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al
Desarrollo de mtodos
en HPLC
Discutiremos:
Etapas en el desarrollo de un mtodo
Objetivos
Recoleccin de informacin
Preparacin de la muestra
Derivatizacin
Recopilacin
de Datos y
Objetivos del
Anlisis
Validar el
Procedimiento
Determinar las
necesidades de
Instrumental
Optimizar la
Separacin
Preparacin de
la muestra
Seleccionar la
Columna y las
Condiciones
Iniciales de la
Separacin
Anlisis o Recuperacin?
Ser necesaria la identificacin?
Separar todos o slo algunos de los componentes?
Qu precisin (RSD) se requiere?
Qu equipamiento est disponible?
Qu personal hay disponible?
Muchas o pocas muestras?
Informacin de la Muestra
Cuntos compuestos hay en la muestra?
Estructura qumica
Pesos moleculares
Solubilidad
pKas de los compuestos
Espectro UV de los compuestos
Cul es el rango de concentracin de los compuestos?
Dilucin
Concentracin
Cul es la matriz de la muestra?
Remover sustancias interferentes
Material particulado
Necesidades de Instrumental
Suministro de Solventes
Capacidad Isocrtica o de Gradiente
Sistemas Binarios, Ternarios o Cuaternarios
Rango de Flujos
Volumen del sistema extracolumnar
Sistema de Datos
Asistencia por
Computadora
Si el anlisis UV no es el
apropiado
ndice de Refraccin
Detector Fluorescencia
Detector Electroqumico
Derivatizacin
Detectores de masa
Preparacin de la Muestra
Objetivo
Obtener los compuestos de inters libres de interferencias en un solvente apropiado a las concentraciones
apropiadas.
Muestras Slidas
Disolver la muestra en la fase mvil siempre que sea posible
Si la muestra es insoluble en la fase mvil, disolverla en un fase ms dbil
Filtrar la muestra para eliminar slidos
Muestras Lquidas
Inyectar directamente si es posible, pero puede ser necesario:
o Filtracin
o Dilucin
o Concentracin
o Reconstitucin
Tcnicas Especiales
Clean-Up automatizado de la muestra
Preconcentracin en columna
Heart-cutting
Muestra - Pretratamiento
Disolver y
Filtrar
Muestra Slida
Matriz
Desconocida
Datos de
la Matriz
Muestra
Lquida
Matriz
Compleja
Dilucin
Filtracin
microdilisis*
Liofilizacin*
Preparacin
de la
Muestra
Extraccin Lquido-lquido*
Extraccin fase slida (SPE)*
Precipitacin-centrifugacin*
Filtracin
10
Modo
Fase
estacionaria
Fase mvil
Neutros
cidos dbiles
Bases dbiles
Fase Reversa
Par inico
C-18, C-8
Compuestos insolubles
en agua.
Ismeros Orgnicos
Fase Normal
Slica, Amino,
Ciano, Diol
Orgnicos
Inicos.
Iones Inorgnicos
Intercambio
Inico
Intercambio
Aninico /
Catinico
Buffer acuoso
Slica,
Poliestireno
Agua / Orgnico
Algunas veces
modificadores
Agua / Orgnico
Reactivo par-inico
11
Modo
Fase
estacionaria
Fase mvil
Protenas
desnaturalizar
Fase Reversa
Agua / Orgnico
C-4, C-3, 300
tamao de poro cido
tricloroactico
Protenas
Interaccin
hidrofbica
Butilo, Fenilo
Acuoso
Gradiente Salino
Anticuerpos,
Inhibidores
Afinidad
Ligantes
especficos
Sal acuosa
Quiral
Orgnico / Agua
12
13
14
Rellenos
15
Si
R
OH
* Si
Si
* Si
* Si
* Si
CH3
* Si
OH
Si
R
* Si
CH3
* Si
CH3
* Si
* Si
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
R
O
* Si
CH3
CH3
CH3
CH3
* Si
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
R
OH
CH3
OH
Convencional
(recubierta)
CH3
CH3
R
O
ODS Clsica
Convencional
(no recubiertas)
* Si
CH3
16
17
Separacin de Pptidos en
Diferentes Fases Unidas
300 SB-C18
300 SB-C8
Condiciones:
300 SB-C3
Columnas:
ZORBAX 300SB, 4.6 x 150mm
Fase Mvil: Gradiente, 0 - 26% B in 30min.
