infectados con la rickettsia y se verific su presencia
mediante una corrida electrofortica en un gel de agarosa al 1 % (Figura 3.1). Posteriormente
se realiz la transcripcin reversa (RT) y a continuacin la PCR empleando cebadores
especficos para cada gen. Inicialmente se estandariz la RT-PCR realizando ensayos con el
gen msp1. Para comprobar la ausencia de ADN en la muestra de ARN aislada, se emplearon
cebadores que hibridan en una regin no transcrita del gen msp1a. En el registro fotogrfico de
la corrida electrofortica que se muestra en la Figura 3.2 se puede observar la presencia de un
fragmento con el tamao esperado (aproximadamente 2500 pb) en el carril correspondiente a
la muestra de ADN del microorganismo (control positivo de la PCR) y la ausencia de bandas
en los carriles pertenecientes al ADNc y ARN total, indicando que con el mtodo empleado la
RT estaba libre de ADN genmico contaminante (Figura 3.2).
23S
16S
5S
Figura 3.1. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica del ARN total extrado de
eritrocitos infectados con A. marginale. Carriles 1 y 2: aislamientos de ARN total. El ARN total
de A. marginale fue aislado de los eritrocitos de bovinos infectados con la rickettsia, empleando
el reactivo Trizol (Invitrogen, USA), seguido de la adicin de cloroformo y posteriormente
isopropanol para precipitar el ARN. Dos microgramos del producto fueron visualizados en un gel
de agarosa al 1%, teido con SYBR safe (Invitrogen, USA).
75
1
pb
10000
8000
5000
3000
2000
Gen msp1a
1000
Figura 3.2. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica de la RT-PCR del gen completo de la
msp1a. Carril 1: Blanco conteniendo solo los reactivos; Carril 2: ADN genmico de A. marginale;
Carril 3: ADNc de A. marginale; Carril 4: ARN de A. marginale. Se aisl el ARN de A. marginale y
se realiz la transcripcin reversa para la obtencin del ADNc para realizar la PCR con los cebadores
que hibridan en una regin no transcrita del gen de la msp1a. Los amplicones fueron visualizados en
un gel de agarosa al 0,.8% teido con SYBR Safe (Invitrogen, USA).
A continuacin, se realiz la PCR con un par de cebadores que hibridan en una regin
del marco de lectura abierto del gen de la msp1a, y por ende est presente en el ARNm. En el
registro fotogrfico de la corrida electrofortica que se muestra en la Figura 3.3 se observa la
amplificacin de un fragmento de aproximadamente 820 bp, tanto en el carril perteneciente al
ADN del microorganismo (control positivo de la PCR) como en el concerniente al ADNc del
mismo (control positivo de expresin), el cual corresponde al tamao reportado por Allred y
colaboradores (1990). Adems, no se observ ningn fragmento en el carril donde se emple
como templado el ARN total tratado con DNasa, lo que indic junto con los resultados
anteriores, que la metodologa empleada permiti realizar la RT con xito (Figura 3.3).
pb
1500
ORF msp1
500
200
Figura 3.3. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica de la RT-PCR con los cebadores del marco
de lectura abierto del gen msp1a. Carril 1: Blanco conteniendo solo reactivos; Carril 2: ADN genmico
de A. marginale; Carril 3: ADNc de A. marginale; Carril 4: ARN de A. marginale. Se aisl el ARN de A.
marginale y se realiz la transcripcin reversa para la obtencin del ADNc para realizar la PCR con los
cebadores que hibridan en el marco de lectura abierto del gen msp1a. Los amplicones fueron
visualizados en un gel de agarosa al 2% teido con SYBR Safe (Invitrogen, USA).
76
Seguidamente, se realiz la RT-PCR de los genes AM202, AM244, AM573, AM778,
AM796, AM854 y AM1097, con el fin de determinar si estos genes se expresan en la rickettsia.
En el registro fotogrfico de la corrida electrofortica de la RT-PCR de los siete genes
seleccionados se observan los fragmentos correspondientes al tamao de cada uno de los
marcos de lectura abiertos de estos genes (Figura 3.4), los cuales concuerdan con los obtenidos
en el anlisis de secuencia realizado (Tabla 3.1). Estos resultados indican que el transcrito de
estos genes est presente en la rickettsia A. marginale.
10
11
12
13
14
pb
1500
1590 pb
1320 pb
1110 pb
705 pb
582 pb
555 pb
500
1000
201 pb
200
Figura 3.4. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica de la RT-PCR de los siete genes de A. marginale
seleccionados. Carril 1: Blanco reactivos con los cebadores del gen AM202; Carril 2: amplicn del gen AM202; Carril
3: Blanco reactivos con los cebadores del gen AM244; Carril 4: amplicn del gen AM244; Carril 5: Blanco reactivos
con los cebadores del gen AM573; Carril 6: amplicn del gen AM573; Carril 7: Blanco reactivos con los cebadores
del gen AM778; Carril 8: amplicn del gen AM778; Carril 9: Blanco reactivos con los cebadores del gen AM796;
Carril 10: amplicn del gen AM796; Carril 11: Blanco reactivos con los cebadores del gen AM854; Carril 12:
amplicn del gen AM854; Carril 13: Blanco reactivos con los cebadores del gen AM1097; Carril 14: amplicn del gen
AM1097. Se aisl el ARN de A. marginale y se realiz la transcripcin reversa para la obtencin del ADNc para
realizar la PCR con los cebadores que amplifican el marco de lectura abierto de los genes de inters. Los amplicones
fueron visualizaos en un gel de agarosa al 2% teido con SYBR Safe (Invitrogen, USA).
Una vez demostrada la presencia del ARNm de estos genes, se decidi trabajar con tres
de ellos, AM202, AM244 y AM573, por ser los tres que presentan mayor porcentaje de
similitud con protenas de membrana o con protenas transportadoras de otros patgenos
relacionados, adems por presentar dominios involucrados en la integridad, mecanismos de
infeccin y de transporte de solutos en la rickettsia. Estos dominios son: OsmY y BON,
presentes en la protena AM202, el dominio TolB y WD40 localizados en la protena AM244
y el dominio TRAP presente en la protena AM573.
77
3.3. Clonacin de los genes AM202, AM244 y AM573 en los vectores de expresin pMalp4x y pThioHis A.
En vista de que los genes AM202, AM244 y AM573 presentan un mayor porcentaje de
similitud con protenas de membrana y de transporte de otros patgenos relacionados con A.
marginale, adems de expresarse en la rickettsia y de presentar dominios involucrados en la
integridad de la bacteria, se procedi a la clonacin de los mismos en los vectores de
expresin pMal-p4x (New England BioLabs, USA) y pThioHisA (Invitrogen, USA); los
cuales se escogieron por diversas razones: en el caso del vector pMal-p4x, se escogi porque
las protenas que se van a expresar son de membrana, protenas casi siempre txicas para las
bacterias en las que se expresan, por lo que esta protena de fusin (MBP, del ingls Maltose
Binding Protein) facilita su plegamiento, purificacin e identificacin, ya que ubica a la
protena recombinante en la regin periplasmtica de E. coli. El vector pThioHisA fue
seleccionado porque la protena que se fusiona en el N-terminal de la protena de inters,
llamada HP-Tiorredoxina, mantiene soluble a la protena recombinante porque favorece la
formacin de los puentes disulfuro intracatenarios, mantenindola en el citoplasma de E. coli,
lo que facilita su purificacin e identificacin en inmunoensayos.
Tambin se clonaron en el vector de expresin pQETriSystem (QIAGEN, USA), ya

que puede ser empleado para la expresin de protenas en clulas procariotas (E. coli) y en
clulas eucariticas (clulas de insectos o de mamferos), adems de aadir una protena de
fusin en el C-terminal de la protena de inters, conformada por ocho histidinas, lo cual
facilita su identificacin en inmunoensayos y su posterior purificacin (QIAGEN, 2003). Sin
embargo, no se logr la expresin de las protenas de inters en este vector, por lo que solo se
detallarn los resultados de los otros dos vectores donde si se logr la expresin de las
protenas de inters.
Los genes AM202 y AM573 fueron clonados en el vector de expresin pMal-p4x

(Figura 2.1) y el gen AM244 en el vector pThioHis A (Figura 2.2), como fue descrito
anteriormente. Para ello previamente se amplificaron estos genes mediante la PCR, tal y como
se describi en la metodologa (Seccin 2.2.5). Estos fragmentos al igual que los vectores de
expresin, fueron digeridos con las enzimas de restriccin correspondientes, segn el
78
protocolo descrito por la casa comercial Promega (USA). Luego de digerirlos, se utiliz la
enzima T4 DNA Ligasa (Promega, USA) para la ligacin de cada fragmento a su vector
correspondiente. Posteriormente, se transformaron en las bacterias E. coli Top 10 y a las
colonias crecidas se les aisl el plsmido, a los cuales se les realiz digestiones para verificar
la presencia de los insertos. Como resultado se obtuvo lo siguiente: en el caso del plsmido
recombinante pMal-p4x-AM202 se obtuvieron siete clones que contenan el inserto (clones 1,
3, 5, 7-10), ya que al digerirse estos plsmidos con la enzima de restriccin Pvu II se
observaron en el registro fotogrfico de la corrida electrofortica, tres fragmentos de
aproximadamente 3178, 2343 y 1676 pb (Figura 3.5, carril 2, 4, 6, 8-11), tamaos esperados
segn el mapa de restriccin realizado a travs del programa on line NEBcutter V2.0
(http://tools.neb.com/NEBcutter2/).
En el caso del plsmido recombinante pMal-p4x-AM573, se obtuvieron 10 clones

positivos, los cuales al digerirse con la misma enzima de restriccin Pvu II se observ en la
corrida electrofortica, cuatro fragmentos de aproximadamente 3178, 1962, 1676 y 93 pb
(Figura 3.6, Carril 2-11).
pb
10
11
8000
6000
1773 pb
4000
3000
2000
1676 pb 1500
3178 pb
1962 pb
1676 pb
1000
500
Figura 3.5. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica para la verificacin de los clones positivos del gen
AM202 en pMal-p4x por medio de la digestin de plsmidos con la enzima de restriccin Pvu II. Carril 1: vector
pMal-p4x sin inserto; Carriles 2-11: plsmidos aislados de las colonias 1-10 de E. coli TOP10. A las colonias
crecidas se les aisl el plsmido empleando el estuche QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAgen, USA) y una
Microcentrifuga (Eppendorf, USA). Estos plsmidos fueron digeridos con la enzima de restriccin Pvu II, segn
el protocolo descrito por la casa comercial Promega (USA). Se visualizaron los fragmentos digeridos en un gel
de agarosa al 0,8% teido con SYBR Safe (Invitrogen, USA).
79
pb
10
11
8000
6000
4000
3000
3178 pb
1500
1962 pb
1676 pb
1773 pb
1676 pb 2000
1000
500
93 pb
Figura 3.6. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica para la verificacin de los clones positivos del
gen AM573 en pMal-p4x por medio de la digestin de plsmidos con la enzima de restriccin Pvu II. Carril 1:
vector pMal-p4x sin inserto; Carriles 2-11: plsmidos aislados de las colonias 1-10 de E. coli TOP10. A las
colonias crecidas se les aisl el plsmido empleando el estuche QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAgen, USA) y
una Microcentrifuga (Eppendorf, USA). Estos plsmidos fueron digeridos con la enzima de restriccin Pvu II,
segn la manufactura (Promega, USA). Se visualizaron los fragmentos digeridos en un gel de agarosa al 0.8%
teido con SYBR Safe (Invitrogen, USA).
En el caso del plsmido recombinante pThioHisA-AM244, solo se identific un clon

positivo (Clon 3) al digerirse con la enzima de restriccin EcoR I (Promega, USA), ya que se
observaron dos fragmentos de aproximadamente 5000 y 577 pb (Figura 3.7, Carril 4).
1
pb
5000
5000 pb
3000
2000
1650
1000
650
500
300
200
577 pb
Figura 3.7. Registro fotogrfico de la corrida electrofortica para la verificacin de clones

positivos del gen AM244 en pThioHisA por medio de la digestin de plsmidos con la enzima de
restriccin EcoR I. Carriles 1: vector pThioHisA sin inserto; Carriles 2-4: plsmidos aislados de las
colonias 1-3 de E. coli TOP10. A las colonias crecidas se les aisl el plsmido empleando el estuche
QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAgen, USA) y una Microcentrifuga (Eppendorf, USA). Estos plsmidos
fueron digeridos con la enzima de restriccin EcoR I, segn la casa comercial Promega (USA). Se
visualizaron los fragmentos digeridos en un gel de agarosa al 0,8% teido con SYBR Safe (Invitrogen,
USA).
80
Estos resultados fueron satisfactorios, ya que indican la presencia de los insertos en sus
plsmidos respectivos. Estos resultados fueron corroborados por la secuenciacin de dichos
clones.
3.4. Secuenciacin de los clones positivos de AM202, AM244 y AM573 de A. marginale.
Para corroborar la identificacin de los plsmidos recombinantes pMal-p4x-AM202,

