Manual de Laboratorio

Bioqumica

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Normas y
Recomendaciones

Elaborado por:
Dra. Claudia Sandoval Yez
Dra. Tatiana Gmez Cano
Dra. Ximena Zrate Bonilla
Dr. Cristian Linares Flores
Dr. Desmond MacLeod Carey

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Recomendaciones

1. Es obligacin del alumno realizar el total de los laboratorios programados. La inasistencia debe
ser debidamente justificada, mediante un certificado mdico a travs de la Direccin de Carrera,
dentro de las 48 horas siguientes a la ausencia del prctico.
La falta del prctico sin justificar A TIEMPO o la ausencia a ms de una prctica significa
automticamente la reprobacin del curso.
2. Como norma de seguridad, los alumnos dejarn sus pertenencias en los casilleros que se
encuentran fuera de los laboratorios usando un candado para su seguridad. Por ningn motivo
dentro del laboratorio y menos, sobre los mesones de trabajos.
3. Frente al uso de cualquier reactivo, el alumno debe tomar las precauciones indicadas por el
profesor y/o ayudante, como asimismo las sealadas por el fabricante. Ante cualquier duda, ms
vale preguntar.
4. Se recomienda el uso del cuaderno de laboratorio ya que le ayudara a recopilar toda la
informacin realizada en el laboratorio para posteriormente elaborar el informe que se entregar
al finalizar cada prctica.
5. El trabajo de laboratorio es grupal.
6. Evaluacin: Las notas estn dentro del 25% de la nota del curso que se suma con los talleres
tericos.

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Normas de Laboratorio

Normas para el trabajo en el laboratorio

El laboratorio debe ser un lugar seguro para trabajar. Para ello se tendrn siempre presentes los
cuidados asociados al trabajo con materiales peligrosos. Nunca hay excusa para los accidentes en
un laboratorio bien equipado, en el cual tanto profesores y alumnos se encuentran bien
informados. A continuacin se exponen una serie de normas que deben conocerse y cumplirse en
el laboratorio:
1. El estudiante debe presentarse puntualmente a la actividad. No se permitir el ingreso de
estudiantes a la actividad despus de 10 minutos del horario de inicio.
2. El estudiante debe presentarse con delantal, pelo tomado (si corresponde), ropa adecuada y
zapato cerrado, para proteger la ropa y el cuerpo en caso de accidente. Evitar el uso de accesorios
(anillos, pulseras u otros) que puedan enredarse o limitar la manipulacin de los instrumentos y
material de laboratorio. Sandalias, zapatos abiertos y tacos altos, as como, pantalones y faldas
cortas, no son permitidos en el laboratorio.
3. Cada estudiante debe ingresar al laboratorio con su Gua del Laboratorio, de modo que pueda
desarrollar la actividad sin entorpecer el trabajo de los dems. Leer cuidadosa y minuciosamente
las guas de prcticas antes de ingresar al laboratorio es obligacin de cada estudiante. Esto
permitir desempear una buena prctica y conocer de antemano los posibles riesgos en sta.
4. En el laboratorio slo se permite el uso de cuaderno, lpices, calculadora, guas y libros de
apoyo. Las prendas personales no deben dejarse sobre el mesn de trabajo. Tampoco debe haber
sobre ellas muchos libros ya que pueden daarse con los reactivos y quitar el espacio. Los
laboratorios poseen lockers para guardar las mochilas y bolsos.
5. Gafas de seguridad son requeridas en algunos trabajos prcticos. Salpicaduras de reactivos son
posiblemente el riesgo ms importante en el laboratorio.
6. Lentes de contacto no son recomendados en el laboratorio. Al contacto con algunos gases, los
lentes de contacto se pueden secar y/o absorber los gases.
7. Mantener una conducta responsable y atenta dentro del laboratorio. Evite distraerse, no
juegue, ni manipule innecesariamente los materiales o reactivos. Se exige un comportamiento que
permita un desarrollo adecuado del laboratorio. El estudiante debe evitar situaciones de riesgo,
como correr y jugar en el laboratorio.

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8. Si el estudiante requiere salir del laboratorio, debe informarle al profesor. Una ausencia
prolongada y sin informar puede ser considerada como inasistencia.
9. No est permitido el uso de aparatos de audio, telfonos celulares, ni el consumo de ningn
tipo de bebida o comida (incluido el chicle). Tampoco est permitido fumar. El profesor puede
solicitar al estudiante que abandone el laboratorio si no cumple con esta norma, quedando
ausente de la actividad. No existe la posibilidad de apelar a esta sancin, pues el estudiante debe
aprender las normas mnimas de comportamiento en un laboratorio.

Normas generales
1. En caso de padecimiento de alguna enfermedad o condicin informarla al profesor.
2. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material. Al finalizar
el laboratorio debe asearse el rea de trabajo y entregarse al profesor los aparatos y materiales
usados totalmente limpios, secos y ordenados. Cuide de dejar bien apagados, todos los
instrumentos elctricos que haya usado.

Normas de seguridad en el laboratorio

Utilizacin de Productos Qumicos:

Toda sustancia qumica peligrosa, ya sea lquida, slida o gaseosa, debe ser manipulada con mucho
cuidado bajo la campana extractora de vapores, mantenerse bien tapada y en un lugar seguro
dentro de la misma campana. Estas sustancias no deben ser sacadas desde la campana, por ningn
motivo.
1. Antes de utilizar un compuesto, leer el rtulo para asegurarse de que es el correcto.
2. Como regla general, utilizar slo los reactivos dispuestos en los mesones de trabajo. No
manipular otros reactivos.
3. Al preparar cualquier disolucin sta debe ser dispuesta en un frasco limpio y rotulado
convenientemente.
4. Nunca devolver los sobrantes de los reactivos utilizados a los frascos de origen sin consultar
con el profesor.

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5. Al eliminar los productos qumicos de desecho en la pila de desage, es importante dejar

circular abundante agua, aunque stos estn debidamente neutralizados.
6. Los cidos requieren un cuidado especial. Al diluirlos, nunca se debe agregar agua sobre ellos.
Siempre se debe agregar el cido sobre agua.
7. Los productos qumicos inflamables (gases, alcohol, ter, etc) no deben estar cerca de fuentes
de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se har al bao Mara, nunca
directamente a la llama.
8. No tocar los productos qumicos con las manos ni con la boca. As mismo, debe evitar exponerse
a sus vapores.
9. No pipetear reactivos con la boca. Utilizar la bomba manual, una propipeta, jeringuilla o
artilugio que se disponga para ello.
10. Si, por accidente, vierte cualquier cido o producto corrosivo sobre usted, avise al profesor y
lvese inmediatamente con abundante agua.
11. Nunca realizar reacciones que no estn explicitadas en la gua de laboratorio, sin el
consentimiento del profesor.

Fuego en el laboratorio
1. Mantener la calma.
2. En caso de encenderse ropa se recomienda la utilizacin de la ducha de seguridad.
3. Nunca usar extinguidores sobre una persona. Pueden ocasionar shock y asfixia.
4. Nunca mover ningn objeto encendido, ya que podra empeorar la situacin.
5. Nunca usar agua para extinguir un fuego qumico.

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Derramamiento de qumicos
1. Informar inmediatamente un derramamiento al profesor o al ayudante.
2. En caso de derramamiento sobre una persona, inmediatamente sacar la ropa afectada y lavar la
zona del cuerpo afectada con mucha agua. En caso de que el derramamiento sea mayor, acudir
hacia la ducha de seguridad y remover las ropas contaminadas mientras el agua est corriendo.
3. Pequeas salpicaduras sobre el mesn, piso o balanzas debe ser limpiado inmediatamente.
Bicarbonato de sodio y vinagre se recomienda como agentes de neutralizacin de cidos y bases,
respectivamente. Neutralizar derramamientos de cidos y bases antes de limpiar.

Equipo de laboratorio
1. Cerciorarse que el material que se le entregue est en buen estado. El empleo de aparatos de
vidrio rotos o trizados pueden hacer fracasar un experimento y lo que es peor, producirle heridas.
Por lo tanto, descarte este tipo de material.
2. Antes de usar un mechero, se recomienda cerciorarse de la ausencia de solventes orgnicos en
las cercanas. Existen solventes orgnicos que son altamente inflamables.
3. Emplear el correcto material en cada experiencia. Solamente el profesor puede indicar el
cambio de un material por otro.
4. Nunca dejar un aparato o equipo, funcionando sin vigilancia.

