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Introduccin
Los avances en el campo de la gentica
molecular estn teniendo una importante
repercusin en nuestra capacidad para comprender, diagnosticar y tratar variedad de
enfermedades congnitas y adquiridas. As, la
posibilidad de introducir genes en clulas eucariotas ha permitido comenzar nuevos protocolos de marcado y de terapia gnica (TG)
humana que no resultaban abordables hace
unos pocos aos.
Tal como se muestra en la figura 1, la TG puede realizarse por medio de dos aproximaciones
diferentes. La primera, denominada terapia gnica de adicin, se basa en la insercin del gen
Terapia de adiccin
Insercin gnica
Alta eficacia de insercin
Insercin gnica homo o heterloga
Limitaciones de regulacin
Aplicable en terapia humana
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Terapia de sustitucin
Recombinacin homloga
Baja eficacia de recombinacin
Precisa reparacin gnica
ptima regulacin de expresin
No implantado en terapia humana
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Figura 3. Distribucin de los ensayos clnicos de Terapia Gnica por indicaciones y vectores.
infeccin, lo que le permitir actuar como vehculo seguro del gen teraputico. Todos los
elementos necesarios para que el vector teraputico pueda empaquetarse e infectar las clulas diana son aportados con las denominadas
lneas celulares empaquetadoras. En la figura
4 se muestra un ejemplo de cmo modificar
un gammarretrovirus para producir un vector
gammarretroviral.
env (SU)
LTR
env (TM)
Gag
Pol
Env
LTR
gag
(matriz)
gag
(cpsida)
RNA
pol
LTR
Ensamblaje
Fusin
de membranas
ARN
ARN
ADN
Integracin
Citoplasma
PROT
LTR
Gen teraputico
mRNA
ARN
Integracin
Ncleo
ADNbc
Ncleo
ARNm
ARNm
ARNm
Vector retroviral
teraputico
Estudios y ensayos
clnicos representativos
sobre los beneficios y
limitaciones de la terapia
gnica actual
Hasta que los laboratorios de gentica molecular ofrezcan alternativas eficaces para el tratamiento de mutaciones dominantes, el tratamiento gentico de las enfermedades monognicas
se est centrando en las que estn asociadas a
mutaciones monognicas recesivas, en las cuales
la expresin de una copia funcional del corres-
Inmunodeficiencia ADA
Entre las enfermedades que primero se consideraron para su tratamiento gnico destacan
las inmunodeficiencias severas combinadas
asociadas a mutaciones en los genes adenosina
deaminasa (ADA-SCID) y gamma-c, asociado a
la inmunodeficiencia X1-SCID. La ausencia de
ADA implica una acumulacin celular del sustrato desoxiadenosina trifosfato, lo cual resulta particularmente txico en los linfocitos T (fig. 5).
Adenosina
Deoxidante
dATP
Iosina
ADA
Deoxiinosa
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Acondicionamiento
submieloablativo
Recoleccin de clulas
de mdula sea
Seleccin de clulas
CD34+
Figura 6. Esquema bsico del protocolo utilizado para la terapia gnica de la inmunodeficiencia ADA-SCID.
88
IL-7R
IL-4R
a
JACK3
IL-2R
b
J3
J3
J3
py-stat
NCLEO
Activacin gnica
Inmunodeficiencia X1-SCID
sta inmunodeficiencia representa aproximadamente la mitad de todas las inmunodeficiencias graves combinadas y est asociada a un
defecto en la cadena c, una protena que forma
parte de numerosos receptores de interleucinas (fig. 7).
La TG de estos pacientes tambin se ha realizado mediante la transferencia del vector teraputico a clulas CD34+, en este caso sobre
pacientes que no recibieron acondicionamiento
alguno. En el 90% de los pacientes se observ reconstitucin del sistema inmunitario con
clulas que contenan el gen teraputico y una
evidente mejora clnica, que, como en el caso
anterior, permiti que los pacientes abandonaran las unidades de aislamiento a las pocas
semanas del tratamiento [7]. Se considera que
9.000
P5
8.000
7.000
Linfocitos T/mcl
6.000
P8
5.000
P7
P4
4.000
3.000
P1
P9
P2
2.000
P6
1.000
P10
0
0
10
12
14
16
18
20
89
??, pues todos los pacientes peditricos tratados han mostrado clara mejora clnica.
Como veremos ms adelante, 5 de los 15
pacientes X1-SCID tratados por TG desarrollaron leucemia linfoctica como consecuencia de
esta intervencin teraputica, si bien 4 de ellos
respondieron satisfactoriamente al tratamiento
antitumoral. Las causas y consecuencias de este
proceso maligno producido como consecuencia del tratamiento con vectores retrovirales se
discuten, as mismo, ms adelante.
