MINISTRIO DA SADE

INSTITUTO NACIONAL DE CNCER JOS ALENCAR GOMES DA SILVA (INCA)

VII CURSO DE VERO DE PESQUISA EM ONCOLOGIA

PROGNSTICO DO CNCER DE
MAMA EM MULHERES IDOSAS:
ESTUDO EPIDEMIOLGICO

RIO DE JANEIRO, RJ
INCA
2015

2015 Instituto Nacional de Cncer Jos Alencar Gomes da Silva/ Ministrio da Sade.
Esta obra disponibilizada nos termos da Licena Creative Commons
Atribuio No Comercial Compartilha igual 4.0 Internacional.
permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a
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de Cncer (http://controlecancer.bvs.br/) e no Portal do INCA (http://www.inca.gov.br).
Tiragem: XXXX exemplares
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GOMES DA SILVA (INCA)
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CURSO I - PROGNSTICO DO CNCER DE MAMA EM MULHERES IDOSAS: ESTUDO

EPIDEMIOLGICO
Pesquisadores responsveis
Anke Bergmann
Luiz Claudio Thuler
Equipe
Karen Abraho
Marcelo Bello
Raquel Menezes
Suzana Aguiar

SUMRIO
Elaborao de um projeto de Pesquisa 5
PASSO 0. VER O QUE OS OUTROS J FIZERAM 5
PASSO 1. A ESCOLHA DO TEMA 6
PASSO 2. A DEFINIO DO PROBLEMA 6
PASSO 3. A HIPTESE 6
PASSO 4. A ESCOLHA DO DELINEAMENTO DA PESQUISA 7
PASSO 5. DEFINIO DOS PARTICIPANTES 7
PASSO 6. A OPERACIONALIZAO DAS VARIVEIS E ELABORAO DOS
INSTRUMENTOS DE COLETA DOS DADOS 8
PASSO 7. ASPECTOS TICOS 9
PASSO 8. PR-TESTE 9
PASSO 9. COLETA DOS DADOS E QUALIDADE DAS INFORMAES 10
PASSO 10. ANLISE DOS DADOS 10
PASSO 11. CRONOGRAMA 10
PASSO 12. ORAMENTO 11
PASSO FINAL. REDAO 12
ANEXO 1: EXEMPLO DE PROJETO DE PESQUISA 13
REFERNCIAS 18
Anexo 2: Anlise de dados com software SPSS verso 20.0

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ANEXO 3: REVISTA Epidemiologia e Servios de Sade 23

ANEXO 4: INTRUO PARA AUTORES DA REVISTA BRASILEIRA DE
CANCEROLOGIA 25

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Elaborao de um projeto de Pesquisa

Passo 0. Ver o que os outros j fizeram
A reviso de literatura refere-se fundamentao terica que ser adotada para
tratar o tema e o problema de pesquisa. Por meio da anlise da literatura publicada ser
traado um quadro terico e ser feita a estruturao conceitual que dar sustentao ao
desenvolvimento da pesquisa.
A reviso de literatura resultar do processo de levantamento e anlise do que j foi
publicado sobre o tema e o problema de pesquisa escolhidos. Permitir um mapeamento de
quem j escreveu e o que j foi escrito sobre o tema e/ou problema da pesquisa.
Reviso narrativa
A reviso narrativa (RN) s vezes tambm chamada de reviso jornalstica ou reviso
tradicional da literatura e tem um escopo temtico mais aberto, dificilmente partindo de uma
questo especfica bem definida; a busca das fontes no predeterminada e especificada,
frequentemente com menor abrangncia; a incluso e a avaliao dos estudos so condicionadas
aos critrios dos revisores, que normalmente tambm no so pr-especificados e tendem a ser
mais subjetivos, sendo as snteses geralmente de ordem qualitativa.
Reviso sistemtica
A reviso sistemtica (RS) um tipo de investigao cientfica que tem por objetivo
reunir, avaliar criticamente e conduzir uma sntese dos resultados de mltiplos estudos
primrios. Deve ser realizada a partir de metodologia clara, que se traduz, antes de tudo, na
elaborao de um projeto de pesquisa elaborado para se definir cuidadosamente o que se
quer saber e determinar previamente o que ser feito, e como, para alcanar a(s) resposta(s).
Estando formulada a questo a que se quer responder, deve-se fazer uma busca abrangente
da literatura publicada e no publicada, no intuito de incluir todos os estudos relevantes para
responder pergunta que ocasionou a reviso.
Metanlise
O termo metanlise apresenta problemas de definio na literatura. Isso tem
importncia prtica: s vezes, o termo aparece significando uma reviso completa, incluindo
busca na literatura, extrao de dados e combinao dos dados quantitativos; outras vezes
o termo restrito descrio da sntese quantitativa de diferentes estudos dentro de uma
reviso. H autores que descrevem metanlise como uma reviso sistemtica quantitativa,
e outros, mais especificamente, como a combinao estatstica de pelo menos dois estudos,
para produzir uma estimativa nica de magnitude (de efeitos de uma interveno teraputica
sob investigao, por exemplo).
5

Curso de vero 2015

Passo 1. A escolha do tema

Para que uma pesquisa seja objetiva e nos conduza a respostas especficas devemos,
sempre pesquisar temas especficos. Quando necessrio, podemos encaminhar pesquisas
paralelas, mas cada uma delas dentro de temas o mais especfico possvel.

Passo 2. A definio do problema

O problema a mola propulsora de todo o trabalho de pesquisa. Aps a delimitao
do tema, a prxima etapa a formulao do problema a ser pesquisado. Toda pesquisa
cientfica comea pela formulao de um problema e tem por objetivo procurar a soluo
do mesmo. O problema de pesquisa costuma ser apresentado geralmente na forma de uma
proposio interrogativa e deve expressar a dvida que queremos esclarecer sobre o tema
delimitado. A questo dever ser respondida por meio da apresentao de uma hiptese,
que ser confirmada ou negada pelo trabalho de pesquisa. O problema criado pelo prprio
autor e relacionado ao tema escolhido. No h regras para se criar um problema, mas alguns
autores sugerem que ele seja expresso em forma de pergunta ou como uma afirmao.

Passo 3. A hiptese
Hiptese sinnimo de suposio. Neste sentido, hiptese uma afirmao
categrica (uma suposio), que tenta responder ao problema levantado para a pesquisa.
uma pr-soluo para o problema levantado. O trabalho de pesquisa, ento, ir confirmar ou
negar a hiptese (ou suposio) levantada.
Uma hiptese de pesquisa a resposta que se imagina para o problema formulado.
Ela deve conter todos os conceitos e variveis envolvidas. Deve ser redigida de forma clara,
sem termos ou conceitos implcitos. A hiptese da pesquisa uma suposio objetiva e no
uma mera opinio. Alm disto, precisa ter bases slidas, assentadas e garantidas por boas
teorias.
Em geral, apresentada a hiptese, o autor revela os objetivos da pesquisa. A definio
dos objetivos determina o que o pesquisador quer atingir com a realizao do trabalho de
pesquisa. Objetivo sinnimo de meta, fim. Alguns autores separam os objetivos em objetivos
gerais e objetivos especficos, mas no h regra a ser cumprida quanto a isto e outros autores
consideram desnecessrio dividir os objetivos em categorias.
Por fim, sempre interessante apresentar a justificativa para a realizao do projeto
de pesquisa. Como o prprio nome indica, o convencimento de que o trabalho de pesquisa
deve ser realizado. O tema escolhido pelo pesquisador e a hiptese levantada so de suma
importncia, para a sociedade ou para alguns indivduos, de ser comprovada. A justificativa
exalta a importncia do tema a ser estudado, ou justifica a necessidade imperiosa de se levar
a efeito tal empreendimento.

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Passo 4. A escolha do delineamento da pesquisa

O delineamento da pesquisa refere-se ao planejamento da mesma em sua
dimenso mais ampla, ou seja, neste momento o investigador estabelece os meios tcnicos
da investigao ao informar se a pesquisa ser bibliogrfica, descritiva, experimental,
epidemiolgica, documental etc. necessrio, ento, que o investigador justifique a escolha
do tipo de pesquisa. Em alguns casos, como nos estudos epidemiolgicos, ser necessrio
indicar o tipo de estudo escolhido; por exemplo: srie de casos, estudo transversal, estudo
caso-controle, estudo de coorte, estudo de sobrevida, ensaio clnico etc.

Passo 5. Definio dos participantes

A populao-alvo, tambm chamada de populao estudada, composta de
elementos distintos possuindo um certo nmero de caractersticas comuns. Uma populao
um conjunto de pessoas, objetos, acontecimentos ou fenmenos com pelo menos uma
caracterstica comum.
Uma amostra um subconjunto de indivduos da populao-alvo. Para que
as generalizaes sejam vlidas, as caractersticas da amostra devem ser as mesmas
da populao. Existem dois tipos de amostras, as probabilsticas, baseadas nas leis de
probabilidades estatsticas, e as amostras no probabilsticas. Existem vrias tcnicas de
amostragem, cada uma tem vantagens e desvantagens, e a escolha dever ser feita pelo
pesquisador de acordo com os objetivos propostos pela pesquisa, de forma a garantir (tanto
quanto possvel) o sucesso da pesquisa e dos resultados. Deve haver critrio para a seleo
desses elementos; cada elemento da populao deve ter a mesma chance de ser escolhido
para garantir amostra o carter de representatividade.
Amostragem probabilstica
a) Amostragem aleatria simples - a seleo por meio de sorteio. Inicialmente, devemos
listar ou numerar de um a N a populao a ser analisada, e posteriormente selecionar uma
amostra de pelo menos 10% da populao mediante a um sorteio. Para o sorteio podemos
fazer uso da tabela de nmeros aleatrios.
b) Amostragem sistemtica - Esse mtodo um procedimento para a amostragem aleatria
utilizado quando os elementos da populao j se acham ordenados. Exemplo: Uma
escola mantm um arquivo contendo os registros de antigos alunos. Entre um total de
10.000 fichas, podemos tirar de forma sistemtica uma ficha a cada 10, totalizando uma
amostragem de 1.000 fichas. Para garantir a mesma probabilidade para cada ficha da
amostra, dever ser feito um sorteio da primeira ficha entre as 10 primeiras. Supondo que
a primeira ficha sorteada foi a de nmero 4, as fichas que iro compor a amostra so: {4,
14, 24, 34, 44,...,9.984}.
c) Amostragem estratificada - Considera a populao dividida em subconjuntos, em que cada
subconjunto recebe o nome de estrato e apresenta uma caracterstica comum entre seus
elementos. Exemplo: suponha uma empresa com 84 funcionrios, em que 25 pessoas
7

Curso de vero 2015

so do sexo feminino e as 59 restantes so do sexo masculino. A populao constituda

pelos 84 funcionrios: N = 84 (100%). Um dos estratos constitudo pelos funcionrios do
sexo masculino: N1 = 59 (70%). O Outro estrato constitudo pelos funcionrios do sexo
feminino: N2 = 25 (30%). A composio da amostra deve manter a mesma proporo dos
estratos. Amostra = 9 elementos n1 = 0,70 x 9 = 6 homens e n2 = 0,30 x 9 = 3 mulheres.
Amostragem no probabilstica
a) Amostragem acidental
b) Amostragem de voluntrios
c) Amostragem por quotas

Passo 6. A operacionalizao das variveis e elaborao dos

instrumentos de coleta dos dados
A explicao minuciosa, detalhada, rigorosa e exata de toda ao desenvolvida no
mtodo (caminho) do trabalho de pesquisa apresentada na seo destinada metodologia.
a explicao do tipo de pesquisa, do instrumental utilizado (questionrio, entrevista etc.), da
durao prevista da pesquisa, da equipe de pesquisadores envolvida e da diviso do trabalho,
das formas de armazenamento e tratamento dos dados, enfim, de tudo aquilo que se utilizou
para realizar o trabalho de pesquisa.
Varivel
Varivel uma caracterstica da populao que pode ser classificada em dois ou
mais grupos disjuntos. A classificao das variveis se faz conforme sua natureza em:
Qualitativa:
- Nominal (no existe ordenao entre as categorias). Exemplos: sexo, raa.
- Ordinal (existe uma ordem natural nas categorias). Exemplos: classe social, grau de
instruo, consumo de lcool.
Quantitativa:
- Discretas (resultado de contagens). Exemplos: nmero de filhos, nmero de reprovaes.
- Contnuas (resultados de mensuraes). Exemplos: estatura, nota na prova, glicemia.
Os principais instrumentos para a coleta de dados so o questionrio e a entrevista.
Esses dois instrumentos tm, de comum, o fato de serem constitudos por uma lista de
indagaes que, respondidas, do ao pesquisador as informaes que ele pretende atingir. A
principal diferena entre um e outro, que o questionrio feito de perguntas, entregues por
escrito ao informante e s quais ele tambm responde por escrito, enquanto, na entrevista,
as perguntas so feitas oralmente, quer a um indivduo em particular quer a um grupo, e as
respostas so registradas, geralmente pelo prprio entrevistador.
8

Curso de vero 2015

Os questionrios e entrevistas possuem tcnicas prprias de elaborao e aplicao,

que precisam ser obedecidas, como garantias para sua validade e fidedignidade.
A entrevista um dilogo preparado com objetivos definidos e uma estratgia
de trabalho. O questionrio um conjunto de questes pr-elaboradas, sistemtica e
sequencialmente dispostas em itens que constituem o tema de pesquisa.
Geralmente se preferem, para o questionrio, perguntas fechadas e, para a entrevista,
perguntas abertas ou simplesmente tpicos. De fato, como nesta ltima o entrevistador se
encontra junto ao informante, bastam apenas indicaes mais amplas, podendo fazer, no
momento oportuno, as adaptaes e complementaes que forem necessrias, o que no
acontece no questionrio onde o informante se encontra sozinho e sem nenhuma ajuda.
Perguntas fechadas so as que algum responde assinalando uma das alternativas, j
anteriormente fixada no formulrio.

Passo 7. Aspectos ticos

Pesquisas envolvendo seres humanos somente devem ser iniciadas aps aprovao
pelo Comit de tica e Pesquisa da instituio. Devem ser cumpridas as recomendaes
do cdigo de biotica nacional (Resoluo 196 da CNS) e internacionais (Guiding Medical
Doctors in Biomedical Research Involvig Human Subjects da Declarao de Helsinki de 1964,
com suas diversas modificaes j ocorridas, sendo a ltima a de Edimburgo em 2001).

Passo 8. Pr-teste
Um pr-teste a aplicao de um questionrio, na sua verso preliminar, a uma
amostra de indivduos, com o objetivo de identificar perguntas-problema que justifiquem uma
modificao da redao, alterao do formato ou mesmo serem eliminadas da verso final.
O pr-teste necessrio para minimizar erros sistemticos no estudo. Ele ajuda o
investigador a refinar o protocolo e melhorar o estudo. O principal propsito do pr-teste
guiar o desenvolvimento do estudo ao prover melhores repostas s perguntas de pesquisa e
reduzir custos em dinheiro e tempo. Um pr-teste geralmente realizado em poucos dias ou 1
a 2 semanas. Ele um perodo de treino para o investigador e os seus assistentes. Em geral
precede imediatamente o comeo do estudo.
J o estudo piloto costuma ser um estudo maior e mais formal, que geralmente
ocorre antes do estudo final. usado para refinamento da metodologia e apoio obteno
de financiamento. Os estudos piloto podem guiar o protocolo final no clculo do tamanho da
amostra, contribuir para o refinamento dos mtodos de recrutamento, dos instrumentos e dos
questionrios, das intervenes e transporte das amostras ao laboratrio e do sistema de
manejo de dados.

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Passo 9. Coleta dos dados e qualidade das informaes

A coleta dos dados constitui parte de um experimento cientfico. Engloba o registro
de dados, caracteres, informaes relativas ao fenmeno ou objeto de estudo. Pode ser
executada dentro de um laboratrio de pesquisa ou externamente, quando chamada de
trabalho de campo.
O controle de qualidade tem como propsito minimizar a chance de obter concluses
errneas. Em geral, trs tipos de controle de qualidade podem ser realizados: qualidade de
procedimentos clnicos, qualidade de procedimentos laboratoriais e qualidade dos dados
colhidos.
Durante o estudo importante que o pesquisador responsvel se mostre presente,
conduza reunies frequentes da equipe de pesquisa e revise regularmente a execuo de todos
os elementos do estudo. Alm disso, uma amostra aleatria dos casos ou das observaes
pode ser reexaminada com o intuito de checar a consistncia dos dados, evitar fraudes e
garantir a completitude da informao.

Passo 10. Anlise dos dados

Devem estar descritos como os dados sero digitados, armazenados e processados
[preparao dos dados e apreciao da sua consistncia], citando inclusive o programa
estatstico usado, quando houver (em geral, nesta etapa utiliza-se o Excel ou planilha similar).
Para a anlise dos dados devem ser citados os mtodos estatsticos que sero usados. Por
exemplo, as variveis categricas so, geralmente, apresentadas em forma de percentual
acompanhadas por intervalos com 95% de confiana. J para as variveis contnuas comum
a apresentao de mdia acompanhada do respectivo desvio padro (no caso de distribuio
normal dos dados) ou mediana com os valores mximo e mnimo (no caso de distribuio
anormal).
Quando houver comparao entre grupos visando testar uma hiptese, os testes
estatsticos que sero empregados devem ser citados. So exemplos: Qui-quadrado, t de
Student, Fisher, Mann-Whitney, Kaplan-Meier, Cox, Spearman, Coeficiente de correlao de
Pearson etc. Em geral, tambm citado o ponto de corte para aceitar um resultado como
estatisticamente significante (p<0,05). Deve-se indicar ainda o programa de computador
utilizado para as anlises.

Passo 11. Cronograma

O cronograma a previso de tempo que ser gasto na realizao do trabalho de
acordo com as atividades a serem cumpridas. As atividades e os perodos sero definidos
a partir das caractersticas de cada pesquisa e dos critrios determinados pelo autor do
trabalho. Os perodos podem estar divididos em dias, semanas, quinzenas, meses, bimestres,
trimestres etc. Esses sero determinados a partir dos critrios de tempo adotados por cada
pesquisador.
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ATIVIDADES/PERODOS
1

Reviso da literatura

Elaborao do Projeto

Submisso ao CEP*

Aprovao pelo CEP*

Coleta de dados

Digitao dos dados

Anlise dos dados

Elaborao do Relatrio Final

Reviso do texto

jan fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez
X
X

X
X
X
X

X
X

X
X

X
X

X
X

10 Encaminhamento para publicao

X
*Comit de tica e Pesquisa da Instituio

Passo 12. Oramento

Normalmente as monografias, as dissertaes e as teses acadmicas no necessitam
que sejam expressos os recursos financeiros. Os recursos s sero includos quando o
Projeto for apresentado para uma instituio financiadora de Projetos de Pesquisa. Os
recursos financeiros podem estar divididos em Material Permanente, Material de Consumo
e Pessoal, sendo que esta diviso vai ser definida a partir dos critrios de organizao de
cada um ou das exigncias da instituio onde est sendo apresentado o Projeto.
Materiais permanentes
So aqueles materiais que tm uma durabilidade prolongada. Normalmente so
definidos como bens durveis que no so consumidos durante a realizao da pesquisa.
Podem ser: geladeiras, ar refrigerado, computadores, impressoras etc.
Exemplo:
ITEM
Computador
Impressora
Scanner
Mesa para o computador
Cadeira para a mesa
TOTAL

CUSTO (R$)
1.700,00
500,00
400,00
300,00
200,00
3.100,00

Materiais de consumo
So aqueles materiais que no tm uma durabilidade prolongada. Normalmente so
definidos como bens que so consumidos durante a realizao da pesquisa. Podem ser:
papel, tinta para impressora, gasolina, material de limpeza, caneta etc.

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Curso de vero 2015

Exemplo:
ITEM
50 CDs
10 resmas de papel tipo A4
5 cartuchos de tinta para impressora
TOTAL:

CUSTO (R$)
50,00
100,00
650,00
800,00

Pessoal
a relao de pagamento com pessoal, incluindo despesas com impostos.
Podem ser includos bolsistas ou funcionrios contratados.
Exemplo:
ITEM
CUSTO MENSAL (R$) CUSTO TOTAL (R$)
1 estagirio de pesquisa (12 meses)
600,00
7.200,00
1 digitador (4 meses)
500,00
2.000,00
1 revisor de texto
1.000,00
1.000,00
1 supervisor de trabalho de campo (4 meses)
1.000,00
4.000,00
TOTAL:
14.200,00

Passo final. Redao

Caractersticas do projeto de pesquisa:
1 - Introduo (obrigatrio)
2 - Reviso da Literatura (obrigatrio)
3 - Problema (obrigatrio)
4 - Hiptese (obrigatrio)
5 - Objetivos (obrigatrio)
6 - Justificativa (obrigatrio)
7 - Metodologia (obrigatrio)
8 - Cronograma (se achar necessrio)
9 - Recursos (se achar necessrio)
10 - Anexos (se achar necessrio)
11 - Referncias (obrigatrio)
12 - Glossrio (se achar necessrio)
Apresentao do projeto de pesquisa:
1- Capa (obrigatrio)
2- Folha de Rosto (obrigatrio)
3- Sumrio (obrigatrio)
4- Texto do projeto (obrigatrio)
5- Referncias (obrigatrio)
6- Capa (se quiser)
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Curso de vero 2015

ANEXO 1: Exemplo de Projeto de Pesquisa

Modelo de projeto de pesquisa
Autor: Z Moleza
Resumo
O presente texto apresenta aos alunos alguns aspectos formais de um Projeto de Pesquisa.
A exposio dos diferentes captulos que compem referido projeto (introduo; objetivos;
justificativa; metodologia e bibliografia) e de seu contedo tm por objetivo formular uma
proposta de padronizao para os diferentes cursos.
Palavras-chave: metodologia, pesquisa cientfica, projeto de pesquisa
Abstract
This article presents to the students some formal aspects of a Research Project. The exposition
of the different chapters which integrate a project (introduction, objectives, justification,
method and bibliography) and its contents is designed to generate a standardization proposal
to various programs.
Keywords: methodology, scientific research, research project
Vale confessar previamente para evitar falsas expectativas: este pequeno texto tem pretenses
muito modestas e objetivos meramente didticos. Seus objetivos so apresentar ao aluno
alguns aspectos formais do Projeto de Pesquisa, ao mesmo tempo em que so transmitidas
certas informaes que podem simplificar sua vida acadmica.
Um Projeto de Pesquisa composto de elementos pr-textuais, formado por capa e sumrio;
elementos textuais, compostos de Introduo, Objetivos, Justificativa e Metodologia; e
elementos ps textuais, do qual fazem parte Cronograma e Bibliografia.
A ateno recair, aqui, sobre os elementos textuais que compem o projeto. Comecemos,
pois, por alguns aspectos grficos importantes. O texto do corpo do projeto deve ser redigido
em fonte tamanho 12 e espaamento duas linhas. A melhor fonte para os ttulos a Arial e
para o texto a fonte Times New Roman ou similares com Serifa, que facilitam a leitura de texto
longos. O papel tamanho A4 o recomendvel.
As margens so as seguintes: esquerda, 4,0 cm; direita 2,5 cm; superior 3,5 cm; inferior
2,5 cm. As pginas devem ser numeradas no canto superior direito, tendo incio naquelas
referentes aos elementos textuais capa e sumrio no so numerados, muito embora entrem
na contagem de pginas (Garcia, 2000).
Introduo
Nem todos os modelos de projetos de pesquisa incluem uma introduo. Muitas vezes passase diretamente aos objetivos. Mas bom no esquecer de que quem l um projeto l muitos.
sempre conveniente, portanto, introduzir o tema da pesquisa, procurando captar a ateno
do leitor/avaliador para a proposta. A redao, como nos demais captulos, deve ser correta
e bem cuidada. Uma leitura prvia e atenta de Medeiros (1999) poder ajudar muito na hora

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Curso de vero 2015

de escrever o texto. Para as dvidas mais correntes da Lngua Portuguesa verificar Garcia
(2000) e Martins (1997). Dicionrios tambm so imprescindveis nessa hora.
Na Introduo, de se esperar que seja apresentado o tema de pesquisa. Escolher um tema
, provavelmente, uma das coisas mais difceis para um pesquisador iniciante. Pesquisadores
experientes costumam desenvolver tcnicas de documentao do trabalho cientfico que lhes
permitem no s extrair de seus arquivos tais temas como trabalh-los concomitantemente.
Mas um estudante de graduao geralmente no acumulou o volume de informaes
necessrio para tal empreendimento. Um bom comeo, portanto, conhecer o que outros
j fizeram, visitando bibliotecas onde seja possvel encontrar monografias de concluso de
curso, dissertaes de mestrado e teses de doutorado. Tais trabalhos podem servir como fonte
de inspirao, alm de familiarizar o aluno com os aspectos formais, tericos e metodolgicos
do trabalho cientfico.
A primeira regra para a escolha do tema bastante simples: o pesquisador deve escolher um
tema do qual goste. O trabalho de pesquisa rduo e, s vezes, cansativo.
Sem simpatizarmos com o tema, no conseguiremos o empenho e a dedicao necessrias.
A segunda regra to importante quanto a primeira: o pesquisador no deve tentar abraar
o mundo. A tendncia dos jovens pesquisadores formular temas incrivelmente amplos,
geralmente resumidos em uns poucos vocbulos: A escravido; a Internet; A televiso; A
Msica Popular Brasileira; O Direito Constitucional; Os meios de comunicao; so alguns
exemplos. preciso pensar muito bem antes de seguir esse caminho. O pesquisador
inexperiente que enveredar por ele ter grandes chances de produzir um estudo superficial,
recheado de lugares comuns.
O tema deve ser circunscrito tanto espacial como temporalmente. A escravido, por exemplo,
um tema dos mais amplos. Escravido na Roma Antiga? No Brasil contemporneo? Nos
Estados Unidos poca da Guerra de Secesso? No livro A Repblica, de Plato? A escravido
por dvidas na Grcia Antiga? Temas apoiados em palavras e sentido muito amplo, como
influncia e atualidade, tambm devem ser evitados. O pesquisador deve se perguntar se
o tema escolhido no permite perguntas do tipo: O qu? Onde? Quando?
No captulo 2 do livro de Umberto Eco, Como se faz uma tese, possvel encontrar uma excelente
ajuda para a escolha do tema de pesquisa, ilustrada com vrios exemplos (Eco, 1999, p. 7-34).
Uma terceira regra vale ser anunciada: o tema deve ser reconhecvel e definido de tal maneira
que seja reconhecvel igualmente por outros (Eco, 1999, p. 21). Ou seja, deve ser aceito como
um tema cientfico por uma comunidade de pesquisadores.
Uma vez anunciado o tema da futura pesquisa, conveniente o pesquisador descrever qual
foi sua trajetria intelectual at chegar a ele. Como se sentiu atrado por esse tema? Que
matrias despertaram seu interesse durante a graduao? Que autores lhe inspiraram?
Apresentado o tema hora seguir adiante e expor os objetivos propriamente ditos da pesquisa.
Objetivos
Este captulo deve comear de forma direta, anunciando para o leitor/avaliador quais so os
objetivos da pesquisa: O objetivo desta pesquisa ...; Pretende-se ao longo da pesquisa
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Curso de vero 2015

verificar a relao existente entre...; Este trabalho enfocar...; so algumas das formas s
quais possvel recorrer.
Vrios autores desenvolvem em trabalhos de metodologia do trabalho cientfico e intelectual o
tema da documentao pessoa. Bons guias para tal so Severino (2000, p. 35-46) e Salomon
(1999, p. 121-143), mas a descrio realizada por Mills (1975, p. 211-243) continua insupervel.
Se na Introduo era apresentado o tema, no captulo Objetivos ser abordado o problema,
bem como as hipteses que motivaro a pesquisa cientfica. A pergunta-chave para este
captulo o que se pretende pesquisar?
Um problema cientfico tem a forma de uma questo, de uma pergunta. Mas uma questo de
tipo especial. uma pergunta formulada de tal maneira que orientar a investigao cientfica
e cuja soluo representar uma ampliao de nossos conhecimentos sobre o tema que lhe
deu origem. Uma resposta provisria a este problema cientfico o que chamamos de hiptese.
A pesquisa cientfica dever comprovar a adequao de nossa hiptese, comprovando se ela,
de fato, uma soluo coerente para o problema cientfico anteriormente formulado.
Franz Victor Rudio apresenta, em seu livro, uma srie de interrogaes que podem ajudar o
jovem pesquisador a escolher o seu tema de investigao e verificar sua viabilidade:
a) este problema pode realmente ser resolvido pelo processo de pesquisa cientfica?
b) o problema suficientemente relevante a ponto de justificar que a pesquisa seja feita
(se no to relevante, existe, com certeza, outros problemas mais importantes que esto
esperando pesquisa par serem resolvidos)?
c) Trata-se realmente de um problema original?
d) a pesquisa factvel?
e) ainda que seja bom o problema adequado para mim?
f) pode-se chegar a uma concluso valiosa?
g) tenho a necessria competncia para planejar e executar um estudo desse tipo?
h) os dados, que a pesquisa exige, podem ser realmente obtidos?
i) h recursos financeiros disponveis para a realizao da pesquisa?
j) terei tempo de terminar o projeto?
l) serei persistente? (Rudio, 1999, p. 96).
Alguns autores recomendam a separao dos objetivos gerais dos objetivos especficos ou
do objetivo principal dos objetivos secundrios. Para atingir seus objetivos mais gerais ou
o objetivo principal, ser necessrio percorrer um caminho de pesquisa que o levar at
eles. So etapas da pesquisa que fornecero a base para abordar de maneira mais direta e
pertinente o objetivo principal.
Essa separao procedente do ponto de vista analtico. Mas os diferentes momentos da
pesquisa s se justificam na medida em que ajudaro a esclarecer o problema principal. No
preciso fazer essa separao em subcaptulos desde que fique claro quais so os objetivos
gerais e quais so especficos, qual o principal e quais os secundrios.
Exemplifiquemos esses momentos da pesquisa. Se aluno se propuser a estudar a proposta
de contrato coletivo de trabalho, por exemplo, de bom tom, antes de discutir suas diferentes
verses, fazer um breve histrico da legislao trabalhista brasileira. Se, por outro lado,
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Curso de vero 2015

pretende estudar os escritos polticos de Max Weber, inevitavelmente ter que comear por
uma reconstituio do contexto poltico e intelectual da Alemanha do incio do sculo. Sem
esclarecer esses objetivos secundrios ou especficos, dificilmente poder levar a cabo sua
pesquisa de maneira aprofundada.
Justificativa
Chegou a hora de dizer porque a universidade, o orientador ou uma instituio de financiamento
deve apostar na pesquisa proposta. Neste captulo justificada a relevncia do tema para a
rea do conhecimento cientfico qual o trabalho est vinculado. A pergunta chave deste
captulo por que esta pesquisa deve ser realizada?
Vrios autores, entre eles Lakatos e Marconi (1992), colocam o captulo da justificativa
antes dos objetivos. A inverso no faz muito sentido: como justificar o que ainda no foi
apresentado? A ordem Objetivos, primeiro, e Justificativa, depois, parece ser a melhor do
ponto de vista lgico.
nas justificativas que o pesquisador deve apresentar o estado da arte, ou seja o ponto
no qual se encontram as pesquisas cientficas sobre o tema escolhido. O dilogo com os
principais autores ou correntes interpretativas sobre o tema deve ser levado a cabo neste
captulo.
J que aqui que sero feitas o maior nmero de citaes ou referncias bibliogrficas,
vamos repassar brevemente as tcnicas de citao e referncia. Se a citao tiver at duas
linhas, ela pode ser reproduzida em itlico, no corpo do pargrafo.
E no esquecer, a citao deve ser direta e deve vir entre aspas, como todas as citaes e
com indicao da fonte seja em rodap, seja pelo sistema autor/data. (Henriques e Medeiros,
1999, p. 127). Quando a citao tiver trs ou mais linhas ela dever iniciar um novo pargrafo
e estar digitada com um espaamento entre linhas 1,5, um espao antes, um depois e recuo
esquerda. o que ensina Medeiros:
No trabalho cientfico, as citaes com at duas linhas so includas no pargrafo
em que se faz referncia a seu autor. J as transcries de trs linhas ou mais
devem ser destacadas, ocupando pargrafo prprio e observando-se recuo e
aspas no incio e no final da citao. (Medeiros, 1999, p. 104)
Na barra de ferramentas do Word h o boto Aumentar Recuo, muito til nessas situaes,
outra possibilidade criar o estilo Citao, atravs do menu Formatar Estilo, com espaamento
entre linhas 1,5 e recuo esquerdo 2,5cm.
Quando uma citao vier intercalada por outra citao, est ltima vir entre aspas simples ( )
Vale ainda lembrar que supresses no texto citado devem ser assinaladas por reticncias
entre parnteses (...) ; e que destaques no texto transcrito devem ser feitos com itlico,
assinalando ao final, entre parnteses a expresso grifos nossos
At aqui utilizamos a tcnica autor/data, a recomendada para as monografias e publicaes
em diversas instituies de ensino. Outra opo a tcnica referncia de rodap. Neste caso,
a indicao do autor, do ttulo do livro e da pgina vo no rodap. Para isso deve ser utilizado
o menu Inserir Notas do Word e escolha Nota de rodap e AutoNumerao.
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Curso de vero 2015

Metodologia
Neste captulo o pesquisador dever anunciar o tipo de pesquisa (formulador, descritivo ou
exploratrio) que empreender e as ferramentas que mobilizar para tal (Cf. Moraes, 1998, p.
8-10). A pergunta chave que deve ser respondida aqui como ser realizada a pesquisa?
Trata-se de explicitar aqui se se trata de pesquisa emprica, com trabalho de campo ou de
laboratrio, de pesquisa terica ou de pesquisa histrica ou se de um trabalho que combinar,
e at que ponto, as vrias formas de pesquisa. Diretamente relacionados com o tipo de
pesquisa sero os mtodos e tcnicas a serem adotados. (Severino, 1996, p. 130)
O pesquisador dever esboar a trajetria que seguir ao longo de sua atividade de pesquisa.
Para tanto dever destacar: 1) os critrios de seleo e a localizao das fontes de informao;
2) os mtodos e tcnicas utilizados para a coleta de dados; 3) os testes previamente realizados
da tcnica de coleta de dados. Ao contrrio do que geralmente se pensa, dados no so
necessariamente expressos em nmeros e processados estatisticamente. O tipo de dados
coletados durante a pesquisa depende do tipo de estudo realizado. Eles tanto podem ser o
resultado de:
1. pesquisa experimental;
2. pesquisa bibliogrfica;
3. pesquisa documental;
4. entrevista;
5. questionrios e formulrios;
6. observao sistemtica
7. estudo de caso
8. relatrios de estgio (Pdua, 1998, p. 132)
Para estas e outras regras de citao ver Segismundo Spina (1984, p. 55).
Cronograma
No cronograma o pesquisador dever fazer um planejamento das atividades ao longo do
tempo que voc dispe para a pesquisa. Ele uma excelente ferramenta para controlar o
tempo de trabalho e o ritmo de produo. Ao mesmo tempo, servir para o orientador ou a
agncia financiadora acompanhar o andamento da pesquisa. Tambm aqui h uma pergunta
chave: quando as diferentes etapas da pesquisa sero levadas a cabo?
A forma mais fcil de organizar um cronograma sob a forma de uma tabela.
Com algumas variaes tais normas so apresentadas, entre outros, por Severino (1996, p.
90-93) e Medeiros (1999, p. 1789-183). Embora Medeiros aconselhe a reproduo de todos
os dados da obra no rodap, tal medida desnecessria, uma vez que eles se encontram na
bibliografia do Projeto.
Para esquemas de captulo metodolgico ver Barros e Lehfeld (1999, p. 36-37) e Salomon
(1999, p.222).
Para tanto pode ser utilizado o menu Tabela do Word para inseri-la. Depois devem ser
selecionadas as clulas que devem ser marcadas e com o comando Bordas e Sombreamento
do menu Formatar preench-las, conforme o exemplo a seguir:

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Curso de vero 2015

1
2
3
4
5
6
ms ms ms ms ms ms

Reviso bibliogrfica

Aplicao de questionrios

Processamento dos dados

Anlise dos dados

Redao da monografia

REFERNCIAS
BARROS, Aidil de Jesus Paes de e LEHFELD, Neide Aparecida de Souza. Projeto de pesquisa:
propostas metodolgicas. 8.ed. Petrpolis: Vozes, 1999.
ECO, Umberto. Como se faz uma tese. 15.ed. So Paulo: Perspectiva, 1999.
GARCIA, Maurcio. Normas para elaborao de dissertaes e monografias. (Online,26.05.2000,
http://www.uniabc.br/pos_graduacao/normas.html.
HENRIQUES, Antonio e MEDEIROS, Joo Bosco. Monografia no curso de Direito.So Paulo:
Atlas, 1999.
LAKATOS, Eva Maria. MARCONI, Marina de Andrade. Metodologia do trabalho cientfico.
4.ed. So Paulo: Atlas, 1992.
LAVILLE, Christian e DIONNE, Jean. A construo do saber. Manual de metodologia da
pesquisa em cincias humanas. Porto Alegre/Belo Horizonte: Artmed/UFMG, 1999.
MARTINS, Eduardo. Manual de redao e estilo de O Estado de S. Paulo. 3.ed. So Paulo:
O Estado de S. Paulo, 1997.
MEDEIROS, Joo Bosco. Redao cientfica. A prtica de fichamentos, resumos, resenhas.
4.ed. So Paulo: Atlas, 1999.
MILLS, C. Wright. A imaginao sociolgica. 4.ed. Rio de Janeiro: Zahar, 1975.
MORAES, Reginaldo C. Corra de. Atividade de pesquisa e produo de texto. Textos
Didticos IFCH/Unicamp, Campinas, n. 33, 1999.
PDUA, Elisabete Matallo Marchesini. O trabalho monogrfico como iniciao pesquisa
cientfica. In: CARVALHO, Maria Ceclia M. de. Construindo o saber.Metodologia cientfica:
fundamentos e tcnicas. 7.ed. Campinas: Papirus, 1998.
RUDIO, Franz Victor. Introduo ao projeto de pesquisa cientfica. 24.ed. Petrpolis:Vozes,
1999.
SALOMON, Dlcio Vieira. Como fazer uma monografia. 8.ed. So Paulo: Martins Fontes,
1999.
SEVERINO, Antnio Joaquim. Metodologia do trabalho cientfico. 20.ed. So Paulo:Cortez,
1996.
SPINA, Segismundo. Normas para trabalhos de grau. So Paulo: tica, 1984.
Fonte: http://www.zemoleza.com.br/como_fazer_projeto.asp
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ANEXO 2: Anlise de dados com software SPSS verso 20.0

(os comandos podem variar ligeiramente de uma verso para outra)
Abrindo o Programa e carregando o Banco de Dados
a. Abra o programa SPSS
b. Carregue o banco de dados da seguinte forma:
ARQUIVO

ABRIR

DADOS

1. Na caixa Abrir dados localize a unidade de disco de seu computador onde voc gravou o
arquivo SPSS que ser analisado
2. Clique sobre o nome do arquivo duas vezes e seu nome aparecer na caixa Nome do
arquivo: banco_mama_2013
3. Clique em abrir

Abrir a janela: SPSS editor de dados certifique-se de que seus dados foram carregados
(a aparncia semelhante a de uma planilha Excel)
1. Anlise de dados
Realize os seguintes comandos de anlise:
ANALISAR

ESTATISTICAS DESCRITIVAS

FREQUNCIAS

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Curso de vero 2015

1.1 Exemplo de anlise de uma varivel categrica: raa categorizada

Realize os seguintes comandos de anlise:
1. Clique sobre o nome da varivel que ser analisada
2. Clique na seta
3. Clique em OK

Proceda de maneira semelhante para as demais anlises.

1.2 Exemplo de anlise de uma varivel contnua: idade
Realize os seguintes comandos de anlise:
1. Clique em Redefinir
2. Clique sobre o nome da varivel que ser analisada: idade
3. Clique na seta
4. Clique em Estatsticas
20

Curso de vero 2015

5. Escolha as estatsticas que deseja fazer: Mnimo, Mximo, Mdia, Desvio padro e Mediana
6. Clique em Continuar
7. Clique em OK

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Curso de vero 2015

Proceda de maneira semelhante para as demais anlises.

Realize os seguintes comandos de anlise:
1. Faa a frequncia de todas as demais variveis categricas.
2. Transcreva os resultados encontrados para uma tabela em word conforme os modelos
usados pelos diversos autores disponibilizados para consulta.
Sugesto: crie uma tabela para as variveis sociodemogrficas e outra para as variveis
clnicas.
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ANEXO 3: REVISTA Epidemiologia e Servios de Sade

Estrutura do artigo cientifico

ComuniCAo
CientfiCA

doi: 10.5123/S1679-49742012000200018

Structure of the scientific paper

Mauricio Gomes Pereira
Professor Titular, Universidade de Braslia, Braslia-DF, Brasil

Os artigos cientficos constituem a unidade de informao do peridico cientfico. Por meio deles, as informaes do autor so transformadas em conhecimento cientfico, que de domnio pblico. Se o artigo divulgado
adequadamente, ele poder ser lido, citado e utilizado por profissionais de sade nas suas atividades dirias. Por
divulgao adequada entenda-se aquela efetuada em peridico cientfico que adota o procedimento de reviso
por pares.1 O Conselho Editorial da revista Epidemiologia e Servios de Sade adota a reviso por pares na avaliao dos artigos que lhe so submetidos para publicao sendo, portanto, um veculo apropriado para publicar
trabalhos cientficos. Dessa maneira, tem-se alta probabilidade de alcanar a audincia acertada, se o tema for
adequado para ser publicado na Revista.
H vrios tipos de artigo cientfico.1 O autor se limitar a abordar os artigos originais (scientific article ou
paper em ingls). So os que contm o relato, em primeira mo, dos resultados de uma pesquisa.

O texto de um artigo cientfico original geralmente dividido em quatro sees com os seguintes ttulos:
Introduo
Mtodos (Mtodo, Material e mtodos ou Metodologia)
Resultados
Discusso

Semelhante estruturao, dita IMRD, predomina na rea biomdica e em muitos campos do conhecimento.
Em um estudo no qual foram analisados quatro dos principais peridicos de clnica mdica publicados no idioma
ingls, Sollaci e Pereira relatam que a estrutura IMRD comeou a ser usada na dcada de 1940.2 Na dcada de
1970, atingiu 80,0% e, na de 1980, foi o nico padro adotado nos documentos originais.
Cada uma das subdivises do artigo cientfico tem suas especificidades, como detalhado a seguir.1
Inicialmente, apresentam-se as informaes que justifiquem a pesquisa, acompanhadas do objetivo do trabalho.
Esse material est confinado seo introdutria do artigo.
Indica-se, na seo sobre mtodo, como o estudo foi delineado e a amostra selecionada, qual a forma de coleta
de dados, qual anlise foi planejada para alcanar o objetivo da pesquisa e quais aspectos ticos foram envolvidos.
So mostrados, em seguida, na seo de resultados, os achados da investigao acompanhados, se aplicvel,
da respectiva anlise estatstica.
O relato termina na seo de discusso, com a interpretao e os comentrios sobre o significado dos resultados, a comparao com outros achados de pesquisas sobre o assunto e as concluses a que chegaram os autores,
em consonncia com o objetivo da pesquisa ou a hiptese formulada. Os fatos e argumentos so concatenados
para orientar o leitor e faz-lo compreender a concluso do autor e poder analisar, ele prprio, a validade e a
aplicabilidade da investigao.
O conhecimento da estrutura apresentada o ingrediente bsico para entender a lgica do artigo cientfico. A
tabela a seguir contm algumas perguntas que podem ajudar o leitor a compreender o contedo das quatro sees
e o relacionamento entre elas. Temas adicionais sobre comunicao cientfica sero abordados em novos textos,
Epidemiol. Serv. Sade, Braslia, 21(2):351-352, abr-jun 2012

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Curso de vero 2015

a serem publicados nos prximos nmeros desta Revista, preparados com base no livro Artigos Cientficos.1 O
domnio desses temas auxiliar o leitor a melhor apreciar a arte e a tcnica da comunicao cientfica.
Estrutura do artigo cientfico e algumas perguntas-chave que auxiliam a redao do contedo de cada seo
Sees

Perguntas-chave

Introduo

De que trata o estudo? Por que a investigao foi feita?

O que se sabia sobre o assunto no incio da investigao?
Ou melhor, o que NO se sabia sobre o assunto e motivou a investigao?

Mtodo

Como o estudo foi realizado?

Resultados

O que foi encontrado? Quais so os fatos revelados pela investigao?

O que significam os achados apresentados?
Os achados esto de acordo com os resultados de outros autores ou so divergentes?
O que este estudo acrescenta ao que j se sabe sobre o assunto?

Discusso
Fonte: Adaptado de Pereira 2011.1

Referncias
1. Pereira MG. Artigos cientficos: como redigir, publicar e avaliar. Rio de Janeiro: Editora Guanabara-Koogan, 2011.
2. Sollaci L, Pereira MG. The introduction, methods, results and discussion (IMRAD) structure: a fifty-year survey. Journal
of the Medical Library Association. 2004; 92(3):364-367.

352

24

Epidemiol. Serv. Sade, Braslia, 21(2):351-352, abr-jun 2012

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ANEXO 4: INTRUO PARA AUTORES DA REVISTA BRASILEIRA DE

CANCEROLOGIA
Informaes gerais
A Revista Brasileira de Cancerologia (RBC) uma publicao trimestral que tem por finalidade divulgar trabalhos
relacionados a todas as reas da Cancerologia. So aceitos para publicao textos em portugus, ingls e espanhol.
A RBC adota os Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals: Writing and Editing
for Biomedical Publication do International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) (http://www.icmje.
org). O original, incluindo tabelas, ilustraes e referncias, deve seguir esses requisitos.
Os manuscritos devem ser inditos e destinar-se exclusivamente RBC, no sendo permitida sua apresentao
simultnea a outro peridico. Os conceitos e opinies expressos nos artigos, bem como a exatido e a procedncia
das citaes, so de exclusiva responsabilidade do(s) autor(es). Manuscritos que se referem a partes de uma mesma
pesquisa tm a submisso desencorajada por essa Revista.
Os manuscritos publicados passaro a ser propriedade da RBC, sendo vedada tanto sua reproduo, mesmo que
parcial, em outros peridicos, como sua traduo para publicao em outros idiomas, sem prvia autorizao desta.
Os manuscritos aceitos para publicao podero ser modificados para se adequar ao estilo editorial-grfico da
Revista, sem que, entretanto, nada de seu contedo tcnico-cientfico seja alterado.
No caso de o manuscrito incluir tabelas e ilustraes previamente publicadas por outros autores e em outros
veculos, dever do autor fornecer comprovante de autorizao de reproduo, assinado pelos detentores dos
direitos autorais dos mesmos.
Os leitores de peridicos biomdicos merecem ter a confiana de que o que esto lendo original, a menos
que exista uma declarao clara de que o artigo est sendo republicado por escolha do autor e do editor. As bases
para essa posio so as leis internacionais de direito autoral, a conduta tica e o uso de recursos, obedecendo a
uma lgica de custo efetividade.
Quando parte do material do manuscrito j tiver sido apresentada em uma comunicao preliminar, em
simpsio, congresso etc., esse fato deve ser citado como nota de rodap na pgina de ttulo, e uma cpia do texto
da apresentao deve acompanhar a submisso do manuscrito.
Na submisso de manuscritos ou resumos de pesquisa clnica, ensaios clnicos, pesquisa bsica, pesquisa aplicada,
pesquisa de traduo; estudos laboratoriais, estudos epidemiolgicos (prospectivos ou retrospectivos); utilizao
de dados de pronturios, pesquisa em banco de dados; relatos de casos; entrevistas, questionrios, inquritos
populacionais; obrigatria a incluso de documento, com o nmero de protocolo, de que todos os procedimentos
propostos tenham sido avaliados e aprovados pelo Comit de tica em Pesquisa (CEP) da Instituio a que se
vinculam os autores ou, na falta deste, por um outro CEP indicado pela Comisso Nacional de tica em Pesquisa
do Ministrio da Sade.
Os pacientes tm direito privacidade, fato que no deve ser infringido sem um consentimento informado.
As informaes de identificao pessoal no devem ser publicadas em descries escritas, fotografias, genealogias e
relatos de caso, a menos que a informao seja essencial para propsitos cientficos e que o paciente (ou seus pais
ou tutores) outorgue um consentimento informado por escrito, autorizando a publicao.
Devem omitir-se detalhes de identificao se no forem essenciais, mas os dados do paciente nunca devero ser
alterados ou falsificados numa tentativa de conseguir o anonimato. O anonimato completo difcil de conseguir,
devendo-se obter o consentimento informado se houver alguma dvida. Por exemplo, mascarar a regio ocular
em fotografias de pacientes uma proteo inadequada para o anonimato.
A RBC, ao reconhecer a importncia do registro e divulgao internacional, em acesso aberto, de informaes
sobre estudos clnicos, apoia as polticas para registro de ensaios clnicos da Organizao Mundial da Sade (OMS)
e do ICMJE. Desta forma, sero aceitos para publicao apenas os artigos de pesquisas clnicas que tenham recebido
um nmero de identificao em um dos Registros de Ensaios Clnicos validados pelos critrios estabelecidos pela
OMS e ICMJE, cujos endereos esto disponveis no stio do ICMJE (http://www.icmje.org).
Conflitos de interesses devem ser reconhecidos e mencionados pelos autores. Entre essas situaes, menciona-se
a participao societria nas empresas produtoras das drogas ou equipamentos citados ou utilizados no trabalho,
assim como em concorrentes da mesma. So tambm consideradas fontes de conflito os auxlios recebidos, as
relaes de subordinao no trabalho, consultorias etc.
A submisso do manuscrito RBC deve ser por e-mail para rbc@inca.gov.br, com o texto integral, tabelas,
grficos, figuras, imagens, CEP e Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (se aplicvel) e de acordo
com as normas da Revista. A Carta de Submisso individual e assinada por cada um dos autores (modelo
disponvel em http://www.inca.gov.br/rbc) deve tambm ser enviada nesta oportunidade.
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Curso de vero 2015

Processo de avaliao dos manuscritos

A publicao dos trabalhos depender da observncia das normas da RBC e da deciso do seu Conselho Editorial.
O processo de avaliao inicia-se com o editor cientfico que avalia se o artigo recebido traz contribuies para a
rea da Cancerologia e se de interesse para os leitores. Avalia tambm se o original est elaborado de acordo com
as instrues recomendadas pela Revista. Os manuscritos considerados pertinentes, mas, em desacordo com essas
instrues, sero devolvidos aos autores para as adaptaes necessrias, antes da avaliao pelo Conselho Editorial.
O manuscrito aceito encaminhado para anlise e emisso de parecer dos membros do Conselho Editorial e/
ou Conselho Ad Hoc, ambos formados por profissionais de notrio saber nas diversas reas da Oncologia. Nesse
processo, o sigilo e o anonimato sero adotados para autor(es) e pareceristas. A anlise dos pareceristas realizada
com base no formulrio Parecer do Conselho Editorial disponvel nas instrues para publicao na RBC em
http://www.inca.gov.br/rbc.
Aps emisso do parecer, o manuscrito enviado ao editor cientfico que toma cincia dos pareceres emitidos
e os analisa em relao ao cumprimento das normas de publicao da Revista e decide sobre a aceitao ou no do
artigo, assim como das alteraes solicitadas, processo sobre o qual tem plena autoridade de deciso. O parecer
ento enviado para os autores por e-mail.
Aps avaliao os manuscritos, podero ser classificados em: manuscrito aprovado sem restries, que ser
encaminhado ao revisor tcnico para reviso e posterior publicao; manuscrito aprovado com restrio, que ser
encaminhado ao(s) autor(es) com as solicitaes de ajuste por e-mail. O manuscrito revisado deve ser reapresentado
pelo(s) autor(es) RBC, por e-mail, acompanhado de carta informando as alteraes realizadas ou, quando no
realizadas, apresentando as devidas justificativas. No havendo retorno do trabalho em quarenta e cinco (45) dias,
ser considerado que os autores no tm mais interesse na publicao; manuscrito no aprovado, nesse caso o autor
receber notificao de recusa por e-mail.
O manuscrito aprovado ser publicado de acordo com o fluxo e o cronograma editorial da Revista.
Categoria dos manuscritos
So considerados para publicao os seguintes tipos de manuscritos:
Artigos Originais so artigos nos quais so informados os resultados obtidos em pesquisas de natureza emprica
ou experimental original cujos resultados possam ser replicados e/ou generalizados. Tambm so considerados
originais as pesquisas de metodologia qualitativa, de contedo histrico e as formulaes discursivas de efeito
teorizante. Como estrutura devem apresentar: introduo, mtodo, resultados, discusso e concluso. O mximo
de laudas 20, incluindo figuras, tabelas, grfico, etc. que no devem ultrapassar 5.
Reviso da Literatura trata-se de reviso sistematizada e atualizada da literatura sobre um tema especfico e que
deve dar ao leitor uma cobertura geral de um assunto. No sero aceitas revises narrativas. Devem ser descritos
os tipos de reviso (integrativa, sistemtica, metanlise), os mtodos e procedimentos adotados para a realizao
do trabalho. A interpretao e concluso dos autores devem estar presentes. Como estrutura devem apresentar:
introduo, mtodo, resultados, discusso e concluso. O mximo de laudas 20, incluindo figuras, tabelas,
grfico, etc. que no devem ultrapassar 5.
Relato de Casos/ Srie de Casos - a descrio detalhada e anlise crtica de um ou mais casos, tpicos ou atpicos,
baseado em reviso bibliogrfica ampla e atual sobre o tema. O autor deve apresentar um problema em seus
mltiplos aspectos, sua relevncia. O mximo de laudas 15, incluindo figuras, tabelas, grfico etc. que no
devem ultrapassar 4.
Artigo de Opinio trata-se de opinio qualificada sobre tema especfico em oncologia. No necessita de resumo.
O mximo de laudas 10, incluindo tabelas, grfico, etc. que no devem ultrapassar 2.
Resenha resenha crtica de livro relacionado ao campo temtico da Cancerologia, publicado no ltimo ano.
O mximo de 4 laudas .
Resumos de dissertaes, teses, de trabalhos que meream destaque ou apresentados em eventos de oncologia nos
ltimos 12 meses, contados da data de envio do resumo - trata-se da informao sob a forma sucinta de trabalho
realizado. Portanto, deve conter a natureza e os propsitos da pesquisa e um comentrio sobre a metodologia,
resultados e concluses mais importantes. Seu objetivo a transmisso aos pesquisadores de maneira rpida e
fcil da natureza do trabalho, suas caractersticas bsicas de realizao e alcance cientfico afirmado. Devem conter
no mnimo 150 at 250 palavras e seguir as normas da Revista quanto estruturao, forma e ao contedo,
inclusive no que se refere aos descritores.
Cartas ao Editor podem estar relacionadas matria editorial ou no, mas devem conter informaes relevantes
ao leitor. No caso de crticas a trabalhos publicados em fascculo anterior da Revista, a carta enviada aos autores
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Curso de vero 2015

para que sua resposta possa ser publicada simultaneamente. As cartas podem ser resumidas pela editoria, mas
sero mantidos os pontos principais. O mximo de 4 laudas.

Preparo do manuscrito
O original deve ser escrito na terceira pessoa do singular com o verbo na voz ativa (ABNT.NBR-6028, 2003, p.2).
O processador de textos utilizado deve ser o Microsoft Word 6.0 ou 7.0, fonte Times New Roman tamanho
12, margens de 30mm em ambos os lados, espao duplo em todas as sees, tamanho do papel A4 (210 x 297mm)
e pginas numeradas.
Para permitir maior clareza na exposio do assunto e localizao direta de cada item, divide-se o texto em
partes lgicas, ordenadas por assuntos considerados afins.
Exemplo:
INTRODUO (SEO PRIMRIA)
MATERIAL E MTODO (SEO PRIMRIA)
Coleta de dados (Seo secundria)
Variveis (Seo terciria)
Na apresentao dos ttulos das sees, deve-se dar destaque gradativo ao tipo e corpo das letras, observando
que todas as sees primrias devem estar escritas da mesma maneira, assim como todas as secundrias e assim
por diante.
O texto de cada seo de um documento pode incluir uma srie de alneas, que devem ser caracterizadas pelas
letras minsculas do alfabeto (a, b, c,...) seguidas de parnteses e que precedam imediatamente primeira
palavra de seu texto.
Exemplo:
a) escrever um artigo cientfico.
b) ilustrar o texto.
Principais orientaes sobre cada seo
1. Pgina de ttulo ou folha de rosto
Deve conter: a) ttulo do artigo, alternando letras maisculas e minsculas, em portugus, ingls e espanhol;
b) ttulo abreviado com at 40 caracteres; c) nome(s) por extenso do(s) autor(es). A designao de autoria deve ser
baseada nas deliberaes do ICMJE, que considera autor aquele que contribui substancialmente na concepo ou no
planejamento do estudo; na obteno, na anlise e/ou interpretao dos dados; assim como na redao e/ou reviso
crtica e aprovao final da verso publicada. Em estudos institucionais (de autoria coletiva) e estudos multicntricos,
os responsveis devem ter seus nomes especificados e todos considerados autores devem cumprir os critrios acima
mencionados; d) indicar para cada autor, em nota de rodap, a categoria profissional, o mais alto grau acadmico,
o(s) nome(s) do(s) departamento(s) e instituio(es) a que o trabalho dever ser atribudo, endereo eletrnico,
cidade, estado e pas; e) nome, endereo e telefone do autor responsvel pela correspondncia sobre o manuscrito;
f) descrio da contribuio individual de cada autor no manuscrito (ex: .... trabalhou na concepo e na redao
final e ...... na pesquisa e na metodologia); g) agradecimentos: os demais colaboradores, que no se enquadram nos
critrios de autoria acima descritos, devem ter seus nomes referidos nesse item especificando o tipo de colaborao.
Os autores so responsveis pela obteno de autorizao escrita das pessoas nomeadas nos agradecimentos, j que se
pode inferir que as mesmas concordam com o teor do trabalho; h) declarao de conflito de interesses (escrever nada
a declarar ou revelar quaisquer conflitos); i) para trabalhos subvencionados, identificar o patrocinador e nmero de
processo (se houver).
2. Resumo e descritores (palavras-chave)
Todos os artigos devero conter resumos estruturados em portugus, ingls e espanhol, acompanhados dos
descritores nos respectivos idiomas. A terminologia para os descritores deve ser denominada no artigo como a
seguir: palavras-chave, key words e palabras clave. Cada resumo dever conter no mnimo 150 palavras e no mximo
250, objetivo(s), metodologia, resultados, concluso e vir acompanhado de no mnimo trs e no mximo seis
descritores. Os descritores so palavras fundamentais que auxiliam na indexao dos artigos em bases de dados
nacionais e internacionais. Para determinar os descritores, deve-se consultar a lista de Descritores em Cincias da
Sade (DECS-LILACS- http://decs.bvs.br) elaborada pela Bireme.
No resumo, no devem ser feitas citaes de referncias, nem se deve incluir abreviaturas, bem como quadros,
tabelas ou figuras.
No caso de resumos de trabalhos apresentados em eventos de oncologia ou que meream destaque e que foram
aceitos para publicao na RBC, caber aos autores proceder adequao s normas da Revista antes de encaminhlos, sendo de sua inteira responsabilidade a preciso e correo da linguagem.
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Curso de vero 2015

3. Introduo
Deve ser objetiva com definio clara do problema estudado destacando sua importncia e as lacunas do
conhecimento; a reviso de literatura deve ser estritamente pertinente ao assunto tratado no estudo, de modo a
proporcionar os antecedentes para a compreenso do conhecimento atual sobre o tema e evidenciar a importncia
do novo estudo. Deve conter o(s) objetivo(s) do estudo.
4. Mtodos
Deve indicar de forma objetiva o tipo de estudo (prospectivo, retrospectivo; ensaio clnico ou experimental;
se a distribuio dos casos foi aleatria ou no; qualitativo etc), os mtodos empregados, a populao estudada
(descrever claramente a seleo dos indivduos dos estudos observacionais ou experimentais - pacientes ou animais
de laboratrio, incluindo controles, bem como dos estudos qualitativos), a fonte de dados e os critrios de seleo
ou grupo experimental, inclusive dos controles. Identificar os equipamentos e reagentes empregados. Descrever
tambm os mtodos estatsticos empregados e as comparaes para as quais cada teste foi empregado.
Os relatos de ensaios clnicos devem apresentar informao de todos os elementos principais do estudo, incluindo
o protocolo (populao estudada, intervenes ou exposies, resultados - e a lgica da anlise estatstica), atributos
das intervenes (mtodos de aleatorizao, indicao dos grupos de tratamento) e os mtodos de mascaramento.
Os autores que enviarem artigos de reviso devero apresentar os procedimentos adotados para localizar,
selecionar, obter, classificar e sintetizar as informaes alm de definir os critrios de incluso e excluso dos estudos
selecionados para a reviso.
Quando forem relatados experimentos com seres humanos, indicar se os procedimentos seguidos estiveram
de acordo com os padres ticos do Comit de Pesquisa em Seres Humanos Institucional, com a Declarao de
Helsinky (ltima verso de 2000) e com a resoluo 196/96 (Res. CNS 196/96). No usar os nomes dos pacientes,
iniciais ou nmeros de registro, especialmente no material ilustrativo. No caso de experimentos envolvendo animais,
indicar se foram seguidas as normas das Instituies, dos Conselhos Nacionais de Pesquisa ou de alguma lei nacional
sobre uso e cuidado com animais de laboratrio.
Dessa seo, tambm faz parte a meno do documento, indicando o nmero de protocolo, do CEP da
Instituio a que se vinculam os autores e que aprovou o estudo realizado.
5. Resultados
Apresentar os resultados relevantes para o objetivo do trabalho e que sero discutidos. Devem ser descritos
somente os resultados encontrados, sem incluir interpretaes ou comparaes. Apresentar os resultados, tabelas
e ilustraes em sequncia lgica, atentando para que o texto complemente e no repita o que est descrito em
tabelas e ilustraes. Restringir tabelas e ilustraes quelas necessrias para explicar o argumento do artigo e para
sustent-lo. Usar grficos como uma alternativa s tabelas com muitas entradas; no duplicar os dados em grficos e
tabelas. Evitar uso de termos tcnicos de estatstica, tais como: random (que implica uma fonte de aleatorizao),
normal, significante, correlao e amostra de forma no tcnica. Definir os termos estatsticos, abreviaes
e smbolos. Nos relatos de casos, as sees mtodos e resultados so substitudas pela descrio do caso.
6. Discusso
Deve conter a interpretao dos autores, comparar os resultados com a literatura, relacionar as observaes a
outros estudos relevantes, apontar as limitaes do estudo, enfatizar os aspectos novos e importantes do estudo e
as concluses derivadas, incluindo sugestes para pesquisas futuras.
A discusso pode ser redigida junto com os resultados se for de preferncia do autor.
No repetir em detalhe dados ou outros materiais colocados nas sees de introduo ou resultados.
7. Concluso
Deve ser fundamentada nos resultados encontrados e vinculada aos objetivos do estudo. Afirmaes no
qualificadas e concluses no apoiadas por completo pelos dados no devem constar dessa seo. Evitar fazer aluso
a estudos que no tenham sido concludos. Estabelecer novas hipteses, quando estiverem justificadas claramente
como tais. Recomendaes, quando apropriadas, podero ser includas.
8. Referncias
Devem ser numeradas no texto por nmeros arbicos, em sobrescrito (ex: A extenso da sobrevivncia, entre
outros1), de forma consecutiva, de acordo com a ordem que so mencionadas pela primeira vez no texto e sem
meno aos autores. A mesma regra aplica-se s tabelas e legendas. No caso de citao sequencial, separar os nmeros
por trao (ex: 1-2); quando intercalados, use vrgula (ex.: 1,3,7).
As referncias no podem ultrapassar o nmero de 25, salvo as revises de literatura, nas quais sero aceitas at 35.
28

Curso de vero 2015

No devem ser includas referncias no resumo. Deve-se constar apenas referncias relevantes e que realmente
foram utilizadas no estudo.
As referncias devem ser verificadas nos documentos originais. Quando se tratar de citao de uma referncia
citada por outro autor dever ser utilizado o termo apud.
A exatido das referncias de responsabilidade dos autores.
As orientaes abaixo objetivam trazer para os autores exemplos de referncias apresentadas em seus trabalhos
informando sobre a padronizao das mesmas. Esto baseadas nas Normas para Manuscritos Submetidos a Revistas
Biomdicas: escrever e editar para Publicaes Biomdicas, estilo Vancouver, formuladas pelo ICMJE. Sero
apresentadas as ocorrncias mais comuns de referncias por tipos de material referenciado. Algumas observaes
listadas abaixo so fruto de ocorrncias em artigos de peridicos submetidos publicao.
Para a padronizao dos ttulos dos peridicos nas referncias utilizado como guia o LocatorPlus1, fonte de
consulta da National Library of Medicine, que disponibiliza, na opo Journal Title, o ttulo e/ou a abreviatura
utilizada. Em algumas fontes, o ttulo j vem padronizado (PubMed, Lilacs e Medline). Caso no seja
utilizada a forma padro d preferncia, inform-lo por extenso evitando utilizar uma abreviatura no padronizada
que dificulte sua identificao.
Para a indicao de autoria, incluem-se os nomes na ordem em que aparecem na publicao at seis autores,
iniciando-se pelo sobrenome seguido de todas as iniciais dos pr-nomes separando cada autor por vrgula (1).
No caso da publicao apresentar mais de seis autores, so citados os seis primeiros; utiliza-se vrgula seguida da
expresso et al. (2). Quando o sobrenome do autor incluir grau de parentesco Filho, Sobrinho, Jnior, Neto - este
deve ser subsequente ao ltimo sobrenome: Joo dos Santos de Almeida Filho - Almeida Filho JS, Jos Rodrigues
Junior - Rodrigues Junior J.
Para padronizao de ttulos de trabalhos, utilizam-se letras minsculas em todo o perodo, com exceo da
primeira palavra que comea, sempre, com letra maiscula. Fogem regra nomes prprios: nomes de pessoas,
nomes de cincias ou disciplinas, instituies de ensino, pases, cidades ou afins, e nomes de estabelecimentos
pblicos ou particulares.
EXEMPLOS DE REFERNCIAS EM PERIDICOS
1. Artigo com at seis autores
Kakuda JT, Stuntz M, Trivedi V, Klein SR, Vargas HI. Objective assessment of axillary morbidity in breast
cancer treatment. Am Surg 1999; 65: 995-8. obs.: usar 995-8, no usar 995-998.
2. Artigo com mais de seis autores
Zheng H, Takahashi H, Murai Y, Cui Z, Nomoto K, Miwa S, et al. Pathobiological characteristics of intestinal
and diffuse-type gastric carcinoma in Japan: an immunostaining study on the tissue microarray. J Clin Pathol
2007 Mar;60(3):273-7.
3. Artigo cujo autor uma Instituio
Utilizar o nome da Instituio indicando entre parnteses o pas quando for uma Instituio pblica (a) no caso
de uma Instituio particular utiliza-se somente o nome da Instituio. Observar a hierarquia (b) qual a Instituio
est subordinada para sua perfeita identificao (no utilizar direto: Secretaria de Ateno Sade. De onde?).
4. Artigo com autoria de mltiplas organizaes
Incluem-se todas. (a) Instituto Nacional de Cncer (Brasil). Encontro Internacional sobre Rastreamento de
Cncer de Mama. Revista brasileira de cancerologia 2009 abr.-jun.; 2 (55): 99-113. (b) Brasil. Ministrio da Sade.
Secretaria de Ateno Sade. Departamento de Ateno Bsica. Coordenao Nacional de Sade Bucal. Projeto
SB Brasil 2003: condies de sade bucal da populao brasileira 2002-2003: resultados principais. Braslia, 2004b.
[acesso em abr 2004]. Disponvel em: <http://www.cfo.org.br/download/pdf/relatorio_sb_brasil_2003.pdf>
5. Autor com indicao de parentesco em seu nome
Mattes RD, Curram Jr WJ, Alavi J, Powlis W, Whittington R. Clinical implications of learned food aversions
in patients with cancer treated with chemotherapy or radiation therapy. Cancer 1992; 70 (1): 192-200.
6. Artigo sem indicao de autoria
Pelvic floor exercise can reduce stress incontinence. Health News 2005 Apr;11(4):11.
7. Artigo com indicao de seu tipo (reviso, abstract, editorial)
Facchini Luiz Augusto. ABRASCO 30 anos: cincia, educao e prtica com compromisso social. [Editorial]
Cad Sade Pblica [peridico na Internet]. 2010 Jan [citado 2010 Ago 23] ; 26(1): 4-4. Disponvel em:
<http://www.scielosp.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0102-311X2010000100001&lng=pt. doi:
10.1590/S0102-311X2010000100001>.
1

Disponvel em: (http://locatorplus.gov/cgi-bin/Pwebrecon.cgi?DB=local&PAGE=First).