Utilizacin de vidrio
1. Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio.
2. El vidrio caliente (y metales) no se diferencia a simple vista del vidrio fro. Para evitar
quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo o tomarlo con material adecuado (pinzas).
3. Nunca introducir un tapn de goma a un tubo de vidrio sin primero humedecer el tubo con
agua, solucin jabonosa o glicerina. Se recomienda adems proteger las manos con guantes, toalla
de papel o trapos.

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4. Al calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observe cuidadosamente estas dos

normas:
Proceda con mucho cuidado y tenga en cuenta que la boca del tubo de ensayo no
apunte a ningn compaero: el lquido puede hervir proyectndose hacia su entorno,
ocasionando un accidente.
Caliente el tubo de ensayo por el costado, nunca por el fondo agite suavemente.

Utilizacin de Balanzas
1. Cuando se determinan masas de productos qumicos, debe colocarse un papel de filtro sobre los
platos de la balanza. Si el producto fuera corrosivo, se utilizar un vidrio de reloj.
2. La balanza debe estar dispuesta en un mueble aislado para evitar cualquier perturbacin que
conduzca a un error, como vibraciones (debidas a golpes o a aparatos en funcionamiento).
Asimismo, procure no soplar sobre los platos de la balanza para evitar lecturas errneas.

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Prctico 1:
Propiedades cido base de
un aminocido

Elaborado por:
Dra. Claudia Sandoval Yez
Dra. Tatiana Gmez Cano
Dra. Ximena Zrate Bonilla
Dr. Cristian Linares Flores
Dr. Desmond MacLeod Carey

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INTRODUCCIN
Los aminocidos son compuestos nitrogenados que se caracterizan por presentar un grupo amino
(-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH) unidos al mismo carbono. Estos dos grupos se pueden ionizar
en medio acuoso, siendo los responsables del anfoterismo de los aminocidos, es decir, pueden
actuar como cidos o como bases, en funcin del pH del medio (los compuestos que son capaces
de aceptar o ceder protones se denominan anfteros o anfolitos): el grupo -carboxilo se comporta
como un cido dbil y el grupo amino, como una base dbil. Por ello, la carga de los aminocidos
vara en funcin del pH. Adems, cinco de los aminocidos proteingenos presentan otro grupo
ionizable en su cadena lateral: Lys, Arg, His (aminocidos con carga positiva o bsicos), Asp y Glu
(Aminocidos con carga negativa o cidos).

Por esta razn, los aminocidos son excelentes amortiguadores. Los grupos cido-base dbiles
presentan una capacidad tamponadora mxima en la zona prxima al pKa. La tabla inferior
muestra los pKa de los 20 a constituyentes de protenas. Hay que destacar el hecho de que estos
valores de pKa calculados para los a en disolucin pueden verse ligeramente modificados en el
entorno proteico. Se observa que el nico grupo lateral con un pKa prximo al pH fisiolgico es la
cadena lateral de la histidina. Por ello, las protenas ricas en este a se comportarn como
excelentes amortiguadores fisiolgicos.

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El comportamiento cido-base de los a es el que va a determinar las propiedades electrolticas de

las protenas, y de ellas dependen, en gran medida, sus propiedades biolgicas. En el modelo de
interaccin protena-ligando, la carga elctrica de una y otro juegan un papel fundamental. Por
este motivo, la funcin de las protenas es extraordinariamente sensible al pH:
A pH bajo, la mayor parte de los grupos disociables estarn protonados, y por lo tanto habr un
gran nmero de cargas positivas en la protena.
A pH elevado, los grupos disociables no estarn protonados, con lo cual habr mayor nmero de
cargas negativas.
Cambios en el pH se traducen en cambios en el nmero de cargas de la protena, y estos cambios
pueden inhibir la interaccin de la protena con un ligando determinado. Por este motivo, muchas
protenas (enzimas, sobre todo) slo pueden funcionar en un margen relativamente estrecho de
pH. Aqu radica la importancia del mantenimiento de valores constantes de pH en el medio interno
del organismo

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En el caso de los aminocidos cuya cadena lateral no posee grupos ionizables, se establecen dos
equilibrios en solucin acuosa entre tres formas inicas distintas. Dichos equilibrios vienen
determinados por las constantes de equilibrio del grupo carboxilo (KC) y del grupo amino (KN):

Al existir dos equilibrios, aparecen dos constantes de equilibrio distintas y tres especies inicas en
disolucin. La constante de equilibrio del grupo carboxilo (KC) relaciona las formas inicas I & II,
mientras que la constante de equilibrio del grupo amino (KN) relaciona las formas inicas II & III.
Tambin se observa del esquema, la existencia de un Zwitterion o ion dipolar, se corresponde con
la forma II, en la que el grupo -carboxilo y el grupo amino estn disociados, por lo que la carga
neta del aminocido es nula. A este pH, el aminocido no presentara movilidad electrofortica.
De esta forma, podemos definir el punto isoelctrico (pI) de un aminocido, como el pH en que la
carga neta del aminocido es nula en este punto el aminocido se encuentra en forma de ion
dipolar, as como en pequeas cantidades equimolares de aniones y cationes y una pequea
fraccin de aminocido no ionizado. Los pI de los aminocidos constituyentes de protenas, se
encuentran listados arriba. En este caso, el pI se calcula como la media aritmtica de los pKC y
pKN.

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Cuando los aminocidos poseen cadenas laterales ionizables, se debe analizar caso a caso,
encontrando primeramente los equilibrios que dan origen al Zwitterion, y luego utilizar ellos para
el clculo de pI, por ejemplo para aminocidos con cadena lateral cida o cadena lateral bsica, los
pI se calculan de las siguientes formas:

Experimentalmente, se puede llevar a cabo una curva de titulacin, la cual es la representacin

grfica de la variacin del pH de una disolucin por la adicin de equivalentes de cido o base.
En el caso de los aminocidos, las curvas de titulacin proporcionan la siguiente informacin:
Medida del pK de los grupos ionizables: se localizan en el punto medio de la zona
tampn.
Regiones de capacidad tampn: mesetas donde se localizan los pKs dichas
regiones se encuentran en el intervalo pK 1 unidad de pH.
-

pI: se localiza en el intervalo de viraje.

Formas ionizables del aminocido en cada rango de pH.

Carga elctrica del aminocido en cada rango del pH

Solubilidad relativa del aminocido en cada rango de pH.

En este trabajo prctico, realizar la curva de titulacin del aminocido glutamato, utilizando una
muestra de ajinomoto comercial. Mucho se ha dicho de este peculiar sazonador, desde que ha
sido daino para la salud, cancergeno y otros males. Sin embargo, se encuentra en casi todos los
alimentos que consumimos a diario. El Glutamato monosdico ha sido utilizado como sazonador
desde hace un siglo por sus propiedades de realzar los sabores ms agradables de los alimentos, y
as poder destacar el famoso quinto sabor: el umami. El glutamato monosodico, tambin conocido
como MSG, es un aditivo alimentario del tipo de sales de sodio, donde el acido glutamico otorga
sus curiosas propiedades.

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OBJETIVOS:
1.

Entender las propiedades cido base de los aminocidos.

2.

Determinar los valores de pKC, pKN y pI de un aminocido.

MATERIALES:
-

Vaso precipitado 100mL (2xgrupo)

Pipeta 5mL

Propipeta

Matraz aforado de 100 mL

Pinza

Soporte universal

Bureta de 50 mL

Balanza granataria

Esptula

Equipo para medir pH (pHmetro)

REACTIVOS:
-

Ajinomoto comestible

NaOH 0,100 M

Fenolftalena

HCl 0,1 M

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PROCEDIMIENTO:
A) Preparacin de una disolucin de Glutamato Monosdico 0,10 M
Prepare 100 mL de una disolucin de Glutamato Monosdico 0,10 M, considerando que el
ajinomoto est constitudo en un 100 % por este aminocido.
B) Realizacin de Curva de Titulacin de Glutamato Monosdico 0,10 M
Disponga 5,00 mL de la disolucin de Glutamato Monosdico 0,10 M en un vaso de precipitado de
100 mL, agregue aproximadamente 20 mL de agua destilada y tres gotas de fenolftalena.
Llene la bureta con NaOH 0,100 M, y proceda a realizar la titulacin aadiendo lentamente
fracciones de 0,5 mL y mida el pH punto a punto. Una vez alcance pH=12,00 considere finalizada la
titulacin.