Granulomatosis crnica
Constituye otra inmunodeficiencia que ha recibido atencin particular para su tratamiento
gentico. Esta enfermedad se caracteriza por
una deficiente respuesta de las clulas fagocticas para generar anin superxido, lo que se
manifiesta mediante un sndrome recurrente de
infecciones y formacin de granulomas (fig. 9).
Estudios experimentales sugieren que la correccin gentica de, aproximadamente, un 5%
de los granulocitos circulantes, ser suficiente
para reportar un beneficio teraputico [9]. Los
estudios clnicos basados en el trasplante de
clulas CD34+ transducidas con vectores retrovirales y trasplantadas en pacientes no acondicionados, no mostraron beneficio teraputico.
No obstante, un ensayo clnico realizado por
Manuel Grez, en Frankfurt, en pacientes que
recibieron acondicionamiento mieloablativo,
ha mostrado evidente mejora clnica en los 2
pacientes tratados [10]; sin embargo, en este
ensayo clnico tambin se han descrito efectos
adversos graves similares a los descritos en pacientes X1-SCID [11].
Hemofilia
La hemofilia es una enfermedad ligada al cromosoma X originada por mutaciones en el gen
que codifica el factor VIII (hemofilia A) o el factor IX (hemoflia B) de la coagulacin. A pesar
de los avances producidos en la administracin
intravenosa de estos factores, su corta vida media
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Hemoglobinopatas
De entre ellas, destacan las talasemias y la
anemia de clulas falciformes. Algunos genes de
hemoglobinopatas (alpha-thal, beta-thal y HbS)
aos de vida. La sustitucin de la globina- defectiva o ausente en pacientes con talasemia , puede ser curativa. Resultados preclnicos recientes
del grupo de G. Ferrari muestran la correccin
de clulas humanas de pacientes con talasemia
major. La caracterizacin de clulas derivadas de
la mdula sea de estos pacientes antes despus
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Anemia de Fanconi
La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosmica recesiva, poco frecuente entre
la poblacin pero de muy mal pronstico. Los
pacientes suelen desarrollar anomalas congnitas mltiples (en el 65% de los casos), fallo
de mdula sea y predisposicin a cncer. En
promedio, la manifestacin de la aplasia se observa alrededor de los 8 aos de edad, si bien
prcticamente todos los pacientes que alcanzan
los 40 aos muestran fallo de mdula sea. Una
de las caractersticas de esta enfermedad, que la
hace particularmente apropiada para su tratamiento por TG, radica en la ventaja selectiva de
las clulas corregidas genticamente respecto a
las clulas defectivas en los genes de Fanconi
[14]. La AF es consecuencia de mutaciones o
deleciones en cualquiera de los 13 genes de
AF relacionados con la estabilidad genmica de
estas clulas. Los resultados publicados sobre
los ensayos realizados en fase I no manifestaron beneficios teraputicos evidentes (Liu et al.,
1999) [15]. Nuestro equipo de investigacin ha
publicado recientemente resultados preclnicos
que abren nuevas expectativas al tratamiento
por TG de esta enfermedad mediante nuevos
procedimientos de manipulacin celular y nuevos vectores lentivirales, ms eficaces y seguros
respecto a los utilizados anteriormente [16].
Fibrosis qustica
El gen de la fibrosis qustica (FQ) est localizado en el cromosoma 7 y posee un tamao de
6,7 kB. En el 75% de los pacientes enfermos de
FQ, la enfermedad se produce por un defecto
en la posicin 508. Como consecuencia de las
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deficiencias de este gen se produce una alteracin fsica y qumica de las secreciones de las
vas respiratorias y de las enzimas pancreticas.
Debido al defecto en el transporte del cloro
entre las clulas, las mucosidades se hacen muy
densas, dificultando la expulsin del moco bronquial y facilitando su infeccin con patgenos
difciles de eliminar. La TG prioritaria de esta enfermedad radica en la insercin del gen de la FQ
en las clulas respiratorias. Se han desarrollado
diversos ensayos clnicos en fase I utilizando
fundamentalmente vectores adenovirales y, ms
recientemente, vectores no virales. Los protocolos con vectores adenovirales han mostrado
ventajas respecto a su eficacia de transduccin
de las clulas diana; sin embargo, tambin han
puesto de manifiesto su inmunogenicidad, al haberse generado anticuerpos que neutralizaron
la eficacia de los vectores. Las formulaciones no
virales facilitarn la administracin repetida de
frmaco gentico. En todo caso, estos ensayos
clnicos estn mostrando mayores complicaciones de la inicialmente previstas.
