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UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA

FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFA


PRCTICAS DE LABORATORIO EN BIOQUMICA
SEGUNDO SEMESTRE - 2006

PRCTICA # 6
TTULO: CINTICA ENZIMTICA

Introduccin
Las reacciones metablicas conforman un cuerpo de reacciones qumicas que ocurren en
condiciones muy particulares (temperatura, pH, concentracin de reactantes y productos) y que
son necesarias para que los seres vivos cumplan con sus funciones biolgicas. Estas condiciones
particulares en las que las reacciones metablicas deben darse son caractersticas de los
organismos, rganos, tejidos o clulas, y en ausencia de un catalizador, no suelen permitir que se
generen los productos a la velocidad requerida. Ciertas protenas han evolucionado entonces como
catalizadores biolgicos cuya funcin es aumentar la velocidad de las reacciones qumicas en los
seres vivos. Es importante recordar que este aumento en la velocidad de reaccin se logra
mediante la disminucin de la energa de activacin de los reactantes y que nada tiene que ver con
el cambio de energa libre que ocurre al convertirse los reactantes en productos.
En trminos simples, la relacin entre la velocidad de la reaccin y la concentracin de sustrato (S,
reactante) en una reaccin catalizada por una enzima (E) est dada por la ecuacin de Michaelis y
Menten de acuerdo al esquema siguiente:
k -1 k2
E + S ES E + P
k +1

k +1, k -1 y k2 : constantes de velocidad

v = Vmax[S]
Km + [S]
Donde, en condiciones de estado estable (velocidad de formacin de ES = velocidad de
descomposicin de ES):
v = velocidad de reaccin a una determinada concentracin de sustrato
[S] = concentracin de sustrato
Vmax = velocidad mxima alcanzable a la concentracin de enzima dada
Km = constante de disociacin aparente de ES = (k -1 + k2)/k +1

Los valores de Km y Vmax son tiles para caracterizar el funcionamiento de una enzima con un
sustrato especfico. El Km mantiene un relacin inversa con la afinidad de la enzima por el sustrato,
y si se conoce la concentracin de la enzima ([E]), la Vmax permite el clculo de la constante de
catlisis de sta (kcat = k2 = Vmax/[E]). La kcat es equivalente al nmero de reacciones que un sitio
activo de la enzima cataliza por unidad de tiempo. El cociente kcat/Km toma en cuenta ambos
parmetros para estimar la eficiencia cataltica de la enzima, entendida sta como la frecuencia en
que la enzima transformar el sustrato en producto cada vez que se encuentre con l (a mayor kcat
[mayor velocidad] y menor Km [mayor afinidad], mayor eficiencia).
En la prctica, los valores de Km y Vmax pueden estimarse a partir de grficas de funciones
derivadas de la ecuacin de Michaelis y Menten. Una primera ecuacin derivada es la de
Lineweaver y Burk:
1/v = (Km/Vmax) . 1/[S] + 1/Vmax
Graficando la inversa de las velocidades de reaccin que se obtienen experimentalmente (eje y)
versus la inversa de las concentraciones de sustrato respectivas (eje x), se obtiene una recta cuya
interseccin con el eje y da la inversa de Vmax y cuya pendiente es equivalente a Km/Vmax.
Una ecuacin derivada alternativa es la de Eadie y Hofstee:
v = - Km . (v/[S]) + Vmax
En este caso, graficando las velocidades de reaccin que se obtienen experimentalmente (eje y)
versus el cociente entre dicha velocidad y la concentracin de sustrato correspondiente (eje x),
se obtiene una recta cuya interseccin con el eje y es directamente el valor de V max y cuya
pendiente es - Km.
En esta prctica se har la caracterizacin cintica de la pirazinamidasa de Mycobacterium
tuberculosis. Esta enzima es expresada en cepas sensibles a la pirazinamida, compuesto que se
utiliza para el tratamiento de la tuberculosis y que es un anlogo de la nicotinamida (vitamina B3).
La pirazinamidasa pertenece a la familia de las hidrolasas y cataliza la hidrlisis de la
pirazinamida para producir cido pirazinoico (forma activa de la droga) y amonio, de acuerdo a la
reaccin siguiente:

Para hacer el estudio cintico de esta enzima, se incubar una concentracin conocida de
pirazinamidasa recombinante con diferentes concentraciones de pirazinamida y se medirn las
velocidades de reaccin correspondientes estimando la cantidad de cido pirazinoico producido
durante el tiempo de incubacin. La adicin de sulfato de amonio ferroso permitir la formacin
de una sal ferrosa rojiza y soluble a partir del cido pirazinoico (reaccin de Wayne), la cual ser
cuantificada en el espectrofotmetro a 450 nm de longitud de onda (E mM.cm-1 = 44.84) luego de
detener la reaccin enzimtica con buffer glicina.HCl 100 mM, pH 3.4.