ANLISIS
1.

En papel milimetrado, realice un grfico de pH vs Volumen de NaOH aadido.

2.

A partir de la Curva de Titulacin determine los valores de pKC, pKN y pI de un aminocido.

3.

Indique las zonas donde el aminocido tiene un alto poder tamponante.

4.

Compare los datos obtenidos con aquellos de la tabla

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Prctico 2:
Cuantificacin de
Protenas
Fotometra : Absorciometra. Montaje
de una tcnica fotocolorimtrica

Elaborado por:
Dra. Claudia Sandoval Yez
Dra. Tatiana Gmez Cano
Dra. Ximena Zrate Bonilla
Dr. Cristian Linares Flores
Dr. Desmond MacLeod Carey

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Fotometra: Absorciometra. Montaje de una tcnica fotocolorimtrica

Principios de absorciometra de UV / visible:

La absorciometra aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber radiacin
electromagntica. Los diferentes tipos de radiacin electromagntica: rayos X, luz ultravioleta
(UV), luz visible, luz infrarroja, ondas de radio, etc., se propagan a la misma velocidad, pero
difieren en longitud de onda y frecuencia. Para estas radiaciones se cumple la siguiente expresin
matemtica.
c=
c = velocidad de la luz en el vaco
= longitud de onda
= frecuencia

El ojo humano detecta la radiacin en un rango de longitudes de onda de 400 a 800 nm, llamada
luz visible (1 nm = 10-9 m). La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la
energa necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de menor
energa a otro de mayor energa de ciertos compuestos, llamados cromforos. Las sustancias
coloreadas absorben luz visible, su color corresponde a la radiacin no absorbida: la luz solar es
blanca ya que contiene radiacin de todo el espectro visible, adems de otras radiaciones.

LEY DE LAMBERT - BEER

La ley de Lambert Beer es la ley fundamental de la absorciometra, ya que relaciona la absorcin
de la luz con la concentracin de las soluciones. Consideremos un haz de luz monocromtica (luz
de una solo longitud de onda) que atraviesa una solucin de un compuesto contenido en un
recipiente de vidrio.

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El siguiente esquema ilustra la situacin:

I0: intensidad de haz incidente

I: intensidad de haz transmitido
b: camino ptico
Si el compuesto absorbe a una longitud de onda dada, I ser menor que I0. Cuanto mayor es el
nmero de molculas de un compuesto cromforo encontradas por el haz de luz en su camino,
menor ser la intensidad de la luz transmitida. Dicho nmero de molculas depende de la
distancia recorrida a travs de la solucin (camino ptico) y de la concentracin.
La relacin entre estos parmetros est dada por la ley de Lambert Beer:

A = bc
Ley de Lambert - Beer

Por conveniencia se usa el siguiente sistema de unidades: b = camino ptico en cm.

c = concentracin en M
= coeficiente de extincin molar, en cm-1 x M-1

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INSTRUMENTOS DE MEDICIN
Los componentes bsicos de todos los instrumentos que se usan en absorciometra de UV / visible
son:
Fuente de luz
Filtros o monocromador, que permite seleccionar la longitud de onda.
Portador de muestra
Detector
Dispositivo que permite la lectura de la medida directamente o inscriptor

LA FUENTE DE LUZ
No existe una fuente de luz que proporcione radiacin de todo el rango espectral UV/Vis de
suficiente intensidad, por consiguiente, se usan diferentes fuentes de luz:
Fuente de luz visible (Vis): lmpara de tungsteno. Produce luz entre 340 850 nm
aproximadamente.
Fuente de luz ultravioleta (UV): Son lmparas de descarga. Su espectro de emisin es muy
concentrado y suele estar en el rango de frecuencia de 100-260 nm para las de vapor de mercurio
y entre 300-380 nm para las de yoduro de galio.

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SELECCIN DE LA LONGITUD DE ONDA FILTROS

No proporcionan luz realmente monocromtica, sino que permiten el paso de un cierto rango de
longitudes de onda alrededor de la longitud de onda mxima transmitancia del filtro.

MONOCROMADORES
Poseen un elemento dispersor, que puede ser un prisma o una red de distraccin. El elemento
dispersor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un sistema de espejo permite
dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada hacia la ranura de salida.
Al cerrar ms la ranura aumentar la monocromaticidad de la luz, pero siempre pasar a travs de
ella un cierto rango de longitud de onda. En la prctica se considera que un espectrofotmetro
opera con luz prcticamente monocromtica. La calidad de un espectrofotmetro depende en
parte importante de esta caracterstica.
Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua, condicin necesaria para
obtener espectros de absorcin. Con un fotmetro de filtro no es posible obtener espectros de
absorcin.

PORTADOR DE MUESTRA
All se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra de referencia. Las cubetas son de vidrio
o plstico (para el visible) o cuarzo (para el UV).

DETECTOR
Los detectores son del tipo fotoelctrico: al incidir luz producen corriente elctrica, de intensidad
proporcional a la intensidad de la luz. Se distinguen celdas de capa barrera (solamente para
fotmetros de filtro). Fototubos y tubos fotomultiplicadores.

LECTURA O REGISTRO
La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia. Si el instrumento
informa la transmitancia se calcula A usando la ecuacin (5). La absorbancia se mide en 3 cifras
despus de la coma. El rango de A medible es de 0.000 hasta 1.500 o hasta 2.000 o 3.000
(dependiendo del instrumento).

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APLICACIN DE LA ABSORCIOMETRA EN EL ANLISIS CUANTITATIVO

1. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE UN CROMFORO PURO
Midiendo la absorbancia de una disolucin problema en un espectrofotmetro y conociendo el
correspondiente y el camino ptico, se puede calcular la concentracin. Normalmente, se usa la
longitud de onda del mximo de una banda, cuyo valor se encuentra reportado en literatura.

2. DETERMINACIONES A TRAVS DE UNA REACCIN QUMICA O TEST

Compuestos que no pueden ser determinados en forma directa porque no absorben
convenientemente, se hacen reaccionar con un reactivo especfico formando entonces un
cromforo. Se realiza en paralelo el test con la muestra problema de concentracin desconocida, y
con una o varias disoluciones del compuesto a determinar de concentracin conocida
(disoluciones patrn). Posteriormente, se mide la absorbancia. Esta absorbancia ser proporcional
a la concentracin del compuesto que se va a determinar dentro de cierto rango de
concentraciones. Si se us solamente una disolucin, se calcula la concentracin por proporcin
directa:
C (problema) = A (problema)
C (estndar)
A (estndar)
Si se usaron varias disoluciones estndar se construye la curva de calibracin del test, y se
interpola en sta. Este grfico ser una recta cuya pendiente se denomina factor de calibracin, k:

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A=kC
En forma alternativa a interpolar en la recta se puede calcular C a partir de la absorbancia medida
dividiendo por el factor de calibracin.

BIBLIOGRAFA

H. WILLARD, L. MERRIT, J.DEAN INSTRUMENTAL METHODS OF ANLYSIS

G. EWING INSTRUMENTAL METHODS OF CHEMICAL ANALYSIS
A. STROBEL INSTRUMENTACIN QUMICA
S.B. BROWN, ED, AN INTRODUCTION TO SPECTROSCOPY FOR BIOCHEMISTS

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TRABAJO PRCTICO

I.- DETERMINACIN DE PROTENAS

Se han descrito un gran nmero de mtodos para la cuantificacin de protenas. Todos
representan ventajas y desventajas, la seleccin de uno en particular va a depender de la protena
que deseamos cuantificar, la sensibilidad deseada, posibles interferencias y la sencillez del
mtodo. En general, los mtodos estn basados en reacciones qumicas, absorcin ultravioleta,
reacciones de fluorescencia y determinacin del nitrgeno.