pMal-p4x-AM573 y pThioHisA-AM244 realizada empleando enzimas de restriccin como se
describi anteriormente, se realiz la secuenciacin de estos mismos plsmidos en la
Fundacin Instituto de Estudios Avanzados IDEA, obtenindose los siguientes resultados:
1.- Para el gen AM202 en el vector pMal-p4x, solo se secuenciaron los clones del 7 al
10, los cuales presentaron la misma secuencia nucleotdica entre ellos (datos no mostrados).
La secuencia de los clones 7 y 9 se logr completar uniendo la secuencia obtenida con los
cebadores Sentido del vector pMal-p4x (secuencia el 5 terminal del inserto) y el Sentido
M13/pUC (secuencia el 3 terminal del inserto), los cuales fueron utilizados para la
secuenciacin. La secuencia de los clones 8 y 10 se obtuvo completa con cada uno de los
cebadores utilizados para la secuenciacin, por lo que se prefiri trabajar con cualquiera de
ellos. Para este estudio se escogi el clon 8 (ver anexos Figura 6.1 y 6.2). La secuencia
obtenida del clon 8 se aline con la secuencia de las cepas St. Maries (n de acceso del
genoma: gb|CP000030.1|), Florida (n de acceso del genoma: gb|CP001079.1|) e Israel
subespecie centrale (n de acceso del genoma: gb|CP001759.1|) de A. marginale reportadas en
el GenBank, observndose dos cambios nucletidicos en la posicin 429 y 435 (Figura 3.8),
probablemente errores insertados por la polimerasa Taq; y otro nucletido en la posicin 519
en la cepa Zulia (en estudio) que solo coincidi con la cepa Israel de la subespecie centrale, el
cual probablemente sea un polimorfismo entre cepas. Sin embargo, estas diferencias
nucleotdicas no generaron cambios en la secuencia de aminocidos, presentando un 99 % y
100 % de similitud en su secuencia nucleotdica y aminoacdica, respectivamente (Figura 3.8 y
3.9).
81
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
ATGAGGTGCAGGGCCTTGCTACTGGCGGTGCTTTTGATAAGTACCCAGACTGGCTGTAGT
************************************************************
CTCATGGTTGCCGGCCTTGCTGTGGTGACTGGGGCTGTGGTGGCGCTACAGGAGCGTTCT
************************************************************
GTCGGCGATGTTATCGATGATGCCGCGATATTGATCAAGATCAATAAGGAACTGTTTCAA
GTCGGCGATGTTATCGATGATGCCGCAATCTTAATCAAGATTAATAAGGAGCTGTTTCAG
************************** ** ** ******** ******** ********
CAGGGCATGTTCTCCTCTATCACCGTCCGTGTTAGCGAAGGAAGGGTGTTGCTGACGGGC
CATGGCATATTTTCCTCTATTACCGTCCGTGTCAGCGAAGGGAGGGTGCTGTTGACGGGC
** ***** ** ******** *********** ******** ****** ** ********
ACTGTTGATTCTCCCGATAAGAGGCTAAAGGCTGAAAGGGTGGCGTGGCAGCAGAGCGAG
ACTGTTGATTCTCCCGATAAGAGGCTAAAAGCCGAAAGGGTGGCGTGGCAGCAGAGTGAG
***************************** ** *********************** ***
GTTAAAGAGGTCGTCAACGAAATTGCAGTAGACAAAGACGAAGTGACCTTGAAAGAGGTT
GTTAAAGAGGTTGTCAACGAAATTGCAGTAGACAAAGACGAAGTAACCTTGAAAGAGGTT
*********** ******************************** ***************
GCTATAGATAGCGCCATCAGTGCGCAGATAAAAGCTCGTATGGTGGCCCATGCGGGGATC
************************************************************
AAGTCTGTAAACTACAGCATCAACACTGTTGGAGGGGTTGTGTACCTGATGGGTATAGCC
AAGTCTGTCAACTATAGCATCAACACTGTTGGAGGGGTTGTGTACCTGATGGGTATAGCC
******** ***** *********************************************
CAGAGCCAGAAAGAGCTGAACTCCGTAATCGGGATTAGCAAAAGGGTTAAAGGCGTAAAG
CAGAGCCAGAAAGAGCTGAACTCCGTAATCGGGATTAGCAAAAGGGTTAAAGGCGTAAAG
CAGAGCCAGAAAGAGCTGAACTCCGTAATCGGGATTAGTAAAAGGGTTAAAGGCGTAAAG
CAGAGCCAGAAAGAGCTGAACTCCGTAATCGGGATTAGTAAAAGGGTTAAAGGCGTAAAG
************************************** *********************
CAGGTAATAAGCTACGTAAGGCTGAAACACAGCAAGTTGCGTCGCTAA 588
************************************************
60
60
60
60
120
120
120
120
180
180
180
180
240
240
240
240
300
300
300
300
360
360
360
360
420
420
420
420
480
480
480
480
540
540
540
540
Figura 3.8. Alineacin de las secuencias nucleotdicas del gen AM202 de A. marginale cepa Zulia (ZU, en
estudio) con las cepas St. Maries (SM; n de acceso del genoma: gb|CP000030.1|; rango: 170363 hasta 170950),
Florida (FL; n de acceso del genoma: gb|CP001079.1|; rango: 169549 hasta 170136) e Israel subespecie centrale
(IS; n de acceso del genoma: gb|CP001759.1|; rango: 1079198 hasta 1079785; hebra complementaria) de A.
marginale, por Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Los asteriscos (*) sealan todos los
nucletidos iguales entre las cepas; los espacios indican los nucletidos diferentes entre las cepas. Los
nucletidos resaltados en amarillo son errores introducidos por la polimerasa Taq, el resaltado en rojo es un
posible polimorfismo entre cepas, y los resaltados en gris son el codn de inicio.
82
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
MRCRALLLAVLLISTQTGCSLMVAGLAVVTGAVVALQERSVGDVIDDAAILIKINKELFQ
************************************************************
60
60
60
60
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
QGMFSSITVRVSEGRVLLTGTVDSPDKRLKAERVAWQQSEVKEVVNEIAVDKDEVTLKEV
HGIFSSITVRVSEGRVLLTGTVDSPDKRLKAERVAWQQSEVKEVVNEIAVDKDEVTLKEV
:*:*********************************************************
120
120
120
120
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
AIDSAISAQIKARMVAHAGIKSVNYSINTVGGVVYLMGIAQSQKELNSVIGISKRVKGVK
************************************************************
180
180
180
180
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
QVISYVRLKHSKLRR
QVISYVRLKHSKLRR
QVISYVRLKHSKLRR
QVISYVRLKHSKLRR
***************
195
195
195
195
Figura 3.9. Alineacin de las secuencias aminoacdicas de la protena AM202 de A. marginale cepa Zulia (Zu,
en estudio) con las cepas St. Maries (SM; n de acceso: ref|YP_153580.1|), Florida (FL; n de acceso:
ref|YP_002563289.1|) e Israel subespecie centrale (IS; n de acceso: ref|YP_002563289.1|) de A. marginale por
Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Los asteriscos (*) sealan todos los amonicidos
iguales entre las cepas; los dos puntos (:) indican los aminocidos diferentes entre las cepas.
2.- En el caso del gen AM244 en el vector pThioHisA, se secuenci el nico clon
positivo segn la digestin del plsmido recombinante (ver anexo Figura 6.3 y 6.4). Al
compararse con la secuencia de las cepas St. Maries (n de acceso del genoma:
gb|CP000030.1|), Florida (n de acceso del genoma: gb|CP001079.1|) e Israel subespecie
centrale (n de acceso del genoma: gb|CP001759.1|) de A. marginale reportadas en el
GenBank, se observaron ocho nucletidos diferentes (posiciones 200, 544, 976, 1003, 1030,
1069, 1078 y 1162), probables errores insertados por la polimerasa Taq (Figura 3.10).
Adems, se encontr que el nucletido 254 es distinto a la cepa St. Maries pero igual al de las
cepas Florida e Israel, el cual gener que el aminocido 86 sea diferente entre la cepa Zulia (en
estudio; aminocido glicina; G) y la cepa St. Maries (aminocido serina; S), el cual pudiera ser
considerado un polimorfismo entre cepas. Adicionalmente, se identificaron otros posibles
polimorfismos: el nucletido 236 difiere de las cepas Florida e Israel pero es igual a la cepa St.
Maries; cinco nucletidos (posiciones 316, 385, 613, 718, 979) distintos a las cepas St. Maries
y Florida, pero iguales a la cepa Israel y un nucletido (posicin 1237) diferente a las cepas St.
Maries e Israel, pero igual en la cepa Florida. Sin embargo, estos cambios no afectaron la
secuencia de aminocidos (Figura 3.11). El codn de inicio del gen fue sustituido en sus dos
primeras bases nucleotdicas (GTG) por las dos ltimas bases de la secuencia de la enzima de
83
restriccin Kpn I (GGTACC), para poder clonar el gen en el vector pThioHisA en su
respectivo marco de lectura abierto, lo que gener un cambio de codn de inicio (CCG) y por
ende el cambio del aminocido valina (V) por prolina (P). Esta secuencia present un
porcentaje de identidad del 99 % de similitud en su secuencia nucleotdica y aminoacdica con
respecto a las tres secuencias de A. marginale.
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
gtccGCGGATTTTCTTCTTTGCTTACGTACTTCCCACCGTCATTTCGCTTCTGTTGGGTTGT
GTGCGGGTTTTCTTCTTTGCTTGCGTGCTTCCTGCGGTTTCCGCGTTTCTACTTTGTTGT
GTGCGGATTTTCTTCTTTGCTTACGTACTTCCCACCGTCATTTCGCTTCTGTTGGGTTGT
GTGCGGATTTTCTTCTTTGCTTACGTACTTCCCACCGTCATTTCGCTTCTGTTGGGTTGT
**** *************** *** ***** * **
** **** * *****
CAGGGAGCTATAGCCGCGCTTGGCGTTGACATCACAAAGGGCAATACCGAAAAGGTTAAG
CAGGGGGCTGTGGCTGCCCTGGGCGTTGACATCACGAAGGGCAATGTTGAAAGGGTTAGG
CAGGGAGCTATAGCCGCGCTTGGCGTTGACATCACAAAGGGCAATACCGAAAAGGTTAAG
CAGGGAGCTGTAGCCGCGCTTGGCGTTGACATCACAAAGGGCAATACCGAAAAGGTTAAG
***** *** * ** ** ** ************** *********
**** ***** *
58
60
60
60
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
ATCTCAGTAGCGCCGATGCATTCTTCCACGAACCTTGAGAAGGAAATAGGAAAGAGTTGC
ATTTCGGTTGCACCTATGCACTCTTCCACGAATCTGGAGAAAGAGGTGGGAAAGAGCTGC
** ** ** ** ** ***** *********** ** ***** ** * ******** ***
178
180
180
180
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
ATCAGAGTGATGCTACGTGATCTAAACAGCACTGGGATATTCGATGCGAGCTGGAAGTTA
GTTAGGGTGGTGTTGCACGATTTGAATAGCACCGGGATATTTGATGCAAGTTGGAAGCTA
ATCAGAGTGATGCTACGTGATTTAAACAGCACTGGGATATTCGATGCGAGCTGGAAGTTA
ATCAGAGTGATGCTACGTGATTTAAACAGCACTGGGATATTCGATGCGAGCTGGAAGCTA
* ** *** ** * * *** * ** ***** ******** ***** ** ****** **
238
240
240
240
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
CCCGCAGGGGGTTTTGGCACCACATCGGAGGGGATGCCTGATTCCAACGCTTGGACGTCT
CCAGCAGGAGGTTTTGGCACCACACCCGAGGGGATGCCCGATTCTGACGCTTGGACATCT
CCCGCAGGGGGTTTTAGCACCACATCGGAGGGGATGCCTGATTCCAACGCTTGGACGTCT
CCCGCAGGGGGTTTTGGTACCACATCGGAGGGGATGCCTGATTCCAACGCTTGGACGTCT
** ***** ****** * ****** * *********** ***** ********** ***
298
300
300
300
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
GTAGCGAAAGACGTCCTGGTAACTGGAAGCATTAAGGAGTTCGCTCAAGGCAGAGTGAAG
GTGGGCAGGGATGTTCTGGTAACCGGAAGCATCAAAGAGTTCTCCCAAGACAGGGTGAAG
GTAGCGAAAGACGTCCTAGTAACTGGAAGCATTAAGGAGTTCGCTCAAGGCAGAGTGAAG
GTAGCGAAAGACGTCCTAGTAACTGGAAGCATTAAGGAGTTCGCTCAAGGCAGAGTGAAG
** * * ** ** ** ***** ******** ** ****** * **** *** ******
358
360
360
360
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
GTAAAGCTGTTCATATGGGACGTGGCTTCAGGTAGGCAGCTGTCCGGCAAATCTTTCAAC
GTCAGGTTATTTATATGGGACGTGGCTTCGGGCAGGCAGTTGTCCGGCAAGTCCTTCAAC
GTAAAGCTGTTCATATGGGACGTGGCCTCAGGTAGGCAGCTGTCCGGCAAATCTTTCAAC
GTAAAGCTGTTCATATGGGACGTGGCCTCAGGTAGGCAGCTGTCCGGCAAATCTTTCAAC
** * * * ** ************** ** ** ****** ********** ** ******
418
420
420
420
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
TTCGCTACGGGAAATTGGCGGCGTGCCGCACACTCTATGTCTGATAGCATATACAGCAGA
TTTGCGGTAGGAAACTGGCGGCGCGCTGCTCACTCTATGTCTGATAGCATATACAGCAGA
** **
***** ******** ** ** ******************************
478
480
480
480
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
ATTACTGGGGAGGGCGGGTATTTCAACACCCGCATAGCGTACGTGGCAGAAACTGGGCTA
ATTACCGGGGAAGGAGGGTATTTCAACACCCGCATAGCATACGTGGCAGAAACAGGATTG
***** ***** ** *********************** ************** ** *
538
540
540
540
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
CCTGGATCCAGGAGAATCGCAATAATGGACCAGGACGGCGCCAATAACATATACATCACC
CCCGGGTCCAGGAGGATCGCGATAATGGACCAGGATGGCGCCAATAATGTGTACATCACC
CCTGGGTCCAGGAGAATCGCAATAATGGACCAGGACGGCGCCAATAACATATACATCACC
CCTGGGTCCAGGAGAATCGCAATAATGGACCAGGACGGCGCCAATAACATATACATCACC
** ** ******** ***** ************** *********** * *********
598
600
600
600
118
120
120
120
84
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
GGCAGGGGGGAGTTTGTCTCCACTCCCAGATTTTCTCCTGACGCGCGGAACCTGGTGTAT
AGCACGGGAGAGTTTGTTTCAACCCCCAGATTCTCTCCCGATGCACGGAGTCTGGTTTAC
GGCAGGGGGGAGTTCGTCTCCACTCCCAGATTTTCTCCTGACGCGCGGAACCTGGTGTAT
GGCAGGGGGGAGTTCGTCTCCACTCCCAGATTTTCTCCTGACGCGCGGAACCTGGTGTAT
*** *** ***** ** ** ** ******** ***** ** ** **** ***** **
658
660
660
660
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
ATGTCGTATGCAAAATCCGGCGGCAGTGTAGTTCTGCATGACCTAGAAACTGGCTACTCA
ATGTCTTATGCAAAATCAAGTGGCAGCATAGTATTGCATGACCTAGAGACTGGTTACTCA
ATGTCGTATGCAAAATCCGGCGGCAGTGTAGTTCTGCATGACCTAGAAACTGGCTACTCG
ATGTCGTATGCAAAATCCGGCGGCAGTGTAGTTCTGCATGACCTAGAAACTGGCTACTCG
***** *********** * ***** **** ************* ***** *****
718
720
720
720
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
ACTGCGCTCGGGGGGGTTAGAGGAGTGAATTCCTCGCCAAGGTTTTCCCCAGATGGCAGG
ACCGCGCTGGGAGGGGTCAGGGGCGTGAATTCTTCCCCCAGGTTTTCCCCGGATGGCAAA
** ***** ** ***** ** ** ******** ** ** *********** *******
778
780
780
780
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
CACGTTTTGCTGTCAGAGTCTGCGCAGGGCTCCACAAACATATACTCGATAGACCTGAAA
CATGTCTTGCTGTCAGAGTCTGCGCAGGGCGCCACAAACATATACTCAATAGACCTGAAA
** ** ************************ **************** ************
838
840
840
840
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
AGTGGGAAGTCTACTCGGCTCACTAATGACAGATCCATAAATACCTCGGCTTCTTATTCG
AGCGGAAAGTCTACCAGGCTAACAAACAACAAATCCATAAATACCTCTGCTTCCTACTCA
** ** ******** **** ** ** *** *************** ***** ** **
898
900
900
900
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
CCGGACAAAAAGTCCATAGTGTTCAACTCAGATAGAAGTGGGAGGCCGCAGCTTTACGTT
CCCGACAAAAAGTCCATAGTGTTTAACTCGGATAGAAGCGGGAGGCCACAGCTTTACGTC
** ******************** ***** ******** ******** ***********
958
960
960
960
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
ATGAATGCGGATGGCACGAATCAGCGCAGAATTAGTTCTGGCAAAGGTGGATATTCTGCC
ATGAATGCGGATGGCACAAATCAGCGTAGAATCAGTTCTGGTAAGGGCGGGTATTCAGCT
ATGAATGCGGATGGCACCAACCAGCGCAGAATTAGTTCTGGCAAGGGTGGATATTCTGCC
ATGAATGCGGATGGCACCAACCAGCGCAGAATTAGTTCTGGCAAGGGTGGATATTCTGCC
***************** ** ***** ***** ******** ** ** ** ***** **
1018
1020
1020
1020
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
CCGGCGTGGTCGCCCAGGGGGGACTGGATAGCCTTTACCAAAACTGAGGGCAAGAGCTTT
CCAGTGTGGTCACCCAGGGGGGATTGGATAGCCTTTACCAAGGCCGATGGGAAAAATTTC
CCGGCGTGGTCACCCAGGGGGGACTGGATAGCCTTTACCAAAACTGAGGGAAAGAGCTTC
CCGGCGTGGTCACCCAGGGGGGACTGGATAGCCTTTACCAAAACTGAGGGAAAGAGCTTC
** * ****** *********** ***************** * ** ** ** * **
1078
1080
1080
1080
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
CACGTGGGGGTTATGAAGCCTGACGGAAGTGGGGAGAGGCTTTTGGCTAAGGGGTACATG
CATATCGGGGTAATGAAACCTGATGGGAGCGGGGAAAGGCTTTTAGCTAAGGGGCACATG
** * ***** ***** ***** ** ** ***** ******** ********* *****
1138
1140
1140
1140
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
GTTGACAGCCCCTCTTGGTCCCCGAATGGCCGGGTGATTCTTTTCACGCAGCAGGATCCT
GTCGACAGCCCCTCATGGTCCCCAAACGGACGTGTGATTCTCTTCACGCAGCAGGATCCT
GTTGACAGCCCCTCTTGGTCCCCAAATGGCCGGGTGATTCTTTTCACGCAGCAGGATCCT
GTTGACAGCCCCTCTTGGTCCCCAAATGGCCGGGTGATTCTTTTCACGCAGCAGGATCCT
** *********** ******** ** ** ** ******** ******************
1198
1200
1200
1200
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
CCATCTGCAACCCATCCGTTCAGGTCTAGGCTCGTAACTGTCGATATAACTGGCACCAAC
CCGTCCGCAACCCATCCTTTCAGGTCCAGACTGGTAACCGTTGACATAACGGGCACCAAC
CCATCTGCAACCCATCCGTTCAGGTCTAGGCTCGTAACCGTCGATATAACTGGCACCAAC
CCATCTGCAACCCATCCGTTCAGGTCTAGGCTCGTAACTGTCGATATAACTGGCACCAAC
** ** *********** ******** ** ** ***** ** ** ***** *********
1258
1260
1260
1260
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
ACACAGATTTTGGATGTCCCGACCAATGCTTCCAACGCCCATTGGTCGCCTGTACTACGC
ACACAGACTTTGGATGTTCCAACCAATGCTTCGAACGCACACTGGTCGCCCGTGTTACGC
******* ********* ** *********** ***** ** ******** ** *****
1318
1320
1320
1320
85
A.marg
A.cent
A.marg
A.marg
ZU
IS
SM
FL
GAGTAG
GAATAG
GAGTAG
GAGTAG
** ***
1324
1326
1326
1326
estudio) con las cepas St. Maries (SM; n de acceso del genoma: gb|CP000030.1|; rango: 170363 hasta 170950;
hebra complementaria), Florida (FL; n de acceso del genoma: gb|CP001079.1|; rango: 169549 hasta 170136;
hebra complementaria) e Israel subespecie centrale (IS; n de acceso del genoma: gb|CP001759.1|; rango:
1079198 hasta 1079785) de A. marginale, por Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Los
asteriscos (*) sealan todos los nucletidos iguales entre las cepas; los espacios indican los nucletidos diferentes
entre las cepas. Los nucletidos resaltados en amarillo son errores introducidos por la polimerasa Taq, los
resaltados en verde pertenecen a la secuencia reportada en el Genbank, los cuales fueron sustituidos por los dos
nucletidos resaltados en fucsia que pertenecen a la enzima de restriccin Kpn I (GGTACC), con la finalidad de
que la secuencia estuviera en marco de lectura abierto con el codn de inicio del vector pThioHisA al momento
de su clonacin, los resaltados en rojo probablemente sean un polimorfismo entre cepas y los resaltados en gris es
el codn de inicio. (Figura en la pgina anterior).
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
VPRIFFFAYVLPTVISLLLGCQGAIAALGVDITKGNTEKVKISVAPMHSSTNLEKEIGKSC
VRIFFFAYVLPTVISLLLGCQGAIAALGVDITKGNTEKVKISVAPMHSSTNLEKEIGKSC
VRIFFFAYVLPTVISLLLGCQGAVAALGVDITKGNTEKVKISVAPMHSSTNLEKEIGKSC
VRVFFFACVLPAVSAFLLCCQGAVAALGVDITKGNVERVRISVAPMHSSTNLEKEVGKSC
*:**** ***:* ::** ****:***********.*:*:***************:****
59
60
60
60
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
IRVMLRDLNSTGIFDASWKLPAGGFGTTSEGMPDSNAWTSVAKDVLVTGSIKEFAQGRVK
IRVMLRDLNSTGIFDASWKLPAGGFSTTSEGMPDSNAWTSVAKDVLVTGSIKEFAQGRVK
IRVMLRDLNSTGIFDASWKLPAGGFGTTSEGMPDSNAWTSVAKDVLVTGSIKEFAQGRVK
VRVVLHDLNSTGIFDASWKLPAGGFGTTPEGMPDSDAWTSVGRDVLVTGSIKEFSQDRVK
:**:*:*******************.**.******:*****.:***********:*.***
119
120
120
120
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
VKLFIWDVASGRQLSGKSFNFATGNWRRAAASMSDSIYSRITGEGGYFNTRIAYVAETGL
VRLFIWDVASGRQLSGKSFNFAVGNWRRAAASMSDSIYSRITGEGGYFNTRIAYVAETGL
*:********************.*************************************
179
180
180
180
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
PGSRRIAIMDQDGANNIYITGRGEFVSTPRFSPDARNLVYMSYAKSGGSVVLHDLETGYS
PGSRRIAIMDQDGANNVYITSTGEFVSTPRFSPDARSLVYMSYAKSSGSIVLHDLETGYS
****************:***. **************.*********.**:**********
239
240
240
240
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
TALGGVRGVNSSPRFSPDGRHVLLSESAQGSTNIYSIDLKSGKSTRLTNDRSINTSASYS
TALGGVRGVNSSPRFSPDGKHVLLSESAQGATNIYSIDLKSGKSTRLTNNKSINTSASYS
*******************:**********:******************::*********
299
300
300
300
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
PDKKSIVFNSDRSGRPQLYVMNADGTNQRRISSGKGGYSAPAWSPRGDWIAFTKTEGKSF
PDKKSIVFNSDRSGRPQLYVMNADGTNQRRISSGKGGYSAPVWSPRGDWIAFTKADGKNF
*****************************************.************::**.*
359
360
360
360
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
HVGVMKPDGSGERLLAKGYMVDSPSWSPNGRVILFTQQDPPSATHPFRSRLVTVDITGTN
HIGVMKPDGSGERLLAKGHMVDSPSWSPNGRVILFTQQDPPSATHPFRSRLVTVDITGTN
*:****************:*****************************************
419
420
420
420
86
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
SM
FL
IS
TQILDVPTNASNAHWSPVLRE
TQTLDVPTNASNAHWSPVLRE
** ******************
440
441
441
441
Figura 3.11. Alineacin de las secuencias aminoacdicas de la protena AM244 de A. marginale cepa Zulia (ZU;
en estudio) con las cepa St. Maries (SM; n de acceso: ref|YP_153606.1|), Florida (FL; n de acceso:
ref|YP_002563315.1|) e Israel subespecie centrale (IS; n de acceso: ref|YP_003328842.1|) de A. marginale, por
Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Los asteriscos (*) sealan todos los aminocidos
iguales entre las cepas; los puntos (.), los dos puntos (:) y los espacios indican los aminocidos diferentes entre
las cepas. El aminocido resaltado en verde pertenece a la secuencia reportada en el Genbank, el cual fue
sustituido por el aminocido resaltado en fucsia que pertenecen a la enzima de restriccin Kpn I, con la finalidad
de que la secuencia estuviera en marco de lectura abierto y los resaltados en rojo probablemente sean un
polimorfismo entre cepas.
3.- Para el gen AM573 en el vector pMal-p4x, solo se secuenciaron los clones 1 al 4 y
al compararse con la secuencia de las cepas St. Maries (n de acceso del genoma:
gb|CP000030.1|), Florida (n de acceso del genoma: gb|CP001079.1|) e Israel subespecie
centrale (n de acceso del genoma: gb|CP001759.1|) de A. marginale reportadas en el
GenBank, se detect que el clon 1 difera en dos nucletidos con la cepa St. Maries y en un
nucletido con la cepa Florida, presentando un 99 % de similitud en su secuencia nucleotdica
con la de estas cepas. Adicionalmente, present treinta y dos nucletidos distintos al alinearla
con la cepa Israel, lo que represent un 83 % de similitud en su secuencia nucleotdica con la
de esta cepa (datos no mostrados). En cuanto a la secuencia aminoacdica, se hall un
aminocido diferente al compararla con las cepas St. Maries y Florida (98 % de similitud) y
nueve aminocidos distintos en la cepa Israel (86 % de similitud) (datos no mostrados). Los
clones del 2 al 4, los cuales tenan la misma secuencia nucleotdica entre ellos (datos no
mostrados), solo diferan en un nucletido (posicin 102) con la cepa St Maries, pero no
gener cambio de aminocidos, presentando un 99 % y 100 % de similitud en sus secuencias
nucleotdicas y aminoacdicas, respectivamente, con la cepa St. Maries. Sin embargo, con las
otras dos cepas, Florida e Israel de A. marginale present un 100 % de similitud tanto en la
secuencia nucleotdica como en la aminoacdica (Figura 3.12 y 3.13), por lo que se decidi
trabajar solo con los clones del 2 al 4, escogindose el clon 2 para realizar el estudio (ver
anexos, Figura 6.5).
Estos resultados demuestran que probablemente existen polimorfismos de un solo

