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EXTRACCION DE ADN A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA

Objetivo: Que el alumno conozca la tcnica de extraccin de ADN y conozca


fsicamente la molcula de ADN.
Introduccin
El cido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN es un tipo de
cido nucleico, una macromolcula que forma parte de todas las clulas. Contiene
la informacin gentica usada en el desarrollo y el funcionamiento de los
organismos vivos conocidos y de algunos virus, siendo el responsable de su
transmisin hereditaria.
El ADN es un polmero de nucletidos. Un polmero es un compuesto formado por
muchas unidades simples conectadas entre s. En el ADN, cada nucletido, a su
vez, est formado por un azcar (desoxirribosa), una base nitrogenada (que
puede ser adeninaA, timinaT, citosinaC o guaninaG) y un grupo fosfato.
Lo que distingue a un nucletido de otro es la base nitrogenada, y por ello la
secuencia del ADN se especifica nombrando slo la secuencia de sus bases.
El ADN se presenta como una doble cadena de nucletidos, en la que las dos
hebras estn unidas entre s por unas conexiones denominadas puentes de
hidrgeno.
Las secuencias de ADN que constituyen la unidad fundamental, fsica y funcional
de la herencia se denominan genes. Cada gen contiene una parte que se
transcribe a ARN y otra que se encarga de definir cundo y dnde deben
expresarse. La informacin contenida en los genes se emplea para generar ARN
y protenas, que son los componentes bsicos de las clulas, los que se utilizan
para la formacin de los orgnulos celulares, entre otras funciones.
Dentro de las clulas, el ADN est organizado en estructuras llamadas
cromosomas que, durante el ciclo celular, se duplican antes de que la clula se
divida.
El conocimiento de la estructura del ADN ha permitido el desarrollo de multitud de
herramientas tecnolgicas que utilizan sus propiedades fisicoqumicas para
analizar su implicacin en problemas concreto.
Podemos clasificar las metodologas de anlisis del ADN en aquellas que buscan
su multiplicacin, in vivo, como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), in
vitro, como la clonacin, y aquellas que explotan las propiedades especficas de
elementos concretos, o de genomas adecuadamente clonados. Es el caso de la
secuenciacin de ADN y de la hibridacin con sondas especficas ("southern blot"
y chips de ADN).

Material
1 jeringa o sistema vacutainer
1 torniquete
1 tubo de tapn morado estril
4 tubos de 13X100
2 vasos de precipitados de 100 ml
2 vasos de precipitados de 250 ml
1 incubadora
1 centrifuga
1 pipeta graduada de 5 ml
1 pipeta Pasteur
1 chupn
Tubos eppendorf de 1.5 ml
1 centrifuga
1 espectrofotmetro
1 pipeta semiautomtica de 100 l
Puntillas
Reactivos
Buffer de lisis:
Cloruro de amonio 131 mM
Bicarbonato de Amonio 0.9 mM
Buffer de digestin:
50 mM tris pH 7.5
100 mM EDTA pH 8.0
400 mM NaCl
0.5 % SDS
Proteinasa K
NaCl 6 M
Etanol al 100%
Etanol al 70%
Agua inyectable

Procedimiento
Mtodo SDS-PK

1.- Tomar en dos tubos con anticoagulante (tapa morada), 3.5 ml de sangre
perifrica con una jeringa o vacutainer, transferirla a dos tubo de plstico
(nalgene) en partes iguales y agregar 3/4 partes del tubo, de buffer de lisis.
Incubar 30 minutos en refrigeracin
2.- Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm, a 4C, y decantar el sobrenadante con
cuidado de no tirar el sedimento.
3.- Realizar 2 lavados ms en las mismas condiciones.
4.- Resuspender el botn en 3 ml de buffer de digestin (buffer de leucocitos) y
agregar 50 L de SDS y 50 L de PK.
5.- Agitar hasta que se disuelva el botn y dejar a incubacin tres dias a 37C.
6.- Agregar 2.5 ml de NaCl 6M y agitar fuertemente por inversin durante 1
minuto.
7.- Centrifugar a 3000 rpm durante 20 minutos. A temperatura ambiente (25 C).
8.- Transferir la fase acuosa (fase superior) a otro tubo 13X100.
9.- Aadir 2 volmenes de etanol absoluto fri.
10.- Observar el ADN precipitado, separarlo con una pipeta y transferirlo a un tubo
eppendorf de 1.5 ml.
11.- Hacer 3 lavados con etanol al 70%.
12.- Dejar que evapore totalmente el etanol 24 horas para despus resuspenderlo
en 100 L de agua inyectable.
13.- Cuantificar la concentracin del ADN por espectrofotometra a 260 nm.
Observaciones
Anota lo que viste durante la prctica.
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Resultados
Anota tus resultados obtenidos

Conclusiones
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Cuestionario
1. Por qu se lava con etanol?
2. Qu otras tcnicas son empleadas en biologa molecular para la
extraccin del ADN?
3. Para que se utiliza la solucin buffer de lisis?
4. Cul es la funcin del buffer de leucos o de digestin?
5. Por qu se usa etanol al 70% frio y no a temperatura ambiente? explique
Bibliografa consultada
Anota la bibliografa que utilizaste para contestar la prctica.
Imgenes
Agrega tus fotografas tomadas durante la prctica.

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Nombre y firma

VO. BO.

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Lugar y fecha