A = 0.1% TFA En Agua
B = 0.1% TFA En Acetonitrilo
Temperatura: 40C
Muestra:
2g de cada peptido
Velocidad de Flujo:
1.0 mL / min.
Deteccin:
UV-210nm
300 SB-CN
18
CH3
Si (CH2)n C
CH3
CH3
Si O Si CH2 CH
CH3
OH
CH2 OH
Ms polar
H
Si
CH3
Si O
Si (CH2)n NH
2
CH3
Selectividad alternativa
19
Acidos
C NH2
Amidas
C OH
Nitro
O
Alcoholes
Aminas
Halgenos
OH
NH2
C H
NO2
F, Cl
Hidrocarburos
Aromticos
CH3
Eteres
O
C OR
R O R
Polaridad
Mayor Retencin
El grupo funcional ms polar, determina la retencin
20
Generalidades en la Optimizacin de la
Fase Mvil
21
Agua/Buffer
Metanol
Acetonitrilo
Isopropanol
Tetrahidrofurano
Fuerza de
elucin
22
mAU
60%
Acetonitrile
40% Water
10
Time (min.)
mAU
80% Acetonitrile
20% Water
10
Time (min.)
23
24
Stronger
Solvents
Weaker
Solvents
IPA/Water
ACN/Water
DECREASING
MeOH/Water
INCREASING
Easily
Overloaded
C-18
C-2
Low Organic
Stationary Phase
High Organic
Stationary Phase
25
65% MeOH
7 mM phosphate
N
P DPP
Ac
50% ACN
7 mM phosphate
BP
Muestra de 7 componentes
Zorbax XDB-C8
DPP
N
Ac
A DPP & N
BP
38% THF
7 mM phosphate
u = uracilo
P = propranolol
BP = butilparabeno
DPP = dipropilftalato
N = naftaleno
Ac = acenafteno
A = amitriptilina
Ac
26
Solvente
n-hexano
0.01
1-clorobutano
0.20
benceno
0.20
xileno
0.24
cloroformo
0.26
tolueno
0.28
Cloruro de metileno
0.32
Acetato de etilo
0.38
tetrahidrofurano
0.44
acetonitrilo
0.50
metanol
0.70
27
Solvente de Inyeccin
Utilizar la fase mvil
Usar solventes para la muestra que no sean ms fuertes que la fase mvil
Inyectar < 20 L salvo cuando el solvente sea < 50% de la fuerza de la fase mvil
Factor de Capacidad
Ajustar la fuerza de la fase mvil para que 1 < k < 20
Fase Mvil
Utilizar aditivos para controlar la ionizacin y la forma de los picos
Seleccin de la Columna
Use un guardacolumna apropiado para alargar la vida til de la columna
Test de Robustez
Chequear la columna, fase mvil y otras variables antes de comenzar a utilizar el mtodo como
rutina.
28
O
R C O H
Bajo pH
O
R C O + H3O+
Menor retencin
O
R C O
y
O
R C O H
pH =
pKa
O
R C O
Alto pH
29
O
R C O H
Dbilmente bsico
5
4
Dbilmente cido
3
2
O
R C O
1
0
2
pH = pK
pH
30
SO Na+
Muestra
+
SO
3
H2PO4
R
N
+
R
O
O C R
31
32
33
Otros Usos
Limpieza de la columna
Exploracin de corridas en el
desarrollo de mtodos
34
% Org
100
k'
75
50
Incremento de la velocidad
del componente
25
0
0
10
20
30
Time (min)
35
100%
5%
Orgnico
Orgnico
36
Empinado
100% B
100% B
tG = 5
tG = 20
0% B
0% B
100% B
100% B
tG = 10
tG = 40
0% B
0% B
0
Poca pendiente
10
10
20
30
min.