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8. Artigo publicado num suplemento de peridico

Nascimento AF, Galvanese ATC. Avaliao da estrutura dos centros de ateno psicossocial do municpio de
So Paulo, SP. Rev Saude Publica 2009; 43 suppl.1: 8-15.
9. Artigo publicado na parte de um nmero
Fukuzawa M, Oguchi S, Saida T. Kaposis varicelliform eruption of an elderly patient with multiple myeloma.
J Am Acad Dermatol. 2000 May;42(5 Pt 2):921-2.
10. Artigo publicado sem indicao de volume ou nmero do fascculo
Schwartz-Cassell T. Feeding assistants: based on logic or way off base? Contemp Longterm Care. 2005 Jan:26-8.
11. Artigo publicado com paginao indicada em algarismos romanos
Nagpal S. An orphan meets family members in skin. J Invest Dermatol. 2003;120(2):viii-x.
12. Artigo contendo retratao ou errata publicadas, a referncia deve conter a indicao da publicao das
mesmas
Mokdad AH, Marks JS, Stroup DF, Gerberding JL. Correction: actual causes of death in the United States,
2000. JAMA. 2005 Jan 19;293(3):293-4. Erratum for: JAMA. 2004 Mar 10;291(10):1238-45.
13. Artigo com publicao eletrnica anterior verso impressa
Bicalho PG, Hallal PC, Gazzinelli A, Knuth AG, Velsquez-Melndez G. Atividade fsica e fatores associados em
adultos de rea rural em Minas Gerais, Brasil. Rev Saude Publica [acesso 2010 Ago 23]. Disponvel em:<http://
www.scielosp.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-89102010005000023&lng=pt> Publicado 2010.
Epub 30-Jul-2010. doi: 10.1590/S0034-89102010005000023.
14. Artigo provido de DOI
Caldeira AP, Fagundes GC, Aguiar GN de. Interveno educacional em equipes do Programa de Sade da
Famlia para promoo da amamentao. Rev Sade Pblica 2008;42(6):1027-1233. doi: 10.1590/S003489102008005000057.
15. Artigo no prelo
Barroso T, Mendes A, Barbosa A. Analysis of the alcohol consumption phenomenon among adolescents: study
carried out with adolescents in intermediate public education. Rev Latino-am Enfermagem. In press 2009.
EXEMPLOS DE REFERNCIAS EM LIVROS E OUTRAS MONOGRAFIAS
16. Livro
Hoppenfeld S. Propedutica ortopdica: coluna e extremidades. Rio de Janeiro: Atheneu; 1993. 294 p.
17. Livro com indicao de editor, organizador, coordenador
Bader MK, Littlejohns LR, editors. AANN core curriculum for neuroscience nursing. 4th. ed. St. Louis (MO):
Saunders; c2004. 1038 p.
18. Livro editado por uma Instituio
World Cancer Research Fund (USA). Food, nutrition, physical activity and prevention of cancer: A global
perspective. Washington (DC): American Institute for Cancer Research; 2007.
19. Quando o autor do captulo o autor do livro, referncia de captulo de livro
Ferreira SA. Nervos proximais do membro superior. In: ____. Leses nervosas perifricas diagnstico e
tratamento. So Paulo: Santos; 2001. p. 35-48.
20. Livro sem indicao de autoria
HIV/AIDs resources: a nationwide directory. 10th ed. Longmont (CO): Guides for Living; c2004. 792 p.
21. Anais de conferncias
Harnden P, Joffe JK, Jones WG, editors. Germ cell tumours V. Proceedings of the 5th Germ Cell Tumour
Conference; 2001 Sep 13-15; Leeds, UK. New York: Springer; 2002.
22. Trabalho apresentado em conferncias
Christensen S, Oppacher F. An analysis of Kozas computational effort statistic for genetic programming.
In: Foster JA, Lutton E, Miller J, Ryan C, Tettamanzi AG, editors. Genetic programming. EuroGP 2002:
Proceedings of the 5th European Conference on Genetic Programming; 2002 Apr 3-5; Kinsdale, Ireland.
Berlin: Springer; 2002. p. 182-91.
23. Legislao
Dispe sobre a Regulamentao do Exerccio da Enfermagem. Lei No. 7.498, 25 de junho de 1986. Dirio
Oficial da Unio. Seo I, fls. 9.273-9.275 (Jun 26, 1986). 1986.
30

Curso de vero 2015

24. Teses e dissertaes

Verde SMML. Impacto do tratamento quimioterpico no estado nutricional e no comportamento alimentar
de pacientes com neoplasia mamria e suas consequncias na qualidade de vida [dissertao]. So Paulo:
Universidade de So Paulo; 2007.
9. Tabelas
As tabelas devero constar em folhas separadas. No enviar as tabelas em forma de imagem, de forma a permitir
sua edio. Numerar as tabelas em ordem consecutiva de acordo com a primeira citao no texto e dar um ttulo
curto a cada uma. Definir para cada coluna um cabealho abreviado ou curto. Colocar as explicaes em rodaps,
no no cabealho. Explicar, em notas de rodap, todas as abreviaes no padronizadas usadas em cada tabela. Para
notas de rodap, utilizar numerao romana.
Identificar medidas estatsticas de variaes, tais como: desvio-padro e erro-padro.
No usar linhas internas, horizontais ou verticais.
Constatar que cada tabela esteja citada no texto por sua numerao e no por citao como: tabela a seguir,
tabela abaixo.
Se forem usados dados de outra fonte, publicada ou no, obter autorizao e agradecer por extenso.
O uso de tabelas grandes ou em excesso, em relao ao texto, pode produzir dificuldade na forma de apresentao
das pginas.
10. Ilustraes
Enviar o nmero requerido de ilustraes ou figuras. No so aceitveis desenhos mo livre ou legendas
datilografadas. As fotos devem ser digitalizadas, em branco e preto, usualmente de 12 x 17cm, no maiores do
que 20 x 25 cm, filmes de raios X ou outros materiais. As letras, os nmeros e smbolos devem ser claros e de
tamanho suficiente, de tal forma que, quando reduzidas para a publicao, ainda sejam legveis. Colocar os ttulos
e explicaes abaixo das legendas e no nas prprias ilustraes.
Se forem usadas fotografias de pessoas, os sujeitos no devem ser identificveis ou suas fotografias devem estar
acompanhadas por consentimento escrito para publicao.
As figuras devem ser numeradas de acordo com a ordem em que foram citadas no texto. Se uma figura j foi
publicada, agradecer fonte original e enviar a autorizao escrita do detentor dos direitos autorais para reproduzir
o material. A autorizao requerida, seja do autor ou da companhia editora, com exceo de documentos de
domnio pblico.
A RBC uma publicao em preto e branco e por isso todas as ilustraes sero reproduzidas em preto e branco.
As ilustraes devem ser fornecidas da seguinte forma:
Arquivo digital em formato .TIFF, .JPG, .EPS, com resoluo mnima de:
300 dpi para fotografias comuns
600 dpi para fotografias que contenham linhas finas, setas, legendas etc.
1.200 dpi para desenhos e grficos
11. Nomenclatura
Devem ser observadas rigidamente as regras de nomenclatura biomdica, assim como abreviaturas e convenes
adotadas em disciplinas especializadas.
Os originais em lngua portuguesa devero estar em conformidade com o Acordo Ortogrfico datado de 1
de Janeiro de 2009.

Resumo dos requisitos tcnicos para a apresentao de manuscritos

Antes de enviar o manuscrito por e-mail, para rbc@inca.gov.br, confira se as Instrues para Autores disponvel
em www.inca.gov.br/rbc foram seguidas e verifique o atendimento dos itens listados a seguir:
Submeter o arquivo integral do manuscrito em Microsoft Word 6.0 ou 7.0.
Usar espao duplo em todas as partes do documento.
Comear cada seo ou componente em uma nova pgina.
Revisar a sequncia: pgina-ttulo/folha de rosto ttulo em portugus, ingls e espanhol; ttulo abreviado;
autoria; resumo e palavras-chave, abstract e key words, resumen e palabras clave; agradecimentos; declarao de
conflito de interesse; declarao de subveno; texto; referncias; tabelas, quadros, figuras com legendas (cada
uma em pginas separadas).
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Curso de vero 2015

De trs a seis palavras-chave e respectivas key words e palabras clave.

Referncias: numeradas, em sobrescrito, na ordem de aparecimento no texto, corretamente digitadas, e no
ultrapassando o nmero de 25. Verificar se todos os trabalhos citados esto na lista de Referncias e se todos os
listados esto citados no texto.
Apresentar ilustraes, fotos ou desenhos separados, sem montar (20 x 25 cm mximo).
Incluir carta de submisso disponvel nas Instrues para Autores. Caso o manuscrito tenha mais que um
autor, cada um deles dever preencher e assinar a carta e o autor responsvel pela submisso deve enviar a mesma
digitalizada em formato .JPG junto com o arquivo do manuscrito para rbc@inca.gov.br.
Incluir permisso para reproduzir material previamente publicado ou para usar ilustraes que possam identificar
indivduos.
Incluir autorizao escrita das pessoas nomeadas nos agradecimentos, quando aplicvel.
Incluir documento comprovando a aprovao do trabalho por CEP ou TCLE, quando aplicvel.

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Curso de vero 2015

Carta de Submisso Revista Brasileira de Cancerologia

Por favor, preencha e envie este formulrio juntamente com o original do seu trabalho para o e-mail: rbc@
inca.gov.br. Caso o manuscrito tenha mais que um autor, cada um deles dever preencher, assinar e encaminhar
esta carta para o autor responsvel pela submisso, para digitalizar em formato .JPG e enviar RBC em anexo,
junto com o manuscrito.
Ttulo do manuscrito ____________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
Classificao do manuscrito:

( ) Artigo Original
( ) Reviso Sistemtica da Literatura
( ) Relato de Caso/Srie de Casos
( ) Artigo de Opinio
( ) Resenha
( ) Resumo
( ) Carta ao Editor
Cada autor deve indicar suas contribuies, marcando com a letra X os campos abaixo:
1. O autor contribuiu:
( ) Na concepo e planejamento do projeto de pesquisa
( ) Na obteno e/ou anlise e interpretao dos dados
( ) Na redao e reviso crtica
2. Conflito de interesses:
( ) O autor no tem conflitos de interesse, incluindo interesses financeiros especficos e relacionamentos e
afiliaes relevantes ao tema ou materiais discutidos no manuscrito.
( ) O autor confirma que todos os financiamentos, outros apoios financeiros, e apoio material/humano para
esta pesquisa e/ou trabalho esto claramente identificados no manuscrito enviado para avaliao do Conselho
Editorial da RBC.
3. Agradecimentos:
( ) O autor confirma que as pessoas que contriburam substancialmente ao trabalho desenvolvido neste texto,
mas que no atendem aos critrios para autoria, foram mencionadas nos Agradecimentos do manuscrito com a
descrio de suas contribuies especficas.
( ) O autor confirma que todos que foram mencionados nos Agradecimentos deram sua permisso por escrito
para serem includos no mesmo.
( ) O autor confirma que, se os Agradecimentos no foram includos no texto submetido, foi porque no
houve nenhuma contribuio substancial de outros ao manuscrito alm dos autores.
4. Transferncia de Direitos Autorais/Publicao
Declaro que em caso de aceitao do manuscrito para publicao, concordo que os direitos autorais a ele passaro
a ser propriedade da RBC, sendo vedada tanto sua reproduo, mesmo que parcial, em outros peridicos, sejam
eles impressos ou eletrnicos, assim como sua traduo para publicao em outros idiomas, sem prvia autorizao
desta e, que no caso de obteno do mesmo, farei constar o competente agradecimento Revista.
Autor _________________________________

Assinatura ________________________________

Data __________________________________

E-mail ___________________________________

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Curso de vero 2015

International Journal of Surgery 12 (2014) S187eS192

Contents lists available at ScienceDirect

International Journal of Surgery

journal homepage: www.journal-surgery.net

Original research

Management of breast cancer in elderly patients

Alfonso Reginelli a, *, Mariagrazia Calvanese b, Vincenzo Ravo c, Rossella Di Franco b,
Giustino Silvestro d, Gianluca Gatta a, Ettore Squillaci e, Roberto Grassi a,
Salvatore Cappabianca a
a

Department of Internal and Experimental Medicine, Magrassi-Lanzara, Institute of Radiology, Second University of Naples, Naples, Italy
Department of Internal and Experimental Medicine, Magrassi-Lanzara, Institute of Radiotherapy, Second University of Naples, Naples, Italy
Department of Radiotherapy, INT Pascale Hospital, Naples, Italy
d
Department of Radiotherapy, Cardinale Ascalesi Hospital, Naples, Italy
e
Department of Diagnostic Imaging, Molecular Imaging, Interventional Radiology and Radiotherapy, University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy
b
c

a r t i c l e i n f o

a b s t r a c t

Article history:
Received 15 May 2014
Accepted 15 June 2014
Available online 23 August 2014

Even if there is not a general consensus, we consider elderly patients of 65 years old or more. The degree
of aging is extremely variable so that we can individuate different groups of patients that are different
one from the other in relation with Performance Status, the presence of other pathology, and of eventual
social discomfort.
Breast Cancer is the most common Tumor in elderly woman and it represent the rst death cause The
45% of Breast Cancer arise in women more than 65 years old and the 33% arise in women of more than 70
years old. Despite these data elderly women are often excluded from screening schedules, moreover
despite there is no evidence that breast cancer is less aggressive in elderly patient they are generally non
considered in trial studies so that they are under treated if compared to young patients that's why we
cannot observe a decrease of mortality such as in younger patients Relative survival between 5 and 10
years in patients more than 75 years old it's lesser than the one observed in younger patients (between
45 and 70 years old) maybe that's because of the incongruity in the access to sanitary structures and
because of the social and economic discomfort.
When we speak about Breast Cancer we cannot be able to leave a multidisciplinary approach out of
consideration. Patient's evaluation must be done by a group of dedicated specialists that are: Radiologist,
Pathologist, Surgeon, Radiotherapist and Oncologist. The team need to analyze all data to improve
treatment and obtain a better cosmetic result [4]. Complex cases must be discussed collectively before
surgery to obtain the best therapeutic strategy. Moreover it's strictly important patient's involvement in
treatment selection. Consensus is mandatory and it can be obtained only if the patient is well informed
about treatment phases, adverse effects, and results.
2014 Surgical Associates Ltd. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

Keywords:
Breast cancer
Diagnostic imaging
Radiation therapy
Elderly

Breast Cancer has reached in Italy such an incidence that can be

considered a very social illness and it represents the rst death
cause by cancer in women [1]. The introduction of screening
schedules [2] increased diagnosis of early stage breast cancer, this

* Corresponding author. Department of Internal and Experimental Medicine,

Magrassi-Lanzara, Institute of Radiology, Second University of Naples, Piazza Miraglia 2, 80138 Naples, Italy
E-mail addresses: alfonso.reginelli@unina2.it (A. Reginelli), antocalv@libero.it
(M. Calvanese), dottenzoravo@gmail.com (V. Ravo), difrancorossella@virgilio.it
(R. Di Franco), radioterapia@aslnapoli1centro.it (G. Silvestro), gianluca.gatta@
unina2.it (G. Gatta), ettoresquillaci@tiscali.it (E. Squillaci), roberto.grassi@unina2.it
(R. Grassi), salvatore.cappabianca@unina2.it (S. Cappabianca).
http://dx.doi.org/10.1016/j.ijsu.2014.08.344
1743-9191/ 2014 Surgical Associates Ltd. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

34

added to therapeutic schedules that are more and more effective

improved survival [2].
When we speak about Breast Cancer we cannot be able to leave
a multidisciplinary approach out of consideration. Patient's evaluation must be done by a group of dedicated specialists that are:
Radiologist, Pathologist, Surgeon, Radiotherapist and Oncologist.
The team need to analyze all data to improve treatment and obtain
a better cosmetic result [2]. Complex cases must be discussed
collectively before surgery to obtain the best therapeutic strategy.
Moreover it's strictly important patient's involvement in treatment
selection. Consensus is mandatory and it can be obtained only if the
patient is well informed about treatment phases, adverse effects,
and results.

Curso de vero 2015

S188

A. Reginelli et al. / International Journal of Surgery 12 (2014) S187eS192

radiation therapy boost is needed in order to establish

beams direction [10,11]. Clips are helpful above all when
patient is submitted to surgical remodeling.
Kind of nodal dissection.
When Radical Mastectomy is the surgical option we need to
know:
 Which kind of mastectomy has been executed
 Which kind of nodal dissection has been executed
 Neoplasm connection to the skin, chest wall, pectoral
muscle
 Potential presence of metal clips
 Post-surgical complications
 Kind of reconstruction (if executed)

1. General approach
In the order to select the most suitable treatment for each patient, we need to know these Data:
1.1. Clinical data






Tumor location
Tumor size
Connection to the nipple
Connection to the skin and the thorax wall
Stage of regional nodes

1.2. Instrumental data

Mammography allows neoplasm identication and the denition of neoplasm size and characteristics giving useful knowledge
for treatment identication.
If preserving surgery is considered, we need to know these
radiological data (referred to bilateral mammography) [3].

Alternative therapeutic approach might consist in injecting the

patients with autologous endothelial progenitor cells, to accelerate
tissue revascularization and prevent a surgical approach [9e13].
Unfortunately, the therapeutic feasibility of such a strategy would
require the elucidation of the biological properties of these rathe
promising cells, which is far from being fully achieved.
1.4. Histological data

 Tumor location
 Tumor size
 Presence of multiple Tumors focuses in the same quadrant or in
different ones
 Tumor contact with the nipple
 Tumor contact with the Thorax wall
 Distribution and location of micro-calcications and dimension
of interested area.
Mammographic results must be described according to BiRRADS
nomenclature [4] and combined with other instrumental examination executed.
Ultrasounds is complementary to mammography and must be
executed in patients whose breast is particularly dense in the order
to dene with accuracy useful data for a feasible treatment [5].
Magnetic Resonance, according to Radiologist indication, could
be useful when Mammography and Ultrasounds can't be easily
interpreted [6].

Macroscopical data:
 Tumor size and surgical cut size
 Connection between tumor and surgical margins
 Neoplasm connection to the skin, chest wall, pectoral muscle
Microscopical and laboratory data:
Histological kind and histological grade
State of Hormonal Receptors
Multi focal disease
Excision margin involvement, grade of involvement itself
Presence and extension of IN SITU DESEASE
Lymphatic and/or Vascular involvement
Number and level of resected nodes, number of positive nodes
and extra capsular extension [11,12]
 HER-2 expression
 Reproducing activity (Ki67%, MIB-1).








1.3. Surgical data

Preserving Surgery is the suggested treatment approach for
small size breast cancer although we have to consider some
particular situations:
 Patients with two or more neoplasms located in different
quadrants or with spread micro-calcications can't be submitted to preserving surgery. When there is the presence of
different nodules in the same quadrant we have to analyze each
case to nd the right indication.
 Preserving surgery can be considered in relation with breast
volume if there is a 4e5 cm tumor mass.
 Preserving surgery is not suggested when there are big size
tumors in small breasts because cosmetic result could be not
satisfactory [7].
 If positive resection margins persist after wide excision, reresection is suggested.
I's strictly important to give a complete description of
intervention. It must be specied:
Which kind of intervention has been executed, with
deepened data about surgical rehash [8].
Presence of metal clips to the sides of tumor bed that can
help the individuation of tumor bed itself when a

All these data seems to be very important above all to get the
right eventual post-surgical treatment that is Radiotherapy treatment to achieve local control of disease and Chemotherapy to reach
general control.
2. Radiotherapy indication
2.1. Invasive carcinoma
Invasive Breast Cancer represent the 70e75% of all breast tumors and ductal Carcinoma is the 70e80% of all histological presentations. In more than 80% of patients with breast cancer
Preserving surgery is feasible.
Whole Breast Irradiation is the gold standard in post-surgical
preserving treatment in fact it decrease local recurrence of 75% if
compared to surgery alone [14e16]. So that we can say that Postoperative Irradiation is mandatory when conservative surgery has
been executedThere are some specic conditions in which post Mastectomy
Radiotherapy treatment is needed:
 Tumor size is more than 5 cm independently by node stage
[17e23]

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A. Reginelli et al. / International Journal of Surgery 12 (2014) S187eS192

 Any size tumor if extended to chest wall, pectoral muscle or skin

independently by node stage [21]
 4 or more axillary nodes involved [17,18,20,21]
 Patients with positive resection margins or close margins
(<2 mm) [17,22]
In post-surgical treatment Whole breast must be irradiated,
such as whole chest wall mast be treated after Mastectomy in those
cases we have just exposed. Supraclavicular Nodes need to be
treated when axillary nodes are involved, in T3eT4 tumors independently by nodes involvement and in T1eT2 tumors when 4 or
more axillary nodes are involved.
After preserving surgery Breast gland can be submitted to a
conventional treatment (1.8e2 Gy/die in 5 fractions per week to the
whole dose of 50e50.4 Gy) or to Hypofractionated schedules that
are shown to be equal in terms of efcacy by the Canadian Study
[23]. It is known that the most part of relapses occur in the tumor
bed it's common practice the delivery of a supplementary dose
(boost) to the tumor bed (2 Gy/die to 10 Gy) [24,25]. When resection margins are involved by the disease a major boost dose is
needed (between 10 and 20 Gy). After mastectomy whole chest
irradiation will be needed: total dose of 50.4 Gy (1.8 Gy/die).
2.2. Non invasive and microinvasive carcinoma
In situ Carcinoma represents the 30% of all breast Carcinomas
and several data suggest that it is a not mandatory precursor of
Invasive Carcinoma. In fact In Situ carcinoma hides all molecular
peculiarity of the Invasive form [26e28].
Common treatment is Preserving Surgery that decrease the risk
of local relapse [29e34]. Radiotherapy schedule is represented by
whole breast irradiation, recommended dose is 50e50.4 Gy with
conventional fractionation (1.8e2 Gy per fraction). It's still
controversial the use of a boost on tumor bed.
Waiting for results boost can be proposed in women younger
than 45 years old with high grade ductal carcinoma.
Mastectomy is the elected treatment when DCIS is located in
different quadrants of the same breast, when tumor size is more
than 4 or 5 cm, when there are spread micro-calcications and
when there are not adequate margins after preservative surgery.
There is no indication to axillary nodes dissection and also there
is no indication to sentinel lymph node biopsy.
Lobular In Situ Carcinoma has only surgery indication [35e37].
Such as the invasive Carcinoma, treatment approach for
Microinvasive Carcinoma is represented by preserving surgery or
mastectomy (when needed) including Sentinel lymph node
dissection. After conservative surgery RT treatment is mandatory
but there is no indication to postoperative RT treatment after
Mastectomy.
3. Our experience
From January 2011 to May 2014 we enrolled 120 patients, median age 71 years old, Karnowsky Performance Status was 90%.
Three patients were affected by bilateral Breast Cancer. 117 patients,
including patients with bilateral disease (97.5%) were submitted to
preserving surgery, and 3 patients (2.5%) underwent radical mastectomy. The 75% (90) of patients were submitted to axillary node
dissection while 25% (30 patients) underwent Sentinel lymph-node
dissection. The most represented Histology was Invasive Ductal
Carcinoma (67.5%) followed by In Situ Carcinoma (22.5%), Invasive
Lobular carcinoma (20%) and Micro-invasive Carcinoma (1%).
Regarding pathological stage 67.5% were T1 neoplasms, 7.5%
were T2 and 2.5% were T4 neoplasms; no T3 neoplasms were
observed, the remaining 22.5% were In Situ Disease. Median

36

S189

involved nodes were15, and only in Three cases we observed surgical positive margins. Only one of all 120 patients was triple
negative the remaining of them all had positive hormone receptors.
The 87.5% of patients (105) underwent chemotherapy treatment
and only one needed to suspend chemotherapy schedule due to
kidney failure. The 40% of patients underwent biological chemotherapy treatment with Herceptin.
All of these patients except the one with hormone receptors
unexpressed underwent to hormonal schedules treatment.
As we can see all these patients were submitted to the same
treatment schedules reserved to younger patients, none of them
was considered too old to underwent a complete treatment. They
were evaluated in our radiotherapy structure and all of them underwent Radiotherapy treatment.
Before to start treatment schedule all patients were submitted
to CT Scan to check the target volume, surgery scar has marked with
a metal strand so that the tumor bed could be easily individuated.
In fact all patients submitted to preserving surgery did not present
metal clips on tumor bed. Patients submitted to chemotherapy
schedules underwent Cardiac Ultrasounds to evaluate ejection
fraction before to start Radiotherapy.
The 90% (108) of patients underwent to conventional radiotherapy treatment: whole breast was treated with opposite tangent
beams to a whole dose 50 Gy, then a supplementary dose was
delivered to tumor bed 2 Gy/die 5 days a week to a total dose of
10 Gy. The complete absorbed dose was of 60 Gy.
The10% of patients [10] underwent whole breast irradiation for a
total dose of 50 Gy 2 Gy/die, 5 days a week.
Only one patient was submitted to simultaneous chest wall and
supraclavicular nodes irradiation.
Patients underwent clinical examination once a week: skin reaction, breast gland solidity, hematologic toxicity were evaluated.
All patients ended RT treatment, 46.8% of acute skin toxicity was
G1 (according to RTOG Scale), 22.5% was grade G2 and 2.5% was
grade G3. Skin toxicity seemed not to be connected to previous
chemotherapy treatment.
At rst follow-up all patients were disease free, only one patient
died for cardiovascular accident. Actually 92% did not present signals of local recurrence, 4.2% are died by different disease and 3%
have spontaneously suspended follow-up trials. Thanks to phone
contact we know that 3 of them have good local control and one of
them is died by cardiovascular accident.
In conclusion we can say that in our experience elderly patient
can be easily treated with the same treatment schedules reserved
to younger patients. Even if it's really difcult to have a long-term
follow-up due to advanced patient's age we established to complete conserving surgery with RT treatment.
All patients sustained a conventional treatment Gy/die 5 days a
week to whole breast to a total dose of 50 Gy, followed by an additional dose of 10 Gy delivered to tumor bed, local control at 3 years is
94.2% and acute skin toxicity is Grade 1 in 46.8%. The 92% of patient
had complete solution of skin toxicity one year after treatment.
In the order to obtain a more feasible RT treatment for elderly
patients from April 2014 we have started a new radiotherapy
schedule for elderly patients. Ten patients, median age 70, T1 N0
M0 were submitted to Hypo-fractionated RT schedule 3.75 Gy, 5
days a week for 16 days to a total dose of 60 Gy. First results are
encouraging, in fact acute skin toxicity is G1 in 40% of cases, G2 in
30% of cases and G3 in 30% of cases. But we need more time and
more enrolled patients to obtain a substantial result.
4. Management of breast cancer in elderly patients
Even if there is not a general consensus, we consider elderly
patients of 65 years old or more. The degree of aging is extremely

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variable so that we can individuate different groups of patients that

are different one from the other in relation with Performance Status, the presence of other pathology, and of eventual social
discomfort [38].
Breast Cancer is the most common Tumor in elderly woman and
it represent the rst death cause.
Senescence is characterized by several oxidative stress induced
diseases like cancer, diabetes, neurodegenerative and cardiovascular [39,40]. Oxidant molecules like NO (Nitric oxide) and ROS
(Reactive oxygen species) are overproduced in response to drugs,
chemicals, high-caloric diets, exercise and other stress agents [41].
The 45% of Breast Cancer arise in women more than 65 years old
and the 33% arise in women of more than 70 years old [42]. Despite
these data elderly women are often excluded from screening
schedules [43,44], moreover despite there is no evidence that
breast cancer is less aggressive in elderly patient they are generally
non considered in trial studies so that they are under treated if
compared to young patients that's why we cannot observe a
decrease of mortality such as in younger patients [45,46]. Relative
survival between 5 and 10 years in patients more than 75 years old
it's lesser than the one observed in younger patients (between 45
and 70 years old) maybe that's because of the incongruity in the
access to sanitary structures and because of the social and economic discomfort [45].
The 40% of elderly patients presents a co-morbidity at the
moment of the diagnosis despite analysis show that the most of the
elderly patients can tolerate a suitable therapy [46]. A correct
therapeutic approach would be apart from the age and include a
multidisciplinary assessment.
Diagnosis is made thanks to the same procedures used in young
women. Mammography taking advantage of contrast of adipose
tissue, that is mostly represented in old women breast gland, easily
allows tumors diagnosis even when their size is really small.
Diagnostic accuracy is near to 100%. Usually women over 70 years
old are not included in screening schedules in fact till now there are
not great evidences that suggest the utility of screening in women
over 70 years old. According to American Society of Geriatrics and
to Italian Consensus Conference, spontaneous screening must be
selected act on performance status, physiological age and life expected of each woman [47e49].
Lesions that can be submitted to surgery must be operated,
instead when patients cannot bear total anesthesia or deep sedation it's possible to execute the excision of the neoplastic lesion
with local anesthesia.
Recommendations to preserving surgery or mastectomy are the
same adopted for young women, of course it's strictly important to
consider patient's possibility to be submitted to Radiotherapy
treatment when preserving surgery is selected [50]. Axillary node
dissection must be done only when there is evidence of positive
nodes, the Sentinel Lymph-node dissection is a lesser invasive
practice so that it can be easily executed. When Biopsy is positive
axillary irradiation can represent an option to axillary node
dissection. An EORTC study named AMAROS compared axillary
dissection to axillary and median supraclavicular region Radiotherapy and rst results seems to indicate Radiotherapy superiority.
Early Breast Cancer Trialists Colaborative Group Meta-Analysis
[51] showed that post preservative surgery RT treatment decrease
local failure risk and produce benet to survival independently
from age. Nevertheless the absolute benet to survival is relative in
elderly patients because almost all these patients presents other
pathologies in addition to Breast cancer. However till now does not
exist a specic indication suggesting that there is a group of patients in which we can avoid RT treatment after preservative surgery [52]. Boost to the tumor bed is considered an optional
treatment.

In Those patients could be a treatment option the use of

Hypofractionated schedules, in fact local failure and disease free
survival are the same obtained with conventional schedules
without a signicant increase of severe and late adverse effect
[53e60]. Another choice is represented by Partial breast irradiation
that is the irradiation of the tumor bed with 1 cm of expansion.
Patients affected by advanced breast cancer tumors must be submitted to mastectomy if performance status and presence of other
pathologies allow the execution of this surgery [61].
Hormonetherapy is considered adjuvant treatment for women
with positive receptors. Chemotherapy must be delivered in
selected cases act on valuation of absolute benet for each patient
[62e71].
Ethical approval
Ethical approval was requested and obtained from the Second
University of Naples/Ascalesi Hospital ethical committee.
Sources of funding
All authors have no source of funding.
Author contribution
Alfonso Reginelli: Participated substantially in conception,
design, and execution of the study and in the analysis and interpretation of data; also participated substantially in the drafting and
editing of the manuscript.
Mariagrazia Calvanese: Participated substantially in conception,
design, and execution of the study and in the analysis and interpretation of data.
Vincenzo Ravo: Participated substantially in the analysis and
interpretation of data.
Rossella Di Franco: Participated substantially in the analysis and
interpretation of data; also participated substantially in the drafting
and editing of the manuscript.
Giustino Silvestro: Participated substantially in the analysis and
interpretation of data.
Gianluca Gatta: Participated substantially in conception, design,
and execution of the study and in the analysis and interpretation of
data.
Ettore Squillaci: Participated substantially in conception, design,
and execution of the study and in the analysis and interpretation of
data.
Roberto Grassi: Participated substantially in conception, design,
and execution of the study and in the analysis and interpretation of
data.
Salvatore Cappabianca: Participated substantially in conception,
design, and execution of the study and in the analysis and interpretation of data; also participated substantially in the drafting and
editing of the manuscript.
Conicts of interest
All authors have no conict of interests.
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Revista Espaola de Geriatra y Gerontologa

www.elsevier.es/regg

ORIGINAL BREVE

Caractersticas y manejo del cncer de mama primario en pacientes octogenarias:

estudio retrospectivo
Jos Luis Lobato Miguelez , Julio Moreno Domingo, Tania Arriba Olivenza,
Saioa Ajuriagogeascoa Andrada y Miguel Lpez Valverde
Servicio de Obstetricia y Ginecologa, Hospital Universitario Basurto, Bilbao, Vizcaya, Espa
na

informacin del artculo

r e s u m e n

Historia del artculo:

Recibido el 5 de enero de 2012
Aceptado el 29 de marzo de 2012
On-line el 4 de agosto de 2012

Objetivo: El nmero de pacientes ancianas con cncer de mama est en aumento y, una proporcin elevada
de estas pacientes mayores no recibe el tratamiento convencional. Analizamos las caractersticas clnicas
y biolgicas de los tumores a esta edad y la supervivencia en funcin del tratamiento local o sistmico.

Material y mtodo: Estudiamos retrospectivamente a 96 pacientes consecutivas de 80 o ms anos

con
cncer primario de mama diagnosticadas en nuestra Unidad entre enero del 2002 y septiembre del
2008. De ellas, 54 se sometieron a ciruga con o sin tratamiento hormonal adyuvante y 42 recibieron
hormonoterapia primaria.
tuvieron tumores con caractersticas biolgicas ms favoResultados: Las pacientes de ms de 80 anos
rables, incluyendo tumores que expresaban receptores esteroideos y ausencia de expresin de c-erb B2.
La supervivencia global fue de 50 meses para el grupo sometido a ciruga y 44 meses para el grupo no
sometido a ciruga. La supervivencia libre de recada local en el grupo operado fue de 44 meses, mientras
que la supervivencia libre de progresin local fue de 18 meses en el grupo no operado.
Conclusiones: En una cohorte de mujeres octogenarias, la supervivencia fue similar en las que recibieron
tratamiento hormonal o quirrgico, aunque las primeras tuvieron un perodo de supervivencia libre de
progresin o recidiva local menor.
2012 SEGG. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados.

Palabras clave:
Cncer de mama
Comorbilidad
Octogenarias

Characteristics and management of early breast cancer in patients aged

80 years and older: Retrospective study
a b s t r a c t
Keywords:
Breast cancer
Comorbidity
Aged 80 and over

Background: The number of elderly patients with breast cancer is increasing, and a large proportion
of these older patients do not receive conventional treatment. Clinical and biological characteristics of
tumours at this age and survival according to local or systemic therapy were analysed.
Material and method: A total of 96 consecutive early breast cancer patients over 80 years of age diagnosed
in our Unit between January 2002 and September 2008 were retrospectively investigated. Of them, 54
underwent surgery with or without adjuvant hormonal treatment, and 42 received primary hormonal
therapy.
Results: Tumours of patients 80 years old or older had more favourable biological characteristics, including expression of steroid receptors, and absence of c-erb B2 expression. Overall survival was 50 months
for the group subjected to surgery, and 44 months for the group who did not undergo surgery. The survival free of local recurrence in the surgery group was 44 months, whereas it was 18 months in the
non-surgery group.
Conclusion: In a cohort of patients aged 80 years and older, survival was similar in those who received
hormonal or surgical therapy, although the former had a shorter period of progression-free survival or
local recurrence.
2012 SEGG. Published by Elsevier Espaa, S.L. All rights reserved.

Autor para correspondencia.

Correo electrnico: lobatomiguelezjl@yahoo.es (J.L. Lobato Miguelez).
0211-139X/$ see front matter 2012 SEGG. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.regg.2012.03.007

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J.L. Lobato Miguelez et al / Rev Esp Geriatr Gerontol. 2012;47(5):210213

Introduccin
El cncer de mama es la neoplasia ms frecuente entre las mujeres y tambin la primera causa de muerte por cncer en la poblacin
femenina. Su incidencia aumenta a medida que lo hace el nivel de
desarrollo econmico lo cual, junto al aumento progresivo de la
esperanza de vida ha tenido como consecuencia el hecho indiscutible de que este tumor se diagnostica cada vez con ms frecuencia
en la mujer anciana. De hecho, algunos estudios indican que para el
2035 el 60% de los nuevos casos se diagnosticarn en pacientes
ano
1.
de ms de 70 anos
La mujer anciana diagnosticada de cncer de mama representa
un subgrupo especial de pacientes con unas peculiaridades singulares ya que por una parte los tumores malignos a esta edad tienen
unos rasgos clnicos y biolgicos propios, y por otro lado, el manejo
diagnstico y teraputico debe ajustarse a la situacin individual de
cada paciente. La presencia constante de factores de comorbilidad

anadidos
al cncer de mama, sobre todo enfermedades cardiovasculares, diabetes y segundas neoplasias, confieren a estas pacientes
un peor pronstico vital con una disminucin de la supervivencia
global, independientemente de la supervivencia especfica para el
cncer de mama.
Analizamos las caractersticas propias del cncer de mama en
este grupo de edad y las implicaciones en cuanto a la eleccin del
tratamiento apropiado.

211

Tabla 1
Distribucin por estadios TNM (UICC/AJCC, 2010), tipos histolgicos y factores
pronsticos
Nmero de pacientes

Porcentaje

Estadio
Estadio I
Estadio II
Estadio III
Estadio IV

10
80
15
5

9%
73%
13,5%
4,5%

Tipo histolgico
Ductal infiltrante
Lobulillar infiltrante
Mucinoso
Otros

84
16
7
3

76,3%
14,5%
6,4%
2,8%

Grado tumoral
G1
G2
G3

30
64
16

27,0%
58,5%
14,5%

Expresin de RE
RE+
RE-

97
13

88%
12%

Sobreexpresin c-erb B2
Negativo
Positivo

101
9

91,8%
8,2%

RE: receptores estrognicos.

Resultados
Material y mtodos
Realizamos un estudio retrospectivo de pacientes de 80 o ms

anos
diagnosticadas de cncer de mama comparando la supervivencia del grupo sometido a ciruga como tratamiento primario
con la del grupo no sometido a ciruga.
Entre el 1 de enero del 2002 y el 31 de diciembre del 2008,
de edad fueron diagnosticadas de
110 pacientes de ms de 80 anos
cncer de mama en la Unidad de Patologa Mamaria del Servicio de
Obstetricia y Ginecologa del Hospital Universitario Basurto, Bilbao.
Se excluyeron a 14 pacientes por distintos motivos: 9 presentaban
una enfermedad en fase terminal en el momento del diagnstico,
3 pacientes fueron tratadas con radiofrecuencia y 2 pacientes que
rechazaron inicialmente la ciruga fueron intervenidas posteriormente tras varios meses de tratamiento hormonal. Finalmente,
96 pacientes fueron incluidas en el estudio y se dividieron en 2
grupos segn fueran o no sometidas a tratamiento quirrgico.
Para verificar si los 2 grupos eran comparables, establecimos parmetros clinicohistolgicos (edad media, estadio tumoral,
expresin de receptores hormonales, etc.) y valoramos la comorbilidad utilizando el ndice de Charlson2 (considerando una
comorbilidad alta cuando el ndice era superior a los 2 puntos).
Hemos considerado la supervivencia global como el tiempo
transcurrido, en meses, desde el tratamiento inicial hasta el fallecimiento de la paciente; supervivencia libre de enfermedad en
el grupo operado como el perodo entre el tratamiento inicial y la
reaparicin de la enfermedad; y supervivencia libre de progresin
local en el grupo no operado como el tiempo entre el tratamiento
inicial y el momento en el que se observa progresin de la enfermedad.
En cuanto al anlisis estadstico, a la hora de realizar el estudio descriptivo, las variables cualitativas vienen expresadas por
el nmero de casos y el porcentaje respecto al total de casos
de la variable estudiada; y las variables cuantitativas mediante
la media. Para comparar variables cualitativas hemos utilizado la
prueba de la Chi-cuadrado de Pearson con correccin de Yates y
para la comparacin de variables cuantitativas la prueba de la t de
Student, considerando significacin cuando el valor de p era menor
de 0,05.

Entre enero del 2002 y diciembre del 2008, 1.295 mujeres fueron
diagnosticadas de un cncer de mama en nuestra Unidad. De ellas,
de edad en el momento
110 pacientes (8,5%) tenan 80 o ms anos

del diagnstico, con una media de 84,7 anos.

La prctica totalidad de estas pacientes (108), referan la presencia de un ndulo en la mama como sntoma principal con un
medio de 33 mm de dimetro, mientras que solo un 49% de
tamano
referan este sntoma y con
nuestras enfermas menores de 80 anos
medio de 19 mm. Entre las pacientes octogenarias, 26
un tamano
(el 23,6%) tenan afectacin axilar clnica y/o ecogrfica, frente al

33% en las pacientes de menos de 80 anos.

En 5 (4,5%) se demostr
la presencia de metstasis a distancia en el estudio de extensin
inicial, porcentaje similar al de las pacientes ms jvenes (5%).
La distribucin por estadios, tipos histolgicos y factores pronsticos se detallan en la tabla 1, que muestra que casi tres cuartas
partes de estas pacientes se encontraban en estadio II, a expensas
del tumor en el momento del diagnstico, y que el
del gran tamano
tumor prototipo en la paciente octogenaria sera un carcinoma ductal infiltrante moderadamente diferenciado que expresa receptores
esteroideos y sin sobreexpresin de c-erb B2.
De las 96 pacientes seleccionadas para el estudio, 54 se sometieron a ciruga como tratamiento primario, que consisti en una
mastectoma en el 55,5% de estas enfermas y en una tumorectoma
amplia en el 45,5% restante. La linfadenectoma axilar se practic en
el 65% de las pacientes operadas (la tcnica de ganglio centinela solo
se practic en una paciente siendo positivo en la biopsia intraoperatoria).Tras la ciruga, 13 pacientes (24%) recibieron radioterapia
adyuvante, 48 (89%) hormonoterapia y ninguna quimioterapia.
Las 42 pacientes restantes no se sometieron a ciruga, la mayora
de las veces (39 casos) por deseo expreso de la paciente consensuado con su familia, y en solo 3 casos por indicacin mdica. Todas
estas mujeres iniciaron tratamiento hormonal con inhibidores de
la aromatasa. En la tabla 2 se comparan las caractersticas de ambos
grupos.
Hasta finales de septiembre del 2011 haban fallecido 55 pacientes (57,3%), 17 de las cuales (el 17,7% del total) debido a la
mortalidad especfica de la neoplasia mamaria, y 38 (el 39,6% del
total) por otras causas ajenas al cncer de mama (tabla 2). Tras

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212

Tabla 2
Caractersticas de ambos grupos, evolucin de la mortalidad y control local
Ciruga
N. de pacientes
Edad media
Grado tumoral
G1
G2
G3

54
83,6

No ciruga
42
86,2
12 (28,5%)
25 (59,5%)
5 (12%)

Expresin RE
RE+
RE

48 (88,8%)
6 (11,2%)

40 (95,2%)
2 (4,8%)

Sobreexpresin c-erb B2
Negativo
Positivo

51 (94,5%)
3 (5,5%)

39 (92,8%)
3 (7,2%)

40 (74%)
14 (26%)

28 (66,6%)
14 (33,4%)

28 (51,8%)
9 (16,6%)
19 (35,2%)

27 (64,2%)
8 (19%)
19 (45,2%)

50 meses

44 meses

4 (7,4%)a
44 mesesa

35 (83,3%)b
18 mesesb

Mortalidad
Global
Cncer de mama
Otras causas
Supervivencia media global
Control local*
Fracaso
Supervivencia libre de fracaso local

0,12
0,66

14 (26%)
32 (59%)
8 (15%)

ndice de comorbilidad de Charlson2

Bajo 2
Alto > 2

Valor de p

0,45
0,91

0,63

0,22
0,84

< 0,001
0,014

RE: receptores estrognicos.

a
Recada local (grupo ciruga).
b
Progresin local (grupo no ciruga).
*
p < 0,05.

un perodo de seguimiento de entre 33 y 105 meses despus del

diagnstico, la supervivencia media global fue de 50 meses para el
grupo sometido a ciruga y de 44 meses para el grupo no sometido
a ciruga. En cuanto al control local, la supervivencia media libre
de recidiva local para el grupo operado fue de 44 meses, pues solamente 4 pacientes han presentado recada local durante el perodo
de seguimiento. Por el contrario, la supervivencia libre de progresin local en el grupo no operado fue de solo 18 meses de media ya
que ms de un 83% de las pacientes de este grupo han presentado
progresin de la enfermedad y en 5 de estas mujeres se opt por una
mastectoma paliativa para lograr el control local de tumoraciones
ulceradas o sangrantes.
Discusin
Es ampliamente admitido en la literatura que el cncer de
mama en ancianas tiene una serie de peculiaridades clnicas y
biolgicas que hacen que el curso de la enfermedad sea ms indolente. As, la expresin de receptores hormonales y la falta de
sobreexpresin de c-erb B2, que observamos en la mayora de las
pacientes de nuestra serie es una constante en todos los estudios de este tipo de pacientes3,4 . La observacin clnica de estas
pacientes muestra una evolucin del cncer ms lenta y menos
agresiva. Daidone et al.5 resumen las caractersticas del cncer
de mama a esta edad: tumoracin bien o moderadamente diferenciada con bajas tasas de afectacin ganglionar, mayor tasa de
receptores hormonales positivos y mayor porcentaje de negatividad para el oncogen HER-2. Por el contrario, las pacientes
33 mm
mayores se diagnostican con tumores de mayor tamano,
de media en nuestra serie, y son ms propensas a presentar
enfermedad localmente avanzada en el momento de la primera
consulta6 .
La existencia de enfermedades concurrentes constituye un

factor fundamental a tener en cuenta a la hora de disenar

el

42

tratamiento ms adecuado para este grupo de pacientes. Su incidencia aumenta con la edad de tal manera, que en una revisin de
Yancik et al.7 , calcularon que las mujeres que se encontraban con
tenan una media de entre 3 y 4 factores
una edad entre 70 y 80 anos
de comorbilidad, lo cual coincide con nuestra experiencia, siendo
la hipertensin, los trastornos artrodegenerativos y las enfermedades cardiovasculares, las afecciones que encontramos con mayor
frecuencia.
La simplificacin del tratamiento en este grupo de edad, evitando la utilizacin de alguna de las terapias incluidas en las
guas de actuacin, es una opcin adoptada por muchos expertos. As, Hughes et al.8 en un estudio randomizado sobre ms de
con cncer de mama tratadas con
600 mujeres de ms de 70 anos
lumpectoma, llegan a la conclusin de que la omisin de la radioterapia adyuvante no tena ningn impacto sobre la supervivencia.
La supresin del abordaje axilar es una actitud asumida por algunos
autores, que indican que este proceder puede ser apropiado para
aquellas mujeres mayores que presenten tumores biolgicamente
poco agresivos y para las que presentan una expectativa de vida
reducida debido a su edad o a factores asociados de comorbilidad9 .
Nosotros no realizamos linfadenectoma en el 35% de las pacientes
operadas sin que ello tuviera efectos en el resultado final. De hecho,
Rudenstam et al.10 demostraron que no realizar la linfadenectoma

en pacientes con cncer de mama mayores de 75 anos,

no tena
ningn impacto sobre la supervivencia de estas mujeres, y Gajdos
11
de pacientes trataet al. , en una revisin retrospectiva de 20 anos
das de un cncer de mama comprobaron que el 54% de sus pacientes
haban sido infratratadas segn las pautas conde ms de 70 anos
vencionales, pero verificaron que la omisin de la diseccin axilar,
la radioterapia y la quimioterapia no tena ningn impacto sobre
el control local, ni sobre la aparicin de metstasis a distancia, ni
sobre la supervivencia.
Adems, a medida que avanza la edad, la mortalidad especfica
por cncer de mama se reduce considerablemente, independientemente del estadio de la enfermedad. Segn Schairer et al.12 , tras
realizar un estudio epidemiolgico sobre pacientes de ms de 70
con cncer de mama localizado, estas mujeres muestraron una
anos
reduccin aproximada del 33% de posibilidades de morir a causa
de dicha enfermedad respecto a las pacientes de menor edad. En
otro estudio epidemiolgico sobre ms de 50.000 pacientes norteamericanas con cncer de mama, los autores demostraron que
la supervivencia de las mujeres ancianas con esta enfermedad era
similar a la de la poblacin general independientemente del estadio
de la enfermedad13 .
En el presente estudio no encontramos variaciones significativas
en la supervivencia especfica del cncer de mama entre el grupo
de las pacientes tratadas con ciruga como tratamiento primario y
el grupo que rechaz el tratamiento quirrgico y que fue tratado
con hormonoterapia.
La mayora de los tumores malignos de mama que aparecen en
mujeres ancianas expresan receptores hormonales (el 88% de nuestra serie). Adems, la proporcin aumenta progresivamente con la
14 .
edad y, llega al 91% en pacientes de ms de 85 anos
La suma de estos elementos puede hacer muy atractiva la idea
de la terapia hormonal primaria y exclusiva para tratar el cncer de
mama en mujeres ancianas, sin embargo, como concluye el metaanlisis de Hind et al.15 , si bien no hubo variaciones significativas
en la supervivencia global entre el grupo tratado con ciruga y el
grupo tratado con tamoxifeno como terapia primaria, si la hubo
respecto al control local. De hecho, la supervivencia libre de progresin en el grupo no operado no super los 24 meses (en nuestra
corta serie fue solo de 18 meses de media), siendo este un importante factor de deterioro de la calidad de vida para estas mujeres
independientemente de la supervivencia global que con frecuencia

obliga a practicar mastectomas higinicas varios anos

despus
del diagnstico inicial encontrndonos con la paradoja de tener

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que operar a una paciente ms envejecida y deteriorada que si lo

hubiramos hecho de inicio.
El anlisis de todos estos factores deja varias cuestiones sin
resolver; en primer lugar, la mayora de los estudios sobre este
tema se centran en pacientes ancianas entendiendo como tales

las que tienen ms de 65 o 70 anos,

siendo pocos los referidos a las pacientes octogenarias. En segundo lugar, casi todos los
ensayos comparan la ciruga frente al tamoxifeno estando pendiente de evaluar la eficacia de los inhibidores de la aromatasa
como terapia primaria para esta poblacin. Posiblemente el ensayo
ESTEM, puesto en marcha en el Reino Unido, con ms de 1.200
pacientes pueda aportar mayor claridad a estas cuestiones. Hasta
entonces, parece razonable utilizar la hormonoterapia como tratamiento primario y exclusivo nicamente en aquellas ancianas con
tumores que expresen receptores de estrgenos y que dispongan de
una expectativa de vida inferior a 24 meses, y en aquellas que rechazan o que no son susceptibles de intervencin quirrgica, as como
las que presentan una enfermedad avanzada en el momento del
diagnstico y no son candidatas a tratamiento quimioterpico15 .
Como conclusin, las guas generales de actuacin que se utilizan en la actualidad para el tratamiento del cncer de mama
pueden ser poco adecuadas para las pacientes muy ancianas. Deberemos tener en cuenta, que estas pacientes presentan tumores
con caractersticas biolgicas ms favorables y, que constituyen un
grupo poblacional muy heterogneo en cuanto a su vulnerabilidad, factores de comorbilidad, capacidad funcional y esperanza de
vida. Adems, su tolerancia a alguna de las terapias convencionales se ve reducida al tiempo que aumenta la yatrogenia asociada
al tratamiento. Por todo ello, ser fundamental realizar una adecuada valoracin geritrica con el fin de estimar razonablemente
la expectativa de vida, y cuando esta sea limitada o existan criterios importantes de fragilidad, el tratamiento hormonal exclusivo
puede ser una opcin vlida a considerar, sin olvidar que siempre
deberemos respetar las opiniones y deseos de nuestras pacientes.

213

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J Surg Oncol. Author manuscript; available in PMC 2014 January 27.

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Published in final edited form as:

J Surg Oncol. 2011 March 1; 103(3): 201206. doi:10.1002/jso.21799.

Breast Cancer In Elderly Women (80 Years): Variation In

Standard Of Care?
Amy Cyr, MD1, William E. Gillanders, MD1, Rebecca L. Aft, MD1,2, Timothy J. Eberlein, MD1,
and Julie A. Margenthaler, MD, FACS1
1Department of Surgery, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO
2Department

of Surgery, John Cochran Veterans Hospital, St. Louis, MO

Abstract
ObjectiveThe study aim was to investigate the methods of breast cancer diagnosis and
treatment for women at advanced ages.

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MethodsWe identified 134 patients 80 years old treated for breast cancer. Data included
patient and tumor characteristics, treatment, and outcomes.
ResultsOf 134 women 80 years old, 146 breast cancers were diagnosed. Sixty-five (45%)
were detected by mammography. Surgical therapy included partial mastectomy in 50% and
mastectomy in 50%. Although 12 (9%) women had no axillary staging, 22 (16%) underwent
axillary lymph node dissection for node-negative disease. Of 73 patients undergoing partial
mastectomy, 34 (47%) received adjuvant radiation. Of 113 cancers with known estrogen receptor
(ER) status, 83% were ER positive; 95% received endocrine therapy. Fourteen (10%) received
adjuvant chemotherapy. Eleven (8%) were Her-2neu-amplified; 1 patient received adjuvant
trastuzumab. At follow-up, 87 (65%) patients were alive without evidence of disease, while 6
(4%) died of breast cancer.
ConclusionsBreast cancer in women 80 years is more likely to be early-stage with favorable
tumor biology. While most women eligible for anti-estrogen therapy received it, adjuvant
radiation, chemotherapy, and/or trastuzumab were utilized infrequently. Despite these variations,
older women with breast cancer are unlikely to suffer breast cancer-related mortality.

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Keywords
Breast cancer; Elderly; Adjuvant therapy

Introduction
Breast cancer incidence increases with age, peaking at age 80 [1]. Life expectancy has
steadily increased. An 80 year old American woman has a life expectancy of 89 years, and a
90 year old woman has a life expectancy of 94.5 years [2]. With the aging Baby Boomer
population, our health system is seeing a higher volume of elderly women with breast
cancer. Unfortunately, large national trials include only small numbers of these older
women, and the data that is available suggests that these women often receive less than the
standard of care [3-6] and have worse outcomes because of it [1, 7-9]. Other data propose
that older women may, in fact, do equally well without aggressive treatment [10-12] or that
standard treatments cause more complications in elderly patients [13]. Much of the literature

Address Correspondence to: Julie A. Margenthaler, MD, Assistant Professor of Surgery, 660 S. Euclid Avenue, Campus Box 8109, St.
Louis, MO 63110, 314-362-7534 (telephone), 314-454-5509 (fax), margenthalerj@wudosis.wustl.edu.

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defines elderly very broadly, including women as young as 65 or even excluding women
over 80 from studies focused on older breast cancer patients [10]. There is a paucity of data
for the oldest old patients, or patients 80 years and over.
Our study aim was to review the treatment and outcomes for women 80 years and older
treated for breast cancer at our institution. Specifically, we were interested in determining
whether these elderly patients received treatments that were similar to what is typically
administered for specific biologic tumor characteristics in younger patients, based on
available literature. This indirect comparison is performed as a consequence of the
infrequent inclusion of elderly patients in randomized trials. Further, we investigated the
outcomes of the elderly breast cancer patients as a proxy for the impact of their prescribed
treatment plan on overall longevity.

Methods

NIH-PA Author Manuscript

Institutional review board approval was obtained prior to the commencement of this
retrospective study. Written informed consent of the patients was not required. Clinical,
demographic, and pathologic data from all breast cancer patients treated at our institution are
prospectively recorded in a database. We reviewed this database and identified 134
consecutive women aged 80 and older with a diagnosis of Stage 0-IV breast cancer who
underwent surgical treatment at our institution between January 1, 1998 and June 30, 2009.
This included a subset of women aged 90 and older. Patient and tumor characteristics and
vital status were recorded. Specific data collected included mode of presentation, patient
comorbidities, tumor pathology, receptor status, staging, methods of treatment, and
outcomes. The first sentinel lymph node biopsy (SLNB) performed in this cohort of patients
occurred in 2000. Axillary staging described as axillary sampling or as a Level I
dissection was categorized as an axillary lymph node dissection (ALND).
All data were transferred to a single spreadsheet (Excel; Microsoft, Redmond, WA). Data
analysis for this study was descriptive in nature. All statistical analyses were performed
using a statistical package SAS (SAS Institutes, Cary, NC). Vital status outcomes of interest
included alive without evidence of breast cancer, alive with evidence of breast cancer, death
from breast cancer, and death from other causes.

Results
Patients and diagnoses

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We identified 146 breast cancers in 134 women aged 80 or older (Table 1). The median age
of the total cohort was 84 (range 80-96), including 9 women in their nineties. There were
104 (78%) Caucasian women and 30 (22%) African-American women. Of 134 women, 59
(44.0%) had concurrent co-morbidities, excluding hypertension. Common co-morbidities
included diabetes mellitus, cerebrovascular disease, coronary artery disease, arrhythmia,
dementia, pulmonary disease, deep venous thrombosis, and Parkinson's disease. Eleven
(8.2%) women had prior non-breast malignancies, including cervical (n = 1), carcinoid (n =
1), bladder (n = 2), melanoma (n = 2), renal cell (n = 1), lung (n = 1), anal (n = 1),
endometrial (n = 1), and colon (n = 1). Twelve women (8.9%) had two primary breast
cancers, either synchronous contralateral (n = 3), metachronous contralateral (n = 1),
synchronous ipsilateral (n = 4), or recurrent disease (n = 4). Because the two cancers of each
of these twelve women had different presentations, biopsy methods, sizes, pathologies,
receptor status, and treatments, they were counted separately in the analysis.
Nearly half of the cancers (65, 44.5%) were identified by an abnormal screening
mammogram. Six (4.1%) were found during workup of a contralateral or separate ipsilateral

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breast cancer or during surveillance following treatment of a prior cancer. One breast cancer
was seen on computed tomography of the chest as part of a renal mass work-up, and one
was diagnosed on a positron emission tomography scan performed for colorectal cancer
staging. However, the majority of cancers presented symptomatically, either as a palpable
mass (n = 60), bloody nipple discharge (n = 4), axillary mass (n = 3), skin changes (n = 1),
breast pain (n = 1), or non-resolving cystic lesion (n = 1). Two presented in an unknown
fashion. The majority of cancers (114, 78.1%) were biopsied percutaneously with or without
imaging guidance. Twelve cancers (8.2%) were diagnosed by excisional biopsy. The
remaining cancers were diagnosed by non-bloody cyst aspirate (n = 1), bloody cyst aspirate
(n = 1), duct excision for bloody nipple discharge (n = 1), fine needle aspiration biopsy
(FNAB) of an axillary mass (n = 1), and skin punch biopsy of a locally advanced cancer (n =
1). Four cancers were diagnosed by unknown means.
Tumor characteristics

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Most of the cancers were diagnosed at early stages, including 16 ductal carcinoma in situ
(DCIS) (10.9%), 3 Tmic cancers (2.1%), and 78 T1 cancers (53.4%). The majority of
cancers were either invasive ductal cancer (IDC) (94, 64.4%) or invasive lobular cancer
(ILC) (14, 9.6%). Other pathologies included tubular (n = 3), papillary (n = 3), mucinous (n
= 5), medullary (n = 1), mixed IDC/ILC (n = 5), and carcinoma not otherwise specified (n =
4). One recurrence has not been resected. Forty-four (30.1%) of the breast cancers were
classified as low grade, 63 (43.2%) as moderate grade, and 24 (16.4%) as high grade. Of the
146 tumors, hormone receptor status was known for 113, and 83.2% of these were estrogen
receptor (ER) positive (64.4% of the entire cohort). Her-2neu status was known for 112 of
the tumors, and 11 were noted to be Her-2neu-amplified (9.8%). Fourteen tumors were
triple negative (12.4%). Tumor characteristics are summarized in Table 2.
Surgical treatment
Surgical therapies are summarized in Table 3. Less than half [72 (49.3%)] of the cancers
were treated with partial mastectomy, while 70 cancers (47.9%) were treated with
mastectomy. Four of the cancers treated with mastectomy occurred after failed partial
mastectomy, including 2 which were performed for an in-breast disease recurrence. One
breast tumor was resected with an unknown procedure and one chest wall recurrence was
resected. One cancer was resected by mastectomy in the setting of an axillary breast cancer
metastasis without an identified breast primary tumor. One recurrence has not yet been
resected.

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Of the 128 invasive cancers that were resected, 12 (9.4%) did not have concurrent axillary
staging. Two additional cancers were not staged due to prior ALNDs and 2 invasive cancers
had unknown axillary staging. Less than half of the DCIS cases had axillary staging: 3
(18.8%) with SLNB concurrent with mastectomy, 2 (12.5%) by ALND during modified
radical mastectomy (MRM), and 1 (6.3%) with a SLNB concurrent with partial mastectomy.
Of the total invasive tumor cohort (n = 128), 47 (36.7%) were staged with ALNDs,
including 40 of 47 (85.1%) which were performed in the era of SLNB. Eighteen of the 47
cancers (38.3%) staged with ALND without prior SLNB had positive nodes found at
dissection, but 22 (46.8%) had no evidence of nodal disease. One cancer (2.1%) had
micrometastatic axillary disease only, and nodal pathology was unknown for 6 of the
cancers (12.8%) staged with ALND. In cases with axillary metastases, the median number
of involved lymph nodes was 2 (range 1-16). The remaining 65 invasive cancers were staged
by SLNB, with or without completion ALND. Of those patients undergoing SLNB, 52
(80.0%) had negative SLNs and 13 (20.0%) had positive SLNs. Two cancers (3.2%) were
associated with micrometastatic disease in the SLNs and ALND was not performed in either
case.

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Adjuvant treatment

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Of the 72 cancers treated with partial mastectomy, 34 (47.2%) completed adjuvant radiation
therapy (27 whole breast/unspecified radiation, 7 partial breast radiation). Of the cancers
that were ER positive (n = 94), 89 (94.7%) received adjuvant endocrine therapy (35
tamoxifen, 54 aromatase inhibitors). We were unable to verify the total length of treatment.
Of 14 cancers with triple negative immunostains, 5 (35.7%) were treated with
chemotherapy. A total of 14 cancers in our cohort were treated with chemotherapy overall,
including the 5 triple negative cancers. Only 1 of 11 (9.1%) Her-2neu-amplified cancers
was treated with adjuvant trastuzumab therapy; all 11 patients were identified in the era of
trastuzumab therapy.
Women aged 90 and older

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Of the 9 women in their nineties at the time of diagnosis, 4 (44.4%) were diagnosed by
screening mammography and the remainder were diagnosed by a palpable abnormality.
Three (33.3%) cancers occurred in patients who had previous contralateral breast cancer. Of
the 9 women, 8 were diagnosed at early stages (3 DCIS and 5 T1). Four (44.4%) of the
tumors in the women aged 90 and older were treated with mastectomy while 5 (56.6%) were
treated with partial mastectomy. Of the 6 invasive tumors, 4 (66.7%) underwent axillary
staging (1 SLNB, 1 ALND, 2 unknown axillary staging), but 2 (33.3%) did not. Of the five
cancers treated with partial mastectomy, none received adjuvant radiation therapy. With
regards to ER status, 2 cancers were ER positive and were treated with tamoxifen, 1 cancer
with an unreported ER status was treated with tamoxifen, 1 cancer was ER negative, and 5
cancers had unknown ER status.
Patient outcomes
The median follow-up for the overall cohort was 34 months (range 1-124 months, mean 36
months). Of the 134 patients included in the cohort, 6 (4.5%) developed systemic metastases
and died during the follow-up period. There was no significant difference in survival
according to patient race. In comparison, the breast cancer-specific mortality for women <80
years old at our institution during the same follow-up period was 16.8% (p<0.001). Of those
elderly patients who did not die secondary to breast cancer, 87 (64.9%) are alive with no
evidence of breast cancer, 4 (3.0%) are alive with evidence of breast cancer recurrence, and
37 (27.6%) are dead secondary to other causes. Thus, the overall recurrence rate was 7.5%
(10 of 134 patients), including a locoregional recurrence rate of 3.0% (4 of 134 patients) and
a distant recurrence rate of 4.5% (6 of 134 patients).

Discussion
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Breast cancer incidence increases with age, peaking at age 80 [1]. Elderly women appear to
be a unique subset of breast cancer patients, but there is no clear consensus in the literature
regarding breast cancer pathology or optimal treatment for these patients. In fact, there is
disagreement about the definition of elderly; studies focusing on elderly or older
patients often include women 70 or older, but may include women as young as 65 or exclude
women over 80 [10]. Further, older patients are rarely included in randomized clinical trials
[14].
The literature reports that 45-80% of elderly patients present with T2 or greater or palpable
tumors [5, 19-21]. Our results partially corroborate these reports in that 41% of the cancers
in our cohort were palpable, and over 50% of our patients were symptomatic at diagnosis.
However, only 25% of the cancers were T2 or larger. This is likely secondary to the fact that
nearly 50% of the patients in our cohort were diagnosed by screening mammography,
despite a lack of recommendation for screening mammography in this patient population.
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One would hypothesize that the lack of standard screening guidelines for elderly women
may translate to advanced disease at diagnosis. Some studies do report that elderly women
over the age of 80 have a higher likelihood of presenting with advanced disease [18], with
up to 44% axillary nodal involvement [20-22], or with breast cancers that have poor
prognostic features [19]. Other studies, however, suggest that older women have less
aggressive disease [15, 16], are less likely to have nodal involvement [17], and that at least
74% of patients have hormone receptor positive tumors [9, 19-22]. Our results are more
consistent with these latter studies, in that the majority of our patients had early-stage
disease, only 25% of the invasive cancers staged had nodal involvement, and 83% of the
cancers were ER positive. Table 4 summarizes the current study and available literature.