nucletido (SNP, del ingls Single nucleotide polymorphisms) en los genes AM202, AM244 y
87
AM573 entre las diferentes cepas de A. marginale, los cuales no generan cambios en la
secuencia aminoacdica de los productos peptdicos codificados por estos genes. Vale la pena
destacar que los codones de inicio de la traduccin de los genes AM202, AM244 y AM573 son
ATG, GTG y TTG, respectivamente, los cuales son usados con una frecuencia del 83
%, 14 % y 3 % en bacterias, respectivamente (Blattner y col., 1997). Por otro lado, el anlisis
del uso frecuente de codones (usage de codones) por E. coli para la expresin de los genes de
inters, arroj un 8 % de codones raramente usados por la bacteria para la expresin de las
protenas AM202 y AM573 (ver anexos, Figura 6.6 y 6.8) y un 9 % para la protena AM244
(ver anexos, Figura 6.7); razn por la cual se decidi transformar, entre otras bacterias, las E.
coli cepa BL21 Rosetta, las cuales proporcionan los ARNt raramente usados por E. coli para la
expresin de protenas (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania; 2013).
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
FL
SM
IS
-------------------------------------------TTGGG--GATA------------------------------------------------TTGGG--GATA------------------------------------------------TTGGG--GATA-----GGTGTGATACCCGGAAACACATATAAAAGTAATCCGCAAGACGTTAAGACGATATCAGTG
**
9
9
9
780
****
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
FL
SM
IS
---------ATGTACGCTACAACTGCGCTATCAGACGAGATGGCATATGCGGTGGTGAAA
CGGGCTTCTATATATGCTACAACTGCGCTATCAGATGAGATAGCATATGCGGTAGTGAAG
** ** ******************** ***** *********** *****
60
60
60
840
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
FL
SM
IS
TCCGTTGCGTCTCATATTGACAGATTTCGTGAGCTTAGCGGTGCTCTGCGGAAACTTGTA
TCCGTTGCGTCTCATATTGACAGATTTCGTGAGCTTAGCGGTGCTCTGCGGAAACTTGTA
TCCGTTGCGTCTCATATTGACAGATTTCGTGAGCTTAGCGGCGCTCTGCGGAAACTTGTA
TCAGTCGCATCTAATATCGATAGATTTCGTGAGCTTAGCGGTGCTCTGCGGAAACTCACA
** ** ** *** **** ** ******************** **************
*
120
120
120
900
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
FL
SM
IS
CTCAGAGATCTGGTAACCAGTGGTAGTGCGGTTCCGCTGCACGACGGCGCAGCACGCTTT
CTTAAGGATCTGGTGACTAGCGGTAGCGCGGTCCCGCTACACAACGGTGCAGCGCGCTTC
** * ******** ** ** ***** ***** ***** *** **** ***** *****
180
180
180
960
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
ZU
FL
SM
IS
TACAGAGAAGTAGGCATGTTGAAATAG
TACGAGGAAATCGGAATGTTGCATTAG
***
*** * ** ****** * ***
207
207
207
987
estudio) con las cepas St. Maries (SM; n de acceso del genoma: gb|CP000030.1|; rango: 170363 hasta 170950;
hebra complementaria), Florida (FL; n de acceso del genoma: gb|CP001079.1|; rango: 169549 hasta 170136;
hebra complementaria) e Israel subespecie centrale (IS; n de acceso del genoma: gb|CP001759.1|; rango:
1079198 hasta 1079785; hebra complementaria) de A. marginale, por Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Los asteriscos (*) sealan todos los nucletidos iguales entre las
cepas; los espacios indican los nucletidos diferentes entre las cepas. Los nucletidos resaltados en rojo
probablemente sean un polimorfismo entre cepas y los resaltados en gris es el codn de inicio.
88
Una vez seleccionados los clones, los plsmidos recombinantes fueron extrados y
utilizados para transformar las cepas E. coli correspondientes a cada vector de expresin, con
la finalidad de obtener las protenas recombinantes. En el caso del vector pMal-p4x, se
utilizaron como hospederos las cepas K12, K12 ER2508 y BL21 Rosetta. Para el vector
pThioHis A se utiliz la cepa BL21 Rosetta y TOP 10. Previo a la transformacin de estas
bacterias, las mismas se hicieron competentes mediante el protocolo descrito por Glover y
Hames (1995), teniendo una eficiencia de transformacin de 2,5 x 106 UFC/g/ml para las E.
coli K12; 1,6 x 105 UFC/g/ml para las E. coli K12 ER2508; 2 x 106 UFC/g/ml para las E.
coli BL21 Rosetta y 8,4 x 105 UFC/g/ml para las E. coli TOP 10.
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
--------------------LGIMYATTALSDEMAYAVVKSVASHIDRFRELSGALRKLV
GVIPGNTYKSNPQDVKTISVRASIYATTALSDEIAYAVVKSVASNIDRFRELSGALRKLT
. :*********:**********:**************.
A.marg
A.marg
A.marg
A.cent
SM
FL
ZU
IS
LRDLVTSGSAVPLHDGAARFYREVGMLK
LKDLVTSGSAVPLHNGAARFYEEIGMLH
*:************:******.*:***:
40
40
40
300
68
68
68
328
Figura 3.13. Alineacin de las secuencias aminoacdicas de la protena AM573 de A. marginale cepa Zulia (ZU;
en estudio) con las cepa St. Maries (SM; n de acceso: ref|YP_153839.1|), Florida (FL; n de acceso:
ref|YP_002563545.1|) e Israel subespecie centrale (IS; n de acceso: ref|YP_003328619.1|) de A. marginale, por
Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Los asteriscos (*) sealan todos los aminocidos
iguales entre cepas; los puntos (.), los dos puntos (:) y los espacios indican los aminocidos diferentes entre
cepas.
3.5. Expresin de las protenas recombinantes AM202, AM244 y AM573.
Una vez que se transformaron las cepas de E. coli ya competentes, con los plsmidos
recombinantes se procedi a la expresin de los productos peptdicos de inters. En el caso de
las protenas AM202 y AM573 de A. marginale, estas se expresaron unidas a la protena de
fusin MBP, contenida en el vector pMal-p4x, y la protena AM244, unida a la protena de
fusin HP-Tiorredoxina, incluida en el vector pThioHis A.
La expresin de las protenas MBP-AM202r y MBP-AM573r se realiz segn el

protocolo descrito por la casa comercial New England Biolabs (New England Biolabs, USA) e
Invitrogen (Invitrogen, USA) para la protena Thio-AM244r. La expresin de dichas protenas
se realiz a dos temperaturas diferentes de crecimiento bacteriano (37 C y 16 C) en
89
diferentes cepas hospederas de E. coli, con la finalidad de conocer cul es la mejor
temperatura y cepa hospedera en la que se obtiene mayor solubilidad y rendimiento en la
produccin de las protenas recombinantes. De esta manera, se determin que la temperatura
de crecimiento bacteriano adecuada para la expresin de cada protena fue de 16 C por 20
horas post-induccin y la mejor cepa hospedera fue la K12 ER2508 para los genes AM202 y
AM573 clonados en el vector pMal-p4x (Figura 3.14) y la cepa TOP 10 para el gen AM244
clonado en el vector pThioHis A (Figura 3.15).
Estos resultados se obtuvieron a travs del anlisis de las muestras del control no
inducido (T0) y las del control inducido (T20) a 16 C, tanto de los vectores de expresin sin
inserto (control negativo) como el de los plsmidos recombinantes, por SDS-PAGE
empleando un gel de poliacrilamida al 10 % para los genes clonados en el vector pMal-p4x y
del 12 % para el gen clonado en el vector pThioHisA. Este gel de poliacrilamida fue utilizado
para transferir las protenas a una membrana de nitrocelulosa y as realizar la inmunotincin,
los cuales fueron revelados por quimioluminiscencia.
Para la inmunotincin de las protenas MBP-AM202r y MBP-AM573r se utiliz el

anticuerpo monoclonal Anti-MBP2 (New England Biolabs, USA); obtenindose bandas de
aproximadamente 70 kDa y 50 kDa, respectivamente, tanto en el sobrenadante como en el
sedimento, lo cual indica la expresin de dichas protenas dado que estas bandas no estn
presentes en el control negativo (Figura 3.14 B). Estos pesos moleculares corresponden a la
sumatoria del peso molecular de la protena de fusin MBP (42 kDa) ms el peso molecular
terico de la protena AM202 (21 kDa) y AM573 (7,4 kDa), respectivamente. Sin embargo, en
el caso de la MBP-AM202r, la banda tiene un peso mayor al esperado, probablemente debido
a su hidrofobicidad por ser una protena de membrana externa. Asimismo, se observ en la
inmunotincin de la expresin de ambas protenas recombinantes (AM202 y AM573) la
presencia de bandas de menor peso molecular, entre ellas la MBP, lo que indica la
degradacin de ambas protenas.
90
A
kDa
150
100
75
50
MBP-AM202r
MBP-AM573r
MBP
37
25
150
100
75
MBP-AM202r
50
37
MBP-AM573r
MBP
25
Figura 3.14. Inmunotincin de las protenas MBP-AM202r y MBP-AM573r expresadas en el vector pMal-p4x a 16 C.
Membrana de nitrocelulosa teida con rojo Ponceau (A) e Inmunotincin con anti-MBP (B). Carriles 1-3: Sobrenadante
T0 del vector pMal-p4x, de las protenas MBP-AM202r y MBP-AM573r; Carriles 4-6: Sobrenadante T20 del vector
pMal-p4x, de las protenas MBP-AM202r y MBP-AM573r; Carriles 7-9: Sedimento T0 del vector pMal-p4x, de las
protenas MBP-AM202 y MBP-AM573; Carriles 10-12: Sedimento T20 del vector pMal-p4x, de las protenas MBPAM202 y MBP-AM573. Estas muestras fueron separadas en un gel de SDS-PAGE al 10 % y transferida a una membrana
de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con el anticuerpo primario anti-MBP (dilucin 1:10000) y se detect
la unin antgeno-anticuerpo utilizando el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo (dilucin 1:10000) conjugado a
peroxidasa y quimioluminiscencia.
En el caso de la inmunodeteccin de la protena Thio-AM244r, se emple el anticuerpo

policlonal anti-Tiorredoxina. Como resultado se obtuvo una banda de aproximadamente 60
kDa, tanto en el sobrenadante como en el sedimento, considerndose esta banda como la
protena de inters, por coincidir con el peso esperado y por no estar presente en el control
negativo (Figura 3.15 B). Este peso molecular representa la sumatoria de la protena de fusin
HP-Tiorredoxina (16 kDa) ms el peso molecular terico de la protena AM244 (48 kDa).
Adicionalmente, se observa una banda de aproximadamente 16 kDa, en el sobrenadante y en
el sedimento del vector pThioHis A, correspondiente a la protena de fusin HP-Tiorredoxina.
91
A
kDa
150
100
75
Thio-AM244r
50
37
25
20
B
kDa
150
100
75
50
Thio-AM244r
37
25
20
HP-Tiorredoxina
Figura 3.15. Inmunotincin de la protena Thio-AM244r expresada en el vector pThioHis A a 16 C. Gel

de SDS-PAGE teido con Azul de Coomasie (A) e Inmunotincin con anti-Tiorredoxina (B). Carriles 1-2:
Sobrenadante T0 del vector pThioHis A y la protena Thio-AM244r; Carriles 3-4: Sedimento T0 del
vector pThioHis A y de la protena Thio-AM244r; Carriles 5-6: Sobrenadante T20 del vector pThioHis A
y de la protena Thio-AM244r; Carriles 7-8: Sedimento T20 del vector pThioHis A y de la protena ThioAM244r. Estas muestras fueron separadas en un gel de SDS-PAGE al 10 % y transferida a una membrana
de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con el anticuerpo primario anti-Thio (dilucin
1:20000) y se detect la unin antgeno-anticuerpo utilizando el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo
(dilucin 1:10000) conjugado a peroxidasa y quimioluminiscencia.
En vista de que las protenas de inters se encuentran en el sobrenadante y en el

sedimento, se prefiri trabajar con la porcin soluble, es decir, con el sobrenadante, para su
posterior purificacin.
92
3.6. Purificacin de las protenas recombinantes AM202, AM244 y AM573.
Una vez estandarizada las condiciones de expresin de las tres protenas de inters, se
procedi a su produccin a gran escala para la purificacin de las mismas. Para ello, se utiliz
la porcin soluble (sobrenadante) de las muestras como se mencion anteriormente. A las
fracciones obtenidas en el proceso de purificacin se les midi su absorbancia a 280 nm con el
espectrofotmetro Smart Spec 3000 (BioRad, USA), para generar curvas de elucin de la
cromatografas y poder identificar las fracciones donde se encontraban la mayores
concentraciones de las protenas purificadas (Figuras 3.16, A y B).
De las tres protenas, solo se logr la purificacin de las protenas MBP-AM202r y

MBP-AM573r (Figuras 3.16 y 3.17) y no se consigui la purificacin de la protena ThioAM244r, ya que esta ltima no se uni a la resina ProBond (cromatografa de afinidad a
niquel). Posiblemente, esto ltimo ocurri, debido a que esta protena es muy hidrofbica y
pudo haber cambiado la conformacin de la protena de fusin HP-Tiorredoxina, ocultando el
sitio de unin de esta ltima a la resina; o quizs por la presencia de 10 mM de Imidazole en la
solucin de unin. Por lo tanto, no se logr estandarizar la purificacin y se decidi trabajar
con la protena Thio-AM244r presente en el sedimento, por contener menor cantidad de
protenas inespecficas, lo cual es una ventaja porque la purificacin no se puede hacer en
condiciones desnaturalizante debido a que se afecta la estructura tridimensional de la protena
de fusin, impidiendo as su purificacin mediante la resina Pro Bond. A esta muestra se le
determin la concetracin de protenas mediante el mtodo de Bradford, obtenindose un
valor de 340 g/ml, con un rendimiento de 2 mg por litro de cultivo inicial de E. coli.
Una vez purificadas las protenas MBP-AM202r y MBP-AM573r, se verific su

presencia en las diferentes fracciones obtenidas, mediante geles de SDS-PAGE (Figura 3.16 B
y 3.17 B). En este gel se observ que la purificacin fue parcial, ya que quedaron algunas
protenas inespecficas. Sin embargo, se observan las protenas de inters de aproximadamente
70 kDa (MBP-AM202r) y 50 kDa (MBP-AM573r).
93
A
Purificacin de AM202-MBP2 a 37C
Curva de elucin(1lt
dedeMBP-AM202r
LB)
Absorbancia
0,5
0,4
0,3
Abs 280 nm
0,2
0,1
0
38
40
42
44
46
48
50
52
54
56
58
60
62
64
66
68
Fracciones
B
1
kDa
9 10 11 12 13 14
250
150
100
75
MBP-AM202r
50
MBP
37
25
20
kDa
120
100
80
9 10 11 12 13 14
MBP-AM202r
60
50
MBP
40
30
20
Figura 3.16. Purificacin de la protena MBP-AM202r. Curva de elucin a 280 nm de la purificacin de la protena
MBP-AM202r (A). Gel de SDS-PAGE teido con Azul de Coomasie (B). Inmunotincin con el anticuerpo primario
anti-MBP y detectada por quimioluminiscencia (C). Carril 1: Lo que no se uni a la resina de amilosa; Carril 2:
Lavado; Carriles 3-14: Fracciones 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 y 64. A estas fracciones se les midi su
absorbancia a 280 nm y las fracciones que contenan la mayor cantidad de protenas fueron separadas por un gel de
SDS-PAGE al 10 % y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con el
anticuerpo primario anti-MBP (dilucin 1:10000) y se detect la unin antgeno-anticuerpo con el anticuerpo
secundario anti-IgG de conejo (dilucin 1:10000) conjugado a peroxidasa y quimioluminiscencia.
94
A
Purificacin
30C
Curva de
elucin dede
deAM573-MBP2
MBP-AM573r
(3lt de LB)
Absorbancia
1
0,8
0,6
Abs 280 nm
0,4
0,2
50
48
46
44
42
40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
Fracciones
B
1
7 8
9 10 11 12 13 14
kDa
75
50
MBP-AM573r
MBP
37
25
kDa
9 10
11 12
13 14
100
5
75
50
37
MBP-AM573r
MBP
25
15
Figura 3.17. Purificacin de la protena MBP-AM573r. Curva de elucin a 280 nm de la purificacin de la protena
MBP-AM573r (A). Gel de SDS-PAGE teido con Azul de Coomasie (B). Inmunotincin con el anticuerpo primario
anti-MBP detectada por quimioluminiscencia (C). Carril 1: Lo que no se peg a la resina amilosa; Carril 2: Lavado;
Carriles 3-14: Fracciones 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 y 50. A estas fracciones se les midi su absorbancia
a 280 nm y las fracciones que contenan la mayor cantidad de protenasfueron separadas por un gel de SDS-PAGE al
10 % y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con el anticuerpo primario
anti-MBP (dilucin 1:10000) y se detect la unin antgeno-anticuerpo con el anticuerpo secundario anti-IgG de
conejo (dilucin 1:10000) conjugado a peroxidasa y quimioluminiscencia.
95
A estas mismas muestras se les realiz una Inmunotincin con el anticuerpo antiMBP2 (Figura 3.16 C y 3.17 C). Se obtuvieron las mismas bandas de aproximadamente 70
kDa y 50 kDa que fueron observadas en el gel teido con Azul de Coomasie, adems de otras
bandas de menor peso molecular, incluyendo la protena MBP (42 kDa), indicando que las
protenas de inters se estn degradando.
Posteriormente, se unieron las fracciones donde se encontraban cada una de las

protenas recombinantes, se concentr la muestra, luego se dializaron para eliminar el exceso
de sales y finalmente, se les determin la concentracin de protenas mediante el mtodo de
Bradford, obtenindose 170 g/ml para MBP-AM202r y 150 g/ml para MBP-AM573r,
dando un rendimiento de 1 mg y 0,9 mg de protenas totales en 1 litro de cultivo inicial de E.
coli, respectivamente. Estas muestras fueron almacenadas a -80C para anlisis posteriores.
3.7. Reactividad serolgica del suero inmune de bovinos infectados experimentalmente

con A. marginale, contra las protenas recombinantes AM202, AM244 y AM573.
Una vez obtenidas las protenas AM202r y AM573r parcialmente purificadas, junto
con la protena AM244r (no purificada), estas protenas fueron utilizadas para evaluar la
respuesta serolgica del suero de bovino infectado experimentalmente con A. marginale,
contra estas protenas recombinantes.
Para ello, se realiz previamente la titulacin de los sueros de bovinos infectados con
A. marginale, antes absorbidos con E. coli, empleando la MSP5r (donado por la Lic. Vanesa
Celma del Laboratorio de Bioqumica e Inmunologa de Hemoparsitos, USB) mediante una
inmunotincin. Los ttulos alcanzados fueron de 100. Luego, se realiz otra Inmunotincin
empleando estos sueros inmunes ya titulados y previamente absorbidos con E. coli para
evaluar la reactividad de estos con las protenas recombinantes AM202, AM244 y AM573.
Los resultados obtenidos indican que ninguno de estos sueros (Bovinos 9236, 9239,
9241 y 9250) reaccion con estas tres protenas recombinanes, pero si con el control positivo,
MSP5r (Figura 3.18 y 3.19), cuyo peso molecular es de aproximadamente 22 kDa (3 kDa de la
96
cola de seis Histidinas mas 19 kDa de la MSP5 nativa), la cual es utilizada para el diagnstico
de la Anaplasmosis Bovina (Reyna-Bello y col., 1998; Torioni y col., 1998).
1
kDa
150
100
70
50
40
MBP-AM202r
MBP
30
MSP5r
20
15
Bov 9236
Bov 9239
Bov 9241
Bov 9250
Ponceau
Figura 3.18. Reactividad serolgica de los bovinos infectados experimentalmente con A. marginale a la protena
MBP-AM202r. Carril 1: protena MBP; Carril 2: lisado del vector pMal-p4x en E. coli K12 ER2508; Carril 3:
protena MBP-AM202r; Carril 4: protena MSP5r. Estas muestras fueron separadas por un el de SDS-PAGE al
12 % y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con los sueros inmunes
de bovinos (dilucin 1:100) y se detect la unin antgeno-anticuerpo empleando el anticuerpo secundario antiIgG de bovino (dilucin 1:10000) conjugado a peroxidasa y quimioluminiscencia.
En el carril 3 se observa una banda de aproximadamente 42 kDa, correspondiente a la

protena MBP, producto de la degradacin de la MBP-AM573r (Figura 3.19), probablemente
sea una reaccin inespecfica producto de que estos animales hayan estado infectados en algn
momento con E. coli, siendo reconocida en esta muestra y no en las dems por encontrarse en
mayor proporcin. As mismo, las otras bandas que se observan en los carriles
correspondientes a las E. coli K12 ER2508, TOP 10 y Thio-AM244r (Figura 3.19),
corresponden a reacciones inespecficas por las razones explicadas anteriormente. No hubo
reaccin de los sueros preinmunes de estos mismos animales, ni de los controles negativos
(Bovinos 9131, 9235, 9244 y 9246), con ninguno de los antgenos evaluados (datos no
mostrados).
Estos resultados sugieren que las protenas AM202, AM244 y AM573 probablemente
no generaron una respuesta humoral en el bovino en su forma nativa, ya que no se encontraron
anticuerpos contra estas protenas en los sueros de los bovinos infectados experimentalmente
con la rickettsia, por lo que se procedi a determinar la ubicacin de dichas protenas en la
bacteria, a travs de una inmunotincin empleando el lisado y membrana externa de A.
97
marginale el cual fue enfrentado con los anticuerpos policlonales producidos en animales de
experimentacin (ratones BALB/c y conejos Nueva Zelanda) contra las protenas
recombinantes.
A
kDa
75
50
Thio-AM244r
MBP-AM573r
37
MBP
25
MSP5r
20
6 1
kDa
75
50
MBP
37
25
MSP5r
20
Bov 9236
Bov 9239
Bov 9241
Bov 9250
Figura 3.19. Reactividad serolgica de los bovinos infectados experimentalmente con A. marginale a las protenas
MBP-AM573r y Thio-AM244r. Membrana de nitrocelulosa teida con Ponceau (A) e Inmunotincin (B). Carril 1:
protena MBP; Carril 2: lisado de E. coli K12 ER2508; Carril 3: protena MBP-AM573r; Carril 4:lisado de E. coli
TOP10; Carril 5: protena Thio-AM244r; Carril 6: MSP5r. Estas muestras fueron separadas por un gel de SDSPAGE al 12 % y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con los sueros
inmunes de bovinos (dilucin 1:100) y se detect la unin antgeno-anticuerpo con el anticuerpo secundario antiIgG de bovino (dilucin 1:10000) conjugado a peroxidasa y quimioluminiscencia.
3.8. Aislamiento de cuerpos iniciales y membrana externa de A. marginale.
Para realizar la inmunodeteccin de las protenas AM202, AM244 y AM573 en A.

marginale, es necesario purificar previamente los cuerpos iniciales de la rickettsia (aislado
Zulia) de la sangre de bovinos infectados con A. marginale, la cual presentaba una bacteriemia
98
del 22 % (1,34 x 109 clulas/ml). Este procedimiento se realiz empleando el protocolo
descrito por Noh y colaboradores (2008) detallado anteriormente, el cual esta basado en la
sonicacin y centrifugacin del material de la rickettsia para la separacin de los cuerpos
iniciales y de la membrana externa.
Para corroborar que la muestra contena el material de A. marginale, se realiz una