MTODO TURBIDIMTRICO
Las protenas precipitan cuando se mezclan con soluciones diluidas de cido tricloroactico,
sulfosaliclico o ferricianuro de potasio en cido actico. Este mtodo tiene desventajas ya que no
todas las protenas precipitan en la misma cantidad e interfieren otras sustancias precipitables por
cidos nucleicos. La ventaja que presenta en uso es la rapidez de la de terminacin. El rango til de
trabajo es entre 0.1 y 0.3 mg de protenas agregadas.

MTODOS COLORIMTRICOS
El mtodo colorimtrico ms difundido es el mtodo de Lwry, en que el color final de la reaccin,
es el resultado de la reaccin de Biuret de la protena con el in cobre en medio alcalino y la
reduccin del reactivo fosfomolbdico fosfotngstico por la serina y triptfano presentes en las
protenas. Los mtodos de Biuret y Bradford se discutirn ms adelante en esta gua y son los que
se realizarn en el presente trabajo prctico.

MTODOS DE ABSORCIN ULTRAVIOLETA

La mayora de las protenas tiene un mximo de absorcin a 280 nm, debido primariamente a la
presencia de tirosina y triptfano, y secundariamente, la fenilalanina y cistena. Por consiguiente,
el coeficiente de extincin molar a 280 nm vara de una protena a otra debido a su composicin
aminoacdica. Ms an, los cidos nucleicos que muchas veces estn como contaminantes en las
preparaciones de protenas, aunque tiene un mximo de absorcin a 260, tambin lo hacen a 280
nm, falseando la lectura de las protenas. La razn de absorbancia a 280 nm / 260 nm ha sido
usada por Wargurg y Christian para eliminar la interferencia de cidos nucleicos en la
determinacin de protenas. El rango til de trabajo es entre 0.1 y 0.6 mg/mL. Por debajo de 230

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nm, la extincin de una solucin de protenas sube precipitadamente alcanzando un mximo a

190 nm, se debe principalmente al enlace peptdico. En la prctica es ms conveniente medir la
extincin a 210 nm, ya que el coeficiente de extincin molar a esta longitud de onda es de cerca de
200 para la mayora de las protenas. Todas tienen una absorcin especfica similar, pues el
contenido de enlaces peptdicos es semejante. Se han descrito una serie de mtodos que utilizan
longitudes de onda de medicin menores a 240 nm, sin embargo, se obtienen mejores resultados
con el mtodo de Scopes, en el cual se efectan lecturas de absorbancia a 205 y 280 nm,
pudindose calcular el coeficiente de extincin molar de una protena a 205 nm con bastante
precisin.

ACTIVIDAD A:
CUANTIFICACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE BIURET
El reactivo de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino) reacciona con un compuesto de contiene
dos o ms enlaces peptdicos dando una coloracin violeta. El color desarrollado se debe a un
complejo de coordinacin entre el Cu y cuatro tomos de nitrgeno que provienen de dos cadenas
peptdicas adyacentes. Los dipptidos y los aminocidos (excepto la serina y treonina) no dan esta
reaccin. La reaccin no es absolutamente especfica para los enlaces peptdicos, interfiriendo una
serie de compuestos en la determinacin de protenas como por ejemplo, sales de amonio.
Mediante este mtodo se pueden valorar protenas en un rango de 1 a 10 mg.

MATERIALES

Reactivo Biuret

Espectrofotmetro (540 nm)

Muestra de albmina: solucin estndar de albmina 10 mg/mL (se dispone de un

estndar es de 80 g/L, por tanto hay que diluir previamente)

Muestra problema (debe ser preparada por el docente a partir del estndar)

CURVA DE CALIBRACIN PARA PROTENAS

1. Disponga de seis tubos y coloque en ellos volmenes de la disolucin estndar que contengan 2
4 6 8 y 10 mg de albmina. El sexto tubo selo como blanco 1 mL de agua destilada en vez de
albmina.
2. Enrase a 1 mL de volumen final con agua destilada.
3. Agregue 4 mL a cada tubo del reactivo de Biuret

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4. Deje desarrollar el color durante 10 min., luego mida a 540 nm

DETERMINACIN DE PROTENAS DE LA MUESTRA PROBLEMA

1. En un tubo coloque un volumen X (hasta 1 ml) de la muestra a determinar y enrasar a 1 ml de
volumen final con agua destilada.
2. Agregue 4 ml del reactivo de Biuret
3. Deje desarrollar color durante 10 min. y mida a 540 nm.

ACTIVIDAD B:

CUANTIFICACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE BRADFORD

Este mtodo utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G250 de unirse a la protena. El
colorante slo presenta un mximo de absorcin a 465 nm mientras que cuando est unido a la
protena el mximo es de 595 nm. La coloracin en presencia de protenas es lineal en el rango de
0 a 30 g, Interfieren en la determinacin, detergentes y lcalis. Se recomienda leer luego de 10
minutos de iniciada la reaccin, debido a que el color no es estable en el tiempo, puesto que la
protena comienza a precipitar debido al medio cido. Este efecto es especialmente significativo a
altas concentraciones de protenas.

MATERIALES
Reactivo de Bradford
Espectrofotmetro (540 nm)
Muestra de albmina: solucin estndar de albmina 0.1 mg/mL
Muestra problema (debe ser preparada por el docente a partir del estndar)

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11

CURVA DE CALIBRACIN
1. Disponga de 7 tubos y coloque en cada uno volmenes adecuados que contengan 5 10 15 20
25 30 g de albmina, el sptimo tubo selo como blanco y agregue 0.8 ml de agua destilada.
2. Complete todos los tubos a 0.8 mL con agua destilada.
3. Agregue 0.2 mL del reactivo de Bradford
4. Espere 10 min y mida A 595 nm.

DETERMINACIN DE PROTENAS EN UNA MUESTRA PROBLEMA

1. Coloque en un tubo un volumen X de la muestra a determinar (hasta 0.5 mL) y enrasar a 0.8 ml
de volumen final con agua destilada.
2. Agregue 0.2 mL de reactivo de Bradford.
3. Espere 10 min y lea la a 595 nm utilizando como blanco el sptimo tubo de la curva de
calibracin.

BIBLIOGRAFA
Skoog & West. Anlisis Instrumental
Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman & Company 2 Edicin Pg.
75 77.
Bradford, M (1976) Analytical Biochemistry 72, Pg. 248 254.

ESPECIFICACIONES PARA EL INFORME DE LABORATORIO

En el caso del presente trabajo prctico, debe graficar la curva de calibracin (Absorbancia v/s
Concentracin), con sus respectivas unidades, en papel milimetrado, o algn software.
Determine la concentracin de la muestra problema interpolando en la curva de calibracin.
Muestre la interpolacin en papel milimetrado, o algn software que s el permita.

Bioqumica

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 El documento debe ser acotado y sinttico, por lo cual no debe sobrepasar 5 pginas, en hojas
tamao carta.
Se recomienda tomar fotografas, o utilizar imgenes lo ms prximas a lo observado. Se debe
sealar en las imgenes lo observado. El ojo humano detecta la radiacin en un rango de
longitudes de onda de 400 a 800 nm, llamada luz visible (1 nm = 10-9 m). La luz del espectro visible
y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energa necesaria para producir transiciones de
electrones desde un orbital molecular de menor energa a otro de mayor energa de ciertos
compuestos, llamados cromforos. Las sustancias coloreadas absorben luz visible, su color
corresponde a la radiacin no absorbida: la luz solar es blanca, ya que contiene radiacin de todo
el espectro visible, adems de otras radiaciones.