40
37
38
Primer Resultado
El resultado de la primera corrida puede ser:
Sin picos/respuesta
Respuesta positiva
No
Si
Optimizar el sistema
Revisar el sistema del HPLC
39
40
40
38
7.43
7.89
3.86
= 10%
COMPOSICION DEL
SOLVENTE (%B)
Cambio
2.61
4.70
8.23
7.11
1.95
25
28
5.70
6.04
30
5.31
4.40
35
La elucin Isocrtica
es posible usando
agua/acetonitrilo
41
Dependencia de la Resolucin de k, N, y
Initial
Varia
k'
Se incrementa
N
Se modifica
42
2.
3.
3.
4.
Elegir una columna para el punto de partida (dimetro, longitud, tamao de partculas - 4.6 x
250 mm, 5m
Usar un tamao de poro apropiado
Usar un pH bajo hace que se necesiten ciertas condiciones en la fase
mvil para las primeras corridas.
Optimizar k (retencin)
Rango de Gradiente, tiempo, pendiente
Fase mvil cambio mnimo
Optimizar la recuperacin:
Solubilizar la muestra
Efectos de la temperatura
Efectos de la fase unida
Modificadores orgnicos
Optimizar (selectividad)
Temperatura
Fase unida
pH (en ltima instancia)
Optimizar N (condiciones de la columna)
Velocidad del flujo
Longitud
Tamao de partculas
43
44
1200barInstruments
SuperficiallyPorous
Particles120A,2.7m
1.8m
Particles
Microbore
CapillaryColumns
15mm
Length
Partculas ms pequeas
Mayores presiones
1000barInstruments
HighTempwith
Steric Protection
400barInstruments
SuperficiallyPorousParticles
300A,5m
Narrowbore
150m
NonPorousParticles
Length
5m
Particles
10m
Particles
3.5m
Particles
Monolith
250mm
Length
SuperficiallyPorous
Particles 40m
45
Caractersticas
Fase ligada determina la selectividad y robustez en diferentes condiciones.
Dimetro interno Capacidad de carga de muestra, flujo (Consumo de
solvente), sensibilidad y robustez.
Tamao de poro Seleccin basada en el tamao de la molcula, 80-120
para molculas pequeas y 300 para protenas y pptidos.
Tamao de partcula Eficiencia y resolucin
Largo de la Columna resolucin versus velocidad de anlisis.
46
47
Conventional
dp= 10 m
1.00 mL/min
4.6 mm
dp= 5 m
4.6 mm
10
Microbore
2.1 mm
0.01 mL/min
dp= 5 m
or
1.0 mm
100 mm
200 mm
0
Ventajas:
Disminuye el consumo de solvente
Bueno para trazar un anlisis si la cantidad
de la muestra es limitada.
Fcil cambio de conversin de la velocidad
del flujo
Desaventajas:
La instrumentacin debe tener muy poco
volumen extra en la columna.
Los Frits deben cambiarse ms
frecuentemente.
48
10
2.1 mm ID
07
49
Particle Size
5- m
5- m
3.5- m Rapid Resolution
3.5- m Rapid Resolution
3.5- m Rapid Resolution
3.5- m Rapid Resolution
3.5- m Rapid Resolution
50
3.5 m
40%
5 m
Analysis
time (min)
18 min
Solvent
Waste (mL)
30 mL
18 mL
20,000
40%
18 mL
Reduccin
20,000
Sin cambios
3.5 m
50%
9 min
Reduccin
9 mL
50%
Reduccin
12,000
10,000
Diferencia del 9%
51
4.6 x 50 mm
Absorbance
4.6 x 30 mm
4. Acetanilida
5. Aspirina (cido acetosaliciico)
6. cido Saliclico
7. Fenacetina (acetofenetidina)
Muestra:
1. Acetaminofenol (4-acetamidofenol)
2. Cafena
3. 2-Acetamidofenol
4.6 x 75 mm
4.6 x 150 mm
min
52
Instrumentacin Especializada
53
H=
+C
0.0030
0.0025
5.0m
HETP(cm)
0.0020
0.0015
3.5m
0.0010
1.8m
0.0005
0.0000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
VolumetricFlowRate(mL/min)
Smallerparticlesizesyieldflattercurves,higherflowrates
withsameefficiency.