Inmunotincin con el suero de bovinos infectados experimentalmente con la rickettsia (Figura
3.20). Como resultado, se identificaron algunas de las protenas de membrana caractersticas
de A. marginale, entre ellas estn la MSP5 (19 kDa), la cual se detect en el material insoluble
de membrana (Carril 5), la MSP4 (31 kDa), en la porcin soluble despus de la sonicacin de
la rickettsia (Carril 4) y la MSP2 (36 kDa), en todos los carriles correspondientes al material
de la rickettsia (Carriles 1, 2, 3, 4).
1
kDa
MSP1a-b
75
50
37
MSP2
w5
MSP4
5
MSP5r
25
20
25 kDa
MSP5r
MSP5
Bov 9250 (+)
Bov 9246 (-)
Ponceau
Figura 3.20. Reactividad serolgica de bovinos infectados experimentalmente con A. marginale a

las protenas de esta rickettsia. Carril 1: Lisado de A. marginale; Carril 2: Porcin soluble de las
protenas de membranas de A. marginale extrado con CHAPS al 4%; Carril 3: Porcin insoluble
de las protenas de A. marginale; Carril 4: material soluble despus de la sonicacin de la rickettsia;
Carril 5: Membrana de eritrocitos; Carril 6: protena MSP5 recombinante (MSP5r). Estas muestras
fueron separadas por un gel de SDS-PAGE al 12 % y transferidas a una membrana de
nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con el suero inmune (Bov 9250) y pre inmune
(Bov 9246) de bovino (dilucin 1:100) y se detect la unin antgeno-anticuerpo con el anticuerpo
secundario anti-IgG de bovino (dilucin 1:10000) conjugado a peroxidasa y quimioluminiscencia.
En la muestra que contena las membranas de eritrocitos (Carril 5) se observaron unas

bandas de aproximadamente 36 kDa y 31 kDa, las cuales pudieran corresponder a las
protenas MSP2 y MSP4, lo que sugiri que probablemente no hubo una buena separacin del
99
material de la rickettsia y las membranas de los hemates, lo que quizs pudo haberse
minimizado empleando gradientes para este proceso de separacin. El control positivo
(MSP5r) fue reconocido (carril 6), certificando la presencia de anticuerpos contra A.
marginale. En la Inmunotincin no se observaron las dupletas de la MSP1a (105 kDa) y la
MSP1b (100 kDa), ni la de 25 kDa reportadas por Noh y colaboradores (2008), pero si se
observaron en la nitrocelulosa teida con Ponceau (carril 3). Las otras bandas observadas tanto
en el Bovino 9250 como en el Bovino 9246 son reacciones inespecficas.
Una vez obtenido el material de la rickettsia A. marginale, se procedi a identificar las

protenas AM202, AM244 y AM573 en este material, empleando anticuerpos policlonales
realizados en ratones BALB/c y conejos Nueva Zelanda (Oryctologus cuniculus) contra las
protenas recombinantes
3.9. Verificacin de la presencia de las protenas AM202, AM244 y AM573 en A.

marginale.
Una vez expresadas y parcialmente purificadas las protenas MBP-AM202r y MBPAM573r, se procedi a producir anticuerpos contra ellas en lquidos ascticos de ratones
BALB/c y en el caso de la protena Thio-AM244r, la cual no pudo ser urificada, se produjo
anticuerpos contra esta protena en el suero de conejos Nueva Zelanda, como se describi
anteriormente.
Vale la pena destacar que al inocular los ratones con las protenas Thio-AM244r y
MBP-AM573r contenidas en un trozo de gel de poliacrilamida, causaron la muerte de los
ratones, experimento que se realiz dos veces obteniendo los mismo resultados. sto no
sucedi con la protena MBP-AM202r, la cual fue inoculada en los ratones en las mismas
condiciones que la Thio-AM244r y MBP-AM573r, por lo tanto se podra descartar la muerte
de los ratones por el efecto txico de la acrilamida. Probablemente las protenas Thio-AM244r
y MBP-AM573r son las que causen la muerte de los ratones, quizs debido a que dichas
protenas recombinantes son txicas para estos animales de experimentacin en comparacin
con la MBP-AM202r. Por tal motivo, se tuvo que inocular a los ratones con la MBP-AM573r
parcialmente purificada en su solucin tampn (20 mM Tris-HCl pH 8; 100 mM NaCl y 6 mM
100
CaCl2) y la Thio-AM244r en conejos, contenida en un trozo de poliacrilamida, que por ser los
conejos de mayor tamao son un poco mas resistentes a los posibles efectos txicos de la
protena Thio-AM244r y de la acrilamida. De esta manera los animales de experimentacin no
murieron y tanto el lquido asctico de los ratones inoculados con la MBP-AM573r como el
suero de los conejos inmunizados con la Thio-AM244r, fueron utilizados en ensayos
posteriores. La protena MBP-AM573r no se inocul en conejo porque no se contaba con
suficiente protena recombinante.
Una vez obtenido el lquido asctico de los ratones y el suero de conejo (previamente
absorbido con E. coli) fueron titulados mediante una inmunotincin utilizando cada una de las
protenas recombinantes correspondientes y luego fueron utilizados para la inmunodeteccin
de las protenas AM202, AM244 y AM573 en el material de A. marginale.
Los ttulos alcanzados para MBP-AM202r (lquido asctico) y Thio-AM244r (suero de

conejo) fueron de 100 y para MBP-AM573r (lquido asctico) fue de 200 (datos no
mostrados). Estos lquidos ascticos de ratones y sueros de conejos de cada una de las
protenas recombinantes se enfrentaron al material de A. marginale, aislado de eritrocitos de
bovinos infectados con la rickettsia. Estos anticuerpos primarios contra cada una de las
protenas recombinantes, reconocieron solo sus respectivos antgenos recombinantes (Figura
3.21, 3.22 y 3.23) y por ende sus respectivas protenas de fusin, la MBP (42 kDa, Figura 3.15
y 3.16) y la HP-Tiorredoxina (13 kDa, Figura 3.23). No se observaron bandas que
correspondieran solo a las protenas AM202 (21 kDa), AM244 (48 kDa) y AM573 (7.4 kDa)
en ninguno de los carriles en donde se encontraba el material de la rickettsia (Figura 3.21, 3.22
y 3.23).
Sin embargo, en los carriles donde se encuentra el lisado y la membrana externa de A.

marginale se detect una banda de aproximadamente 37 kDa (Figura 3.23), la cual se pudiera
pensar que es la protena AM244, a pesar de tener menor tamao que el peso molecular
terico de esta protena (48 kDa), ya que esta banda no se observa en el material del patgeno
al utilizar el suero preinmune del conejo. Por otro lado, es posible que tambin esta banda de
37 kDa sea una reaccin cruzada producto, debido
probablemente a que esta protena
101
comparta algn epitope con protenas de E. coli, ya que el suero preinmune del conejo
reconoci varias bandas en el carril correspondiente a la protena recombinante Thio-AM244r,
entre estas la de 37 kDa, que en este caso corresponde a una protena de E. coli, ya que la
protena recombinante no pudo ser purificada. En la muestra que corresponde a la membrana
de eritrocitos se observa tambin la bande de 37 kDa, lo que quizs se deba a que no se logr
una separacin completa de los cuerpos iniciales de A. marginale de las membranas de los
glbulos rojos como fue mencionado anteriormente.
3 4
kDa
75
37
MBP-AM202r
R-PKAr
MBP
25
20
AM202r
50
kDa
75
MBP-AM202r
50
MBP
37
25
20
(+)
(-)
Figura 3.21. Reactividad del lquido asctico de ratones BALB/c inmunizados con la protena MBP-AM202r (+) y con
adyuvante (-). Membrana de nitrocelulosa teida con Ponceau (A) e Inmunotincin (B). Carril 1: Lisado de A. marginale;
Carril 2: Porcin soluble de las protenas de membranas de A. marginale extrado con CHAPS al 4%; Carril 3: Porcin
insoluble de las protenas de A. marginale; Carril 4: Membrana de eritrocitos; Carril 5: protena MBP-AM202r; Carril 6:
protena MBP control; Carril 7: protena recombinante de la subunidad reguladora de PKAde Trypanosoma evansi; Carril
8: protena MBP-AM202r no digerida; Carril 9: protena MBP-AM202r digerida. Estas muestras fueron separadas por un
gel de SDS-PAGE al 12 % y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con el
lquido asctico de los ratones BALB/c que contiene los anticuerpos primarios anti-MBP-AM202r (dilucin 1:100) y se
detect la unin antgeno-anticuerpo con el anticuerpo secundario anti-IgG de ratn (dilucin 1:3000) conjugado a
peroxidasa y quimioluminiscencia.
102
kDa
R-PKAr
100
75
50
37
MBP-AM573r
MBP
25
20
15
010
AM573r
0
B
kDa
100
75
50
37
MBP-AM573r
MBP
25
20
15
010
0
(+)
(-)
Figura 3.22. Reactividad del lquido asctico de ratones BALB/c inmunizados con la protena MBP-AM573 (+) y
con adyuvante (-). Membrana de nitrocelulosa teida con Ponceau (A) e Inmunotincin (B). Carril 1: Lisado de A.
marginale; Carril 2: Porcin soluble de las protenas de membranas de A. marginale extrado con CHAPS al 4%;
Carril 3: Porcin insoluble de las protenas de A. marginale; Carril 4: Membrana de eritrocitos; Carril 5: protena
MBP-AM573; Carril 6: lisado de pMal en E.coli K12 ER2508; Carril 7: protena recombinante de la subunidad
reguladora de la PKA de Trypanosoma evansi; Carril 8: protena MBP-AM573 no digerida; Carril 9: protena MBPAM573 digerida. Estas muestras fueron separadas por un gel de SDS-PAGE al 15 % y transferidas a una membrana
de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con el lquido asctico de los ratones BALB/c que contiene los
anticuerpos primarios anti-MBP-AM573r (dilucin 1:200) y se detect la unin antgeno-anticuerpo con el
anticuerpo secundario anti-IgG de ratn (dilucin 1:3000) conjugado a peroxidasa y quimioluminiscencia.
103
A
1
kDa
kDa
250
150
100
100
75
50
37
75
50
Thio-AM244r (61 kDa, Carril 5, 8 y 9)

R-PKAr (57 kDa, Carril 7)
AM244r
37
25
25
20
20
HP-Tiorredoxina
B
kDa
6 7
250
150
100
kDa
100
75
50
37
75
Thio-AM244r
50
37
Thio-AM244r
AM244r
25
20
25
20
HP-Tiorredoxina
SI
SPI
Figura 3.23. Reactividad del suero de conejos Nueva Zelanda inmunizados con la protena Thio-AM244r (SI) y el
suero preinmune (SPI). Membrana de nitrocelulosa teida con Ponceau (A) e Inmunotincin (B). Carril 1: Lisado de
A. marginale; Carril 2: Porcin soluble de las protenas de membranas de A. marginale extrado con CHAPS al 4%;
Carril 3: Porcin insoluble de las protenas de A. marginale; Carril 4: Membrana de eritrocitos; Carril 5: protena
Thio-AM244r; Carril 6: lisado de pThioHisA en E.coli TOP10; Carril 7: protena recombinante de la subunidad
reguladora de la PKA de Trypanosoma evansi; Carril 8: protena Thio-AM244r no digerida; Carril 9: protena ThioAM244r digerida. Estas muestras fueron separadas por un gel de SDS-PAGE al 12 % y transferidas a una
membrana de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con el suero inmune de conejo que contiene los
anticuerpos primarios anti-AM244r (dilucin 1:100) y se detect la unin antgeno-anticuerpo con el anticuerpo
secundario anti-IgG de conejo (dilucin 1:10000) conjugado a peroxidasa y quimioluminiscencia.
104
Para saber si esto se debe a la falta de produccin de anticuerpos por los ratones y/o
conejos contra las protenas AM202r, AM244r y AM573r, se realiz una digestin con sus
respectivas proteasas para separar a estas protenas recombinantes (AM202, AM244 y
AM573) de sus respectivas protenas de fusin (MBP y HP-Tiorredoxina). Posteriormente, se
realiz otra inmunotincin empleando los anticuerpos policlonales presentes en el lquido
asctico y suero de conejo contra las protenas recombinantes completas (MBP-AM202r,
MBP-AM573r y Thio-AM244r).
Como resultado se obtuvo la deteccin de la protena de fusin MBP, pero no de las

protenas AM202r y AM573r, al digerirse las protenas MBP-AM202r y MBP-AM573r con la
proteasa Factor Xa (Figura 3.21 y 3.22), lo que indic que dichas protenas probablemente no
fueron capaces de inducir una respuesta humoral en los ratones. En el caso de la digestin de
la protena Thio-AM244r, se detect la AM244r (48 kDa), la HP-Tiorredoxina y la protena
recombinante completa (Thio-AM244r) (Figura 3.23), ya que la digestin fue parcial; por lo
tanto, la protena AM244r fue antignica para el conejo, ya que hubo produccin de
anticuerpos contra ella. El control negativo utilizado fue la protena recombinante de la
subunidad reguladora de la protena quinasa A de Trypanosoma evansi (PKA, del ingls
Protein Kinase A; 56 kDa), donada por el Dr. Jos Bubis (Laboratorio de Qumica de
protenas de la Universidad Simn Bolvar). Como se esperaba, la subunidad reguladora de la
PKA de Trypanosoma evansi no fue detectada por los anticuerpos presentes en el lquido
asctico de los ratones inmunizados con las protenas MBP-AM202r y MBP-AM573r (Figura
3.21 y 3.22), ni por los anticuerpos presentes en el suero de conejo inmunizado con la protena
Thio-AM244r (Figura 3.23). El control negativo del suero de conejo fue el suero preinmune,
el cual detect una banda de aproximadamente 15 kDa y otra de 37 kDa en la muestra
correspondiente a la protena Thio-AM244r (protena no purificada; carril 5), las cuales se
consideran inespecficas, ya que estos conejos probablemente estuvieron expuestos a
infecciones con E. coli. Por lo tanto, se podra decir que los resultados de estos experimentos
son confiables.
Los resultados obtenidos en la digestin de la protena Thio-AM244r con la

enteroquinasa (New England BioLabs, USA) (Figura 3.23, carril 9), fueron corroborados con
105
el anticuerpo policlonal anti Tiorredoxina, el cual se une solo a la protena de fusin HPTiorredoxina y no a la protena AM244r. Esta inmunotincin se realiz empleando la misma
membrana, utilizada en el experimento anterior (Figura 3.23, carriles 8 y 9) una vez que
fueron retirados los anticuerpos policlonales contra la protena Thio-AM244r producidos en
conejos. Como resultado se obtuvo una banda que corresponda a la protena completa ThioAM244r (60 kDa) (Figura 3.24), la cual estaba presente porque la digestin con la
enteroquinasa fue parcial; la banda de aproximadamente 48 kDa, correspondiente a la protena
AM244r no fue detectada por este anticuerpo, lo que valida una vez mas que esta banda
(aproximadamente 48 kDa) observada en la Figura 3.23 corresponde a la protena de inters.
kDa
250
150
100
75
50
Thio-AM244
AM244
37
25
20
Figura 3.24. Inmunotincin de la protena Thio-AM244r digerida con la enteroquinasa frente al anticuerpo antiTiorredoxina. Carril 1: protena Thio-AM244r sin digerir; Carril 2: digestin parcial de la protena
ThioAM244r. Las membranas fueron incubadas con el anticuerpo policlonal anti-Tiorredoxina (dilucin
1:20000) y se detect la unin antgeno-anticuerpo con el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo (dilucin
1:10000) conjugado a peroxidasa y quimioluminiscencia.
En vista de que la protena Thio-AM244r fue capaz de generar una respuesta humoral
en el conejo, adems de ser la protena recombinante con mejor rendimiento en su expresin
se procedi a confirmar que esta protena recombinante correspondiera a la protena AM244
(TolB) de A. marginale a travs de un anlisis por Espectrometra de masa en tndem.
106
3.10 Anlisis de Espectrometra de Masa en Tndem de la protena Thio-AM244r.
Para confirmar que la protena Thio-AM244r corresponde a la protena AM244 (TolB)

de A. marginale, se le realiz un anlisis de espectrometra de masa en tndem en la Unidad de
Protemica del Centro de Biologa Estructural del Instituto Venezolano de Investigaciones
Cientficas (IVIC), bajo la asesora de la Licenciada Mnica Rincn. Para ello, la protena
Thio-AM244r fue digerida con la proteasa Tripsina (Sequencing Grade Modified Trypsin
(Promega, USA) y posteriormente se analiz en el espectrmetro MALDI-TOF-TOF (modelo
Autoflex III SmartBeamTM, Bruker, Mxico) obtenindose as su huella pptidica (Figura
3.25).
Esta
fue
analizada
empleando
un
programa
online
llamado
Mascot
(http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF) con la
finalidad de buscar su homologa con otras protenas de patgenos relacionados. Este anlisis
demostr que la protena recombinante tena una alta homologa con la protena AM244
(TolB) de A. marginale cepa Sta Maries (N de acceso: YP_153606.1) y que los pptidos
trpticos obtenidos de la protena recombinante cubrieron en un 51 % la secuencia de la
protena TolB de la cepa Sta Maries. Adicionalmente, se observ que la protena recombinante
fue expresada por completo, ya que se obtuvo la secuencia C-terminal de la misma en uno de
los pptidos trpticos (Figura 3.26; Tabla 3.2). Por lo tanto, la protena AM244r corresponde a
la protena TolB de A. marginale.
Con estos resultados se puede sugerir que las tres protenas AM202, AM244 y AM573
no son capaces de generar una respuesta humoral en el bovino infectado con A. marginale.
Adicionalmente, dos de ellas, las protenas AM202r y AM573r tampoco generaron
anticuerpos en los ratones por lo que no se puedo concluir sobre la ubicacin de las protenas
en la rickettsia (Tabla 3.3). En el caso de la protena AM244r, esta si gener una respuesta
humoral en el conejo, obteniendose un bajo ttulo de anticuerpos (100), lo que sugiere que esta
protena probablemente sea un antgeno subdominante, ya que no gener anticuerpos en su
forma nativa en bovinos infectados con la rickettsia y gener bajos ttulos de anticuerpos en
conejo en su forma recombinante. Sin embargo, con este bajo ttulo se logr identificar una
banda de aproximadamente 37 kDa en las muestras de A. marginale, la cual habra que
confirmar si se trata de la protena AM244 debido a que no tiene el peso molecular terico (48
107
kDa), o si se trata de una reaccin inespecfica generada por una infeccin del conejo con E.
Intens. [a.u.]
coli como se ha venido mencionando (Tabla 3.3).
x104
D:\Data\IDEA\Joilyneth_Ferreira\Huellas_peptidicas\20130822_244_L27\0_F5\1\1SRef
2.5
1199.471
1163.533
2.0
1953.918
1.5
1.0
2175.004
1864.810
1803.776
0.5
1552.579
1333.628
568.088
2358.054
937.393
2604.168
3361.654
0.0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
m/z
Figura 3.25. Huella peptdica de la protena Thio-AM244r. En la grfica se demuestran los valores de
intensidad de los iones vs la relacin masa/nmero de carga del in de cada pptido trptico. La
protena Thio-AM244r fue digerida con tripsina y posteriormente analizada con el espectrmetro
MALDI-TOF-TOF (modelo AutoflexTM III SmartBeam, Bruker, Mxico).
108
Figura 3.26. Alineacin de los pptidos trpticos de la protena Thio-AM244r con la secuencia
aminoacdica de la protena TolB de A. marginale cepa Sta Maries. Los pptidos trpticos de la
protena Thio-AM244r alineados con la secuencia aminoacdica de la protena AM244 (TolB) de A.
marginale cepa Sta Maries (N de acceso: YP_153606.1) estn resaltados en rojo; los cuales cubren
en un 51 % a la secuencia de la protena AM244 (TolB) de A. marginale cepa Sta Maries. La huella
peptdica de la protena Thio-AM244r fue analizada en el programa online Mascot
(http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF); empleando
como modificaciones fijas la propionamidacin de la cistena y como modificaciones variables, la
oxidacin de la metionina y la deamidacin de la asparagina y glutamina.
Tabla 3.2. Secuencias de los pptidos trpticos de la protena ThioAM244r.