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The current study found that the main cause of death for our elderly patients were non-breast
cancer causes, and only a small number of women (4%) died secondary to their breast
cancer. We did not observe any significant difference in survival according to patient race,
though the low breast cancer-specific mortality may have precluded any meaningful
comparison. Previous studies have reported higher rates of breast cancer-specific mortality
for the elderly population [23]. Rodriguez et al. [23] reported on a series of 100 patients
aged 70 and older who underwent curative-intent surgical therapy for breast cancer and
found that breast cancer was the principle cause of death, despite a 77% co-morbidity rate.
Evron et al. [17] similarly identified breast cancer as the cause of death in one third of the
deceased patients in their cohort of 135 women aged 80 and older. It is unclear why so few
women in our study died secondary to breast cancer. This finding is consistent with the less
aggressive tumor biology observed in our cohort. It is also possible that the co-morbidities
of our patient population were more significant than those reported in other series.

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The extent of surgical treatment performed in elderly breast cancer patients varies in
previous reports. The combination of concomitant co-morbidities and the relative safety of
endocrine therapy in elderly patients have prompted some limited data regarding primary
endocrine therapy in the absence of surgical treatment [1, 7, 24]. The GRETA trial
randomized patients to receive tamoxifen alone versus surgical removal of the breast cancer
followed by adjuvant tamoxifen. Although patients in the tamoxifen alone group had
increased local disease progression, there was no difference in overall or disease-specific
survival [24]. In contrast, other studies have shown that replacement of surgical therapy with
primary endocrine therapy in elderly patients is associated with a poorer survival [1, 7]. We
do not have any data regarding the use of primary endocrine therapy in our surgical
database. However, we did find that our elderly patients undergoing surgical treatment of
their breast cancer were as likely to have mastectomy as partial mastectomy. In fact,
previous reports also demonstrate this trend toward lower rates of breast-conserving therapy
in elderly women [5, 9, 19, 20, 22, 25-27].
In contrast to the trends in breast surgical procedures, elderly women are less likely to
undergo axillary staging procedures compared to younger women [3, 19, 21, 25]. This is
despite previous studies demonstrating that nodal involvement retains prognostic
significance in older breast cancer patients [12] and that adjuvant treatment decisions are
altered in many elderly patients based on axillary staging results [28-30]. Whether the
absence of axillary staging necessarily translates to less favorable outcomes is less clear.
Martelli et al. [10] reported 5-year follow-up on a cohort of 219 women aged 65-80 with
clinical T1N0 breast cancer who were randomized to ALND versus no axillary surgery. Two
women who had no axillary surgery developed an axillary recurrence, but there was no
difference in overall or disease-specific mortality between the two groups [10]. Mandelblatt
et al. [13] found that women aged 67 and older who underwent axillary staging, either by
SLNB or ALND, developed upper extremity complications three times that of younger
women. These sequelae also had a larger impact on physical and mental function in the

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older patients [13]. The risks of axillary procedures in elderly women must be weighed
against the potential prognostic information and benefits obtained; this is true for women of
all ages, but may be particularly relevant in the elderly population. Overall, 9% of the
patients in our study had no axillary surgical staging procedures, consistent with the
literature. However, we were surprised by the high rates of ALND usage in women who
were clinically and pathologically node-negative. It is difficult to interpret the reasons
retrospectively, but this does represent potential surgical over-treatment in our cohort.

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Our results corroborate that older patients receive less adjuvant radiation therapy following
breast-conserving procedures [5, 25]. A report from the Netherlands Cancer Registry found
that women over 80 years old were 10 times less likely to receive adjuvant radiation therapy
compared to women less than 80 years of age [31]. Hughes et al. [11] randomized 636
women aged 70 and older with ER positive, Stage I breast cancer who underwent partial
mastectomy to receive tamoxifen alone or tamoxifen plus adjuvant radiation therapy. The
locoregional recurrence rate was 1% in the group receiving both tamoxifen and radiation
therapy and 4% in the group receiving tamoxifen only (p < 0.001), but there was no
difference in overall survival or distant disease recurrence. In contrast, a study of over 1800
women found a higher rate of death in patients not receiving adjuvant radiation therapy
following partial mastectomy [9]. This latter study, however, included women aged 65 and
older with Stage I and II disease. Current National Comprehensive Cancer Network
guidelines state that adjuvant radiation therapy may be omitted in selected older patients. At
our institution, all women aged 70 and older who undergo partial mastectomy are seen by
the radiation oncologists and a multidisciplinary decision is made.

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Systemic chemotherapy appears to provide elderly women the same benefit as in younger
women, and poorer outcomes have been reported for patients in whom chemotherapy is
omitted [5, 20, 32, 33]. Despite this, most studies report that elderly patients receive less
cytotoxic therapy than younger women [5, 20, 22, 25]. Few of our patients received
systemic chemotherapy. With respect to tumors with high risk characteristics, only 36% of
the patients with triple negative breast cancer received adjuvant chemotherapy, and only 1
patient with a Her-2neu-amplified cancer received trastuzumab. The reasons for low rates of
systemic chemotherapy use are likely multifactorial. Standard chemotherapy regimens may
expose elderly patients to increased morbidity with less benefit when compared to their
younger counterparts [11, 34]. Deviation from standard treatment guidelines may be a result
of patient co-morbidity and/or preferences as well [35]. Although we observed a low rate of
systemic chemotherapy use in our elderly patients, only 4.5% developed metastatic disease.
Thus, other patient factors not readily evident in the available patient and tumor data may
have resulted in the omission of systemic chemotherapy and/or trastuzumab secondary to
perceived lower risk of distant recurrence.
Limitations of this study include its retrospective nature and potential for selection bias. We
included only patients who underwent surgical therapy and were recorded in our surgical
database. We do not know how many elderly patients with significant or life-threatening comorbidities were not treated. We also do not know how many elderly patients may have
been treated with endocrine therapy alone. We also do not have information for many
patients regarding the reasons various surgical or adjuvant treatment options were performed
and/or omitted. The individual factors involved in these complex surgical-decision-making
processes were not discernible in the existing data. In addition, the extended time period
over which the patients were treated could contribute to the results, as improvements in
chemotherapy and hormonal therapy have been observed over time. We were unable to
control for changes in treatment recommendations that occurred during the study period,
such as the use of SLNB for axillary staging and trastuzumab for Her-2 neu amplified

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tumors. Finally, this represents a single institutional experience with a relatively small
patient cohort and results are difficult to extrapolate to other population-based data.

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In summary, there is disagreement within the literature regarding the biology, natural
history, and optimal treatment of breast cancer in elderly women. Our data show that elderly
women treated at our institution present with early-stage, ER- positive disease, even when
the majority are symptomatic at diagnosis. For women undergoing surgical therapy, more
extensive surgical resection was observed. Although endocrine therapy was utilized in
nearly all eligible patients, a minority of eligible patients received adjuvant radiation,
systemic chemotherapy, and/or trastuzumab. Overall, breast cancer-specific mortality was
low in our elderly population. Future institutional research will focus on standardizing
surgical treatment algorithms for elderly women with breast cancer. Randomized controlled
trials are necessary to determine optimal multidisciplinary treatment strategies for women of
advanced age.

Acknowledgments
We thank the Alvin J. Siteman Cancer Center at Barnes-Jewish Hospital and Washington University School of
Medicine in St. Louis, Missouri, for the use of the Biostatistics Core. The Core is supported in part by the National
Cancer Institute Cancer Center Support Grant #P30 CA91842 to the Siteman Cancer Center. We also thank Marsha
Woodall for her maintenance of the surgical breast cancer database.

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51

Curso de vero 2015

Cyr et al.

Page 9

NIH-PA Author Manuscript

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NIH-PA Author Manuscript

NIH-PA Author Manuscript
J Surg Oncol. Author manuscript; available in PMC 2014 January 27.

52

Curso de vero 2015

Cyr et al.

Page 10

Synopsis

NIH-PA Author Manuscript

Breast cancer in elderly women (80 years) is associated with favorable tumor biology.
Despite some differences in surgical and adjuvant treatment approaches, older women
with breast cancer are unlikely to suffer breast cancer-related mortality.

NIH-PA Author Manuscript

NIH-PA Author Manuscript
J Surg Oncol. Author manuscript; available in PMC 2014 January 27.

53

Curso de vero 2015

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Page 11

Table 1

Presentation and Diagnosis of 146 Breast Cancers in 134 Women Aged 80 and Older

NIH-PA Author Manuscript

Number

Percent

Routine mammography

65

44.5

Palpation

60

41.1

Breast disease follow-up

4.1

Axillary mass

2.0

Bloody nipple discharge

2.7

Unknown

1.4

Imaging an unrelated problem

1.4

Skin change

0.7

Breast pain

0.7

Incidental biopsy finding

0.7

Enlarging breast cyst

0.7

Ultrasound core

74

50.7

Stereotactic core

20

13.7

Excisional biopsy

12

8.2

Unspecified core

12

8.2

Fine needle aspiration

Presentation

Diagnosis

NIH-PA Author Manuscript

11

7.5

Palpation core

5.5

Unknown

2.7

Cyst aspiration

1.4

Skin punch biopsy

0.7

Duct excision

0.7

Axillary mass biopsy

0.7

NIH-PA Author Manuscript

J Surg Oncol. Author manuscript; available in PMC 2014 January 27.

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Curso de vero 2015

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Page 12

Table 2

Tumor Characteristics of 146 Breast Cancers in 134 Women Aged 80 and Older

NIH-PA Author Manuscript

Number

Percent

In situ

16

10.9

Tmic

2.1

T1a

4.1

T1b

25

17.1

T1c

47

32.2

T2

25

17.1

T3

4.1

T4

2.1

15

10.3

44

30.1

II

63

43.2

III

24

16.4

Tumor size

Unknown
Grade

NIH-PA Author Manuscript

Mixed

1.4

13

8.9

Positive

94

64.4

Negative

19

13.0

Unknown

33

22.6

Unknown
Estrogen receptor status

Her-2neu status
Amplified
Non-amplified
Unknown

11

7.5

101

69.2

34

23.3

NIH-PA Author Manuscript

J Surg Oncol. Author manuscript; available in PMC 2014 January 27.

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Cyr et al.

Page 13

Table 3

Surgical Treatment of 146 Breast Cancers in 134 Women Aged 80 and Older

NIH-PA Author Manuscript

Number

Percent

Breast Procedure
Partial mastectomy

72

49.3

Mastectomy

70

47.9

2.7

54

42.2

Other*
Axillary Procedure
SLNB
ALND

47

36.7

SLNB + ALND

11

8.6

No axillary staging

12

9.4

3.1

Other

MRM = modified radical mastectomy; SLNB = sentinel lymph node biopsy; ALND = axillary lymph node dissection
*

NIH-PA Author Manuscript

Includes 1 patient with unknown surgical resection, 1 excision of a chest wall recurrence, 1 patient who underwent mastectomy for an occult
breast primary, and 1 recurrence not yet resected.

Calculated as a percentage of invasive tumors.

Includes 2 patients with prior ALND and 2 patients with unknown axillary staging.

NIH-PA Author Manuscript

J Surg Oncol. Author manuscript; available in PMC 2014 January 27.

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NIH-PA Author Manuscript

NIH-PA Author Manuscript

NIH-PA Author Manuscript

Table 4

Elderly breast cancer characteristics in the literature

Current study

Evron [17]

Litvak [5]

Brunello [16]

Poltinnikov [18]

Laki [15]

Smith [25]

Yood [9]

134

135

354

260

106

538

56725

1837

Age

80+

80+

70+

70+

70+

70+

65+

65+

Median age

84

83

N/A

75.6 (mean)

76

N/A

76

N/A

J Surg Oncol. Author manuscript; available in PMC 2014 January 27.

Palpable

41%

80%

46%

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

T1

53%

90% T1 and T2

70% Stage I-II

53%

85%

41%

N/A

71%

T2

17%

90% T1 and T2

70% Stage I-II

43%

15%

49%

N/A

29%

T3

4%

N/A

N/A

3%

0%

N/A

N/A

N/A

IDC

64%

67%

71%

73%

90%

78%

N/A

N/A

ILC

10%

11%

12%

13%

10%

14%

N/A

N/A

ER positive

83%

76%

45%

80%

78%

84%

N/A

74%

Her-2 amplified

10%

N/A

N/A

N/A

22%

N/A

N/A

N/A

Partial mastectomy

49%

N/A

47%

55%

100%

72%

59%

47%

Radiation therapy*

47%

N/A

45%

65%

100%

100%

74%

74%

Antiestrogen therapy*

93%

N/A

67%

N/A

90%

N/A

N/A

N/A

Axillary staging performed

90%

N/A

N/A

90%

69%

89%

N/A

N/A

Nodal metastases

25%

44%

N/A

36%

23%

31%

N/A

N/A

Median follow-up (months)

34

70

N/A

30

55

91

N/A

N/A

Recurrence

4%

13%

N/A

N/A

N/A

9%

N/A

N/A

Cyr et al.

Table 4 legend:
N = Number of patients in sample; N/A = not available; IDC = invasive ductal carcinoma; ILC = invasive lobular carcinoma; ER = estrogen receptor.
*

Calculated as the percentage of patients eligible for therapy, rather than absolute numbers receiving therapy.

Calculated as the percentage of patients undergoing nodal staging who were found to have nodal metastases .

This study examined only women undergoing partial mastectomy with adjuvant radiation therapy.

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The Breast xxx (2014) 1e6

Contents lists available at ScienceDirect

The Breast
journal homepage: www.elsevier.com/brst

Original article

Treatment strategies in elderly breast cancer patients: Is there a need

for surgery?*
J.C. Sierink a, S.M.M. de Castro a, N.S. Russell b, M.M. Geenen c, E.Ph. Steller a,
B.C. Vrouenraets a, *
a

Department of Surgery, Sint Lucas Andreas Hospital, Jan Tooropstraat 164, 1061 AE, Amsterdam, The Netherlands
Department of Radiotherapy, The Netherlands Cancer Institute-Antoni van Leeuwenhoek Hospital, Plesmanlaan 121e123, 1066 CX,
Amsterdam, The Netherlands
c
Department of Internal Medicine, Sint Lucas Andreas Hospital, Jan Tooropstraat 164, 1061 AE, Amsterdam, The Netherlands
b

a r t i c l e i n f o

a b s t r a c t

Article history:
Received 10 December 2013
Received in revised form
1 July 2014
Accepted 12 August 2014
Available online xxx

Background: The aim of this study was to determine the role of surgery in elderly patients with breast
cancer.
Methods: Between 1999 and 2009, 153 consecutive women, 80 years old with breast cancer were
treated at our hospital. Surgically and non-surgically treated patients were compared with respect to
characteristics and survival.
Results: Treatment was surgical in 102 patients (67%). The non-surgically treated patients were older
than surgically treated patients, had more co-morbidity and were more often diagnosed with a clinically
T3/T4 tumour and distant metastasis. Patients not receiving surgery, had an 11% overall survival rate at 5year versus 48% in surgically treated patients (P < 0.001). Independent factors for survival were clinical
N0 status, M0 status at presentation and surgery.
Conclusion: One in three patients of 80 years and older did not have surgical treatment for breast cancer.
Patient not treated surgically are older, have more severe co-morbidity and are diagnosed with more
advanced disease than patients who underwent surgery.The selection of patients, who have a poor
prognosis, is made on clinical grounds not measurable with a common co-morbidity survey. Better and
evidence-based selection criteria for surgical and non-surgical treatment in these patients are needed.
2014 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Keywords:
Breast cancer
Elderly
Management

Introduction
Breast cancer is the most common cancer in women worldwide,
with 1.15 million new cases per year [1]. Increasing life expectancy
and aging of our population makes breast cancer among the elderly
of major concern. Unfortunately, older breast cancer patients are
still substantially underrepresented in cancer-treatment trials [2,3].
It is assumed that breast cancer characteristics are more
favourable among older patients than younger patients [4e7].
Despite this favourable disease pattern, some studies suggest that
elderly are consequently undertreated compared to younger
*
Presentations: The paper was presented as an oral presentation to the Annual
Meeting of the Dutch Surgical Society, Veldhoven, The Netherlands, May 2011.
* Corresponding author. Tel.: 31 20 5108740.
E-mail addresses: j.c.sierink@amc.nl (J.C. Sierink), stevedecastro@me.com
(S.M.M.
de
Castro),
n.russell@nki.nl
(N.S.
Russell),
m.geenen@slaz.nl
(M.M.
Geenen),
e.steller@slaz.nl
(E.Ph.
Steller),
bc.vrouenraets@slaz.nl
(B.C. Vrouenraets).

patients [8e14]. These assumptions are based on information from

large databases with few patients over 70 years of age, or from
small retrospective studies. A recent study compared patients aged
less than 65 years with patients of at least 75 years with respect to
adherence to treatment guidelines and showed that guidelines
were followed less often in patients over 75 years of age [15].
The aim of this study was to determine the management
strategy in patients with breast cancer in patients over 80 years of
age and, specically, to assess incidence and reasons for not undergoing surgery. Secondly, survival and prognostic factors for
survival were determined.
Patients and methods
Study population
All patients diagnosed with breast cancer in a large teaching
hospital between 1999 and 2009 were identied (n 1079). Data

http://dx.doi.org/10.1016/j.breast.2014.08.006
0960-9776/ 2014 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Please cite this article in press as: Sierink JC, et al., Treatment strategies in elderly breast cancer patients: Is there a need for surgery?, The Breast
(2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.breast.2014.08.006

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Curso de vero 2015

J.C. Sierink et al. / The Breast xxx (2014) 1e6

were derived from the hospital pathology records and were

checked with the Netherlands Cancer Registry of the Association
Comprehensive Cancer Centres, recording all cancer cases in the
Netherlands. Subsequently, all patients older than 80 years at
diagnosis were identied (n 167). Patients treated elsewhere
(n 2) and patients with missing data (n 12) were excluded. One
hundred-and-fty-three patients of 80 years and older were analysed in the present study.
Data collection
Data were collected retrospectively from patient charts and
computerized hospital databases. Physician notes and surgery- and
pathology records were also used. Recorded variables included date
of birth, date of diagnosis, symptoms at diagnosis, referral pattern,
co-morbidity at diagnosis, ndings at clinical breast examination,
cytological and histological data resulting from diagnostic procedures, surgery performed, reasons for omitting surgery, tumour
characteristics in terms of morphology, steroid receptor status and
HER2 expression, disease stage, adjuvant therapies, survival status
and cause of death.
Co-morbidity was classied according to the Adult Co-morbidity
Evaluation-27 index, which is proven to predict mortality in
different patient populations [16e18]. In this index, co-morbid
diseases are divided into different organ systems: cardiovascular,
respiratory, gastrointestinal, renal, endocrine, neurological, psychiatric, rheumatologic, immunological, malignancy, substance
abuse and body weight. The severity of the co-morbidity ranges
from 0 to 3. Grade 0 is considered as no co-morbidity, grade 1 as
mild, grade 2 as moderate and grade 3 as severe co-morbidity.
Reasons for omitting surgery were classied as follows: breast
cancer stage, patient preference, severe co-morbidity, age and
other reasons.
Breast cancer morphologic subtypes consisted of ductal and
lobular carcinoma, ductal carcinoma in situ, other carcinomas, and
unknown (no histological conrmation of diagnosis).
The steroid receptors were classied as positive (10%), negative (<10%) or unknown. HER2 over-expression is classied as
positive (immunohistochemical score of 3 or demonstrated by
FISH), negative or unknown.
Staging was done using the TNM-classication system (7th
edition) as formulated by the International Union Against Cancer
[19]. Patients lacking sufcient pathological stage information were
classied as stage unknown. Data on survival status and cause of
death were obtained from the clinical les and by telephone contact with the general practitioners who cared for the patient.
All patients were discussed in a multidisciplinary meeting.
Treatment modalities consisted of surgery (either mastectomy or
breast conserving therapy), radiotherapy (adjuvant or as single
treatment), chemotherapy and/or hormonal therapy.
Statistical analysis
The Pearson's Chi square Test, ManneWhitney U Test and Student's T-test for independent samples were used to compare
nominal, ordered categorical and interval variables respectively. If
study groups were too small for these tests, Fisher's Exact Test was
used. A KaplaneMeier curve was plotted for the 5-year survival
comparing patients who did undergo surgery with patients who
did not undergo surgery. Multivariable analysis was done using Cox
regression model for survival. Statistical tests were performed
against 2-sided alternatives and a level of P < 0.05 was used to
determine statistical signicance. SPSS software was used to
perform these analyses (version 19.0; SPSS Inc, Chicago, IL).

Results
Patient characteristics
Patient and tumour characteristics are summarized in Table 1.
The average age at diagnosis was 86 years. The most important
reason to seek medical attention was a palpable mass in 93 patients
(61%) and breast cancer found incidentally during routine
screening program in 35 patients (23%). The diagnosis was
conrmed with histologically in 134 patients (88%), cytologically in
13 patients (9%) and not conrmed in 6 patients (4%).
Tumour characteristics
Overall, 115 patients (75%) had a T1 or T2 tumour. Median
tumour size was 2 cm (interquartile ranges 1.5e2.7 cm). In 41

Table 1
Patient and tumour characteristics.
Patients
No.
Patient characteristics
Age, years
Mean
Standard deviation
80e84
85e89
90
Sex
Female
Male
Race
Caucasian
Non-Caucasian
ACE-27 score
Grade 0
Grade 1
Grade 2
Grade 3
History of contralateral BC
Synchronous bilateral BC
Tumour characteristics
Clinical tumour size
T1
T2
T3
T4
Clinical nodal status
Positive
Negative
M-stage at diagnosis
No (M0)
Yes (M1)
Morphology
Ductal carcinoma
Lobular carcinoma
DCIS
Other
Gradea,b
1, well
2, moderate
3, poor
Receptor statusa
ER and PR
HER2 over-expressiona
Positive
Negative

Missing data
%
0

86
4
67
75
11

44
49
7

151
2

98
2

129
13

84
9

31
50
48
22
8
8

20
33
32
15
5
5

45
70
15
11

28
46
10
7

41
101

27
66

137
14

90
9

73
29
5
27

48
19
3
18

20
46
18

14
31
12

12

8
45

5
31

No.

11

0
0

0
0

12

11

19

13

64

43

25

17

95

64

Abbreviations: ACE-27, Adult Co-morbidity Evaluation-27; BC, breast cancer; Mstage, distant metastasis stage; DCIS, ductal carcinoma in situ.
a
Total number of patients in this category is 148, since this variable is not
applicable in patients with DCIS.
b
Tumour grade was not known for the non-surgical treated patients.

Please cite this article in press as: Sierink JC, et al., Treatment strategies in elderly breast cancer patients: Is there a need for surgery?, The Breast
(2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.breast.2014.08.006

59

Curso de vero 2015

J.C. Sierink et al. / The Breast xxx (2014) 1e6

patients (27%), clinically suspected lymph nodes were found and

conrmed. Distant metastasis at the time of diagnosis was found in
14 patients (9%).
Of the patients in whom histology of the tumour was known, 73
patients (47%) had invasive ductal carcinoma while 29 patients
(19%) had invasive lobular carcinoma. Other forms of breast cancer
were found in 27 patients (18%) including: carcinoma not otherwise
specied (n 11), mucinous carcinoma (n 8), tubular carcinoma
(n 3), intra-cystic papillary carcinoma (n 3), meta-plastic carcinoma (n 1) and mixed ductal and mucinous carcinoma (n 1).
Co-morbidities
In two patients (1%), the co-morbidity status at time of breast
cancer diagnosis was unknown due to missing data. Of the 151
remaining patients, the severity of co-morbidity according to the
ACE-27 is shown in Table 1. Mild to severe co-morbidities were seen
in 120 patients (80%). Elderly patients were mostly affected by
cardiovascular and neurological disease. The most prevalent coexisting condition was hypertension, which affected 50 of the
elderly patients (33%).
Treatment strategies
Treatment strategies are depicted in Fig. 1. Fifty-one of the patients (33%) were not treated surgically.
Breast cancer stages I and II (n 80)
All patients with early-stage breast cancer received surgery as
primary treatment. Sixty-ve of these patients underwent mastectomy (81%) and the remaining breast conserving surgery (BCS).
In the early years, 41 patients (51%) with stage I and II breast cancer
underwent primary axillary lymph node dissection (ALND). The
percentage of lymph node involvement after primary ALND was
48%. Sentinel node biopsy (SNB) was performed in 32 patients
(44%) of whom 10 had tumour positive lymph nodes and subsequently underwent an ALND. All patients with BCS underwent
postoperative radiotherapy of the breast.
None of the patients received neo-adjuvant treatment. Postmastectomy radiotherapy was given in 10 patients (12%).

Hormonal therapy was given in 48 patients (60%). None of the

patients received chemotherapy as adjuvant treatment.
Breast cancer stage III and non-metastatic stage IV (n 18)
Eighteen patients (12%) had locally advanced disease and 10 of
these patients were treated with mastectomy. Breast conserving
surgery followed by radiotherapy was performed in one elderly
patient. Ten patients received primary ALND. SNB was performed in
one patient. Seven patients did not receive axillary surgery at all.
Adjuvant therapy was given in the form of post-mastectomy
radiotherapy in ve patients and hormonal therapy in eight
patients.
Seven patients were not treated with surgery: ve received
hormonal therapy and two were treated with radiotherapy.
Metastatic breast cancer (n 14) breast cancer stage IV (n 17)
There were 14 patients (9%) with metastatic disease. Two of
these patients were treated with surgery, see Table 2. Of the nonsurgically treated patients, nine patients received hormonal therapy, one received radiotherapy and two refused treatment.
Non-surgical treatment (n 51)
Seventeen of the 51 non-surgically treated patients were diagnosed with stage III or IV disease, two with ductal carcinoma in situ
and in 32 patients there was no pathologic disease stage. Documented reasons to withhold surgical treatment in these elderly
patients were patients' preference (n 19), disease stage (n 11),
co-morbidity (n 10), unknown reasons (n 9) and age (n 1)
One patient died before treatment started. Of the patients who did
not receive surgery, 43 patients (84%) received other treatments.
Thirty-eight of the patients (75%) received hormonal therapy, while
5 patients (10%) received radiotherapy.
Patients and tumour characteristics were compared for surgical
and non-surgical treatment (Table 2). Patients not treated surgically
were on average older than surgically treated patients (87 vs. 85
years, P 0.002). They were more often diagnosed with clinical T3/
T4 disease (31% vs. 12%, P 0.003) and distant metastasis (24% vs.
2%, P < 0.001). Patients who did not receive surgery had more severe co-morbidities compared to patients who received surgery. Of
the non-surgical treated patients, 31 patients (63%) had grade 2 and
3 co-morbidity versus 39 patients (38%) in the surgical group
(P 0.004).
Survival

Fig. 1. Initial treatment for patients with breast cancer at diagnosis. Abbreviations:
BCS, breast conserving surgery; RT, radiotherapy. * Four patients underwent ablation
after irradical BCS. Fifteen patients received radiotherapy after ablation.

Median follow-up period was 29 months (range 0e118). Median

follow-up of the living patients was 35 months (range 0e118). The
overall 5-year survival rate was 39% in patients over 80 years of age.
During follow-up, local recurrence was found in 2 patients (2.5%).
Overall, 87 patients (57%) died during follow-up. Eleven deaths
(13%) were breast cancer related, 18 patients (21%) died of cardiovascular, respiratory or neurological diseases, four patients died of
another form of cancer (5%), nine patients (10%) died of other
causes and in 45 patients (52%) cause of death could not be
retrieved.
Five-year overall survival in patients who received surgical
treatment was signicantly better than that in patients who did not
receive surgery (48% vs. 11%, P < 0.001). A KaplaneMeier curve of
survival comparing patients who did undergo surgical treatment
with patients who did not undergo surgical treatment is displayed
in Fig. 2.

Please cite this article in press as: Sierink JC, et al., Treatment strategies in elderly breast cancer patients: Is there a need for surgery?, The Breast
(2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.breast.2014.08.006

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J.C. Sierink et al. / The Breast xxx (2014) 1e6

Table 2
Univariable sample and tumour characteristics of patients over 80 years of age with
breast cancer by surgical treatment.
Surgical treatment

Patient characteristics
Age, years
Mean
Standard deviation
80e84
85e89
90
Sex
Female
Male
Race
Caucasian
Non-Caucasian
ACE-27 score
Grade 0
Grade 1
Grade 2
Grade 3
History of contra-lateral BC
Synchronous bilateral BC
Tumour characteristics
Clinical tumour size
T1
T2
T3
T4
Clinical nodal status
Positive
Negative
M-stage at diagnosis
No (M0)
Yes (M1)
Morphology
Ductal carcinoma
Lobular carcinoma
DCIS
Other
Gradeb,c
1, well
2, moderate
3, poor
Receptor statusb
ER and PR
HER2 over-expressionb
Positive
Negative

Yes (n 102)

No (n 51)

No.

No.

85
3
53
45
4

52
44
4

87
4
14
30
7

27
59
14

100
2

98
2

51
0

100
0

84
7

92
8

45
6

88
12

23
40
28
11
5
8

22
39
28
11
5
8

8
10
20
11
3
0

16
21
41
22
7
0

35
47
8
3

38
50
9
3

10
23
7
8

21
48
14
17

26
70

27
73

15
31

33
67

99
2

98
2

38
12

76
24

58
17
3
23

57
17
3
23

15
12
2
4
e

46
36
12
6
e

20
46
18

24
55
21

10

10

5
29

15
85

3
16

16
84

P-valuea

%
0.002

<0.001

0.314

0.419

0.010

0.703
0.057
0.003

0.497

<0.001

0.070

0.339
1.000

Abbreviations: ACE-27, Adult Co-morbidity Evaluation-27; BC, breast cancer; Mstage, distant metastasis stage; DCIS, ductal carcinoma in situ.
a
Statistical tests used were Mann Whitney U Test, Chi-square Test and Fisher's
Exact Test.
b
Total number of patients in this category is 148, since this variable is not
applicable in patients with DCIS.
c
Tumour grade was not known for the non-surgical treated patients.

Cox regression model of survival was used to perform multivariable analysis. Results are shown in Table 3. Independent factors
to predict better survival were a N0 status, M0 status and surgery
itself.
Discussion
In the present study 33% percent of the patients of 80 years and
older with breast cancer did not undergo surgery. These patients
were older, have more severe co-morbidity and were diagnosed
with more advanced disease than patients who underwent surgery.
These patients also had a decreased 5-year overall survival

compared with surgically treated patients. In multivariable analysis, surgical treatment itself appeared to be an independent predictor of survival while co-morbidity according to the ACE-27 was
not.
Most of the patients of 80 years and older had ductal and lobular
carcinomas, but other types of carcinomas (e.g. mucinous and
tubular carcinomas) occurred relatively more often compared to
what is found in literature. Eight percent of patients were diagnosed with hormone receptor negative tumours in line with several
studies showing that hormone negative disease is relatively uncommon among the elderly [4e7].
Several studies have shown that treatment of elderly patients
with breast cancer differs and that surgical treatment is often
omitted [9e14,20]. Co-morbidity has been described as the main
reason to withhold surgery for elderly patients [20,21], but in the
present study patients preference and stage of disease were equally
important. The attending physician might inuence' preference of
the patient, especially in the elderly. The present study found that
elderly patients with stage I and II breast cancer underwent more
extensive procedures. The majority of these elderly patients underwent mastectomy instead of breast conserving therapy. The
trend towards more extensive procedures in the elderly has been
described in several other studies [9e12,20,22,23]. These studies
hypothesize that elderly patients and their physicians nd cosmesis
after surgery less important, and that radiotherapy after BCS is
considered too demanding for the elderly. Multiple trials of BCS for
breast cancer have shown that postoperative irradiation decreases
the rate of ipsilateral recurrence but offers no survival benet
[24e26]. Risk of local recurrence is lower in older women, particularly those receiving adjuvant tamoxifen [27]. A randomized trial
evaluating tamoxifen alone or combined with radiotherapy in
women of 70 years who had small (T1) lymph node-negative, ERpositive breast cancer after BCS, found that the rate of local recurrence at 5 years was 1% in the radiotherapy combined with
tamoxifen group and t 4% in the tamoxifen group [28]. Given its
negative effect on the quality of life, the role of adjuvant radiotherapy is questionable in elderly patients with breast cancer.
In the present study, 51% of the elderly patients with stage I and
II disease received ALND. However only half of the patients turned
out to have lymph node involvement. This is partly due to the
introduction of sentinel node biopsy in 2001 in our hospital. A
study that analysed intra-operative lymphatic mapping on 86
breast cancer patients aged 70 years or older [28] found no sentinel
node in 15% of the cases and these cases had ALND. The value of
ALND is questionable in these patients and nowadays is reserved
only for patients with overt lymph node metastases and minimal
co-morbidity.
Several studies found a signicant decrease in the use of
chemotherapy when age increases [12,13,29,30]. This was also the
case in the present study where none of the elderly patients
received chemotherapy. Similarly, in the recent overview of randomized adjuvant therapy trials in early breast cancer [31], a
decreasing benet from chemotherapy was observed with
increasing age, even though only about 3% of the included patients
were 70 years or older. There are also studies that suggest that
selected elderly patients may benet from chemotherapy [31,32].
The benet of adjuvant chemotherapy in older patients is mainly
seen oestrogen-receptor-negative patients [33]. The optimal
chemotherapy regimens, doses and schedules for adjuvant treatment of elderly patients have not yet been dened, while concern is
increasing regarding the toxicity in this patient population. A
recent on-going trial on chemotherapy in elderly patients with
breast cancer reported a signicantly hampered accrual rate. Patient's refusal or preference for a particular type of treatment, and
an overall condition considered as too t or too frail for inclusion

Please cite this article in press as: Sierink JC, et al., Treatment strategies in elderly breast cancer patients: Is there a need for surgery?, The Breast
(2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.breast.2014.08.006

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J.C. Sierink et al. / The Breast xxx (2014) 1e6

Fig. 2. KaplaneMeier analysis for survival comparing patients who were and who were not treated surgically.

are reported reasons for not participating [34].Another recent trial

suggests the use of a comprehensive geriatric assessment as an
addition to the decision-making process. In this study the number
of geriatric conditions was associated with chemotherapy-related
toxicity and survival [35].
The majority of the patients in the present study had their comorbidity status well documented. The ACE-27 has been proven
to be a reliable index to predict mortality [4,10,11]. Unlike
numerous other studies, this study evaluated not only the consequences of avoidance of surgery on survival, but made adjustments for co-morbidity. This study found that the management of
elderly patients with breast cancer is inuenced by the comorbidity of the patient according to ACE-27. This is especially
important since patients with severe co-morbidities have a
decreased survival rate [36]. The apparent benet of surgery in

Table 3
Multivariable Cox regression model of OS in elderly patients with breast cancer.

Covariates
Clinical tumour size
<2 cm (T1)
2 to <3 cm (T2)
 3 cm (T3)
 5 cm (T4)
ACE-27 score
Grade 0
Grade 1
Grade 2
Grade 3
Dichotomous variablesa
Clinical N0
M0 at diagnosis
Surgery

Hazard ratio

95% Condence interval

P-value

1.00
1.4
1.2
0.9

0.8e2.4
0.5e2.9
0.3e2.5

0.255
0.610
0.850

1.00
0.6
1.5
2.3

(0.3e1.2)
(0.8e2.9)
(1.0e5.2)

0.117
0.257
0.410

0.4
5.3
1.9

(0.3e0.8)
(2.1e13.7)
(1.0e3.4)

0.002
0.001
0.039

Note. Affected organ systems were excluded since there are already incorporated in
the ACE-27 score.
Abbreviations: OS, overall survival; ACE-27, Adult Co-morbidity Evaluation-27; N0,
no affected lymph nodes; M0, no distant metastasis.
a
Reference group is the group without the characteristic.

our series is probably due to patient selection for surgery. In

other words, futile surgery in patients with a poor prognosis and
severe comorbidity was generally avoided. A recent study that
evaluated the impact of adjuvant radiotherapy in women over 75
years with early (stage) breast cancer also found an association
between co-morbidity and survival [37]. Patients with moderate
to severe co-morbidities according to the ACE-27 had a signicantly decreased survival compared to patients with no or mild
co-morbidities.
Limitations
The present study has some limitations. Since medical charts
were retrospectively studied it was not possible to collect all information needed. For instance the HER2 status, treatment motives
and cause of death were missing. A large proportion of patients had
unknown HER2 status and unknown cause of death, making the
remaining number of patients too small to draw reliable conclusions. Analysis of reasons to withhold surgery from elderly patients
may not do justice to the rich detail of all considerations taken into
account when the treating physician recommends a treatment
plan.
Conclusion
One in three patients of 80 years and older did not have surgical
treatment for breast cancer. Patient not treated surgically are older,
have more severe co-morbidity and are diagnosed with more
advanced disease than patients who underwent surgery. The selection of patients, who have a poor prognosis, is made on clinical
grounds not measurable with a common co-morbidity survey.
Better and evidence-based selection criteria for surgical and nonsurgical treatment in these patients are needed.
Sources of funding
There were no sources of funding for this research.

Please cite this article in press as: Sierink JC, et al., Treatment strategies in elderly breast cancer patients: Is there a need for surgery?, The Breast
(2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.breast.2014.08.006

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Conict of interest statement

All authors have no conicts of interest to declare.
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Please cite this article in press as: Sierink JC, et al., Treatment strategies in elderly breast cancer patients: Is there a need for surgery?, The Breast
(2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.breast.2014.08.006

63

Curso de vero 2015

VOLUME

31

NUMBER

19

JULY

2013

JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

ONCOLOGY GRAND ROUNDS

Should a Woman Age 70 to 80 Years Receive

Radiation After Breast-Conserving Surgery?
Jaroslaw T. Hepel, Rhode Island Hospital, Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI
David E. Wazer, Tufts Medical Center, Tufts University School of Medicine, Boston, MA; and Rhode Island Hospital, Alpert
Medical School of Brown University, Providence, RI
See accompanying article on page 2382
The Oncology Grand Rounds series is designed to place original reports published in the Journal into clinical context. A case
presentation is followed by a description of diagnostic and management challenges, a review of the relevant literature, and
a summary of the authors suggested management approaches. The goal of this series is to help readers better understand how
to apply the results of key studies, including those published in Journal of Clinical Oncology, to patients seen in their own
clinical practice.

Case 1: A 72-year-old woman presents with a palpable mass detected during yearly physical examination by
her primary care physician. She has controlled hypertension and remains active, playing tennis three times a
week. Physical examination reveals a 1.5 cm mass in the upper outer quadrant of the left breast with no
palpable axillary lymphadenopathy. Diagnostic imaging reveals a suspicious mass, and core biopsy confirms
invasive ductal carcinoma (IDC) that is estrogen receptor moderately positive (60%), progesterone receptor
negative and Her2-neu that is not overexpressed. She undergoes a wide local excision and sentinel node
biopsy. Pathology reveals a 1.5 cm IDC that is high grade without lymphovascular invasion (LVI). The
margins are negative with the closest laterally at 2 mm. One sentinel node is negative for metastasis.
Case 2: A 72-year-old woman presents with an abnormal screening mammogram that shows a small area of
architectural distortion in the upper outer quadrant of the left breast (Fig 1). She is a former smoker with
mild chronic obstructive pulmonary disease and has mild to moderately symptomatic osteoarthritis managed with a nonsteroidal anti-inflammatory agent. She remains active and independent. Physical examination reveals neither palpable breast mass nor axillary lymphadenopathy. Diagnostic ultrasound confirms a
1.8 cm mass, and core biopsy reveals IDC that is estrogen and progesterone receptor strongly positive (>
90%) and Her2-neu that is not overexpressed. She undergoes a wide local excision and sentinel node biopsy.
Pathology reveals a 1.9 cm IDC that is low grade. The margins are widely negative at > 5 mm and there is no
LVI. One sentinel node is negative for metastasis.
CHALLENGES IN DIAGNOSIS AND MANAGEMENT

Radiation therapy represents an integral part of breast-conserving

therapy (BCT), as multiple trials have consistently shown increased
rates of ipsilateral breast tumor recurrence (IBTR) in women undergoing breast-conserving surgery when radiation therapy is omitted. In
addition to the effect on local tumor recurrence, radiotherapy after
breast-conserving surgery reduces the risk of death, as demonstrated
in the recent update of the Early Breast Cancer Trialists Collaborative
Group (EBCTCG) meta-analysis, where radiotherapy was found to
lower the risk of breast cancer death by one sixth.1
The local management of older patients with early stage breast
cancer presents a special set of challenges. In an elderly patient, toxicity
concerns may be more prominent than for a younger patient and, as
such, often influence the assessment of the risks and benefits of any
Journal of Clinical Oncology, Vol 31, No 19 (July 1), 2013: pp 2377-2381

treatment course. Even so, clinicians must be mindful to avoid subtle

or overt discrimination that can manifest by withholding treatment
based solely on chronologic age. When making decisions about
therapeutic options, it is appropriate to consider what is sometimes
characterized as biologic age, which can be roughly described as an
estimate of life expectancy assessed through an evaluation of competing risks for mortality from comorbid conditions. Clearly, if a
patient with breast cancer is expected to receive no discernable
benefit from local radiation therapy and to experience death from
a cause unrelated to breast cancer, then it makes little sense to
subject her to the financial cost and the risk of adverse effects
associated with the treatment.
The biology of breast cancer varies considerably with age, and it is
independent of other known tumor-related characteristics.2 Increasing age has been shown to inversely correlate with the risk for local and
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Hepel and Wazer

Fig 1. Left breast cranial-caudal view mammogram depicting a small area of

architectural distortion suspicious for malignancy (black arrow). This abnormality was confirmed on spot compression views (not shown) and was new
compared with previous mammography 1 year earlier. An ultrasound and
biopsy were recommended.

distant disease recurrence and positively correlates with the likelihood

of disease-specific survival.1,3 Patients older than age 70 typically have
low-grade, strongly estrogen receptor (ER) positive tumors that have
an indolent natural history. However, this is not the case for all older
patients, and, as such, factors that influence risk of local and systemic
recurrence need to be considered for each individual.
Treatment options for early-stage breast cancer in elderly
patients commonly considered after breast-conserving surgery include observation, endocrine therapy alone, endocrine therapy
combined with radiation therapy, and radiation therapy alone. In
2378

2013 by American Society of Clinical Oncology

contemporary clinical practice, endocrine therapy consists of either tamoxifen or an aromatase inhibitor administered daily for a
period of at least 5 years. Adverse effects can include hot flashes,
thrombotic events, and risk of endometrial cancer with tamoxifen,
and hot flashes, arthralgias, and osteoporosis with aromatase inhibitors. Some of these adverse effects can be sufficiently bothersome to patients to result in as many as one third becoming
noncompliant with the full prescribed course of endocrine therapy.4,5 Radiation therapy typically consists of irradiation of the
whole breast using a standard fractionated regimen delivered 5
days per week during a 6- to 7-week course. Adverse effects include
fatigue and local skin irritation during treatment and long-term
risks of rib fracture, pneumonitis, and cardiac injury. Although the
adverse effect profile of endocrine therapy and radiation therapy
are both favorable, relatively minor adverse effects that are well
tolerated by a younger patient may be much more significant in an
older patient. For example, aromatase inhibitorrelated arthralgias
or radiation-related fatigue has the potential of reducing a wellfunctioning older patient to one who is dependent in activities of
daily living.
Recently, more convenient short-course radiation therapy
options have become available. Hypofractionated whole-breast
radiation therapy is delivered in approximately 312 weeks and has
been shown to be equally well tolerated and as effective as standard
fractionated treatment.6 In addition, older, low-risk breast cancer
patients are classified by consensus statement of the American
Society for Radiation Oncology as suitable for accelerated partial
breast irradiation (APBI), which can be delivered during 1 week
or less.7
The choice of radiation therapy approach is complex and dependent on both technique-specific considerations and patient preference. Hypofractionated whole-breast radiation therapy is appropriate
for most older patients. Patients with a large body habitus or large
breast size may not be ideal candidates for this approach, as the normal
tissue effects resulting from radiation dose inhomogeneity are magnified by using hypofractionation and may result in a higher risk of acute
and late toxicity.8 APBI can be considered for patients at low risk for
recurrence beyond the immediate tumor bed. According to the American Society for Radiation Oncology Consensus Statement, patients
felt to be most appropriate for APBI are women older than 60 years
with T1N0 tumors that are unifocal, ER positive, without LVI, and
have  2 mm negative margins 7. APBI may be a preferred option for
patients with suboptimal lung or cardiac anatomy, where tangential
whole breast irradiation would place these organs at excessive risk.
APBI may also be a good option for patients with large breast size, as
acute skin toxicity can be minimized as compared to whole breast
irradiation. The APBI techniques that are associated with the most
mature outcome data are interstitial multicatheter and intracavitary
balloon catheter brachytherapy. As both techniques are invasive, they
may not be acceptable to some patients. Novel minimally invasive or
noninvasive APBI techniques are currently under investigation that
may expand future options for APBI.
The patients perspective as to the optimal course of therapy is
often not limited to just the potential adverse effects, but may also
extend to the convenience and lifestyle impact of the treatment course
itself. As such, some will prefer the simplicity of an extended course of
a daily oral medication to the disruption in daily routine that is associated with daily irradiation. Conversely, others will prefer a brief
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Radiation After BCS for Women Older Than 70 Years

Table 1. Absolute Risk Reduction at 10 Years in First Recurrence With

Radiation Therapy on the Basis of Data From the EBCTCG Meta-Analysis
Women  70 Years of Age With T1N0 and ER-Positive Tumors Treated
With Lumpectomy
Tumor Grade

Tamoxifen

No Tamoxifen

Low
Intermediate
High

5
9
20

11
19
38

NOTE. Table numbers represent absolute difference (%) in the rate of first
recurrence between patients who received no radiation compared with those
who received radiation. First recurrence includes locoregional or distant
recurrence. Data from Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group
(EBCTCG) meta-analysis.1
Abbreviation: ER, estrogen receptor.

period of radiation therapy over committing to consumption of a

daily pill for 5 or more years.
SUMMARY OF THE RELEVANT LITERATURE

As noted, the EBCTCG meta-analysis of BCT showed a 50% reduction (35% v 19%) in recurrence with whole breast radiation therapy. Of note, however, a statistically significant increase in overall
survival was limited to those patients for whom radiotherapy resulted in a recurrence reduction of 10% or greater.1 In light of this
threshold relationship between risk reduction in local failure and
subsequent impact on breast cancer mortality, the clinical value of
radiotherapy must be carefully considered in patients at low risk
of recurrence.
There has been considerable effort expended during the past two
decades to identify a cohort of patients at sufficiently low risk for local
failure for whom radiation therapy may be safely omitted. The National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B21 trial randomly
assigned 1,009 women of all ages with small tumors ( 1.0 cm) that
were ER positive to tamoxifen alone, radiation therapy alone, or tamoxifen and radiation therapy.9 In a separate trial, Fyles et al10 enrolled 769 women older than age 50 with T1or2N0 tumors that were
ER positive and randomly assigned them to tamoxifen alone or tamoxifen and radiation therapy. In these putatively low-risk patient

populations that spanned a broad spectrum of ages, both trials found

a  10% increase in local failure when radiation therapy was omitted.
Cancer and Leukemia Group B (CALGB) study 9343 incorporated older age as a prognostic variable in identifying a patient population suspected to be at particularly low risk for recurrence.
Consistent with all prior randomized studies of BCT, the initial report
of this trial after 5 years of follow-up showed a statistically significant
lower rate of local failure with the addition of radiation therapy.11
However, the 3% absolute reduction in the rate of local failure with
radiotherapy was of dubious clinical significance, as there was no
difference in the rates of subsequent mastectomy, distant metastases,
or overall survival. On the basis of these findings, the treatment guidelines of the National Comprehensive Cancer Network were revised to
state that radiotherapy may be reasonably omitted in women age 70 or
older with ER-positive, stage I breast cancer who receive antiestrogen
endocrine therapy.12
Remarkably, the initial results of CALGB 9343 and the subsequent revision in the National Comprehensive Cancer Network
guidelines appeared to have minimal effect on the use of radiation
therapy in older patients,13 perhaps as a result of fear that with longer
follow-up these findings might not persist. To address these concerns,
an update of CALGB 9343 has been reported with a median follow-up
duration of 12.6 years.14 At 10 years, two thirds of the patients remained alive, and a statistically significant lower local failure rate
continued to be associated with the administration of radiation therapy (2% v 10%). However, as with the earlier report, radiation therapy
remained of minimal clinical value, as no difference was seen in the
rate of subsequent mastectomy, breast cancerspecific survival, or
overall survival. These results provide compelling confirmation of
high-quality level I evidence that for this select patient population, the
administration of tamoxifen and the omission of radiation therapy is a
safe and reasonable treatment approach.
The CALGB 9343 trial, however, is deficient in some important
respects that limit the application of its findings to all older women
with T1N0 estrogen receptorpositive breast cancer. First, a subgroup
analysis has not been performed that evaluates the impact of factors
known to influence the risk of locoregional recurrence, including LVI
and tumor grade. The EBCTCG meta-analysis showed that for patients with T1N0 estrogen receptorpositive tumors, high tumor

Table 2. Suggested Algorithm for Management of Women Older Than Age 70 Years With T1N0 and ER-Positive Invasive Breast Cancer
Life
Expectancy

Risk Assessment

 2 to 5 years Severe comorbidity and minimal risks for

local or systemic recurrence
 5 years
Low risk for local or systemic recurrence

Considerations

Treatment
Observation

Relative side effects of treatment with radiation Endocrine therapy alone or radiation therapy alone
(CVD, COPD, or lung disease); tamoxifen
(risk of thromboembolism); or aromatase
inhibitor (arthritis/joint symptoms,
osteoporosis)
Dominant risk for local recurrence only
Risk factors: close or focally positive margins
Radiation therapy alone
not amenable to re-excision
Moderate to high risk for local and systemic Risk factors: high grade, LVI, high recurrence
Endocrine therapy and radiation therapy
recurrence
score on multigene panel, or overexpression
of HER2/neu (consider chemotherapy)

Abbreviations: COPD, chronic obstructive pulmonary disease; CVD, collagen vascular disease; ER, estrogen receptor; HER2, human epidermal growth factor
receptor 2; LVI, lymphovascular invasion.

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Hepel and Wazer

grade is associated with markedly increased local failure risk, translating to a large absolute benefit for radiation therapy in patients treated
with or without tamoxifen (Table 1).1 A similar increase in risk might
be encountered in the presence of other adverse pathologic findings,
such as LVI. Therefore, it is impossible to definitively declare that there
are no subpopulations within the cohort of older patients with T1N0
estrogen receptorpositive tumors who may be at substantial risk of
local failure with tamoxifen alone and may show a clinically meaningful benefit with the addition of radiation therapy. Second, there is a
lack of information related to other prognostic variables, including
performance status, extent of medical comorbidities, and Her2-neu
receptor status. Third, the design of CALGB 9343 was limited in scope
as to the full range of possible treatment options that might be considered in these patients, in that it did not address the use of observation
or radiation therapy alone. Most of the patients enrolled in CALGB
9343 were at low risk of both local and systemic recurrence. Therefore,
the benefit of tamoxifen was likely predominantly limited to reduction
of recurrence in the breast. The more relevant and practical clinical
question faced in the management of the low-risk older patient with
multiple comorbidities, limited life expectancy, and narrow tolerance
to treatment adverse effects may not be tamoxifen versus tamoxifen
plus radiation therapy, but tamoxifen alone versus radiation therapy
alone versus observation only after local excision. Unfortunately, we
lack prospective evaluation of the relative recurrence risk, compliance
rate, toxicity, and quality of life assessment associated with the full
spectrum of management approaches that are often considered in
older patients.
SUGGESTED APPROACHES TO MANAGEMENT

Table 2 outlines a suggested approach to the local management of

patients older than age 70 with estrogen receptorpositive stage I
breast cancer. The dominant considerations are life expectancy and
comorbid conditions. A thorough evaluation of medical history as
well as performance status and overall function are critical for making
this assessment. At the extreme, patients with severe medical comorbidity, a short life expectancy, and low-risk breast cancer are unlikely
to experience local or systemic benefit from either endocrine therapy
or radiation therapy. After wide excision of the local tumor, observation alone may be a reasonable option. For severely debilitated patients
who are poor operative risks, endocrine therapy alone can be considREFERENCES
1. Darby S, McGale P, Correa C, et al: Effect of
radiotherapy after breast-conserving surgery on 10year recurrence and 15-year breast cancer death:
Meta-analysis of individual patient data for 10,801
women in 17 randomized trials. Lancet 378:17071716, 2011
2. Schonberg MA, Marcantonio ER, Li D, et al:
Breast cancer among the oldest old: Tumor characteristics, treatment choices, and survival. J Clin
Oncol 28:2038-2045, 2010
3. Antonini N, Jones H, Horiot JC, et al: Effect of
age and radiation dose on local control after breast
conserving treatment: EORTC trial 22881-10882.
Radiother Oncol 82:265-271, 2007
4. Owusu C, Buist DS, Field TS, et al: Predictors
of tamoxifen discontinuation among older women
2380

2013 by American Society of Clinical Oncology

ered after core needle biopsy.15,16 However, for the majority of older
women with early breast cancer and life expectancy  5 years, treatment options should be tailored based on specific risk factors that
influence the likelihood of local or systemic recurrence.
The patient presented in case 1 has an excellent performance
status, minimal comorbidity, and a life expectancy that likely exceeds
10 years. Unfortunately, her tumor is moderately positive for estrogen
receptor and has significant risk for both local and systemic recurrence
with high tumor grade. This patients estimated IBTR risk is  15%
and her estimated systemic relapse risk is  20%.Whole breast radiotherapy combined with endocrine therapy would be recommended.
Case 2 presents a patient with moderate comorbidity but a good
performance status and a life expectancy of at least 5 years. She has a
favorable breast cancer that is at low risk for systemic recurrence. Her
dominant recurrence risk is local. To reduce this risk, either radiation
therapy or endocrine therapy is appropriate, as either approach would
be expected to result in an IBTR risk of less than 10% at 10 years. The
decision between endocrine therapy and radiation therapy should be
based on potential treatment-related adverse effects, as well as patient
preference. As this patient has chronic obstructive pulmonary disease,
any consideration of whole breast radiotherapy would need to include
an assessment of her thoracic anatomy and potential irradiated volume of lung in order to minimize the risk of pneumonitis and compromised lung function. An alternative to whole breast radiation
therapy is APBI, as minimal lung tissue is irradiated with most partial
breast irradiation techniques. With respect to endocrine therapy, she
has mild to moderate arthritis, which may be exacerbated if she is
given an aromatase inhibitor. This patient was offered the choice of an
aromatase inhibitor, hypofractionated whole breast radiation therapy,
or APBI. After a comprehensive discussion of options, she elected
endocrine therapy.
AUTHORS DISCLOSURES OF POTENTIAL CONFLICTS
OF INTEREST
The author(s) indicated no potential conflicts of interest.

AUTHOR CONTRIBUTIONS
Manuscript writing: All authors
Final approval of manuscript: All authors

with estrogen receptorpositive breast cancer.

J Clin Oncol 26:549-555, 2008
5. Henry NL, Azzouz F, Zereunesay D, et al:
Predictors of aromatase inhibitor discontinuation as
a result of treatment-emergent symptoms in earlystage breast cancer. J Clin Oncol 30:936-942, 2012
6. Whelan TJ, Pignol JP, Levine MN, et al: Longterm results of hypofractionated radiation therapy for
breast cancer. N Engl J Med 362:513-520, 2010
7. Smith BD, Arthur DW, Buchholz TA, et al:
Accelerated partial breast irradiation consensus
statement from the American Society for Radiation
Oncology (ASTRO). Int J Radiat Oncol Biol Phys
74:987-1001, 2009
8. Smith BD, Bentzen SM, Correa CR, et al:
Fractionation for whole breast irradiation: An American Society for Radiation Oncology (ASTRO)
evidence-based guideline. Int J Radiat Oncol Biol
Phys 81:59-68, 2011

9. Fisher B, Bryant J, Dignam, J, et al: Tamoxifen, radiation therapy, or both for prevention of
ipsilateral breast tumor recurrence after lumpectomy in women with invasive breast cancers of one
centimeter or less. J Clin Oncol 20:4141-4149, 2002
10. Fyles A, McCready D, Manchul L, et al: Tamoxifen with or without breast irradiation in women
50 years of age or older with early breast cancer.
N Engl J Med 351:963-970, 2004
11. Hughes KS, Schnaper LA, Berry D, et al:
Lumpectomy plus tamoxifen with or without irradiation in women 70 years of age or older with early
breast cancer. N Engl J Med 351:971-977, 2004
12. National Comprehensive Cancer Network:
NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology:
Breast Cancer. http://www.nccn.org
13. Soulos PR, Yu JB, Roberts KB, et al: Assessing the impact of a cooperative group trial on breast
cancer care in the Medicare population. J Clin Oncol
JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

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Radiation After BCS for Women Older Than 70 Years

30:1601-1607, 2012
14. Hughes KS, Schnaper LA, Bellon JR, et al:
Lumpectomy plus tamoxifen with or without irradiation in women age 70 years or older with early
breast cancer: Long-term follow-up of CALGB 9343.
J Clin Oncol 31:2382-2387, 2013

15. Hind D, Wyld L, Reed MW: Surgery, with or

without tamoxifen, vs tamoxifen alone for older
women with operable breast cancer: Cochrane review. Br J Cancer 96:1025-1029, 2007
16. Wink CJ, Woensdregt K, Nieuwenhuijzen GA,
et al: Hormone treatment without surgery for

patients aged 75 years or older with operable breast

cancer. Ann Surg Oncol 19:1185-1191, 2012

DOI: 10.1200/JCO.2012.48.3875; published

online ahead of print at www.jco.org on May
20, 2013

Conquer Cancer Foundation of the American Society of Clinical Oncology

The Conquer Cancer Foundation is working to create a world free from the fear of cancer by funding breakthrough
research, by sharing knowledge with physicians and patients worldwide, and by supporting initiatives to ensure that all
people have access to high-quality cancer care. Working in close collaboration with a global network of top scientists and
clinicians, as well as leading advocacy and research organizations, the Foundation draws on the passion and expertise of
the more than 30,000 oncology professionals who are members of its affiliate organization, the American Society of Clinical
Oncology (ASCO). To learn how you can help support the Foundation, visit:
ConquerCancerFoundation.org.

www.jco.org

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2381

Curso de vero 2015

original articles

Annals of Oncology

28. Eiermann W, Pienkowski T, Crown J et al. Phase III study of doxorubicin/

cyclophosphamide with concomitant versus sequential docetaxel as adjuvant
treatment in patients with human epidermal growth factor receptor 2-normal,
node-positive breast cancer: BCIRG-005 trial. J Clin Oncol 2011; 29:
38773884.
29. Martin M, Mackey J, Pienkowski T et al. Ten-Year Follow-Up Analysis of the
BCIRG 001 Trial Conrms Superior DFS and OS Benet of Adjuvant TAC
(Docetaxel, Doxorubicin, Cyclophosphamide) over FAC (uorouracil, Doxorubicin,
Cyclophosphamide) in Women with Operable Node-Positive Breast Cancer.
Cancer Research 2010; 70: (suppl. abstr S4-3).
30. Hugh J, Hanson J, Cheang MC et al. Breast cancer subtypes and response to
docetaxel in node-positive breast cancer: use of an immunohistochemical
denition in the BCIRG 001 trial. J Clin Oncol 2009; 27: 11681176.
31. Dowsett M, Nielsen TO, AHern R et al. Assessment of Ki-67 in Breast Cancer:
Recommendations from the International Ki-67 in Breast Cancer Working Group.
J Natl Cancer Inst, 2011; 103: 16561664.
32. Jacquemier J, Penault-Llorca F, Mnif H et al. Identication of a basal-like
subtype and comparative effect of epirubicin-based chemotherapy and sequential
epirubicin followed by docetaxel chemotherapy in the PACS 01 breast cancer
trial: 33 markers studied on tissue-microarrays (TMA). J Clin Oncol 2006; 24:
(suppl. abstr 2509).
33. Coates AS, Colleoni M, Goldhirsch A. Is adjuvant chemotherapy useful for
women with luminal A breast cancer? J Clin Oncol 2012; 30: 12601263.

Annals of Oncology 24: 12111219, 2013

doi:10.1093/annonc/mds642
Published online 18 January 2013

Adjuvant chemotherapy in elderly women with breast

cancer (AChEW): an observational study identifying
MDT perceptions and barriers to decision making
A. Ring1, H. Harder2, C. Langridge2, R. S. Ballinger2 & L. J. Falloweld2*
1

Brighton and Sussex Medical School, Sussex Cancer Centre, Royal Sussex County Hospital, Brighton; 2Sussex Health Outcomes Research and Education in Cancer
(SHORE-C), Brighton and Sussex Medical School, University of Sussex, Brighton, UK

Received 10 September 2012; revised 31 October 2012; accepted 23 November 2012

Background: As few older women with breast cancer receive adjuvant chemotherapy, we examined the barriers and
perceptions of 24 UK NHS multidisciplinary breast cancer teams to offering this treatment to women 70 years.

Patients and methods: Questionnaires regarding 803 patients with newly diagnosed breast cancer were completed
by specialist teams following discussion or outpatient consultation.
Results: Of 803 patients, 116 (14%), all <85 years, were offered chemotherapy and 66 (8%) received it. Only 94 of
309 (30%) of women with high-risk disease were offered chemotherapy, and 53 (17%) received it. The most common
reasons for not offering chemotherapy were other treatments more appropriate (usually patients with ER-positive
tumours) or benets too small (63% and 54% of patients, respectively). Co-morbidities and frailty were less common
reasons but became more frequent with increasing age. Recommendations regarding chemotherapy were made in the
absence of documented HER2 and performance status in 29% and 33%, respectively. Treatment offered varied
considerably between cancer centres.
Conclusions: National guidelines need development describing the minimally acceptable data for decision making,
incorporating objective tness measures and specic treatment recommendations. Such guidelines will require

Downloaded from http://annonc.oxfordjournals.org/ at Instituto Nacional do Cncer (INCA) on November 17, 2014

21. Laporte S, Jones S, Chapelle C et al. Consistency of Effect of DocetaxelContaining Adjuvant Chemotherapy in Patients with Early Stage Breast Cancer
Independent of Nodal Status: Meta-Analysis of 12 Randomized Clinical Trials.
Cancer Research 2009; 69 (24 Suppl): Abstract nr 605.
22. Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group. Comparisons between different
polychemotherapy regimens for early breast cancer: meta-analyses of long-term
outcome among 100,000 women in 123 randomised trials. Lancet 2012; 379:
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23. Sparano JA, Wang M, Martino S et al. Weekly paclitaxel in the adjuvant
treatment of breast cancer. N Engl J Med 2008; 358: 16631671.
24. Harvey V, Mouridsen H, Semiglazov V et al. Phase III trial comparing three doses
of docetaxel for second-line treatment of advanced breast cancer. J Clin Oncol
2006; 24: 49634970.
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Administration of Docetaxel after Standard FEC Regimen for Node-Positive Breast
Cancer: Long-Term Follow-Up Results of the FNCLCC-PACS 01 Trial. Cancer
Research 2009; 69 (24 Suppl): Abstract nr 603.
26. Cognetti F, De Laurentiis M, De Matteis L et al. Sequential epirubicindocetaxel
CMF as adjuvant therapy for node-positive early stage breast cancer: updated
results of the TAXit216 randomized trial. Annals of Oncology 2008; 19:
viii77viii88.
27. Swain SM, Jeong JH, Geyer CE, Jr et al. Longer therapy, iatrogenic amenorrhea,
and survival in early breast cancer. N Engl J Med 2010; 362: 20532065.

*Correspondence to: Prof L. J. Falloweld, Sussex Health Outcomes Research and

Education in Cancer (SHORE-C), Brighton and Sussex Medical School, University of
Sussex, Falmer, Brighton BN1 9QG, UK. Tel: +44-1273-873015; Fax: +44-1273873022; E-mail: l.j.falloweld@sussex.ac.uk

The Author 2013. Published by Oxford University Press on behalf of the European Society for Medical Oncology.
All rights reserved. For permissions, please email: journals.permissions@oup.com.

69

Curso de vero 2015

original articles

Annals of Oncology

educational support for implementation but should standardise care and improve chemotherapy uptake in this
increasing population of older patients.
Key words: adjuvant chemotherapy, breast cancer, clinical decision making, elderly women

introduction

methods
study design and patients
A study-specic questionnaire was developed by the research team (the
authors) and through feedback from additional clinicians. This two-page
questionnaire asked clinicians to provide prospectively details about
individual patient characteristics and treatment decisions. For each patient,
the following data were recorded: tumour characteristics, treatment setting,
performance status and whether the questionnaire was completed after a

| Ring et al.

70

study conduct
Eligible patients were women aged 70 years with a diagnosis of early
breast cancer. Participating centres were asked to complete prospectively
one questionnaire per patient either after a multidisciplinary team
discussion or after a patient consultation depending on where the clinical
decision was nally made. Patients who were offered chemotherapy
following a consultation with an oncologist were given a participant
information sheet inviting them to take part in an interview with a
researcher exploring attitudes and decision making regarding
chemotherapy (the results of this sub-study will be reported elsewhere).
All centres were asked to collect a minimum of 9 months and maximum
of 12 months of data.
The study was approved by Brighton West Research Ethics Committee
(10/H1111/4) and by Research and Development departments in
participating centres. The study was adopted on to the UK National
Cancer Research Network portfolio (study ID 8486).

statistical analysis
Completed questionnaires were sent to the co-ordinating centre: Sussex
Health Outcomes, Research and Education in Cancer (SHORE-C), for
analysis. Data were entered on to an Access database and 100% quality
assurance undertaken. Sample size was determined by the number of
patients seen in participating centres. Two analyses were planned: the
whole study population, and patients who had undergone surgery and had
a high risk of recurrence based on pathological parameters where the issue
of adjuvant chemotherapy use is most relevant. Patients with a high risk of
recurrence were dened as those with breast cancer, which was oestrogen
receptor (ER) negative, HER2 positive or ER positive with grade 3 disease
and/or 4+ positive nodes [9]. This mirrored the eligibility criteria for the
UK ACTION trial, which planned to investigate the benets of adjuvant
chemotherapy in women aged 70 years [9]. The data collected were those
available at the time the questionnaire was completed and the treatment
decision made. Further information may have subsequently become
available (for example receptor status), but because this had not been used
to inform the treatment recommendation, this was dened as unknown/
missing. Data was then imported into SPSS. The differences between those
who were and were not offered chemotherapy, according to clinical and
pathological parameters were compared by chi-square test. Logistic
regression analyses (using enter selection method) was employed to
identify factors that were associated with chemotherapy offer. Variables
included in the nal multi-variable logistic regression model were age,
high-risk prole, hospital type and performance status. Analysis was done
using Statistical software IBM SPSS Statistics 20. All tests were two tailed,
and P 0.05 was considered signicant.