Bioqumica

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Manual de Laboratorio
Bioqumica

Bioqumica

Prctico 2:
Cuantificacin de
Protenas
Fotometra : Absorciometra. Montaje
de una tcnica fotocolorimtrica

Elaborado por:
Dra. Claudia Sandoval Yez
Dra. Tatiana Gmez Cano
Dra. Ximena Zrate Bonilla
Dr. Cristian Linares Flores
Dr. Desmond MacLeod Carey

Bioqumica

Fotometra: Absorciometra. Montaje de una tcnica fotocolorimtrica

Principios de absorciometra de UV / visible:

La absorciometra aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber radiacin
electromagntica. Los diferentes tipos de radiacin electromagntica: rayos X, luz ultravioleta
(UV), luz visible, luz infrarroja, ondas de radio, etc., se propagan a la misma velocidad, pero
difieren en longitud de onda y frecuencia. Para estas radiaciones se cumple la siguiente expresin
matemtica.
c=
c = velocidad de la luz en el vaco
= longitud de onda
= frecuencia

El ojo humano detecta la radiacin en un rango de longitudes de onda de 400 a 800 nm, llamada
luz visible (1 nm = 10-9 m). La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la
energa necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de menor
energa a otro de mayor energa de ciertos compuestos, llamados cromforos. Las sustancias
coloreadas absorben luz visible, su color corresponde a la radiacin no absorbida: la luz solar es
blanca ya que contiene radiacin de todo el espectro visible, adems de otras radiaciones.

LEY DE LAMBERT - BEER

La ley de Lambert Beer es la ley fundamental de la absorciometra, ya que relaciona la absorcin
de la luz con la concentracin de las soluciones. Consideremos un haz de luz monocromtica (luz
de una solo longitud de onda) que atraviesa una solucin de un compuesto contenido en un
recipiente de vidrio.

Bioqumica

El siguiente esquema ilustra la situacin:

I0: intensidad de haz incidente

I: intensidad de haz transmitido
b: camino ptico
Si el compuesto absorbe a una longitud de onda dada, I ser menor que I0. Cuanto mayor es el
nmero de molculas de un compuesto cromforo encontradas por el haz de luz en su camino,
menor ser la intensidad de la luz transmitida. Dicho nmero de molculas depende de la
distancia recorrida a travs de la solucin (camino ptico) y de la concentracin.
La relacin entre estos parmetros est dada por la ley de Lambert Beer:

A = bc
Ley de Lambert - Beer

Por conveniencia se usa el siguiente sistema de unidades: b = camino ptico en cm.

c = concentracin en M
= coeficiente de extincin molar, en cm-1 x M-1

Bioqumica

INSTRUMENTOS DE MEDICIN
Los componentes bsicos de todos los instrumentos que se usan en absorciometra de UV / visible
son:
Fuente de luz
Filtros o monocromador, que permite seleccionar la longitud de onda.
Portador de muestra
Detector
Dispositivo que permite la lectura de la medida directamente o inscriptor

LA FUENTE DE LUZ
No existe una fuente de luz que proporcione radiacin de todo el rango espectral UV/Vis de
suficiente intensidad, por consiguiente, se usan diferentes fuentes de luz:
Fuente de luz visible (Vis): lmpara de tungsteno. Produce luz entre 340 850 nm
aproximadamente.
Fuente de luz ultravioleta (UV): Son lmparas de descarga. Su espectro de emisin es muy
concentrado y suele estar en el rango de frecuencia de 100-260 nm para las de vapor de mercurio
y entre 300-380 nm para las de yoduro de galio.

Bioqumica

SELECCIN DE LA LONGITUD DE ONDA FILTROS

No proporcionan luz realmente monocromtica, sino que permiten el paso de un cierto rango de
longitudes de onda alrededor de la longitud de onda mxima transmitancia del filtro.

MONOCROMADORES
Poseen un elemento dispersor, que puede ser un prisma o una red de distraccin. El elemento
dispersor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un sistema de espejo permite
dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada hacia la ranura de salida.
Al cerrar ms la ranura aumentar la monocromaticidad de la luz, pero siempre pasar a travs de
ella un cierto rango de longitud de onda. En la prctica se considera que un espectrofotmetro
opera con luz prcticamente monocromtica. La calidad de un espectrofotmetro depende en
parte importante de esta caracterstica.
Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua, condicin necesaria para
obtener espectros de absorcin. Con un fotmetro de filtro no es posible obtener espectros de
absorcin.

PORTADOR DE MUESTRA
All se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra de referencia. Las cubetas son de vidrio
o plstico (para el visible) o cuarzo (para el UV).

DETECTOR
Los detectores son del tipo fotoelctrico: al incidir luz producen corriente elctrica, de intensidad
proporcional a la intensidad de la luz. Se distinguen celdas de capa barrera (solamente para
fotmetros de filtro). Fototubos y tubos fotomultiplicadores.

LECTURA O REGISTRO
La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia. Si el instrumento
informa la transmitancia se calcula A usando la ecuacin (5). La absorbancia se mide en 3 cifras
despus de la coma. El rango de A medible es de 0.000 hasta 1.500 o hasta 2.000 o 3.000
(dependiendo del instrumento).

Bioqumica

APLICACIN DE LA ABSORCIOMETRA EN EL ANLISIS CUANTITATIVO

1. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE UN CROMFORO PURO
Midiendo la absorbancia de una disolucin problema en un espectrofotmetro y conociendo el
correspondiente y el camino ptico, se puede calcular la concentracin. Normalmente, se usa la
longitud de onda del mximo de una banda, cuyo valor se encuentra reportado en literatura.

2. DETERMINACIONES A TRAVS DE UNA REACCIN QUMICA O TEST

Compuestos que no pueden ser determinados en forma directa porque no absorben
convenientemente, se hacen reaccionar con un reactivo especfico formando entonces un
cromforo. Se realiza en paralelo el test con la muestra problema de concentracin desconocida, y
con una o varias disoluciones del compuesto a determinar de concentracin conocida
(disoluciones patrn). Posteriormente, se mide la absorbancia. Esta absorbancia ser proporcional
a la concentracin del compuesto que se va a determinar dentro de cierto rango de
concentraciones. Si se us solamente una disolucin, se calcula la concentracin por proporcin
directa:
C (problema) = A (problema)
C (estndar)
A (estndar)
Si se usaron varias disoluciones estndar se construye la curva de calibracin del test, y se
interpola en sta. Este grfico ser una recta cuya pendiente se denomina factor de calibracin, k:

Bioqumica

A=kC
En forma alternativa a interpolar en la recta se puede calcular C a partir de la absorbancia medida
dividiendo por el factor de calibracin.

BIBLIOGRAFA

H. WILLARD, L. MERRIT, J.DEAN INSTRUMENTAL METHODS OF ANLYSIS

G. EWING INSTRUMENTAL METHODS OF CHEMICAL ANALYSIS
A. STROBEL INSTRUMENTACIN QUMICA
S.B. BROWN, ED, AN INTRODUCTION TO SPECTROSCOPY FOR BIOCHEMISTS

Bioqumica

TRABAJO PRCTICO

I.- DETERMINACIN DE PROTENAS

Se han descrito un gran nmero de mtodos para la cuantificacin de protenas. Todos
representan ventajas y desventajas, la seleccin de uno en particular va a depender de la protena
que deseamos cuantificar, la sensibilidad deseada, posibles interferencias y la sencillez del
mtodo. En general, los mtodos estn basados en reacciones qumicas, absorcin ultravioleta,
reacciones de fluorescencia y determinacin del nitrgeno.

MTODO TURBIDIMTRICO
Las protenas precipitan cuando se mezclan con soluciones diluidas de cido tricloroactico,
sulfosaliclico o ferricianuro de potasio en cido actico. Este mtodo tiene desventajas ya que no
todas las protenas precipitan en la misma cantidad e interfieren otras sustancias precipitables por
cidos nucleicos. La ventaja que presenta en uso es la rapidez de la de terminacin. El rango til de
trabajo es entre 0.1 y 0.3 mg de protenas agregadas.

MTODOS COLORIMTRICOS
El mtodo colorimtrico ms difundido es el mtodo de Lwry, en que el color final de la reaccin,
es el resultado de la reaccin de Biuret de la protena con el in cobre en medio alcalino y la
reduccin del reactivo fosfomolbdico fosfotngstico por la serina y triptfano presentes en las
protenas. Los mtodos de Biuret y Bradford se discutirn ms adelante en esta gua y son los que
se realizarn en el presente trabajo prctico.