N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Secuencia aminoacdica de los pptidos trpticos

VMLRDLNSTGIFDASWK + Deamidacin (NQ)
DVLVTGSIKEFAQGR
LFIWDVASGR
SFNFATGNWR
ITGEGGYFNTR
IAYVAETGLPGSR
RIAIMDQDGANNIYITGR
IAIMDQDGANNIYITGR
IAIMDQDGANNIYITGR + Oxidacin (M)
SGGSVVLHDLETGYSTALGGVR
SINTSASYSPDKK
SIVFNSDR
SGRPQLYVMNADGTNQR
SGRPQLYVMNADGTNQR + Oxidacin (M)
GGYSAPAWSPR
SFHVGVMKPDGSGER
GYMVDSPSWSPNGR
GYMVDSPSWSPNGR + Oxidacin (M); Deamidacin (NQ)
LVTVDITGTNTQILDVPTNASNAHWSPVLRE
109
Tabla 3.3. Resumen del estudio realizado a las protenas AM202, AM244 y AM573 de Anaplasma
marginale
Protena
Alineacin (Blastp)
Pptido seal
Hlices transmembranas
Dominios
ARNm
Anticuerpos en bovinos a
Anticuerpos en ratones o conejos b
Localizacin en A. marginale
AM202
Lipoprotena
A. centrale
Si
Si
OsmY
BON
Si
No
AM244
TolB A.
marginale
Si
No
TolB
PD40
Si
No
AM573
Protena transportadora
A. centrale
No
No
No
?
Si
Si (confirmar)
No
?
TRAP
Hlices transmembranas (TMpred): http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html

Pptido seal (SignalP 3.0): http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
Alineacin (Blastp): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
a: Anticuerpos generados por las protenas nativas AM202, AM244 y AM573
b: Anticuerpos generados por las protenas AM202r, AM244r y AM573r
Si
No
110
CAPITULO IV
DISCUSIN
Muchas investigaciones se han focalizado en el estudio de las protenas de membrana
externa abundantes y altamente inmunognicas de A. marginale, las bien conocidas protenas
principales de superficie (MSP, del ingls Major Superface Proteins) (Arulkanthan y col.,
1999; Barbet y col., 1999; 2000; 2001; McGarey y col., 1994; Palmer y col., 1986; 1988;
1989; 1994 a y b). Estudios recientes basados en un enfoque genmico y protemico han
facilitado la identificacin de componentes que se encuentran en menor proporcin en la
membrana externa bacterial, los cuales han sido ignorados por los anlisis inmunolgicos,
probablemente debido al enmascaramiento generado por el carcter inmunodominantes de las
MSPs (Lpez y col., 2005).
En este estudio se realiz un anlisis in silico a las protenas de funcin conocida

descritas por Brayton y colaboradores (2005), con la finalidad de comparar los resultados
obtenidos con los reportados por los autores, de manera de validar el anlisis in silico
realizado a las protenas hipotticas o de funcin desconocidas y seleccionar tres de ellas para
estudiar su inmunogenicidad en la bsqueda de nuevos antgenos que sirvan como potenciales
candidatos vacunales.
En el anlisis in silico realizado a las protenas de funcin conocida se obtuvo 21
protenas de membrana externa pertenecientes a la superfamilia msp2, 9 protenas de
membrana externa pertenecientes a la superfamilia msp1, 3 protenas de membrana externa
que no pertenecen a ninguna de estas superfamilias (TolC, OMA87 y MSP5), 8 protenas
relacionadas con el Sistema de Secrecin tipo IV y 3 protenas de membrana interna (ver
anexos, Tabla 6.1, 6.2 y 6.3), siendo estos resultados iguales a los obtenidos por Brayton y
colaboradores (2005). En este anlisis no se tom en cuenta las 12 copias del gen orfX y las 7
copias del gen orfY, ni los 7 seudogenes de los genes msp2 y msp3, que forman parte de la
superfamilia msp2. La exclusin de dichos genes se debe a que estos no pertenecen a la
111
familia de antgenos de superficie (pfam01617) (Brayton y col., 2005); por lo tanto, no forman
parte del objetivo de este trabajo. El mismo anlisis in silico fue realizado a las 384 protenas
de funcin desconocida, en el cual se obtuvo 14 protenas de membrana externa, 5 protenas
de secrecin, 2 protenas periplasmticas y 37 protenas de membrana interna (Tabla 3.1; ver
anexos Tablas 6.4, 6.5 y 6.6).
Estos resultados sugieren que estas protenas de funcin desconocidas pudieran ser
posibles inmungenos, ya que reportes de una gran cantidad de autores han demostrado que
este tipo de protenas, presentes en diversas bacterias patgenas, tienen actividades
inmunognicas; como es el caso de Guerreiro y colaboradores (2001), quienes identificaron
una gran diversidad de antgenos proteicos mediante el estudio de los perfiles electroforticos
de clulas completas de Leptospira; estos antgenos incluyen protenas citoplasmticas,
periplasmticas y de membrana interna y externa. Riding y colaboradores (2003) identificaron
cuatro antgenos de membrana del A. marginale, llamados Ana 43, Ana 37, Ana 32 y Ana 29,
los cuales confieren proteccin parcial contra desafos homlogos; estos antgenos son
protenas de membranas, los cuales representan una menor proporcin del proteoma de esta
rickettsia. Por otra parte, Ariel y colaboradores (2002) focalizaron su estudio, principalmente,
en productos de ORF expuestos en la superficie y/o secretados de Bacillus anthracis
(plsmido pXO1), ya que consideraron que estos criterios son relevantes para la identificacin
de protenas involucradas en varios pasos de los procesos de infeccin. Este tipo de protenas
secretadas o de superficie son fcilmente accesibles a los anticuerpos, por lo que se consideran
como ideales candidatos vacunales (Mora y col., 2003).
Por todo lo antes expuesto, se decidi trabajar con los genes de funcin desconocida
ubicados, en el locus AM202, AM244, AM573, AM778, AM796, AM854 y AM1097 del
genoma de A. marginale, los cuales tienen el mayor porcentaje de similitud con protenas de
membrana externa, de secrecin y de transporte de diversas bacterias patgenas, adems de
existir un alto grado de relacin entre estas siete protenas de A. marginale con otros
patgenos relacionados (Tabla 3.1).
112
Brayton y colaboradores (2005) reportaron la secuencia de estos genes en la base de
datos GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/): AM202 (ref/YP_153580.1), AM244
(ref/YP_153606.1),
AM573
(ref/YP_153839.1),
AM778
(ref/YP_153969.1),
AM796
(ref/YP_153982.1), AM854 (ref/YP_154026.1) y AM1097 (ref/YP_154208.1), con tamaos de

582, 1320, 201, 1590, 1110, 705 y 555 bp, respectivamente, los cuales coincidieron con la
longitud de los amplicones obtenidos en las RT-PCRs realizadas (Figura 3.4), indicando que el
ARNm de estos genes est presente en la rickettsia. Una vez que se demostr la expresin de
estos genes, se procedi a trabajar con solo tres de ellos, AM202, AM244 y AM573.
La protena AM202 podra estar involucrada en el mantenimiento de la integridad de A.

marginale cuando este est frente a un cambio osmtico, ya que los dos dominios presentes en
esta protena (OsmY y BON), estn involucrados en la proteccin del patgeno frente a estos
cambios de concentraciones de solutos (Yin y Villarejo, 1992; Yeats y Bateman, 2003).
Por su parte, la protena TolB (AM244) de A. marginale podra estar involucrada en la

integridad de la envoltura bacterial y en el mecanismo de infeccin de la rickettsia, ya que se
ha reportado que este tipo de protenas forman parte de un complejo multiproteico llamado
Tol/Lipoprotenas asociadas al pptidoglicano (PAL, del ingls Peptidoglycan Associated
Lipoprotein) en E. coli, empleado por la Colicina del grupo A para penetrar y matar a las
clulas del hospedero. Se han encontrado homlogos de TolB y del sistema Tol/PAL en
muchas bacterias Gram-negativas, el cual tiene un rol esencial en el mantenimiento de la
integridad de la envoltura celular (Rigal y col., 1997). En el caso de la Salmonella
typhimurium, TolB es requerido por la bacteria para la infeccin letal en ratones (Abergel y
col., 1999). Por otro lado se ha observado la presencia de un dominio llamado PD40, el cual
forma parte de la superfamilia WD40. Esta superfamilia est conformada por protenas con
repeticiones del dipptido WD (Trp-Asp) en su C-terminal, con una longitud de 40
aminocidos, los cuales son altamente conservados. Adicionalmente, este tipo de protenas
tienen en su N-terminal repeticiones del dipptido GH, con una longitud de 11 a 24
aminocidos y en el centro, entre los dipptidos GH y WD se encuentra un ncleo conservado
en el cual pueden unirse otras protenas de forma estable o reversible. Esta superfamilia de
protenas ha sido encontrada en eucariotas pero no en procariotas. Este dominio WD tienen
113
diversas funciones celulares en los organismos eucariotas: divisin celular, determinacin del
destino celular, transcripcin de genes, sealizacin transmembrana, modificacin del ARNm
y fusin de vesculas (Neer y col., 1994). Por lo tanto, esta protena TolB tambin podra estar
involucrada en algunas de estas funciones celulares importantes para la vida de la rickettsia A.
marginale. A pesar de que el producto peptdico del gen AM244 fue reportado por Brayton y
colaboradores (2005) como una protena TolB de A. marginale, se decidi evaluar su
capacidad de generar una respuesta humoral en el bovino y en animales de experimentacin
(conejos Nueva Zelanda), en su forma nativa y recombinante, respectivamente, debido a que
actualmente no hay estudios sobre ello; por lo que fue de inters su estudio como un posible
candidato vacunal para la Anaplasmosis bovina.
En el caso de la protena AM573, contiene un dominio conservado del sistema de

transporte periplasmtico tripartita independiente de ATP (TRAP, del ingls Tripartite ATPindependent periplasmic), el cual es un transportador secundario dependiente de una protena
receptora de solutos extracitoplasmticos (ESR, del ingls Extracytoplasmic Solute Receptor),
la cual captura el soluto especfico con alta afinidad y lo transfiere luego al complejo de
permeasas localizado en la membrana interna bacterial (Transporte TRAP) (Rucktooa y col.,
2007). Este transporte es comn en procariotas pero no ha sido bien caracterizado. Hasta ahora
se conoce muy poco de sus sustratos y funcin fisiolgica, solo se sabe que este sistema
transporta una gran cantidad de solutos, que est ubicado en la membrana interna (Thomas y
col., 2006) y que adems, su funcin la ejercen a travs de un gradiente inico y no por
hidrlisis
de
ATP.
Se
ha
reportado
una
familia
de
protenas
inmunognicas
extracitoplasmticas conservada que se asocian a este sistema (Kelly y Thomas, 2001). Por
otro lado esta protena AM573 tiene similitud con una protena inmunognica de A.
phagocytophilum agente causal de la anaplasmosis equina (Stannard y col., 1969; citado por
Salvagni y col., 2010) y no tiene pptido seal ni regiones transmembranas, lo que pudiera
facilitar la expresin heterloga en E. coli.
Por todas estas razones, se consider de gran inters clonar, expresar y purificar las
protenas AM202, AM244 y AM573 para evaluar su antigenicidad en su forma nativa
empleando los sueros de bovinos infectados experimentalmente con A. marginale o en su
114
forma recombinante a travs de la inmunizacin de animales de experimentacin (ratones
BalB/c o conejos Oryctologus cuniculus) con la protena recombinante. De ser antignicas
estas protenas, se podra evaluar en un futuro su potencial uso como un antgeno vacunal en el
bovino.
Estos tres genes (AM202, AM244 y AM573) posiblemente presentan polimorfismos de

un solo nucletido (SNP, Single nucleotide polymorphisms) al compararlos con las cepas St.
Maries
(gb|CP000030.1|),
Florida
(gb|CP001079.1|)
Israel
subespecie
centrale
(gb|CP001759.1|) de A. marginale (Figuras 3.8, 3.10 y 3.12); lo cual ha sido observado por
Dark y colaboradores (2009) al comparar mltiples cepas de A. marginale, donde observaron
que existe una gran diversidad a nivel de nucletidos, por lo que consideraron que el anlisis
de SNP en multiples cepas de A. marginale parece ser una herramienta poderosa para los
estudios filogenticos de la bacteria que la caracterizacin de sus protenas principales de
superficie (de la Fuente y col., 2002). De hecho, los SNP presente en los tres genes en estudio,
no generaron cambios en la secuencia aminoacdica de las protenas codificadas por estos
(Figuras 3.9, 3.11 y 3.13).
Es importante mencionar que las protenas AM244 y AM573 no poseen pptido seal,
el cual es caracterstico de las protenas de superficie, ya que tiene como funcin dirigir la
protena a la membrana externa (von Heijne, 1984; citado por de la Fuente y col., 2003). Se ha
demostrado que la protena de superficie MSP1a de A. marginale tambin carece de este
pptido (Tabla 6.1) (Brayton y col., 2005) y que probablemente contiene una seal de
secrecin/anclaje (T/AD/NWRQEM/VR/HSK) para la rickettsia en los 10 aminocidos
previos a la primera regin transmembrana (de la Fuente y col., 2003). Esta secuencia tiene
una identidad que est entre 33 y 80 % con otras protenas de membrana externa hipotticas
bacterianas, lo que llevara a sugerir que las protenas de membrana externa predichas en este
estudio y que carecen de pptido seal (Tabla 6.4), podran valerse del mismo mecanismo para
llegar a la superficie celular. En cuanto a las protenas de membran interna (ver anexos, Tabla
6.5), normalmente tienen un sitio de clivaje muy dbil ya que la secuencia del pptido seal
permanece no clivada (Chakravarti y col., 2001).
115
Por todas estas razones, se consider evaluar si las protenas AM202, AM244 y
AM573 son capaces de generar una respuesta humoral en su forma nativa en bovinos
infectados experimentalmente con A. marginale o en su forma recombinante a travs de su
inoculacin en animales de experimentacin (ratones BalB/c o conejos Oryctologus
cuniculus), con el objeto de ser evaluadas en el futuro en el bovino, siempre y cuando estas
protenas generen altos ttulos de anticuerpos. Para ello, se procedi a la clonacin y
secuenciacin de los genes AM202, AM244 y AM573 para expresar sus productos peptdicos y
as evaluar su antigenicidad.
Al purificar parcialmente estas protenas recombinantes se not un bajo rendimiento en

la expresin, particularmente de las protenas MBP-AM202r y MBP-AM573r, quizs por la
presencia de regiones transmembranas, en el caso de la protena AM202 lo que probablemente
dificulta su expresin en las bacterias E. coli (Laible y col., 2004; citados por Martnez Molina
y col., 2008). En el caso de la protena AM573, esta no posee pptido seal ni hlices
transmembranas, pero tiene un 33 % de similitud con una protena piruvato formato liasa de E.
coli (N de acceso en el GenBank: WP_001351177.1) (Figura 4.1), involucrada en el
metabolismo anaerbico de la glucosa, lo que probablemente genere que la bacteria E. coli
regule la expresin de esta protena inhibindola para que no influya en su metabolismo.
A.marg
E.coli
549
ATTALSDEMAYAVVKSVASHIDRFRELS-GALRKLVLRDLVTSGSAVPLHDGAARFYREV
A ++L+++ Y VVK +
I++
L
A++ V R L TSGSA P+ G
+ E+
AKSSLNEQDIYDVVKRI---IEQHGALDPAAIKNEVYRQL-TSGSAAPVQSGTMSRHEEI
64
604
Figura 4.1. Alineacin de las secuencias aminoacdicas de la protena AM573 de A. marginale cepa
Zulia (en estudio, color azul) y de la cepa E. coli (Genbank) por BLASTP. Nmero de acceso de la protena
piruvato formato liasa de E. coli: WP_001351177.1. Longitud: 800 aminocidos. Rango: desde el aminocido
549 al 604. Valor esperado: 8.4. Identidad: 20/60 (33 %). Positivos: 33/60 (55 %). Espacios: 5/60 (8 %).
Por otro lado, este bajo rendimiento en la expresin puede deberse a la degradacin de
estos productos peptdicos (AM202r y AM573r) a pesar de usar bacterias deficientes de
proteasas (E. coli K12 ER2508) o por la posible sntesis incompleta de los polipptidos, ya
que al realizar el anlisis del uso frecuente de codones por E. coli para la expresin de las
protenas heterlogas se obtuvo un 8 % de codones raramente usados por la bacteria en
AM202 y AM573 y para la protena AM244, el resultado fue de un 9 %. Por esta razn se
decidi expresar a estas protenas, en las bacterias E. coli cepa BL21 Rosetta, la cual
116
proporciona los ARN de transferencia (ARNt) necesarios para los codones AGG, AGA, AUA,
CUA, CCC, GGA y as lograr mejorar el rendimiento en la expresin de las protenas
recombinantes (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania; 2013). Sin embargo, esto no fue as, ya
que se mantuvo un bajo rendimiento en la expresin de estas protenas, quizs porque la cepa
BL21 Rosetta no logr suministrar todos los codones necesarios, raramente usados por E. coli
para la expresin de las protenas. En el caso de la protena AM244r, falt suplir el codon
(CGG) afectando en cinco aminocidos de cuarenta y tres (ver anexos, Figura 6.7) y en la
protena AM573r no supli un codon (CGG) afectando en un aminocido de seis (ver anexos,
Figura 6.8). En la protena AM202r supli todos los codones, sin embargo el rendimiento en la
expresin fue bajo. Tambin es posible que haya ocurrido un dao postraduccional debido a la
oxidacin o adicin de radicales libres, lo que genera la eficiente remocin de la maquinaria
proteoltica bacterial (Goldberg y Goff, 1986; citados por Makrides, 1996). Adicionalmente,
estas protenas han sido designadas en este estudio como protenas de membrana externa,
cuyas dificultades en su expresin surgen por el limitado espacio fsico en la membrana
celular, adems de que esta expresin puede ser txica para la bacteria (Laible y col., 2004;
citados por Martnez Molina y col., 2008). Por otro lado, si la capacidad de plegamiento de la
protena e insercin en la membrana celular se excede, el resultado ser la agregacin y
acumulacin de protena inactiva en cuerpos de inclusin generando un bajo rendimiento en la
expresin de las protenas recombinantes (Loll, 2003; citados por Martnez Molina y col.,
2008). Por lo tanto, en el caso de la protena AM202, es probable que el rendimiento de la
expresin mejore al eliminarle el pptido seal, ya que de esta manera al expresar la protena
AM202, esta no se ira a la membrana de la bacteria E. coli.
En cuanto al rendimiento de la protena Thio-AM244r (2 mg), este fue mejor que el de

las protenas MBP-AM202r (1 mg) y MBP-AM573r (0,9 mg), a pesar de ser identificada en
este estudio como una protena de membrana externa, adems de tener un 9 % de codones
raramente usados por E. coli para su expresin. No se observ degradacin de la protena pero
si se formaron cuerpos de inclusin, ya que se encontraba en mayor cantidad en la porcin
insoluble (sedimento). Hubo inconvenientes en la purificacin de la protena Thio-AM244r
porque sta no se uni a la resina, quizs debido a que su hidrofobicidad o la sustitucin del
aminocido valina (primer aminocido de la protena AM244) por el aminocido prolina
117
cambi la conformacin de la protena de fusin o probablemente, por la presencia de
imidazol en la solucin de unin, lo que no permiti que la protena de fusin se fijara a la
resina (Manual His-Patch ThioFusiomTM Expression System, Versin F, 2003).
En busca de mejorar el rendimiento de la expresin de estas protenas recombinantes,

se debera evaluar la expresin de las mismas sin su pptido seal, en el caso de la protena
AM202r, para que sta no sea dirigida a la membrana celular de E. coli y se exprese de forma
soluble en el citoplasma, tal y como fue realizado en estudios con la protena MSP4 de A.
marginale (Oberle y col., 1993) y con la protena porina (PorB) de membrana externa de
Neisseria meningitidis (Wright y col., 2002). Por otro lado, se podra sustituir los codones que
no fueron suplidos por las bacterias E. coli cepa BL21 Rosetta por los codones frecuentemente
utilizados por la E. coli (Devlin y col., 1988; Hernan y col., 1992; Mohsen y col., 1995;
citados por Makrides, 1996), o empleando la coexpresin de los mismos con la protenas de
inters lo cual ha sido demostrado que favorece la expresin de protenas recombinantes
mejorando su rendimiento (Garca y col., 1986; Brinkmann y col., 1989; Del Tito y col., 1995;
citados por Makrides, 1995).
A pesar del bajo nivel de expresin de las protenas MBP-AM202r, Thio-AM244r y