Volume 24 | No. 5 | May 2013

Downloaded from http://annonc.oxfordjournals.org/ at Instituto Nacional do Cncer (INCA) on November 17, 2014

The aging of the population has led to a worldwide increase in

the number of cancers diagnosed in older people. In the UK,
33% of all breast cancers are now diagnosed in women aged
70 years [1, 2]. In 2010, the UK National Cancer Equality
Initiative concluded that older patients experienced inequalities
in access to cancer services and treatment; furthermore, they
also had worse outcomes, which were improving at a slower
rate than those for younger patients [3].
In the 2005 analysis of the Early Breast Cancer Trialists
Collaborative Group, adjuvant chemotherapy in women aged
70 years with early breast cancer was found to reduce the
risks of recurrence by 12% and death by 13% [4]. The results
were not statistically signicant owing to the small number of
women aged 70 years in the analyses; nonetheless,
international guidelines recommend that chemotherapy should
be considered in older women with breast cancer who are
deemed to be t enough, and in particular in those with highrisk disease [5, 6]. Despite this, across Europe and USA,
numerous studies report low rates of receipt of adjuvant
chemotherapy in older women [7, 8]. There is therefore an
urgent need to understand more about the reasons
underpinning the existing treatment decisions made by
specialist breast cancer teams. This issue has become all the
more important owing to the under-representation of older
patients in clinical trials and the failure of recent randomised
trials [9]. The drivers and barriers to offering chemotherapy
are probably multi-factorial. Undoubtedly, many older women
are likely to have pre-existing co-morbidities that might
preclude chemotherapy as an option. Some health care
professionals may make decisions that are driven by concerns
about treatment side-effects and a lack of efcacy data. Some
perceive the putative benets of treatment of the elderly to be
too small and others that the patients themselves will decline
chemotherapy treatment. The adjuvant chemotherapy in
elderly women with breast cancer (AChEW) study was
conducted to describe prospectively the clinical decision
making of multidisciplinary breast cancer teams regarding
adjuvant chemotherapy in women aged 70 years with early
breast cancer. This information might then be used to identify
where interventions should be targeted to increase
chemotherapy uptake and optimise care.

multidisciplinary meeting (team decision) or after a patient consultation

(clinician decision). Where patients were not offered adjuvant or
neoadjuvant chemotherapy, clinicians were asked to describe why this
decision had been reached. Nine pre-dened options were provided, and
there was also the opportunity to provide free-text answers. Where patients
were offered chemotherapy, oncologists were asked to provide details of the
intended treatment regimen and whether the patient had decided to receive
it. Three months later, clinicians were asked to report whether or not the
patients offered chemotherapy had actually received the treatment.

Curso de vero 2015

original articles

Annals of Oncology
Table 1. Characteristics of 803 female patients 70 years with breast cancer
Characteristics

78.5 (6.2), 70103

245 (31)
251 (31)
160 (20)
103 (13)
44 (6)

Treatment decision
Offered chemotherapy (N = 116)b
73.6 (2.9), 7083
76 (66)
36 (31)
4 (3)

Pc
Not offered chemotherapy (N = 687)b
79.3 (6.2), 70103
169 (25)
215 (31)
156 (23)
103 (15)
44 (6)

<0.0001
<0.0001

576 (72)
102 (13)
88 (11)
37 (5)

91 (78)
11 (9)
11 (9)
3 (3)

485 (71)
91 (13)
77 (11)
34 (5)

0.344

683/120 (85/15)
120 (15)
383 (48)
300 (37)

111/5 (96/4)
5 (4)
51 (44)
60 (52)

572/115 (83/17)
115 (17)
332 (48)
240 (35)

0.001
<0.0001

173 (22)
284 (35)
120 (15)
226 (28)

6 (5)
38 (33)
9 (8)
63 (54)

167 (24)
246 (36)
111 (16)
163 (24)

<0.0001

262 (32)
332 (41)
126 (16)
26 (3)
4 (1)
53 (7)

28 (24)
45 (39)
34 (29)
4 (3)
1 (1)
4 (3)

234 (34)
287 (42)
92 (13)
22 (3)
3 (1)
49 (7)

0.001

119 (15)
396 (49)
273 (34)
15 (2)

1 (1)
40 (35)
75 (65)

118 (17)
356 (52)
198 (29)
15 (2)

<0.0001

153 (19)
395 (49)
172 (21)
55 (7)
28 (4)

7 (6)
38 (33)
38 (33)
22 (19)
11 (10)

146 (21)
357 (52)
134 (19)
33 (5)
17 (3)

<0.0001

674 (84)
122 (15)
7 (1)

68 (59)
48 (41)

606 (88)
74 (11)
7 (1)

<0.0001

70 (12)
503 (88)
230 (29)

32 (32)
68 (68)
16 (14)

38 (8)
435 (92)
214 (31)

<0.0001

263 (33)
194 (24)
60 (7)
18 (2)
4 (1)
264 (33)

70 (60)
29 (25)
1 (1)

16 (14)

193 (28)
165 (24)
59 (8)
18 (3)
4 (1)
248 (36)

<0.0001

Downloaded from http://annonc.oxfordjournals.org/ at Instituto Nacional do Cncer (INCA) on November 17, 2014

Age (years)
Mean (SD), range
7074
7579
8084
8589
90
Histology
Ductal
Lobular
Other
Unknown/missing
Surgery
Yes/no
Only biopsy or none
Breast conserving
Mastectomy
Axillary surgery
None
SNB
ANS
AND
T stage
1
2
3
4
Multifocal
Unknown
Grade
I
II
III
Unknown
Nodal status
Nx
N0
N1
N2
N3
ER status
Positive
Negative
Unknown
HER2 status
Positived
Negatived
Unknown/missing
Performance status
0
1
2
3
4
Unknown/missing

Total (N = 803)a

Continued

Volume 24 | No. 5 | May 2013

doi:10.1093/annonc/mds642 |

71

Curso de vero 2015

original articles

Annals of Oncology

Table 1. Continued
Characteristics
Hospital type
Academic (9 centres)
DGH (15 centres)
Decision making
MDT
Patient consultation

Total (N = 803)a

Treatment decision
Offered chemotherapy (N = 116)b

Pc
Not offered chemotherapy (N = 687)b
0.307

360 (45)
443 (55)

49 (42)
67 (58)

311 (45)
376 (55)

520 (65)
283 (35)

23 (20)
93 (80)

497 (72)
190 (28)

<0.0001

Data are numbers (percentage) unless stated otherwise.

Percentages calculated using the total sample.
b
Percentages calculated using the number of patients per subgroup.
c
Overall P values based on Pearsons chi squared test for signicance between treatment decision groups.
d
Percentages calculated using the number of patients with available HER2 status data as the denominator.
SNB, sentinel node biopsy; ANS, axillary node sample; AND, axillary node dissection; MDT, multidisciplinary team.
a

study population
Between April 2010 and December 2011, 24 UK specialist
breast cancer teams returned 832 questionnaires relating to
individual patient treatment decisions. There were 29
questionnaires excluded because the patients were not eligible
[male patients (N = 2), non-invasive cancer (N = 9), advanced
disease (N = 11), already commenced chemotherapy (N = 3),
form illegible/incomplete (N = 4)]. Of the nal 803
questionnaires analysed, 360 (45%) were returned from cancer
centres at nine academic (teaching) hospitals and 443 (55%)
from 15 district general hospitals. The majority of patients
underwent surgery to the breast (85%) and axilla (78%).
Patients who did not have surgery were older (83.9 versus 77.5
years; P < 0.001) and were more likely to receive treatment in a
district general hospital (75% versus 25%; P < 0.001). At the
time of treatment recommendation and hence questionnaire
completion, information regarding performance status and
HER2 status were not available in 33% and 29% of patients,
respectively. The characteristics of the 803 eligible patients are
shown in Table 1 (column 1).

patients offered chemotherapy

all patients

Of the total study population 116/803 (14%) were offered

adjuvant or neoadjuvant chemotherapy. The characteristics of
those offered chemotherapy or not are shown in Table 1
(columns 2 and 3). Younger patients and those with a better
performance status were more likely to be offered
chemotherapy. In patients aged 80 years (38% of the study
population), only 4 of 307 (1.3%) were offered chemotherapy,
all were <85 years. Regarding tumour characteristics, patients
were more likely to be offered chemotherapy if their breast
cancer was higher grade, higher T or N stage, ER negative or
HER2 positive. The proportion of patients where a decision
was made not to offer chemotherapy following a
multidisciplinary meeting (MDM) discussion was 497 (of 803
whole population) and 158 (of 309 high-risk population).
There were no differences between academic (teaching)
hospitals and district general hospitals in terms of rates of

| Ring et al.

72

offering chemotherapy. After excluding those with missing

performance status or HER2 status, the nal logistic regression
model was based on 539 patients. This showed that younger
age [odds ratio (OR) 0.75, 95% CI 0.690.81, P < 0.001], highrisk of recurrence (OR 12.5, 95% CI 6.723.4, P < 0.001) and
better performance status (OR 15.7, 95% CI 2.0124.8,
P = 0.009) were signicantly associated with chemotherapy
offer.
high-risk patients

A secondary analysis was restricted to those patients

undergoing surgery and meeting the pre-dened high-risk
disease characteristics, where the issue of adjuvant
chemotherapy use is most relevant. Of the 683 patients who
had surgery, 309 (45%) were dened as at high risk of disease
recurrence, and 94 (30%) of those women were offered
chemotherapy. The characteristics of those women with highrisk disease according to whether chemotherapy was offered
are shown in Table 2.

reasons for not offering chemotherapy

The reasons why chemotherapy was not offered are shown in
Table 3 for the whole study population and those at high risk
of recurrence following surgery. Respondents could select as
many reasons as were relevant from the list, but if stating more
than one reason were asked for the most important reason.
The most common reasons for not offering chemotherapy in
the whole population were that other treatment was more
appropriate (the majority of patients for whom this option was
selected were ER positive) or that the perceived benets were
too small. In the high-risk group, co-morbidities and frailty
were selected as the dominant reason for not offering
chemotherapy in 17% and 10% of patients respectively.
The reasons for not offering chemotherapy were examined
according to age group, Figure 1. As age increased, clinicians
were more likely to cite co-morbidities, frailty, and impairment
of quality of life as reasons not to offer chemotherapy, despite
the fact that performance status was not documented in 33% of
cases.
The probability of being offered chemotherapy varied
according to hospital. For the whole study population, the

Volume 24 | No. 5 | May 2013

Downloaded from http://annonc.oxfordjournals.org/ at Instituto Nacional do Cncer (INCA) on November 17, 2014

results

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original articles

Annals of Oncology
Table 2. Characteristics of 309 female patients with breast cancer 70 years with a high risk of recurrencea
Characteristics

77.8 (5.7), 70103

104 (34)
94 (30)
70 (23)
30 (10)
11 (4)

Pd

Treatment decision
Offered chemotherapy (N = 94)c

Not offered chemotherapy (N = 215)c

73.7 (2.9), 7083

62 (66)
28 (30)
4 (4)

79.6 (5.8), 70103

42 (20)
66 (31)
66 (31)
30 (14)
11 (5)

<0.0001
<0.0001

245 (79)
24 (8)
29 (9)
11 (4)

77 (82)
7 (7)
8 (9)
2 (2)

168 (78)
17 (8)
21 (10)
9 (4)

0.898

143 (46)
166 (54)

43 (46)
51 (54)

100 (47)
115 (53)

21 (7)
99 (32)
52 (17)
137 (44)

2 (2)
32 (34)
8 (9)
52 (55)

19 (9)
67 (31)
44 (20)
85 (40)

0.003

81 (26)
146 (47)
64 (21)
10 (3)
1 ()
7 (2)

24 (26)
37 (39)
26 (28)
2 (2)
1 (1)
4 (4)

57 (27)
109 (51)
38 (18)
8 (4)

3 (1)

0.072

3 (1)
67 (22)
239 (77)

23 (24)
71 (76)

3 (1)
44 (20)
168 (78)

0.396

17 (6)
141 (46)
70 (23)
53 (17)
28 (9)

2 (2)
34 (36)
25 (27)
22 (23)
11 (12)

15 (7)
107 (50)
45 (21)
31 (14)
17 (8)

0.033

199 (64)
110 (36)

49 (52)
45 (48)

150 (70)
65 (30)

0.004

60 (26)
171 (74)
78 (25)

31 (38)
50 (62)
13 (14)

29 (19)
121 (81)
65 (30)

0.003

119 (39)
86 (28)
20 (6)
3 (1)
2 (1)
79 (26)

56 (60)
25 (27)

13 (14)

63 (29)
61 (28)
20 (9)
3 (1)
2 (1)
66 (31)

<0.0001

135 (44)
174 (56)

40 (43)
54 (57)

95 (44)
120 (56)

0.804

Downloaded from http://annonc.oxfordjournals.org/ at Instituto Nacional do Cncer (INCA) on November 17, 2014

Age (years)
Mean (SD), range
7074
7579
8084
8589
90
Histology
Ductal
Lobular
Other
Unknown/missing
Surgery
Breast conserving
Mastectomy
Axillary surgery
None
SNB
ANS
AND
T stage
1
2
3
4
Multifocal
Unknown
Grade
I
II
III
Unknown
Nodal status
Nx
N0
N1
N2
N3
ER status
Positive
Negative
HER2 status
Positivee
Negativee
Unknown/missing
Performance status
0
1
2
3
4
Unknown/missing
Hospital type
Academic (9 centres)
DGH (15 centres)

Total (N = 309)b

Continued

Volume 24 | No. 5 | May 2013

doi:10.1093/annonc/mds642 |

73

Curso de vero 2015

original articles

Annals of Oncology

Table 2. Continued
Characteristics
Decision making
MDT
Patient consultation

Total (N = 309)b

174 (56)
135 (44)

Treatment decision
Offered chemotherapy (N = 94)c
16 (17)
78 (83)

Pd
Not offered chemotherapy (N = 215)c
158 (73)
57 (27)

<0.0001

Table 3. Reasons for not offering chemotherapy in whole study

population and in patients who had high-risk disease following surgery

Reasons not offering chemotherapy

Other treatment more
appropriatea
Perceived benets too small
Co-morbidities
Frailty
Would impair quality of life
Concerns treatment compliance
Choice burden to patient
Otherb
Number of reasons given
1
2
3
Median
Most important reasonc
Other treatment more appropriate
Perceived benets too small
Co-morbidities
Frailty
Would impair quality of life
Concerns treatment compliance
Choice burden to patient
Otherb

Study
population
(N = 687)

High-risk
patients
(N = 215)

430 (63)

115 (53)

374 (54)
197 (29)
148 (22)
113 (16)
16 (2)
43 (6)
21 (3)

100 (47)
72 (33)
62 (29)
58 (27)
5 (2)
26 (12)
6 (3)

274 (40)
247 (36)
164 (24)
2

75 (35)
83 (39)
57 (26)
2

276 (45)
205 (34)
62 (10)
33 (5)
14 (2)
1
4 (1)
15 (2)

69 (38)
49 (27)
32 (17)
18 (10)
9 (5)

3 (2)
3 (2)

Data are numbers (percentage) unless stated otherwise.

Of which 96% ER positive, 94% HER2 negative (whole study population)
and 89% ER positive and 84% HER2 negative (high-risk group).
b
Other: patient choice, MDT decision, palliative care, previous
chemotherapy for other malignancies.
c
The most important reason was cited in 610 patients of the whole study
population, and in 183 of the high-risk patients.
a

proportion of patients offered chemotherapy varied between

0% and 29% as shown in supplementary Table S1, available at
Annals of Oncology online. For the high-risk patients, the
proportion varied between 6% and 60% (excluding centres

| Ring et al.

74

with fewer than ve high-risk patients seen). The reasons for

not offering chemotherapy also showed considerable variation
across sites (supplementary Table S1, available at Annals of
Oncology online). For those high-risk patients who were not
offered chemotherapy, the reason cited was perceived benets
too small in 47% of patients overall. However, in individual
sites, the proportion of patients for whom this was cited as a
reason not to offer chemotherapy varied between 0% and
100%.

type of chemotherapy proposed and acceptance

The type of chemotherapy offered and acceptance rates are
shown in Table 4. Overall, 116 patients were offered
chemotherapy, the majority (93 of 116, 80%) after patient
consultation. Anthracycline-based regimens were most
frequently recommended. At 3-month follow-up, 66 (57%) of
the patients received chemotherapy, representing 8% of the 803
patients. Fifty-three of the 66 patients accepting chemotherapy
had a high risk of recurrence (17% of all of those with disease
at a high risk of recurrence). Of the 116 patients offered
chemotherapy, 58 (50%) agreed to be interviewed by the
researchers regarding their attitudes to chemotherapy and their
decision-making process. These data will be presented
elsewhere.

discussion
This study found that of women aged 70 years with early
breast cancer, only 14% are offered adjuvant chemotherapy, all
aged <85 years. It was notable that recommendations regarding
chemotherapy were made in the apparent absence of critical
information regarding performance status and HER2 status in
up to one-third of patients. Many clinicians stated that the
most important reason not to offer chemotherapy was that the
perceived benets were too small: 34% in the whole study
population and 27% in those women with disease at high risk
of recurrence. Co-morbidities and frailty were relatively
infrequently cited as the main reason for not offering
chemotherapy; although with increasing age, these two factors
were found to dominate treatment decisions. There was
however considerable variation across hospital sites as to the

Volume 24 | No. 5 | May 2013

Downloaded from http://annonc.oxfordjournals.org/ at Instituto Nacional do Cncer (INCA) on November 17, 2014

Data are numbers (percentage) unless stated otherwise.

a
Patients with high-risk breast cancer dened as patients with HER2-positive disease and/or ER-negative disease, or ER positive with grade 3 disease and/or
4+ positive nodes [9].
b
Percentages calculated using the total sample of high-risk patients.
c
Percentages calculated using the number of high-risk patients per subgroup.
d
Overall P values based on Pearsons chi-square test for signicance between treatment decision groups.
e
Percentages calculated using the number of patients with available HER2 status data as the denominator.

Curso de vero 2015

original articles

Annals of Oncology

Table 4. Chemotherapy offered and chemotherapy decision at 3-month

follow-up
Chemotherapy offereda
Anthracycline based
Taxane based
Anthracyclinetaxane based
Otherb
Unknown
Chemotherapy decision at 3-month follow-up
Accept
Decline
Undecided

80 (69)
12 (10)
10 (9)
6 (5)
8 (7)
66 (57)
49 (42)
1 (1)

Data are numbers (percentage) unless stated otherwise.

a
Twenty-one patients were offered trastuzumab in addition to their
chemotherapy.
b
Other: methotrexate and mitozantrone (MM) and carboplatin.

likelihood of being offered chemotherapy and the reasons for

not offering it.
The key strengths of this study are that the information on
which treatment decisions were based was recorded, and that

Volume 24 | No. 5 | May 2013

clinicians were asked to describe prospectively their reasons for

not offering chemotherapy. This is the rst study to address
these issues. There are, however, limitations to the approach
used: centres opted to become involved in the study, and as
such are likely to over-represent those with a specic interest in
management of older women with breast cancer. This may
lead to bias and may mean that the rate with which
chemotherapy offered to older women is over-estimated. The
design of the study also makes it difcult to be certain as to the
response rate at each participating centre. Nonetheless, the
study includes patients with a broad range of histological
tumours, with all age groups well represented and from a
variety of health care settings. As a result, the patients
described are likely to broadly reect those seen in UK clinical
practice.
Two previous studies from the United States describe
adjuvant chemotherapy use in older women with early breast
cancer [8, 10]. These studies report chemotherapy use in 10%
of 7074-year olds and 4% of 7579-year olds [8] and 14% of
women aged 70 years, respectively [10]. The AChEW study
found similar rates of chemotherapy use: 8% of all patients
aged 70 years. However, the AChEW study builds upon these
results by describing the chemotherapy receipt in the subset of

Downloaded from http://annonc.oxfordjournals.org/ at Instituto Nacional do Cncer (INCA) on November 17, 2014

Figure 1. Proportion of patients not offered chemotherapy for the given reason, (A) other treatment more appropriate, (B) perceived benets too small,
(C) co-morbidities, (D) frailty, (E) would impair quality of life. Presented according to risk of recurrence and age group: 7074 years (total: N = 169, high risk:
N = 42), 7579 years (total: N = 215, high risk: N = 66), and 80 years (total: N = 303, high risk: N = 107) for all graphs. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.

doi:10.1093/annonc/mds642 |

75

Curso de vero 2015

original articles

| Ring et al.

76

needs to validate the use of tness scores as predictors of

chemotherapy tolerance [18] and explore the inuences
of womens preferences for chemotherapy on the
decision-making processes.

acknowledgements
The authors thank the patients and staff of the recruitment
sites: Alexandra Hospital, Redditch; Broomeld Hospital,
Chelmsford; Charing Cross Hospital, London; Conquest
Hospital, St Leonards; Dorset County Hospital, Dorchester;
Eastbourne District Hospital, Eastbourne; George Eliot
Hospital, Nuneaton; Guys Hospital, London; Kings College
Hospital, London; Princess Royal University Hospital,
Orpington; Queen Alexandra Hospital, Portsmouth; Queen
Elizabeth Hospital, Woolwich; Royal Bournemouth Hospital,
Bournemouth; Royal Shrewsbury Hospital, Shrewsbury; Royal
Sussex County Hospital, Brighton; Southmead Hospital,
Bristol; St Jamess University Hospital, Leeds; St Marys
Hospital, London; Stafford Hospital, Stafford; Stoke
Mandeville Hospital, Aylesbury; University Hospital,
Coventry; Warwick Hospital, Warwick; Worthing District
Hospital, Worthing; Wycombe Hospital, High Wycombe.

funding
This work was supported by an unrestricted educational grant
from Roche Products Limited [no grant number]. The
sponsors of the study had no role in study design, data
collection, data analysis, data interpretation or writing of the
report. All authors had access to all the data in the study. The
corresponding author had nal responsibility for the decision
to submit for publication.

disclosure
The authors have declared no conicts of interest.

references
1. Kinsella K, He W. U.S. Census Bureau, International Population Reports, P95/09
1. An Aging World: 2008. Washington, DC: U.S. Government Printing Ofce,
2009.
2. Cancer Research UK. Breast cancerUK incidence statistics. Cancer Research
UK: London. http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/types/breast/incidence/
#age (8 May 2012, date last accessed).
3. National Cancer Equality Initiative. Reducing cancer inequality: evidence, progress
and making it happen: report by the National Cancer Equality Initiative. UK:
Department of Health, 2010.
4. Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group (EBCTCG). Effects of
chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and
15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005; 365:
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5. Biganzoli L, Wildiers H, Oakman C et al. Management of elderly patients with
breast cancer: updated recommendations of the International Society of Geriatric
Oncology (SIOG) and European Society of Breast Cancer Specialists (EUSOMA).
Lancet Oncol 2012; 13: 148160.
6. Carlson RW, Moench S, Hurria A et al. NCCN Task Force Report: breast cancer
in the older woman. J Natl Compr Canc Netw 2008; 6(Suppl 4): S1S25.

Volume 24 | No. 5 | May 2013

Downloaded from http://annonc.oxfordjournals.org/ at Instituto Nacional do Cncer (INCA) on November 17, 2014

patients with high-risk disease (17%) and by describing on an

individual patient basis the reasons for not offering
chemotherapy.
The patterns of treatment and reasons given for not offering
chemotherapy show considerable variation suggesting that
clinicians are interpreting the available data in different ways,
and that there is little consensus as to what are the benets of
treatment. The UK National Cancer Research Network
ACTION trial planned to address this issue in a randomised
trial of adjuvant chemotherapy versus no chemotherapy in
women aged 70 years with early breast cancer [9]. This study
failed to recruit, and the resulting lack of direct clinical trial
data is likely to undermine condence in offering
chemotherapy. Many treatment decisions were made in the
absence of information about HER2 status and performance
status. HER2 is a poor prognostic factor in women with early
breast cancer whose prognosis might otherwise be good [11].
The inuence of general health and biological as opposed to
chronological age is also a key factor when considering the
advisability of adjuvant chemotherapy [12], and performance
status is a measure of general health. Therefore, there is a risk
that without HER2 and performance status the patient may be
wrongly assumed to be at low risk of recurrence, or wrongly
assumed to be frail (on the basis of their age alone) and
chemotherapy erroneously discounted. The introduction of
multidisciplinary care has been demonstrated to improve
breast cancer survival and reduce variation in survival between
hospitals [13]. In order to ensure that these benets continue
to be realised in older patients, it is essential that members of
the team have access to all of the relevant data in order to
make informed decisions. This is of critical importance
because in 62% of the total study population, a decision was
made not to offer chemotherapy after an MDM discussion and
therefore before (or in the absence of ) a formal consultation
with an oncologist. It may be possible to improve
multidisciplinary team (MDT) decision making by including a
formal geriatric assessment in the information provided to the
MDT.
The chemotherapy regimens offered broadly reect the
limited available clinical trial data. The majority of patients
were offered anthracycline-based treatment, for which the
greatest evidence base exists [14, 15]. There is increasing
evidence to support the use of taxane only regimens in older
patients (offered to 10% of patients), with the advantages of
less cardiac toxicity and superior efcacy, but at the cost of a
higher risk of myelo suppression [16].
The aging of the population means that, in forthcoming
years, clinicians are going to be faced with an increasing
number of women aged 70 years diagnosed with breast
cancer. The median life expectancy of a 70-year-old woman in
the UK is 17 years [17]. If the survival of these women when
diagnosed with breast cancer is to be improved, then national
guidelines should be developed and implemented with the
support of an educational programme. These should include
criteria for dening high risk of recurrence, the minimal
acceptable data on which to make a treatment
recommendation, a discussion of the incorporation of
objective measures of co-morbidities and guidance regarding
chemotherapy regimens and doses. Future research also

Annals of Oncology

Curso de vero 2015

original articles

Annals of Oncology

13. Kesson EM, Allardice GM, George WD et al. Effects of multidisciplinary team
working on breast cancer survival: retrospective, comparative, interventional
cohort study of 13 722 women. BMJ 2012; 344: e2718.
14. Muss HB, Berry DA, Cirrincione CT et al. Adjuvant chemotherapy in older women
with early-stage breast cancer. N Engl J Med 2009; 360: 20552065.
15. Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group (EBCTCG). Comparisons
between different polychemotherapy regimens for early breast cancer: metaanalyses of long-term outcome among 100 000 women in 123 randomised
trials. Lancet 2012; 379: 432444.
16. Jones S, Holmes FA, OShaughnessy J et al. Docetaxel with cyclophosphamide
is associated with an overall survival benet compared with doxorubicin and
cyclophosphamide: 7-year follow-up of US Oncology Research Trial 9735. J Clin
Oncol 2009; 27: 11771183.
17. Ofce for National Statistics 2010-based period expectation of life, 1981-2060.
United Kingdom: Principal Projection, 2011. http://www.ons.gov.uk/ons/
publications/re-referencetables.html?edition=tcm%3A77-227587. (30 May
2012, date last accessed).
18. Ring A. Treating cancer in older people. BMJ 2012; 345: e4954.

Annals of Oncology 24: 12191225, 2013

doi:10.1093/annonc/mds603
Published online 5 December 2012

Docetaxelcisplatin might be superior to

docetaxelcapecitabine in the rst-line treatment
of metastatic triple-negative breast cancer
Y. Fan, B. H. Xu*, P. Yuan, F. Ma, J. Y. Wang, X. Y. Ding, P. Zhang, Q. Li & R. G. Cai
Department of Medical Oncology, Cancer Institute and Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing, China

Received 9 April 2012; revised 29 August 2012 & 7 October 2012; accepted 16 October 2012

Background: Triple-negative breast cancer (TNBC) may be more sensitive to platinum. This study was to compare
platinum-based regimen with nonplatinum regimen in the rst-line treatment of advanced TNBC.

Patients and methods: Eligible metastatic TNBC (mTNBC) women without prior treatment for advanced disease
were randomized (1 : 1) to receive either docetaxelcisplatin (TP) or docetaxel capecitabine (TX) q3w for up to 6
cycles, until disease progression or unacceptable toxicity. The primary end point was objective response rate (ORR)
and the secondary end points included progression-free survival (PFS) and overall survival (OS). In total 53 patients
were enrolled.
Results: The median follow-up was 24 months. ORR was higher in the TP group than in the TX group (63.0% versus
15.4%, P = 0.001). PFS was more than doubled (10.9 months versus 4.8 months, P < 0.001) and median OS was also
greatly improved (32.8 months versus 21.5 months, P = 0.027). Toxic effects were not different except G3/4 vomiting
and G2/3 hand-foot syndrome.
Conclusions: This study suggested that cisplatin-based chemotherapy was superior to capecitabine-based regimen
in the rst-line treatment of mTNBC, as measured by ORR, PFS and OS. Further large-scale study should be
warranted. These results are not sufcient to change clinical practice.
Key words: capecitabine, cisplatin, mBC, triple-negative

Downloaded from http://annonc.oxfordjournals.org/ at Instituto Nacional do Cncer (INCA) on November 17, 2014

7. Bouchardy C, Rapiti E, Blagojevic S et al. Older female cancer patients:

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(ACTION) Studywhat did we learn from the pilot phase? Br J Cancer 2011;
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10. Buist DSM, Chubak J, Prout M et al. Referral, receipt, and completion of
chemotherapy in patients with early-stage breast cancer older than 65 years and
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11. Tovey SM, Brown S, Doughty JC et al. Poor survival outcomes in HER2-positive
breast cancer patients with low-grade, node-negative tumours. Br J Cancer
2009; 100: 680683.
12. Ring A, Sestak I, Baum M et al. The inuences of co-morbidities and age on risk
of death without recurrence: a retrospective analysis of the ATAC trial. J Clin
Oncol 2011; 29: 42664272.

*Correspondence to: Professor B. H. Xu, Department of Medical Oncology, Cancer

Institute and Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union
Medical College, No.17, Panjiayuan Nanli, Chaoyang District, Beijing 100021, China.
Tel: +86-10-87788826; Fax: +86-10-87715711; E-mail: xubinghe@medmail.com.cn

Abstract of this paper was presented in the 34th San Antonio Breast Cancer
Symposium, 2011.

The Author 2012. Published by Oxford University Press on behalf of the European Society for Medical Oncology.
All rights reserved. For permissions, please email: journals.permissions@oup.com.

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Curso de vero 2015

B O l e t I m

d A
9912293886-dR/SPm

Soc. Bras. de
Mastologia

FECHAMENTO AUTORIZADO
PODE SER ABERTO PELA ECT

ANO XVI - N 100 - 2012

Editorial

faixa etaria ainda considerada como um dos

principais fatores prognsticos no desenvolvimento do
cncer de mama.
Atualmente cerca de 50% dos
casos de cncer de mama ocorrem entre as mulheres com mais
de 65 anos de idade e 30% dos casos entre as mulheres acima de
70 anos.
Infelizmente, o tratamento
da cncer de mama entre as mulheres idosas influenciado por
uma serie de equvocos. A subestimao da expectativa de vida;
a dificuldade de locomoo; a
toxicidade do tratamento; etc...
so fatores que muitas vezes
propiciam uma incoerncia na
proposta terapeutica. Quando
ainda acrescentamos a esses fatores; as diversas comorbidades
existentes, frequentes nesse
grupo etreo, a suposio que
as clulas tumorais nessa fase
da vida se dividem lentamente,
acabamos percebendo, por parte
de muitos especialistas, uma tendncia menos agressiva e sub-dimensionada no estabelecimento
do tratamento orientado essas
mulheres, prejudicando assim,
seu prognstico. As mulheres
acima de 70 anos raramente so

Prof. Dr. Silvio E. Bromberg

Doutor em Cirurgia pela FM USP
Mastologista do Centro de Oncologia do HIAE

includas nos trials clnicos randomizados, dificultando a anlise do impacto de novos tratamentos nesse grupo etreo. Alm
disso, devemos lembrar que na
literatura os poucos estudos com
mulheres idosas exibem critrios
diferentes quanto a idade considerada como limite para incluso
nesse grupo.
Em fim, como resultado de
tantas variveis que confundem
e desorientam o mastologista, o
oncologista e o radioterapeuta,
permanecem muitas controvrsias e indefinies sobre o melhor tratamento para esse grupo
etreo.
Mesmo estabelecendo um
vnculo maior entre os mdicos

geriatras com os oncologistas e

mastologistas e mesmo criando
critrios facilitadores das tomadas de decises sobre estratgias terapeuticas, ainda assim
estamos distante de uma forma
protocolar nica e eficaz de atendimento.
Ainda estamos em uma fase
de terapeutica artesanal essas
pacientes, fazendo com que ainda devamos explorar minuciosamente todos os fatores que possam influenciar negativamente o
estabelecimento de uma conduta teraputica.
Devemos procurar evitar prejudicar a paciente.
Devemos sempre lembrar de
insistir na discusso multidisclipinar de cada caso .
Devemos, enquanto no houver condutas decorrentes de clinical trials dedicados, fazer uso
da taylor medicine e da medicina baseada em evidncia.
Esse boletim vem nos mostrar
o quanto controverso a abordagem e manejo da mulher idosa
com cncer de mama e mostrar
o que devemos pensar e saber ao
estarmos confrontando essa situao em nosso dia a dia.
Bom proveito !

SOCIEDADE BRASILEIRA DE MASTOLOGIA REGIONAL SO PAULO

Presidente: Csar Cabello dos Santos Vice Presidente: Afonso Celso Pinto Nazrio 1 Secretrio: Vilmar Marques de Oliveira 2 Secretrio: Slvio
Eduardo Bromberg 1 Tesoureiro: Felipe Eduardo Martins de Andrade 2 Tesoureiro: Gilberto Uemura Diretor Cientico: Jos Roberto Filassi
Editores: Slvio Eduardo Bromberg, Gil Facina.

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CNCER DE MAMA NA MULHER IDOSA

CANCER DE MAMA NA MULHER IDOSA

Curso de vero 2015

CANCER DE MAMA NA MULHER IDOSA

RADIOTERAPIA

Boletim da Associao Brasileira de Mastologia Regional So Paulo ANO XVI - N 100 - 2012

cncer de mama afeta mulheres em todas as faixas etrias,

com uma estimativa para o Brasil de mais de 52 mil casos para o ano
de 2012, segundo dados do INCA. Estima-se que desse total de pacientes,
cerca de 20% tenha idade superior a 75
anos. Em virtude do cncer de mama
em idosas ter um comportamento biolgico mais indolente, alm de uma
maior frequncia de comorbidades
nestas pacientes, o tratamento de forma geral tende a ser menos agressivo.
Em relao a radioterapia (RT), a
meta-anlise conduzida pelo Early Breast Cancer Trialists Group mostrou
benefcio em reduo de recorrncia
locorregional e melhora na sobrevida
com a adio desta modalidade teraputica. Entretanto, tal benefcio foi
menor no grupo de melhor prognstico, com uma reduo em 11% em recidiva locorregional em pacientes com
mais de 70 anos contra 22% naquelas
com menos de 50 anos. Em virtude
deste fato, questiona-se se a RT possa
ser omitida em pacientes com baixo
risco para recidiva.
O trabalho publicado pelo CALGB avaliou 636 mulheres com idade maior que
70 anos tratadas com cirurgia conservadora, com estdio clnico I e receptores
hormonais positivos. Com seguimento
mediano de 10.5 anos, observou-se uma
reduo da recidiva local de 9 para 2%
com a adio da RT, porm sem benefcio
significante na sobrevida. Anlise de subgrupos como status da margem, histologia ou grau tumoral no foi realizada,
impossibilitando desta forma determinar se um grupo de pacientes com tumores de alto grau, invaso linfovascular e
margens positivas se beneficiaria ou no
com a RT.
Considerando pacientes idosas
e com tumores de bom prognstico

Prof. Dr. Roberto Arajo Segreto

Dr. Rodrigo Souza Dias

Professor Associado Livre Docente do Departamento de

Oncologia Clnica e Experimental e Chefe do Setor de
Radioterapia da UNIFESP

Mdico Assistente do Setor de Radioterapia da UNIFESP

(margens negativas, sem invaso linfovascular, baixo grau histolgico), podemos dizer que a RT adjuvante principalmente naquelas com expectativa
de vida menor que 5 anos ofereceria
pouco benefcio. Entretanto, a maior
dificuldade na prtica clnica definir
quais seriam essas pacientes, principalmente pela falta de ferramentas validadas para se estimar a expectativa
de vida.
Alm disso, tem-se a disposio novas tcnicas de tratamento, que possibilitam a realizao da RT em menos
fraes e com menor custo. Podemos
citar a RT parcial de mama e o hipofracionamento. A RT parcial de mama
consiste na irradiao apenas do leito
operatrio com 1 a 2 cm de margem e
recomendada pela ASTRO para pacientes com tumores T1N0, idade maior
que 60 anos, margens negativas, sem
componente in situ e invaso linfovascular, e receptores hormonais positivos. Trabalhos evidenciam resultados
iniciais com boa cosmese e controle
locorregional, porm ainda a melhor
tcnica a ser utilizada e o melhor esquema de fracionamento e dose no
esto estabelecidos, sendo necessrio

mais estudos com maior tempo de seguimento.

O hipofracionamento consiste no emprego de maior dose por frao e permite
que o tratamento seja entregue em perodo mais curto (usualmente em 3 semanas), reduzindo seus custos e permitindo
uma maior aderncia ao mesmo. advogado para pacientes com tumores T1-2N0, com idade maior que 50 anos e que
no necessitem de quimioterapia. Estudos mostram no inferioridade quando
comparada a RT convencional, porm
a principal preocupao com o hipofracionamento a complicao nos tecidos
de resposta lenta e um maior tempo de
seguimento se faz necessrio para se esclarecer tal fato.
Como concluso pode-se dizer que
o cncer de mama em idosas tem de
forma geral um comportamento menos agressivo. A omisso da RT em pacientes com fatores de bom prognstico e com expectativa de vida menor
que 5 anos parece no alterar a sobrevida, porm aumenta o risco de recidiva local. A utilizao de novas tcnicas,
principalmente a RT parcial de mama,
pode ter importante papel nesse grupo de pacientes.

Todos os textos apresentados nesse boletim so publicados - na ntegra - conforme enviados pelos respectivos autores.
Toda informao e opinio pessoal exposta, de responsabilidade exclusiva do Autor.
Os editores do boletim so responsveis somente pela organizao e execuo do mesmo.
Gil Facina e Silvio E. Bromberg

79

Curso de vero 2015

CANCER DE MAMA NA MULHER IDOSA

TRATAMENTO ADJUVANTE E PROGNSTICO EM
PACIENTES IDOSAS COM CNCER DE MAMA

Prof. Dr. Auro Del Giglio

Dra. Patrcia Santi

Professor Titular da Disciplina de Oncologia

e Hematologia da FMABC

Mdica Assistente do Servio de Oncologia e Hematologia da

FMABC e Mdica Coordenadora do Servio de Oncogeriatria
da FMABC.

A hormonioterapia deve ser oferecida s pacientes idosas com tumores

com receptores hormonais positivos
e deve-se considerar a incluso de
inibidores de aromatase. Como h aumento do risco cardiovascular e perda
de massa ssea relacionados a estas
medicaes associado ausncia de
benefcio de sobrevida global nos estudos comparativos, os guidelines
sugerem tamoxifeno por 2 ou 3 anos
seguido de inibidor de aromatase por
2 ou 3 anos (estratgia switch).
A terapia hormonal neoadjuvante,
principalmente com inibidores de aromatase, apresenta timos resultados
nesta populao e hoje considerado
uma importante estratgia teraputica.
As pacientes com estgio I-III apresentam benefcio clnico com quimioterapia similar s pacientes jovens,
entretanto, apresentam maior risco de
efeitos colaterais e mortalidade relacionados ao tratamento. Associado a uma
avaliao geritrica, o Adjuvant! Online
e o Oncotype Dx so ferramentas importantes que auxiliam esta deciso. A
adio de taxanos quando h comprometimento linfonodal deriva benefcio
semelhante s pacientes jovens.
O uso de Trastuzumabe nos casos
de doena HER-2 positiva indicado
apesar de no haver estudos especficos para esta faixa etria. A incidncia
de cardiotoxicidade sabidamente

maior e deve ser rigorosamente monitorada.

A expectativa de vida, presena de
co-morbidades, status funcional,
cognitivo e nutricional so alguns
fatores importantes que devem ser
considerados durante a deciso sobre
oferecer tratamento adjuvante, principalmente quimioterapia. A realizao
da avaliao geritrica global se faz
necessria para auxiliar na estimativa
da expectativa de vida, que deve ser
longa o bastante para que a paciente
possa usufruir do benefcio associado
a terapia adjuvante, identificar os idosos frgeis e avaliar de forma objetiva
o risco/benefcio de uma interveno
teraputica. Atualmente, com o crescimento desta populao nos servios
de Oncologia, imprescindvel a presena de um novo profissional, o Onco-Geriatra, para auxiliar a deciso teraputica bem como acompanhar estes
pacientes durante todo o tratamento.
Referncias Bibliogrficas
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www.inca.gov.br. (acesso em 05 de abril de 2012)
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(NCCN) guidelines. Disponvel em: www.nccn.
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for older adults with breast cancer: the perspective of oncologists and primary care providers. J
Clin Oncol 2008; 26:5386.

Boletim da Associao Brasileira de Mastologia Regional So Paulo ANO XVI - N 100 - 2012

cncer de mama a neoplasia

mais frequente entre as mulheres em todo mundo. Em 2012,
esperam-se, para o Brasil, 52.680 novos
casos com um risco estimado de 52 casos a cada 100.000 mulheres.
A idade continua sendo o principal
fator de risco e as taxas de incidncia
aumentam rapidamente at os 50 anos
e, posteriormente, este aumento ocorre de forma mais lenta. Nos Estados
Unidos, aproximadamente 230.480 novos casos de cncer de mama so diagnosticados anualmente e cerca de metade ocorrem em pacientes com mais
de 65 anos.
O cncer de mama em mulheres idosas associado a um perfil biolgico
tumoral favorvel devido a alta prevalncia de tumores com expresso de
receptores de estrgeno, ausncia de
hiper-expresso HER2 e baixos ndices de
proliferao celular. O tipo histolgico
mais comum o carcinoma ductal invasivo mas h maior incidncia de histologias mais favorveis como os mucinosos
e papilferos. No entanto, mulheres com
mais de 70 anos apresentam maiores ndices de mortalidade quando comparadas as pacientes jovens.
Nos Estados Unidos, entre 1990 e
2003, houve um declnio do risco de
morte associado ao cncer de mama
mas esta reduo foi maior entre as
pacientes com menos de 70 anos. O
fato de que as pacientes idosas so
diagnosticadas em estgios mais
avanados e que, geralmente, recebem
tratamentos menos agressivos so as
duas causas mais relevantes apontadas pela literatura para explicar esta
discrepncia.
A idade isolada no representa contra-indicaco a radioterapia mas vale
ressaltar que o risco de recidiva local
baixo nesta populao levando a diminuio do benefcio deste tratamento. H evidncia na literatura para que
pacientes com mais de 70 anos, EC I e
receptor hormonal positivo sejam poupadas de radioterapia adjuvante quando submetidas a cirurgia conservadora
sem prejuzo a sobrevida global.

80

Curso de vero 2015

CANCER DE MAMA NA MULHER IDOSA

DIAGNOSTICO DO CNCER DE MAMA EM IDOSA

Boletim da Associao Brasileira de Mastologia Regional So Paulo ANO XVI - N 100 - 2012

mbora as mulheres com 65 anos

ou mais compreendam apenas
14% das mulheres nos Estados
Unidos, quase metade (47%) dos casos de cncer de mama diagnosticado
anualmente e mais da metade (53%)
da mortalidade por cncer de mama
ocorre nessa faixa etria. A diminuio
da mortalidade por essa doena observada durante a ltima dcada para
as mulheres de 50 a 69 anos tem sido
menos evidente em mulheres com 70
anos ou mais.
Parte dessa recente diminuio na
mortalidade por cncer de mama pode
ser atribuda mamografia. Entre as
mulheres com idades entre 50 a 69
anos, tem havido uma diminuio na
taxa de doena em estdios avanados, ao mesmo tempo que tem havido
um aumento na utilizao da mamografia. Embora as taxas de mamografia
de rastreio aumentaram para todas as
mulheres durante a ltima dcada, as
mulheres com idade entre 70 e 79 anos
tm taxas mais baixas de triagem do
que mulheres mais jovens.
A eficcia da mamografia de rastreamento em mulheres com idade entre
70 e 79 anos no conhecido. De oito
estudos aleatorizados sobre o tema,
apenas dois incluram mulheres com
mais de 69 anos. Ambos mostraram um
benefcio pequeno, no significativo,
entre as mulheres com idade entre 70
a 74 anos, mas no tinham poder estatstico para fornecer resultados significativos, devido ao nmero da amostra.
Mulheres com 75 anos e mais velhas
no foram includas em nenhum dos
ensaios.
Sabe-se que a expectativa de vida
aumentou em pases ocidentais, resultando em um aumento na proporo da populao de idosos. Como a
incidncia da maioria dos cnceres
maior em idades mais avanadas, a

Simone Elias
Coordenadora do Setor de Diagnstico da Disciplina de
Mastologia. Escola Paulista de Medicina - Universidade Federal
de So Paulo

proporo de pessoas idosas no momento do diagnstico do cncer de

mama crescente .
A heterogeneidade dos fatores de
risco entre as mulheres pr e ps-menopausa reconhecida. Pesquisas envolvendo fatores de risco para cncer
de mama em grupos etrios mais velhos so relativamente limitadas. Alm
disso, estudos que consideraram o papel especfico da idade como fator de
risco de cncer de mama em mulheres
ps-menopausadas, tem tratado todas
as mulheres com 65 ou mais anos de
idade como um grupo nico.
Diferenas nas caractersticas patolgicas de tumores de mama em mulheres de acordo com a idade tambm
tm sido descritos. A proporo de
mulheres com doena metasttica, a
distribuio dos tipos histolgicas e a
proporo de tumores que expressam
receptores hormonais e outros marca-

dores biolgicos favorveis aumenta.

Estas tendncias parecem continuar
para alm da idade de 70 anos. As diferenas na patologia pode refletir influncias biolgicas diferentes sobre o
desenvolvimento do tumor de mama
nessa populao.
Na reviso da literatura consultada, a concluso que a mamografia
de rastreamento foi associada a uma
diminuio do risco de doena metasttica entre mulheres com idade entre
66 a 79 anos.
Estes resultados suportam a viso
de que rotina mamogrfica pode ser
eficaz em mulheres idosas. No entanto, os cnceres iniciais so detectados 3 vezes mais entre as mulheres
rastreadas. A triagem pode beneficiar
algumas dessas mulheres com cncer
de mama precoce, considerando aquelas cuja doena teria progredido, mas
pode no ser benfico em outras, cujas
leses podem no ter sido clinicamente importante.
As recomendaes devem avaliar
o benefcio do rastreamento mamogrfico em mulheres idosas contra o
aumento dos custos de triagem e tratamento de leses iniciais que podem
no ter nenhum efeito sobre a mortalidade. Mas, deve-se considerar dados
de registro de tumores que parecem
apoiar um benefcio da mamografia
na sobrevivncia, mesmo em mulheres
com mais de 80 anos.
Finalmente, anlises longitudinais
de ensaios clnicos randomizados sugerem que o efeito da mamografia
sobre a mortalidade comea a ocorrer
de 4 a 10 anos aps o incio do rastreio.
Portanto, parece razovel recomendar
rastreio para mulheres idosas que tenham uma mdia de 10 anos de expectativa de vida ou mulheres de alto risco com mais de 5 anos de expectativa
de vida.

81

Curso de vero 2015

CANCER DE MAMA NA MULHER IDOSA

TRATAMENTO CIRRGICO NAS PACIENTES IDOSAS

margem das discordncias

influenciou adversamente na sobrevi-

no tratamento das mulhe-

da global, sendo que no grupo que no

res portadoras de cncer de

recebeu a DAC, o ndice de recorrncia

mama consideradas idosas (maiores

axilar esteve em 3%, comparado com

de 70 anos), a Sociedade Internacio-

ndice de 1% nas pacientes que rece-

nal de Oncologia Geritrica (SIOG) e a

beram a DAC, com tempo mdio de

Sociedade Europia de Especialistas

seguimento de 6,6 anos3. A concluso

em Cncer de Mama (EUSOMA), publi-

destes estudos foi que a baixa incidn-

caram em abril de 20121, um protocolo

cia de eventos axilares sugere que a

de conduta de assistncia mulheres

DAC pode ser omitida nas pacientes

portadoras de cncer de mama com

com mais de 70 anos e estdio clnico I.

mais de 70 anos.

Martelli e colaborados, em um estudo

de extrema importncia a definio de condutas nesta faixa etria,

Anastasio Berrettini Jr.

Professor Convidado da Universidade So Francisco
Ps-Graduando-UNIFESP

pois se estima que at 2050 a popula-

Boletim da Associao Brasileira de Mastologia Regional So Paulo ANO XVI - N 100 - 2012

82

seguimento de 15 anos, em pacientes

idosas com tumores em estdio clnico

o mundial com mais de 80 anos se

eleve em 170%.

no randomizado, retrospectivo, com

I tratados com cirurgia e tamoxifeno,

mente negativa. Recentes estudos

dividiu a paciente em dois grupos (DAC

O tratamento padro ouro para o

mostraram que a omisso da dissec-

versus no DAC), que no mostraram

cncer de mama nesta faixa etria a

o axilar em pacientes com linfonodo

diferenas na sobrevida global3. Outro

cirurgia conservadora associado ra-

sentinela positivo e, at a omisso da

ponto favor neste estudo, foi a de-

dioterapia total da mama (consideran-

pesquisa de linfonodo sentinela nesta

monstrao de que a omisso da DAC

do-se os mesmos critrios de incluso

faixa etria pode ser razovel 2,3,4.

trouxe melhor qualidade de vida (QoL).

para mulheres mais jovens) ou mastec-

Dois grandes estudos randomiza-

O estudo Z0011 (ACOSOG) compa-

tomia seguida ou no de radioterapia.

dos compararam a DAC versus no-

rou a omisso da DAC em pacientes

Com relao ao manejo dos linfonodos

-DAC em pacientes com linfonodos

com linfonodo sentinela positivo (1 a

axilares, o padro ouro a disseco

axilares clinicamente negativos (ne-

2) versus tratamento padro (DAC)5. A

axilar completa (DAC) em pacientes

nhuma paciente foi submetida LS)2,3.

mdia de idade foi 54 anos (sem DAC) e

com comprovao de metstase axilar

A maioria das pacientes era receptor

56 anos (DAC). Todas as pacientes rece-

ou a pesquisa de linfonodo sentinela

de estrgeno positivo e recebeu 5 anos

beram cirurgia conservadora de mama

(LS) nas pacientes com axila clinica-

de Tamoxifeno. A omisso da DAC no

seguida de radioterapia em toda a

Curso de vero 2015

CANCER DE MAMA NA MULHER IDOSA

mama. O estudo avaliou 856 mulheres

So necessrios estudos para que a

2. Martelli G, Boracchi P, De Palo M,

com seguimento de 6,3 anos. A recor-

omisso da DAC se torne tratamen-

et al. A randomized trial comparing

to padro-ouro.

axillary dissection to no axillary dis-

submetidas LS somente e 0,5% nas

Omisso de LS pode ser indicada

section in older patients with T1N0

pacientes submetida LS e DAC , sem

em determinadas pacientes ido-

breast cancer: results after 5 years of

diferena na incidncia de metstases

sas (tumores de bom prognstico),

follow-up. Ann Surg 2005; 242: 16.

distncia (83,9% e 82,2% respecti-

onde se deseja apenas controle lo-

vamente) e sobrevida global (92,5% e

cal da doena.

3. Rudenstam CM, Zahrieh D, Forbes

JF, et al. Randomized trial comparing

91,8% respectivamente). Esses dados

Sabendo-se que grande parte das

axillary clearance versus no axillary

devem ser avaliados com ateno, de-

pacientes idosas apresenta tu-

clearance in older patients with breast

vido seleo das pacientes: pT1 (70%),

mores hormnio-dependentes, a

cancer: fi rst results of International

receptor de estrgeno positivo (80%) e

descoberta de doena adicional

Breast Cancer Study Group Trial 10-93.

presena de micrometstase no linfo-

axilar no mudar a conduta sist-

J Clin Oncol 2006; 24: 33744.

nodo sentinela (40%).

mica (aguardar resultado do estu-

Alternativa DAC em pacientes ido-

do AMAROS6).

4. Martelli G, Miceli R, Daidone MG,

et al. Axillary dissection versus no

sas com LS positivo, a radioterapia axi-

A omisso do LS ou DAC (ou ambos)

axillary dissection in elderly patients

lar est sendo investigada no estudo

aumentar a taxa de recorrncia

with breast cancer and no palpable

AMAROS6. Observaes precoces des-

local, levando cirurgias comple-

axillary nodes: results after 15 years

te estudo demonstram que a falta de

mentares. Esta situao provocar

of follow-up. Ann Surg Oncol 2011; 18:

conhecimento sobre a real extenso

efeitos psicolgicos na paciente

12533.

do comprometimento linfonodal nas

que so difceis de avaliar em estu-

pacientes em que foi omitida a DAC,

dos clnicos.

no apresenta tanta influncia na deciso sobre a terapia sistmica a ser re-

5. Giuliano AE, Hunt KK, Ballman KV,

et al. Axillary dissection vs no axillary
dissection in women with invasive bre-

REFERNCIAS

ast cancer and sentinel node metasta-

alizada, sugerindo que a radioterapia

sis: a randomized clinical trial. JAMA

axilar pode ser uma opo racional nas

1. Biganzoli L, Wildiers H, Oakman C

pacientes com LS positivo, evitando-se

et al. Management of elderly patients

6. Straver ME, Meijnen P, van Tie-

a morbidade da DAC.

with breast cancer: updated recom-

nhoven G, et al. Role of axillary clearan-

mendations of the International So-

ce after a tumor-positive sentinel node

ciety of Geriatric Oncology (SIOG) and

in the administration of adjuvant the-

European Society of Breast Cancer Spe-

rapy in early breast cancer. J Clin Oncol

cialists (EUSOMA). Lancet Oncol. 2012

2010; 28: 73137.

Em resumo
A DAC em pacientes com LS positivo
ainda o tratamento padro-ouro.

2011; 305: 56975.

Apr;13(4):e148-60.

(19) 3737-0770 - www.cdenet.com.br

Ressonncia Magntica Mamria com Bipsia

Boletim da Associao Brasileira de Mastologia Regional So Paulo ANO XVI - N 100 - 2012

rncia axilar foi de 0,9% nas pacientes

Responsabilidade Tcnica: Dr. Hlio Camargo - CRM 39998

7

83

Curso de vero 2015

CASO CLNICO
CASO CLNICO
IDENTIFICAO: CCM, 79 anos, dona de
casa aposentada, viva, natural e procedente de So Paulo.
QUEIXA E DURAO: Ndulo doloroso
em mama esquerda h 6 meses.
HISTRIA PREGRESSA DA MOLSTIA
ATUAL: Paciente refere ndulo doloroso em mama esquerda h seis meses,
com crescimento progressivo desde
ento, percebido no auto-exame.
ANTECEDENTES FAMILIARES: Nega casos de cncer na famlia.

Boletim da Associao Brasileira de Mastologia Regional So Paulo ANO XVI - N 100 - 2012

ANTECEDENTES GINECOLGICOS: Menarca aos 16 anos, com nica gestao

aos 30 anos. Menopausa aos 45 anos,
negando uso de terapia hormonal at
ento. No apresenta antecedentes
mamrios patolgicos.

84

ANTECEDENTES PESSOAIS: Paciente

em seguimento por mltiplas comorbidades, sendo as mais importantes:
desnutrio protica-calrica, DPOC
e conseqente hipertenso pulmonar
compensadas, fibrilao atrial em uso
crnico de cumarnico oral e insuficincia cardaca congestiva.

Autor: Dra. Marcela Balseiro de Freitas

Co-autor: Dr. Afonso Celso Pinto Nazrio

Residncia mdica. Universidade Federal de So Paulo, UNIFESP

Prof. Da Disciplina de Mastologia da UNIFESP.

EXAME FSICO: Mamas de pequeno volume, ptticas, com abaulamento em

regio retroareolar de mama esquerda s inspees esttica e dinmica.
palpao, evidencia-se ndulo irregular, endurecido, mvel e pouco doloroso em regio retroareolar de mama
esquerda, medindo aproximadamente
5 cm, sem alteraes na pele sobrejacente. Em axila esquerda, linfonodo
palpvel de 1 cm, mvel, indolor e fibroelstico. Expresso papilar bilateral negativa (FIGURA 1)

de assimetria focal em quadrante spero-lateral da mama esquerda, a qual

persistiu aps compresso localizada,
associada a calcificaes pleomrficas
(BI-RADS 4 ACR). (FIGURA 2). A ultrassonografia complementar evidenciou,
na mesma topografia, ndulo irregular, hipoecico, com margens microlobuladas e atenuao acstica posterior, medindo 3,7 x 2,0 cm nos maiores
dimetros (BI-RADS 4 ACR).

PROPEDUTICA SUBSIDIRIA: Como

exame inicial, a mamografia revelou

CONFIRMAO DIAGNSTICA: A paciente foi submetida bipsia percutnea por agulha grossa guiada por
ultrassonografia, com resultado histo-

mamas densas para a idade (Padro

4 do ACR BI-RADS) e identificou rea

patolgico de Carcinoma Ductal Invasivo Grau 2. Na anlise imunoistoqu-

Cncer de Mama: O diagnstico

precoce faz toda a diferena
O Femme Laboratrio da Mulher conta com
estrutura completa e tecnologia avanada para
diagnosticar precocemente o cncer de mama, o
maior causador de morte entre mulheres.

Ultrassonografia
Mamografia Digital
Agulhamento Mamrio
PAAF
Core Bipsia

Mamotomia
Estereotaxia Digital
Ressonncia Magntica das Mamas com Bipsia
Anatomia Patolgica e Citopatologia
Gentica

Responsvel Tcnico: Prof. Dr. Dcio Roveda Jr CRM 68.192

Rua Afonso de Freitas, 188 Paraso, So Paulo - SP CEP 04006-050 Tel.: 3050.9043 www.laboratoriodamulher.com.br

Curso de vero 2015

CASO CLNICO

CONDUTA: Em pacientes idosas com

cncer de mama (idade acima de 75
anos, de acordo com a maioria das diretrizes) alguns fatores corroboram
para a escolha do tratamento adequado, sendo que o grau e a gravidade
das comorbidades apresentadas pela
paciente tm papel fundamental, evitando riscos maiores do que os possveis benefcios. No caso em questo,
devido s complicaes mltiplas, sobretudo cardiolgicas e pulmonares,
optou-se pelo tratamento cirrgico
inicial menos conservador. A cirurgia
foi realizada cerca de 30 dias aps o
diagnstico.
TRATAMENTO: A paciente foi submetida a mastectomia total com bipsia de
linfonodo sentinela esquerda (estdio clnico T2 N0 M0). O resultado histopatolgico final constatou Carcinoma
Ductal Invasivo Grau 2, medindo 8,0 x
2,0 cm nos maiores dimetros, associa-

FIGURA 1 Exame clnico

FIGURA 2 Mamograia (MLO e Compresso localizada esquerda)

do a Carcinoma Ductal in situ extenso

tipo comedo, com margens livres. A
avaliao do linfonodo sentinela foi
negativa (pT3 pN0). Mesmo com indicao fundada nas diretrizes atuais, devido s comorbidades apresentadas,
decidiu-se no proceder radioterapia
ou quimioterapia adjuvantes e, em
conformidade com o perfil imunoisto-

MAMOGRAFIA BIPSIA PERCUTNEA BIPSIA CORE PESQUISA DE

LINFONODO SENTINELA LOCALIZAO RADIOGUIADA ROLL AGULHAMENTO MAMRIO
ULTRA-SONOGRAFIA DENSITOMETRIA SSEA
Central de agendamento:
11 3254-6800 - www.uddo.com.br
Horrio de atendimento: segunda sexta-feira, das 8h s 18h /sbado, das 8h s 12h
Rua Itapeva, 366, cjto 83/84 - e-mail: atendimento@uddo.com.br

qumico triplo negativo, no submetida, igualmente, a hormonoterapia

adjuvante.
SEGUIMENTO: A paciente mantm
acompanhamento ambulatorial h
dois anos, com exame clnico trimestral e mamografia contralateral anual,
sem sinais de recidiva.

Boletim da Associao Brasileira de Mastologia Regional So Paulo ANO XVI - N 100 - 2012

mica revelou expresso do Receptor

de Estognio negativo, Receptor de
Progesterona negativo, Ki67 positivo
em menos de 1% das clulas e HER-2
inconclusivo. O teste FISH confirmou
a negatividade do HER-2. Os exames
adicionais para o rastreamento de metstases (TC de trax e abdome e Cintilografia ssea) mostraram-se dentro
da normalidade.

85

Curso de vero 2015

CANCER DE MAMA NA MULHER IDOSA

PADRO HISTOPATOLGICO
CANCER DE MAMA EM IDOSA

Boletim da Associao Brasileira de Mastologia Regional So Paulo ANO XVI - N 100 - 2012

10

86

pesar da inicidncia crescente

em faixas etrias mais jovens o
cncer de mama continua sendo uma doena importante na ps-menopausa. Embora os tipos histolgicos
bem como os padres moleculares
sejam os mesmos, a idade parecer determinar neoplasias clinicamente distintas, do ponto de vista de evoluo e
prognstico.
O carcinoma de mama da paciente
idosa na sua maioria uma leso invasiva (apenas 3,9% de Carcinoma in situ
puro), bem diferenciada, de grau baixo/
intermedirio, com alta expresso dos
receptores esterides, baixa amplificao/superexpresso do HER-2. Uma
porcentagem alta desses carcinomas
invasivos correspondem ao tipo histolgico ductal, sem outras especificaes (CDI-NOS, 80-87%). Esses tumores
apresentam alto/moderado grau de
formao tubular, com discreto pleomorfismo celular, ncleos pouco/
moderadamente pleomrficos e baixa contagem mittica. Os outros dois
padres histolgicos mais frequentes
so o lobular e mucinoso (em torno de
7% e 3%, respectivamente), nos quais
tambm se observa, na maioria dos
casos, pleomorfismo celular discreto
e baixo ndice de proliferao celular.
Os demais tipos histolgicos so bem
mais raros (como metaplsico, adenide cstico e papilfero invasivo).
Assim como nas mulheres de outras faixas etrias, os carcinomas das
pacientes idosas, nas suas diversas
apresentaes morfolgicas se dividem nos 5 tipos moleculares j estabelecidos, a depender da expresso
dos marcadores prognsticos RE (receptor de estrognio), RP (receptor de
progesterona), HER-2, Ki-67 (antgeno
de proliferao celular), CK5/6 (citoceratina de baixo peso molecular) e EGFR
(receptor para fator de crescimento
epidrmico): luminal (A e B, que dife-

Ana Paula Torres

Doutora em Patologia Mamria pela FMUSP

rem apenas quanto ao ndice de proliferao celular, sendo alto neste ltimo), luminal hbrido (RE e/ou RP pos.
HER-2 pos), HER-2 (RE e RP neg, HER-2
pos) e Basal smile (RE, RP e HER-2 neg,
CK5/6 e/ou EGFR pos). Na mulher idosa
a proporo carcinoma luminal (RE e/
ou RP positivo, HER-2 neg) significativamente superior a mulher mais jovem, chegando a 80% dos casos (versus
50-60%). O restante dos casos compreendem os padres moleculares basal
smile e HER-2, que se caracterizam por
comportamento biolgico mais agressivo (maior taxa de recidiva, menor intervalo livre de doena e menor sobrevida global), com discreto predomnio
do primeiro.
O prognstico dos carcinomas mamrios em pacientes idosas, considerando o predomnio do perfil molecular luminal bastante bom. Todavia,
sabido que outros fatores alm da
expresso de receptores hormonais
so importantes na determinao do
curso clnico dos canceres de mama. O
tamanho do tumor, a presena de comprometimento metasttico regional e
a amplificao/superexpresso do oncogene HER-2 so tambm fatores que
influenciam negativamente o prog-

nstico clnico da doena. A idade, j

de maneira bem determinada, se correlaciona com todos os fatores descritos acima. De tal forma que, pacientes
mais jovens (principalmente aquelas
abaixo dos 35 anos), diferentemente
das idosas, tendem a apresentar tumores maiores, com comprometimento
axilar ao diagnstico, com baixa expresso de RE e/ou RP e maiores taxas
de HER-2 positivo, por conseguinte, um
prognstico mais reservado que a paciente idosa.
O comprometimento metasttico
a distncia determinado por uma srie de fatores. A gentica tumoral um
fator importante. Os dados sugerem
que a informao da metstase j est
presente no DNA das clulas tumorais
desde o incio do crescimento tumoral,
de tal forma que as clulas neoplsicas
desenvolvem durante seu crescimento
as condies locais e distncia, atravs de fatores secretados pela neoplasia, nos stios de implantao. Todavia,
esse processo sofre modulao do
sistema imunolgico. Alguns fatores
clnicos e morfolgicos se correlacionam com a presena de metstases
a distncia, como tamanho tumoral,
presena de invaso vascular linftica,
comprometimento de linfonodo locoregional e, por fim o perfil molecular.
De uma maneira geral, a porcentagem
das pacientes com cncer de mama
invasivo, que no apresentam comprometimento axilar, porm desenvolvem
metstase a distncia de 5%. Todavia, quando h comprometimento de
linfonodos locoregionais a incidncia
de metstases sobe para 18%. De tal
forma que, a presena da metstase
regional aumenta sobremaneira o risco da paciente desenvolver metstase
a distncia. Esse risco ainda modulado pela idade, sendo mais baixo em
pacientes masi velhas (acima dos 50
anos).