Reaccin de Wayne

Objetivos
1. Medir la velocidad de reaccin de la pirazinamidasa con distintas concentraciones de
pirazinamida.
2. Estimar los parmetros cinticos Km y kcat a partir de los datos experimentales.
3. Identificar factores experimentales que resultan crticos para la estimacin de los parmetros
cinticos de la enzima.
Materiales y Reactivos
- Pirazinamidasa 100 M en buffer fosfato 100 mM, pH 6.4
- Pirazinamida 1, 5, 10 y 40 mM en buffer fosfato 100 mM, pH 6.4
- Buffer fosfato 100 mM, pH 6.4
- Buffer glicina.HCl 100 mM, pH 3.4
- Sulfato de amonio ferroso al 20% en H2O
- Agua destilada
- Gradilla de tubos
- Tubos de vidrio
- Micropipetas
- Puntas
- Cronmetro
- Espectrofotmetro
- Cubetas
- Papel milimetrado
- Hielo
- Recipientes de desecho

Procedimiento
Rotular los tubos a ser utilizados indicando las concentraciones de sustrato correspondientes. Cada
tubo (concentracin de sustrato) se trabajar individualmente, y en cada uno se aadirn los
reactivos en el orden y cantidad indicados en la tabla siguiente:

Buffer fosfato
(L)
H2O
(L)
Pirazinamidasa
(L)
Pirazinamida
1 mM (L)
Pirazinamida
5 mM (L)
Pirazinamida
10 mM (L)
Pirazinamida
40 mM (L)

0
0.2 0.4
0.6 0.8
1.5 2
4
8
10
mM* mM mM* mM mM* mM mM* mM mM* mM
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
45

25

33

29

30

25

25

20

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20

40

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12

16

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15

20

40

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20

25

Luego de aadida la pirazinamida (sustrato), se mezclar el contenido golpeando suavemente con


el dedo la base del tubo mientras se activa el cronmetro para dar 1 minuto de incubacin a
temperatura ambiente. Pasado el minuto se agregarn 10 L de la solucin de sulfato de amonio
ferroso al 20%, se agitar suavemente el tubo y se aadirn inmediatamente 890 L del buffer
glicina.HCl 100 mM, pH 3.4 para detener la reaccin. Una vez completados los 10 tubos, se
proceder a leer la absorbancia a 450 nm en un espectrofotmetro utilizando el primer tubo (0
mM) como blanco.
La concentracin de cido pirazinoico producido ser calculada a partir del coeficiente de
extincin molar de la sal ferrosa producida durante la reaccin de Wayne mediante la frmula
siguiente:
[cido pirazinoico] (mM) = 2 x 10 x absorbancia/44.84
Como la reaccin ha ocurrido en 1 minuto, este mismo valor corresponder a la velocidad
expresada en mM/min.
Una vez calculadas las velocidades correspondientes a las diferentes concentraciones de sustrato,
se graficarn los datos en papel milimetrado de acuerdo a las ecuaciones de Lineweaver y Burk y
Eadie y Hofstee para estimar los valores de Km y Vmax. Teniendo en cuenta que la concentracin de
enzima utilizada ha sido 100 M, se calcularn la kcat y la relacin kcat/Km.
Finalmente, se repetir el mismo procedimiento con las concentraciones que aparecen en la tabla
con un asterisco pero esta vez incubando por 10 min. Aqu se podrn trabajar los tubos de
manera escalonada, iniciando las reacciones con una diferencia de un minuto. No olvidar que

para calcular la velocidad, se debe dividir en este caso las concentraciones de cido pirazinoico
obtenidas entre 10.
Preguntas
1. Deducir las ecuaciones de Lineweaver y Burk y Eadie y Hofstee a partir de la ecuacin
de Michaelis y Menten.
2. Qu diferencias encuentra entre los grficos obtenidos por los mtodos de Lineweaver y
Burk y Eadie y Hofstee? Qu ventajas y desventajas encuentra en cada uno de estos
mtodos?
3. Qu ocurre cuando la incubacin se realiza durante 10 min en lugar de 1 min? Se alteran
los parmetros cinticos? Explique las razones.

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