MBP-AM573r, se pudo realizar los ensayos necesarios para determinar su antigenicidad. Estas
protenas se enfrentaron a los sueros de bovinos infectados experimentalmente con A.
marginale y se observ que no fueron capaces de generar una respuesta humoral en su forma
nativa, ya que no hubo reactividad de los sueros inmunes de los bovinos contra las protenas
recombinantes (Figura 3.18 y 3.19), lo que demuestra la ausencia de anticuerpos contra las
protenas AM202, AM244 y AM573 nativas en los bovinos infectados. Probablemente se deba
a que los sueros de bovino no presentaron buenos ttulos de anticuerpos, ya que al titularlos
frente a la MSP5r, la cual es una protena inmunodominante en su forma nativa en la rickettsia
y es utilizada para el diagnstico de la anaplasmosis bovina (Reyna-Bello y col., 1998; Torioni
y col., 1998), los ttulos obtenidos fueron muy bajos (100) (datos no mostrados). Por lo tanto,
quizs no se detectaron a las protenas AM202r, AM244r y AM573r, porque probablemente se
encuentren en menor proporcin en el proteoma de membrana externa de A. marginale o sean
dbilmente inmunognicas. Por otro lado, es factible que estas protenas sean enmascaradas
118
por el carcter inmunodominantes de las MSPs de A. marginale, quien utiliza esta
inmunodominancia como un mecanismo de evasin a la respuesta inmune del bovino,
generndose anticuerpos contra las MSPs y no contra las protenas vitales para la rickettsia.
Tal es el caso de algunas protenas del sistema de secrecin tipo IV de A. marginale, VirB2
(OrfX), VirB7, VirB11 y VirD4, las cuales, junto con otras protenas del mismo sistema, estn
encargadas de mediar la secrecin o transferencia de clula a clula de macromolculas,
protenas o complejos ADN-protenas en bacterias Gram negativas (Christie y col., 2000;
Baron y col., 2002; citados por Lopez y col., 2005). Estas protenas han sido capaces de
estimular la proliferacin de linfocitos T de memoria de una manera significativa en el ganado
inmunizado con membrana externa de A. marginale, pero no generaron anticuerpos ya que no
fueron detectadas por los sueros de estos animales. Esto pudo deberse a que estas protenas no
estn expuestas a las clulas B, siendo sus epitopes probablemente presentados por las Clulas
Presentadoras de Antgenos a los linfocitos T. Probablemente, estas protenas no estn
expuestas en la superficie, pero estn asociadas fsicamente con otras protenas del sistema de
secrecin tipo IV que si lo estn, con el fin de estimular las clulas T para ayudar a mejorar la
respuesta de anticuerpos contra la protena que est expuesta en la superficie (Sutten y col.,
2010). Este proceso podra estar ocurriendo con las protenas AM202, AM244 y AM573, por
lo que es necesario evaluar en un futuro si estas protenas inducen una proliferacin
significativa de linfocitos T CD4+ y secrecin de IFN-, que son respuestas inmune asociadas
con la inmunidad protectiva contra la anaplasmosis (Tebele y col., 1991; Brown y col.,
1998a).
Para determinar la ubicacin de las protenas AM202, AM244 y AM573 en A.

marginale, se procedi al aislamiento de los cuerpos iniciales y membrana externa de la
rickettsia, para enfrentarlos posteriormente con los anticuerpos producidos en ratones (MBPAM202r y MBP-AM573r) o conejos (Thio-AM244r) contra cada una de las protenas
recombinantes.
En el aislamiento de los cuerpos iniciales y membrana externa de A. marginale se

observaron algunas protenas que caracterizan al proteoma de esta rickettsia, la MSP5 (19
kDa), la MSP4 (31 kDa) y la MSP2 (36 kDa), las cuales fueron detectadas mediante una
119
inmunotincin realizada con el suero inmune del Bovino 9250, el cual fue infectado
experimentalmente con la rickettsia (Figura 3.20). En la inmunotincin no se observ la
dupleta que corresponde a la MSP1a (105 kDa) y a la MSP1b (100 kDa), ni tampoco la
dupleta de 25 kDa reportada por Noh y colaboradores (2008), pero en la tincin con Rojo
Ponceau se observan estas dupletas. En la muestra que corresponde a las membranas de
eritrocitos, las cuales fueron obtenidas en el mismo proceso de aislamiento del material de la
rickettsia, se observan unas bandas de aproximadamente 36 kDa y 31 kDa, las cuales podran
corresponder a las protenas MSP2 y MSP4. Lo anterior indicara que la separacin no fue
completa, o quizs probablemente se deban a la presencia de autoanticuerpos antieritrocticos
en el suero de los bovinos infectados, los cuales reaccionan contra sus propios hemates, lo
que genera la anemia observada en la anaplasmosis bovina (Ristic y col., 1972; Ajayi y col.,
1978; Francis y col., 1980).
Diversos autores han aislado cuerpos iniciales y membrana externa de A. marginale y

el patrn de bandas es similar a los obtenidos en este estudio, tal es el caso de Hope y
colaboradores (2004), quienes emplearon un gradiente con Percoll y el de Noh y
colaboradores (2008), quienes realizaron un procedimiento basado en la sonicacin y
centrifugacin del material de la rickettsia para la separacin de los cuerpos iniciales y de la
membrana externa, mtodo utilizado en este estudio (ver anexos, Figura 6.9 y 6.10). Por lo
tanto, se podra considerar que el aislamiento de los cuerpos iniciales y membrana externa de
la rickettsia se logr, material que fue empleado para la identificacin de las protenas AM202,
AM244 y AM573 en A. marginale, empleando anticuerpos policlonales realizados en ratones
BALB/c y conejos Nueva Zelanda (Oryctologus cuniculus) contra cada una de estas protenas
recombinantes.
En este estudio, no se logr la deteccin de las protenas AM202 y AM573 en el

material de la rickettsia (Figura 3.21 y 3.22), probablemente debido a la falta de respuesta
humoral de las protenas recombinantes en los animales de experimentacin, lo que trae como
consecuencia la dificultad de su identificacin por cualquier tipo de inmunoensayo. Esta falta
de respuesta humoral pudo deberse a la poca cantidad de protena recombinante inoculada a
los ratones, ya que el inculo fue de 20 g de protenas totales, como se menciona en la
120
literatura, pero con la desventaja que la purificacin de estas protenas fue parcial. Por otro
lado, tambin se piensa que probablemente estas protenas no estn expuestas a las clulas B,
como fue mencionado anteriormente, razn por la cual no generaron anticuerpos ni en el
bovino ni en los ratones, como ocurre con las protenas VirB2 (OrfX), VirB7, VirB11 y VirD4
del sistema de secrecin tipo IV de A. marginale (Sutten y col., 2010). Tambin es posible que
la protena de fusin MBP (42 kDa) haya enmascarado a las protenas AM202r (21 kDa) y
AM573r (8 kDa), debido a su gran tamao, en comparacin con las protenas en estudio,
generndose anticuerpos solo contra la protena de fusin MBP, lo que adems comprob la
presencia de las protenas AM202r y AM573r en el inculo, ya que estas estaban unidas a la
MBP.
A pesar de que la respuesta humoral de los ratones estuvo dirigida a la protena de

fusin MBP, los ttulos alcanzados fueron bajos. En el caso de la protena MBP-AM202r, el
ttulo fue de 100 y para la protena MBP-AM573r, el ttulo fue de 400, lo que pudo generarse a
causa de que el inculo tena una cantidad menor de antgeno en comparacin al reportado en
la literatura, en la que se recomienda que el inculo tenga 20 g de antgeno para la
preinmunizacin e inmunizacin de ratones (Tung, 1983). Esto ocurri debido a que los
antgenos fueron purificados parcialmente y los clculos para el inculo fueron aproximados.
En el caso de la protena MBP-AM202r, se separ de las protenas inespecficas mediante un
gel de SDS-PAGE, extrayendo el trozo de gel de poliacrilamida que contena la protena de
inters. Por lo tanto, al emulsificar la muestra quedaron trozos de gel sin emulsificar y con l
parte de la protena, inoculndose una menor cantidad de antgeno. Pero para la protena MBPAM573r no se realiz este procedimiento porque los ratones moran al inocularles la protena
contenida en el gel, por lo tanto, se inocul el antgeno parcialmente purificado, reducindose
la cantidad de MBP-AM573r inoculada, ya que estaba acompaada de otras protenas
inespecficas. Todos esto posiblemente gener el inconveniente de los bajos ttulos de
anticuerpos para la MBP y a su vez la falta de respuesta humoral en los ratones para las
protenas AM202 y AM573, lo que impidi su posterior identificacin en el material de A.
marginale.
121
En el caso de la protena AM244r, la cual fue confirmado que corresponde a la protena
AM244 (TolB) de A. marginale por anlisis de Espectrometra de Masa en Tndem, si fue
capaz de generar una respuesta humoral en el conejo. Sin embargo, no se logr detectar una
banda de aproximadamente 48 kDa en el material de la rickettsia, correspondiente al peso
molecular terico de la protena AM244, sino una banda de menor peso (aproximadamente 37
kDa) (Figura 3.23), la cual es probable que sea la protena de inters, ya que esta no se observa
en el material de la rickettsia cuando se emplea el suero preinmune de conejo. Es probable que
la protena AM244 (TolB) de A. marginale de 48 kDa, sea procesada para obtener una
protena madura de 37 kDa, la cual ejerce las funciones fisiolgicas en la rickettsia. Este
proceso de maduracin fue observado en la bacteria E. coli, en la cual se demostr que la
protena TolB de 47,5 kDa era una protena de membrana interna precursora de la protena
TolB de 43 kDa, la cual se encontraba soluble en el periplasma de la bacteria cumpliendo
funciones vitales para la misma (Isnard y col., 1994). Por lo tanto, es posible que en A.
marginale suceda este proceso de maduracin para la protena AM244 (TolB). Sin embargo,
habra que confirmar este resultado inmunoprecipitando a esta protena de 37 kDa para
realizarle una espectrometra de masa, ya que se observa una banda del mismo peso en la
muestra de la protena Thio-AM244r (no purificada) cuando se emple el suero preinmune.
Por lo tanto, esta banda tambin podra ser una reaccin inespecfica, en la cual esta protena
de 37 kDa es reconocida por los anticuerpos contra E. coli presentes en el suero de conejo, ya
que es posible que esta protena sea similar a algn producto peptdico de E. coli como ocurre
en el caso de la protena TolB de A. marginale, la cual tiene 30 % de similitud con la protena
TolB de E. coli (Figura 4.2).
En cuanto a la dbil respuesta humoral detectada en el conejo contra la protena ThioAM244r (dilucin 1:100) (datos no mostrados), probablemente se deba a que el inculo
utilizado en la preinmunizacin, para la produccin de anticuerpos policlonales en el suero del
conejo, fue menor (0,2 mg) a la cantidad de antgeno descrita en la literatura (0,5 mg), a pesar
de que en las inmunizaciones se inocul el doble de la cantidad de antgeno (0,2 mg) reportada
(0,1 mg) (Padilla-Londoo y col., 2008). Este antgeno Thio-AM244r fue procesado de la
misma manera que la protena MBP-AM202r. Es posible, que los anticuerpos producidos
contra la protena AM244r en el conejo sea producto a que esta protena es de mayor tamao
122
(48 kDa) en comparacin a su protena de fusin Tiorredoxina (13 kDa) o a que quizs ocurri
un cambio conformacional por la sustitucin del primer aminocido valina de la protena por
una prolina, el cual se origin por la necesidad de clonar el gen en su marco de lectura abierto
en el vector pThioHisA. Estas suposiciones se generan debido a que esta protena no gener
anticuerpos en su forma nativa en el bovino, por lo que habra que realizar un estudio de
dicrosmo circular para comparar la estructura conformacional de la protena nativa con la
recombinante y as confirmar esta suposicin.
A.marg
97
E.coli
90
A.marg
155
E.coli
150
A.marg
212
E.coli
208
A.marg
272
E.coli
268
A.marg
332
E.coli
328
A.marg
392
E.coli
388
AWTSVAKDVLVTGSIKEFAQGRVKVKLFIWDV--ASGRQLSGKSFNFATGNWRRAAHSMS
AW+++ DV+V G +
G
V
+ D
A G L+ S+
R A H+ S
AWSALGIDVVVVGQVTPNPDGSYNVAYQLVDTGGAPGTVLAQNSYKVNKQWLRYAGHTAS
154
149
DSIYSRITGEGGYFNTRIAYVAETG---LPGSRRIAIMDQDGANNIYITGRGEFVSTPRF
D ++ ++TG G F TRIAYV +T
P
R++ D DG N
+
+ + +P +
DEVFEKLTGIKGAFRTRIAYVVQTNGGQFPYELRVS--DYDGYNQFVVHRSPQPLMSPAW
211
SPDARNLVYMSYAKSGGSVVLHDLETGYSTALGGVRGVNSSPRFSPDGRHVLLSESAQGS
SPD
L Y+++
++V+ L G
+
N +P FSPDG + + S GS
SPDGSKLAYVTFESGRSALVIQTLANGAVRQVASFPRHNGAPAFSPDGSKLAFALSKTGS
271
TNIYSIDLKSGKSTRLTNDRSINTSASYSPDKKSIVFNSDRSGRPQLYVMNADGTNQRRI
N+Y +DL SG+ ++T+ RS NT ++ PD +++ F SD++GRPQ+Y +N +G
+RI
LNLYVMDLASGQIRQVTDGRSNNTEPTWFPDSQNLAFTSDQAGRPQVYKVNINGGAPQRI
331
SSGKGGYSAPAWSPRGDWIAFTKTEGKSFHVGVMKPDGSGERLLAKGYMVDSPSWSPNGR
+
S G ++
+ G
H+
G ++L+ ++ ++PS +PNG
TWEGSQNQDADVSSDGKFMVMVSSNGGQQHIAKQDLATGGVQVLSSTFLDETPSLAPNGT
391
VILFT
+++++
MVIYS
207
267
327
387
396
392
Figura 4.2. Alineacin de las secuencias aminoacdicas de la protena AM244 (TolB) de A. marginale
cepa Zulia (en estudio, color azul) y de la cepa E. coli (Genbank) por BLASTP. Nmero de acceso de la protena
TolB de E. coli: WP_001509430.1. Longitud: 430 aminocidos. Rango: desde el aminocido 90 al 392. Valor
esperado: 4e-39. Identidad: 90/305 (30 %). Positivos: 156/305 (51 %). Espacios: 7/305 (2%).
Es necesario evaluar la antigenicidad de estas protenas recombinantes empleando

otros adyuvantes. Se ha demostrado que el uso de factores de crecimiento, protenas
recombinantes de otros patgenos o complejos coloidales son vehculos eficaces para
subunidades vacunales, los cuales actan como adyuvantes induciendo inmunidad. Tal es el
caso de Mwangi y colaboradores (2002), quienes utilizaron los factores de crecimiento como
el Ligando de la tirosina quinasa 3 del hgado fetal (Flt3L) y el Factor estimulante de colonias
de granulocitos y macrfagos (GM-CSF), incorporados en una vacuna de ADN, para aumentar
el reclutamiento de las clulas dendrticas en el sitio de inmunizacin y de esta manera
aumentar la respuesta de los linfocitos T CD4+ para la MSP1a expresada en el vector de ADN
123
empleado como vacuna en el ganado. Por otro lado, Michelon y colaboradores (2006)
evaluaron la respuesta inmune humoral y celular de los ratones BalB/c contra la MSP1a
recombinante de A. marginale, cuyo gen fue clonado en un plsmido de expresin
micobacterial con el cual se transform la cepa BCG Pasteur 1173P2 de Mycobacterium bovis.
Esta cepa recombinante fue inoculada en los ratones los cuales obtuvieron altos titulos de
anticuerpos anti-MSP1a recombinante, los cuales reconocen la protena nativa de la rickettsia
obtenida de eritrocitos infectados, adems de la produccin de IFN- especfica de la MSP1a
recombinante inducido por la cepa BCG recombinante. sto les sugiri que existe una
respuesta inmune celular Th1, indicando que el antgeno recombinante fue adecuadamente
presentado al sistema inmune. Kawasaki y colaboradores (2007) evaluaron la respuesta
inmune humoral en ratones BalB/c para la MSP1a, MSP1b, MSP4 y MSP5 recombinantes de
A. marginale incorporadas en un complejo inmunoestimulatorio (ISCOM, del ingls
Immunostimulant Complex) y con el adyuvante ISCOMATRIX, los cuales produjeron altos
ttulos de IgG total, IgG1 e IgG2 especficos para las MSPs recombinantes. Resultados
similares fueron obtenidos por Gasparini y colaboradores (2013) quienes emplearon el
adjuvante ISCOMATRIX con las MSPs recombinantes (MSP1ar, MSP1br, MSP4r y MSP5r)
para evaluar la respuesta inmune humoral del ganado, observando un incremento significativo
en la IgG total, IgG1 e IgG2, por lo que concluyeron que este complejo ISCOMATRIX/MSPs
recombinantes fue capaz de inducir una seroconversin en ganados, por lo que consideran
necesario explorar la proteccin desplegada por las MSPs recombinantes y por las protenas
previamente identificadas por Lopez y colaboradores (2005) como antgenos subdominantes,
de forma individual y asociadas empleando el adyuvante ISCOMATRIX contra el desafo con
A. marginale.
A pesar de todas las ventajas que traen estas diferentes molculas portadoras de
antgenos para estimular la respuesta inmunolgica hacia el inmungeno de inters, la MBP no
gener este efecto en el sistema inmunolgico de los animales de experimentacin hacia las
protenas AM202r y AM573r; ya que la respuesta humoral de los ratones estuvo dirigida a la
MBP y no a las protenas AM202r y AM573r impidiendo su deteccin en la rickettsia. La HPTiorredoxina gener una dbil respuesta humoral para la AM244r, ya que la produccin de
anticuerpos en los conejos estuvo dirigida hacia ambas protenas (HP-Tiorredoxina y
124
AM244r), logrndose la posible deteccin de la protena AM244 en la rickettsia. Por lo tanto,
con estos resultados, no se puede descartar la idea de que las protenas AM202 y AM573, en
su forma nativa se encuentren en la rickettsia, ya que se demostr en este estudio que su
transcrito estaba presente en el patgeno. En el caso de la protena AM244 (TolB), es
necesario corroborar si la banda de aproximadamente 37 kDa que se detect con el anticuerpo
policlonal anti Thio-AM244r corresponde a la protena de inters presente en A. marginale
para as definir su ubicacin en la bacteria. Adicionalmente, se sugiere realizar una
espectrometra de masa para secuenciar las tres protenas recombinantes en estudio, realizar un
ensayo de dicrosmo circular para comparar la estructura conformacional de las protenas
nativas con las recombinantes y de esta manera validar que las protenas analizadas en este
trabajo corresponden a las protenas AM202, AM244 y AM573 de A. marginale.
125
CAPITULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Del anlisis in slico de los ORFs identificados en el genoma de A. marginale se
escogieron siete, AM202, AM244, AM573, AM778, AM796, AM854 y AM1097, las cuales
tiene mayor porcentaje de similitud con protenas de membrana externa, de secrecin o de
transporte de diversas bacterias patgenas, adems de existir un alto grado de relacin entre
estas siete protenas de A. marginale con otros patgenos relacionados.
Los siete genes escogidos se expresan en la rickettsia, y se seleccionaron tres de ellos,

AM202, AM244 y AM573, los cuales probablemente presentan polimorfismos de un solo
nucletido en sus secuencias al compararlos con las cepas St. Maries, Florida e Israel
subespecie centrale de A. marginale, sin afectar sus productos peptdicos y adems por ser las
tres del grupo con mayor porcentaje de similitud con protenas transportadoras de otros
microorganismos relacionados y poseer dominios relacionados con la integridad del patgeno.
Los genes AM202, AM244 y AM573 fueron amplificados a partir del ADN genmico
de A. marginale, clonados en los vectores de expresin pMal-p4x (para los genes AM202 y
AM573) y en pThioHisA (para el gen AM244), y expresados en E. coli K12 ER2508 y TOP
10, respectivamente. Las protenas de fusin, exceptuando la protena Thio-AM244r, fueron
purificadas parcialmente del extracto de E. coli. En el caso de la protena Thio-AM244r se
realizaron los ensayos con la protena contenida en el sedimento, sin purificarla, ya que no se
logr estandarizar su purificacin. El rendimiento de la expresin de las protenas MBPAM202r, MBP-AM573r y Thio-AM244r fue de 1 mg; 0,9 mg y 2 mg por litro de cultivo
inicial de E. coli, respectivamente.
Al evaluar la respuesta humoral de las protenas AM202, AM244 y AM573 en su
forma nativa, se observ que no generaron anticuerpos en el bovino infectado
experimentalmente con A. marginale. Resultados similares fueron obtenidos cuando se evalu
126
la respuesta humoral en ratones inmunizados con las protenas AM202r y AM573r. Esta falta
de respuesta humoral impidi determinar la localizacin de estas protenas en A. marginale.
Sin embargo, la protena AM244r si gener la produccin de anticuerpos en el conejo lo que
favoreci su posible deteccin en el lisado de la rickettsia. Adicionalmente en este trabajo se
confirm por anlisis de Espectrometra de Masa en Tndem de que esta protena
recombinante corresponde a la protena AM244 (TolB) de A. marginale.
En un futuro, una vez que se hayan mejorado las condiciones de expresin de las
protenas recombinantes, y de la respuesta inmune humoral de las mismas con el empleo de
otros adyuvantes, es necesario conocer si estas protenas recombinantes tienen la capacidad de
inducir la proliferacin de los linfocitos TCD4+, secrecin de IFN- y produccin de
Inmunoglobulina G2 en bovinos inmunizados con A. marginale o con la membrana externa de
la rickettsia, respuesta caracterstica en la inmunidad protectora contra la anaplasmosis bovina,
y posteriormente evaluar su potencial vacunal.
127
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ANEXOS
Tabla 6.1. Genes de A. marginale con dominios que codifican protenas de superficie.
Locus/Gen
AM075
AM090
AM123
AM124
AM133
AM180
AM188
AM236
No. Acceso
GenBank
Hlices
Sitio de clivaje
transmembranas del pptido seal
(TMpred)
(SignalP 3.0)
Alineacin
(Blastp)
OMP14 de A.
marginale
cepa St.
Maries
MSP4 de A.
YP_153501.1 Del aa 42 al 63
Entre los aa 29-30
marginale
MSP1B-2 de
Del aa 287 al 305
A. marginale
YP_153523.1 Del aa 328 al 344 Sin pptido seal
cepa St.
Del aa 373 al 393
Maries
MSP1B de A.
Del aa 138 al 162
marginale
cepa St.
Del aa 372 al 394
Maries.
MSP1B de A.
Del aa 167 al 185
marginale
cepa St.
Del aa 253 al 273
Maries
MSP1B-1 de
Del aa 287 al 305
A. marginale
cepa St.
Del aa 373 al 393
Maries
MSP1B de A.
marginale
cepa St.
Maries
MSP5 de A.
Sin hlices
marginale
YP_153599.1
Entre los aa 26-27
transmembrana
cepa St.
Maries
Del aa 277 al 303
Del aa 339 al 359
*Identidad
(%)
96%
100%
90%
92%
93%
90%
81%
100%
aa: Aminocido; OMP: Protena de membrana externa; MSP: Protena Principal de Superficie; TMpred:
http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html; SignalP 3.0: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ;
Blastp: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; *Identidad (%): Similitud existente entre las protenas de A. marginale con
protenas de otros patgenos relacionados.
143
Tabla 6.1. Genes de A. marginale con dominios que codifican protenas de superficie
(Continuacin).
Locus/Gen
AM530
AM532
AM535
No. Acceso
GenBank
YP_153809.1
YP_153810.1
YP_153811.1
AM536
YP_153812.1
AM987
YP_154134.1
AM1024
AM1063
AM1096
Hlices
transmembranas
(TMpred)
Del aa 111 al 131
Del aa 400 al 418
Del aa 428 al 447
Del aa 490 al 512
Del aa 521 al 539
Del aa 59 al 80
Del aa 82 al 104
Del aa 142 al 164
Del aa 167 al 188
Del aa 257 al 275
Del aa 257 al 275
Del aa 26 al 44
Del aa 77 al 98
Del aa 116 al 134
Del aa 163 al 180
Del aa 191 al 210
Del aa 1 al 17
Del aa 82 al 100
Del aa 111 al 133
Del aa 173 al 194
Del aa 203 al 220
Sin hlices
transmembrana
Sitio de clivaje
del pptido seal
(SignalP 3.0)
Alineacin
(Blastp)
*Identidad
(%)
MSP1a de A.
marginale
Entre los aa 19-20
cepa St.
Maries.
67%
Sin pptido seal
MLP2 de A.
marginale
cepa St.
Maries
90%
Sin pptido seal
MLP3 de A.
marginale
cepa St.
Maries
91%
Sin peptide seal
MLP4 de A.
marginale
cepa St.
Maries
77%
OMP 15 de A.
marginale
OMP TolC de
YP_154160.1 Del aa 55 al 75
Sin peptide seal
A. marginale
MSP3 de A.
Del aa 116 al 137
marginale
YP_154182.1
Entre los aa 33-34
Del aa 842 al 858
cepa St.
Maries
OMP OMA87
de A.
Sin hlices
YP_154207.1
Entre los aa 28-29
marginale
transmembrana
cepa St.
Maries
Entre los aa 28-29
100%
93%
85%
96%
aa: Aminocido; OMP: Protena de membrana externa;