10 de N

MINISTRIO DA SADE
INSTITUTO NACIONAL DE CNCER JOS ALENCAR GOMES DA SILVA (INCA)

VII CURSO DE VERO DE PESQUISA EM ONCOLOGIA

CONTROLE DO CNCER
INFANTIL

RIO DE JANEIRO, RJ
INCA
2015

2015 Instituto Nacional de Cncer Jos Alencar Gomes da Silva/ Ministrio da Sade.
Esta obra disponibilizada nos termos da Licena Creative Commons
Atribuio No Comercial Compartilha igual 4.0 Internacional.
permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a
fonte.
Esta obra pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade Preveno e Controle
de Cncer (http://controlecancer.bvs.br/) e no Portal do INCA (http://www.inca.gov.br).
Tiragem: XXXX exemplares
Elaborao, distribuio e informaes
MINISTRIO DA SADE
Instituto Nacional de Cncer JOS ALENCAR
GOMES DA SILVA (INCA)
Coordenao de Pesquisa e Educao
Rua Andr Cavalcanti, 37
Centro Rio de Janeiro RJ
Cep 20231-050
www.inca.gov.br

Normalizao editorial
Coordenao de Preveno e Vigilncia
Servio de Edio e Informao TcnicoCientfica
Rua Marqus de Pombal, 125
Centro Rio de Janeiro RJ
Cep 20230-240
Tel.: (21) 3207-5500

CURSO II - CONTROLE DO CNCER INFANTIL

Pesquisadores responsveis
Beatriz de Camargo
Sima Ferman
Equipe
Dbora Gomes
Neimar Silva
Rafaela Montalvo
Rejane Reis

SUMRIO
INTRODUO 5
PARTE 1 CNCER NA CRIANA 6

Cncer infantil no mundo 6

Cncer infantil no Brasil 6
Leucemia 8

Tumor do Sistema Nervoso Central (Meduloblastoma) 9
Neuroblastoma 9

Tumores renais (Nefroblastoma) 10
Retinoblastoma 10
PARTE 2 - NVEIS DE PREVENO DO CNCER PEDITRICO 12

Preveno terciria em oncologia peditrica 17
18

Tratamento individualizado de acordo com fatores biolgicos do tumor

Preveno quaternria em oncologia peditrica 19
REFERNCIAS 21
APNDICE CRONOGRAMA DE ATIVIDADES 26

Curso de vero 2015

INTRODUO
O controle do cncer se faz atravs de estratgias de interveno nos diversos nveis
de preveno dos tumores peditricos. Com o conhecimento da histria natural de cada tumor
as linhas de cuidado seguem o fluxo desde a preveno primaria (preveno da exposio),
secundaria (rastreamento), terciria (diagnstico, tratamento, qualidade de vida) e quaternria
(cuidados paliativos). A integrao multidisciplinar (biologia/gentica, farmcia, fisioterapia,
nutrio, enfermagem, psicologia, medicina, odontologia) primordial para o sucesso do
controle do cncer.

Curso de vero 2015

PARTE 1 CNCER NA CRIANA

Cncer infantil no mundo
Entende-se por cncer infantil aquelas neoplasias malignas que acometem indivduos
com menos de 15 anos de idade (BOYLE; LENVIN, 2009). Faz-se necessria a anlise desses
tumores separadamente dos tumores dos adultos, uma vez que eles possuem comportamentos
distintos daqueles, principalmente quanto ao comportamento clnico. Enquanto os tumores nos
adultos esto associados ao de vrios fatores de risco como tabagismo, dieta, ocupao
e exposio a agentes carcinognicos, as associaes causais para os tumores infantis ainda
so pouco exploradas.
Considerada uma doena rara, seus padres tanto de incidncia quanto de mortalidade
variam em todo mundo. Enquanto nos pases desenvolvidos leucemia o tumor mais incidente,
seguido dos tumores de SNC e linfomas, nos pases em desenvolvimento, as posies dos
dois ltimos se invertem. A incidncia dos tumores peditricos corresponde, em mdia, entre
0,5 e 3% de todos os tumores malignos (Parkin et al., 1988; Buka; Koranteg; Vargas,
2007). Em todo o mundo, o nmero anual de casos novos de cncer infantil ultrapassa 200
mil, sendo que mais de 80% destes ocorreriam em pases desenvolvidos (Barr et al., 2006).
Em alguns pases em desenvolvimento, onde a populao de crianas chega a 50% do
total da populao geral, a proporo do cncer infantil representa de 3% a 10% do total de
neoplasias. J nos pases desenvolvidos, essa proporo diminui, chegando a cerca de 1%
(BOYLE; LENVIN, 2009).
A mortalidade do cncer infantil possui diferenas importantes em relao sua
frequncia. Enquanto nos pases desenvolvidos o bito por neoplasia a segunda causa de
morte na infncia, correspondendo a 4%-5% de crianas de 1 a 14 anos de idade, nos pases
em desenvolvimento, essa proporo menor, devido s mortes por doenas infecciosas
como malria, diarreias, e desnutrio (BOYLE; LENVIN, 2009).
As sobrevidas globais em 5 anos para crianas e adolescentes na dcada de 1990
variariam de 64% a 75%, com diferenas entre as regies para praticamente todos os grupos
de tumores. (Steliarova-Foucher et al., 2004).

Cncer infantil no Brasil

No Brasil, a vigilncia sobre a ocorrncia de cncer na populao tem como um de seus
principais pilares os Registros de Cncer de Base Populacional. Atualmente, 26 RCBP com
informaes disponveis permitem conhecer a real magnitude dos diferentes tipos de cncer.
Portanto, os RCBP desempenham papel fundamental no planejamento e avaliao das aes
da Poltica Nacional de Ateno Oncolgica (INCA, 2010). Estimativas de cncer apontam
que em 2015 ocorrero cerca de 11.840 casos novos de cncer em crianas e adolescentes
at os 19 anos de idade (INCA, 2014). A variao dos tumores infantis em relao ao total
de neoplasias de 1,5% a 6% (INCA, 2008; INCA, 2013). A mediana das taxas de incidncia
mostra que a cada um milho de meninos, 150 so casos novos diagnosticados. Nas meninas,
esse risco um pouco menor, 134/ 1.000.000 de casos novos.
6

Curso de vero 2015

Figura 1 Distribuio das taxas de incidncia de todas as neoplasias, ajustadas por idade*, em
crianas e adolescentes (0 a 19 anos), segundo o RCBP e perodo de referncia dos dados.
* Populao padro mundial, 1960.
Fonte: Registros de Cncer de Base Populacional; Mistrio do Planejamento, Oramento e Gesto (MPOG)/
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica (IBGE); Ministrio da Sade (MS)/INCA/Coordenao de Preveno
e Vigilncia (Conprev)/Diviso de Vigilncia e Anlise da Situao.

Para a mortalidade, em 2012, ocorreram 5.950 bitos por cncer em crianas e

adolescentes (0 a 19 anos). As neoplasias ocupam a segunda posio de bitos ocorridos
em 2012 no Brasil para crianas e adolescentes (1-19 anos de idade), perdendo somente
para bitos por causas externas, configurando-se como a doena que mais mata. Dentre
as neoplasias, as leucemias so o tipo de cncer que mais mata seguido pelos tumores do
sistema nervoso central (SNC) e pelos tumores sseos (BRASIL, 2010).

Curso de vero 2015

Figura 2 Distribuio proporcional das 10 principais causas de morte por neoplasia maligna, ambos
os sexos, 0 a 19 anos, Brasil, 2008 a 2012.
Fonte: MS/Secretaria de Vigilncia em Sade (SVS)/Sistema de Informao sobre Mortalidade (SIM); MPOG/
IBGE; MS/INCA/Conprev/Diviso de Vigilncia e Anlise da Situao.

Recentemente, cinco estudos brasileiros analisaram as informaes sobre incidncia e

mortalidade do cncer infantil (DE Camargo et al., 2009; DE Camargo et al., 2011; Reis
et al., 2011; Ferreira et al., 2012; Ferman et al., 2013).

Leucemia
A leucemia o tipo de cncer mais frequente em crianas e adolescentes na maioria das
populaes, variando de 25% e 35% de todas as neoplasias peditricas, sendo a Leucemia
Linfide Aguda (LLA) a de maior ocorrncia em crianas de 0 a 14 anos (Little, 1999;
Boyle; levin, 2009).
Em geral, a LLA mais incidente entre as crianas menores de 5 anos, acomete mais
os meninos do que as meninas com uma razo de sexo normalmente entre 1,1 e 1,4 (Parkin
et al., 1988; Little, 1999).
As leucemias surgem em clulas do sistema hematopoitico, no estgio inicial de
desenvolvimento, resultando em uma doena de incio rpido, denominada LLA. Quando
tem origem nas clulas granulocticas e monociticas so denominadas de leucemia mielide
aguda (LMA). Em crianas as leucemias crnicas so raras, ocorrendo somente na forma
denominada de leucemia mielomonocitica juvenil (LMMJ) diferenciado (BOYLE; LENVIN,
2009).
O diagnstico das leucemias baseia-se bem estudos da medula ssea (MO) e do sangue
perifrico (SP), como anlise morfolgica, imunofenotipagem, padres citogenticos e de
8

Curso de vero 2015

rearranjos dos genes. A diviso em grupos especficos importante para deciso teraputica,
prognstico e tambm para padronizao de estudos cientficos. As recomendaes de
classificaes estabelecidas por experts atravs da WHO so de grande utilidade clnica e
prognstica e vem sendo adotada mundialmente (POMBO-DE-OLIVEIRA, 2008; BAIN, 2010;
Creutzig et al, 2012).

Tumor do Sistema Nervoso Central (Meduloblastoma)

Os tumores do S.N. Central so heterogneos em relao histologia e as caractersticas
clnicas. Podem se desenvolver em reas diferentes, a partir de diferentes tipos de clulas
e podem ter tratamentos e prognsticos diferentes. Alm dos gliomas, ependimomas,
astrocitomas, etc, os tumores neuroectodrmicos primitivos (PNETs) representam,
aproximadamente, 20% de todos os tumores primrios do sistema nervoso central na infncia.
O meduloblastoma consiste em um PNET localizado no cerebelo e representa 40% dos
tumores cerebelares (PACKER et al., 1999).
A maior incidncia ocorre entre os 3 e 6 anos de idade sendo mais frequente em meninos
(KIM, W. et al., 2011). Nos Estados Unidos a incidncia dos meduloblastomas nas crianas
de 6,0 casos por milho (SMOLL; DRUMMOND, 2012). No Brasil, os tumores peditricos do
sistema nervoso central (SNC) foram o terceiro tipo de cncer infantil mais comum (entre 7 e
17% dos casos) (REIS; SANTOS; THULER, 2007).
Os tumores do SNC podem obstruir o fluido cerebroespinhal e, assim, aumentar a
presso intracranial. Os sintomas iniciais consistem em cefaleia, nusea e vmitos em jejum
(FRUHWALD; RUTKOWSKI, 2011). O tratamento sempre multidisciplinar baseado em
trs abordagens: cirrgica, radioterpica e quimioterpica. A mxima resseco do tumor
sempre o objetivo, desde que o procedimento no acarrete sequelas neurolgicas com
grande morbidade para o paciente. O tamanho residual do tumor aps a cirurgia, a idade do
paciente e/ou a presena de hidrocefalia influenciam na conduta teraputica (HEIDEMAN et
al., 1997; KIM, W. et al., 2011).

Neuroblastoma
O neuroblastoma o tumor slido extracranial mais comum em crianas com menos
de 5 anos de idade. Tem origem nas clulas da crista neural indiferenciadas durante o
desenvolvimento embrionrio (YOUNG et al., 1986; BRODEUR; CASTLEBERRY, 1997). A
incidncia mundialmente de 10,2 casos por milho em crianas com menos de 15 anos,
com a prevalncia em pases desenvolvidos de 1 em 7000 nascidos vivos (WOODS et al.,
2002; MARIS, 2010). As maiores taxas foram encontradas nos pases desenvolvidos, como
nos EUA (9,1 casos por milho) e as mais baixas em pases por poucos recursos como
Uruguai (2,9) (HECK et al., 2009). No Brasil a taxa de incidncia ajustada por idade variou
entre 2,3 (em Manaus) e 14,2 (em Curitiba) casos por milho (DE CAMARGO et al., 2011).
A localizao do tumor pode ser distribuda ao longo do tronco neural simptico, cerca
de 65% se localiza no abdmen, 20% no trax, 5% no pescoo, 5% na plvis e em 1% dos
pacientes o tumor no detectvel (BRODEUR, 2003; KUSHNER, 2004; COLON; CHUNG,
2011; DAVENPORT et al., 2012). Sintomas presentes podem ser febre e perda de peso, dor,
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Curso de vero 2015

distenso abdominal, linfoadenopatia, dificuldade respiratria causada pela hepatomegalia e,

principalmente, a presena de uma massa abdominal palpvel (HAASE; LAQUAGLIA, 2003).
O diagnstico pode ser realizado atravs de marcadores biolgicos como a deteco
de catecolaminas (cido vanilmandlico e cido homovanlico) na urina ou no plasma
das crianas ou atravs de exames de imagem como a tomografia computadorizada ou a
ressonncia magntica (XU, Y. et al., 2010). O tratamento direcionado de acordo com a
estratificao de risco e o estadio do paciente, consistindo em quimioterapia, resseco
cirrgica e/ou radioterapia (BRODEUR et al., 1993). O progresso na cura das crianas
portadoras de neuroblastoma no foi to acentuado, como ocorreu em outros tumores. Cerca
de 50% a 60% dos pacientes de alto risco apresentam recada tumoral, portanto a mortalidade
apresentou uma discreta diminuio (COLON; CHUNG, 2011).

Tumores renais (Nefroblastoma)

O nefroblastoma, tambm denominado de Tumor de Wilms, o principal tumor
renal da infncia. A incidncia do nefroblastoma varia geograficamente com a taxas de,
aproximadamente, 9,0 casos por milho nos Estados Unidos e Canad e 2 a 4 casos por
milho no Leste asitico (PARKIN, 1998; PASTORE et al., 2006; COONEY et al., 2007). No
Brasil a mediana da taxa de incidncia ajustada por idade para o nefroblastoma foi de 9,5
casos por milho (DE CAMARGO et al., 2011). Ocorrem mais frequentemente em crianas at
os cinco anos de idade, com um pico de incidncia entre dois e trs anos (PODE-SHAKKED;
DEKEL, 2011).
derivado das clulas-tronco mesodrmicas, possuindo uma histologia clssica
trifsica, com propores variadas de epitlio, blastema e estroma, que recapitula o rim
fetal, sendo classificada como um tumor de origem embrionria (SHARPE; FRANCO, 1995;
GELLER; KOCHAN, 2011; MASCHIETTO et al., 2011). Corresponde a um dos grandes
exemplos de sucesso teraputico. O tratamento deve ser sempre multidisciplinar, com cirurgia,
quimioterapia e radioterapia em casos selecionados. Os principais fatores prognsticos so o
estadiamento e o tipo histolgico. Oitenta por cento dos pacientes so curados e atualmente
um dos principais objetivos identificar marcadores de bom e mau prognstico permitindo
reduzir ou intensificar o tratamento (HABIB et al., 1993; DE CAMARGO; FRANCO, 1994;
SONN; SHORTLIFFE, 2008).

Retinoblastoma
Retinoblastoma (RB) a malignidade intra-ocular mais comum na infncia, afetando
aproximadamente uma em cada 14000 crianas nascidas vivas. A incidncia de retinoblastoma
unilateral tem sido maior nas regies em desenvolvimento, sugerindo que os fatores ambientais
relacionados com o nvel socioeconmico possam aumentar o risco da mutagnese nas clulas
da retina (ORJUELA et al., 2005). A incidncia varia de 3 a 4 casos por milho mundialmente
(RIES et al., 1999). No Brasil a incidncia variou de 2,8 (Cuiab) a 12,6 casos por milho em
Natal (DE CAMARGO et al., 2011).
O RB, tumor intra-ocular maligno, pode ocorrer de forma familial e de forma espordica.
Aproximadamente, 10% das crianas com retinoblastoma herdam dos pais o gene Rb1 com
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Curso de vero 2015

um dos alelos mutado, sendo ento classificado com familial. Ou seja, todas as clulas da
criana contm a mutao germinativa. O retinoblastoma espordico pode ser hereditrio
(atravs de uma mutao de novo durante o desenvolvimento embrionrio), ou no (atravs
de dois eventos mutacionais em clulas somticas da retina) (KNUDSON, A. G., JR. et al.,
1975; BUNIN et al., 1989a; MEHTA et al., 2012).
O tratamento atual visa no s a sobrevida, mas tambm preservar a viso e minimizar
as sequelas tardias. Os tratamentos utilizados so a crioterapia focal, radioterapia, laser ou
quimioterapia seguida por uma terapia focal quando possvel. O tratamento clssico consiste
na enucleao, ou seja, a remoo completa do olho. A doena disseminada extremamente
grave e na maioria dos casos fatal (CORSON; GALLIE, 2007).

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Curso de vero 2015

PARTE 2 - NVEIS DE PREVENO DO CNCER PEDITRICO

A carcinognese o processo de desenvolvimento de tumores. um processo que
se relaciona com diversos fatores, tais como: fatores de risco ambientais, infeces virais,
caractersticas genticas e susceptibilidade individual. Existem quatro nveis de preveno do
cncer (Figura 3).

Figura 3 - Nveis de preveno do cncer e pontos de interveno.

Fonte: Adaptado de BRASIL, 2009.

A preveno primria o mtodo mais eficiente de reduzir a morbimortalidade por

cncer. Visa prevenir o desenvolvimento inicial da doena, para isso atua na tentativa de
eliminar fatores de risco que possuem atividade carcinognica comprovada (RIBEIRO, 2008),
como por exemplo, o tabagismo. Entretanto o hbito tabagista no possui papel carcinognico
bem esclarecido para os tumores peditricos, visto que desde a exposio a este fator de
risco especfico at o desenvolvimento de tumores h a necessidade de um longo perodo
de exposio e latncia, o que no ocorre nestes tipos de tumores. Frente a este cenrio,
as exposies intrauterinas so as mais especuladas como possveis desencadeadoras
da carcinognese peditrica (BRASIL, 2009). O papel da exposio a fatores de risco em
diferentes perodos (pr-concepo, pr-natal ou ps-natal), a busca de fatores genticos
de susceptibilidade e de interaes gentica-ambiente tm sido estudados na gnese de
tumores embrionrios.
H uma falta de estudos etiolgicos de grande escala em todos os tipos de cnceres
infantis e h muito poucos dados referentes s possveis causas e mecanismos etiopatognicos.
Assim, ainda no existem ainda medidas de preveno primria efetivas no combate ao
desenvolvimento de cncer peditrico, com exceo da vacinao contra hepatite B, a qual
eficaz na preveno de hepatocarcinoma (NI, et al., 2004).
A relao da exposio radiao solar ultravioleta na infncia e a ocorrncia de cncer
de pele em adolescentes e adultos tem sido avaliado por vrios estudos e apontado um
incremento de risco, todavia estudos que avaliem esta exposio e a ocorrncia de cncer
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Curso de vero 2015

de pele melanoma e no melanoma peditricos ainda so limitados (BUKA, KORANTEG e

VARGAS, 2007).
A causa da maioria das leucemias no completamente elucidada, no entanto h
evidncias consistentes da associao com a exposio a radiaes ionizantes, agentes
alquilantes utilizados na quimioterapia, e exposio ocupacional ao benzeno. Alguns fatores
j esto bem estabelecidos como sendo fator de risco para o desenvolvimento da leucemia
como, por exemplo, a exposio intrauterina radiao ionizante (LITTLE, 1999). Outros,
embora j apresentem alguns resultados, ainda precisam de maiores esclarecimentos.
A exposio a fatores ambientais j foi associada ao risco do desenvolvimento dos
tumores do SNC, como a radiao ionizante, campos eletromagnticos, ocupao paternal
em indstrias qumicas, uso de tabaco durante a gravidez, exposio materna a compostos
N-nitroso, o consumo de carne processada e, como fator protetor, a ingesto de cido flico
durante a gestao (RIMM, I. J. et al., 1987; RON et al., 1988; RODVALL et al., 1990; NORMAN
et al., 1996; PRESTON-MARTIN et al., 1996; PRESTON-MARTIN et al., 1998; MCKEANCOWDIN et al., 1998; DIETRICH et al., 2005; BUNIN et al., 2006; SCHUZ et al., 2006).
O papel do cido flico foi estudado no desenvolvimento de tumores embrionrios.
Observou-se uma relao entre a reduo do consumo de alimentos com cido flico pelas
mes e um maior risco de seus filhos desenvolverem retinoblastoma e meduloblastoma. Aps
a fortificao do cido flico ser implementada no Canad e nos Estados Unidos, houve um
declnio da incidncia de neuroblastoma, de nefroblastoma e de tumores neuroectodrmicos
primitivos. (GRUPP, et al., 2011; LINABERY, et al., 2012)
O risco do desenvolvimento de neuroblastoma j foi relacionado a alguns fatores
demogrficos e ambientais com resultados inconsistentes. A ocupao parental na zona
rural (pesticidas), indstrias (campos eletromagnticos) e a exposio a hidrocarbonetos;
consumo maternal durante a gestao de lcool, maconha, anticoncepcionais, diurticos,
hipertensivos e analgsicos; hipertenso materna durante a gravidez; mes que possuam
doenas sexualmente transmissveis e infeces vaginais e prematuridade foram relatadas
(KRAMER et al., 1987; BUNIN et al., 1990a; WILKINS; HUNDLEY, 1990; SCHWARTZBAUM,
1992; MICHALEK et al., 1996; YANG et al., 2000; DE ROOS et al., 2001; SCHUZ et al.,
2001b; MCCALL; OLSHAN; DANIELS, 2005; BLUHM et al., 2006; PEARCE et al., 2006;
SCHUZ; WEIHKOPF; KAATSCH, 2007). No foram encontradas associaes significativas
entre fatores ambientais amplamente estudados como exposio a tabaco, herona, crack,
anfetaminas, raios X, agentes infecciosos e peso ao nascimento (SCHWARTZBAUM, 1992;
YANG et al., 2000; SCHUZ et al., 2001b).
Estudos tipo caso-controle relacionando os estilos de vida, exposies paternas/
maternas com o risco do desenvolvimento do tumor de Wilms, como a radiao ionizante,
chumbo, hidrocarbonetos, tabaco, solventes, pesticidas domsticos, alto peso ao nascer
(>4000g) tem sido reportados. Porm esses estudos apresentam resultados inconsistentes
e no confirmados (HICKS et al., 1984; WILKINS; SINKS, 1984; STJERNFELDT et al., 1986;
BUNIN et al., 1989a; OLSHAN et al., 1993; SCHUZ et al., 2001a; COONEY et al., 2007;
FEAR et al., 2009). O Grupo Cooperativo Brasileiro para o tratamento de Tumor de Wilms
(GCBTTW) realizou um estudo caso-controle de base hospitalar avaliando a exposio
paterna a pesticidas. Observou um risco quatro vezes maior quando os pais eram expostos
a pesticidas. Porm essa relao foi vista apenas nas crianas diagnosticados depois dos
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Curso de vero 2015

dois anos de idade sugerindo que exposio deve ter ocorrido aps o nascimento (SHARPE
e FRANCO, 1995).
Estudos caso-controle em crianas portadoras de retinoblastoma so escassos na
literatura. Estudos prvios que avaliaram fatores de risco para o retinoblastoma espordico
como o uso de raios X durante a gestao, baixo escolaridade maternal, idade parental
avanada, ocupao parental em indstrias metalrgicas ou expostos a radiao ionizante,
sugerem uma fraca associao (HICKS et al., 1984; BUNIN et al., 1989b; BUNIN et al.,
1990b). Orjuela e colaboradores estudaram, na cidade do Mxico, crianas portadoras de
retinoblastomas espordicos e demonstrou que a ingesto de frutas e vegetais foi menor
nas mes de crianas portadoras de retinoblastoma do que no grupo controle. O risco de ter
uma criana portadora de retinoblastoma em mes que consumiam menos de 2 pores de
vegetais foi de 3,4 vezes maior (OR, 3,4;95%IC 2,0-6,0) ou 3,9 vezes maior com baixo aporte
de folato (OR, 3,9;95% IC2,1-7,3) (ORJUELA, et al., 2005).
Embora haja evidncias das associaes ambientais ao desenvolvimento do cncer
infantil, a resposta para a pergunta de um pai/ me, Por que minha criana adquiriu cncer?,
ainda no possui uma resposta muito clara (BUKA; KORANTEG; VARGAS, 2007).
A preveno secundria consiste em avaliar indivduos assintomticos com o objetivo
de detectar doena oculta ou pr-clinica. O diagnstico precoce e o rastreamento so as
medidas includas neste nvel de preveno. O rastreamento capaz de identificar fatores de
risco, predisposio gentica, precursores e evidncias iniciais de determinada doena em
populaes em massa, ou em populaes especficas submetidas a um risco elevado para
tais doenas. Esse procedimento permite um melhor controle sobre as doenas previamente
detectadas. O objetivo final do rastreamento alcanar a reduo da morbimortalidade pelas
doenas objetos do rastreamento, se estes objetivos no puderem ser alcanados com a
estratgia empregada, a essncia do rastreamento perdida (RIBEIRO, 2008).
A Organizao Mundial de Sade em 1968 estabeleceu como princpios para o
rastreamento os seguintes:
A condio deve ser um importante problema de sade pblica;
Deve existir um tratamento aceitvel para os pacientes detectados;
Tecnologias para o diagnstico e tratamento devem estar disponveis;
A condio deve apresentar um perodo de latncia, ou de fase inicial reconhecido;
O teste ou exame deve ser adequado para a populao em anlise;
O teste deve ter boa aceitabilidade pela populao;
A histria natural da doena, desde o desenvolvimento, a latncia e a doena
estabelecida deve ser bem conhecida;
Deve-se existir polticas de acolhimento dos pacientes detectados;
O custo por caso detectado (incluindo diagnostico e tratamento) deve ser balanceado,
a fim de que seja factvel a sua aplicao, considerando as condies do sistema de
sade;
O processo de rastreamento deve ser contnuo, no basta que sejam realizadas
campanhas de rastreamento.
Um mtodo eficaz de preveno secundria deve possuir ndice de falso-negativo e
falso-positivo baixos. Alm disso, a sensibilidade e especificidade devem ser elevadas.
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Curso de vero 2015

A preveno secundria ainda no alcanada para os tumores peditricos. O

rastreamento j foi sugerido e abandonado para o neuroblastoma, com a deteco de cido
vanil mandlico na urina. Todavia no se reduziu a mortalidade por este tipo de tumor e ainda
a incidncia e o supertratamento se elevaram incrementados por um grupo de tumores que
provavelmente involuiriam ou maturariam espontaneamente (TREUNER e SCHILLING, 1995;
MARIS e WOODS, 2008).
Portadores da mutao germinativa R337H TP53 tm um importante incremento de
risco de desenvolvimento de uma srie de tumores, dentre eles o carcinoma adrenocortical em
crianas. Estudos epidemiolgicos estimam que na regio sul do Brasil haja uma frequncia
de 0,3% da populao que carrega esta mutao, portanto j foram propostas medidas de
rastreamento que visassem a deteco desta mutao no sentido de reduzir a ocorrncia dos
tumores a ela relacionados. No obstante, este tipo de rastreamento no detectaria uma fase
assintomtica da doena e sim um risco em potencial de desenvolver, no s o carcinoma
adrenocortical, como uma srie de outros tumores na infncia e na vida adulta. Ou seja, o
paciente detectado com a mutao seria submetido a um estresse s vezes desnecessrio.
Assim, o que fica recomendado que esforos sejam realizados no sentido de conscientizar,
informar e treinar a comunidade mdica para identificar melhor as famlias com alto risco
de cncer e direcion-los a programas de aconselhamento gentico (ACHATZ, HAINAUT &
ASHTON-PROLLA, 2009).
As caractersticas ao nascimento podem ter influncia no risco da criana desenvolver
cncer. A associao de anomalias congnitas com o risco aumentado do desenvolvimento
do cncer infantil tem sido relatada e pode indicar que essa populao seja de alto risco,
portanto devendo ser submetida a um rastreamento. A existncia dessa associao entre
cncer peditrico e defeitos ou anomalias congnitas pode indicar que alguns genes esto
envolvidos tanto em tumorignese quanto morfognese. Algumas alteraes cromossmicas
afetando dois ou mais genes tambm poderiam resultar em um espectro clnico que inclui
anomalias congnitas e risco constitutivo para o desenvolvimento de cncer (FISHER et al.,
2012, PLON et al., 2011).
As caractersticas ao nascimento, tais como peso, Apgar e a idade materna, tm sido
relatadas como fatores de risco em alguns estudos (HDJALGRIM et al. 2003; LI et al. 2012)
O escore Apgar ao nascimento revela a vitalidade do recm-nascido e um fator preditor de
mortalidade neonatal e prejuzos neurolgicos. O ambiente subtimo relacionado com um
baixo Apgar pode tambm estar associado a baixas respostas imunolgicas aos tumores. Li
et al. (2012) demonstraram que crianas com Apgar baixo aos 5 minutos com escore entre 0-5
apresentaram um risco aumentado de cncer infantil antes dos 6 meses de vida. Um escore
baixo pode estar relacionado etiologia do cncer iniciado durante o perodo fetal e diferentes
vias biolgicas podem estar associadas, incluindo o tratamento neonatal recebido aps o
nascimento. (BLUHM et al., 2008; SCHMIDT et al., 2010; SCHZ et al., 2011; SPECTOR et
al., 2005; SADETZKI et al., 2009) Diversos estudos epidemiolgicos sugerem que o alto peso
ao nascimento est associado a fator de risco para o cncer infantil. A idade materna elevada
tambm tem sido documentada em diversos estudos como sendo responsvel por aumentar
o risco de desenvolvimento de diferentes tipos de neoplasias infantis (FISHER et al., 2012).
O tumor de Wilms est associado com mais de 50 condies clnicas diferentes e
muitas anormalidades de caritipo. Todavia, evidencias conclusivas de aumento de risco
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Curso de vero 2015

para o desenvolvimento deste tipo de tumor so apresentadas essencialmente para uma

minoria destas condies relacionadas (SCOTT et al., 2006). O incremento de risco variado
e depende do tipo de sndrome que o paciente apresenta, o que pode ser visto na Tabela 1.
Recomenda-se o rastreamento com exames de ultrassom abdominal peridico nesses casos.
Tabela 1 - Condies que aumentam o risco de Tumor de Wilms, estratificados por grau de aumento
de risco.

Alto Risco (>20%)

Delees em WT1 (incluindo sndrome WAGR)
Truncagen e mutao missense em WT1 (incluindo a sndrome Denys-Drash)
Tumor de Wilms Familial
Sndrome de Perlman
Anemia de Fanconi D1/mutaes bialelicas em BRCA2
Risco Moderado (520%)
Sndrome de Frasier
Sndrome de Beckwith-Wiedemann
Sndrome de Simpson-Golabi-Behmel
Baixo risco (<5%)
Hemi-hipertrofia isolada
Sndrome de Bloom
Sndrome Li-Fraumeni e Li-Fraumeni-like
Hiperparatireoidismo hereditrio
Nanismo de Mulibrey
Trissomia do 18
Trissomia do 13
Delees 2q37
Fonte: Adaptado de Scott et al., 2006.

O retinoblastoma outro tipo de tumor especulado para se fazer o rastreamento com

exame de fundo de olho e averiguao da mutao do gene RB, mas em diversos estudos
realizados em diferentes localidades este rastreamento no promoveu incremento de sobrevida
global, entretanto o que se observou nestas pesquisas foi um aumento de sobrevida ocular
justificando o rastreamento em casos documentados de mutao Rb (ABRAMSON et al., 2003).
Khan & Al-Mesfer (2005), avaliaram a capacidade diagnstica do exame oftalmoscpico
direto em pupila farmacologicamente dilatada e concluram que 38% dos pacientes com
doena conhecida no foram detectados como portadores de retinoblastoma. Os autores
ainda relataram os potenciais efeitos adversos provocados pela prtica de dilatao pupilar
em crianas, tais como: taquicardia, hipertenso arterial, vmito e reaes psicticas.
A recomendao atual da Academia Americana de Pediatria que todas as crianas
faam o exame de reflexo vermelho nos olhos durante os dois primeiros meses de vida por
um pediatra ou outro mdico da ateno bsica devidamente treinado (AAP, 2003). Segundo
Ribeiro (2008), enquanto no h programas de rastreamento factveis para o retinoblastoma,
o que pode ser feito oferecer programas educacionais para os pais, prover cuidados efetivos
e conscientizar a populao dos sinais da doena, o que levaria ao diagnstico precoce, o
qual poderia inquestionavelmente salvar olhos e vidas.
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Curso de vero 2015

Preveno terciria em oncologia peditrica

A preveno terciria visa o tratamento minimizando os efeitos adversos, causados
pela doena e tratamento, bem como promover a reabilitao, pesquisa e registro de cncer.
Atualmente um dos grandes objetivos na oncologia peditrica obedece o lema a cura no
o suficiente. Temos que curar com a menor morbidade possvel. Nos ensaios clnicos atuais
j se considera como ponto fundamental a qualidade de vida.
As aes necessrias para a viabilizao dessas estratgias da preveno terciria so:
- Disponibilidade de mtodos teraputicos efetivos. Tratamento em centros especializados
com equipe interdisciplinar o padro ouro de atendimento em oncologia peditrica.
- Promoo de pesquisas bsica para descoberta de novos medicamentos, modelos de
tratamento e medidas que diminuam sequelas dos protocolos atuais.
- Promoo da reabilitao.
- Educao, orientao e apoio psicossocial aos pacientes e seus familiares.
- Implantao de Registros de Cncer.
O tratamento do cncer infantojuvenil vem evoluindo nos ltimos anos, a sobrevida
hoje dos diversos tipos de cncer pode chegar a 80%, chegando a mais de 90 % em tipos
especficos (como Tumor de Wilms, por exemplo) (NCI National Cancer Institute, 2013).
Segundo estimativas do Instituto Nacional do - INCA no Brasil as crianas ainda so
encaminhadas em estdios avanados de doena, o que tem impacto direto no tratamento
escolhido, na sobrevida e nas sequelas. Existindo necessidade de otimizar o diagnstico
precoce para alcanarmos os mesmos ndices de cura dos pases desenvolvidos (INCA,
2007).
As principais causas de atraso no diagnstico so: desinformao dos pais, medo do
diagnstico/negao, desinformao dos profissionais de sade e problemas na organizao
das redes de servio. (BRASIL. Ministrio da Sade. Instituto Nacional de Cncer. Diagnstico
precoce do cncer na criana e no adolescente (INCA, 2009).
Os atuais tratamentos tm dois grandes objetivos: aumentar as taxas de sobrevida,
minimizando os efeitos tardios; e reintegrar a criana na sociedade com qualidade de vida
(CAMARGO e KURASHIMA, 2007). Os pilares do tratamento oncolgico so quimioterapia
(os tumores de criana respondem melhor a quimioterapia que os dos adultos, isto atribudo
ao tipo de clula geralmente acometida), radioterapia e cirurgia (PIZZO; POPLACK, 2006).
O plano teraputico deve ser elaborado em centros especializados, conduzido por um
oncologista peditrico e com a participao de diversos profissionais da equipe multidisciplinar.
recomendado manter contato com o pediatra que fez o diagnstico e fazer consultas a outros
centros especializados, quando necessrio utilizar a telemedicina, desta forma oferecendo o
melhor tratamento disponvel para as crianas e adolescentes com cncer (Organizational
Principles to Guide and Define the Child Health Care System and/or Improve the Health of all
Children Pediatrics, 2014).
Um dos principais sucessos do tratamento a participao de uma equipe interdisciplinar.
A influncia do modelo fragmentado de organizao do trabalho, em que cada profissional
realiza parcelas do trabalho sem uma integrao com as demais reas envolvidas, tem sido
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Curso de vero 2015

apontada como uma das razes que dificultam a realizao de um trabalho em sade mais
integrador e de melhor qualidade, tanto na perspectiva daqueles que o realizam como para
aqueles que dele usufruem (PIRES, 1999). Considerando a realidade e as especificidades do
trabalho em sade, que desenvolvido por seres humanos para outros seres humanos, cuja
complexidade ultrapassa os saberes de uma nica profisso, que se tem defendido que o
trabalho em sade deve envolver prticas que se identificam com o que tem sido classificado
como multi, pluri, inter e transdisciplinaridade, por uma necessidade prpria da evoluo do
conhecimento e da complexidade que vo assumindo os problemas de sade na realidade
atua (PEDUZZI, 1998).
Sabe-se que em oncologia o melhor atendimento oferecido quando o servio possui
profissionais que integram a equipe multidisciplinar. O paciente oncolgico precisa ser visto
como um todo e no de forma fragmentada, sendo de fundamental importncia a interao
entre os profissionais de diversas reas de atuao (fonoaudilogo, psiclogo, terapeuta
ocupacional, mdico, enfermeiro, assistente social, fisioterapeutas, dentre outros), por isto a
importncia do cncer ser tratado em centros especializados.
Os principais fatores prognsticos do cncer so: tipo histolgico/caractersticas
biolgicas do tumor; estadiamento (doena localizada x metasttica, tamanho do tumor);
tratamento em centros especializados e por equipe interdisciplinar; polticas que viabilizam o
diagnstico precoce e o rpido acesso aos centros especializados de tratamento tm impacto
direto no prognstico do cncer infantojuvenil.

Tratamento individualizado de acordo com fatores biolgicos do tumor

Atualmente se discute a possibilidade e individualizar o tratamento, isto , personalizar
dependendo de fatores do hospedeiro e caractersticas do tumor. Entendendo o fentipo do
cncer, conhecendo as caractersticas genticas herdadas em cada indivduo, definindo alvos
moleculares e suas interaes e principalmente com o desenvolvimento de uma farmacologia
moderna que equilibre efeitos teraputicos e toxicidade, ser possvel atingir os ndices
teraputicos desejados para cada indivduo (MORAES, 2011).
Pacientes com doenas avanadas entram como sujeitos de pesquisa clnica aplicada
de drogas experimentais, desta forma tendo acesso a nova tecnologia e contribuindo para o
desenvolvimento do conhecimento e novos avanos teraputicos.
Nos tumores peditricos, alguns marcadores biolgicos foram estudados com objetivo
de realizar o diagnstico precocemente ou de caracterizar o prognstico de cada paciente.
Em relao ao neuroblastoma, por exemplo, podemos descrever os seguintes marcadores:
o Amplificao doMYCN: tumores com amplificao doMYCNso caracterizados por um
comportamento agressivo apresentando pior prognstico; est correlacionada com os
outros fatores como idade mais avanada, doena disseminada, hiperdiploidia e histologia
desfavorvel;
o Ploidia:O contedo de DNA est relacionado ao prognstico. Esse ndex categoriza em 2
grupos: diploide ou (ndex DNA ~ 1.0 ou ~2.0) ou hiperdiploide (geralmente triploide ~1.5).
A grande maioria dos tumores so hiperdiploides (triploide ou penta/hexaploide), menos da
metade so diploides. Os tumores diploides so mais frequentes em estdios avanados;
18

Curso de vero 2015

o Deleo de 1p36: a deleo do brao curto do cromossomo 1 est presente em 35% dos
casos de neuroblastoma ao diagnstico. Frequentemente, esta alterao est associada
a estdios avanados da doena e com a presena da amplificao deMYCN.O valor
independente da deleo 1p36 tem sido controverso mas evidncias recentes tm
sugerido que crianas com tumores localizados com perda allica 1p36 apresentam um
risco maior de recada, mesmo sem a amplificao deMYCN;
o Expresso de receptores de tironisas quinases:os receptores neurotrofinas, tais como os
genesNTRK1, NTRK2, NTRK3codificam para as protenas TrkA, TrkB e TrkC as quais so
importantes na sobrevida, crescimento e diferenciao das clulas neurais. A expresso
alta de TrkA no tumor correlaciona com as crianas portadoras de neuroblastoma com
menor idade ao diagnstico, estadio mais baixo, histologia favorvel e melhor prognstico.
Ao contrrio a expresso de TrkB fortemente associada a tumores agressivos e histologia
e fatores biolgicos desfavorveis, tais como amplificao de MYCN. Recentemente
foi documentado que um polimorfismo do gene NTRK1 (c.1810C>T) foi fator de pior
prognstico independente dos outros fatores prognsticos;
o Deleo de 11q:a perda allica de 11q este presente em 35 a 40% dos neuroblastomas.
Essa alterao quase nunca est associada amplificao do gene MYCN, porm
estfrequentemente associada a outros fatores de risco como estdio avanado, maior
idade e histologia desfavorvel. Dados recentes sugerem ser um fator independente de
recada tumoral;
o Ganho de 17q:o ganho do brao longo do cromossomo 17 associado com doena mais
agressiva. O ganho de um segmento fator preditivo de pior prognstico e o ganho do
cromossomo inteiro caracterstico do subtipo hiperdiploide.
Os diversos biomarcadores citados acima esto frequentemente inter-relacionados. O
grupo internacional padronizou os biomarcadores essenciais para o prognstico, orientando o
tratamento, nos quais inclui a amplificao doMYCN, contedo de DNA, a deleo do 11q23,
alm de informao sobre a histologia e dados clnicos de cada paciente (revisado por PARK
et al., 2008). O conhecimento das informaes genticas de cada tumor possibilitar uma
melhor classificao prognstica e um tratamento mais individualizado.

Preveno quaternria em oncologia peditrica

Atualmente denomina-se de preveno quaternria a melhoria da qualidade de vida
dos doentes prevenindo e aliviando o sofrimento dos prprios e de seus familiares, evitando
o excesso de intervencionismo mdico, detectando indivduos em risco do tratamento,
prevenindo a iatrogenia.
Nesse nvel de preveno visa evitar ou atenuar o excesso de intervencionismo medico,
atos desnecessrios ou injustificados passivos ou ativos. Essa fase corresponde o conceito
atual da OMS de Cuidados paliativos. O princpio fundamental para a preveno quaternria
PRIMUN NON NOCERE, obedecendo os princpios de beneficncia, no-maleficncia,
autonomia e justia. Existem diversas barreiras como a obstinao teraputica, falta de
preparo, falta de educao profissional, falta de confiana e competncia para uma boa
atuao na preveno quaternria.
19

Curso de vero 2015

Os Cuidados Paliativos consistem em uma abordagem ou tratamento visando a qualidade

de vida dos pacientes e seus familiares diante de doenas que ameacem a continuidade da
vida. Para tanto, necessrio avaliar e controlar no somente a dor, mas, todos os sintomas
de natureza fsica, social, emocional e espiritual (OMS, 2002). Os objetivos dos cuidados
paliativos sodiminuir o sofrimento do pacientee da sua famlia. O primeiro passo garantir
a melhor qualidade de vida possvel para o paciente.
Os cuidados paliativos devem prover conforto fsico, suporte psicossocial e espiritual.
importante reconhecer abertamente o processo de morrer e nem sempre considerar a morte
como uma falha de profissionais de sade ou da cincia ou como um inimigo (JUSTIN, 2008).
Quando um paciente est sob cuidados paliativos isso no significa que ele ser
abandonado ou que no receber medicao. H necessidades de cuidados intensivos e de
superviso mdica altamente qualificada com o objetivo de aliviar o sofrimento ou melhorar
a qualidade de vida dos pacientes terminais.O controle de sintomas, principalmente dor, a
base dos cuidados paliativos.
Devem ser oferecidos desde o diagnstico aumentando progressivamente dependendo
do curso da doena. Acompanha-se a criana e a famlia do diagnstico ao desfecho final,
sendo este a cura ou o luto. Este modelo de cuidado conhecido como ideal e obtm xito
no controle de sintomas bem como auxilia o nvel quaternrio de ateno ao cncer, que
diminuir a medicalizao que advm da obstinao teraputica e da incompreenso por parte
dos familiares do quadro real da criana (HENDRICKSON; McCORKLE).

Figura 4 - Modelo ideal de Cuidados Paliativos em Crianas.

Fonte: Michael B. Harris, 2004.

20

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25

Curso de vero 2015

APNDICE CRONOGRAMA DE ATIVIDADES

Segunda
02/02/2015
Visita aos
laboratrios

Epidemiologia

Apresentao
do curso

Discusso

Segunda
09/02/2015
Custo x
efetividade
do Controle
do Cncer
peditrico

Tera
10/02/2015
Discusso sobre
o contedo

Discusso

26

Tera
03/02/2015

Elaborao
do projeto de
pesquisa

Quarta
04/02/2015
Fatores de risco
e Nveis de
preveno
Discusso
Quarta
11/02/2015
Montagem da
apresentao
final

Quinta
05/02/2015
Marcadores
genticos
(prognstico e
susceptibilidade)
Discusso
Quinta
12/02/2015

Apresentao
do projeto

Sexta
06/02/2015
Tratamento
e Cuidados
paliativos
Discusso
Sexta
13/02/2015

Encerramento

MINISTRIO DA SADE
INSTITUTO NACIONAL DE CNCER JOS ALENCAR GOMES DA SILVA (INCA)

VII CURSO DE VERO DE PESQUISA EM ONCOLOGIA

CNCER HEREDITRIO

RIO DE JANEIRO, RJ
INCA
2015

2015 Instituto Nacional de Cncer Jos Alencar Gomes da Silva/ Ministrio da Sade.
Esta obra disponibilizada nos termos da Licena Creative Commons
Atribuio No Comercial Compartilha igual 4.0 Internacional.
permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a
fonte.
Esta obra pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade Preveno e Controle
de Cncer (http://controlecancer.bvs.br/) e no Portal do INCA (http://www.inca.gov.br).
Tiragem: XXXX exemplares
Elaborao, distribuio e informaes
MINISTRIO DA SADE
Instituto Nacional de Cncer JOS ALENCAR
GOMES DA SILVA (INCA)
Coordenao de Pesquisa e Educao
Rua Andr Cavalcanti, 37
Centro Rio de Janeiro RJ
Cep 20231-050
www.inca.gov.br
Curso III - CNCER HEREDITRIO
Pesquisador responsvel
Miguel ngelo Martins Moreira
Equipe
Brbara Lusa Soares
Raissa Coelho Andrade
Renan Gabriel Gomes Jnior

Normalizao editorial
Coordenao de Preveno e Vigilncia
Servio de Edio e Informao TcnicoCientfica
Rua Marqus de Pombal, 125
Centro Rio de Janeiro RJ
Cep 20230-240
Tel.: (21) 3207-5500

SUMRIO
1. Introduo ao Cncer hereditrio 5

1.1 Sndrome de cncer de mama e ovrio hereditrios 9

1.2 Sndrome de Lynch 12

1.3 Sndrome de Li-Fraumeni e Li-Fraumeni like 15
2. Metodologias empregadas no diagnstico do cncer hereditrio 18

2.1 Anlise de heredograma 18

2.2 Bancos de dados biolgicos 22

2.3 Sequncias de nucleotdeos 23

2.4 Extrao de DNA 27

2.5 Reao em cadeia de polimerase (PCR) 28

2.6 Eletroforese em gel de agarose 30

2.7 Sequenciamento de Sanger 33

2.8 MLPA 37

2.9 Genotipagem de Microssatlites 40

2.10 Imuno-histoqumica 43
2.11 Sequenciamento de nova gerao 46

APNDICES PROTOCOLOS 50

Curso de vero 2015

1. INTRODUO AO CNCER HEREDITRIO

Na maior parte dos casos, o cncer uma doena gerada a partir de eventos genticos e
epigenticos adquiridos ao longo da vida, que culminam com uma desregulao da sinalizao
celular, reparo ineficaz do DNA, senescncia celular aberrante, e finalmente, transformao
maligna. Entretanto, uma frao dos casos possui um forte componente hereditrio, com
padres mendelianos de herana, que responsvel por fentipos de predisposio a tumores
(SAMUEL et al., 2014).
A freqncia de cnceres hereditrios varia de acordo com o tipo tumoral, mas em
mdia, estima-se que 5 a 10% dos cnceres possuam essa predisposio herdvel, associada
a alteraes germinativas envolvendo oncogenes, supressores tumorais, e genes de reparo.
Diversos avanos foram feitos na identificao e deteco molecular dessas sndromes, e
hoje existem mais de 200 sndromes de cncer hereditrio descritas, que juntas contribuem
substancialmente com a morti-morbidade do cncer no mundo (NAGY et al., 2004). Exemplos
dessas sndromes podem ser observados no quadro 1.
A identificao dos indivduos acometidos importante por vrias razes: primeiro,
portadores dessas alteraes apresentam um risco bem maior de desenvolver cncer que a
populao em geral; segundo, outros familiares desses indivduos tambm podem apresentar
elevado risco de desenvolvimento de cncer; e terceiro, medidas de preveno e vigilncia
podem ser aplicadas a esses grupos, possibilitando reduzir riscos de desenvolvimento, e
detectar precocemente novos tumores, elevando as chances de cura (MINISTRIO DA
SADE, 2009; SAMUEL et al., 2014). A suspeita de sndrome hereditria de cncer em geral
ocorre quando as famlias possuem algumas das seguintes caractersticas:
Dois ou mais familiares com o mesmo tipo de cncer no mesmo lado da famlia;
Diversas geraes afetadas;
Idade precoce ao diagnstico em relao faixa etria normalmente vista para aquele
cncer;
Indivduos com mltiplos tumores primrios;
A ocorrncia de cnceres comuns a uma determinada sndrome na mesma famlia;
A ocorrncia concomitante de condies no-malignas e malignas no mesmo indivduo
e/ou famlia (por exemplo, hbito marfanide um quadro clnico com presena de
membros longos e frouxido articular, semelhante sndrome de Marfan em conjunto
com carcinoma medular de tireide: ambas condies relacionadas sndrome de
neoplasia endcrina mltipla tipo 2B).

Curso de vero 2015

Quadro 1. Sndromes de cncer hereditrio de alta penetrncia. Adaptado de NAGY et al., 2004.

Sndrome

OMIM#a

Incidncia
populacional
1/30 000 a
1/100 000
Desconhecida,
rara
Desconhecida,
rara
Rara
1/200 000
1/5000 a 1/10
000

Ataxia-telangiectasia

208900

ATM

BirtHoggDube

135150

BHD

Sndrome de Bloom

210900

BLM

Complexo de Carney
Sndrome de Cowden
Polipose adenomatosa
familial

160980
158350

PRKRA1A
PTEN

175100

APC

Melanoma maligno
familial

155600

Sndrome de
paraganglioma familial

168000,
185470

CDKN2A
(TP16), CMM1, Desconhecida
CDK4

Anemia de Fanconi

Sndrome de cncer
de mama e ovrio
hereditrios
Cncer gstrico difuso
hereditrio
Leiomiomatose e
Carcinoma de Clulas
Renais Hereditrio

Carcinoma renal
papilfero hereditrio
Sndrome de
hiperparatireoidismo/
tumor de mandbula
Sndrome de polipose
juvenil
Sndrome de Li
Fraumeni
Neoplasia endcrina
mltipla tipo 1
Neoplasia endcrina
mltipla tipo 2
Neurofibromatose tipo 1

Penetrnciab
100%
Desconhecida,
porm reduzida
100%
Desconhecida
9095%
100%
100%

SDHD, SDHB

Rara

Desconhecida

227650

FANCA,
FANCB,
FANCC,
FANCD,
FANCE,
FANCF,
FANCG,
FANCL

1/360 000

100%

113705,
600185

BRCA1
BRCA2

1/500 a 1/1000

At 85%

137215

CDH1

Desconhecida,
rara

90%

605839

FH

Desconhecida,
rara

Desconhecida,
porm reduzida

MLH1, MSH2,
MSH6, PMS1,
PMS2

1 em 400

90%

605074

MET

Desconhecida

Desconhecida,
porm reduzida

145001

HPRT2

Desconhecida,
rara

90%

174900

MADH4
(SMAD4),
BMPR1A

1/100 000

90100%

151623

TP53

Rara

9095%

131100

MEN1

1/100 000

95%

RET

1/30 000

70100%c

NF1

1/3000

100%

Cncer colorretal
114500
hereditrio no-polipose

Gene(s)

171400,
162300
162200

Curso de vero 2015

Quadro 1. Continuao.

Sndrome
Neurofibromatose tipo 2
Sndrome do carcinoma
nevide basocelular
Sndrome de quebra de
Nijmegen
Sndrome de Peutz
Jeghers (PJS)
Retinoblastoma
hereditrio (RB)
Sndrome de Rothmund
Thomson
Esclerose tuberosa (TS)
Von HippelLindau
(VHL)

Xeroderma pigmentoso
(XP)

101000

NF2

Incidncia
populacional
1/40 000

109400

PTC

1/57 000

90%

251260

NBS1

Rara

100%

175200

LKB1 (STK11) 1/200 000

180200

RB1

1/13 500 a 1/25

90%
000

268400

RECQL4

Rara

100%

191100,
191092

TSC1, TSC2

1/30 000

95100%

193300

VHL

1/36 000

9095%

278700,
133510,
278720,
278730,
278740,
278760,
278780

XPA, ERCC3,
XPC, ERCC2,
XPE, ERCC4,
ERCC5

1/1 000 000d

100%

OMIM#a

Gene(s)

Penetrnciab
100%

95100%

Nmeros OMIM Online Mendelian Inheritance in Man - um catlogo de doenas genticas disponvel
online. Os nmeros comeando em 1 indicam herana autossmica dominante; os que comeam em 2
indicam herana autossmica recessiva, e as que comeam em 6 so loci autossmicos ou fentipos
includos no catlogo aps maio de 1994. bA penetrncia estimada at os 70 anos de idade, e inclui
tanto ocorrncias malignas quanto benignas. Com exceo de MEN2, a penetrncia estimada clnica.
c
A penetrncia estimada de MEN2A de 70% at os 70 anos, mas por meio de teste bioqumico
(estmulo calcitonina com infuso de clcio pentagastrina), de 95100% at os 70 anos. dA incidncia
de XP no Japo de 1/40000.

O aconselhamento gentico um processo de suma importncia no cncer hereditrio.
Trata-se de um procedimento de comunicao que lida com os problemas associados
ocorrncia ou possibilidade de ocorrncia de um distrbio gentico em uma famlia,
levando em conta a informao, preveno, diagnstico precoce, e os aspectos psicossociais
e afetivos relacionados ao impacto e manejo da informao gentica. O objetivo principal
do aconselhamento gentico oncolgico a identificao dos indivduos portadores de
sndromes de predisposio hereditria ao cncer e o planejamento das medidas de vigilncia
ou preveno aplicveis s diferentes situaes de alto risco de desenvolvimento de cncer
(MINISTRIO DA SADE, 2009).
Com esse objetivo, o processo deve ser iniciado com a coleta de informaes a
respeito da histria familial do indivduo, para identificao dos critrios especficos para cada
sndrome, e os testes genticos adequados podem ento ser aplicados, contribuindo para a
predio de riscos e manejo do paciente e de seus familiares.
Abordaremos aqui algumas sndromes de cncer hereditrio investigadas em nosso
laboratrio, bem como as metodologias mais utilizadas para o diagnstico das mesmas.
7

Curso de vero 2015

Referncias:
MINISTRIO DA SADE. Rede nacional de cncer familial: manual operacional. 229 pp. Instituto
Nacional de Cncer Rio de Janeiro: INCA, 2009.
NAGY R, SWEET K, ENG C. Highly penetrant hereditary cancer syndromes. Oncogene, 23(38): 644570. 2004.
SAMUEL N, VILLANI A, FERNANDEZ CV, MALKIN D. Management of familial cancer: sequencing,
surveillance and society. Nat Rev Clin Oncol, 11(12):723-731. 2014.

Curso de vero 2015

1.1 Sndrome de cncer de mama e ovrio hereditrios

O cncer de mama, de forma geral, a primeira causa de morte relacionada ao cncer
em mulheres de todas as idades no Brasil e o mais prevalente no mundo (PARKIN, 2001). Do
total de casos de cncer de mama diagnosticados a cada ano, estima-se que de 5% a 10%
sejam hereditrios, ou seja, causados por uma alterao gentica herdada que confere a seu
portador um risco de cncer significativamente maior que o da populao em geral. Apesar da
alta incidncia, o cncer de mama possui um prognstico relativamente favorvel, com uma
taxa de sobrevivncia de 91% no primeiro ano aps o diagnstico e de 65% nos cinco anos
subsequentes (PALMERO, 2013).
A sndrome hereditria de cncer de mama e ovrio se destaca em relao s demais por ser
o tipo de cncer hereditrio mais incidente na populao feminina mundial (PALMERO, 2007).
Alem disso o cncer de mama tambm faz parte do espectro tumoral de vrias sndromes
de predisposio hereditria ao cncer (BRASIL, 2009). Mutaes germinativas nos genes
autossmicos dominantes de alta penetrncia BRCA1 e BRCA2 esto associadas a 60-80%
dos casos desse tipo de tumor hereditrio. Alm desses dois genes, mais de 20 outros genes
j foram descritos e associados a um risco de alto a moderado no desenvolvimento de cncer
de mama, tal como PTEN, TP53, MSH2, RAD51D. (HEARLE et al., 2006; SEAL et al., 2006;
SCHRADER et al., 2008; GONZALEZ-ANGULO et al., 2009; RAHMAN et al., 2010).
Alteraes germinativas na sequncia codificante do gene BRCA1 esto associadas a
45-50% de todos os casos de cncer de mama hereditrio (RISCH et al., 2007), e de 40-45%
para cncer de ovrio hereditrio (BEGG et al., 2008; WALSH et al., 2009; MAHFOUNDH et
al., 2011), alm de risco significativamente aumentado de neoplasias malignas colorretais,
da prstata, tumor de Wilms, entre outros (OFFIT, 1998; THOMPSON E EASTON, 2002;
HODGSON et al., 2007). Mutaes ocorridas no gene BRCA2 esto associadas a 30-40% de
todos os casos de cncer de mama hereditrio (RISCH et al., 2007; WALSH et al., 2009), e
de 10-25% para o cncer de ovrio (BEGG et al., 2008; MAHFOUNDH et al., 2011), alm de
casos de cncer de prstata, pncreas, estmago, vias biliares e melanoma (OFFIT, 1998;
The Breast Cancer Linkage Consortium, 1999; THOMPSON e EASTON, 2002). Desta forma,
os genes BRCA1 e BRCA2 figuram entre os principais no rastreamento da sndrome do
cncer de mama e ovrio hereditrios (HBOC), e a identificao de mutaes em indivduos
com risco para esta neoplasia tem sido priorizada pelos programas de rastreamento (BRASIL,
2009).
O diagnstico da sndrome dado pela anlise clnica do probando atravs do levantamento
do histrico familiar do indivduo, levando em considerao os casos de cncer na famlia.
O passo seguinte visa averiguar se o histrico do mesmo compatvel com os critrios
sugestivos para a sndrome, que normalmente incluem: a) Dois ou mais casos de cncer de
mama e/ou ovrio em idade precoce (antes dos 50 anos ou antes da menopausa); (b) Mltiplos
casos na famlia; (c) Cncer de mama bilateral e (d) Padro de transmisso vertical. Caso o
probando atenda aos critrios pr-estabelecidos, h um forte indcio de que o mesmo esteja
em risco para o cncer de mama hereditrio. Logo, ele submetido ao diagnstico gentico
de mutaes associadas aos genes BRCA1 e BRCA2, levando a perda de funo destes
genes. A tcnica baseia-se na reao em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento
pelo mtodo de Sanger e, em alguns casos, so utilizadas tcnicas complementares para o
9

Curso de vero 2015

rastreamento (WALSH et al., 2006). Aps o sequenciamento so realizadas anlises para a

determinao do significado clnico das mutaes a fim de direcionar a conduta a ser adotada.
A identificao de indivduos em risco para o cncer hereditrio importante por vrias
razoes. Primeiro, pelo fato do indivduo afetado apresentar um risco cumulativo vital superior
mdia da populao em geral, para vrios tipos de cncer. Segundo, porque outros
familiares do probando podem estar em risco para o cncer hereditrio, uma vez que os
tumores hereditrios apresentam um padro de herana autossmico dominante, ou seja,
cada indivduo possui a chance de 50% de herdar o alelo alterado. Por ltimo, a identificao
de familiares com alto risco para o desenvolvimento de cncer torna possvel a adoo de
medidas preventivas e profilticas, que tm se mostrado altamente eficazes na reduo do
risco de cncer (BRASIL, 2009; HARTMANN, 1999).

Referncias:
BEGG C. B. et al. Variation of breast cancer risk among BRCA1/2 carriers. The journal of the American
Medical Association, v. 299, n. 2, p. 194-201, 2008.
BRASIL, MINISTRIOS DA SADE, INSTITUTO NACIONAL DE CNCER. Rede Nacional de cncer
familial: Manual operacional, Instituto Nacional de Cncer, Rio de Janeiro, p. 229, 2009.
GONZALES-ANGULO, et al. High risk of recurrence of patients with breast cancer who have human
epidermal growth factor receptor 2-positive, node-negative tumors 1 cm or smaller. Journal of Clinical
Oncology, v. 27, n. 34, p. 5700-5706, 2009.
HARTMANN, L.C., et al. Efficacy of bilateral prophylactic mastectomy in women with a family history of
breast cancer. N Engl J Med 340, 77-84 (1999).
HEARLE, N. et al. Frequency and spectrum of cancer in the Peutz-Jeghers syndrome. Clinical Cancer
Research, n. 12, p. 3209-3215, 2006.
HODGSON SV, FOULKES WD, ENG C, MAHER ER. 2007. A practical Guide to Human Cancer
Genetics. Third edition. Cambridge University Press, Cambridge, p. 410, 2007.
MAHFOUNDH, W. et al. Hereditary breast cancer in Middle Eastern and North African (Mena)
populations: Identification of novel, recurrent and founder BRCA1 mutations in the Tunisian population.
Molecular Biology Reports, v. 39, n. 2, p. 1037-1046, 2011.
OFFIT, K. The common hereditary cancers. In: Clinical Cancer Genetics:
Management. Wiley-Liss, New York, p. 440, 1998.

Risk Counseling and

PALMERO, E, I. Hereditariedade e cncer de mama. Onco&, p. 38-41, 2013.

PALMERO, E, I. Identificao e caracterizao de pacientes em risco para cncer de mama hereditrio
no sul do Brasil. Tese (doutorado), 344p, 2007.
PARKIN, D.M. Global cancer statistics in the year 2000. Lancet Oncol 2, 533-543 (2001).
RAHMAN, N. et al. PALB2, which encodes a BRCA2-interacting protein, is a breast cancer susceptibility
gene. Nature Genetics, v.39, n.2, p. 165-167, 2010.
RISCH, H. A. et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrance: a
kin-cohort study in Ontario, Canada. Journal of the National Cancer Institute, v. 98, p.1694- 706, 2007.

10

Curso de vero 2015

SEAL, S. etal. Truncating mutations in the Fanconi anemia J gene BRIP1 are low-penetrance breast
cancer susceptibility alleles. Nature Genetics, v. 38, p. 12391241, 2006
SCHRADER, K.A. et al. Hereditary diffuse gastric cancer: association with lobular breast cancer. Familial
Cancer, vol. 7, p.73- 82, 2008.
THOMPSON, D.; EASTON, D. F. Cancer Incidence in BRCA1 mutation carriers. Journal of the National
Cancer Institute, v. 94, n. 18, p. 1358-1365, 2002.
WALSH, T. et al. Spectrum of Mutations in BRCA1, BRCA2, CHEK2, and TP53 in Families at High Risk
of Breast Cancer. Journal of the American Medical Association, v. 295, p.1379-1388, 2006.

11

Curso de vero 2015

1.2 Sndrome de Lynch

O cncer colorretal (CCR) representa a quarta causa de morte por cncer no mundo,
sendo que entre todos os tipos de cnceres o terceiro mais freqente entre homens e o
segundo entre mulheres (Wong et al., 2013). No Brasil, para o ano de 2014 foram esperados
15.070 casos novos de cncer de clon e reto em homens e 17.530 em mulheres (INCA,
2014).

O CCR obedece 3 padres distintos: o espordico, que ocorre pelo acmulo de
mutaes somticas e so responsveis por 80% dos casos; o hereditrio, provocado por
mutaes germinativas em genes de reparo do DNA; e o CCR familial, casos que impedem
sua classificao como espordicos, mas que seguem o padro de ocorrncia de casos
similar ao observado nas sndromes hereditrias.

Apenas 5% dos casos esto associados predisposio hereditria. Das sndromes
hereditrias, as mais freqentes so Sndrome de Lynch (HPNCC), representando 3-4%
dos casos e a polipose adenomatosa familial (FAP), representando menos de 1% dos casos
(SEPULVEDA; AISNER, 2010).

A formao de tumores nos casos de cncer colorretal se d por influncias de fatores
intrnsecos e extrnsecos. Entre os fatores extrnsecos esto a alimentao (dieta pobre
em fibras e rica em lcool e carnes vermelhas), idade, sexo, fatores de co-morbidade (ex:
doenas inflamatrias intestinais, obesidade, diabetes mellitus), estilo de vida (fumantes,
sedentarismo) (Wong et al., 2013) e, em alguns casos, influncia de infeces bacterianas
(exemplo: Fusobacterium) (Kostic et al., 2013). A patognese do CCR caracterizada pela
ativao de proto-oncogenes (KRAS, PIK3CA, BRAF) e inativao de genes supressores
de tumor (APC, TP53) por meio de alteraes genticas e/ou mecanismos epigenticos. A
predisposio gentica tambm afeta a susceptibilidade do cncer colorretal (YU et al., 2014).

Existem 3 vias moleculares principais que podem estar associadas com o aparecimento
do cncer colorretal: a instabilidade cromossmica (CIN), a instabilidade de microssatlites
(MSI- sequncias de repeties de 1 a 6 nucleotdeos em tandem, dispersas ao longo
do genoma) e a metilao das ilhas CpG (CIMP). Ao contrrio da via de CIMP, que est
exclusivamente associada com a forma espordica da doena, as vias CIN e MSI esto
tambm associadas forma hereditria da doena.

Dentre as sndromes hereditrias, a Sndrome de Lynch (SL) a mais frequente.
uma doena autossmica dominante de penetrncia 80%, caracterizada por mutaes nos
genes MSH2 e MLH1 (85-90% dos casos) e MSH6 e PMS2 (10-15% dos casos) (PELTOMAKI
et al., 2005; DRUMMOND et al., 1995). A presena de mutaes pontuais ou de mutaes que
levam perda de expresso de um dos genes acima capaz de provocar danos no reparo
de DNA por mau pareamento (do ingls, Mismatch repair -MMR). Pacientes com SL herdam
um alelo mutado dos pais, e uma mutao somtica inativa o outro alelo, contribuindo para o
aparecimento dos tumores.

A SL clinicamente caracterizada por ocorrncia precoce dos tumores (antes dos 45
anos de idade), predominncia do clon direito (proximal), e presena de tumores sincrnicos
(18% dos casos), metacrnicos (50% dos casos) ou extracolnicos (endomtrio, tumores do
trato gastrointestinal, estmago, etc). Os tumores so diferenciados, apresentando clulas
diplides em forma de anel de sinete. Os critrios clnicos para diagnosticar um paciente com
12

Curso de vero 2015

SL so baseados nos antecedentes familiares (Critrios de Amsterd) e na suspeita clnica

(Critrios de Bethesda), de acordo com os quadros 2 e 3, respectivamente. (ROSSI, 2011).
Quadro 2. Critrios de Amsterd para o diagnstico clnico de SL.