MTODOS DE ABSORCIN ULTRAVIOLETA

La mayora de las protenas tiene un mximo de absorcin a 280 nm, debido primariamente a la
presencia de tirosina y triptfano, y secundariamente, la fenilalanina y cistena. Por consiguiente,
el coeficiente de extincin molar a 280 nm vara de una protena a otra debido a su composicin
aminoacdica. Ms an, los cidos nucleicos que muchas veces estn como contaminantes en las
preparaciones de protenas, aunque tiene un mximo de absorcin a 260, tambin lo hacen a 280
nm, falseando la lectura de las protenas. La razn de absorbancia a 280 nm / 260 nm ha sido
usada por Wargurg y Christian para eliminar la interferencia de cidos nucleicos en la
determinacin de protenas. El rango til de trabajo es entre 0.1 y 0.6 mg/mL. Por debajo de 230

Bioqumica

nm, la extincin de una solucin de protenas sube precipitadamente alcanzando un mximo a

190 nm, se debe principalmente al enlace peptdico. En la prctica es ms conveniente medir la
extincin a 210 nm, ya que el coeficiente de extincin molar a esta longitud de onda es de cerca de
200 para la mayora de las protenas. Todas tienen una absorcin especfica similar, pues el
contenido de enlaces peptdicos es semejante. Se han descrito una serie de mtodos que utilizan
longitudes de onda de medicin menores a 240 nm, sin embargo, se obtienen mejores resultados
con el mtodo de Scopes, en el cual se efectan lecturas de absorbancia a 205 y 280 nm,
pudindose calcular el coeficiente de extincin molar de una protena a 205 nm con bastante
precisin.

ACTIVIDAD A:
CUANTIFICACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE BIURET
El reactivo de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino) reacciona con un compuesto de contiene
dos o ms enlaces peptdicos dando una coloracin violeta. El color desarrollado se debe a un
complejo de coordinacin entre el Cu y cuatro tomos de nitrgeno que provienen de dos cadenas
peptdicas adyacentes. Los dipptidos y los aminocidos (excepto la serina y treonina) no dan esta
reaccin. La reaccin no es absolutamente especfica para los enlaces peptdicos, interfiriendo una
serie de compuestos en la determinacin de protenas como por ejemplo, sales de amonio.
Mediante este mtodo se pueden valorar protenas en un rango de 1 a 10 mg.

MATERIALES

Reactivo Biuret

Espectrofotmetro (540 nm)

Muestra de albmina: solucin estndar de albmina 10 mg/mL (se dispone de un

estndar es de 80 g/L, por tanto hay que diluir previamente)

Muestra problema (debe ser preparada por el docente a partir del estndar)

CURVA DE CALIBRACIN PARA PROTENAS

1. Disponga de seis tubos y coloque en ellos volmenes de la disolucin estndar que contengan 2
4 6 8 y 10 mg de albmina. El sexto tubo selo como blanco 1 mL de agua destilada en vez de
albmina.
2. Enrase a 1 mL de volumen final con agua destilada.
3. Agregue 4 mL a cada tubo del reactivo de Biuret

Bioqumica

10

4. Deje desarrollar el color durante 10 min., luego mida a 540 nm

DETERMINACIN DE PROTENAS DE LA MUESTRA PROBLEMA

1. En un tubo coloque un volumen X (hasta 1 ml) de la muestra a determinar y enrasar a 1 ml de
volumen final con agua destilada.
2. Agregue 4 ml del reactivo de Biuret
3. Deje desarrollar color durante 10 min. y mida a 540 nm.

ACTIVIDAD B:

CUANTIFICACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE BRADFORD

Este mtodo utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G250 de unirse a la protena. El
colorante slo presenta un mximo de absorcin a 465 nm mientras que cuando est unido a la
protena el mximo es de 595 nm. La coloracin en presencia de protenas es lineal en el rango de
0 a 30 g, Interfieren en la determinacin, detergentes y lcalis. Se recomienda leer luego de 10
minutos de iniciada la reaccin, debido a que el color no es estable en el tiempo, puesto que la
protena comienza a precipitar debido al medio cido. Este efecto es especialmente significativo a
altas concentraciones de protenas.

MATERIALES
Reactivo de Bradford
Espectrofotmetro (540 nm)
Muestra de albmina: solucin estndar de albmina 0.1 mg/mL
Muestra problema (debe ser preparada por el docente a partir del estndar)

Bioqumica

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CURVA DE CALIBRACIN
1. Disponga de 7 tubos y coloque en cada uno volmenes adecuados que contengan 5 10 15 20
25 30 g de albmina, el sptimo tubo selo como blanco y agregue 0.8 ml de agua destilada.
2. Complete todos los tubos a 0.8 mL con agua destilada.
3. Agregue 0.2 mL del reactivo de Bradford
4. Espere 10 min y mida A 595 nm.

DETERMINACIN DE PROTENAS EN UNA MUESTRA PROBLEMA

1. Coloque en un tubo un volumen X de la muestra a determinar (hasta 0.5 mL) y enrasar a 0.8 ml
de volumen final con agua destilada.
2. Agregue 0.2 mL de reactivo de Bradford.
3. Espere 10 min y lea la a 595 nm utilizando como blanco el sptimo tubo de la curva de
calibracin.

BIBLIOGRAFA
Skoog & West. Anlisis Instrumental
Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman & Company 2 Edicin Pg.
75 77.
Bradford, M (1976) Analytical Biochemistry 72, Pg. 248 254.

ESPECIFICACIONES PARA EL INFORME DE LABORATORIO

En el caso del presente trabajo prctico, debe graficar la curva de calibracin (Absorbancia v/s
Concentracin), con sus respectivas unidades, en papel milimetrado, o algn software.
Determine la concentracin de la muestra problema interpolando en la curva de calibracin.
Muestre la interpolacin en papel milimetrado, o algn software que s el permita.

Bioqumica

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 El documento debe ser acotado y sinttico, por lo cual no debe sobrepasar 5 pginas, en hojas
tamao carta.
Se recomienda tomar fotografas, o utilizar imgenes lo ms prximas a lo observado. Se debe
sealar en las imgenes lo observado. El ojo humano detecta la radiacin en un rango de
longitudes de onda de 400 a 800 nm, llamada luz visible (1 nm = 10-9 m). La luz del espectro visible
y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energa necesaria para producir transiciones de
electrones desde un orbital molecular de menor energa a otro de mayor energa de ciertos
compuestos, llamados cromforos. Las sustancias coloreadas absorben luz visible, su color
corresponde a la radiacin no absorbida: la luz solar es blanca, ya que contiene radiacin de todo
el espectro visible, adems de otras radiaciones.

Bioqumica

13

Manual de Laboratorio
Bioqumica

Bioqumica

Prctico 4:
La enzima catalasa y
su accin en los
alimentos

Elaborado por:
Dra. Claudia Sandoval Yez
Dra. Tatiana Gmez Cano
Dra. Ximena Zrate Bonilla
Dr. Cristian Linares Flores
Dr. Desmond MacLeod Carey

Bioqumica

La enzima catalasa y su accin en los alimentos

INTRODUCCIN
Fundamento: La catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los tejidos animales y
vegetales que posee la funcin de catalizar la hidrlisis de un producto txico que se genera
durante el metabolismo celular, el perxido de hidrgeno (H2O2), generando agua y oxgeno.
La industria alimentaria evita la oxidacin de los alimentos mediante diferentes tcnicas, como el
envasado al vaco, y tambin utilizando antioxidantes. Hay antioxidantes naturales, presentes en el
organismo, o sintticos. Los antioxidantes en alimentos se definen como preservantes que
retardan el deterioro, rancidez o decoloracin debida a la oxidacin. Despus de que el
antioxidante se une al agente oxidante, ste no est libre para reaccionar con algunos compuestos
de los alimentos y por lo tanto no puede causar su oxidacin. Los antioxidantes pueden ser
enzimas que aumentan la velocidad de ruptura de los agentes oxidantes (radicales libres). Entre
ellas se encuentran las enzimas superxido dismutasa, glutatin peroxidasa y la catalasa. La
catalasa se obtiene fundamentalmente a partir de microorganismos y su funcin es convertir el
agua oxigenada (H2O2) en agua (H20) y oxgeno (O2):

Realizaremos las siguientes pruebas para poner en evidencia la presencia de catalasa en tejido
animal (visualizando los productos finales de la reaccin que cataliza) y para destacar la
importancia de la estructura tridimensional de las enzimas para mantener su funcionalidad. La
existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como
desinfectante cuando se aplica sobre una herida. Como muchas de las bacterias patgenas son
anaerobias (no pueden vivir en presencia de oxgeno), mueren con el desprendimiento de oxgeno
que se produce cuando la catalasa de los tejidos acta sobre el agua oxigenada.
La catalasa se obtiene fundamentalmente a partir de microorganismos y su funcin es convertir el
agua oxigenada (H2O2) en agua (H20) y oxgeno (O2), reaccin (1).
El uso de esta enzima permite alargar la vida til de zumos de ctricos, cerveza y vino ya que, al
degradar el agua oxigenada (un agente oxidante) en sustancias no reactivas (agua y oxgeno) se
inhiben las reacciones oxidativas sin problemas secundarios.