MSP: Protena Principal de Superficie; MLP: Protena parecida a la MSP1a;
TMpred: http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html;
SignalP 3.0: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ; Blastp: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; *Identidad (%):
Similitud existente entre las protenas de A. marginale con protenas de otros patgenos relacionados.
144
(Continuacin).
Locus/Gen
No. Acceso
GenBank
Hlices
Sitio de clivaje
transmembrana del pptido seal
(TMpred)
(SignalP 3.0)
Sin hlices
transmembrana
AM1139
YP_154240.1
Entre los aa 23-24
AM1140
Del aa 149 al 167

Del aa 206 al 226
YP_154241.1
Entre los aa 44-45
Del 206 al 226
Del aa 289 al 309
AM1142
YP_154243.1
Sin hlices
transmembrana
Entre los aa 29-30
AM1143
YP_154244.1
Sin hlices
transmembrana
Entre los aa 24-25
AM1144
YP_154245.1
AM1156
YP_154249.1
Del aa 29 al 56
Entre los aa 36-37
Del aa 306 al 322
Sin helices
transmembrana
Sin peptide seal
Alineacin
(Blastp)
OMP1 de A.
marginale
cepa St.
Maries
Gen 3
asociado al
operon de la
MSP2 de A.
marginale
cepa St.
Maries
Gen 2
asociado al
operon de la
MSP2 de A.
marginale
cepa St.
Maries
Gen 1
asociado al
operon de la
MSP2 de A.
marginale
cepa St.
Maries
MSP2 de A.
marginale
cepa St.
Maries
OMP2 de A.
marginale
cepa St.
Maries
*Identidad
(%)
85%
100%
100%
90%
85%
95%
aa: Aminocido; OMP: Protena de membrana externa; MSP: Protena Principal de Superficie; TMpred:
http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html; SignalP 3.0: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ;
Blastp: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; *Identidad (%): Similitud existente entre las protenas de A. marginale con
protenas de otros patgenos relacionados.
145
(Continuacin).
Locus/Gen
No. Acceso
GenBank
Hlices
Sitio de clivaje
(TMpred)
(SignalP 3.0)
AM1159
YP_154250.1
Del aa 51 al 70
Del aa 91 al 109
AM1164
YP_154252.1
Del aa 311 al 335

Entre los aa 54-55
Del aa 345 al 365
AM1166
YP_154254.1
Del aa 152 al 171

Entre los aa 40-41
Del aa 274 al 300
Sin peptide seal
AM1197
Del aa 139 al 158

Del aa 188 al 207
YP_154277.1
Entre los aa 39-40
Del aa 246 al 268
Del aa 271 al 289
AM1219
YP_154292.1
Sin hlices
transmembrana
Entre los aa 26-27
AM1220
YP_154293.1
Del aa 32 al 50
Entre los aa 23-24
Del aa 289 al 310
AM1221
YP_154294.1
Del aa 32 al 50
Entre los aa 23-24
Del aa 292 al 313
Alineacin
(Blastp)
OMP3 de A.
marginale
cepa St.
Maries
OMP4 de A.
marginale
cepa St.
Maries
OMP5 de A.
marginale
cepa St.
Maries
Protena de
membrana
exportadora,
Sec F de A.
marginale
cepa St.
Maries
OMP6 de A.
marginale
cepa St.
Maries
OMP7 de A.
marginale
cepa St.
Maries
OMP8 de A.
marginale
cepa St.
Maries
*Identidad
(%)
87%
100%
97%
84%
100%
86%
88%

146
(Continuacin).
Locus/Gen
No. Acceso
GenBank
Hlices
Sitio de clivaje
(TMpred)
(SignalP 3.0)
Alineacin
(Blastp)
OMP9 de A.
Sin hlices
marginale
Entre los aa 23-24
transmembrana
cepa St.
Maries
OMP10 de A.
marginale
Del aa 283 al 299 Entre los aa 48-49
cepa St.
Maries
Protena de
membrana
Del aa 3 al 22
exportadora,
Del aa 362 al 380 Sin pptido seal
SecD de A.
Del aa 452 al 478
marginale
cepa St.
Maries
OMP11 de A.
marginale
Sin hlices
Entre los aa 24-25
cepa St.
transmembrana
Maries
AM1222
YP_154295.1
AM1223
YP_154296.1
AM1245
YP_154313.1
AM1255
YP_154318.1
AM1257
Del aa 185 al 207

YP_154319.1
Entre los aa 32-33
Del aa 221 al 241
AM1258
YP_154320.1 Del aa 46 al 65
Sin pptido seal
OMP12 de A.
marginale
cepa St.
Maries
OMP13 de A.
marginale
cepa St.
Maries
*Identidad
(%)
92%
96%
100%
100%
100%
88%

147
Tabla 6.2. Genes de A. marginale con dominios que codifican protenas de membrana
interna.
Locus/Gen
AM460
AM733
AM1076
Hlices
Sitio de clivaje
Alineacin *Identidad
(Blastp)
(%)
(TMpred)
(SignalP 3.0)
Del aa 35 al 56
Del aa 81 al 100
Del aa 434 al 456
IMP YidC de
YP_153758.1
Sin pptido seal
97%
Del aa 503 al 521
A. marginale
Del aa 559 al 578
Del aa 598 al 616
Del aa 5 al 23
IMP TerC de
Del aa 51 al 67
A. marginale
Del aa 81 al 100
YP_153938.1
Sin pptido seal
cepa St.
93%
Del aa 152 al 168
Maries
Del aa 183 al 201
Del aa 205 al 226
Del aa 29 al 49
IMP ana29 de
Del aa 69 al 88
A. marginale
87%
cepa St.
Del aa 184 al 202
Maries
Del aa 215 al 235
No. Acceso
GenBank
aa: Aminocido; IMP: Protena de membrana interna;

148
Tabla 6.3. Genes de A. marginale con dominios que codifican protenas del sistema de
secrecin tipo cuatro.
Locus/Gen
AM813
AM814
Hlices
Sitio de clivaje
(TMpred)
(SignalP 3.0)
Del aa 65 al 85
Del aa 91al 114
Del aa 416 al 435
Del aa 469 al 489
YP_153995.1
Entre los aa 24-25
Del aa 582 al 600
Del aa 606 al 625
Del aa 667 al 688
Del aa 761 al 783
Del aa 424 al 445
Del aa 564 al 587
No. Acceso
GenBank
Del aa 20 al 42
Del aa 48 al 65
AM815
YP_153997.1
AM1312
Del aa 11 al 35
Del aa 160 al 182
AM1313
YP_154360.1
AM1314
YP_154361.1
Sin helices
transmembranas
Sin pptido seal
Sin pptido seal
Del aa 33 al 51
Sin pptido seal
Del aa 339 al 361
Alineacin
(Blastp)
*Identidad
(%)
Protena
VirB6 de A.
marginale
92%
Protena
VirB4 de A.
marginale
Protena
VirB3 de A.
marginale
Protena
VirD4 de A.
marginale
Protena
VirB11 de A.
marginale
Protena
VirB10 de A.
marginale
100%
100%
83%
96%
86%
aa: Aminocido; TMpred: http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html; SignalP 3.0:

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ; Blastp: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; *Identidad (%): Similitud existente
entre las protenas de A. marginale con protenas de otros patgenos relacionados.
149
Tabla 6.4. Genes de A. marginale con dominios que sugieren la codificacin de protenas de
superficie
Locus/Gen
No. Acceso
GenBank
Hlices
Sitio de clivaje del
transmembranas
pptido seal
(TMpred)
(SignalP 3.0)
AM1315
YP_154362.1
Sin hlices
transmembranas
AM1316
YP_154363.1
Del aa 36 al 56
AM071
YP_153491.1
Sin hlices
transmembranas
AM139
YP_153536.1
Sin hlices
transmembranas
AM343
Del aa 42 al 59
YP_153679.1 Del aa 65 al 84
Del aa 133 al 151
Alineacin
(Blastp)
Protena
Entre los aa 25-26 VirB9 de A.
marginale
Protena
Sin pptido seal
VirB8 de A.
marginale
OMP de W.
Sin pptido seal
endosymbiont
OMP
Agrobacteriu
Entre los aa 21-22
m tumefaciens
cepa C58
OMP B2
Entre los aa 21-22
Moraxella
catarrhalis
*Identidad
(%)
93%
91%
27%
33%
46%
AM560
YP_153828.1
Del aa 40 al 56
Entre los aa 34-35
OMP putativa
Bordetella
pertussis
Hastahama I
AM686
YP_153918.1
Sin hlices
transmembranas
Sin pptido seal
OMP de W.
endosymbiont
41%
AM712
Del aa 740 al 759

Del aa 780 al 803
Del aa 1528 al 1557
YP_153931.1 Del aa 1999 al 2020
Del aa 2239 al 2257
Del aa 2846 al 2865
Del aa 3246 al 3268
Sin pptido seal
Lipoprotena
de superficie
MycoplaSM a
hyorhinis
21%
AM779
Del aa 113 al 131

YP_153970.1 Del aa 186 al 205
Del aa 410 al 428
Entre los aa 25-26
AM780
YP_153971.1
Del aa 206 al 225

Del aa 401 al 419
Entre los aa 22-23
OMP Porina
de E. canis
cepa Jake
OMP Porina
de E. canis
cepa Jake
37%
26%
27%

SignalP 3.0: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ; Blastp: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; *Identidad (%): Similitud
existente entre las protenas de A. marginale con protenas de otros patgenos relacionados.
150
superficie (Continuacin).
Locus/Gen
No. Acceso
GenBank
Hlices
Sitio de clivaje del
transmembranas
pptido seal
(TMpred)
(SignalP 3.0)
Alineacin
(Blastp)
*Identidad
(%)
OMP
AM798
YP_153984.1 Del aa 158 al 177
AM1067
YP_154186.1 Del aa 151 al 168
AM1078
Del aa 30 al 55
Del aa 59 al 85
YP_154192.1 Del aa 125 al 144
Del aa 171 al 189
Del aa 259 al 279
Entre los aa 22-23
Methanosarcin
a acetivorans
25%
Entre los aa 38-39
Lipoprotena
de OM de E.
canis cepa
Jake
31%
Sin pptido seal
OMP
precursora de
pmpC
31%
aa: Aminocido; OMP: Protena de membrana externa; OM: Membrana externa;

151
membrana interna
Locus/Gen
No. Acceso
GenBank
Hlices
transmembranas
(TMpred)
AM038
Del aa 8 al 27
YP_153472.1 Del aa 37 al 56
Del aa 59 al 77
AM041
YP_153474.1
AM118
YP_153519.1 Del aa 38 al 58
AM127
YP_153527.1
AM555
Del aa 4 al 23
Del aa 6 al 67
Del aa 117 al 134
YP_153823.1 Del aa 159 al 181
Del aa 201 al 220
Del aa 232 al 251
Del aa 266 al 282
AM562
Del aa 52 al 68
YP_153830.1 Del aa 104 al 124
Del aa 157 al 176
Sin hlices
transmembranas
Del aa 11 al 33
Del aa 839 al 859
Sitio de clivaje
del pptido seal
(SignalP 3.0)
Alineacin
(Blastp)
IMP
hipottica E.
ruminantium
Sin pptido seal
cepa
Welgevonden
IMP de E.
ruminantium
Entre los aa 22-23
cepa
Welgevonden
MP de
Rhodospirillu
m rubrum
Sin pptido seal
metalopeptid
asas
IMP
hipottica E.
ruminantium
Sin pptido seal
cepa
Welgevonden
Sin pptido seal
Sin pptido seal
*Identidad
(%)
32%
27%
36%
35%
IMP de E.
canis cepa
Jake
46%
IMP
hipottica E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
41%
aa: Aminocido; IMP: Protena de membrana interna; MP: Protena de membrana;

152
membrana interna (Continuacin).
Locus/Gen
AM616
Hlices
transmembranas
(TMpred)
Del aa 34 al 59
Del aa 72 al 90
YP_153867.1
Del aa 221 al 244
Del aa 514 al 533
No. Acceso
GenBank
AM649
YP_153889.1
Sin hlices
transmembranas
AM660
YP_153898.1
Sin hlices
transmembranas
AM788
Del aa 11 al 32
YP_153975.1 Del aa 108 al 126
Del aa 145 al 167
AM790
YP_153977.1
AM810
Del aa 335 al 352

Del aa 366 al 384
Del aa 447 al 469
YP_153992.1 Del aa 471 al 496
Del aa 518 al 537
Del aa 771 al 787
Del aa 791 al 814
AM811
YP_153993.1
Sin hlices
transmembranas
Del aa 594 al 619

Del aa 669 al 690
Del aa 697 al 716
Del aa 771 al 793
Del aa 804 al 824
Del aa 838 al 862
Del aa 925 al 944
Del aa 960 al 985
Sitio de clivaje
del pptido seal
(SignalP 3.0)
Alineacin
(Blastp)
MP
conservada
Sin pptido seal Mycobacteriu
m leprae TN
IMP de E.
ruminantium
Entre los aa 42-43
cepa
Welgevonden
IMP
hipottica E.
ruminantium
Sin pptido seal
cepa
Welgevonden
IMP
hipottica de
Sin pptido seal
Serratia
marcescens
MP de
Methylobacill
Sin pptido seal
us flagellatus
Entre los aa 57-58
Entre los aa 21-22
*Identidad
(%)
24%
20%
31%
28%
27%
IMP de W.
endosymbiont
31%
IMP de W.
endosymbiont
28%
aa: Aminocido; IMP: Protena de membrana interna; MP: Protena de membrana;

153
Locus/Gen
AM812
AM823
Hlices
transmembranas
(TMpred)
Del aa 22 al 44
Del aa 646 al 664
Del aa 669 al 688
Del aa 752 al 769
YP_153994.1 Del aa 777 al 802
Del aa 823 al 842
Del 864 al 884
Del aa 895 al 913
Del aa 919 al 941
No. Acceso
GenBank
YP_154003.1
Del aa 570 al 588

Del aa 672 al 690
Del aa 740 al 765
Del aa 768 al 791
Del aa 1153 al 1170
Del aa 1206 al 1227
del aa 34 al 54
Del aa 81 al 99
AM846
YP_154019.1
AM848
Del aa 29 al 49
Del aa 61 al 85
YP_154021.1
Del aa 99 al 117
Del aa 164 al 183
AM851
Del aa 1 al 18
YP_154023.1 Del aa 30 al 51
Del aa 55 al 75
AM862
YP_154032.1 Del aa 1 al 17
AM867
YP_154035.1 Del aa 20 al 38
Sitio de clivaje
del pptido seal
(SignalP 3.0)
Alineacin
(Blastp)
*Identidad
(%)
HMP de W.
endosymbiont
29%
IMP de E.
ruminantium
Entre los aa 22-23
cepa
Welgevonden
28%
Sin pptido seal
IMP
hipottica E.
ruminantium
Entre los aa 27-28
cepa
Welgevonden
IMP de E.
ruminantium
Entre los aa 21-22
cepa
Welgevonden
IMP de E.
ruminantium
Sin pptido seal
cepa
Welgevonden
HMP de E.
ruminantium
Sin pptido seal
cepa
Welgevonden
IMP de E.
ruminantium
Entre los aa 22-23
cepa
Welgevonden
60%
50%
50%
37%
37%
aa: Aminocido; IMP: Protena de membrana interna; HMP: Protena de membrana hipottica;
154
Sitio de clivaje
del pptido seal
(SignalP 3.0)
Alineacin
(Blastp)
*Identidad
(%)
Sin pptido seal
IMP
hipottica E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
20%
YP_154118.1 Del aa 1 al 18
Sin pptido seal
MP de E.
canis cepa
Jake
(Metalopeptid
asa)
38%
AM1054
YP_154175.1 Del aa 77 al 96
IMP de E.
ruminantium
Entre los aa 23-24
cepa
Welgevonden
72%
AM1055
YP_154176.1 Del aa 85 al 104
AM1056
YP_154177.1 Del aa 154 al 175
AM1103
Del aa 15 al 41
Del aa 56 al 80
Del aa 86 al 107
Del aa 124 al 143
Del aa 163 al 179
Del aa 202 al 220
YP_154212.1
Del aa 229 al 253
Del aa 268 al 290
Del aa 295 al 321
Del aa 324 al 343
Del aa 360 al 383
Del aa 405 al 424
Locus/Gen
AM921
AM965
No. Acceso
GenBank
Hlices
transmembranas
(TMpred)
Del aa 37 al 55
Del aa 110 al 133
YP_154086.1
Del aa 208 al 226
Del aa 276 al 295
IMP de E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
IMP
hipottica E.
Entre los aa 43-44 ruminantium
cepa
Welgevonden
Entre el aa 34-35
Sin pptido seal
IMP
hipottica de
E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
74%
74%
41%
aa: Aminocido; MP: protena de membrana; IMP: Protena de membrana interna;

155
Locus/Gen
No. Acceso
GenBank
Hlices
transmembranas
(TMpred)
Sitio de clivaje
del pptido seal
(SignalP 3.0)
AM1114
YP_154221.1 Del aa 6 al 28
Sin pptido seal
AM1179
YP_154263.1 Del aa 49 al 66
Entre los aa 29-30
AM1180
YP_154264.1 Del aa 40 al 58
Entre los aa 20-21
AM1181
YP_154265.1 Del aa 7 al 27
AM1209
Del aa 518 al 536