Pelo menos trs membros de uma mesma famlia com CCR, ou

adenocarcinoma de endomtrio, ou carcinoma de clulas transicionais
de vias excretoras renais (pelve renal ou ureter), ou adenocarcinoma de
intestino delgado
Um dos membros ser parente em 1 grau dos outros dois
Pelo menos duas geraes acometidas
Pelo menos um dos membros com CCR e idade menor que 50 anos
Excluso de polipose adenomatosa familiar (PAF)
Quadro 3. Critrios Critrios de Bethesda revisados para o diagnstico da SL.

CCR diagnosticado em paciente com menos de 50 anos

Presena de CCR sincrnico ou metacrnico, ou outro tumor extracolnico,
associado sndrome, independentemente da idade
CCR com histologia sugerindo MSI*, diagnosticado em paciente com menos
de 60 anos
CCR diagnosticado em um ou mais parentes em 1 grau, com tumor
relacionado sndrome, com um dos tumores tendo sido diagnosticado
antes dos 50 anos
CCR diagnosticado em um ou mais parentes de 1 ou 2 graus, com tumores
relacionados sndrome, independentemente da idade


Noventa porcento dos portadores da SL apresentam instabilidade de microssatlites
(MSI) no tumor. Os microssatlites so segmentos de DNA que apresentam repeties de
sequncias curtas de aproximadamentre 1 a 6 nucleotdeos (short tandem repeats- STRs).
Existem 5 marcadores moleculares mais recomendados para a investigao instabilidade
de microssatlites (MSI) para a confirmao do diagnstico de CCR: BAT25 e BAT26, que
apresentam repetices de mononucleotdeos; e D2S123, D5S346, D17S250, que apresentam
repeties de dinucleotdeos. A classificao dos tumores com base na instabilidade de
microssatlites realizada de acordo com a frequncia de alteraes destes marcadores:
estveis - nenhum marcador alterado (MSS); alta instabilidade - mais de um marcador alterado
(MSI-H); baixa instabilidade - apenas um marcador alterado (MSI-L) (BOLAND et al., 1998).
Alm da pesquisa por MSI, utiliza-se tambm a pesquisa por expresso de protenas
como diagnstico molecular da SL. Por meio de imuno-histoqumica possvel avaliar a
expresso dos principais genes envolvidos com SL, principalmente das protenas MLH1 e
MSH2, no tecido tumoral de pacientes com suspeita clnica de SL. O sequenciamento de
Sanger do gene correspondente protena no expressa deve ser tambm realizado
(BAUDHUIN et al., 2005).
13

Curso de vero 2015

Alm da SL, existe uma segunda sndrome mais freqente em pacientes com CCR.
Esta sndrome denominada Polipose Adenomatosa Familial (FAP), e ao contrrio da SL,
acompanhada pelo desenvolvimento de plipos gastroinstestinais, polipose duodenal e
aparecimento de milhares de plipos de clon e reto. Est presente em menos de 1% dos
indivduos com CCR e caracterizada pelo aparecimento de mutaes germinativas no gene
APC (cromossomo 5q21-22), apresentando penetrncia de 100%.

Referncias:
BAUDHUIN, L.M.; BURGART, L.J.; LEONTOVICH, O.; THIBODEAU, S.N. Use of microsatellite instability
and immunohistochemistry testing for the identification of individuals at risk for Lynch syndrome. Familial
Cancer, vol. 4, p.
DRUMMOND, J.T.; LI, G.M.; LONGLEY, M.J.; MODRICH, P. Isolation of an HMSH2-p160 heterodimer
that restores DNA mismatch repair to tumor cells. Science, vol. 268, p.1909-1912, 1995.
Kostic, A.D.; Chun, E.; Robertson, L.; Glickman, J.N, Gallini, C.A.; Michaud, M, et al.
Fusobacterium nucleatum potentiates intestinal tumorigenesis and modulatesthe tumor-immune
microenvironment. Cell Host & Microbe;14:20715, 2013.
PELTOMAKI, P. Lynch syndrome genes. Familial Cancer, vol. 4, p.227-232, 2005.
Rossi, B.M. Manual operacional: rede nacional de cncer familial. Rio de janeiro: Ministrio da Sade,
2011, 228.
SEPULVEDA, A.T.; AISNER, D.L. Molecular Basis of Diseases of Gastrointestinal Tract. In: COLEMAN,
W.B; TSONGALIS, G. Essential Concepts in Molecular Pathology. Estados Unidos: Elsevier Inc.,
fevereiro de 2010. 243-261.
Wong, S. H.; Sung, J.J.Y. ; Chana, F.K.L.; To, K. F. ; Ng, S.S.M.; Wang, X.J.; Yu, J.; WU, W. J.J.
Genome-wide association and sequencing studies on colorectal cancer. Seminars in Cancer Biology,
502-509, 2013.
Yu, J. et al. Novel recurrently mutated genes and a prognostic mutation signature in colorectal cancer.
Colon Cancer, v.0:110, 2014.

14

Curso de vero 2015

1.3 Sndromes de Li-Fraumeni e Li-Fraumeni like

A sndrome de Li-Fraumeni (SLF), descrita por Li e Fraumeni, em 1969, uma sndrome

hereditria de predisposio a diversos tipos de cncer em idade precoce. O diagnstico
clnico da SLF obtido pelo levantamento do histrico de cncer do probando e sua famlia, de
acordo com os seguintes critrios (LI et al., 1988): (1) Probando com sarcoma diagnosticado
antes dos 45 anos de idade; e (2) um familiar de primeiro grau com qualquer cncer antes dos
45 anos; e (3) um familiar de primeiro ou segundo grau com qualquer cncer antes dos 45
anos ou um sarcoma em qualquer idade (Figura 1).
A sndrome de Li-Fraumeni foi inicialmente associada a osteossarcomas, sarcomas de
partes moles, cncer de mama pr menopausa, tumores cerebrais, tumores adrenocorticais
e leucemias agudas (LI & FRAUMENI, 1969). Estes constituem os tumores cernes da SLF/
LFL, representando 77% dos cnceres relatados na sndrome. Entretanto, desde sua primeira
descrio, diversas neoplasias foram adicionadas a seu amplo espectro tumoral, como
tumores gastrointestinais, urogenitais, cncer bronquioalveolar de pulmo, melanoma, entre
outros (BIRCH et al., 2001; HARTLEY et al., 1994).

Figura 1. Heredograma de uma famlia portadora da sndrome de Li-Fraumeni. Crculos e quadrados

preenchidos representam membros afetados com cncer. As barras atravessando crculos e quadrados representam
familiares falecidos. Os nmeros representam as idades ao diagnstico. BB = Cncer de mama bilateral (bilateral
breast cancer); CNS = Tumor de sistema nervoso central (brain tumor) ; BR = Cncer de mama unilateral
(unilateral breast cancer); LK = leucemia (leukemia); CPC = carcinoma do plexo coride (choroid plexus
carcinoma); RMS = rabdomiossarcoma; OS = osteossarcoma. Retirado de MALKIN, 2011.

Outros autores definiram critrios mais abrangentes para a sndrome, que possibilitam
a incluso de famlias que no possuem o fentipo clssico da sndrome, mas exibiam diversos
casos de cncer em idade precoce. Suas definies foram classificadas como variantes de
Li-Fraumeni, ou sndrome de Li-Fraumeni like. So eles:
Critrios de Chompret (revisado por TINAT et al., 2009): (1) probando com tumor do
espectro da sndrome de Li-Fraumeni antes dos 46 anos de idade, e (2) pelo menos um familiar
de primeiro ou segundo grau com tumor da SLF (exceto cncer de mama se o probando tiver
cncer de mama) antes dos 56 anos; ou (1) um probando com mltiplos tumores (exceto
tumores de mama), tendo o primeiro deles ocorrido antes dos 46 anos, ou (1) probando
diagnosticado com carcinoma adrenocortical ou tumor do plexo coride.
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Critrios de Birch (BIRCH et al., 1994): (1) probando com cncer infantil, sarcoma,
tumor de SNC ou carcinoma adrenocortical antes dos 45 anos; e (2) um familiar de primeiro ou
segundo grau com um cncer tpico da sndrome de Li-Fraumeni (sarcoma, cncer de mama,
SNC, ADR ou leucemia) em qualquer idade e (3) um familiar de primeiro ou segundo grau com
qualquer cncer antes dos 60 anos.
Critrios de Eeles (EELES et. al., 1995): presena de dois familiares de primeiro ou
segundo grau com tumores relacionados SLF (sarcoma, cncer de mama pr-menopausa,
tumor de SNC, leucemia, ADR, melanoma, cncer de prstata, cncer pancretrico) em
qualquer idade.
At o momento, o nico gene definitivamente associado sndrome o supressor
tumoral TP53. Mutaes germinativas nesse gene esto relacionadas a um risco cumulativo
de cerca de 90% para o desenvolvimento de cncer ao longo da vida (BIRCH et al., 2001).
Localizado no brao curto do cromossomo 17, TP53 extende-se por 20 kb e est organizado
em 11 xons, sendo os xons 2-11 codificantes, responsveis pela traduo da protena p53.
A protena p53 produzida constitutivamente nos tecidos humanos, sendo reponsvel pela
regulao do ciclo celular em resposta a situaes de stress celular (como hipxia, danos
ao DNA, privao de nutrientes, e ativao oncognica), ativando a transcrio de genes
especficos, podendo induzir a parada do ciclo celular, apoptose, reparo do DNA, senescncia,
entre outros (TOLEDO E WAHL, 2006). Por sua funo anti-proliferativa em clulas que
sofreram danos no DNA, o TP53 tem papel crtico no bloqueio do desenvolvimento tumoral,
e foi denominado guardio do genoma (LEE E BERNSTEIN, 1993). Mutaes germinativas
em TP53 so encontradas em pelo menos 70% dos pacientes com SLF clssica, e em 20 a
40% dos pacientes com sndrome de Li-Fraumeni like (VARLEY et al., 1997).
A sndrome de Li-Fraumeni e sua variante Li-Fraumeni like so especialmente
prevalentes no Sul e Sudeste do Brasil (ACHATZ, 2008), devido ocorrncia da mutao
germinativa R337H, com frequncia allica estimada na populao brasileira do sul e sudeste
de 0,3% (PALMERO et al., 2008). A R337H, primeiramente associada a tumores adrenocorticais
em crianas, consiste em uma troca de G>A no xon 10 de TP53, culminando com a troca de
uma arginina por uma histidina no domnio de oligomerizao da p53 (RIBEIRO et al., 2001;
FIGUEIREDO et al., 2006). A mutao germinativa R337H est presente em 89,7% das
famlias com SLF e LFL no Brasil (ACHATZ, 2008).
O sequenciamento do gene TP53 indicado a pacientes que preencham os critrios
clnicos para a SLF/LFL. Uma vez detectada a mutao, deve ser oferecido o acompanhamento
a esses pacientes, visando um esclarecimento a respeito de medidas preventivas para o
desenvolvimento de novos tumores, e a utilizao de exames de rotina para deteco precoce
dos mesmos. O exame gentico tambm deve ser oferecido aos familiares, tanto sintomticos
quanto assintomticos. Por se tratar de uma sndrome com amplo espectro tumoral, deve-se
avaliar inicialmente os tumores mais incidentes dentro de cada famlia para a realizao de
exames peridicos adequados nos indivduos sob risco. No caso das mulheres, o rastreio
de cncer de mama sempre ser sempre uma prioridade. O autoexame mensal das mamas
deve ser iniciado aos 18 anos, e os exames de imagem devem ser iniciados a partir dos 20-25
anos, ou 5 a 10 anos antes da idade ao diagnstico mais precoce na famlia (STRONG, 2003).

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Referncias:
ACHATZ MI, HAINAUT P, ASHTON-PROLLA P. Highly prevalent TP53 mutation predisposing to many
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BIRCH JM, HARTLEY AL, TRICKER KJ et al. Prevalence and diversity of constitutional mutations in the
p53 gene among 21 Li-Fraumeni families. Cancer Res. 1994 Mar 1;54(5):1298-304.
BIRCH JM, ALSTON RD, MCNALLY RJ, et al. Relative frequency and morphology of cancers in carriers
of germline TP53 mutations. Oncogene. 2001 Aug 2;20(34):4621-8.
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2001 Jan;38(1):43-7.
EELES RA. Germline mutations in the TP53 gene. Cancer Surv. 1995;25:101-24.
FIGUEIREDO BC, SANDRINI R, ZAMBETTI GP, et al. Penetrance of adrenocortical tumours associated
with the germline TP53 R337H mutation. J Med Genet. 2006 Jan;43(1):91-6.
LI FP, FRAUMENI JF JR, MULVIHILL JJ, BLATTNER WA, DREYFUS MG, TUCKER MA, MILLER RW.
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RIBEIRO RC, SANDRINI F, FIGUEIREDO B, et al. An inherited p53 mutation that contributes in a
tissue-specific manner to pediatric adrenal cortical carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul
31;98(16):9330-5.
STRONG LC. General keynote: hereditary cancer: lessons from Li-Fraumeni syndrome. Gynecol Oncol.
2003 Jan;88(1 Pt 2):S4-7
TINAT J, BOUGEARD G, BAERT-DESURMONT S, et al. 2009 version of the Chompret criteria for Li
Fraumeni syndrome. J Clin Oncol. 2009 Sep 10;27(26):e108-9.
TOLEDO F, WAHL GM. Regulating the p53 pathway: in vitro hypotheses, in vivo veritas. Nat Rev Cancer.
2006 Dec;6(12):909-23.
VARLEY JM, EVANS DG, BIRCH JM. Li-Fraumeni syndrome--a molecular and clinical review. Br J
Cancer. 1997;76(1):1-14.

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2. Metodologias empregadas no diagnstico do cncer

hereditrio
2.1 Anlise de heredograma
O levantamento histrico das famlias permite determinar o padro de herana em que
certas caractersticas aparecem, o que permite ao geneticista saber se uma caracterstica
ou no hereditria e de que modo ela herdada. Esse levantamento feito na forma
de uma representao grfica denominada heredograma ou pedigree, tambm conhecida
como genealogia ou rvore genealgica. A construo de um heredograma consiste na
representao, usando smbolos, das relaes de parentesco entre os indivduos de uma
famlia. Cada indivduo representado por um smbolo que indica as suas caractersticas e
sua relao de parentesco com os demais.
Os principais smbolos so os seguintes:

Em alguns casos, abaixo da representao grfica, segue o tipo de cncer adquirido

pelo indivduo bem como a idade na qual o tumor foi identificado. Podemos tambm encontrar
informaes a respeito do teste gentico, com o smbolo +, indicando a presena da mutao
no gene em questo, em caso de ausncia da mutao, ou ambos os smbolos em caso do
teste gentico para mais de um gene.

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Figura 2. Representao hipottica do histrico familiar de cncer de mama (CM) composto por trs
geraes. A seta preta indica o probando (III:3), o nmero e os sinais +/+ indicam a confirmao de
mutao para o genes BRCA1 e BRCA2, respectivamente, aos 34 anos de idade. O heredograma
apresenta ainda a confirmao de cncer de mama na me do probando (II:2) diagnosticada aos 51
anos, e av (I:2) diagnosticada aos 60 anos partir de exames anatomopatolgicos.

Alm disso, informaes especficas para a mutao detectada podem estar presentes,
como por exemplo a mutao R337H, localizada no xon 10 do gene TP53, entre outros tipos
de representao.

Figura 3. Representao do histrico familiar de probandos assintomticos (III.6 e IV.12) portadores de

mutao R337H para a sndrome de Li-Fraumeni participantes do programa de rastreamento de mama.
Indivduos afetados so representados pelos smbolos hachurados. A seta preta indica os probandos,
o nmero indica a idade atual, o nmero entre parnteses indica do diagnstico e o nmero seguido da
letra m, idade de falecimento. WT (Wild-type): alelo selvagem. (Achatz, 2008 modificado).

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Com podemos observar, a montagem de um heredograma obedece a algumas regras,

so elas:
1) Em cada casal, o homem deve ser colocado esquerda, e a mulher direita, sempre
que for possvel.
2) Os filhos devem ser colocados em ordem de nascimento, da esquerda para a direita.
3) Cada gerao seguinte indicada por algarismos romanos (I, II, III, etc.). Dentro de cada
gerao, os indivduos so indicados por algarismos arbicos, da esquerda para a direita.
A anlise dos heredogramas permite, na maioria dos casos, determinar o gentipo
das pessoas envolvidas (pelo menos em parte delas), e o padro de herana de uma certa
caracterstica, se autossmica, dominante ou recessiva, e etc. Quando um dos membros
de um heredograma manifesta um fentipo dominante, e no conseguimos determinar se ele
homozigoto dominante ou heterozigoto, normalmente o seu gentipo indicado como A-,
B- ou C-, por exemplo.
Nainterpretao de um heredograma, a primeira informao que se procura se o carter
em questo condicionado por umgenedominante ou recessivo. Deste modo, deve ser
procurado no heredograma casais fenotipicamente idnticos e que tiverem um ou mais filhos
diferente deles. Caso a caracterstica no tenha se manifestado em nenhum dos membros do
casal e manifestou-se no filho, significa que esta caracterstica provavelmente determinada
por um alelo recessivo. Depois de identificado o padro dominante e recessivo, deve ser
identificado o homozigoto recessivo, pois todos eles manifestam o carter recessivo. Em
seguida, identificam-se os gentipos dos outros indivduos, levando em considerao dois
importantes pontos:
1) Em um par de alelos, um veio do pai e o outro veio da me. Se um indivduo homozigoto
recessivo, ele deve ter recebido um alelo recessivo de cada ancestral.
2) Se um indivduo homozigoto recessivo, ele envia o alelo recessivo para todos os
seus filhos. Dessa forma, como em um quebra-cabeas, os outros gentipos vo sendo
descobertos. Todos os gentipos devem ser indicados, mesmo que na sua forma parcial (A-,
por exemplo).

Para o diagnstico clnico das sndromes hereditrias de cncer o ideal documentar
detalhadamente a histria familiar mediante registro do heredograma com os dados obtidos,
que deve incluir, pelo menos, trs geraes, pelo lado paterno e materno do caso-ndice e
confirmao de todos os casos de cncer na famlia, atravs de laudos anatomopatolgicos e
a declarao de bito (ARAJO, 2007).

Diante de um heredograma incluindo vrias geraes de todos os casos de cncer na
famlia, bem como as respectivas idades ao diagnstico, realizada uma anlise criteriosa do
mesmo, com o intuito de verificar se preenche os critrios clnicos de incluso preconizados
pelas sndromes de predisposio hereditrias ao cncer (PALMERO, 2007).
Alm da representao esquemtica, h uma linguagem normalmente utilizada neste
tipo de estudo. Abaixo seguem os principais termos utilizados:
Carter hereditrio: uma caracterstica gentica transmissvel, que pode ou no ser
congnita ou seja, pode se manifestar antes ou depois do nascimento.
Herana autossmica:determinada por genes situados nos cromossomos autossmicos, ou
seja, aqueles que so igualmente compartilhados por indivduos do sexo masculino e feminino.
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Herana ligada ao X:determinada pelos genes situados na poro do cromossomo X que

no apresenta nenhuma homologia com o cromossomo Y, o que provoca uma diferena
significativa na forma como esta se distribui entre o sexo masculino e feminino.
Penetrncia:se refere frao de indivduos de uma populao que apresentam um
determinado fentipo entre todos aqueles que so capazes de exibi-lo. Quando um homozigoto
recessivo no exibe o fentipo para uma caracterstica correspondente, ou quando um portador
de um alelo dominante no exibe o fentipo correspondente, diz-se que a caracterstica exibe
penetrncia incompleta. Se todos os indivduos que apresentam um determinado alelo exibem
um mesmo fentipo, diz-se que a caracterstica apresentapenetrnciacompleta.
Expressividade:se refere ao grau com que uma caracterstica hereditria pode se manifestar
nos indivduos. Isso ocorre porque certos alelos podem apresentar diferentes nveis de
expresso entre indivduos diferentes.

Referncias:
ACHATZ, M. I. A. S. W. Modificadores de penetrncia de mutaes germinativas no gene TP53 em
famlias brasileiras com diagnstico clnico da sndrome de Li-Fraumeni e Li-Fraumeni like: Impacto
dos polimorfismos intragnicos do TP53 e de genes que regulam a atividade da p53. Tese (doutorado).
Faculdade de medicina da Universidade de So Paulo, So Paulo (SP), 2008.
ARAJO, L. H. L. M. Metstases gstricas de cncer de mama: Relato de caso e reviso da literatura.
Revista brasileira de cancerologia, Rio de Janeiro, 53(3):365-368, 2007.
CAVALLARO, A. et al. Molecular screening in Sicilian families with hereditary non-poliposis colorectal
cancer (H.N.P.C.C.) syndrome: Identification of a novel mutation in MSH2 gene. International journal of
surgery, 2014.
PALMERO, E. I. Identificao e caracterizao de pacientes em risco para cncer de mama hereditrios
no sul do Brasil. 2007, 64p. Tese (doutorado) Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de
Biocincias. Programa de Ps-Graduao em Gentica e Biologia Molecular. Porto Alegre (RS), 2007.
Hereditariedade e a natureza da cincia. Disponvel em: <http://dreyfus.ib.usp.br/bio203/texto1.pdf>.
Acesso em 31/10/2014.
Universidade Estadual de Londrina. <http://www.uel.br/pessoal/rogerio/genetica/respostas/pratica_12.
html>. Acesso em 31/10/2014.

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2.2 Bancos de dados biolgicos

Um Banco de dados biolgicos constitui um grande conjunto organizado de dados com
contedo de carter biolgico, geralmente associado a um software projetado para atualizar,
consultar e recuperar componentes dos dados armazenados no sistema. Tem como objetivo
organizar a informao biolgica e disponibiliz-la de maneira simples aos pesquisadores em
um nico lugar, reduzindo enormemente a dificuldade de encontrar e acessar a informao,
bem como o tempo gasto na busca.
Com o avano da tecnologia, existem cada vez mais sequncias e anotaes. Isso torna
fundamental o uso de um banco de dados bem estruturado que permita o armazenamento,
o acesso e o processamento destas informaes de forma simples e eficiente. Com esse
objetivo, uma base de dados pblica foi criada, o NCBI (National Center for Biotechnology
Information) (Figura 1). Hoje ele uma das mais importantes bases de pesquisa cientfica, em
termos de informaes sobre sequncias, reunindo trabalhos acadmicos de todos os pases
e com artigos em diversos idiomas.
Os bancos de dados de genoma representam uma das principais ferramentas de
suporte para os bilogos moleculares e geneticistas. de fundamental importncia para a
pesquisa nesta rea realizar cadastros de sequncias e de algumas anotaes relacionadas,
e realizar consultas nestes bancos a fim de levantar dados para anlises biolgicas. Entre
estas anlises possvel destacar a comparao de sequncias a identificao de genes, e
caracterizao das funes de uma sequncia de DNA/RNA ou protena.
Os bancos de dados aplicados biologia molecular podem ser classificados de acordo
com as informaes biolgicas que armazenam, que so, principalmente, de:
Sequncias (de nucleotdeos ou de protenas) e anotaes sobre as mesmas;
Protenas e informaes sobre as respectivas funes;
Estruturas de molculas de protenas (secundrias, representadas em um
plano, ou tercirias, representadas em trs dimenses);
Taxonomia (classificaes dos organismos vivos);
Bibliografia na rea de biologia molecular (artigos, jornais, peridicos, etc).

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2.3 Sequncias de nucleotdeos

Os bancos de sequncias de nucleotdeos armazenam, alm da prpria sequncia,
anotaes contendo dados de caractersticas biolgicas relevantes sobre elas, que so:
organismo a que pertencem, regies das sequncias que codificam molculas de protenas,
funo, fentipo, e links para outros bancos de dados contendo informaes biolgicas sobre
a sequncia. Embora exista um controle sobre erros comuns detectados na submisso de
sequncias ao banco, a qualidade da informao de responsabilidade do pesquisador que
submeteu a sequncia, obedecendo a diferentes critrios sobre a qualidade da sequncia que
est sendo enviada. Alm disso, alguns tm a preocupao de retirar da sequncia os dados
de clones vindos do sequenciamento, outros no agem desta forma, poluindo a sequncia
com informaes desnecessrias. Assim, redundncias e inconsistncias so inevitveis. Os
bancos de dados de nucleotdeos apresentam, portanto, alguns erros. As sequncias existentes
nestes bancos podem estar incompletas, e com erros oriundos do prprio sequenciamento.
O principal banco de dados e mais importante que armazenam sequncias de
nucleotdeos o GenBank. O GenBank um repositrio amplo de sequncias de nucleotdeos,
usado como referncia no sentido de verificar se uma dada sequncia j est catalogada. O
histrico do volume de sequncias armazenadas no GenBank demonstra que, a cada ano, o
nmero de sequncias armazenadas cresce cerca de 70%.

Figura 4. Interface do banco de dados NCBI.

O Genbank armazena sequncias de nucleotdeos e protenas, alm de informaes

biolgicas relevantes sobre cada sequncia, que so, por exemplo, o nome cientfico e a
taxonomia do organismo de origem, um conjunto de anotaes que especificam regies
codificantes na sequncia e tambm outras regies de relevncia biolgica. Nestas anotaes
esto includas ainda informaes sobre as protenas sintetizadas nas regies codificantes
que foram anotadas (funo, estrutura, etc.). Um registro do GenBank identificado pelo
atributo nmero de acesso. A seguir apresentado um exemplo de registro do GenBank.
Cada registro possui rtulos que definem a informao que est armazenada.

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Os rtulos referem-se s seguintes informaes biolgicas:

Locus: nome curto escolhido para sugerir a definio da sequncia.
Definition: descrio concisa da sequncia.
Accession: nmero de acesso primrio, um valor nico e imutvel atribudo para cada
sequncia.
Keywords: palavras-chave associadas ao gene ou a outras informaes sobre o registro.
Source/Organism: O campo Source consiste de duas partes. A primeira parte encontrada
depois do rtulo Source e contm o nome do organismo onde a sequncia foi encontrada. A
segunda parte consiste de informaes encontradas depois do rtulo secundrio Organism.
Ela possui o nome cientfico formal do organismo (gnero e espcie, onde foi catalogado)
seguido por sua taxonomia.
Reference: citaes a todos os artigos que contm dados sobre este registro.
Authors: lista os autores na ordem em que eles aparecem no artigo citado.
Title: ttulo da publicao.
Journal: citao da literatura para o registro da sequncia. A palavra Unpublished aparecer
depois do rtulo secundrio Journal se os dados no aparecerem na literatura cientfica, mas
foram diretamente depositados no banco de dados. Para as sequncias publicadas a linha
Journal contm a tese, a revista, ou o livro, incluindo o ano de publicao.
Remark: comentrio que especifica a relevncia da citao do registro.
Comment: referncias cruzadas para outras sequncias, comparaes com outras colees,
anotaes de modificaes no nome do Locus e outras observaes.
Features: tabela que contm caractersticas encontradas em determinados stios da
sequncia.
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Base Count: sumrio do nmero de ocorrncias de cada cdigo base na sequncia.

Origin: especificao de como a primeira base da sequncia relatada est localizada dentro
do genoma. Isto possivelmente inclui sua localizao dentro de um grande mapa gentico.
Sequence: informa a sequncia de nucleotdeos.
Uma vez detectada uma variao gentica em um paciente com cncer hereditrio, o
GenBank pode ser utilizado para verificar se a variante em questo j foi descrita, a localizao
exata da variante no gene, e em muitos casos o banco de dados contm informaes sobre a
relevncia clnica da mesma, alm de links para as referncias relacionadas variante. Essas
referncias normalmente esto contidas banco de dados de literatura biomdica tambm
desenvolvido pelo NCBI, o Pubmed, que o banco de banco de dados mais conhecido nessa
rea, com mais de 24 milhes de citaes. No Pubmed esto disponveis artigos sobre as
mais diversas doenas e tecnologias voltadas sade, sendo uma ferramenta rotineira na
investigao biomdica.
Existem tambm bancos de dados especializados em reunir informaes sobre
alteraes genticas em cncer. O International Agency for Research on Cancer TP53
database (IARC TP53 database), um banco de dados voltado para o gene TP53, que rene
estatsticas relacionadas s mutaes germinativas e somticas relatadas neste gene (os tipos
de tumores nos quais essas mutaes foram encontradas, a frequncia de cada mutao, a
relevncia clnica das mesmas, entre outras informaes). Um banco de dados semelhante
o Breast Cancer Information Core (BIC), neste caso direcionado ao cncer de mama, e s
mutaes descritas para os genes BRCA1 e BRCA2.
No caso de uma variante gentica ainda no ter sido descrita, ou caso ela tenha sido
descrita, mas seja de significado clnico desconhecido, existem programas para realizao
de anlises in silico (atravs de simulao computacional), capazes de predizer o quanto
uma determinada alterao poderia afetar a expresso de um gene e/ou funo da protena
por ele codificada. O Polyphen um programa utilizado para predizer o efeito de mutaes
missense, que causaro a substituio de um aminocido em uma protena. O programa gera
um score que vai de 0.0 a 1.0, sendo que valores prximos de zero podem ser interpretados
como alterao benigna, e valores prximos de 1.0 so interpretados como alteraes
provavelmente danosas. O Human Splicing Finder um programa prprio para analisar
alteraes intrnicas, gerando scores para predizer se a alterao em questo encontra-se
em possveis regies regulatrias de um ntron, e portanto, se poderia prejudicar a correta
transcrio de um gene. Vale ressaltar que, apesar de teis, as ferramentas in silico possuem
limitaes, e portanto elas mostram apenas indcios de que uma variante pode ser patognica
ou no, sendo necessrios experimentos in vitro e/ou estudos epidemiolgicos adicionais
para determinar o significado clnico da mesma.

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Referncias:
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using PolyPhen-2. Curr Protoc Hum Genet, Chapter 7:Unit7.20 (2013).
ELMASRI, R.; NAVATHE, S. B. [Trad.]. Sistemas de bancos de dados. Traduzido do original:
FUNDAMENTALS OF DATABASE SYSTEMS. So Paulo: Pearson (Addison Wesley), 2005. 724 p.
ISBN: 85-88639-17-3.
KORTH, H.; SILBERSCHATZ, A. Sistemas de Bancos de Dados. 3a. Edio, Makron Books, 1998.
NCBI National Center for Biotechnology Information, U. S. National Library of Medicine. <http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK44864/>.
PETITJEAN A, MATHE E, KATO S, ISHIOKA C, TAVTIGIAN SV, HAINAUT P, OLIVIER M. Impact of
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RAGHU RAMAKRISHNAN; JOHANNES GEHRKE. Database Management Systems, Second Edition,
McGraw-Hill, 2000.
FO DESMET, HAMROUN D, LALANDE M, COLLOD-BEROUD G, CLAUSTRES M, BEROUD C. Human
Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals.Nucleic Acid Research, 2009

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2.4 Extrao de DNA de sangue perifrico

Em maro de 1953, com a descoberta da estrutura da dupla-hlice do DNA pelo norteamericano James Watson e o britnico Francis Crick, iniciou-se uma nova era, denominada
biologia molecular. Desde ento defrontamos diariamente com a utilizao e necessidade de
sua aplicao em: diagnstico de doenas como o papilomavrus humano, anlise gentica
de marcadores tumorais, teste de paternidade, entre outros. Desta forma, as tcnicas de
biologia molecular avanaram rapidamente visando melhoria no isolamento do DNA e a
reduo dos custos (CARVALHO et al., 2010).

A etapa inicial em estudos de biologia molecular a de escolha do mtodo mais indicado
para a obteno do DNA do organismo de acordo com a amostra que se pretende trabalhar,
buscando sempre a qualidade e integridade do DNA que so fundamentais para o sucesso
nas etapas posteriores. Independente do protocolo utilizado, eles se dividem basicamente em
quatro etapas: 1) Lise das membranas plasmticas e nucleares; 2) Remoo dos lipdeos e
protenas da membrana celular; 3) Precipitao do DNA.

Os componentes das solues utilizadas na extrao variam de acordo com o protocolo
utilizado, sendo que em geral so utilizados: um detergente para solubilizar as membranas,
um tampo para estabilizar o Ph, um sal ou solvente para dissociar as protenas e auxiliar
na precipitao do DNA, e um agente inativante das DNAses cuja funo proteger o DNA
genmico.

Referncias:
CARVALHO, C. V.; RICCI, G.; DA SILVA, P. N. O.; AFFONSO, R. Extrao de DNA. In: CARVALHO, C.
V.; RICCI, G.; AFFONSO, R. Guia de prticas em biologia molecular. So Caetano do Sul SP. Yendis
editora, 2010, 283p.
THERMO SCIENTIFIC. Phenol/Chloroform: Extraction and ethanol precipitaion protocol. Thermo
Scientific. Diponvel em: <http://www.thermoscientificbio.com/uploadedFiles/Resources/phenolchloroform-extraction-ethanol-precipitation.pdf>.
ZUMBO, P. Phenol-Chloroform extration. Disponvel em: <http://physiology.med.cornell.edu/faculty/
mason/lab/zumbo/files/PHENOL-CHLOROFORM.pdf>

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2.5 Reao em cadeia de polimerase (PCR)

Desenvolvida por Kary Mulli na dcada de 1980, a reao em cadeia de polimerase,
ou PCR, revolucionou a rea da biologia molecular. Esta tcnica se baseia na amplificao
enzimtica in vitro de um fragmento de DNA utilizando dois oligonucleotdeos (tambm
chamados de primers ou iniciadores), que hibridizam com as fitas complementares de uma
sequncia molde (sequncia alvo ou template). O procedimento envolve repetidos ciclos
com variaes de temperatura, que permitem desnaturao do DNA molde, pareamento dos
primers s sequncias complementares e extenso a partir dos primers hibridados pela DNA
polimerase de uma nova cadeia de DNA complementar fita molde. O resultado ao final de
mltiplos ciclos o acmulo exponencial de um fragmento especfico.
A simplicidade do mtodo de PCR, bem como a sua capacidade de amplificar uma
sequncia-alvo a partir de preparaes de DNA com baixo grau de purificao, utilizao
de pequenas quantidades de material e preparaes de DNA com alto grau de degradao,
mostram a potencialidade de utilizao do mtodo, aplicvel no s pesquisa bsica, mas
tambm aplicada. A tecnologia de PCR pode ser utilizada em diversas abordagens que
permitem o seu emprego no diagnstico pr-natal (particularmente nas doenas herdadas),
no diagnstico de doenas infecciosas, tipagem para transplante de rgos, susceptibilidade
para doenas auto imunes especficas, diagnstico e prognstico de cncer e criminalstica
(DNA fingerprint). O processo ocorre em trs passos, que em conjunto compreendem um ciclo
que ser repetido vrias vezes. So eles:
Desnaturao do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96C), de
modo a separar as duas fitas.
Hibridao ou anelamento dos iniciadores ao DNA alvo na fita simples por
complementaridade de bases. (Temperaturas entre 50 e 65C, durante
1 minuto). A temperatura neste passo depende da porcentagem de GC da
sequncia a amplificar.
Extenso dos iniciadores atravs da sntese da fita complementar partir de
cada fita molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72C)
O processo envolvendo estes trs passos pode ser repetido vrias vezes (25 a 40 ciclos),
sendo possvel aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao do fragmento de DNA
de interesse pr-existente. Em teoria, se tivermos 25 ciclos de amplificao seguidos, a
concentrao do fragmento de DNA de interesse aumentaria 225 vezes.

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Este processo tem lugar num termociclador, um equipamento que automaticamente

controla e alterna as temperaturas durante perodos programados de tempo para o nmero
apropriado de ciclos de PCR. O produto de PCR, chamado de amplicon, pode ser visualizado
aps eletroforese em gel de agarose, e o seu tamanho pode ser estimado por comparao
com padres lineares de DNA.

Referncias:
CARVALHO, C. V.; RICCI, G.; DA SILVA, P. N. O.; AFFONSO, R. Extrao de DNA. In: CARVALHO, C.
V.; RICCI, G.; AFFONSO, R. Guia de prticas em biologia molecular. So Caetano do Sul SP. Yendis
editora, 2010, 283p.
Roche sistemas de diagnstico. Disponvel em: <http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/
equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/>.
NCBI. Disponvel em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechPCR.shtml>.

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2.6 Eletroforese em gel de agarose

A tcnica de eletroforese uma tcnica bastante utilizada, principalmente em Biologia
Molecular, para a visualizao de cidos nuclicos (DNA e RNA) e separao de protenas.
A tcnica se baseia na migrao dessas molculas (DNA, RNA e protenas) sobre gis de
poliacrilamida ou agarose atravs da utilizao de corrente eltrica (Lehninger et al,
2010) e tem duas funes principais: a funo analtica, para a verificao do tamanho dos
fragmentos de cidos nuclicos e protenas, e a funo preparativa, para a verificao da
qualidade das amostras de interesse. O movimento de partculas carregadas ocorre por meio
de um campo eltrico externo, sendo que a tcnica se baseia no uso das cargas eltricas das
biomolculas (DNA, RNA e protenas) para separar e analisar as suas propriedades fsicoqumicas. (Dorfman et al, 2013).

A migrao das molculas ocorre com base no seu tamanho, formato e peso molecular,
de forma que molculas mais pesadas e densas tendem a demorar mais tempo para correr sobre
o gel. A eletroforese de protenas geralmente realizada em gis de poliacrilamida, enquanto
a agarose mais comumente utilizada para cidos nuclicos (embora gis de policrilamida
tambm possam ser utilizados para a visualizao de cidos nuclicos) (Lehninger et al,
2010).

O gel de poliacrilamida constitui um polmero formado por uma rede entrelaada
ou entrecruzada originada da reao radicalar entre os compostos acrilamida e
metilenobisacrilamida, necessitando de persulfato de amnio e TEMED para que ocorra sua
polimerizao. O gel de agarose, entretanto, formado pela agarose, que umpolissacardeoe
forma uma rede que prende as molculas durante a migrao. Uma vez solidificado, capaz de
permitir a migrao das molculas com base na sua concentrao e tamanho dos fragmentos
(Lehninger et al, 2010).

Para a migrao da protena no gel, geralmente utiliza-se um detergente de Sdio
Dodecil sulfato (SDS), que liga-se proporcionalmente s protenas com base no seu peso
molecular. O SDS contribui para alterar a conformao nativa da protenas, aumentando a sua
carga negativa e permitindo que ela se mova sobre o gel com base no seu peso molecular.
Aps a eletroforese, os fragmentos so visualizados com a adio de um corante fluorescente
(Coomassie blue) que se liga especificamente s protenas (Figura 1). Um padro de peso
molecular com tamanhos adicionado a uma das canaletas, podendo-se estimar o tamanho
real das bandas de protenas encontradas (Figura 2) (Lehninger et al, 2010).

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Figura 5: Eletroforese (a) Amostras so carregadas no gel de poliacrilamida. As protenas movem-se

sobre o gel quando h aplicao de corrente eltrica. (b) Visualizao de protenas aps a eletroforese
por tratamento do gel com Coomassie blue, que se liga as protenas e no ao gel propriamente dito.

Figura 6: Estimando o peso molecular das molculas por meio de um gel de eletroforese 1- Padro de
peso molecular 100 pares de base; 2/ 3- Sequncia de 227 pares de base do xon 2 do gene MSH2;
4- Controle negativo do xon 2 do gene MSH2; 5/6- Sequncia de 224 pares de base do xon 4 do gene
MSH2; 7- Controle negativo do xon 4 do gene MSH2

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Existem diversas maneiras de visualizao dos fragmentos presentes no gel: por

fluorescncia, que necessita de um fluorforo ligado molcula, podendo ser o corante cianina
para corar protenas; o brometo de etdio, que se intercala dupla fita de DNA; fluoricenas ligadas
aos diferentes ddNTPs; e didexi-ribonucletdeos marcados com fluorescncia, utilizados no
sequenciamento de DNA pelo mtodo de Sanger. Alm dos metdos fluororimtricos, existe
ainda a anlise das bandas por densitometria, em que se usam padres quantitativos para a
construo de uma curva padro. Com base na rea sob a curva densitomtrica, que tende
a ser proporcional quantidade de cido nuclico ou protenas, obtm-se as respectivas
concentraes dos fragmentos de interesse (Lehninger et al, 2010).

Referncias
LEHNINGER, A.L.; NELSON, D. L. ; COX, M.M. Princpios de Bioqumica. Editora: Sarvier, 4ed., 2007.
DORFMAN, K.D.; KING, S. B.; OLSON, D.W. ; THOMAS, J. D. P. ; TREE, D.R. Beyond gel electrophoresis:
Microfluidic separations, fluorescence burst analysis, and DNA stretching. Chem Rev. 113(4): 2584
2667, 2013.

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2.7 Sequenciamento de Sanger

Na dcada de 1990, aps o aperfeioamento da tecnologia do DNA recombinante e
clonagem gnica, os cientistas lanaram o Projeto Genoma Humano, que tinha como objetivo
o mapeamento de todos os genes humanos, bem como a determinao das sequncias
nucleotdicas dos 23 pares de cromossomos humanos. O sequenciamento do genoma
humano foi inicialmente liderado por laboratrios pblicos dos pases participantes, pelo
norte-americano Francis Collins. Em 1998, a empresa privada Celera Genomics, liderada
pelo pesquisador J. Craig Venter entrou na disputa para a construo da sequncia do
genoma humano. Em dezembro de 1999 e maio de 2000, foram publicadas as sequncias
completas dos cromossomos 22 e 21, respectivamente. Com a interveno do governo dos
Estados Unidos, as suas vertentes (laboratrios pblicos e empresas privadas) resolveram
publicar os rascunhos do genoma humano juntos, e em fevereiro de 2001, foram publicadas
as sequncias genmicas (SNUSTAD; SIMMONS, 2013).

O sequenciamento do Genoma Humano foi realizado com base nos princpios propostos
por Sanger et al. (1974). A tecnologia proposta por Sanger tem como base o princpio de
replicao de DNA, em que a enzima DNA polimerase incorpora nucleotdeos hidroxila 3
da sequncia de DNA, de acordo com molcula de DNA molde. O sequenciamento usa da
incorporao de anlogos de nucleotdeos que no apresentam o grupamento hidroxila na
extremidade 3 da molcula (essencial para a formao da ligao fosfodister com o prximo
nucleotdeo a ser incorporado). Esses nucleotdeos so denominados dideoxinucleotdeos, e
uma vez que so incorporados molcula de DNA, impedem a continuidade da reao, por
impedir a formao de ligaes fosfodisteres (APPLIED BIOSYSTEMS, 2009).

O sequenciamento de Sanger requer uma molcula de DNA molde, um primer de
sequenciamento, DNA polimerase, nucleotdeos (dNTPs), dideoxinucleotdeos (ddNTPs) e um
tampo de reao. No sequenciamento manual, quatro reaes separadas eram realizadas,
contendo cada uma um tipo de nucleotdeo radioativo (ddA, ddC, ddG ou ddT). Uma vez que
os nucleotdeos normais (A,T,C,G) so adicionados extremidade 3, a cadeia de extenso
pode continuar. Entretanto, com a adio de dideoxinucleotdeos cadeia 3, a cadeia de
extenso finalizada, uma vez que no h mais como formar ligaes fosfodisteres com o
prximo nucleotdeo (APPLIED BIOSYSTEMS, 2009).

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Figura 7: Sntese da fita da DNA utilizando a tecnologia do tipo Sanger (APPLIED BIOSYSTEMS,
2009).

Os produtos de extenso formados pela reao de sequenciamento so posteriormente

separados por eletroforese. As molculas de DNA, que so carregadas negativamente,
movem-se em direo a um eletrodo positivo, de maneira que a velocidade com que cada
fragmento de DNA move-se inversamente proporcional ao peso molecular do fragmento. A
figura 8 ilustra o sequenciamento manual proposto por Sanger, onde possvel observar a
construo da sequncia de nucleotdeos de um determinado genoma, com base no padro
com que os nucleotdeos dissociam-se sobre o gel de poliacrilamida.

Figura 8: Ilustrao do sequenciamento manual proposto por Sanger e colaboradores em 1974.

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Com o avano das tecnologias, em 1986, a empresa Caltech (Applied Biosystems,

EMBL e GE), props o primeiro equipamento de sequenciamento semiautomtico do mercado,
sequenciando o gene constitutivo HPRT. Em 1996, a Applied Biosystems lana no mercado
o primeiro sequenciador automtico da ABI Prism 310. A identificao da sequncia de
nucleotdeos ocorre quando os ddNTPs, que so molculas marcadas com fluorescncia, so
incorporadas na cadeia de oligonucleotdeos, emitindo fluorescncia a partir da exitao por
um laser com comprimento de onda especfico e captao da fluorescencia por uma cmera
no sequenciador automtico (SNUSTAD; SIMMONS, 2013). Nesse tipo de sequenciamento,
os quatro ddNTPs marcados so adicionados na mesma reao. A figura 3 exemplifica os
resultados obtidos a partir de um sequenciamento automtico, por meio de eletroferogramas.

Figura 9. Eletroferograma representando o resultado de um sequenciamento do tipo Sanger

em equipamento automtico. Na parte de baixo da figura, possvel notar a comparao com o
sequenciamento manual, feito em quatro reaes diferentes.

Os resultados de um sequenciamento podem ser analisados em diferentes softwares
de bioinformtica gratuitos (ex: ChromasPro, MEGA, etc) ou pagos (ex:Variant Reporter
ABI, etc). A partir da anlise dos resultados possvel visualizar alteraes na sequncia
de nucleotdeos de um determinado indivduo, sendo possvel identificar alteraes pontuais
em homo ou heterozigose, bem como inseres ou delees. A figura 4A exemplifica uma
alterao pontual em heterozigose para um indivduo. A heterozigose uma alterao em
que se observa que um alelo apresenta um determinado nucleotdeo, enquanto o outro alelo
apresenta um nucleotdeo diferente do primeiro, dessa maneira, os picos heterozigotos so
representados com a metade da altura dos picos normais, e os picos do restante da sequncia
aparecem inalterados, e, alm disso, visualmente consegue-se identificar a sobreposio
de duas bases distintas correspondentes, cada uma, a um dos alelos. As delees so
demonstradas na figura 4B, sendo possvel observar picos sobrepostos a partir do ponto em
que um nucleotdeo foi deletado na sequncia, pois a sequncia do alelo no qual ocorreu a
deleo ser mais curta que a sequncia do alelo selvagem (LIFE TECHNOLOGIES, 2014).

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Figura 10: (A) Exemplo de alterao pontual em heterozigose G>A. (B) Exemplo de deleo na
sequncia nucleotdica de um indivduo.

Referncias:
APPLIED BIOSYSTEMS. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis: Applied Biosystems
Chemistry Guide. Segunda Edio, 2009
SNUSTAD, D.P.; SIMMONS, M. J. Genmica. In: SNUSTAD, D.P.; SIMMONS, M. J., 6 Ed.
Fundamentos de Gentica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. 398-431.
LIFE TECHNOLOGIES. Sequencing Experiences for Life. Disponvel em: < http://lifesequencing.
blogspot.com.br/p/troubleshooting-sequenciamento.html> Acesso em: 12/10/2014.

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2.8 MLPA
As tcnicas desenvolvidas para deteco de mutaes pontuais geralmente no so
teis para a investigao de grandes delees ou amplificaes. Dessa forma, para uma
anlise mais abrangente de genes associados a determinada patologia, faz-se necessrio o
uso de tcnicas complementares.
A tcnica de MLPA (Multiplex-ligation probe amplification) um mtodo eficaz para
essa finalidade, sendo capaz de detectar grandes delees e amplificaes em diversas
regies do genoma numa mesma reao. A tcnica consiste na hibridizao de sondas ao
DNA, e posterior amplificao das sondas hibridizadas para quantificao das regies de
interesse. Uma reao de MLPA composta de quatro etapas:
Desnaturao do DNA: Nessa etapa o DNA da amostra mantido a 98C por pelo
menos 5 minutos, para que as fitas simples fiquem livres para a hibridizao com as sondas
(Figura 11A).
Hibridizao: Cada sonda de MLPA consiste em dois oligonucleotdeos complementares
sequencia de DNA alvo. Esses oligonucleotdeos se hibridizam adjacentemente. Ligadas a
cada um dos oligonucleotdeos, existem sequncias no complementares ao DNA alvo, que
formam extremidades livres durante a hibridizao. Essas extremidades so complementares
a primers utilizados na posterior amplificao da sonda. Esses primers so ditos universais,
por serem os mesmos para todas as sondas. Em uma das extremidades livres, alm da
poro complementar a um dos primers, existe uma sequncia stuffer, de tamanho varivel,
que ser responsvel pelo reconhecimento de cada sonda especfica por eletroforese capilar
(Figura 11B). Um kit de MLPA contm sondas para at 50 regies diferentes.
Ligao: Aps a hibridizao das sondas, uma enzima ligase adicionada reao.
Ela ser responsvel pela ligao dos oligonucleotdeos adjacentes, o que permitir que a
DNA polimerase percorra toda a extenso da sonda durante a etapa de amplificao (Figura
11C). Dessa forma, nas regies onde no ocorreu a adequada hibridizao e ligao, as
sondas no sero amplificadas.
PCR: Nessa etapa, o pareamento das sondas com o DNA desfeito, e os primers
utilizados no kit iro se ligar s extremidades livres de cada sonda, para amplificao
dos fragmentos pela DNA polimerase (Figura 11D). importante ressaltar que os primers
utilizados so marcados com fluorocromo para deteco das sondas durante a eletroforese.
a quantificao da emisso de fluorencncia que permitir a anlise do nmero de cpias
encontradas para cada regio.

Figura 11. Reao de MLPA. A) Desnaturao da amostra de DNA para pareamento com as sondas.
B) Hibridizao das sondas ao DNA. Em azul: oligonucleotdeos; Em verde: sequncia stuffer, de
tamanho varivel; Em preto nas extremidades das sondas: regio de pareamento com os primers
universais. C: Ligao dos oligonuclotdeos. D: Amplificao das sondas que tiveram hibridizao e
ligao adequadas.

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A eletroforese capilar gera eletroferogramas com picos correspondentes a cada uma

das sondas, de acordo com seu tamanho. A altura de cada pico proporcional intensidade
da fluorescncia absoluta detectada para cada sonda. A anlise dos resultados feita atravs
da normalizao dessa fluorescncia (Figura 11). Essa normalizao feita em duas etapas:
Normalizao intra-amostra: em cada amostra, so utilizadas sondas controle, ou
seja, correspondentes a regies do DNA onde no so esperadas alteraes do nmero de
cpias. A razo entre a intensidade de fluorescncia das sondas alvo com as sondas controle
medida e utilizada na:
Normalizao inter-amostras: em toda reao de MLPA, a(s) amostra(s) de interesse
so comparadas a amostras controle, ou seja, amostras nas quais no se espera encontrar
alteraes de nmero de cpias para os genes analisados.
Essas normalizaes so feitas por programas especficos, como o Coffalyzer.NET
e GeneMarker, e geram um quociente de dosagem (QD) final, que determina a variao no
nmero de cpias para cada sonda. Amostras normais tero um QD em torno de 1,0; regies
deletadas resultaro em um QD em torno de 0.5 (no caso de deleo em heterozigose) ou 0.0
(no caso de deleo em homozigose) (Figura 12). J as regies com QD acima de 1,3 so
consideradas amplificadas.

Figura 12. Exemplo de eletroferograma gerado a partir da eletroforese capilar de produtos de MLPA.
Cada pico corresponde a uma sonda do kit.

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Figura 13. Exemplo de anlise de MLPA aps a normalizao das fluorescncias absolutas. Na figura,
podemos notar trs regies com conjuntos de sondas indicando delees: duas regies com delees
em heterozigose (circuladas em preto), e uma regio com delees em homozigose (circuladas em
vermelho).

A tcnica de MLPA apresenta as vantagens de ser custo-efetiva, rpida e de fcil

execuo, quesitos que a tornam uma importante ferramenta, tanto para deteco de
mutaes constitutivas quanto tumorais. Foram tambm desenvolvidas variaes dos kits
para quantificao de transcritos (Reverse Transcriptase MLPA) e para quantificao e
anlise do perfil de metilao do DNA (Methylation-sensitive MLPA). Entretanto, algumas
limitaes devem ser consideradas, como a incapacidade de detectar rearranjos balanceados
e mosaicismos com pequena porcentagem de clulas alteradas, e o fato do mtodo ser muito
sensvel qualidade do DNA utilizado, quando comparado a outras tcnicas rotineiras como
a PCR e sequenciamento.

Referncias:
KOZLOWSKI P, et al. New applications and developments in the use of multiplex ligation-dependent
probe amplification. Electrophoresis. 2008 Dec;29(23):4627-36.
ELDERING E, et al. Expression profiling via novel multiplex assay allows rapid assessment of gene
regulation in defined signalling pathways. Nucleic Acids Res. 2003 Dec 1;31(23):e153.
NYGREN AO, et al. Methylation-specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation
and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Res. 2005 Aug 16;33(14):e128.
SCHOUTEN JP, et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligationdependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 2002 Jun 15;30(12):e57.
MRC Holland Webpage. Disponvel em: <www.mlpa.com>. Acesso em 15/10/2014.

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2.9 Genotipagem de Microssatlites

Microssatlites so sequncias de repeties de 1 a 6 nucleotdeos em tandem, dispersas
ao longo do genoma. Microssatlites podem ser altamente polimrficos ou monomrficos, mas
diferentemente do DNA de sequncia nica, sua variabilidade ocorre no nmero de repeties
presentes, e no na alterao de nucleotdeos. Microssatlites polimrficos so excelentes
marcadores moleculares. Eles podem ser utilizados para mapeamento, estudos de linkage,
e para investigao de origem parental. Utilizando-se primers para regies no-polimrficas
adjacentes aos microssatlites, possvel gerar fragmentos que tero tamanhos variveis,
dependendo do nmero de repeties presentes. Quando um dos primers marcado com
fluorocromo, a identificao dos fragmentos possvel em equipamentos de eletroforese
capilar (Figura 14).

Figura 14. Exemplo de fragmento de DNA contendo um microssatlite. As regies em vermelho

correspondem a um microssatlite, variando em cinco tamanhos diferentes em uma determinada
populao, quanto ao nmero de repeties presentes. As regies em azul correspondem a
sequncias no polimrficas adjacentes aos microssatlites, nas quais os primers podem se anelar
para a amplificao do fragmento. Os smbolos esquerda representam fluorocromos ligados a um dos
primers, que permitiro a deteco dos fragmentos em equipamentos de eletroforese capilar.

Dependendo do microssatlite em questo, a variabilidade no nmero de repeties

entre indivduos diferentes comum. Entretanto, em um mesmo indivduo, o normal que cada
alelo de um microssatlite apresente o mesmo nmero de repeties em todas as clulas.
Existe um fenmeno conhecido como instabilidade de microssatlites (IMS), no qual o nmero
de repeties presentes em um microssatlite em determinado indivduo alterado em um
grupo de clulas. A IMS um indcio de que o sistema de reparo do DNA no est funcionando
adequadamente durante a replicao celular, deixando de corrigir erros da DNA polimerase.
Mais especificamente, esse fenmeno est associado a erros no sistema de reparo por mau
pareamento das protenas MMR (Mismatch repair proteins). Essa falha pode manter, nas
clulas filhas, no s variaes nas regies de microssatlites, como tambm mutaes em
outras regies importantes do genoma, como oncogenes e genes supressores tumorais.
Dessa forma, a investigao dos microssatlites tem especial relevncia no cncer,
j que as falhas no sistema de reparo podem levar ao acmulo de mutaes que culmina com
o desenvolvimento de clulas tumorais. A instabilidade de microssatlites encontrada em
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Curso de vero 2015

cerca de 15% dos casos de cncer colo-retal: 10% representam cnceres espordicos, e 5%
associados sndrome de Lynch, causada por alteraes em genes que codificam protenas
MMR (MSH2, MLH1, PMS2 e MSH6). A discordncia no tamanho dos microssatlites entre
clulas de tecido normal e clulas tumorais utilizada para definir a IMS (Figura 15). O
National Cancer Institute props a anlise de cinco microssatlites para deteco de IMS,
que constituem o Painel de Bethesda: BAT25, BAT26, D5S346, D2S123 e D17S250. Se a
instabilidade for detectada em dois ou mais marcadores, o tumor classificado com IMS alta;
para apenas um marcador instvel, a IMS dita baixa; e quando nenhum marcador apresenta
alterao, o tumor considerado estvel para microssatlites.
medida que esses marcadores so investigados em novas populaes, o painel vem
sendo aprimorado. Existe um novo marcador proposto, denominado CAT25, que foi relatado
como monomrfico nas populaes investigadas, e altamente especfico para deteco de
IMS em cncer colorretal. Dessa forma, avalia-se o possvel papel da anlise do microssatlite
CAT25 como complemento ou como alternativa ao painel de Bethesda. Ao ser detectada a
IMS, sugerida a investigao por imunohistoqumica das protenas MMR no tumor e rastreio
de mutaes constitutivas nos genes MMR.

Figura 15. Instabilidade de microssatlite detectada para o marcador BAT26. Na parte de cima da
figura, observamos a presena de um nico alelo no tecido saudvel do paciente. Na parte de baixo,
podemos notar a presena de um novo alelo, com cerca de 15 pares de base a menos, em tecido
tumoral.

A reao de genotipagem de microssatlites por eletroforese capilar iniciada com

uma PCR comum, na qual um dos primers marcado com fluorocromo. Os produtos de PCR
podem ser armazenados a 4C por at uma semana. Para perodos mais longos, armazenar
entre -25C e -15C. Os fluorocromos so sensveis luz, e portanto, os produtos devem ser
armazenados protegidos da luz (em caixas escuras ou envoltos em papel alumnio).
As condies e concentraes dos produtos utilizados na eletroforese capilar dependem
do equipamento utilizado. Para cada capilar, deve ser aplicada uma mistura contendo: o
produto da amplificao, um padro de peso molecular, formamida HiDi (highly deionized).
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Curso de vero 2015

Essa mistura deve ser incubada por 3 min em temperaturas elevadas (em torno de
90C) para desnaturao dos fragmentos, e imediatamente aps essa incubao deve ser
levada ao gelo e mantida sob refrigerao por alguns minutos, para evitar a renaturao
do DNA, antes de ser aplicada no equipamento. Os dados gerados podem ser analisados
por diversos programas, dependendo do equipamento utilizado, como o GeneMapper,
GeneMarker e Peakscanner.

Referncias:
BIANCHI F, et al. CAT25 is a mononucleotide marker to identify HNPCC patients. J Mol Diagn. 2009
May;11(3):248-52.
ELLEGREN H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nat Rev Genet. 2004
Jun;5(6):435-45.
FINDEISEN P, et al. T25 repeat in the 3 untranslated region of the CASP2 gene: a sensitive and specific
marker for microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 2005 Sep 15;65(18):8072-8.
RODRIGUEZ-BIGAS MA. et al. A National Cancer Institute Workshop on Hereditary Nonpolyposis
Colorectal Cancer Syndrome: meeting highlights and Bethesda guidelines. J Natl Cancer Inst. 1997;
89(23):1758-62.
SINICROPE FA, SARGENT DJ. Molecular pathways: microsatellite instability in colorectal cancer:
prognostic, predictive, and therapeutic implications. Clin Cancer Res. 2012 Mar 15;18(6):1506-12.
Source Biosciences Webpage. Microsatellite Genotyping. Disponvel em: <http://www.lifesciences.
sourcebioscience.com/genomic-services/faq/microsatellite-genotyping/>. Acesso em 28/10/2014.

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Curso de vero 2015

2.10 Imuno-histoqumica
Imunohistoqumica (IHQ) a localizao de antgenos em cortes histolgicos por meio
de sua interao com anticorpos marcados. O resultado dessa interao pode ser visualizado
ao microscpio atravs da marcao que o anticorpo carrega. Alguns anticorpos so marcados
com fluorescncia, elemento radioativo ou ouro coloidal. Outros so ligados a enzimas que
catalizam reaes a partir de substratos cromognicos, produzindo uma colorao especfica,
que permite sua identificao. O mtodo de deteco pode ser direto ou indireto. No mtodo
direto, o prprio anticorpo est ligado ao marcador; e no mtodo indireto, um anticorpo
secundrio carrega o marcador, e acrescentado reao para se conjugar ao anticorpo
primrio ligado ao antgeno (Figuras 16 e 17).

Figura 16. Mtodo direto com anticorpo marcado com fluorescncia. Aps a interao dos anticorpos
com as clulas ou tecido em anlise, o material visualizado em microscpio. A luz incidente
do microscpio causar a emisso do sinal fluorescente pelo marcador do anticorpo, permitindo a
identificao do antgeno.

Figura 17. Mtodo indireto com anticorpo secundrio conjugado a enzima cromognica. Aps a
interao dos anticorpos primrios com os antgenos, os anticorpos secundrios conjugados a enzimas
cromognicas interagem com os anticorpos primrios. O substrato cromgeno adicionado lmina, e
a reao catalizada pela enzima gera um produto colorido, permitindo a identificao.

A interao antgeno-anticorpo confere alta especificidade tcnica, o que a tornou amplamente

utilizada tanto em diagnsticos laboratoriais quanto em pesquisa. A imunohistoqumica pode
ser utilizada para investigar a expresso e distribuio de protenas em diferentes tipos
histolgicos, e em diferentes contextos celulares (como as diferentes etapas da diferenciao
43

Curso de vero 2015

celular). A tcnica tem especial importncia na patologia, principalmente na rea oncolgica,

por poder identificar padres de expresso de antgenos que no s diferenciam clulas
malignas de clulas saudveis, mas tambm fornecem dados mais precisos para o
prognstico, como estadiamento e classificao tumorais. Esses antgenos incluem enzimas,
oncoprotenas, protenas supressoras de tumor, marcadores de proliferao celular e alguns
antgenos especficos de clulas tumorais. A IHQ tambm pode identificar o tipo celular de
uma metstase para auxiliar na identificao do tumor primrio, e ainda, testar a eficincia de
um tratamento, detectando antgenos das vias alvos da droga em questo.
A imunohistoqumica uma das primeiras anlises realizadas quando h suspeita de
sndrome de Lynch em pacientes com cncer cororretal. A expresso anmala de alguma
dasprotenas MMR nos adenorcarcinomas colorretais um indicativo de qual gene MMR
pode conter alteraes germinativas no paciente (Figura 18). Essa anlise somada aos
dados obtidos por investigao de instabilidade de microssatlites, para uma triagem dos
pacientes antes do teste gentico dos genes MMR.

Figura 18. Exemplo de imunohistoqumica para a protena MLH1. esquerda: adenocarcinoma

colorretal exibindo imunopositividade nuclear para MLH1, representada pela colorao marrom.
direita: adenocarcinoma pouco diferenciado imuno-negativo para MLH1.

Para que a IHQ seja aplicada, o tecido tratado com um fixador, que tem como
finalidades: inativar os mecanismos autolticos, imobilizar as molculas para evitar sua
difuso para outros compartimentos celulares ou para fora do tecido, e aumentar a rigidez do
tecido para que seja possvel seccion-lo. A seguir, esses tecidos podem ser congelados ou
emblocados em meios que facilitam o armazenamento e seco, como parafina ou resinas.
Uma seo de alguns micrmetros separada com o uso de um micrtomo, e aderida a uma
lmina de microscpio.

O tecido aderido lmina passar por tratamentos com solventes e rehidratao, que
iro prepar-lo para que a reao com os anticorpos ocorra. Tambm realizado um processo
de recuperao de antgeno, que desfaz possveis ligaes entre protenas que possam
mascarar os eptopos. Aps esse processo os anticorpos podem ser adicionados para que
ocorra a reao.

44

Curso de vero 2015

Referncias:
AMAZONAS MK. Instabilidade de microssatlites, imuno-histoqumica das protenas MMR e mutao
BRAF V600E no cncer colorretal. 2013. 121 pp. Dissertao. Instituto Nacional de Cncer (INCA). Rio
de Janeiro, 2013.
BOLAND CR, KOI M, CHANG DK, CARETHERS JM. The biochemical basis of microsatellite instability
and abnormal immunohistochemistry and clinical behavior in Lynch syndrome: from bench to bedside.
Fam Cancer. 2008;7(1):41-52.
DURAIYAN J, GOVINDARAJAN R, KALIYAPPAN K, PALANISAMY
immunohistochemistry. J Pharm Bioallied Sci. 2012 Aug;4(Suppl 2):S307-9.

M.

Applications

of

Leinco Technologies Inc Webpage. Immunohistochemistry Protocol for Frozen Sections. Disponvel em
<http://www.leinco.com/immunohistochemistry>. Acesso em 28/10/2014.
TRU LD, ROSAI J. Atlas of diagnostic immunohistopathology. Philadelphia (Pa.): Lippincott, 1990.