Bioqumica

OBJETIVOS:
1. Poner de manifiesto la presencia de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales.
2. Examinar la accin de la temperatura sobre la actividad de las enzimas.

MATERIALES:
- Tubos de ensayos (2xgrupo)
- Pipeta 5mL
- Pinza
- Propipetas
- Gradillas
- Vaso precipitado 50mL (1xgrupo)
- Mechero

REACTIVOS:
-Perxido de Hidrgeno (Agua oxigenada)
-Muestra: Tejido heptico de ave fresco y hervido

PROCEDIMIENTO:
A) Presencia de enzima catalasa en tejido animal
Colocar dos trozos pequeos de tejido heptico en vaso precipitado, agregar suficiente agua
destilada y hervir utilizando mechero.
Rotular dos tubos de ensayo: 1 y 2.
Introducir en el tubo 1 trocitos de hgado fresco y en el 2 trocitos de tejido heptico previamente
hervido en agua.
Aadir a cada tubo 5 ml de agua oxigenada. Observar y anotar.

Bioqumica

Discutir sobre la funcionalidad de la enzima o la perdida de la funcin.

B) Desnaturalizacin de la enzima catalasa
Mediante esta experiencia, se estudiar la propiedad de desnaturalizacin que tienen las protenas
y que consiste en la prdida de su estructura terciaria (tridimensional), lo que afecta su funcin. La
enzima catalasa, al igual que otras protenas, se puede desnaturalizar al exponerla a altas
temperaturas. Al perder su estructura se perder tambin la funcin, por lo que no podr
descomponer el agua oxigenada.
PROCEDIMIENTO
I. Colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hgado u otros tejidos.
II. Aadir agua hasta cubrir la muestra y machacar con un mortero (o similar) para degradar las
clulas y liberar su contenido.
III. Filtrar la mezcla y separar la muestra en dos tubos de ensayo (A y B).
IV. Al tubo A agregarle 5 cm3 de agua oxigenada y observar. Anotar los resultados.
V. Calentar el tubo B sobre un mechero durante un minuto hasta que hierva (colocar el tubo en
posicin oblicua cuidando que su abertura se dirija hacia el lado opuesto).
VI. Aadir el agua oxigenada y observar. Anotar los resultados.

PREGUNTAS PARA ANALIZAR EL TRABAJO PRCTICO

1. Cul es la fuente de la que se extrae la enzima catalasa?
2. Cul ser la funcin de esa enzima en el organismo?
3. Cul es el sustrato sobre el que acta esta enzima?
4. Cul es el producto que se obtiene de su actividad?
5. Cul es el efecto del tratamiento trmico en la estructura enzimtica?
6. Comparar y justificar los resultados obtenidos en los tubos A y B de la segunda parte de la
experiencia.

Bioqumica

Manual de Laboratorio
Bioqumica

Bioqumica

Prctico 5:
Catabolismo y
Biosntesis

Elaborado por:
Dra. Claudia Sandoval Yez
Dra. Tatiana Gmez Cano
Dra. Ximena Zrate Bonilla
Dr. Cristian Linares Flores
Dr. Desmond MacLeod Carey
Bioqumica

Catabolismo y Biosntesis

INTRODUCCIN
El almidn es un polisacrido de reserva alimenticia predominante en las plantas, constituido por
amilosa y amilopectina. Proporciona el 70-80% de las caloras consumidas por los humanos de
todo el mundo. Tanto el almidn como los productos de la hidrlisis del almidn constituyen la
mayor parte de los carbohidratos digestibles de la dieta habitual.
Los glcidos, carbohidratos, hidratos de carbono o sacridos son molculas orgnicas compuestas
por carbono, hidrgeno y oxgeno. Son solubles en agua y se clasifican de acuerdo a la cantidad de
carbonos o por el grupo funcional que tienen adherido. Son la forma biolgica primaria de
almacenamiento y consumo de energa. Su determinacin es de importancia para conocer el valor
nutritivo de los componentes digeribles de un alimento o forraje. Pueden determinarse
indirectamente por diferencia entre 100 y la suma de los porcentajes de los dems componentes
principales (humedad, cenizas, fibra, protenas y lpidos). Pero esto nunca es exacto, por lo que
esta diferencia suele llamarse mejor "extractivos no nitrogenados', pues incluyen otros
componentes como taninos, pigmentos, pectinas.

A. Determinacin de almidn y glucosa en alimentos

Reactivos
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.

Reactivo de lugol
Reactivo de Fehling
Almidn
Solucin del glucosa al 2%
Agua destilada
Un trozo de pan
Una papa
Un pltano
Una manzana
Jugo de zanahoria, de durazno y de uva
Azcar de mesa (comn)

Bioqumica

Materiales
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Pipeta
Esptula
Gradilla
Tubos de ensayo
Mortero y pistilo
Vasos de precipitados de 50 y de 300 mL
Gotero
Mechero
Trpode
Malla de asbesto

1. Prepare una solucin disolviendo 0.5 g de almidn en 10.0 mL de agua para esto utilice un vaso
de precipitado de 50 mL. Tome 5.0 mL de la solucin por medio de una pipeta y aade tres gotas
de lugol, por medio de un gotero. Observe el cambio de coloracin de la solucin. Este tubo de
ensayo debe ser colocado en la gradilla y se debe utilizar como muestra patrn de referencia.
2. Haga un pur con la papa, el pltano o el pan, partiendo o cortando pequeos trozos y luego
triturando se puede utilizar un mortero para esto.
3. Para cada muestra utilice un tubo de ensayo diferente, aada 2.0 mL de agua destilada y agite.
Luego adicione tres gotas de lugol y agite. Compare la coloracin obtenida para cada alimento con
la muestra patrn. Registre los resultados.
4. Aliste un bao Mara y ajuste la temperatura a 50C. Adicione 2.0 mL de la solucin de glucosa y
adicione 2.0 mL de reactivo de Fehling (1.0 mL de reactivo de Fehling A y 1.0 mL de B). Caliente
durante tres minutos. Observe los cambios que se producen y guarde esta muestra como patrn.
5. Nuevamente, para cada muestra utilice un tubo de ensayo diferente, aada 2.0 mL de agua
destilada y agite. A cada tubo de ensayo adicione 2.0 mL de reactivo de Fehling (1.0 mL de A y 1.0
mL de B). Caliente en el bao Mara durante cinco minutos. Registre los cambios y compare con la
muestra patrn.
Anlisis
1. Indique los alimentos que contienen almidn y los que contienen glucosa.
2. Es posible ordenar los alimentos con base en su contenido de almidn?
B. Identificacin de algunos aminocidos presentes en alimentos

Bioqumica

Reactivos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Un huevo
Queso
Leche
Una manzana
Etanol
cido clorhdrico concentrado
Solucin de hidrxido de sodio al 10%
Solucin de sulfato de cobre al 1.0%
Solucin de acetato de plomo

Materiales
1.
2.