La seguridad en terapia
gnica
Problemas en el tratamiento
de la deficiencia de la ornitn
transcarbamilasa
Esta es una enfermedad en la que los pacientes carecen de una enzima clave del metabolismo de aminocidos, la ornitn transcarbamilasa (OTC), lo que da lugar a una acumulacin
potencialmente fatal de amoniaco en la sangre.
Puesto que la actividad OTC est normalmente presente en el hgado, se considera que ste
es el tejido diana de vectores que expresen la
versin correcta del gen OTC. En virtud de la
eficacia de los adenovirus para infectar clulas
hepticas, se propuso utilizar tales vectores para
transducir las clulas hepticas de estos pacientes con el gen OTC. Estudios in vitro, y tambin
Incidencia de leucemias
en pacientes X1-SCID tratados
mediante terapia gnica
De los 20 pacientes X1-SCID que fueron
tratados en Pars y Londres mediante TG, 5 desarrollaron leucemia linfoctica asociada a la insercin del gen teraputico en la proximidad de
diferentes oncogenes [17]. De manera paralela a
la observacin de las primeras leucemias en los
pacientes SCID-X1, C. Baum observ por primera vez en animales de experimentacin un fenmeno similar. En sus experimentos trasplant
clulas madre hematopopyticas que haban sido
transducidas con vectores gamarretrovirales a
animales receptores [18] ??. Al cabo del tiempo
observ en algunos animales la aparicin de una
leucemia clonal, que investig en su nivel molecular. En su estudio, Baum observ que el vector retroviral se haba insertado junto al oncogn evi1,
al cual haba activado mediante las secuencias
promotoras presentes en el vector. De manera
anloga, en los ensayos clnicos con pacientes
Puesta en marcha
de nuevos ensayos clnicos
con vectores teraputicos
de nueva generacin
Como consecuencia de los estudios de seguridad realizados desde que se pusieron de
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La reprogramacin celular,
una nueva estrategia
para la terapia gnica
de enfermedades
monognicas
manifiesto los primeros efectos adversos asociados a la terapia con vectores retrovirales,
comenz el desarrollo de vectores lentivirales
para su aplicacin clnica. El primer ensayo de
tratamiento de una enfermedad monognica
con vectores lentivirales se realiz recientemente en Pars en pacientes con X-adrenoleucodistrofia (ALD) [23]. Esta enfermedad
cursa con una desmielinizacin severa en
cerebro, por deficiencia en la protena ALD.
La progresin de la enfermedad puede ser
detenida mediante trasplante alognico de
progenitores hematopoyticos. En el ensayo
clnico realizado por N. Cartier et al., se transdujeron clulas CD34+ de la mdula sea de
los pacientes con vectores lentivirales portadores del gen de la ALD y se reinfundieron
tras un acondicionamiento mieloablativo de
los pacientes (fig. 11). Los resultados reportados en este trabajo demuestran por primera
vez la detencin del proceso de desmielinizacin en pacientes tratados por TG, abriendo
una nueva expectativa para la terapia de esta
grave patologa.
41.253
P4
6 13 17 24 31 34 -C 37 M
MFG c
44.218
1
46.229
MFG c
54.614
2
P5
Hacein-Bey et al., Science 302, 416;2003.
3LTR
IS
10 ngWT
% de inmigracin
198 pbs
5
4
3
2
1
50 c. IS
10 ngWT
0
CD3
T PBL
PBL
-10 a -9
-9 a -8
-8 a -7
-7 a -6
-6 a -6
-5 a -1
-4 a -3
-3 a -2
-2 a -1
-1 a 0
0a1
1a2
2a3
3a4
4a6
6a6
6a7
7a8
8a9
9 a 10
500 c. IS
Figura 10. Oncognesis insercional en dos pacientes X1-SCID tratados por terapia gnica.
94
20 months
ALD patient
(lipid storage disorder)
Lipid storage
relief
Gene-corrected HSCs
Progeny
of gene-corrected
HSCs distribute
throughout
the body
HSCs
Figura 11. Terapia gnica con vectores lentivirales en pacientes con X-adrenoleucodistrofia (tomado de L
Naldini. Science 326, 805-6, 2009).
Avances de la terapia gnica en el tratamiento de enfermedades monognicas
95
+ Oct 3/4
+ Sox2
Clulas de la piel +
FANCA
+ c-Myc
+ Klf4
Clula iPS
CMH
CMH
Figura 12. Esquema seguido para la generacin de progenitores hematopoyticos a partir de fibroblastos de
piel de pacientes con anemia de Fanconi (Raya et al. Nature 460: 53-9, 2009).
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