45

Curso de vero 2015

2.11 Sequenciamento de nova gerao

A tecnologia de sequenciamento de DNA teve origem por volta da dcada de 1960/1970
com o sequenciamento das seqncias 5s, 16s e 23s do RNA ribossomal proveniente da
bactria Escherichia coli, bem como do bacterifago R17. Por volta de 1977, Sanger reportou
o sequenciamento do DNA do bacterifago f1, utilizando a tecnologia de nucleosdeos
trifosfatados modificados. Com os adventos da biologia molecular, as estratgias de
sequenciamento de cidos nuclicos foram se tornando cada vez mais eficazes, levando ao
surgimento das tecnologias de Sequenciamento de Nova Gerao (NGS) (Middendorf et
al., 2002).
Existem diferentes plataformas que utilizam o NGS, entretanto todas elas tm em
comum o sequenciamento de milhes de pequenos fragmentos de DNA ao mesmo tempo
(Behjati; Tarpey, 2013), reduzindo os custos e o tempo de sequenciamento quando
comparadas com a tecnologia proposta por Sanger. O NGS permite o sequenciamento de
milhes de sequncias continuas de DNA em um nico experimento, uma vez que sequencia
reads (leituras) de pequenos fragmentos de DNA. O sequenciamento do tipo Sanger, em
contrapartida, faz a leitura de fragmentos bem maiores (700pb) por fracionamento eletrofortico
em gis de poliacrilamida, o que aumenta o tempo de rastreamento e o custo por base
sequenciada (Hert; Fredlake; Barron, 2008).
A utilizao da tecnologia de NGS para o rastreamento molecular na rea de oncologia
tem crescido progressivamente, uma vez que o cncer uma doena provocada pelo acmulo
de mutaes somticas no genoma humano, que exige um diagnstico preciso. O NGS pode
ser utilizado na identificao de mutaes especficas em tumores,. Alm disso, pode ser
utilizado na classificao e identificao de variantes frequentes em determinadas populaes
(Behjati; Tarpey, 2013).
Dentre as plataformas de NGS, destacaremos nesta apostila as plataformas da
empresa Illumina (HiSeq2000/ HiSeq2500/MiSeq), que utilizam o sequenciamento por sntese
para o rastreamento molecular das regies genmicas de interesse. O HiSeq2000, por
exemplo, capaz de produzir at 450 Gigabases/dia (Gb), sendo que ao final de uma corrida
de 10.8 dias produz 1.6 bilhes de bases de leituras de 100 pb. O MiSeq, entretanto, possui
uma capacidade menor, produz 1.5 Gigabases/dia e gera um total de 5 milhes de bases de
leituras de 150 pb (Caporaso et al., 2012).
O sequenciamento por sntese envolve quatro etapas principais. A fragmentao
do DNA, com posterior ligao de adaptadores (P5 e P7) nas extremidades da seqncia,
constitui a primeira etapa do processo. As molculas de DNA fragmentadas e marcadas
com os adaptadores so posteriormente aderidas, por afinidade, uma superfcie slida,
denominada superfcie slida de clonagem (flow cells) na extremidade 5 (CARVALHO; SILVA,
2010). Esta etapa de preparao das bibliotecas genmicas realizada atravs do Nextera
DNA Sample Preparation Kit (Illumina), que utiliza a enzima transposase, capaz de clivar o
DNA em fragmentos menores e adicionar os oligonucleotdeos adaptadores P5 e P7 nas
extremidades 5 e 3, respectivamente, ou atravs do TruSeq DNA Sample Preparation Kit
(Illumina).
Alm dos adaptadores, so adicionados indexes aos fragmentos de DNA. Os ndexes
so pequenas sequncias que funcionam como um cdigo de barras, para posterior
46

Curso de vero 2015

reconhecimento da amostra. Durante a etapa de pareamento, o adaptador presente na

extremidade livre 3 da molcula encontra seu oligonucleotdeo complementar fixado ao
suporte slido (flow cell), formando pontes e permitindo a extenso das sequncias de DNA.
Posteriormente, h a separao e linearizao das fitas, formando clusters de molculas
idnticas ligadas ao suporte. A formao de clusters e amplificao isotrmica dos fragmentos
ocorre no equipamento denominado cBot. As fitas so clonadas por amplificao em pontes,
ou seja, a fita simples se complementa a um oligonucleotdeo presente na flow cell, diferente do
primeiro oligonucleotdeo complementar, a polimerase gera uma fita complementar, formando
duplas fitas em forma de ponte. H desnaturao da dupla fita, gerando duas fitas simples
complementares, mas que so separadas por adaptadores distintos nas pontas. O processo
repetido vrias vezes, e ao final, as fitas REVERSE so lavadas, deixando apenas as fitas
FORWARD ancoradas na flow cell (CARVALHO; SILVA, 2010).
Aps a formao dos clusters com as fitas FORWARD, so adicionados
oligonucleotdeos compementares s sequencias adaptadoras e senguen-se ciclos de
sintese de DNA onde cada nucleotdeo e adiconado individualmente. A cada ciclo os dNTPs
competem pelas regies na fita de DNA, sendo que apenas um nucleotdeo incorporado.
Com a incorporao de nucleotdeos marcados com fluorocromos e com a extremidade 3
da desoxirribose bloqueada, h excitao do laser e gerado um sinal que capturado pelo
dispositivo de leitura. A leitura feita de forma sequencial, o que permite a montagem da
sequncia completa de cada cluster. Aps a emisso de fluorescncia os fluorocromos so
retirados e a extremidade 3 da desoxirribose e desbloqueada, o que permite a adio de
novos nucleotdeos. A figura 1 ilustra o processo de sequenciamento por sntese descrito
acima (CARVALHO; SILVA, 2010).

47

Curso de vero 2015

Figura 19. Representao esquemtica do sequenciamento por sntese. (A) Fragmentao do DNA
aleatoriamente e ligao a adaptadores A e B em ambas as extremidades. (B) As molculas de DNA
de fita simples so aderidas por afinidade ao suporte slido onde esto tambm aderidos em alta
densidade oligonucleotdeos complementares aos adaptadores A e B. (C) Etapa de anelamento, no
primeiro ciclo de amplificao da PCR em fase slida, o adaptador da extremidade livre da molcula
aderida ao suporte encontra seu oligonucleotdeo complementar no suporte, formando uma estrutura
em ponte. (D) Uma vez fornecidos os reagentes necessrios, a PCR iniciada utilizando a extremidade
3 livre do oligonucleotdeo como primer. (E) Na etapa de desnaturao, a ponte desfeita mediante
elevao de temperatura. (F) Repete-se a etapa de anelamento, formando novas estruturas em ponte
e iniciando um novo ciclo de amplificao. (G) Aps uma srie desses ciclos, sero obtidos clusters de
molculas idnticas ligadas ao suporte. (H) Com a incorporao de nucleotdeos terminadores marcados
e excitao a laser, gerado sinal. (I) O sinal captado por dispositivo de leitura e interpretado como
um dos quatro possveis nucleotdeos componentes da cadeia. (J, K) O processo de incorporao de
nucleotdeo marcado, excitao e leitura repetido para cada nucleotdeo componente da sequncia.
(L) A leitura feita de forma sequencial, o que permite a montagem da sequncia completa de cada
cluster.
48

Curso de vero 2015

Aps o sequenciamento por sntese, as leituras so alinhadas criando contigs que

so alinhados sequncia referncia de DNA. A anlise dos dados ocorre por meio de
ferramentas de bioinformtica e envolve algumas etapas principias, como: converso do
formato dos arquivos (CASAVA, Illumina); verificao da qualidade das seqncias por meio
de softwares especficos, corte das regies no necessrias, avaliao do contedo GC (ex:
Prinseq); alinhamento das sequncia sequncia referncia correspondente (ex: Bowtie2)
e verificao dos ndices de cobertura e de stios variveis (ex: GATK) (SCHMIEDER;
EDWARDS, 2011;DEPRISTO et al., 2011;LANGMEAD et al., 2012).

Referncias:
Behjati, S.; Tarpey, P.S. What is next generation sequencing? Arch Dis Child Educ Pract Ed, v. 0,
13, outubro, 2013.
CAPORASO, J. G. et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and
MiSeq platforms. The ISME Journal, v.6, p. 16211624, mar. 2012.
CARVALHO, M. C. C. G.; SILVA, D. C. G. S. Next generation DNA sequencing and its applications in
plant genomics. Cincia Rural, v.40, n.3, mar, 2010.
DEPRISTO, M. et al. 2008. Advantages and limitations of nextgeneration sequencing technologies: A
comparison of electrophoresis and non- electrophoresis methods. Electrophoresis. v. 29, 46184626,
2008.
LANGMEAD, B.; SALZBERG, S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods, v. 9, p.
357-359, 2012.
MIDDENDORF, L.; HUMPHREY, P.; RAYANAN, N.; ROEMER, S. Sequencing Technology. Essentials of
Genomics and Bioinformatics, v WILEY-VCH Verlag GmbH, 2002
PHILIPPAKIS, A. et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA
sequencing data. Nature Genetics, v.43, p.491-498, 2011.
SCHMIEDER, R.; EDWARDS, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.
Bioinformatics, v. 27, 863-864, 2011.

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Curso de vero 2015

APNDICES - PROTOCOLOS
Extrao de DNA de sangue perifrico
Amostra: 2 a 5 mL de sangue armazenado em EDTA.
Solues e enzimas:
Tampo de lise de hemcias (155mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 1mM EDTA, pH 7,4)
Tampo de lise de ncleos (400mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 2mM EDTA )
SDS 20%
Proteinase K (20mg/ml)
NaCl 5M
Etanol absoluto e etanol 70% gelados
Equipamentos:
Fluxo para trabalhar com amostra biolgica
Centrfuga para tubos falcon
Banho Maria ou Estufa
Vortex
DIA 1
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

8.
9.
10.

Verter a amostra em tubo falcon (de 14 ou 50 mL);

Adicionar tampo de lise de hemcias (aproximadamente 3 X o volume de sangue);
Homogeneizar gentilmente e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos;
Centrifugar a 3.000 rpm por 30 minutos;
Descartar o sobrenadante*, mantendo o pellet de leuccitos;
Para eliminao dos resqucios de hemoglobina, ressuspender o pellet em 10 mL de lise
de hemcias, vortexando brevemente;
Centrifugar a 3.000 rpm por 10 minutos, e descartar novamente o sobrenadante*;
(Repetir os passos 6 e 7 quantas vezes forem necessrias para limpar o pellet de
leuccitos)
Acrescentar 3 mL de tampo de lise de ncleos, homogeneizar em vortex;
Adicionar 150l de SDS 20% e 10l de proteinase K, homogeineizar gentilmente;
Incubar a 56C, overnight (pode-se incubar a 37C; a lise de protenas vai ocorrer mais
devagar).

*O sobrenadante deve ser descartado em recipiente com gua sanitria, e mantido por 24
horas antes de ser descartado na pia.
DIA 2
1. Adicionar 1 mL de NaCl 5M amostra e agitar em vortex por 15 segundos, para precipitao
das protenas;
2. Centrifugar a 3.000 rpm por 30 minutos;
3. Transferir o sobrenadante contendo o DNA para um novo tubo falcon;
4. Centrifugar novamente (3.000 rpm por 10 minutos);
5. Transferir o sobrenadante novamente para outro tubo;
6. Adicionar etanol absoluto gelado em quantidade correspondente a 2X o volume contido
no tubo, seguido de inverso para precipitao do pellet de DNA;
7. Centrifugar o pellet de DNA a 3.000 rpm por 5 minutos, e descartar o sobrenadante. 8.
Lavar o pellet com 500l de etanol 70%;
9. Centrifugar novamente a 3.000 rpm por 5 minutos e descartar o sobrenadante;
10. Manter o DNA em temperatura ambiente por 15-30 minutos para secar;
11. Re-hidratar o DNA em 500l de gua illi-Q ou TE (deixar algumas horas para eluir bem);
12. Coletar o DNA eludo com pipeta Pasteur e armazenar em criotubo (manter o DNA a 4C.
Por longos perodos, manter preferencialmente a -20C).

50

Curso de vero 2015

PCR
1.
2.
3.
4.
5.

Retirar o DNA do freezer e deixar temperatura ambiente.

Lavar as mos e colocar luvas
Identificar os tubo. No esquecer de separar um tubo para o controle negativo.
Manter os tubos a serem utilizados, as pipetas e os tips sob luz UV por 15 minutos,
Preparar o Mix de PCR. As concentraes de alguns reagentes em uma PCR podem
necessitar de modificaes, de acordo com algumas variveis, como por exemplo o
fragmento a ser amplificado e a qualidade e concentrao da amostra de DNA utilizada.
Normalmente, necessria uma nova padronizao para cada fragmento. Em geral,
devem ser adicionados os seguintes reagentes por amostra:

Reagente

Concentrao
das solues de
estoque

H2O destilada
estril
Tampo de PCR
dNTP

Concentrao
Final

5 ul

5 ul x n

1X

1 ul

1 ul x n

200 uM

3 ul

3 ul x n

1,5 mM
20 pmol

QSpara 50
uL
10X
10 mM

MgCl2

Volume por tubo

multiplicado
pelo n total de
amostras (MIX)

Volume
(por tubo)

25 mM

Primer senso
(foward)

20 mM = 20
pmol/uL

1 ul

1 ul x n

Primer antisenso
(reverse)

20 mM = 20
pmol/uL

1 ul

1 ul x n

20 pmol

DNA molde

Varivel

Varivel

No entra no MIX

~
105molculas

Taq DNA
polimerase

5 Unidades/ul

0,5 ul

0,5 ul x n

2,5 unidades

6. Distribuir nos tubos o volume equivalente a 50 uL menos a quantidade de DNA a ser

adicionada em cada tubo.
7. Levar ao termociclador. O programa a ser utilizado ir variar de acordo com o fragmento
a ser amplificado. Em geral, as ciclagens de uma PCR so as seguintes:
Etapa do Ciclo

Temperatura

Tempo

Nmero de
Ciclos

Desnaturao inicial

94 C a 98 C

1 minuto

Desnaturao

94 C

10 a 60 segundos

Anelamento

5 C abaixo de Tm

30 segundos

Extenso

70 C a 80 C

Amplicon e DNA
polimerase dependente

Extenso final

70 C a 80 C

5 minutos

Hold

4C

25-35

51

Curso de vero 2015

Eletroforese em gel de agarose

1. Primeiro, deve-se pesar a agarose. A concentrao a ser utilizada vai depender do
tamanho dos framentos a serem analisados:
Tamanho do produto de PCR
At 1 kb
13 kb
37 kb
715 kb

Concentrao de
agarose
1.7%
1.5%
1%
0.7%

2. Coloca-se a agarose em um erlenmeyer e, depois, 100mL de tampo NaOH 1X.

3. Aquecer esta soluo no forno microondas, aos poucos, tirando o erlenmeyer de vez em
quando do forno e homogeneizar com cuidado, at que a soluo fique completamente
homognea. Este processo dura aproximadamente 1 minuto.
4. Esperar esfriar um pouco e adicionar o brometo de etdeo. Cuidado!!!! No o adicione
com o gel ainda muito quente, pois a aspirao de seus vapores muito prejudicial a sua
sade e a sade de quem estiver ao seu lado!!!
5. Pr o gel no molde e colocar o pente. Esperar pela polimerizao (aproximadamente 15
minutos).
6. Retirar o pente do gel e transferir para a cuba de corrida. Adicionar tampo NaOH 1X
(sempre adicione o mesmo tampo que foi utilizado no preparo do gel e na mesma
concentrao).
7. Aplicar 5L de amostra homigeneizada com 2L de tampo de amostra (azul de bromofenol,
xileno-cianol e glicerol a 20%). Os corantes azul de bromofenol e xileno-cianol ajudam a
acompanhar a frente de corrida, enquanto que o glicerol um agente espessante de alta
densidade que evita o refluxo da amostra aps ser aplicada no poo do gel.
8. Cobrir a cuba e conectar os cabos fonte de tenso de forma que a migrao ocorra do
plo negativo para o plo positivo.
9. Aplicar voltagem da distncia entre os eletrodos, de acordo com o tamanho do fragmento
e concentrao:
Tamanho do produto de PCR
At 1 kb
13 kb
37 kb
715 kb

Concentrao de
agarose
1.7%
1.5%
1%
0.7%

Condies de corrida
56 V/cm por 0.51 h
44.5 V/cm por 12 h
33.5 V/cm por 2 h
2.5 V/cm por 56 h

10. Monitorar a passagem de corrente atravs da formao de bolhas que ocorre nos plos
devido eletrlise do tampo.
11. Aps a corrida (aproximadamente 20 minutos), desligar a fonte de tenso e remover o gel
da cuba.
12. Analisar o padro de migrao expondo o gel luz UV e fotograf-lo para documentao.

52

Curso de vero 2015

Sequenciamento de Sanger
RECOMENDAES PARA O PREPARO DAS AMOSTRAS PARA
SEQUENCIAMENTO NA PLATAFORMA ABI 3130xl
Documento elaborado por Kelly Rose Lobo de Souza e Leila Schuindt Monnerat - Diviso de Gentica.
CPQ. Instituto Nacional de Cncer. Rio de Janeiro. 2011.
I - Quantificar o template com base nos valores recomendados pela Applied Biosystems:

Quadro 1 - Quantidade de template recomendada para reao de sequenciamento no ABI 3130 xl

II - Montar as reaes de sequenciamento, totalizando o volume final de 10 L, utilizando

como referncia o seguinte protocolo:
Reagente
Ready Reaction Kit
BigDye Sequencing Buffer (5X)
Primer (senso ou antisenso)
Template
gua deionizada
Volume final

Quantidade
(por reao)
1 L
1,5 L
3,2 pmol
Ver Quadro 1
q.s.p.
10 L

Quadro 3 - Quantidades recomendadas para montagem da reao de sequenciamento com o BigDye

Terminator Cicle Sequencing Kit v3.1

IMPORTANTE: Para o preparo da reao controle (pGEM), utilizar os seguintes volumes:

Reagente
Ready Reaction Kit
BigDye Sequencing Buffer (5X)
Primer M13
pGEM
gua deionizada
Volume final

Quantidade
(por reao)
1 L
1,5 L
4,0 L
1,5 L
2 L
10 L

OBSERVAES: (1) Montar a reao controle (pGEM) preferencialmente no poo H12; (2) O primer
M13 e o pGEM so fornecidos juntamente com o kit de sequenciamento (BigDye Terminator Cicle
Sequencing Kit v3.1).

53

Curso de vero 2015

III Preparar as reaes utilizando a seguinte ciclagem bsica:

Quadro 3 - Ciclagem bsica para reao de sequenciamento com o BigDye Terminator Cicle Sequencing
Kit v3.1

IV Precipitar as reaes de sequenciamento seguindo um dos protocolos (Precipitao por

Etanol/EDTA; Purificao por Etanol/EDTA/Acetato de Sdio; BigDye X Terminator Purification
Kit) descritos no DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Applied Biosystems Chemistry
Guide. Second Edition (Part Number 4305080 Rev. C 05/2009).
Alternativamente, pode ser realizada a precipitao por Etanol/Isopropanol, seguindo
o protocolo utilizado na Plataforma de Sequenciamento e Anlise de Fragmentos PDTIS/
Fiocruz, descrito abaixo.
ETAPA Precipitao da Reao de Sequenciamento (Etanol/Isopropanol)
1
Centrifugar a 600 rpm por 1 minuto (Spin).
2
Adicionar 30 L de Isopropanol 75% (Merck).
Ressuspender as amostras, com a pipeta, 3 a 4 vezes, para homogeneiz-las.
3
Alternativamente, pode ser utilizado o vrtex.
4
Incubar a placa, por 15 minutos, temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
5
Centrifugar, a 4C, por 45 minutos, a 4.000 rpm.
Descartar o sobrenadante vertendo a placa sobre papel-toalha, atravs de
6
movimentos circulares, apoiada sobre uma bancada.
Centrifugar a placa invertida sobre papel-toalha (spin down), a 600 rpm, por 1
7
minuto.
8
Adicionar 50 L de Etanol 75% (Merck).
9
Centrifugar, a 4C, por 15 minutos, a 4.000 rpm.
Descartar o sobrenadante usando papel-toalha, de acordo como descrito
10
anteriormente.
Centrifugar a placa invertida sobre papel-toalha (spin down), a 600 rpm, por 1
11
minuto.
12
Colocar a placa em um bloco aquecido a 60C, por 10 minutos, ao abrigo da luz.
IMPORTANTE: Quando mantidas a 20C, devidamente seladas e protegidas da luz, as placas
precipitadas podero ser armazenadas por at 30 dias.

54

Curso de vero 2015

MLPA
DIA 1
Desnaturao do DNA:
1. Adiconar 5 l de DNA (50-250 ng) em cada tubo ou poo a ser utilizado. Utilizar TE ou
gua destilada para o tubo de controle negativo.
2. Colocar os tubos no termociclador, e iniciar o programa de MLPA (Tabela 1). Desnaturar as
amostras por 5 minutos a 98C, e resfri-las at 25C antes de remov-las do termociclador.
Reao de Hibridizao:
1. Deixar o tampo de MLPA (MLPA buffer) e o mix de sondas (probemix) descongelarem em
temperatura ambiente, e agit-los brevemente em vrtex antes de sua utilizao;
2. Preparar um mix de hibridizao, contendo, para cada reao: 1,5 l de tampo de MLPA
+ 1,5 l de mix de sondas. Homogeneizar a mistura por pipetagem ou vortex.
3. Durante a pausa a 25, adicionar 3 l do mix preparado na etapa anterior a cada amostra.
Misture bem.
4. Continuar o programa no termociclador: incubar por 1 min a 95, e de 16 a 20 h a 60C.

DIA 2

Reao de ligao:
1. Deixar os tampes da ligase descongelarem em temperatura ambiente, e agit-los
brevemente em vrtex antes de sua utilizao;
2. Preparar um mix de ligao, contendo, para cada amostra: 25 l de gua destilada +3 l
de tampo de ligase A + 3 l de tampo de ligase B + 1 l de enzima Ligase-65. Misture
pipetando gentilmente. Jamais levar mix contendo enzimas ao vrtex.
3. Continuar o programa no termociclador: passar para a pausa a 54C.
4. Quando as amostras chegarem a 54C, adicionar 32 l do mix de ligao a cada tubo.
Misturar pipetando gentilmente.
5. Continue o progrma no termociclador: incubao a 54C por 15 min (para a ligao); 5 min
a 98C para inativar a enzima Ligase, e pausa a 20C.
Reao de PCR:
1. Deixar o mix de primers (SALSA PCR primer mix) descongelar em temperatura ambiente,
e agit-lo brevemente em vrtex antes de sua utilizao;
2. Preparar o mix de PCR adicionando, para cada reao: 7,5 l de gua destilada + 2 l de
primers + 0,5 l de DNA polimerase (SALSA polymerase). Misturar pipetando gentilmente.
3. Quando as amostras estiverem a 20C, adicionar 10 l do mix de PCR em cada tubo.
Misturar pipetando gentilmente. Continuar o programa no termociclador: 35 ciclos de: 30
seg a 95C, 30 seg a 60C, 60 seg a 72C. finalizar a reao com 20 minutos a 72C,
pausar a 15C.
4. Para evitar contaminao, no abrir os tubos no mesmo ambiente do termociclador aps
a PCR. Use diferentes pipetas para manusear o material antes e depois da PCR.
5. Os produtos de PCR podem ser armazenados a 4C por at uma semana. Para perodos
mais longos, armazenar entre -25C e -15C. Os fluorocromos so sensveis luz, e
portanto, os produtos devem ser armazenados protegidos da luz (em caixas escuras ou
envoltos em papel alumnio).
Eletroforese capilar:
As condies e concentraes dos produtos utilizados na eletroforese capilar dependem do
equipamento utilizado. Para cada capilar, deve ser aplicada uma mistura contendo:

O produto da amplificao (~0,7 L)

Um padro de peso molecular (~0,3 L)

Formamida HiDi (highly deionized) (~9,0 L)
Essa mistura deve ser incubada por 3 min em temperaturas elevadas (em torno de 90C), e
imediatamente aps essa incubao deve ser levada ao gelo e mantida sob refrigerao por
alguns minutos, para evitar a renaturao das sondas, antes de ser aplicada no equipamento.
Os dados gerados podem ser analisados por diversos programas, dependendo do equipamento
utilizado, como o Coffalyser.Net, GeneMapper, GeneMarker e Peakscanner.
55

Curso de vero 2015

Referncias:
LORENZ, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization
Strategies.J. Vis. Exp.(63), e3998, 2012.
MILLER, S. A.; DYKES, D. D.; POLESKY, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from
human nucleated cells.Nucleic acids research, v. 16, n. 3, p. 1215, 1988.
MRC-HOLLAND. MLPA DNA Protocol version MDP-005. Disponvel em <http://www.mlpa.com/
WebForms/WebFormMain.aspx?Tag=_wl2zCji-rCGANQgZPuTixtCplCA1mmwJoFo_xHPnTgc.>.
Acesso em 20/11/2014.
QIAGEN. QIAGEN LongRange PCR Handbook. Disponvel em: < http://www.qiagen.com/br/resources/
resourcedetail?id=e90c8e4b-f3c4-4876-a320-9890aaec1e17&lang=en>. Acesso em 20/11/2014.
SAMBROOK, J.A.R., RUSSEL, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. New York, Cold
Spring Harbor Laboratory Press. 2001.

56

MINISTRIO DA SADE
INSTITUTO NACIONAL DE CNCER JOS ALENCAR GOMES DA SILVA (INCA)

VII CURSO DE VERO DE PESQUISA EM ONCOLOGIA

BUSCA POR BIOMARCADORES DE

DIAGNSTICO EM CNCER A PARTIR
DE ANLISES DE EXPRESSO
GNICA EM LARGA ESCALA

RIO DE JANEIRO, RJ
INCA
2015

2015 Instituto Nacional de Cncer Jos Alencar Gomes da Silva/ Ministrio da Sade.
Esta obra disponibilizada nos termos da Licena Creative Commons
Atribuio No Comercial Compartilha igual 4.0 Internacional.
permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a
fonte.
Esta obra pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade Preveno e Controle
de Cncer (http://controlecancer.bvs.br/) e no Portal do INCA (http://www.inca.gov.br).
Tiragem: XXXX exemplares
Elaborao, distribuio e informaes
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Curso IV - BUSCA POR BIOMARCADORES DE DIAGNSTICO EM CNCER A PARTIR

DE ANLISES DE EXPRESSO GNICA EM LARGA ESCALA
Pesquisadores responsveis
Luis Felipe Ribeiro Pinto
Sheila Coelho Soares Lima
Equipe
Isabela Martins Gonzaga
Marcela Farias Costa
Colaborador
Pedro Nicolau Neto

SUMRIO
CAPTULO 1 3
1. Biomarcadores em cncer 3

1.1. Classificao de biomarcadores 3

1.2. Etapas de rastreio de biomarcadores 4
Metodologia de rastreio de biomarcadores em cncer por anlise de expresso em
larga escala 6
CAPTULO 2 12
1. Validao de um biomarcador 12
2. Adeso celular 12

2.1 Junes Ocludentes 13

2.2 Junes Comunicantes 13

2.3 Junes Aderentes 13

2.4 Adeso celular e doena 14

2.5 Adeso celular e cncer 14
Metodologia de validao de biomarcadores em cncer 16
REFERNCIAS 20

Curso de vero 2015

CAPTULO 1
1. Biomarcadores em Cncer

Atualmente, o cncer aparece como a segunda causa de morte na populao
brasileira, apresentando uma tendncia de aumento para os prximos anos (INCA, 2011). Ao
longo das ltimas dcadas, houve grande mobilizao da rea cientfica mundial pelo maior
conhecimento sobre as diferentes doenas que compreendem o cncer, visando compreender
seus fatores causais, os mecanismos celulares envolvidos durante a carcinognese e possveis
explicaes para resistncias aos tratamentos j disponveis. A partir destas descobertas, foi
possvel criar estratgias para tentar reverter o quadro do cncer mundialmente. Dentre elas,
destaca-se a busca por biomarcadores.

Os biomarcadores podem ser definidos como qualquer substncia, estrutura ou
processo que pode ser mensurado em fluidos corporais ou clulas e que tenham a capacidade
de predizer processos biolgicos normais, patolgicos ou resposta farmacolgica alguma
interveno teraputica (NIH, 2014; W, 2014). A utilizao destes biomarcadores na prtica
clnica transformou a forma de lidar com as neoplasias. A possibilidade de detectar a doena
mais precocemente, de individualizar as condutas teraputicas e acompanhar a resposta ao
tratamento dos pacientes fez com que o avano das taxas de mortalidade por cncer no
mundo comeasse a regredir (Siegel, 2011).
1.1 Classificao de biomarcadores

Os biomarcadores podem ser classificados atravs da sua fonte de origem ou
atravs das suas possveis utilidades na prtica clnica. possvel detectar um biomarcador
atravs do DNA, RNA ou protenas que possam identificar um determinado estado da clula,
classificando-a como tumoral ou saudvel, ou ainda atravs de concentraes distintas de
metablitos que podem ser produzidos pelo paciente com cncer, comparado a um indivduo
que no possua a doena. Alm disso, esses biomarcadores tambm podem ser classificados
quanto ao objetivo da sua utilizao, podendo ser biomarcadores de diagnstico, prognstico
ou predio teraputica, que sero detalhados a seguir (Figura 1).
1. Biomarcadores de diagnstico: So aqueles com a capacidade detectar e identificar um
determinado tipo de cncer.
Exemplo: Fuso gnica BCR-ABL usado para auxiliar o diagnstico de leucemia
mieloide crnica (LMC) e monitorar a doena.
2. Biomarcadores de prognstico: So utilizados uma vez que a doena j tenha sido
diagnosticada. Estes biomarcadores so utilizados para predizer o provvel curso que
doena seguir e a sua agressividade.
Exemplo: Subunidade beta de gonadotrofina corinica humana (beta-hCG) para o
estadiamento e prognstico de coriocarcinoma.
3. Biomarcadores de predio teraputica: So capazes de determinar quais sero os
possveis respondedores e no respondedores para uma determinada terapia, predizendo
a elegibilidade do paciente para este tratamento.
Exemplo: Mutao em EGFR e resposta ao tratamento ao Gefitinib em cncer de
pulmo no pequenas clulas.
(Kulasingam e Diamandis, 2008)
3

Curso de vero 2015

Figura 1: Classificao de biomarcadores (Baseado em Mishra e Verma, 2010)

Alm disso, importante ressaltar que estes diferentes tipos de biomarcadores podem
ser encontrados no sangue, na urina, fezes, nas clulas do tumor e em fluidos corporais. No
entanto, prefervel a identificao de um biomarcador que possa ser medido de maneira
no invasiva ao paciente. Por exemplo, a superexpresso do gene 3 de cncer de prstata
(PCA3) analisado a partir da urina e pode ser utilizado como ferramenta adicional ao exame
do antgeno prosttico especfico (PSA), muito comum para o rastreio de cncer de prstata
(FDA, 2014). Porm, esta no uma tarefa simples quando se desenvolve um biomarcador
para cncer. A maioria dos marcadores j estabelecidos preferencialmente mensurada a
partir de clulas do prprio tumor ou atravs do sangue do paciente (NCI, 2014).

1.2 Etapas de rastreio de biomarcadores:

A busca por identificao de biomarcadores em cncer pode ser feita atravs de
diferentes tcnicas atualmente, no entanto, se destacaram nos ltimos anos a utilizao de
anlises em larga escala para detectar potenciais biomarcadores em cncer. Dentre elas esto
as anlises globais de expresso gnica, de nveis de metilao do DNA, de expresso proteica
e de peptdeos e outras molculas secretadas capazes de serem detectadas no sangue.

O principio bsico destas metodologias, quando se trata de busca por biomarcadores
de diagnstico, comparar tecidos tumorais contra tecidos normais adjacentes ao tumor e/
ou comparar pacientes com a doena contra pacientes sem a doena. Com isso, uma srie
de marcadores que possuam capacidade de diferenciar a doena pode ser identificada. Alm
disso, outros parmetros podem ser levados em considerao, como: se aquele biomarcador
reflete um impacto na sobrevida dos pacientes e na evoluo da doena. Podendo ser, ao
mesmo tempo, um marcador de diagnstico e prognstico.

Dois dos principais parmetros a serem analisados para a determinao de um
biomarcador o seu valor de sensibilidade e especificidade. O valor de sensibilidade reflete
os chamados verdadeiros positivos, ou seja, a capacidade do biomarcador em predizer
que aquela amostra tem a doena quando ela realmente apresenta a doena. J o valor de
especificidade reflete os chamados verdadeiros negativos, ou seja, quando o biomarcador
capaz de predizer que a amostra no possui a doena quando ela realmente no tem
4

Curso de vero 2015

a doena. Sendo assim, o ideal que os biomarcadores detectados apresentem valores

prximos 100% de sensibilidade e especificidade.

Alm disso, a validao e liberao de um biomarcador para a prtica clnica necessita
de diversas etapas. Por exemplo, se um biomarcador detectado em uma analise global de
expresso gnica e se mostra capaz de diferenciar tecidos tumorais de tecidos no tumorais,
o prximo passo seria comprovar este mesmo fenmeno com uma metodologia mais sensvel,
como RT-PCR em tempo real. Como a utilizao de PCR na clnica apresenta um custo
muito elevado, seria interessante uma prxima anlise do biomarcador atravs da expresso
proteica por imuno-histoqumica, uma metodologia largamente utilizada na rotina clnica. Uma
vez o biomarcador apresentando bons ndices de sensibilidade e especificidade ao longo desta
validao, o prximo passo inclui a investigao do potencial deste biomarcador em ensaios
clnicos retrospectivos e prospectivos. A partir de todas estas etapas, agncias regulatrias
da sade so responsveis por aprovar a utilizao deste biomarcador para diagnstico e
aps anlises de custo-benefcio por aqueles que promovero os testes em pacientes, o
biomarcador passa a ser includo na rotina clnica para a deteco daquele tipo de cncer
(Figura 2) (Ludwig & Weinstein, 2005; Kulasingam e Diamandis, 2008).

Figura 2: Cronologia do desenvolvimento de um biomarcador (adaptado de Ludwig & Weinstein, 2005).

5

Curso de vero 2015

METODOLOGIA DE RASTREIO DE BIOMARCADORES EM CNCER POR

ANLISE DE EXPRESSO EM LARGA ESCALA:
1.Extrao de RNA e determinao da integridade.
1.1 Extrao de RNA.
Colocar um fragmento da bipsia de at 30 mg em um microtubo de 1,5 mL junto com
200 mL do tampo RLT com beta-mercaptoetanol.
Macerar o tecido, com auxlio de um pilo e adicionar mais 400 mL do tampo RLT
Centrifugar em microcentrfuga por 3 min velocidade de 12.000 x g para sedimentar
o material no lisado.
Transferir o sobrenadante para um novo tubo e 1 volume de etanol 70% ser adicionado.
Aps homogeneizao, transferir 700 mL da soluo para uma coluna de purificao
alocada em um tubo coletor de 2 mL.
Centrifugar por 15 s a 8.000 x g.
Descartar o lquido do tubo coletor.
Repetir o procedimento at passar toda a soluo pela coluna.
Adicionar 700 mL do tampo RW1 na coluna de purificao
Centrifugar por 15 s a 8.000 x g.
Descartar o lquido do tubo coletor.
Adicionar 500 mL do tampo RPE a coluna de purificao.
Centrifugar por 2 min a 8.000 x g.
Transferir a coluna para um novo tubo coletor de 2 mL.
Centrifugados por 1 min a 12.000 x g.
Transferir a coluna para um microtubo de 1,5 mL.
Adicionar 30 mL de gua no centro da membrana sem encostar a ponteira na mesma
a fim de eluir o RNA total. Aguardar 1 minuto.
Centrifugar por mais 1 min a 8.000 x g.
Descartar a coluna e posteriormente os tubos contendo o RNA total extrado devem
ser armazenados -80C.
1.2 Quantificao e Determinao da Integridade do RNA.

A concentrao de RNA nas amostras ser determinada pela utilizao do
espectrofotmetro NanoDrop (Uniscience) com absorvncia determinada no comprimento de
onda de 260 nm. O clculo da concentrao do RNA tomar por base a informao de que
uma unidade de absorvncia corresponde a uma concentrao de 40 mg / mL de RNA.
Adicionar 1,0 mL de gua duas vezes no espectrofotmetro, a fim de determinar o
branco.
Adicionar 1,0 mL de RNA extrado.
Para determinarmos a integridade do RNA extrado, utilizamos o equipamento
Bioanalyzer (Agilent), com o chip RNA 6000 Nano, seguindo o protocolo do fabricante. Como
resultado, o Bioanalyzer fornece um nmero de integridade do RNA (RIN) e amostras com
RIN inferior a 8 sero descartadas. A integridade do RNA ser determinada pela razo entre
os rRNAs 18S e 28S e a presena de material degradado, conforme apresentado na Figura 3.
6

Curso de vero 2015

Figura 3: Eletroferograma representativo do padro de RNA atravs do equipamento Bioanalizer

(Agilent); RIN igual a 9,5. Legenda: A: pico representando o rRNA 18S; B: pico representando o rRNA
28S; C: rea de anlise de RNA degradado

2. Microarranjo de DNA.
2.1 Sntese de cDNA
A preparao das amostras para a anlise de microarranjo de DNA ser realizada com
a utilizao do WT Expression Kit (Ambion), conforme recomendao da Affymetrix, produtora
dos chips para microarranjo utilizados (Gene Chip Expression Analysis Technical Manual Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA).
O RNA total de cada tumor e tecido adjacente ser convertido em cDNA dupla-fita
utilizando o oligonucleotdeo iniciador T7-Oligo(dT)24 de sequncia 5 GGCCAGTGAATTG
TAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(dT)24 3.
- Etapas:
Adicionar 2,0 mL do controle Poly-A e 5,0 mL do mix para sntese da primeira fita de
cDNA em um microtubo.
Adicionar 3,0 mL contendo 100 ng de RNA.
Os tubos contendo cada uma das reaes sero incubados no termociclador Veriti
(Applied Biosystems) com as seguintes condies:
- 1 hora a 25C;
- 1 hora a 42C;
- 2 min a 4C.
Aps este processo, transferir os tubos para um isopor com gelo.
A sntese da segunda fita de cDNA ser feita imediatamente em seguida, formando um
cDNA dupla-fita. Aps a adio de 50,0 mL do Second-Strand Mix em cada uma das
reaes, e os microtubos sero incubados no termociclador Veriti (Applied Biosystems)
com as seguintes condies:

Curso de vero 2015

- 1 hora a 16C;
- 10 min a 65C;
- 2 min a 4C.
2.2 Sntese e purificao de cRNA.
Preparar a reao, contendo:
24,0 mL de tampo
60,0 mL de cDNA sintetizado
6,0 mL da enzima

A reao ser realizada incubando a mistura por 16 horas a 40C no termociclador
Veriti (Applied Biosystems).
Aps o final do processo, o cRNA ser purificado utilizando beads magnticas (Nucleic
Acid Binding Beads, Ambion, Life Technologies, USA), utilizando o seguinte protocolo:
Adicionar 50,0 mL do tampo das beads magnticas e 10,0 mL das beads magnticas
em cada tubo contendo cRNA, homogeneizando por pipetagem.
Transferir essa soluo para placa em U fornecida pelo kit.
Adicionar 60,0 mL de isopropanol (MERCK) em cada tubo, homogeneizando por
pipetagem.
Agitar a placa por 2 minutos a 400 rpm;
Posicionar a placa sobre uma superfcie magntica por 5 minutos.
Retirar o sobrenadante, sem perturbar as beads que esto ligadas ao cRNA.
Lavar as beads 2 vezes com soluo de lavagem de cidos nucleicos fornecida pelo
kit, utilizando o misturador de placas e a placa magntica como descrito anteriormente,
retirando o sobrenadante no final.
Eluir o cRNA adicionando 40,0 mL de soluo de eluio, fornecida pelo kit, pr
aquecida por 10 min 58C.
Incubar a placa por 2 min, com subsequente rotao vigorosa no misturador de placas
por 3 min.
Posicionar a placa em U sobre a placa magntica.
Transferir o sobrenadante contendo o cRNA purificado para tubos de 0,5 mL. A soluo
ser armazernada em gelo e ser feita a nova sntese de cDNA.
Antes de proceder com a nova sntese de cDNA, a eficincia da reao ser verificada
atravs de quantificao no espectrofotmetro NanoDrop (Uniscience) com absorvncia
determinada no comprimento de onda de 260 nm. As reaes sero consideradas
eficientes quando a concentrao de cRNA for maior ou igual a 455 ng/mL.
2.3 Segundo ciclo de sntese de cDNA.
O segundo ciclo de sntese de cDNA ser realizado adicionando 10,0 g de cRNA
purificado em um volume final de 22 mL em um microtubo.
Adicionar 2,0 mL de oligonucleotdeos randmicos.
Incubar em um termociclador, seguindo o protocolo a seguir:

Curso de vero 2015

- 5 min a 70C
- 5 min a 25C
- 2 min a 4C

Preparar uma mistura contendo: 8,0 mL de tampo e 8,0 mL de enzima, ambos

fornecidos pelo kit e adicion-la no microtubo contendo cRNA e os olinucleotdeos.
Incubar em um termociclador, seguindo o protocolo abaixo:


- 10 min a 25C

- 90 min a 42

- 10 min a 72C

- 2 min a 4C.
Para hidrolizao, adicionar 2,0 mL de RNaseH mistura.
Incubar em um termociclador, seguindo o protocolo abaixo:


- 45 min a 37C

- 5 min a 95C

- 2 min a 4C
O produto do segundo ciclo de cDNA ser ento purificado utilizando beads magnticas
da mesma forma descrita anteriormente no item Sntese e purificao de cRNA,
utilizando etanol (MERCK) no lugar do isopropanol, fornecendo um cDNA simples fita
(ssDNA) que ser quantificado para avaliar a eficincia da reao no espectrofotmetro
NanoDrop (Uniscience) com absorvncia determinada no comprimento de onda de 260
nm. As reaes sero consideradas eficientes quando apresentaram concentrao de
ssDNA maior ou igual a 185,0 ng/mL.
2.4 Fragmentao e Hibridao no Chip Human Exon 1.0 ST
Para hibridao, 5,5 g de cRNA (em um volume de 10 L) de cada amostra sero
fragmentados com 4,8 mL de tampo de fragmentao 10X, 1,0 mL da enzima UracilDNA Glycosylase (UDG), 1,0 mL da enzima Humanapurinic/ apyrimidinicendonuclease
(APE) e gua para completar o volume final de 48,0 mL.
Incubar essa mistura, seguindo o protocolo abaixo:

- 60 min a 37C
- 2 min a 95C
- 2 min a 4C

O tamanho dos fragmentos ser verificado por eletroforese em gel de agarose.

As bandas devem ser equivalentes a 0,5 kb e, aps a fragmentao, devem ser
equivalentes a fragmentos de 35 a 200 bases.
A primeira marcao ser realizada com:

Curso de vero 2015

- 45,0 mL do produto da fragmentao

- 12,0 mL de tampo de fragmentao (5x)
- 2,0 mL de Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)
- 1,0 mL de DNA labelling reagent
Incubar em um termociclador, seguindo o protocolo abaixo:

- 60 min a 37C
- 10 min a 70C
- 2 min a 4C.

Para cada amostra de tecido tumoral ou adjacente ao tumor ser utilizado um chip de
microarranjo Human Exon 1.0 ST (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA).
As sondas dos arrays so produzidas utilizando tecnologias que combinam fotolitografia
e qumica combinatria, sendo que at 1,3 milho de diferentes sondas de oligonucleotdeos
so sintetizadas em cada array. Cada um desses oligonucleotdeos est localizado em uma
rea especfica do array chamada de probecell e cada uma delas pode conter milhares
at milhes de cpias de um determinado oligonucleotdeo. Os arrays so previamente
equilibrados temperatura ambiente. Uma mistura de reao para cada amostra ser
preparada, tomando-se o cuidado de aquecer previamente a soluo estoque de controles de
hibridao eucariticos 20X a 65C por 5 minutos para a completa ressuspenso do ssDNA.
A mistura de reao composta por gua ultrapura em quantidade suficiente para
100,0 mL:
- 27,0 mL da reao ssDNA fragmentada
- 1,7 mL de oligonucleotdeo B2 Controle (Affymetrix)
- 5,0 mL de controles de hibridao eucariticos 20X (bioB, bioC, bioD, cre) (Affymetrix)
- 50,0 mL de tampo de hibridao 2X
- 7,0 mL de DMSO
Aquecer a mistura a 99C por 5 min e logo em seguida resfri-la a 45C por 5 min.
Centrifugar por 5 min na velocidade de 12.000 x g para remover qualquer material
insolvel.
Remover a soluo tampo dos cartuchos e substituir pela mistura de reao clarificada.
Os arrays sero acondicionados em caixas rotisserie em forno de hibridao a 45C e
hibridados por 17 horas com rotao de 60 rpm.
Todo o processo de lavagem e colorao sero feitos na estao fludica GeneChip
Fluidics Station 450 de acordo com a seguinte programao:
- 10 ciclos de 2 mixes/ciclo com tampo A a 30C
- 6 ciclos de 15 mixes/ciclo com tampo B a 50C, tampo SAPE por 5 min a
35C
- 10 ciclos de 4 mixes/ciclo com tampo A a 30C, soluo de anticorpo por 5
min a 35C, tampo SAPE por 5 min a 35C
- 15 ciclos de 4 mixes/ciclo com tampo A a 35C.

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Curso de vero 2015

2.5 Leitura dos Chips e aquisio dos valores de expresso.

Para a leitura ptica dos chips Human Exon 1.0 ST os arranjos de sonda so lidos em
scanner GeneArray Scanner 7G (Affymetrix), equipado com laser de on argnio, programado
segundo as instrues do fabricante, atribuindo-se 3 m para o valor de pixel e comprimento
de onda de 570 nm. A captura das imagens e anlise inicial das hibridaes sero feitas com
o software Affymetrix Expression Console e os arquivos gerados sero salvos em formato
*.cel.
2.6 Determinao de genes diferencialmente expressos
Os dados obtidos na aquisio dos sinais de fluorescncia presentes nos arquivos
*.cel sero normalizados e sumarizados utilizando o software Expression Console
(Affymetrix). Para tanto utilizado o algoritmo RMA (Robust Multi-array Average), que
ir gerar uma matriz formada pelas sondas nas linhas e amostras nas colunas.
Aps a normalizao e sumarizao, os dados sero analisados no software R /
Bioconductor (Development core team, 2004), utilizando o pacote Limma. O Limma
foi desenvolvido para anlises de expresso diferencial gnica de dados oriundos de
experimentos de microarranjo de DNA (Wettenhal e Smyth, 2004).
Uma anlise de componente principal realizada utilizando todos os dados presentes no
RMA, visando observar como a varincia na expresso de todas as sondas impactaria
no agrupamento das amostras. Para tanto utilizado o pacote pcaMethods.
Aps a adequao no modelo linear os genes so classificados como diferencialmente
expressos aplicando-se os seguintes critrios:

- Valor de p ajustado menor que 0,05

- Ods probability maior que 95%
- Log2 Fold Change absoluto maior ou igual a 1.
Aps a seleo dos genes diferencialmente expressos, realizada uma anlise de
agrupamento hierrquico bayesiano das amostras nas duas dimenses (Heller e
Ghahramani, 2003), havendo a formao de grupos gnicos.
Cada grupo gnico formado enriquecido utilizando as plataformas Gene Ontology
(GO) (The Gene Ontology Consortium, 2000) e KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes
and Genomes) (Kanehisa et al., 2004)

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Curso de vero 2015

CAPTULO 2
1. Validao de um biomarcador
As tcnicas em larga escala como o microarranjo oferecem a possibilidade de avaliar
no s genes, mas tambm vias celulares alteradas durante o processo de carcinognese.
Uma vez que biomarcadores podem ser molculas envolvidas nos mais diversos processos
celulares, tais como sinais de crescimento e seus receptores, protenas envolvidas no reparo
de DNA, molculas de adeso celular, entre outros, a anlise por microarranjo pode ser uma
importante ferramenta para a identificao desses marcadores.
Protenas de adeso tm mostrado um grande potencial como biomarcadores, j que
muitas vezes so diretamente correlacionadas ao grau de diferenciao de uma clula.
sabido que um dos passos para a transformao celular exatamente a perda de diferenciao,
portanto, a expresso diferencial de molculas de adeso pode ser um indcio importante deste
processo. Alm disso, clulas tumorais podem adquirir capacidade de migrao e invaso,
processo este tambm dependente da expresso diferencial de protenas de adeso. Sendo
assim, tais molculas podem ser importantes biomarcadores no s de diagnstico, mas
tambm de prognstico uma vez que sejam capazes de predizer metstase. Como exemplo
pode ser citada a protena e-caderina no cncer gstrico: sua expresso vem sendo estudada
pelo mtodo de imuno-histoqumica e est sendo encontrada por diversos autores diminuda
em cncer gstrico; associao entre a sua expresso e ao grau de diferenciao do tumor;
e a taxa de sobrevida e a sobrevivncia livre de doena parece ser maior quando a protena
est mais expressa (LI; CHEN, 2014; ON; CHAN, 2006).

2. Adeso Celular
A vida pluricelular s existe porque as clulas conseguem manter-se ligadas. A
existncia de tecidos e rgos uma demonstrao da evoluo e da seleo de mecanismos
que possibilitaram uma ligao celular eficiente, de forma a possibilitar a compartimentalizao
dos organismos, resistir a injrias, e formar uma barreira fsica entre: os animais e plantas
ao seu entorno, e rgos ao resto do organismo. A adeso celular crucial para a unio de
clulas nos tecidos animais. As clulas simplesmente no grudam para formar os tecidos,
elas so organizadas em padres muito diferentes e altamente distintos, e essa variedade
possvel pela existncia de mecanismos de adeso celular, que so responsveis pela unio
das clulas, juntamente com suas conexes com o citoesqueleto interno (GUMBINER, 1996).
Ao contrrio do que se possa pensar, apesar de promover a adeso tecidual, os
mecanismos de adeso celular no so estticos. So dinmicos e esto a todos os
momentos sendo regulados, desta forma, os tecidos exercem suas funes. Existe mais de
um mecanismo de adeso celular, e estes mecanismos exercem funes diversas alm de
apenas ligar clulas umas s outras (Gumbiner, 1996). As formas de conexo tecidual so
compostas por protenas de superfcie celular denominadas protenas de adeso, e essas
protenas esto envolvidas na promoo de sinais bioqumicos e fsicos que regulam uma
sria de funes como expresso gnica, proliferao celular, diferenciao, apoptose e
migrao, pois existe interao entre elas e outras molculas celulares (BUCKLEY et al.,
1998). Os tipos de adeso so:
12

Curso de vero 2015

2.1 Junes Ocludentes

As junes ocludentes tm como funo mediar o transporte entre clulas: regulando
caractersticas da permeabilidade do espao entre clulas adjacentes e dividindo a superfcie
celular em diferentes compartimentos bioqumicos e funcionais. Dentre as propriedades
fisiolgicas deste tipo de juno celular, a capacidade de formar barreiras seletivas de
permeabilidade se sobressai, pois clulas comumente so organizadas de modo a formar
interfaces entre compartimentos com caractersticas e composies bioqumicas diferentes
(GUMBINER, 1987), ou seja, este tipo de juno tem uma caracterstica maior de isolamento
que de comunicao. Essa funo essencial para regular a movimentao de solutos,
ons, macromolculas e tambm clulas. Dentre os exemplos podem ser citados: trfego
de leuccitos entre endotlio e epitlio, adsoro de nutrientes pelo epitlio gastrointestinal,
manuteno do correto balano eletroltico no sistema nervoso, e a isolamento eltrico de
xons pela mielina (GUMBINER, 1987). As principais protenas envolvidas neste tipo de
juno so as claudinas e ocludinas (TSUKITA; FURUSE, 1999).
2.2 Junes Comunicantes
As junes comunicantes, segundo o prprio nome, tem funo de comunicao entre
clulas. Este tipo de juno permite um transporte de molculas mais permissivo que as junes
ocludentes, por difuso passiva entre clulas adjacentes. Esse transporte pouco especfico e
a sua seletividade parece se basear principalmente no tamanho molecular, esta caracterstica
permite a passagem de molculas menores que 1000 Da, e impede a passagem de cidos
nucleicos. Este mecanismo bem conservado evolutivamente e existe em praticamente todos
os animais, vertebrados e invertebrados, e em plantas maiores, utilizando um mecanismo
similar. Em nvel de organismo, com exceo do msculo esqueltico, eritrcitos e linfcitos
circulantes, a maioria dos tecidos normais se comunica atravs destas junes. A principal
protena envolvida neste tipo de juno a conexina (KUMAR; GILULA, 1996).
2.3 Junes Aderentes
As junes aderentes ligam clulas adjacentes em vrios arranjos necessrios para a
formao das estruturas teciduais (NIESSEN; GOTTARDI, 2008). Estas estruturas promovem
adeso forte a clulas e proteo ao stress mecnico. Ligam-se atravs das membranas
celulares no espao extracelular e formam uma ponte at o citoesqueleto, desta maneira,
formam redes transcelulares que coordenam o comportamento de populaes celulares.
Dentro da classificao de junes aderentes, morfologicamente, existem dois tipos: os
desmossomos e os hemidesmossomos. Ambos possuem a mesma funo primordial, conferir
adeso forte, mas em compartimentos celulares distintos (YAP; BRIEHER; GUMBINER,
1997). Alm de seu papel na ancoragem de clulas, tambm atuam no estabelecimento da
forma celular, na diviso, crescimento, apoptose e na manuteno da barreira (BRANDNER;
HAFTEK; NIESSEN, 2010). As junes aderentes tm como principais protenas as caderinas
(YAP; BRIEHER; GUMBINER, 1997).

13

Curso de vero 2015

Figura 4: Ilustrao dos mecanismos de adeso celular.

Copyright 2011 Division of Life Sciences,
Komaba Organization for Educational Excellence,
College of Arts and Sciences,
The University of Tokyo. All Rights Reserved.

2.4 Adeso celular e doena

As clulas dos seres pluricelulares precisam manter-se aderidas desde os seus
primeiros momentos de vida, como a fecundao e implantao, (SINGH; APLIN, 2009) at
a formao de um organismo. Desta forma, no de se admirar que a desregulao destas
molculas esteja envolvida em diversas doenas.
Segundo McMurray, 1996, a ativao leucocitria, circulao e localizao nos stios
inflamatrios so dependentes de molculas de adeso. Neste contexto, doenas autoimunes
como a artrite reumatoide, diabetes melittus, lpus sistmico eritematoso e esclerose mltipla j
foram associadas a estas molculas. Existem tambm, ainda dentro das doenas autoimunes,
os casos de clivagem de protenas adesivas, como no impetigo bolhoso, em que a toxina
esfoliativa cliva uma caderina desmossomal (PAYNE et al., 2004). As junes celulares so
importantes nos mais diversos tipos celulares, portanto, de se esperar que a desregulao
de protenas adesivas esteja envolvida com outras classes de doenas. Cardiomiopatias
(BROOKE; NITOIU; KELSELL, 2012; LI, 2014), sndromes metablicas (SAMUELOV et al.,
2014) e o cncer tambm j foram relacionadas a tal (BROOKE; NITOIU; KELSELL, 2012;
CHIDGEY; DAWSON, 2007).
2.5 Adeso celular e cncer
Dentro do contexto do cncer, os estudos sobre adeso tm sido feitos em vrias
frentes: promoo e progresso tumoral (HIROHASHI; KANAI, 2003; JOHNSON, 1999;
SHIMOYAMA et al., 1989); diagnstico e biomarcadores (LI; KING, 2012; SARDANA; DOWELL;
DIAMANDIS, 2008); metstase (BREMNES et al., 2002; TAKEICHI, 1993). Baseado em
evidncias de que alteraes em propriedades adesivas em clulas neoplsicas conferem14

Curso de vero 2015

na capacidade invasiva e migratria, a adeso vem sendo relacionada a todos os passos da

progresso tumoral, incluindo o desligamento de clulas malignas do stio primrio, entrada no
sistema circulatrio e formao de stios secundrios (MAKRILIA et al., 2009). Por conta deste
envolvimento, as molculas de adeso vm sendo estudadas em diversas frentes tentando
elucidar a significncia clnica: nos mecanismos de resistncia a drogas; no diagnstico do
cncer; no prognstico e no tratamento (MAKRILIA et al., 2009). Como um exemplo de estudo
de molcula de adeso, foi vista a expresso diminuda de duas caderinas desmossomais,
desmoglena 1 e desmocolina 1 em carcinoma anal, e este achado foi associado a um melhor
prognstico destes pacientes (MYKLEBUST et al., 2012).

15

Curso de vero 2015

METODOLOGIA DE VALIDAO DE BIOMARCADORES EM CNCER:

1. Validao do resultado do microarranjo de DNA por PCR em tempo real.
1.1 Sntese cDNA - Reao da Transcriptase Reversa.
O RNA total extrado dos tumores reversamente transcrito em cDNA para anlises de
PCR em tempo real utilizando a transcriptase reversa SuperScript II (Invitrogen), conforme
descrito abaixo:
- Em um microtubo sero adicionados:

- 250 ng de primer randmico (Promega)

- 500 ng de RNA alvo

- 1L do set de dNTPs a 10mM

- gua RNase FREE suficiente para completar o volume final de 12 L de reao,
- Aquecer por 5 minutos 65C.
- Adicionar 4 L do tampo da enzima transcriptase reversa (5X) fornecido pelo
fabricante (Invitrogen)

- Adicionar 2 L de DTT 0,1M
- Incubar por 2 min 25C.

- Adicionar 1 L de SuperScript II contendo 200 U
- Incubar as reaes em um termociclador, seguindo o protocolo abaixo:

- 10 min a 25C
- 50 min a 42C
- Inativar a enzima a 70C por 15 min.

Aps a sntese, o cDNA ser armazenado -20C

1.2 PCR em tempo real.
As reaes de PCR em tempo real (PCRq) sero realizadas na plataforma Rotor-gene
(Qiagen).
Em cada reao ser adicionado:

- 7,5 L de tampo SYBR green FAST 2x (Qiagen)

- 0,3 L de cada um dos oligonucleotdeos especficos da reao 10M

-1,0 L de cDNA diludos 1:20 e 5,5 L de gua deionizada autoclavada. As
reaes ocorreram com a seguinte ciclagem:

- 1 etapa: 1 X 95C por 5 min

- 2 etapa: 40X 95C por 5 seg
60C por 10 seg com posterior captura de
fluorescncia.

Para a quantificao dos resultados e determinao da eficincia dos oligonucleotdeos

iniciadores especficos para cada gene estabelecida uma curva padro de expresso
utilizando uma diluio seriada de cDNA de um controle positivo da reao.
16

Curso de vero 2015

Aps a amplificao dos produtos feita a anlise da curva de dissociao (curva de Melt).
Essa etapa importante para verificar se os produtos observados na PCRq so especficos
e para verificar se h formao de estruturas secundrias entre os oligonucleotdeos e
contaminao na reao
A quantificao relativa de cada gene contra o controle interno, GAPDH, possvel pelo
mtodo de Cq. Um grfico de amplificao, cujo eixo Y o sinal de fluorescncia e o
eixo X o nmero de ciclos, ser desenhado (exemplo na Figura 5). No primeiro ciclo da
reao de PCR h pouca mudana no sinal de fluorescncia. Isso define a linha de base
para o grfico de amplificao. Um nvel de fluorescncia acima da linha de base indica o
acmulo de produto de PCR. determinado, ento, um limiar de deteco de fluorescncia
fixo acima da linha de base durante a fase exponencial da PCR. O parmetro Cq (limiar)
definido como o nmero de ciclos, inteiro ou no, no qual a fluorescncia ultrapassa os
limiares previamente fixados. A diferena entre as mdias (de trs experimentos) do gene
de interesse e dos genes de referencia, GAPDH, calculada pelo programa Microsoft
Excel e o valor de quantificao relativa ser expresso como 2-Cq.( Livak e Schmittgen,
2001)

Figura 5: Grfico representativo da emisso de fluorescncia ao longo da sntese de produtos PCR,

durante a reao de PCR em tempo real.

2. Validao do resultado do microarranjo de DNA por imuno-histoqumica

A. Cortar os Blocos de tecido em parafina a 3 m.

- Lminas para marcao do anticorpo;

- Lminas de Controle Negativo de cada bloco;

- Lmina do Controle Positivo do Anticorpo.
B. Fixar o corte na estufa a 60C por no mnimo 2 horas. Ideal: incubao overnight.
C. Desparafinizao:

- Banhos de Xilol aquecido (dentro da estufa) por 5 minutos.

- 4 Banhos de Xilol a temperatura ambiente (dentro da Capela) 6 a 10 batidas
17

Curso de vero 2015

D. Desidratar:

- 6 Banhos de lcool Etlico 6 a 10 batidas
E. Hidratar:

- 1 Banho em gua corrente por no mnimo 1 min.
F. Recuperao Antignica:

Em Banho-Maria

- Preparar 200mL do tampo EDTA

- Colocar o pote com tampo no Banho Maria a 98C.

- Incubar as lminas por 45 min.:

- Retirar o pote do Banho Maria e deixar esfriar por 10 minutos a

temperatura ambiente.

- Deixar o pote com tampo em gua corrente at igualar com a

temperatura da torneira
G. Ciclagem:

- Passar as lminas para a bandeja, secando o excesso de gua e contornando o
tecido com a caneta hidrofbica.

- Pingar TBS 1X+Tween20 0,1% nas lminas 3X de 5 minutos

(NUNCA DEIXAR O CORTE SECAR!!!)
H. Bloqueio da Peroxidase Endgena:

- Escorrer e secar o que restou de TBS com papel higinico;

- Pingar a soluo de Perxido de Hidrognio 3% Incubar com dois banhos de 20
minutos a temperatura ambiente;

- Escorrer o excesso e lavar com gua Destilada

- Pingar TBS 1X+Tween20 0,1% nas lminas 3X de 5 minutos
I. Bloqueio de Ligaes Inespecficas:

- Escorrer e secar o que restou de TBS com papel higinico;

- Pingar protein block - Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente;

- Escorrer e secar o que restou de Bloqueio com papel higinico;
J. Anticorpo Primrio:

- Preparar a diluio do anticorpo, 1:300 (Diluir em Soluo Diluidora de Anticorpo);

- Pingar o anticorpo primrio na quantidade necessria de cada corte, sempre
priorizando economizar a soluo de anticorpo.

- Colocar gua destilada na parte inferior da bandeja;

- Incubar Overnight Refrigerao a 4C (Geladeira)
K. Soluo de Biotinylated Link Universal (kit) :

- Escorrer o excesso de anticorpo primrio e lavar com gua destilada;

- Pingar TBS 1X+Tween20 0,1% nas lminas 3X de 5 minutos
18

Curso de vero 2015

- Escorrer e secar o excesso de TBS com papel higinico;

- Pingar o Anticorpo Secundrio Biotinilado Incubar por 30 minutos.

L. Soluo de Strepdavidin-AP (kit):

- Escorrer o excesso de anticorpo secundrio e lavar com gua detilada;

- Pingar TBS 1X+Tween20 0,1% nas lminas 3X de 5 minutos

- Escorrer e secar o excesso de TBS com papel higinico;

- Pingar o Anticorpo Tercirio (Streptavidina) Incubar por 30 minutos;
M. Revelao por DAB:

- Escorrer o excesso de anticorpo tercirio e lavar com gua destilada;

- Pingar TBS 1X+Tween20 0,1% nas lminas 2X de 5 minutos

- Preparar Soluo de DAB Lquido (2mL de Tampo : 1 gota de cromgeno
DAB)

- Escorrer e secar o excesso de TBS com papel higinico;

- Pingar DAB dissolvido Incubar por 3 minutos;

- Paralisar a reao lavando com gua destilada;
N. Contra-Colorao:

- Transferir as lminas para cestas de plsticos;

- 1 Banho em gua corrente por 4 minutos;

- Contra-corar com hematoxilina Incubar por __ segundos;

- 1 Banho em gua corrente at a gua azulecer.
O. Montagem de Lminas:

- Desidratar: 4 banhos de lcool Etlico;

- Clarificar: 4 banhos de Xilol;

- Pingar 1 gota de meio de montagem na lmina e colocar a lamnula.

19

Curso de vero 2015

REFERNCIAS
BRANDNER, J. M.; HAFTEK, M.; NIESSEN, C. M. Adherens Junctions , Desmosomes and Tight
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BROOKE, M. A.; NITOIU, D.; KELSELL, D. P. Cell-cell connectivity: desmosomes and disease. The
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SARDANA, G.; DOWELL, B.; DIAMANDIS, E. P. Emerging biomarkers for the diagnosis and prognosis
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SHIMOYAMA, Y. et al. Cadherin cell-adhesion molecules in human epithelial tissues and carcinomas.
Cancer research, v. 49, n. 8, p. 212833, 15 abr. 1989.
SIEGEL R et al. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities
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SINGH, H.; APLIN, J. D. Adhesion molecules in endometrial epithelium: tissue integrity and embryo
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TAKEICHI, M. Cadherins in cancer: implications for invasion and metastasis. Current opinion in cell
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TSUKITA, S.; FURUSE, M. Occludin and claudins in tight-junction strands: leading or supporting
players? Trends in Cell Biology, v. 9, n. 7, p. 268273, jul. 1999.
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CADHERIN-BASED ADHERENS JUNCTIONS. Annual review of cell and developmental biology, v. 13,
p. 119146, 1997.

21

MINISTRIO DA SADE
INSTITUTO NACIONAL DE CNCER JOS ALENCAR GOMES DA SILVA (INCA)

VII CURSO DE VERO DE PESQUISA EM ONCOLOGIA

ESTUDO CITOGENTICO
CONVENCIONAL E MOLECULAR DAS
LEUCEMIAS AGUDAS DA INFNCIA

RIO DE JANEIRO, RJ
INCA
2015

2015 Instituto Nacional de Cncer Jos Alencar Gomes da Silva/ Ministrio da Sade.
Esta obra disponibilizada nos termos da Licena Creative Commons
Atribuio No Comercial Compartilha igual 4.0 Internacional.
permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a
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Esta obra pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade Preveno e Controle
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Curso V - ESTUDO CITOGENTICO CONVENCIONAL E MOLECULAR DAS LEUCEMIAS

AGUDAS DA INFNCIA
Pesquisador responsvel
Maria Luiza Macedo Silva - luizamacedo@inca.gov.br
Equipe
Amanda Faria de Figueiredo - amandaffbr@yahoo.com.br
Daniela Ribeiro Ney Garcia - danyneygarcia@yahoo.com.br
Mariana T. de Souza M. Bizarro - desouza_mt@yahoo.com.br
Roberto R. C. de Matos - capela_roberto@hotmail.com

SUMRIO
INTRODUO 5

1. Leucemias agudas 5

2. Importncia da caracterizao citogentica das leucemias agudas
6

3. Consideraes gerais acerca do estudo cromossmico 7

3.1 Caritipo e sua classificao 7

3.2 Histrico da anlise citogentica 8
JUSTIFICATIVA DO ESTUDO 10
REFERNCIAS 11
APNDICES 12

APNDICE I Cronograma do curso de vero 12

APNDICE II Protocolos 13

APNDICE III Nomenclatura citogentica 22

Curso de vero 2015

INTRODUO
1. Leucemias agudas

As leucemias compreendem um conjunto heterogneo de doenas hematolgicas
malignas que tem incio por um processo de perda do controle de proliferao, diferenciao
e/ou maturao das clulas das linhagens hematopoiticas. Estas doenas se apresentam
clinicamente diferentes com relao ao nvel de maturao das clulas e ao curso da doena
de forma crnica ou aguda.

As leucemias agudas possuem evoluo clnica rpida e se no tratadas adequadamente
podem levar ao bito em poucos meses ou at mesmo semanas. Estas hemopatias so divididas
em dois grandes grupos de acordo com o tipo de clula hematopoitica envolvida; so eles:
mieloide e linfoide. Estes dois grupos diferem entre si em aspectos clnicos e, principalmente,
na resposta terapia. Alm disso, essa diferenciao entre Leucemia Linfoblstica Aguda
(LLA) e Leucemia Mieloide Aguda (LMA) fundamental para as decises teraputicas.
Atualmente, uma srie de estudos biolgicos tm contribudo na elucidao biolgica
desta neoplasia. Dentre estes estudos, esto os estudos citogenticos e moleculares. Um
exemplo da importncia destes estudos foi a descoberta feita por Nowell Hungerford da
translocao t(9;22)(q34;q11), cromossomo Philadelfia (Ph), em 1960, que significou um
marco na etiologia citogentica das leucemias, quando, pela primeira vez, demonstrouse a associao efetiva entre uma aberrao cromossmica e uma neoplasia maligna, a
Leucemia Mieloide Crnica (LMC). A fuso gnica gerada por esta translocao resulta em
uma protena quimrica, que apresenta uma atividade tirosina quinase aumentada, levando a
uma proliferao celular anormal nesta neoplasia. Baseando-se na descoberta desta fuso, a
primeira terapia alvo molecular para as leucemias foi desenvolvida.