54
H=
+C
55
Estndard
A
1
Resolucin rpida
4.6 x 150 mm, 3.5m
B
1
2
5
3
Resolucin Rpida
4.6 x 75 mm, 3.5m
C
1
2
5
3 4
6 7
Resolucin Rpida
4.6 x 50 mm, 3.5m
5
2
3 4
6 7
RRHT
Resolucin Rpida
HT
4.6 x 50 mm, 1.8m
E
0
Columnas:
Nmeros de
Partculas:
10
12 min
A) 990967-902
B) 963967-902
C) 966967-902
D) 935967-902
E) 925975-902
56
Longitud.
L1 L2
dp1 dp2
Vinj1 Vinj2
L1dp1 L2dp2
.
57
mAU
400
100
0
0.5
1.5
2.5
min
Resolution 1.902
mAU
300
250
200
150
100
50
0
0.5
1.5
2.5
min
58
80Hz
PW = 0.33 sec
40Hz
PW=0.42sec
20 Hz
PW=0.67sec
10Hz
PW=1.24sec
5Hz
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
min
59
P
(bar)
HMIN
(m)
5.0
14.5
10.0
25,000
3.0
66.9
6.0
41,000
1.5
531
3.0
83,000
1.0
1800
2.0
125,000
0.75
4270
1.5
166,000
0.50
14400
1.0
250,000
60
Poder de rango
The Power Range of an instrument is its combined
flow rate and pressure capability.
bar
1200
Agilent 1290
(planned, MVS 1000bar @2ml/min)
1000
800
600
Agilent RRLC
400
200
Standard LC
0
0
ml/min
61
62
Derivatizacin Pre-Columna
Ventajas y Desventajas
Ventajas
Desventajas
Pueden aparecer artificios y picos mltiples
La reaccin debe ser muy reproducible
La separacin pude resultar ms dificultosa
63
Derivatizacin Pre-columna
64
Derivatizacin
Aminocidos Primarios y Secundarios usando o-ftalaldehdo y 9-Fluorenilmetilcloroformato a
temperatura ambiente
CHO
+HNR
+ H2 NR
=
CH
2 -O-C-Cl
CHO
HS(CH2 )2COOH
60SEC/RT
60SEC/RT
SR
NR
CH
2 -O-C-NR
=
240
ALA
PRO
GLY
220
ARG
SER
THR
GLU
180
LEU
200
ILE
VAL
PHE
140
EX/EM: 266/3135
LYS
TRP
TRY
80
ORN
100
HIS
ASP
MET
120
EX/EM: 230/455
mV
160
60
10
Tiempo (min.)
15
20
65
Derivatizacin Post-Columna
Ventajas y Desventajas
Ventajas
Pueden utilizarse varios detectores simultneamente
La generacin de artificios es menor
No se necesita el desarrollo de nuevas separaciones
Desventajas
66
Derivatizacin Post-columna
67
Derivatizacin
Grupo Funcional Reactivo
-NH
o-Ftalaldehdo
-NHR
9-Fluorenilmetilcloroformato
-COOH
p-Bromofenilacil bromuro
2-Naftacil Bromuro
-OH
Fenilisocianato
-CHO, -CO
2, 4-Dinitofenilhidracina
-CO-COOH
2, 4-Dinitrofenilhidracina
68
Lo logramos!
69
Como seguimos?
Desarrollo
Validacin
Transferencia
70
71
72