YP_154284.1 Del aa 570 al 589
Del aa 601 al 618
AM1248
AM1276
Del aa 217 al 241

Del aa 340 al 358
Del aa 369 al 389
YP_154314.1
Del aa 396 al 389
Del aa 396 al 414
Del aa 437 al 456
Del aa 30 al 52
Del aa 51 al 74
Del aa 83 al 104
YP_154332.1 Del aa 111 al 129
Del aa 143 al 162
Del aa 165 al 183
Del aa 208 al 230
Sin pptido seal
Sin pptido seal
Sin pptido seal
Sin pptido seal
Alineacin
(Blastp)
HMP de E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
IMP de E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
IMP de E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
HMP E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
IMP hipottica
E. ruminantium
cepa
Welgevonden
IMP hipottica
E. ruminantium
cepa
Welgevonden
IMP de E. canis
cepa Jake
*Identidad
(%)
29%
41%
26%
23%
22%
23%
53%
aa: Aminocido; IMP: Protena de membrana interna; HMP: Protena de membrana hipottica; TMpred:
http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html;
156
Locus/Gen
AM1285
AM1292
AM1298
AM1350
Hlices
Sitio de clivaje
(TMpred)
(SignalP 3.0)
Del aa 63 al 81
Del aa 133 al 152
Entre los aa 53-54
YP_154337.1 Del aa 174 al 194
Del aa 211 al 231
Del aa 250 al 272
No. Acceso
GenBank
YP_154342.1 Del aa 79 al 97
Del aa 10 al 34
Del aa 57 al 77
YP_154347.1 Del aa 85 al 106
Del aa 122 al 141
Del aa 146 al 179
Del aa 11 al 36
Del aa 57 al 82
YP_154386.1
Del aa 85 al 106
Del aa 129 al 148
Alineacin
(Blastp)
*Identidad
(%)
IMP de E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
25%
IMP de E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
28%
Sin pptido seal
HMP de E.
canis cepa Jake
36%
Sin pptido seal
HMP de W.
endosymbiont
41%
Entre los aa 30-31
aa: Aminocido; IMP: Protena de membrana interna; HMP: Protena de membrana hipottica;
157
secrecin.
Locus/Gen
No. Acceso
GenBank
Hlices
transmembranas
(TMpred)
Del aa 315 al 346
Del aa 375 al 394
Del aa 411 al 432
del aa 462 al 481
Del aa 540 al 558
Del aa 631 al 651
Sitio de clivaje
del pptido seal
(SignalP 3.0)
Alineacin
(Blastp)
*Identidad
(%)
Sin pptido seal
HSP de
Campylobacter
jejuni subsp.
jejuni
23%
AM387
YP_153704.1
AM579
YP_153843.1 Del aa 110 al 129
Sin pptido seal
AM796
YP_153982.1 Del aa 31 al 50
Sin pptido seal
HSP de
Magnetospirillum
magnetotacticum
HSP de E.
ruminantium
cepa
Welgevonden
22%
35%
aa: Aminocido; HSP: Protena de secrecin hipottica;

158
Figura 6.1. Electroferograma de la secuencia sentido del gen AM202 en el vector de expresin pMal-p4x. La
secuenciacin fue obtenida con el cebador Sentido pMal-p4x (5-GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC3) que secuencia a partir del extremo 5 terminal del inserto. La secuenciacin se realiz empleando un
Secuenciador Automtico de 4 capilares modelo 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA),
utilizando el kit BigDye v3.1 (Applied Biosystems, USA). Seal: 1209 Guanina (G), 538 Alanina (A), 657
Timina (T), 467 Citosina (C). Se secuenciaron 727 bases en 8777 escaneos. La lnea de color negro
corresponde a la base nitrogenada Guanina, la de color verde a la Alanina; la de color rojo a la Timina y la de
color azul a la Citosina. La flecha amarilla son posibles errores de la polimerasa Taq y la roja posibles
polimorfismos de un solo nucletido. El codn de inicio (ATG) est resaltado en verde y el de parada (TAA)
en rojo.
159
Figura 6.2. Electroferograma de la secuencia antisentido del gen AM202 en el vector de expresin pMal-p4x.
La secuenciacin fue obtenida con el cebador Sentido M13/pUC (5-GTAAAACGACGGCCAG-3), el cual
secuencia a partir del 3 terminal del inserto. La secuenciacin se realiz empleando un Secuenciador
Automtico de 4 capilares modelo 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA), utilizando el kit
BigDye v3.1 (Applied Biosystems, USA). Seal: 1352 Guanina (G), 1176 Alanina (A), 1147 Timina (T),
1078 Citosina (C). Se secuenciaron 730 bases en 8764 escaneos. La lnea de color negro corresponde a la
base nitrogenada Guanina, la de color verde a la Alanina; la de color rojo a la Timina y la de color azul a la
Citosina. La flecha amarilla son posibles errores de la polimerasa Taq y la roja posibles polimorfismos de un
solo nucletido. La secuencia complementaria del codn de inicio (CAT) esta resaltada en verde. No se logr
obtener la secuencia complementaria del codn de parada (TTA).
160
161
Figura 6.3. Electroferograma de la secuencia sentido del gen AM244 en el vector de expresin pThioHisA.
La secuenciacin fue obtenida con el cebador Sentido Trx (5-TTCCTCGACGCTAACCTG-3). La
secuenciacin se realiz empleando un Secuenciador Automtico de 4 capilares modelo 3130 Genetic
Analyzer (Applied Biosystems, USA), utilizando el kit BigDye v3.1 (Applied Biosystems, USA). Seal: 276
Guanina (G), 228 Alanina (A), 166 Timina (T), 170 Citosina (C). Se secuenciaron 929 bases en 11560
escaneos. La lnea de color negro corresponde a la base nitrogenada Guanina, la de color verde a la Alanina;
la de color rojo a la Timina y la de color azul a la Citosina. La flecha amarilla son posibles errores de la
polimerasa Taq y la roja posibles polimorfismos de un solo nucletido. La secuencia del codn de inicio
modificado (CCG) est resaltada en verde. No se logr secuenciar el codn de parada (TAG).
162
163
Figura 6.4. Electroferograma de la secuencia antisentido del gen AM244 en el vector de expresin
pThioHisA. La secuenciacin fue obtenida con el cebador Antisentido Trx
(5-TGTAAAACGACGGCCAGTGC-3). La secuenciacin se realiz empleando un Secuenciador
Automtico de 4 capilares modelo 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA), utilizando el kit
BigDye v3.1 (Applied Biosystems, USA). Seal: 387 Guanina (G), 317 Alanina (A), 277 Timina (T), 301
Citosina (C). Se secuenciaron 875 bases en 10656 escaneos. La lnea de color negro corresponde a la base
nitrogenada Guanina, la de color verde a la Alanina; la de color rojo a la Timina y la de color azul a la
Citosina. La flecha amarilla son posibles errores de la polimerasa Taq y la roja posibles polimorfismos de un
solo nucletido. La secuencia complementaria del codn de parada (CTA) est resaltada en rojo. No se logr
obtener la secuencia complementaria del codn de inicio modificado (CGG).
164
Figura 6.5. Electroferograma de la secuencia sentido del gen AM573 en el vector de expresin pMal-p4x. La
secuenciacin fue obtenida con el cebador Sentido pMal-p4x (5-GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC3) que secuencia a partir del extremo 5 terminal del inserto. La secuenciacin se realiz empleando un
Secuenciador Automtico de 4 capilares modelo 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA),
utilizando el kit BigDye v3.1 (Applied Biosystems, USA). Seal: 1826 Guanina (G), 1272 Alanina (A), 961
Timina (T), 948 Citosina (C). Se secuenciaron 700 bases en 8433 escaneos. La lnea de color negro
corresponde a la base nitrogenada Guanina, la de color verde a la Alanina; la de color rojo a la Timina y la de
color azul a la Citosina. La flecha roja indica un posible polimorfismo de un solo nucletido. La secuencia
del codn de inicio (TTG) est resaltada en verde y la del codn de parada (TAG) en rojo .
165
Frec.
Posicin
Frec.
Posicin
Figura 6.6. Anlisis del uso frecuentes de codones por la bacteria E. coli para la expresin del gen AM202 de A.
marginale. Las barras rojas sealan que la frecuencia en que son utilizados esos codones por E. coli para esos
aminocidos es menor al 1%. Las barras verdes indican una frecuencia de uso del codn mayor al 1%. Fraccin de
codones censados por debajo del umbral (<1.00 %): 16 aa/195 totales (8%). Programa E. coli Codon Usage
Analyzer 2.1 (http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm).
166
Frec.
Posicin
Frec.
Posicin
Frec.
Posicin
167
Frec.
Posicin
Frec.
Posicin
Figura 6.7. Anlisis del uso frecuentes de codones por la bacteria E. coli para la expresin del gen AM244 de A.
marginale. Las barras rojas sealan que la frecuencia en que son utilizados esos codones por E. coli para esos
aminocidos es menor al 1%. Las barras verdes indican una frecuencia de uso del codn mayor al 1%. Fraccin
de codones censados por debajo del umbral (<1.00 %): 43 aa/441 totales (9%). Programa E. coli Codon Usage
Analyzer 2.1 (http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm).
168
Frec.
Posicin
Figura 6.8. Anlisis del uso frecuentes de codones por la bacteria E. coli para la expresin del gen AM5734
de A. marginale. Las barras rojas sealan que la frecuencia en que son utilizados esos codones por E. coli
para esos aminocidos es menor al 1%. Las barras verdes indican una frecuencia de uso del codn mayor al
1%. Fraccin de codones censados por debajo del umbral (<1.00 %): 6 aa/68 totales (8%). Programa E. coli
Codon Usage Analyzer 2.1 (http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm).
169
MSP1a
MSP1b
MSP2
MSP4
Figura 6.9. Gel de SDS-PAGE teido con plata de las fracciones de A. marginale. Carril 1 contiene
material soluble despus de la lisis de la rickettsia por sonicacin. Carril 2 contiene toda la rickettsia.
Carril 3 contiene el material de membrana de la rickettsia. Carril 4, 5 y 6 contiene los productos
secuenciales de los pasos de solubilizacin de la membrana: del material de membrana soluble en 2% de
Zwittergent 3-12, material de membrana soluble en 6M de guanidina HCl y material de membrana soluble
en 2% de SDS, respectivamente (Hope y col., 2004; modificado por Ferreira, 2013).
MSP1a y b
MSP2
Dupleta 25 kDa
MSP5
Figura 6.10. Inmunizaciones de bovinos con el complejo de superficie indujo un subgrupo de anticuerpos antgeno
especficos en comparacin con la inmunizacin con membranas externas. Los antgenos de A. marginale aislado
de eritrocitos de bovinos infectados fueron detectados con el suero de animales inmunizados, diluido 1:3000. Se
demostr una exposicin diferente para el animal 53 inmunizado con membrana externa, donde se ve con ms
claridad la dupleta de 100 kDa. No se observaron anticuerpos inespecficos en los animales previos a la
inmunizacin (72P) o en los animales inoculados con adyuvante (Noh y col., 2008; modificado por Ferreira, 2013).
170
CONGRESOS
ANLISIS DE LA SECUENCIA DEL GENOMA DE Anaplasma marginale PARA LA

IDENTIFICACIN DE PROTENAS DE SUPERFICIE O DE EXCRECIN PARA SU
USO POTENCIAL EN VACUNAS.
(Genome sequence analysis of Anaplasma marginale to identification surface or excretion
protein to use potential in vaccine)
Ferreira, J.; Porco, A. y Caballero, H.
Universidad Simn Bolvar
E-mail: jferreira50@yahoo.com
La anaplasmosis es una enfermedad infecciosa que afecta al ganado vacuno, causada por la
rickettsia intraeritroctica Anaplasma marginale. Dicha patologa esta caracterizada por
anemia progresiva, alteracin del sistema inmune, debilidad severa e ictericia, causa severas
prdidas econmicas debido a su incidencia negativa sobre la ganancia de peso y produccin
de leche del ganado. A pesar de su impacto global, no se ha desarrollado una vacuna efectiva
hasta el momento; sin embargo, con la ventaja de la Vacunologa Inversa el campo de las
vacunas es radicalmente cambiado, proporcionando la oportunidad de desarrollar nuevas y
mejores vacunas. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es identificar posibles protenas de
superficie o excretadas para ser utilizadas como blancos antignicos para el desarrollo de
vacunas contra A. marginale empleando la Vacunologa Inversa. Para ello, a partir de la
secuencia genmica del A. marginale cepa St. Maries, reportada en el banco de datos
GenBank, se realiz un anlisis in silico, en el cual se clasificaron los marcos de lectura
abiertos (ORF) de funcin desconocida por homologa de secuencias empleando el programa
BLAST. Adems se emple el programa SignalP versin 3.0 para la prediccin del pptido
seal y por ltimo las hlices transmembrana fueron identificadas por el programa TMpred. El
anlisis in silico realizado a estas protenas mostr la presencia de 16 protenas de membrana
externa, 6 protenas de secrecin, 2 protenas periplasmticas y 33 protenas integrales de
membrana. Estos resultados permitirn que estas protenas puedan considerarse como posibles
inmungenos favoreciendo as el desarrollo de vacunas.
Palabras claves: Anaplasmosis, Anaplasma marginale, Vacunologa Inversa.
171
172
173
EXPRESIN DE LOS GENES AM202, AM244, AM573, AM778, AM796, AM854 Y AM1097
DE Anaplasma marginale: POSIBLES INMUNGENOS SEGN EL ANLISIS in silico
DEL GENOMA DE ESTE HEMOPARSITO.
Expression of the genes AM202, AM244, AM573, AM778, AM796, AM854 and AM1097 of
Anaplasma marginale: possible immunogen according to in silico analysis of the genome of
this hemoparasite
Ferreira, J.; Porco, A. y Caballero, H.
Universidad Simn Bolvar
E-mail: jferreira50@yahoo.com
La anaplasmosis es una enfermedad infecciosa que afecta a bovinos, causada por la
rickettsia intraeritroctica Anaplasma marginale. A pesar del impacto global de la enfermedad,
no se ha desarrollado una vacuna efectiva hasta el momento, probablemente debido a que las
investigaciones se han orientado fundamentalmente hacia las denominadas Protenas
Principales de Superficie, las cuales tienen un carcter inmunodominante pero brindan una
proteccin parcial. Con la ventaja de la secuenciacin del genoma de A. marginale y de la
bioinformtica, el campo de las vacunas es radicalmente cambiado, proporcionando la
oportunidad de convertir a protenas de superficie poco o no inmunognicas, probablemente
esenciales para la vida del patgeno, en blancos antignicos. Este nuevo enfoque es llamado
Vacunologa Inversa, que permite generar nuevos y mejores candidatos vacunales para el
desarrollo de una vacuna segura y eficaz para patgenos difciles de cultivar. Un estudio
previo realizado en nuestro laboratorio, aplicando este nuevo enfoque, permiti la
identificacin en el genoma de A. marginale, de los genes que codifican para 16 protenas de
membrana externa, 6 protenas de secrecin, 2 protenas periplasmticas y 33 protenas
integrales de membrana. De estos, se escogieron siete genes ubicados en los loci AM202,
AM244, AM573, AM778, AM796 y AM1097, por ser los candidatos ms fuertes a ser protenas
de secrecin o transmembrana que pudieran ser blancos antignicos en el desarrollo de
vacunas contra esta rickettsia. Objetivo: Demostrar la expresin de los genes AM202, AM244,
AM573, AM778, AM796, AM854 y AM1097, los cuales pudieran codificar protenas putativas
de membrana externas, periplasmticas o de secrecin; pudiendo ser considerados blancos
antignicos, ayudando as al desarrollo de vacunas contra A. marginale. Metodologa: Basados
en la secuencia genmica reportada en el GenBank, se disearon los cebadores para la
amplificacin de dichos genes mediante RT-PCR y de esta manera demostrar su expresin.
Los resultados obtenidos demostraron que los sietes genes se expresan en esta rickettsia.
Actualmente se est llevando a cabo la clonacin y expresin de los mismos con la finalidad
de evaluar su potencial uso en la elaboracin de vacunas.
174
175
176
EXPRESIN Y PURIFICACION DE LAS PROTENAS AM202 Y AM573 DE

Anaplasma marginale.
Ferreira, J., Martinez, J., Porco, A. y Caballero, H.
Universidad Simn Bolvar. Departamento de Biologa Celular. Sartenejas. Estado Miranda.
Venezuela.
La Fundacin Instituto de Estudios Avanzados IDEA. Departamento de Estructura Molecular.
Sartenejas. Estado Miranda. Venezuela.
Introduccin: La anaplasmosis es una enfermedad infecciosa que afecta a bovinos, causada
por la rickettsia intraeritroctica Anaplasma marginale. A pesar de su impacto global, no se ha
desarrollado una vacuna efectiva hasta el momento. Con la ventaja de la Vacunologa
Inversa, el campo de las vacunas esta cambiando radicalmente, proporcionando la
oportunidad de desarrollar nuevas y mejores vacunas. Un estudio in silico previo, realizado en
nuestro laboratorio, permiti la identificacin, de dos genes ubicados en los loci AM202 y
AM573 en el genoma de A. marginale, fuertes candidatos a ser protenas de secrecin o
transmembrana que pudieran ser potenciales blancos antignicos en el desarrollo de vacunas
contra esta rickettsia. Objetivo: Expresar y Purificar las protenas AM202 y AM573
consideradas potenciales inmungenos, ayudando as al desarrollo de vacunas contra A.
marginale. Metodologa: Los genes AM202 y AM573 fueron insertados en el vector de
expresin pMal-p4x, obtenindose el plsmido recombinante pMal-p4x-AM202 y pMal-p4xAM573, generando una protena de fusin MalE-AM202 y MalE-AM573, respectivamente.
Para la expresin, se transform Escherichia coli K12 con los plsmidos recombinantes,
empleando el medio de cultivo Luria Bertani, estandarizndose tiempo y temperatura de
induccin. La expresin fue analizada en geles de SDS-PAGE al 10%. Para la purificacin, se
emple el sobrenadante, obtenido despus de la lisis celular, el cual fue transferido a la resina
Amilosa, incubndose a 4 C con rotacin durante la noche. La resina fue empacada y lavada
para eluir la protena y analizarla en geles de SDS-PAGE al 10%. La concentracin de las
protenas recombinantes se midi usando el mtodo de Bradford. Resultados: La mejor
expresin se obtuvo con la incubacin a 16 C por 20 horas post-induccin. La purificacin
por cromatografa de afinidad no fue a homogeneidad. La concentracin de las protenas
recombinantes purificadas fue de 1,6 mg, partiendo de un litro de medio de cultivo.
Conclusiones: Se estandariz la expresin y purificacin de las protenas recombinantes
AM202 y AM573 de A. marginale, lo que facilitar posteriores ensayos para determinar si
estas protenas son potenciales inmungenos, lo que favorecer el desarrollo de vacunas.
177
178
179
PUBLICACIONES
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UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR

DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

IDENTIFICACIN DE NUEVOS ANTGENOS DE Anaplasma marginale

Joilyneth Ferreira Reyes

UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR

IDENTIFICACIN DE NUEVOS ANTGENOS DE Anaplasma marginale

Tesis Doctoral presentado a la Universidad Simn Bolvar por

Joilyneth Ferreira Reyes

como requisito parcial para optar al grado acadmico de

Doctor en Ciencias Biolgicas

Con la asesora de los profesores

Les agradezco a todos mis compaeros y profesores del Grupo de Bioqumica e

Al Fondo Nacional de Ciencias y Tecnologa (FONACIT),

por ser un apoyo

Finalmente, le agradezco a Dios por haberme puesto a todas estas personas en mi

UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR

ACTA DEL VEREDICTO

CAPTULO I: MARCO TERICO

1.1. Biologa del Anaplasma marginale..

1.1.1. Clasificacin Taxonmica.......

1.1.2. Morfologa del Anaplasma marginale.

1.2. Genoma de A. marginale..

1.3. Caractersticas de la Anaplasmosis Bovina..

1.3.1. Distribucin geogrfica e incidencia mundial de la enfermedad.

1.3.2. Transmisin de la Anaplasmosis.

1.3.3. Patogenia y patologa de la enfermedad..

1.4. Respuesta inmune del bovino.......

1.4.1. Inmunidad natural o innata.......

1.4.2. Inmunidad adquirida.

1.4.2.1. Inmunidad humoral

1.4.2.2. Inmunidad celular..

1.5. Control de la Anaplasmosis Bovina..

1.5.1. Mtodos de inmunizacin contra la anaplasmosis.......

1.5.1.2. Inmunizacin con organismos inactivados

1.5.1.2.1. Inmunizacin con cuerpos iniciales inactivos de A. marginale...

1.5.1.2.2. Inmunizacin con A. marginale inactivo derivado de cultivo.

1.5.1.2.3. Inmunizacin con membrana externa de A. marginale...

1.5.1.3. Subunidades vacunales..

1.5.1.3.1. Inmunizacin con protenas nativas y recombinantes de A.

1.6. Vacunologa Inversa: del genoma al microorganismo.................................................

1.6.1. La Bioinformtica en el anlisis de genomas..

1.6.2. Del candidato al antgeno: inmunogenicidad y proteccin..

1.6.3. Aplicacin de la Vacunologa Inversa: potenciales candidatos vacunales..

1.8. Objetivo general

1.9. Objetivos especficos

CAPTULO II: MARCO METODOLGICO...

2.1. Plan de Trabajo.

2.2.1. Seleccin de genes candidatos vacunales de A. marginale..................

2.2.2. Aislamiento del ADN genmico del A. marginale.......

2.2.3. Aislamiento del ADN plasmdico.

2.2.4. Aislamiento del ARN de A. marginale.

2.2.5. Reaccin en cadena de la polimerasa.......

2.2.6. Reaccin en Cadena de la Polimerasa por Transcripcin Reversa...

2.2.7. Clonacin de los genes seleccionados de A. marginale

2.2.8. Transformacin de las Escherichia coli

2.2.9. Electroforesis en geles de agarosa...

2.2.10. Cuantificacin espectrofotomtrica de cidos nucleicos

2.2.11. Anlisis de secuencias

2.2.12. Produccin de protenas recombinantes de A. marginale en la bacteria

2.2.12.1. Determinacin de la solubilidad de las protenas AM202 y AM573 en

2.2.12.2. Determinacin de la solubilidad de la protena AM244 en el vector de

2.2.13. Purificacin de las protenas recombinantes...

2.2.14. Aislamiento de cuerpos iniciales de A. marginale.