Diez tubos de ensayo

Gradilla

Procedimiento
1. Realice un orificio pequeo en la cscara de un huevo y separe cuidadosamente la clara en un
vaso de precipitado. Agite la clara durante un tiempo y agregue dos veces su volumen de agua.
2. Filtre la mezcla para as obtener una solucin de albmina homognea. Tome siete tubos de
ensayo y mrquelos como A, B, C, D, E, y F y agregue 2.0 mL de esta mezcla en cada tubo.
3. Tome el tubo A y calintelo suavemente en la llama del mechero. Registre sus observaciones.
4. Tome los tubos B, C, D y E y adicione 2.0 mL de etanol al B 1.0 mL de hidrxido de sodio al 10%
al C 1.0 mL de cido clorhdrico concentrado al D y 1.0 de cido ntrico concentrado al E. Registre
las observaciones para cada tubo.
5. Al tubo de ensayo C agregue nuevamente 1.0 mL de la solucin de hidrxido de sodio al 10% (se
ha agregado en total 2.0 mL de hidrxido desodio). Mezcle suavemente y aada dos gotas de
solucin de sulfato de cobre al 1%. Registre sus observaciones.
6. Al tubo de ensayo E adicione unas cuantas gotas de la solucin de hidrxido de sodio al 10%.
Registre sus observaciones.

Bioqumica

7. Tome el tubo de ensayo F y aada 2.0 de la solucin de acetato de plomo y 1.0 mL de la solucin
de hidrxido de sodio al 10%. Caliente hasta ebullicin. Observe el color del precipitado formado y
su apariencia general.
8. En un vidrio de reloj coloca un trozo de queso y agregue unas gotas de cido ntrico
concentrado. Registre sus observaciones.
9. Repita el procedimiento anterior con un trozo de manzana en lugar del queso.
10. Coloque en un tubo de ensayo 2.0 mL de leche y aada 1.0 mL de cido ntrico concentrado.
Caliente suavemente. Registre sus observaciones.

Anlisis
1. Qu comportamiento comn observa para los tubos A, B, C, D y E?
2. Cul es la finalidad de la prueba del paso cinco?
3. Qu nombre recibe la prueba efectuada en el tubo de ensayo E?
4. Qu tipo de aminocidos se puede identificar mediante la prueba con acetato de plomo?
5. Qu puede identificar con las ltimas tres pruebas?

Bioqumica

Manual de Laboratorio
Bioqumica
Bioqumica

Prctico 6:
Propiedades
fisicoqumicas de los
carbohidratos
Elaborado por:
Dra. Claudia Sandoval Yez
Dra. Tatiana Gmez Cano
Dra. Ximena Zrate Bonilla
Dr. Cristian Linares Flores
Dr. Desmond MacLeod Carey

Bioqumica

Propiedades fisicoqumicas de los carbohidratos

INTRODUCCIN
Los carbohidratos (CH) se reconocen como una sustancia orgnica slida, blanca y soluble en agua,
que constituye las reservas energticas de las clulas animales y vegetales est compuesta por un
nmero determinado de tomos de carbono, un nmero determinado de tomos de oxgeno y el
doble de tomos de hidrgeno. La funcin principal de los carbohidratos es el aporte energtico.
Son una de las sustancias principales que necesita nuestro organismo, junto a las grasas y las
protenas. Tambin son llamados glcidos, carbohidratos, hidratos de carbono o sacridos, son
elementos principales en la alimentacin, que se encuentran principalmente en azcares,
almidones y fibra. El sistema digestivo maneja todos los carbohidratos de la misma forma: los
rompe (o trata de romperlos) en molculas de azcar simples, ya que slo stos son lo
suficientemente pequeos para pasar al torrente sanguneo. Tambin convierte la mayora de los
carbohidratos digestibles en glucosa (tambin conocida como azcar en la sangre), porque las
clulas estn diseadas para utilizar esto como una fuente de energa universal.
Los CH se encuentran en una amplia variedad de alimentos entre los que se encuentras el pan,
alubias, leche, palomitas de maz, patatas, galletas, fideos, gaseosas, maz o pastel de cereza.
Tambin vienen en una variedad de formas. Las formas ms comunes y abundantes son los
azcares, fibras y almidones. Tambin son polihidroxialdehdos, polihidrixicetonas o compuestos
que por hidrolisis se convierten en aqullos, un carbohidrato que no es hidrolizable a compuestos
ms simples, se denomina monoscarido. Un carbohidrato que por hidrlisis da dos molculas de
monosacrido se llama disacrido, mientras que el que da muchas molculas de monosacrido por
hidrlisis es un polisacrido. Un monosacrido se puede clasificar ms precisamente: si contiene
un grupo aldehdo se le conoce como aldosa si contiene una funcin cetona es una cetosa. Segn
el nmero de tomos de carbono que contenga, se conoce el monosacrido como triosa, tetrosa,
pentosa, hexosa, y as sucesivamente. Los CH que reducen los reactivos de Fehling (o Benedict) y
Tollens, se conocen como azcares reductores. Todos los monosacridos, sean aldosas o cetosas,
son azcares reductores, como lo son tambin la mayora de los disacridos, siendo una excepcin
importante la sacarosa (azcar de mesa comn), la que no es reductora.

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Objetivo
Identificar mediante reacciones caractersticas el comportamiento qumico de los carbohidratos.

Reactivos
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.

Glucosa
Fructosa
Sacarosa
Almidn
Trozo de pan
Una papa
Solucin de yodo o reactivo de lugol
Solucin diluida de HCl
Alcohol etlico
Reactivo de Tollens
Reactivo de Fehling (soluciones A y B)

Materiales
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Gradilla
Tubos de ensayo
Vaso de precipitado de 250 ml.
Pipeta de 10 ml.
Mechero de gas o de alcohol
Malla de asbesto
Termmetro
Lpiz vidriograf

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PROCEDIMIENTO
Parte A: solubilidad
1. Se toma 0.5 g de un azcar en cada uno de los tubos de ensayo, debidamente rotulados.
Organice los tubos de ensayo en la gradilla.
2. Aada 2.0 ml. de agua a cada tubo de ensayo. Agite cada tubo de ensayo fuertemente durante
un minuto y deje en reposo durante 30 segundos. Anote sus observaciones.
3. Repita los dos pasos anteriores utilizando otros tubos de ensayo, pero en vez de agua utilice 2.0
mL de alcohol etlico. Anote sus observaciones.
4. Construya un cuadro en donde cualifique cualitativamente el grado de solubilidad de las
diferentes muestras.

Parte B: prueba con los reactivos de Tollens y Fehling

1. Realice un montaje de bao de Mara y caliente a 60C.
2. Prepare soluciones de cada azcar al 10%. Tome 1.0 mL de cada solucin y llvela a diferentes
tubos de ensayo, previamente rotulados. Organice los tubos de ensayo en la gradilla.
3. Adicione 1.0 mL del reactivo de Tollens a cada tubo de ensayo.
4. Verifique que la temperatura en el bao Mara se sostenga a 60 C. Coloque dentro un vaso de
precipitado los diferentes tubos de ensayo y lleve este conjunto al bao Mara por 5 minutos.
Anote sus observaciones.
5. Repita los pasos dos, tres y cuatro, pero en lugar del reactivo de Tollens utilice 0.5 mL del
reactivo A de Fehling y 0.5 ml. del reactivo B de Fehling.
6. Ahora, tome 2.0 mL de solucin de sacarosa y agregue tres o cuatro gotas de solucin diluida de
HCL Agite y caliente suavemente por un minuto. Permita que se enfre y luego agregue 0.5 mL de
reactivo A de Fehling y 0.5 mL de reactivo B de Fehling. Caliente en el bao de Mara por tres
minutos. Anote sus observaciones.

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Parte C: polisacridos
1. Prepare una solucin concentrada de almidn en agua. Caliente suavemente hasta que se forme
engrudo. Djela en reposo hasta que enfre. Luego aada dos gotas de solucin de yodo o de
reactivo de lugol. Anote sus observaciones.
2. Repita esta prueba utilizando reactivo de lugol en una rebanada de papa o de pan. Anote sus
observaciones.

Anlisis
1. Qu resultados muestra la prueba con el reactivo de Tollens? Y con el reactivo de Fehling?
2. Qu resultados muestra la prueba de solubilidad?

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