Com relao classificao, as leucemias agudas podem ser divididas de acordo
com a classificao do Grupo Franco-Americano-Britnico (FAB) ou a classificao da
Organizao Mundial da Sade (World Health Organization - WHO). A classificao FAB
leva em considerao aspectos morfolgicos e imunofenotpicos caractersticos do fentipo
leucmico das clulas tumorais. Sendo assim, as LLAs so divididas em trs subtipos,
enquanto as LMAs so divididas em 8 subtipos, de acordo com o grau de maturao da
clula envolvida no processo leucmico. J a classificao WHO, alm dos critrios adotados
pela classificao FAB, agrega aspectos citogenticos e moleculares para a definio do
diagnstico. Dentre estes fatores utilizados na estratificao das leucemias agudas, os estudos
citogenticos e moleculares so importantes para a definio dos grupos de risco, alm de
serem a ferramenta fundamental e a base gentica para a descrio de novos biomarcadores
envolvidos na gnese das leucemias.
A etiologia das leucemias vem sendo foco de vrios estudos epidemiolgicos, e
os resultados destes estudos tm mostrado que diversos fatores podem estar associados
ao seu desenvolvimento, dentre estes, esto os fatores extrnsecos, como a exposio
radiao ionizante, pesticidas, solventes e viroses, e os fatores intrnsecos, como desordens
congnitas e constitucionais associadas com a instabilidade cromossmica e do DNA. Ainda,
neste contexto, h uma interao entre fatores exgenos e endgenos com a susceptibilidade
gentica.

Curso de vero 2015

2. Importncia da caracterizao citogentica das leucemias agudas

As translocaes cromossmicas so elementos chave na etiologia tumoral, uma vez
que os cromossomos anormais, adquiridos nas clulas somticas, ativam oncogenes onde
os pontos de quebra destas anormalidades cromossmicas ocorrem. As fuses gnicas so
frequentemente originadas pelas translocaes cromossmicas, as quais usualmente envolvem
xons de pelo menos dois cromossomos envolvidos, levando a um produto transcricional, que
aps processamento, gera um RNAm hbrido, especfico do tumor, que posteriormente, se
tornar uma protena quimrica. Este tipo de evento comum em leucemias e sarcomas.
Estas translocaes gnicas podem ser divididas em tipos distintos, de acordo com o gene
envolvido, dentre os quais, nas leucemias agudas, destacam-se os genes reguladores de
transcrio, que tm um papel essencial na determinao do destino celular (Tabelas 1 e 2).

As anormalidades cromossmicas de clulas leucmicas so descritas em 80%
dos casos de LLA e LMA da infncia. Alm da resposta inicial terapia, o prognstico dos
pacientes com leucemias agudas determinado pela presena de alteraes genticas e
anormalidades cromossmicas.
Tabela 1: Anlise citogentica: cromossomos anormais na LMA

Anormalidades
t(8;21)(q22;q22)
inv(16)(p13q22)
t(15;17)(q22;q21)
t(9;11)(p22;q23)
t(3;21)(q26;q22)

Fuso dos
genes
AML1-ETO
CBF-MYH11
PML-RAR
MLL-AF9
AML1-EAP/
EVII

Subtipo
M2/M1
M4Eo
M3/M3v
M5

Frequncia (%)
Crianas
Adultos
10-15
8-12
6-12
8-12
8-15
8-10
8-10
1-2

<1

Prognstico
Bom
Bom
Bom
Ruim
Ruim

t(6;9)(p23;q34)

DEK-CAN

M1/M2

1-2

Rara

inv(3)(q21;q26)
t(1;22)(p13q13)
Trissomia do 8
Anormalidades
do 11
Complexo

EVII
OTT-MAL

M7
-

<1
2
1-4

1-2
<1
3-5

No
estabelecido
Ruim
Ruim
Bom/Ruim

M1/M2

<1

Ruim

10-20

Ruim

Fonte: Adaptado de Schoch & Haferlach, 2002.

Tabela 2: Anlise citogentica: Anormalidades cromossmicas estruturais na LLA

Anormalidades
t(9;22)(q34;q11)
t(4;11)(q21;q23)
t(1;19)(q23;p13)
Forma balanceada/
Forma no balanceada
t(12;21)(p12;q22)
t(8;14)(q24;q32)
t(10;14)(q24;q11)
del 9p(21-22)

Fuso dos genes

BCR-ABL
AF4-MLL

Subtipo
LLA pr-B
LLA pr-B

Prognstico
Ruim
Ruim

E2A/PBX1

LLA pr-B

Bom/ Intermedirio

TEL/AML1
MYC-IgH
TCRA/ TCRD-TLX1
P16INK4A/p15INK4B

LLA pr-B
LLA B
LLA T
LLA B ou T

Bom
Bom
No estabelecido
No estabelecido

Fonte: Adaptado de Mrzek et. al, 2009 e Miltelman et. al, 2009.

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3. Consideraes gerais acerca do estudo cromossmico

3.1 Caritipo e sua classificao

O estudo citogentico compreende o estudo microscpico dos cromossomos e suas
variaes. Cromossomo uma palavra derivada do grego, na qual chromos = cor e soma =
corpo. Os cromossomos so estruturas em forma de cordo localizadas no ncleo das clulas,
sendo formados basicamente de DNA e protenas histonas e no-histonas e se tornam visveis
quando as clulas se dividem. O complemento cromossmico humano consiste de 22 pares
de autossomos e 1 par de cromossomos sexuais, XX no sexo feminino e XY no masculino.
Os autossomos so numerados de acordo com os seus tamanhos relativos, com exceo dos
cromossomos 21 e 22. Assim, cada clula humana contm um total de 46 cromossomos.

Para estabilizar a funo de um cromossomo, so necessrios um centrmero localizado
ao longo do seu comprimento e um telmero em cada poro terminal. O centrmero
uma regio cromossmica especializada que define o lugar de ligao do cinetcoro (uma
estrutura complexa que regula a segregao dos cromossomos durante a diviso celular). As
regies centromricas contem grandes reas de sequncias de DNA repetitivo, algumas das
quais contribuem para a formao de segmentos de heterocromatina constitutiva encontrada
ao redor dos centrmeros de todos os cromossomos. O centrmero divide o cromossomo
em dois braos: o brao curto, designado por p (do frnces, petit) e o brao longo, em
analogia, por q. Nos telmeros, se encontra outro tipo de elemento de DNA repetitivo, essas
unidades repetidas in tandem (TTAGGG) mantm a integridade estrutural da poro terminal
do cromossomo e, garantem a replicao completa da maioria das sequncias terminais norepetitivas. Em humanos, essas sequncias so mantidas pela enzima telomerase. A reduo
no nvel da telomerase, associada ao decrscimo do nmero das repeties TTAGGG, um
importante evento na morte celular e no processo de envelhecimento celular.

O conhecimento da estrutura cromossmica foi possvel atravs do uso do microscpio
ptico e, por meio de tcnicas de colorao especial, que coram seletivamente o DNA, de
forma que cada cromossomo pode ser individualmente identificado. Os cromossomos podem
ser visualizadas de melhor forma durante a diviso celular na fase de metfase, que quando
se apresentam condensados ao mximo, devido ao maior empacotamento do DNA (Figura 1).
Nesse perodo, os genes so transcritos em nveis basais.

Figura 1: Esquema ilustrativo mostrando a condensao da molcula de DNA at o nvel cromossmico,

e a diviso do cromossomo pelo centrmero em brao curto (p) e longo (q).
7

Curso de vero 2015

Morfologicamente os cromossomos so classificados de acordo com a posio
do centrmero. Se este estiver localizado centralmente, o cromossomo denominado
metacntrico; se prximo extremidade acrocntrico; se o centrmero estiver em uma
posio intermediria, o cromossomo submetacntrico. H um quarto tipo, o cromossomo
telocntrico, cuja posio do centrmero terminal. Este tipo de cromossomo no encontrado
na espcie humana. Os cromossomos acrocntricos do conjunto cromossmico humano
apresentam, nas extremidades dos seus braos curtos, apndices de forma pedunculada,
denominados satlites, responsveis pela formao dos nuclossomos durante a interfase
celular, contendo mltiplas cpias repetidas dos genes para RNA ribossmico (Figura 2).

Os cromossomos individuais diferem no somente na posio dos centrmeros, mas
tambm, no seu comprimento total. Os cromossomos humanos so classificados com base
nos trs parmetros: comprimento ou tamanho do cromossomo, posio do centrmero e
presena ou ausncia de satlites. A apresentao dos 46 cromossomos mitticos chamada
de caritipo humano.

Figura 2: Esquema ilustrativo de um cromossomo mostrando o satlite do cromossomo (no detalhe

amarelo).

3.2 Histrico da anlise citogentica

A anlise citogentica das clulas malignas representou o incio de um dos maiores
avanos na compreenso da natureza biolgica das neoplasias, em especial no campo da
leucemognese, com implicaes prognsticas importantes.
Os melhoramentos das tcnicas para anlise cromossmica podem ser divididos em
3 fases. A primeira, que foi at o ano de 1969, caracterizada pela descoberta de mtodos para
obteno de clulas metafsicas em culturas in vitro e se estende at 1969. Nesta primeira fase
os cromossomos eram corados com corante Giemsa, mas sem nenhum tratamento prvio,
o que tornava a caracterizao dos cromossomos difcil. Entretanto, com esta metodologia,
8

Curso de vero 2015

em 1960, Nowell e Hungerford descobriram o cromossomo Philadelphia (Ph) na Leucemia

Mieloide Crnica (LMC), que se tornou um importante marcador cromossmico na leucemia
humana.
Na segunda fase, que correspondeu aos anos de 1969 at 1971, foi iniciado o
desenvolvimento da tcnica de marcao morfolgica caracterizada pela presena de
bandas claras e escuras, bandeamento, possibilitando a identificao precisa dos pares
cromossmicos, o que tornou possvel a identificao de aberraes cromossmicas. Nesse
momento, foi caracterizada a primeira translocao especfica no cncer humano: a t(8;21)
(q22;q22), em pacientes com LMA. Ainda, foi constatado que o cromossomo Ph se tratava de
uma translocao recproca entre os cromossomos 9 e 22, colocando abaixo a hiptese do
mesmo ser resultado de uma deleo.

Finalmente, na terceira fase, subsequente ltima citada e que compreende a
atualidade, d-se incio ao uso de sondas de DNA especficas para identificar genes ou regies
cromossmicas, o que deu origem ao desenvolvimento de tcnicas como a Hibridizao
Fluorescente in situ (FISH) e outras tcnicas novas como o Multiplex-FISH (M-FISH) e o
Multicolor Chromosome Banding (MCB).

Curso de vero 2015

JUSTIFICATIVA DO ESTUDO
A anlise citogentica no s fornece informaes importantes no diagnstico,
prognstico e acompanhamento dos pacientes, tambm uma ferramenta valiosa para pesquisa
nas leucemias agudas da infncia. A citogentica pode detectar rearranjos cromossmicos no
genoma inteiro, alm de servir como ponto de partida para outras investigaes. Os rearranjos
cromossmicos especficos tm sido reconhecidos como importantes eventos de incio da
leucemognese. Em muitos casos, estudos moleculares destas alteraes cromossmicas
estruturais permitiram a clonagem de genes localizados em pontos de quebra cromossmica
e tm ajudado a caracterizar as protenas envolvidas no processo leucmico.

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Curso de vero 2015

REFERNCIAS
1. Alberts, B.; Johson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. Biologia Molecular da Clula.
Porto Alegre: Artmed; 2004, p. 191-234.
2. Bennett, J.M.; Catovsky, D.; Daniel, M. T.; Flandrin, G.; Galton, D. A. G.; Gralnick, H. R.; Sultan,
C. Proposals for the classification of the acute leukaemias. British Journal of Hematology: 1976,
v. 33, p. 451-458.
3. Bennett, J. M.; Catovsky, D.; Daniel, M. T.; Flandrin, G.; Galton, D. A. G.; Gralnick, H. R.; Sultan, C.
Proposed revised criteria for the classification of acute myeloide leukemia. A report of the FrenchAmerican-British Cooperative Group. Annals of Internal Medicine:1985, v.103, p.620-625a.
4. Bergmann, J.H.; Martins, N. M.; Larionov, V.; Masumoto, H.; Earnshaw, W. C. HACking the
centromere chromatin code: insights from human artificial chromosomes. Chromosome Research:
2012, v.20(5), p. 505-519.
5. Borowitz, M. J. Acute lymphoblastic leukemia. IN: Knowles, D.M. Neoplastic hematopathology
1992, Williams & Williams Baltimore, Hong Kong, London, Munich, Philadelphia, Sydney, Tokyo.
6. Clark, S. S.; McLaughlin, J.; Crist, W. M.; Champlin, R.; Witte, O. N. Unique forms of the abl tyrosine
kinase distinguish Ph1-positive CML from Ph1-positive ALL. Science: 1987, v. 235, p. 85-88.
7. Conter, V.; Rizzari, C.; Sala, A.; Chiesa, R.; Citterio, M.; Biondi, A. Lymphoblastic Leukemia. Orfanet
Encycopledia: 2004; December
8. Daser, A.; Rabbitts, T. H. Extending the repertoire of the mixed-lineage leukemia gene MLL in
leukemogenesis. Genes & Development: 2004, v. 18, p. 965674.
9. Gisselsson, D. Cytogenetic Methods. In: Heim, S; Mitelman, F. Cancer Genetics. New Jersey: John
Wiley & Sons, Inc; 2009. p. 18.
10. Greaves, M. Science, medicine, and the future: Childhood leukemia. British Journal of Haematology:
2002, v. 324, p. 283-287.
11. Heim, S.; Mitelman, F. Cytogenetic Nomenclature. In: Heim, S; Mitelman, F. Cancer Genetics. New
Jersey: John Wiley & Sons, Inc; 2009. p. 18.
12. Heisterkamp, N.; Jenkins, R.; Thibodeau, S.; Testa, J. R.; Weinberg, W.; Groffen, J. The BCR gene
in Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia. Blood: 1989, v. 73, p. 13071311.
13. Silva, M.L.M. ; Land, M. . Anomalias Citogenticas e Moleculares nas Leucemias da Infncia. In:
Gerson Carakushansky. (Org.). Doenas genticas em pediatria. Doenas genticas em pediatria.
1ed.Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S.A., 2001, v. 36, p. 350-362.
14. Manola, K. N. Cytogenetics of pediatric acute myeloid leukemia. European Journal of Haematology:
2009, v. 83(5), p. 391-405.
15. McKenney, A.; Arber, D. A. Acute myeloid leukemia. Hematology/Oncology Clinics of North America:
2009, v. 23(4), p. 633-654.
16. Mrzek, K.; Heerema, N. A.; Bloomfield , C. D. Cytogenetics in acute leukemia. Blood Reviews:
2004; v. 18, p. 115-134.
17. Pui, C. H.; Relling, M. V.; Campana, D.; Evans, W. E. Childhood acute lymphoblastic leukemia.
Reviews in Clinical and Experimental Hematology: 2002, v. 6(2), p. 161-180.
18. Pui, C. H.; Relling, M. V.; Downing, J.R. Mechanisms of Desease: Acute Lynfoblastic Leukemia.
New England Journal of Medicine: 2004; v. 350(15), p. 1535-1548.
19. Pui, C. H.; Robinson, L. L.; Look, A. T. Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet: 2008, v. 321, p.
1030-1042.
20. Ribeiro, R. C.; Oliveira, M. S.; Fairclough, D.; Hurwitz, C.; Mirro, J.; Behm, F. G.; Head, D.; Silva,
M. L. M.; Raimondi, S. C.; Crist, W. M.; Krance, R. Acute megakaryoblastic leukemia in children
and adolescents: a retrospective analysis of 24 cases. Leukemia & Lymphoma: 1993, v. 10(4-5), p.
299-306.

11

Curso de vero 2015

APNDICES
APNDICE I CRONOGRAMA DO CURSO DE VERO
Primeira Semana
Data

Programao

02/02/2015

Aula Prtica: Cultivo Celular

03/02/2015

Aula Prtica: Retirada de Cultura;

Preparao Cromossmica

04/02/2015

Aula Prtica: Tcnica de Bandeamento G;

Anlise do Bandeamento G

05/02/2015

Aula Prtica: Pr Tratamento das lminas para FISH;

Hibridizao da sonda

06/02/2015

Aula Prtica: Lavagem das lminas de FISH;

Anlise do FISH
Segunda Semana

Data

12

Programao

09/02/2015

Discusso de Artigos

10/02/2015

Discusso de Artigos

11/02/2015

Preparao da Apresentao

12/02/2015

Apresentao dos Projetos

13/02/2015

Livre

Curso de vero 2015

APNDICE II PROTOCOLOS
PROTOCOLO DE CULTIVO CELULAR
Reagentes:
Meio de cultura RPMI 1640 aquecido a 37C
Soro Bovino Fetal (SBF) inativado previamente em banho-maria a 56C durante 40
minutos
Glutamina (adicionar no meio RPMI na proporo 1:100)
Lquido de Thomas
Equipamentos / Materiais:
Tubos falcon
Pipetas Pasteur descartveis
Micropipeta de 50 (p20-200-1000) uL
Ponteira de 50 (p20-200-1000) uL
Tubo de ensaio
Cmara de Newbauer
Lamnula de vidro
Microscpio ptico
Garrafas para cultura
Estufa CO2
Procedimentos:
1. No fluxo laminar, transferir o material (medula ssea e/ou sangue perifrico), enviado ao
laboratrio, para um tubo falcon de 15 mL;
2. Em um tubo de ensaio com 1 mL de liquido de Thomas, diluir 50 uL do material com auxilio
de uma micropipeta;
3. Colocar essa soluo na cmera de Newbauer (Figura 1) coberta com uma lamnula de
vidro, entre a superfcie da cmara e a lamnula;

Figura 1: Cmara de Newbauer

4. Levar a cmara de Newbauer ao microscpio ptico (aumento de 20x) e contar as clulas

presentes nos 4 quadrantes da cmara (Figura 2);
5. O nmero de clulas ser obtido, somando-se o numero de clulas encontrado,
multiplicando o somatrio por 21 e depois por 2500;
6. Colocar 4 mL de meio de cultura RPMI, 1 mL de SBF e 0,5 mL de material em cada garrafa
de cultura;
7. Colocar os tubos em estufa de CO2 a 37C por 24 horas.

REFERNCIAS
1. Testa, J.R.; Misawa, S.; Ogrema, N.; van Slaten, K.; Wiernik, P.H. Chromosomal alterations in acute
leukemia patients. Studies with improved culture methods. Cancer Res: 1985, v. 45, p. 430-434.
13

Curso de vero 2015

PROTOCOLO DE RETIRADA DE CULTURA

Reagentes:
Colchicina
KCL (cloreto de potssio)
Soluo de Carnoy/Fixador (Soluo de cido Actico e Metanol, na proporo 1:3)
Equipamentos / Materiais:
Seringa e agulha
Pipetas Pasteur descartveis
Centrfuga de bancada
Banho-maria a 37 C
Procedimentos:
1. Duas horas antes de completar 24 horas de cultura, levar ao fluxo laminar as garrafas onde
as clulas foram cultivadas e aplicar, com uma agulha, 6 gotas de soluo colchicinha 10; 50 uL
2. Recolocar as garrafas na estufa, onde devem permanecer por mais 1 hora;
3. Retirar as garrafas da estufa e transferir o material contido em cada uma para um tubo
falcon de 15 mL;
4. Centrifugar por 6 minutos a 1.500 rpm;
5. Retirar o sobrenadante dos tubos, homogeneizar o pellet e acrescentar (em jatos), com
o auxlio de uma pipeta pasteur descartvel, soluo de KCL at completar 8 mL, para
efetuar o choque hipotnico;
6. Colocar os tubos em banho-maria a 37 C por 20 minutos;
7. Aps sair do banho-maria, centrifugar os tubos novamente por 6 minutos a 1.500 rpm;
8. Retirar o sobrenadante dos tubos, homogeneizar o pellet e gotejar, aos poucos, a soluo
de Carnoy at completar 8 mL;
9. Deixar os tubos por 20 minutos a temperatura ambiente;
10. Aps este tempo, centrifugar mais uma vez o material;
11. Retirar o sobrenadante, homogeneizar o pellet, unir o contedo de todos os tubos em um
nico e acrescentar soluo de Carnoy at completar 8 mL;
12. Repetir passos 7 e 8 at o material ficar lmpido;
13. Armazenar o tubo na cmara fria (4 C).
3

REFERNCIAS
1. Hungerford, D.A. Leukocytes cultures from small inocula of whole blood and the preparation of
metaphase chromosomes by treatament with hypotonic (KCL). Stain Technol., 1965, v. 40, p. 333338.

14

Curso de vero 2015

PROTOCOLO DE PREPARAO DAS LMINAS

Reagentes:
Corante Giemsa (Merck)
Tampo fosfato
Equipamentos / Materiais:
Lminas de microscopia
Pipetas Pasteur descartveis
Cubas de vidro
Bico de Bunsen
Procedimentos:
1. Retirar o sobrenadante at ficar mais ou menos o dobro do pellet;
2. Limpar as lminas;
3. Baforar as lminas;
4. Gotejar uma ou duas gotas de material nas lminas, com a pipeta um pouco distante da
lmina;
5. Flambar em fogo mdio no bico de Bunsen;
6. Corar em soluo de Giemsa (aproximadamente 2,5 mL de Corante Giemsa e 40 mL de
Tampo fosfato) por aproximadamente 12 minutos;
7. Observar ao microscpio ptico (em contraste de fases) se h presena de metfases na
lmina;
8. Se houver metfases, seguir novamente os passos 1-4 e guardar as lminas preparadas
em local coberto por um ou dois dias para o envelhecimento das mesmas.

15

Curso de vero 2015

bandeamento g
nas clulas somticas, os cromossomos so tipicamente estudados durante a metfase
do ciclo celular, momento no qual a cromatina est altamente condensada e a morfologia
cromossmica bem definida. Na maioria dos mtodos de bandeamento, os cromossomos
individuais so identificados por seu tamanho relativo, pela posio dos centrmeros e pelo
padro de bandas. O nmero de bandas pode variar de acordo com a resoluo da tcnica
de bandeamento utilizada. No bandeamento G, os cromossomos so desproteinizados por
ao da tripsina e, posteriormente so corados com Giemsa (de onde deriva o nome bandas
G). Os cromossomos mostram um padro de bandas claras e escuras, no qual as faixas
escuras correspondem ao DNA rico em bases AT e poucos genes ativos; as bandas G claras
tm DNA rico em bases GC e apresentam muitos genes ativos. Baseando-se nisso, os braos
cromossmicos curto (p) e longo (q) so divididos em regies morfolgicas distintas, que em
contrapartida podem se subdividir em bandas e sub-bandas (Figura 1).

Figura 1: Padro de bandas obtidas atravs da tcnica de Bandeamento G

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Curso de vero 2015

PROTOCOLO PARA OBTENO DE BANDAS G

Reagentes:
Soluo Dulbeco
Tripsina
Soro fisiolgico
Tampo-fosfato
Corante Giemsa
Equipamentos / Materiais:
Esptula
Balana de preciso
Bquer de 100 mL
Banho-maria
Pipetas Pasteur descartveis
Cubas de vidro
Procedimentos:
1. Mergulhar a lmina na soluo de tripsina (0,1 g de tripsina e 100 mL de Soluo Dulbeco)
aquecida a 37 C no banho maria por 30 minutos, por alguns segundos;
2. Lavar as lminas em soro fisiolgico;
3. Corar em soluo de Giemsa por mais ou menos 15 minutos;
4. Lavar em soro fisiolgico e esperar secar;
5. Ao microscpio, observar se o tempo de exposio tripsina foi suficiente para gerar
o padro de banda. Se os cromossomos estiverem digeridos demais, diminuir o tempo
de exposio. Se o tempo no for suficiente para os cromossomos estarem bandeados,
aumentar o tempo, at garantir o resultado desejado;
6. Analisar no mnimo 20 metfases para liberao do laudo.

REFERNCIAS
1. Gisselsson, D. Cytogenetic Methods. In: Heim, S; Mitelman, F. Cancer Genetics. New Jersey: John
Wiley & Sons, Inc; 2009. p. 18.
2. Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet: 1971 v. 2, p. 971-972.

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Curso de vero 2015

PROTOCOLO DE HIBRIDIZAO IN SITU POR FLUORESNCNCIA (FISH)

As tcnicas de hibridizao in situ so baseadas na organizao inerente do DNA nas
duas fitas complementares antiparalelas. Aps a desnaturao do DNA alvo, em metfases ou
ncleos interfsicos, sondas de DNA de fita nica podem formar complexos hbridos de duplafita com sequncias genmicas complementares. Aps a hibridizao, as sondas podem ser
marcadas com fluorforos, permitindo a deteco direta da sequncia alvo por microscopia
de fluorescncia. Essa estratgia de hibridizao in situ por fluorescncia permite a deteco
simultnea de vrias sequncias genmicas alvo atravs de fluorforos de diferentes
comprimentos de onda em um mesmo experimento (Figura 1).

Figura 1: Esquema resumido dos processos feitos durante a tcnica d FISH

Uma grande vantagem da FISH sua versatilidade com respeito as sequncias alvo,
na qual cromossomos inteiros ou partes grandes dos mesmos, podem ser alvo de pinturas
cromossmicas (painting probes), enquanto centrmeros, telmeros, regies NOR e regies
satlite podem ser detectados por sondas especficas de sequncias repetitivas. Alm disso,
sondas de cpia nica podem ser produzidas atravs da amplificao de DNA genmico de
bibliotecas de DNA de vrios vetores, como cosmdeos, fosmdeos, cromossomos artificiais
bacterianos (BACs) e cromossomos artificiais de leveduras (YACs). Essas sondas podem
detectar sequncias nicas at o nvel gnico. As sondas de cpia nica so muito teis na
deteco de pontos de quebra em metfases, ou para pesquisar mudanas de nmero de
cpias em metfases ou ncleos interfsicos. Todas estas aplicaes da tcnica de FISH
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Curso de vero 2015

necessitam de uma pr-seleo experimental das sequencias a serem estudadas, uma vez
que s ser possvel obter informaes daquelas sequncias para o qual a sonda especfica.
PR-TRATAMENTO DAS LMINAS DE FISH
Reagentes:
lcool 70%, 85% e 100%
2xSSC (Ph 7,0)
Pepsina 0,005% HCl 0,001M
PBS 1X
Formaldedo 1%/PBS 1X

Equipamentos / Materiais:
Cubas de vidro
Cubas de plstico
Lminas de vidro
Pipetas Pasteur estreis
Banho-maria
Termmetro
Procedimentos:
1. Pingar o material em lminas limpas e lavadas em lcool 70% e deixar secar em placa
mida por alguns minutos;
2. Observar ao microscpio ptico e selecionar a rea onde a sonda dever ser aplicada;
3. Incubar as lminas em uma soluo de 2xSSC (pH 7,0) a 37C durante 20 minutos;
4. Incubar as lminas em soluo de pepsina 0,005%Cl 0,0001M a 37C por 10 minutos;
5. Lavar as lminas por 3 minutos em PBS1X a temperatura ambiente;
6. Incubar as lminas em uma soluo de formaldedo 1% PBS1X por 10 minutos em
temperatura ambiente;
7. Lavar as lminas em PBS1X temperatura ambiente por 3 minutos;
8. Desidratar as lminas em uma srie de etanol 70%, 85% e 100% por 2 minutos em cada
lcool;
9. Deixar as lminas secarem naturalmente.
CO-DESNATURAO DAS LMINAS DE FISH
Reagentes:
Sonda locus especfica
Tampo de hibridizao
gua MiliQ
Equipamentos / Materiais:
Micropipeta de 10 uL
Ponteira
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Curso de vero 2015

Tubo eppendorf
Lamnula de 20x20 mm
Cola especial (rubber cement)
Banho seco
Termmetro
Cmara escura
Estufa de CO2
Procedimentos:
1. Deixar a sonda em temperatura ambiente por alguns minutos;
2. Para preparar um volume final de 8l da sonda para aplicao, dilu-la em tampo fosfato,
na proporo: 5,6 l de tampo de hidratao, 1,9 l de gua, 0,5 l da sonda concentrada.
3. Aplicar 8l da sonda (pronta) sobre a rea previamente selecionada e cobrir com uma
lamnula de 20x20mm;
4. Selar a lamnula cola especial (rubber cement);
5. Colocar as lminas em uma placa aquecida a 75 C e deixar durante 7 minutos.
HIBRIDIZAO
1. Colocar as lminas em uma caixa mida e escura;
2. Colocar em estufa a 37 C por uma noite (de 12 a 16 horas).

REFERNCIAS
1. Gisselsson, D. Cytogenetic Methods. In: Heim, S; Mitelman, F. Cancer Genetics. New Jersey: John
Wiley & Sons, Inc; 2009. p. 18.
2. Guerra, M.; FISH Conceito e aplicaes na citogentica: Sociedade brasileira de citogentica, 2004.

20

Curso de vero 2015

PS-HIBRIDIZAO DAS LMINAS DE FISH

Reagentes:
0,4XSSC,3%/Tween20 (pH=7,0)
2XSSC 0,1%/Tween20 (pH=7,0)
DAPI counter strain
Equipamentos / Materiais:
Pina
Micropipeta de 20 uL
Ponteiras
Cubas de plstico
Banho-maria
Termmetro
Lamnula de 24x32 mm
Cmara escura
Procedimentos:
1. Aps o perodo de incubao, remover com cuidado a cola e a lamnula;
2. Colocar as lminas em uma soluo de 0,4XSSC,3% Tween20 a 72C (pH=7,0) por 2
minutos
3. Colocar as lminas em uma soluo de 2XSSC 0,1% Tween20 (pH=7,0) por 1 minuto
temperatura ambiente;
4. Deixar as lminas secar em temperatura ambiente;
5. Aplicar 15uL da contra colorao DAPI (Vysis) sobre a rea de hibridizao e cobrir com
uma lamnula 24x32 mm;
6. Guardar a lmina em uma caixa escura, por no mnimo 10 minutos antes de observar em
microscpio de fluorescncia.
REFERNCIAS
1. Guerra, M.; FISH Conceito e aplicaes na citogentica: Sociedade brasileira de citogentica, 2004.

21

Curso de vero 2015

APNDICE III NOMENCLATURA CITOGENTICA

A nomenclatura dos cromossomos humanos baseada em um consenso alcanado
atravs de vrias conferncias internacionais, que publicaram aps cada encontro um sistema
uniforme com as recomendaes para descrio cariotpica. A mais recente destas descries
o Sistema Internacional de Nomenclatura Citogentica (2009), ISCN (2009).

Os cromossomos so classificados de acordo com o seu tamanho, a localizao do
centrmero centrmero e o padro de bandas ao longo de cada brao cromossmico. Os
autossomos so numerados de 1 a 22 em ordem decrescente de tamanho, os cromossomos
sexuais so identificados como X e Y.
Designao das regies e bandas

Cada brao cromossmico, brao curto p e brao longo q, pode consistir de uma ou
mais regies. Cada regio delimitada por landmarks especficas, ou seja, fatores morfolgicos
consistentes e distintos de importncia para a identificao cromossmica. As landmarks
incluem a extremidade dos braos cromossmicos (os telmeros), o centrmero, e tambm
certas bandas caractersticas. Uma regio consiste de uma ou mais bandas e, definida
como uma rea que encontra entre duas landmarks adjacentes. Uma banda definida como
uma rea cromossmica que distinguvel de outros segmentos adjacentes pela aparncia
de claro e escuro que elas podem assumir de acordo com as tcnicas aplicadas.

As regies e bandas so numeradas consecutivamente do centrmero em direo a
cada brao do cromossomo. Ento, duas regies adjacentes ao centrmero so identificadas
com o nmero 1 cada uma. E a regio seguinte mais distal identificada pelo nmero 2 e,
assim consecutivamente.

Para designar uma banda, 4 itens so necessrios: o nmero do cromossomo, o brao
cromossmico (p ou q), o numero da regio e, o numero da banda dentro dessa regio. Estes
itens so colocados em ordem consecutiva sem espao ou pontuao. Por exemplo, 9q34
significa cromossomo 9,brao longo, regio 3, banda 4.

De acordo com a resoluo cromossmica, as bandas cromossmicas podem
ser subdivididas em sub-bandas. Assim como as bandas, sub-bandas so numeradas
consecutivamente, a partir do centrmero. Por exemplo, a banda original 1q42 pode ser
subdividida em 3 sub-bandas definidas como 1q42.1, 1q42.2 e 1q42.3. Se as sub-bandas
so subdivididas, por sua vez, dgitos adicionais so utilizados, no entanto, sem pontuao.
Por exemplo, a sub-banda 1q42.1 pode ser subdividida em 1q42.1, 1q42.12 e , assim
sucessivamente.
Nomenclatura cariotpica

Na descrio do caritipo, o primeiro que deve ser especificado o nmero de
cromossomos, seguido por virgula (,). Logo aps so especificados os cromossomos sexuais.
Sendo assim, o caritipo feminino normal 46, XX e o masculino normal 46, XY. Para
especificar cromossomos alterados estruturalmente, abreviaes com letras nicas ou
em trio so utilizadas. O nmero do(s) cromossomo(s) envolvido(s) no rearranjo (so)
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Curso de vero 2015

especificado(s) entre parnteses imediatamente aps o smbolo que indica o tipo de rearranjo.
Se dois ou mais cromossomos esto envolvidos na alterao um ponto e vrgula (;) utilizado
para separa as suas designaes. Se um dos cromossomos alterados um cromossomo
sexual, este listado primeiro; por outro lado, a regra que cromossomos de nmero
menor so mencionados primeiramente. Os pontos-de-quebra, dados entre parnteses, so
especificados na mesma ordem assim como, os cromossomos envolvidos, e, um ponto e
virgula (;) novamente utilizado para separar os pontos-de-quebra. importante ressaltar
que nunca utilizada pontuao quando se trata de rearranjos intracromossomais, ou seja,
para separar os pontos-de-quebra de um mesmo cromossomo.

Os termos utilizados para utilizar descrever caritipos anormais so definidos pelo
ISCN 2009. Observe abaixo alguns das abreviaes mais comuns e exemplo de como elas
podem ser utilizadas:
Translocao, abreviada como t:

Significa que um segmento cromossmico se moveu de um cromossomo para outro.
A translocao pode ou no ser recproca. 46, XX, t(9;22)(q34;q11) a representao de um
caritipo feminino contendo uma translocao entre os cromossomos 9 e 22 com o ponto de
quebra do cromossomos 9 na banda q34 do cromossomos 22 na banda q11.
Insero, abreviada como ins:

Significa que um segmento cromossmico se move para uma nova posio intersticial
no mesmo cromossomo ou em outro. O cromossomo no qual segmento inserido sempre
especificado primeiramente. Por exemplo, ins(5;2)(p14;q22q32) significa que a quebra e a
unio ocorreram na banda 5p14 no brao curto do cromossomo 5 e as bandas 2q22 e 2q32
do brao longo do cromossomo 2. O segmento entre 2q22- 2q32 foi inserido no cromossomo
5p na banda 5p14.
Inverso, abreviada como inv:

Designa a rotao de 180 de um segmento cromossmico. No caritipo 46, XY, inv(16)
(p13q22), a quebra e a unio ocorreram nas bandas 16p13 e 16p22.O segmento entre essas
bandas ai est presente, mas de cabea para baixo.
Deleo, abreviada como del:

Significa a perda de um segmento cromossmico. A deleo interpretada como
terminal ou intersticial baseando-se na designao do ponto-de-quebra. Sendo assim, del(1)
(q23) indica uma deleo terminal com a quebra na banda 1q23 e perda do segmento distal
do brao longo. O cromossomo restante consiste do brao curto do cromossomo 1 e parte
do seu brao longo que est entre o centrmero e banda 1q23. Em contrate, del(1)(1q21q31)
indica uma deleo intersticial com quebra e unio nas bandas 1q21 e 1q31.
Duplicao, abreviada como dup:

Indica a presena de uma cpia extra de uma parte de um cromossomo. Os pontosde-quebra especificam o segmento duplicado, por exemplo, dup(1)(q21q31).

23

Curso de vero 2015

Cromossomo marcador, abreviado como mar:

Significa a presena de um cromossomo estruturalmente alterado. Quando o padro
de banda reconhecido, o marcador pode ser adequadamente descrito pela nomenclatura
padro. A definio precisa para um mar um cromossomo estruturalmente anormal, no
qual nenhuma parte pode ser identificada. Quando um material de origem desconhecida
adicionado a uma regio ou banda cromossmica, ele pode ser descrito com o termo add
(adio) antes da especificao do ponto de quebra. Por exemplo, add(19)(p13) indica que um
material extra foi adicionado banda 19p13, mas nem a origem do segmento adicionado ou
o tipo de rearranjo conhecido. Estas anormalidades frequentemente so descritas usando
os seguintes smbolos t e ?, por exemplo t(19?)(p13?), no entanto, uma vez que raramente se
sabe que o cromossomo alterado resultado de uma translocao, o smbolo add o mais
recomendado.
Cromossomo derivativo, abreviado como der:

Significa no somente qualquer cromossomo alterado estruturalmente resultante de
uma anormalidade envolvendo dois ou mais cromossomos, mas tambm rearranjos estruturais
gerados por mais de uma aberrao em um nico cromossomo. O termo der sempre se
refere ao(s) cromossomo(s) que tm seu centrmero intacto. O cromossomo derivativo
especificado entre parnteses, seguido por todas as aberraes envolvidas na gerao deste
cromossomo derivativo. Por exemplo, der(1)t(1;3)(p32;q21)t(1;11)(q25;q13) especifica um
derivativo do cromossomo 1 gerado por duas translocaes, uma envolvendo o brao curto
com um ponto de quebra em 1p32 e o outro envolvendo o brao longo com um ponto de
quebra em 1q25.
Mais (+) e Menos (-):

Sinais de mais e menos so colocados antes do nmero de um cromossomo para
indicar adio ou perda de qualquer cromossomo interiro. Eles so colocados aps um
smbolo para indicar um aumento ou diminuio no comprimento de um brao cromossmico,
Assim, 47,XY,+21 representa um caritipo masculino com 47 cromossomos, incluindo um
cromossomo 21 adicional, enquanto que 21q+ indica um aumento no cumprimento do brao
longo do cromossomo 21. Esta ltima terminologia deve ser llimitada ao texto escrito: em
descries formais de caritipos, 21q. deve ser descrito utilizando a abreviatura add, add(21)
(q?).
Nomenclatura de populaes celulares de tumor

Um clone definido como uma populao de clulas derivada de um progenitor nico.
de prtica comum inferir uma origem clonal quando um nmero de clulas tem um mesmo
nmero ou um nmero aproximado de complementos cromossmicos anormais relacionados.
Um clone, portanto, no necessariamente completamente homogneo, nem cariotipicamente,
nem fenotipicamente, desde que subclones tenham evoludo durante o desenvolvimento do
tumor.

Como afirma o ISCN (2009), um clone existe se duas ou mais clulas so encontradas
com a mesma aberrao estrutural. Se a anormalidade compreende uma anormalidade
24

Curso de vero 2015

numrica, ela deve estar presente em pelo menos 3 clulas. A regra geral da citogentica
tumoral que somente anormalidades cromossmicas clonais devem ser relatadas no
caritipo tumoral. Quando mais de um clon est presente, a designao do caritipo de cada
clone deve ser separada por uma barra (/).

O nmero cromossmico modal o nmero cromossmico mais comum em uma
populao de clulas tumorais. O nmero modal pode ser descrito como near-diploide quando
este aproximadamente diploide, mas sem preciso, hipodiploide quando o complemento tem
menos do que 46 cromossomos e hiperdiploide quando o nmero cromossmico maior do
que 46. Nmeros modais em populaes de clulas tumorais pode tambm ser descrito como
haploide, triploide, tetraploide, hipotriploide, near-triploide, hipertriploide, hipotetraploide,
near-tetraploide, hipertetraploide, e assim por diante, dependendo do nmero cromossmico
predominante. Caritipos com um nmero cromossmico normal, mas que mesmo assim
contm alteraes estruturais e/ou numricas, podem ser descritos como pseudodiploides.

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MINISTRIO DA SADE
INSTITUTO NACIONAL DE CNCER JOS ALENCAR GOMES DA SILVA (INCA)

VII CURSO DE VERO DE PESQUISA EM ONCOLOGIA

RASTREAMENTO MUTACIONAL
POR SEQUENCIAMENTO DE NOVA
GERAO

RIO DE JANEIRO, RJ
INCA
2015

2015 Instituto Nacional de Cncer Jos Alencar Gomes da Silva/ Ministrio da Sade.
Esta obra disponibilizada nos termos da Licena Creative Commons
Atribuio No Comercial Compartilha igual 4.0 Internacional.
permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a
fonte.
Esta obra pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade Preveno e Controle
de Cncer (http://controlecancer.bvs.br/) e no Portal do INCA (http://www.inca.gov.br).
Tiragem: XXXX exemplares
Elaborao, distribuio e informaes
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Instituto Nacional de Cncer JOS ALENCAR
GOMES DA SILVA (INCA)
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Curso VI - RASTREAMENTO MUTACIONAL POR SEQUENCIAMENTO DE NOVA

GERAO
Pesquisador responsvel
Hector Nicolas Seuanez Abreu
Equipe
Albert Rahul Eugene Anto Nobre de Menezes - albertmenezes@gmail.com
Hanna Soares Pereira - hannasoaresbiomed@gmail.com
Leila Cabral de Almeida Cardoso - leilacac@gmail.com
Rgis Afonso Costa - regis_afonso@yahoo.com.br
Colaborao
Carolina Furtado - cfurtado@inca.gov.br
Maria Carolina Viana Alves - mcarolviana@gmail.com

SUMRIO
Apresentao 5
1. Introduo ao retinoblastoma 6
2. Metodologias de laboratrio 9
2.1 Extrao de DNA 9
2.2 Protocolo: Isolamento de DNA a partir de sangue perifrico (Adaptado de

Miller e cols., 1988) 10
2.3 Quantificao de DNA 12
2.4 Protocolo: Eletroforese em gel de agarose 14
2.5 Espectrofotometria 15
2.6 Protocolo: Espectrofotometria - nanodrop ND-1000 17
2.7 Sequenciamento de DNA 18
2.8 Conhecendo a plataforma de sequenciamento de nova gerao hiseq

2500 (Illumina) 20
2.9 Preparo de bibliotecas para a plataforma hiseq 2500 (Illumina) 21

3. Anlises computacionais 23
Referncias 25

Curso de vero 2015

Apresentao
Este material foi preparado com o objetivo de esclarecer as etapas envolvidas nos
estudos de mutaes por sequenciamento de nova gerao, alm de abranger a teoria
do rastreio mutacional por sequenciamento de capilar (conhecido como sequenciamento
Sanger). Para isso, um tumor maligno das clulas embrionrias da retina, o retinobalstoma,
foi escolhido como alvo de nosso curso por ser considerado modelo no estudo do cncer.
Dessa forma as prticas foram divididas em trs sees:
I) Introduo ao Retinoblastoma; II) Metodologias em laboratrio; III) Anlises computacionais.
Dia 1 Segunda 02/fev
Apresentao do laboratrio, introduo s tcnicas e equipamentos que sero abordados
durante o curso.
Dia 2 Tera 03/fev
Introduo ao retinoblastoma;
Extrao de DNA, quantificao e verificao da integridade.
Dia 3 Quarta 04/fev
Sequenciamento por capilar do gene RB1;
Rastreio mutacional no gene RB1 por anlise de eletroferogramas.
Dia 3 Quinta 05/fev
Conhecendo a plataforma de sequenciamento de nova gerao HiSeq 2500 (Illumina);
Preparo de bibliotecas para a plataforma Illumina.
Dia 4 Sexta 06/fev
Quantificao das bibliotecas;
Converso dos dados do sequenciador HiSeq 2500 (Illumina).

Dia 5 Segunda 09/fev
Checar e filtrar qualidade das leituras de sequncias de DNA;
Alinhamento de leituras de DNA uma referncia genmica humana;
Localizao visual de mutaes, navegando em um mapa de leituras.
Dia 6 Tera 10/fev
Anlise pelo portal Sabiosciences (Qiagen);
Discusso dos resultados e as consequncias moleculares das possveis mutaes
encontradas.
Dia 7 Quarta 11/fev
Discusses gerais;
Preparo da apresentao.

Curso de vero 2015

1. Introduo ao retinoblastoma

O retinoblastoma (RB) um tumor maligno das clulas embrionrias da retina. Ocorre,
em geral, em crianas antes dos cinco anos de idade e sua incidncia de um a cada 15 mil a
20 mil nascimentos. O RB pode ser unifocal (nico foco tumoral) ou multifocal (mltiplos focos
tumorais). Aproximadamente 60% dos indivduos afetados tm a forma unilateral, com mdia
de idade ao diagnstico de 24 meses, e 40% tm bilateral, com mdia de idade ao diagnstico
de 15 meses.

Os heterozigotos para uma mutao predisponente ao tumor em um alelo do gene
retinoblastoma 1 (RB1) so designados como portadores de mutaes germinativas. O tumor
inicia-se com a inativao biallica do gene RB1 (Lohmann, 1999). Esses pacientes tambm
possuem risco aumentado de desenvolver outros tumores, no oculares, relacionados ao RB
(Lohmann & Gallie, 2013). O diagnstico de retinoblastoma comumente clnico, sendo a sua
principal manifestao a leucocoria (Figura 1), reflexo branco na retina, presente em 60% dos
casos, e definido pelo exame de fundo de olho usando a oftalmoscopia indireta. O estrabismo,
presente em 20% dos pacientes, o segundo sintoma mais frequente e, em geral, acompanha
a leucocoria. A confirmao diagnstica feita pelo exame histopatolgico do tumor. Estudos
de imagem como ultrassonografia, tomografia e ressonncia magntica tambm so utilizados
para dar suporte ao diagnstico e estadiamento tumoral (Lohmann & Gallie, 2013).

Figura 1: Leucocoria, reflexo pupilar branco em criana com RB.

A inativao do gene RB1 responsvel pelo desenvolvimento do RB, este tambm

o nico gene onde mutaes foram caracterizadas e associadas diretamente predisposio
hereditria ao RB. A avaliao molecular do gene RB1 em DNA de leuccitos pode identificar
mutaes germinativas em mais de 95% dos indivduos com predisposio hereditria ao RB.
A probabilidade de detectar uma mutao no gene RB1 depende da lateralidade do tumor, da
histria familiar ser positiva ou negativa, e da sensibilidade do mtodo empregado (Lohmann
& Gallie, 2013).
Este gene apresenta 27 xons e codifica uma protena nuclear que tem um papel
importante na regulao da transio G1 > S do ciclo celular. Centenas de mutaes pontuais
j foram identificadas ao longo do gene RB1, a maioria resultando em cdons de terminao,
levando ao truncamento da protena RB e, consequentemente, regulao inadequada de
G1 > S no ciclo celular (Lohmann & Gallie, 2013; Taylor et al, 2007).
6

Curso de vero 2015

Atualmente, as seguintes tcnicas so usadas no diagnstico molecular do

retinoblastoma (Lohmann & Gallie, 2013):
(1) Rastreamento de mutaes atravs de sequenciamento de Sanger que ou o
qual identifica mutaes de ponto, que so responsveis por cerca de 70% das mutaes
oncognicas em RB1. Utilizado rotineiramente na Diviso de Gentica do INCA (Figura 2);
(2) Genotipagem de marcadores polimrficos. A genotipagem e estudos de ligao
gnica utilizando microsatlites altamente polimrficos localizados dentro ou nas proximidades
do gene RB1 pode ser usada em quatro situaes: a) Detectar ausncia de um alelo parental
na criana, o qual pode indicar presena de uma deleo germinativa de novo; b) Comparar
amostra tumoral e de sangue perifrico na criana afetada, afim de detectar delees
somticas que resultam em perda allica; c) Rastrear o alelo mutante em uma famlia com
mais de dois afetados e d) Determinar se um indivduo, em risco, membro de uma famlia na
qual h apenas um afetado herdou algum alelo, presente no indivduo afetado;
(3) outros mtodos de pesquisa de grandes rearranjos, como MLPA (Multiple Ligationdependent Probe Amplification) e PCR multiplex quantitativo podem detectar grandes e
pequenas delees e duplicaes que so responsveis por 15% das mutaes oncognicas
em RB1.
A estimativa do risco em familiares de portadores de retinoblastoma depende do
probando ter ou no a mutao germinativa em RB1. A avaliao molecular do DNA dos
leuccitos do probando, ou outras clulas no tumorais, podem detectar a mutao
predisponente ao cncer; se uma mutao que predispe ao cncer identificada no probando,
a anlise de mutao do RB1 pode ser usada para determinar o status de irmos e filhos ao
risco de desenvolverem o retinoblastoma (Lohmann & Gallie, 2013) .
No seguimento destas crianas importante o rastreamento de segundo tumor ocular
que inclui exame fundoscpico. Necessitam tambm de vigilncia oftalmolgica para deteco
precoce de retinoblastoma, crianas portadoras de mutao germinativa patognica no gene
RB1, indivduos portadores de retinomas ou outras leses associadas ao RB, crianas com
retinoblastoma unilateral assim como a sua irmandade (Richter et al, 2003).

Curso de vero 2015

Figura 2: Fluxograma de investigao no Aconselhamento Gentico de retinoblastoma utilizado no

INCA.

Curso de vero 2015

2. Metodologias de laboratrio
2.1 Extrao de DNA
O DNA (cido desoxirribonuclico) uma molcula composta de duas cadeias
polinucleotdicas em forma de dupla-hlice. Cada uma destas cadeias composta de bases
nucleotdicas, que podem ser purinas (adenina e guanina) ou pirimidinas (citosina e timina),
localizadas no interior de um esqueleto composto de acar (desoxirribose) e fosfato. As cadeias
polinucleotdicas esto unidas por ligaes fracas e no-covalentes (pontes de hidrognio)
entre os pares de bases nucleotdicas. As duas fitas tm a mesma geometria helicoidal, mas
o pareamento das bases faz com que as fitas se unam de forma antiparalela. As pontes de
hidrognio entre as bases complementares (A e T ou C e G) so uma caracterstica importante
da dupla hlice, contribuindo para a estabilidade da molcula e para a especificidade do
pareamento de bases. No ncleo celular interfsico, o DNA se encontra compactado na forma
de cromatina, enovelado em protenas de carter bsico, conhecidas como histonas. Na
clula em mitose, o nvel de compactao da cromatina aumenta ainda mais, dando origem
aos cromossomos.
A extrao de DNA uma tcnica que se baseia na lise celular e na recuperao do cido
nuclico aps degradao protica. um dos procedimentos mais rotineiros em laboratrios
de biologia molecular e tem ampla utilizao na medicina, melhoramento gentico de plantas
e animais, gentica forense, entre outros. O material utilizado so os mais variados como, por
exemplo: sangue perifrico, tecido tumoral fresco ou includo em parafina, mucosa oral, bulbo
capilar, etc. Para cada tipo de material biolgico, utiliza-se a tcnica mais adequada, sendo
que todas as variaes obedecem ao mesmo fundamento:
1. Ruptura (fsica e qumica) das membranas celulares para liberao do material
gentico;
2. Desmembramento dos cromossomos em seus componentes bsicos: DNA e protenas;
3. Separao do DNA dos demais componentes celulares.
A ruptura das membranas celulares pode ser feita atravs de lise osmtica, utilizao de
detergentes e de proteinases para clivagem de protenas de membrana. O desmembramento
dos cromossomos com proteinases libera o DNA para extrao, que ocorrer por meio da
utilizao de etanol absoluto. Em ambiente livre de molculas de gua, o DNA (que uma
molcula polar e, consequentemente, hidroflica) se torna insolvel, sendo visualizado como
uma nuvem que se separa do restante da soluo. Ao final da extrao, faz-se a diluio
do DNA extrado em gua ou tampo Tris-EDTA (TE), estocando-se esta soluo em freezer
(-20C) por tempo indeterminado, ou em geladeira (4C) durante o perodo em que estiver
sendo manipulado. Uma observao importante que alquotas de DNA pouco concentradas
podem sofrer hidrlise cida se forem guardadas por muito tempo em temperaturas elevadas,
sendo degradadas. Logo, para garantir a integridade desta molcula, o melhor armazenar
um estoque concentrado no freezer e utilizar pequenas alquotas na diluio adequada de
acordo com o experimento que ser feito.

Curso de vero 2015

2.2 Protocolo: Isolamento de DNA a partir de sangue perifrico (Adaptado de

Miller e cols., 1988)
1 parte:
BIOSSEGURANA: os procedimentos do 1 dia de extrao devem ser feitos em
capela de fluxo laminar, devido ao contato com material possivelmente contaminado com
agentes patognicos (sangue).
1. Ao receber o material para extrao de DNA, deve-se ter bastante cuidado e anotar
todos os dados do paciente. Este um passo crucial, pois todos os resultados obtidos
dependem dele.
2. Homogeneizar bem os tubos com sangue.
Os tubos de coleta preferenciais so aqueles que contm o anticoagulante EDTA, pois
este preserva o DNA de alta massa molecular durante a estocagem do sangue. Devese homogeneizar a fim de desprender algum cogulo eventual que tenha se formado.
3. Adicionar tampo de lise de hemcias gelado, em um volume correspondente a 3,5x o
volume de sangue no tubo.
As hemcias so descartadas por no possurem ncleo, no contendo DNA. Para
tanto, utiliza-se uma soluo com concentrao suficiente para provocar lise osmtica
nas hemcias, mas no nos leuccitos (as clulas nucleadas).
Composio do tampo de lise de hemcias:
NH4Cl ................. 155mM
KHCO3..................10mM
EDTA Na2............. 1mM
H2O q.s.p ............. 1L
4. Deixar pelo menos 30 minutos no gelo.
5. Centrifugar a 3.000 rpm por 30 minutos, preferencialmente a 4C.
A centrifugao, que ser bastante utilizada neste procedimento, far a separao dos
componentes do sangue em fases, aps a lise osmtica, da seguinte forma (figura 3):

Figura 3: Primeira etapa de centrifugao para extrao de DNA a partir de sangue perifrico.

6. Descartar o sobrenadante, enxaguando bem. Ressuspender o precipitado em 10mL

de tampo de lise de hemcias. Centrifugar por mais 10 minutos a 3.000 rpm.
As lavagens com tampo de lise de hemcias retiram toda a hemoglobina restante, uma
vez que esta pode ser inibitria de enzimas e prejudicar procedimentos posteriores.
10

Curso de vero 2015

7. Descartar o sobrenadante. Ressuspender o precipitado em 3mL de tampo de lise de

ncleos.
O tampo de lise de ncleos far a lise osmtica dos ncleos dos leuccitos, liberando
o DNA para a soluo.
Composio do tampo de lise de ncleos:
Tris pH 8,0....................... 10mM
NaCl................................ 400mM
EDTA Na2....................... 2mM
H2O q.s.p........................ 1L
8. Certificar-se de que o precipitado foi completamente dissolvido.
9. Adicionar 10L de proteinase XIV (concentrao final de 50g/mL).
10. Adicionar 150L de SDS 20% (concentrao final de 0,5%).
11. Incubar a 37C durante 16h, aproximadamente.
2 parte:
1. Adicionar 1mL de NaCl 5M ao material e misturar bem.
O NaCl far a desnaturao das protenas presentes na soluo, tornando-as insolveis
e permitindo a sua precipitao.
2. Centrifugar a 3.000rpm por 30 minutos.
A centrifugao far a separao das protenas da parte da soluo que contm DNA
(figura 4).

Figura 4: Precipitao de protenas com o uso de NaCl.

3. Retirar o sobrenadante, passando-o a outro tubo.

4. Adicionar dois volumes de etanol absoluto gelado e inverter o tubo vrias vezes.
Na escassez de molculas de gua (meio com etanol absoluto), o DNA ficar insolvel
devido a sua natureza hidroflica, formando um nico aglomerado (figura 5).

11

Curso de vero 2015

Figura 5: Aglomerao da molcula de DNA em meio ao etanol absoluto.

5. Retirar o DNA com auxlio de pipeta Pasteur, ala de vidro ou ponteira, transferindo-o
para um eppendorf com 1mL de etanol 70%. Esperar 5 minutos.
Ao se lavar o DNA com etanol 70%, inicia-se a reidratao do material.
6. Transferir o DNA (ainda insolvel) para um criotubo com gua ou TE (Tris pH 8,0 a
10mM; EDTA Na2 a 1mM).
7. Armazenar a 4C ou -20C (armazenamento durante um longo perodo).

2.3 Quantificao de DNA

Aps a extrao do DNA, necessrio conferir a sua integridade, qualidade e
quantidade. Esta anlise pode ser feita por meio da eletroforese em gel de agarose e da
espectrofotometria.
1. Eletroforese em gel de agarose
A agarose um polmero extrado de algas marinhas. O gel feito por aquecimento
deste polmero em soluo tampo adequada, formando uma soluo transparente e
homognea. Aps a polimerizao, o dimetro dos poros da matriz do gel proporcional
concentrao da agarose utilizada. Devido presena dos grupamentos fosfato no DNA que
lhe conferem carga negativa em pH neutro ou alcalino, esta molcula tende a migrar para o
anodo (plo positivo), quando submetida a um campo eltrico (figura 6).
Para a visualizao do DNA no gel e a interpretao correta so utilizados um agente
intercalante de DNA e um marcador de massa apropriado. O principal agente intercalante
utilizado o brometo de etdeo, que um anlogo de base que se intercala na molcula
de DNA e emite fluorescncia violeta quando excitado com luz ultravioleta (UV). Para gis
rotineiros, a concentrao adequada de brometo de etdeo de 0,1 0,5g/mL. O limite
de deteco de 10ng de DNA/ banda visualizada com brometo de etdeo. Alm disto, a
intensidade de fluorescncia diretamente proporcional massa molecular do fragmento
12

Curso de vero 2015

de cido nuclico. fundamental o cuidado com este reagente, pois carcinognico. Uma
alternativa utilizar o tampo de amostra contendo blue green em vez de utilizar o brometo
no gel, o que diminui o risco de contato com a substncia mutagnica.

Figura 6: Esquema do material utilizado na eletroforese. A) vista lateral da cuba de corrida contendo
em seu interior o gel de agarose. B) vista frontal da cuba de corrida conectada fonte eltrica, a direo
da corrida eletrofortica e a frente de corrida, representada pelos corantes azul de bromofenol (AB) e
xileno cianol (X).

Os marcadores de massa so utilizados para se determinar o tamanho de uma

molcula de DNA. Existem diferentes tipos de marcadores com massa molecular variando
desde poucos pares de bases at dezenas de Kb. A faixa de tamanhos de fragmentos de
DNA contida no marcador dever ser compatvel com o material analisado. Outra observao
importante que, em uma amostra, os fragmentos de DNA de maior tamanho ficam mais
tempo retidos na matriz do gel, migrando mais lentamente do que os fragmentos de menor
tamanho (figura 7).
Pela eletroforese em gel de agarose, tambm se pode fazer a verificao da integridade
do DNA aps a sua extrao. Quando o DNA est degradado, observa-se um longo rastro
(figura 8A). No entanto, quando est ntegro, apresenta-se em nica banda, que migra muito
vagarosamente no gel, devido a sua massa molecular elevada (figura 8B).

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Curso de vero 2015

Figura 7: Eletroforese em gel de agarose evidenciando o marcador de tamanho de fragmento de 100

pares de bases (1) e fragmentos de DNA de diversos tamanhos e intensidades (2 a 10).

Figura 8: Gis de agarose corados com brometo de etdeo aps exposio ao UV. A= DNA degradado.
B= DNA ntegro.

2.4 Protocolo: Eletroforese em gel de agarose

1. Primeiro, deve-se pesar a agarose. Utiliza-se 0,8% para gis de verificao de
integridade de DNA genmico e 1,5% para gis de verificao de produtos de PCR.
Para gis a 0,8%, utiliza-se 0,8g de agarose para um volume final de 100mL de
gel, enquanto para gis a 1,5%, utiliza-se 1,5g de agarose para 100mL de gel.
2. Coloca-se a agarose em um erlenmeyer e, depois, 100mL de tampo NaOH 1X.
3. Aquecer esta soluo no forno microondas, aos poucos, tirando o Erlenmeyer de
vez em quando do forno e homogeneizar com cuidado, at que a soluo fique
completamente homognea. Este processo dura aproximadamente 1 minuto.

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Curso de vero 2015

4. No caso da utilizao do brometo de etdeo, esperar esfriar um pouco e adicionar o

reagente. Cuidado!!!! No o adicione com o gel ainda muito quente, pois a aspirao
de seus vapores muito prejudicial a sua sade e de quem estiver ao seu lado!!! Em
nosso curso utilizaremos apenas o tampo de amostra contendo blue green.
5. Montar a frma para o gel, com o molde e o pente que formar os poos para a
aplicao das amostras. Esperar pela polimerizao (aproximadamente 15 minutos).
6. Retirar, cuidadosamente, o pente do gel e transferir para a cuba de corrida. Adicionar
tampo NaOH 1X (sempre adicione o mesmo tampo que foi utilizado no preparo do
gel e na mesma concentrao).
7. Aplicar 3L de amostra com 1L de tampo de amostra contendo blue green (azul de
bromofenol, xileno-cianol e glicerol a 20%, para o gel feito sem a dio de brometo de
etdeo).
Os corantes azul de bromofenol e xileno-cianol ajudam a acompanhar a frente de
corrida, enquanto o glicerol um agente espessante de alta densidade que evita
o refluxo da amostra aps ser aplicada no poo do gel.
8. Cobrir a cuba e conectar os cabos fonte de tenso de forma que a migrao ocorra
do plo negativo para o plo positivo.
9. Aplicar voltagem de 1 a 5V/cm da distncia entre os eletrodos. Monitorar a passagem
de corrente atravs da formao de bolhas que ocorre nos plos devido eletrlise
do tampo.
10. Aps a corrida (aproximadamente 20 minutos), desligar a fonte de tenso e remover
o gel da cuba.
11. Analisar o padro de migrao expondo o gel luz UV e fotograf-lo para documentao.

2.5 Espectrofotometria
O espectrofotmetro de absoro um aparelho capaz de ler o espectro de absoro e
quantificar molculas em soluo. constitudo por uma fonte de luz, um prisma que decompe
a luz em vrios comprimentos de onda, uma fenda que seleciona o comprimento de onda de
interesse, um suporte para a amostra e uma fotoclula que detecta a luz que atravessou
a amostra (figura 9). Alguns espectrofotmetros funcionam com auxlio de programas
computacionais, a exemplo do NanoDrop ND-1000. Este um tipo de aparelho que faz a
leitura em vrios comprimentos de onda simultaneamente (220 a 750nm), possibilitando a
leitura de amostras com volume de 1L sem diluio e sem cubetas, utilizando apenas a
tenso superficial.

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Curso de vero 2015

Figura 9: Espectrofometria. A= Componentes de um espectrofotmetro de absoro. B= Pedestais do

espectrofotmetro NanoDrop ND-1000 e coluna formada pela tenso superficial da amostra.

Cada substncia tem um espectro de absoro caracterstico, dependendo de quais

comprimentos de onda so absorvidos. Esta propriedade permite a distino de componentes
individuais em misturas simples. Como exemplo, possvel saber se uma preparao de DNA
est ou no contaminada com protenas. A absoro de luz depende da concentrao da
substncia absorvente, sendo proporcional ao nmero de molculas. A lei de Lambert-Beer
descreve este processo da seguinte forma: A= a.b.c, onde A= absorbncia em um determinado
comprimento de onda; a= constante de absortividade; b= percurso ptico; c= concentrao da
substncia absorvente.
O espectro de absoro do DNA corresponde ao ultravioleta, sendo comum observar
um pico em torno de 260nm. Em espectrofotmetros nos quais se utilizam cubetas, devese diluir a amostra previamente. A diluio evita erros de leitura, os quais no ocorrem no
NanoDrop ND-1000 e, por isso, este aparelho no exige este preparo prvio. A concentrao
de DNA pode ser calculada da seguinte forma:
[ DNAfd (g/mL) ]= 50 x A260 x diluio
Onde DNA fd= DNA fita-dupla e A260= absorbncia no comprimento de onda de 260nm.
O aparelho NanoDrop ND-1000 realiza os clculos e oferece os valores das absorbncias e
da concentrao imediatamente aps a leitura.
A avaliao da pureza de uma preparao de DNA pode ser realizada atravs da anlise
da razo dos comprimentos de onda 230, 260 e 280nm. A razo 260/280 de aproximadamente
1,8 aceitvel, indicando pureza do DNA. Se esta razo for inferior a 1,8, possivelmente
existem contaminantes que absorvem no comprimento de 280nm, como protenas e fenol, por
exemplo. J a razo 260/280 uma medida secundria de pureza de cidos nuclicos, sendo
aceitvel na faixa de 1,8 a 2,2. Valores inferiores indicam a presena de contaminantes.
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Curso de vero 2015

2.6 Protocolo: Espectrofotometria - NanoDrop ND-1000

1. Iniciar o programa NanoDrop: Iniciar Programas NanoDrop ND-1000 (version).
2. Selecionar a opo Nucleic Acid.
3. Em seguida, o aparelho exigir que os pedestais sejam limpos com gua deionizada.
Deve-se pipetar 1L de gua no pedestal inferior (figura 10) e clicar OK.

Figura 10: Vista lateral do espectrofotmetro e aplicao da amostra. Adaptado de NanoDrop

Technologies. 2007

4. Antes de se fazer as medies, deve-se zerar o espectrofotmetro com a mesma

soluo na qual o DNA foi diludo. Ex.: gua ou TE. O branco far a excluso de
possveis interferncias inerentes ao solvente utilizado na amostra. Aplicar 1L, desta
soluo, no pedestal inferior e clicar BLANK. Repetir esta operao mais uma vez.
Limpar os pedestais com leno de papel.
5. Iniciar a medio das amostras, aplicando 1L no pedestal inferior e clicando em
MEASURE. Limpar os pedestais com leno de papel entre as aplicaes.
6. Aps a leitura, surgir um grfico representativo da amostra analisada (figura 11). O
pico em 260nm indica a presena de DNA.
7. Ao trmino da medio, limpar o pedestal inferior com gua. Clicar em EXIT Escape
Key (ESC).

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Curso de vero 2015

Figura 11: Grfico obtido aps quantificao de DNA. Adaptado de NanoDrop Technologies. 2007

2.7 Sequenciamento de DNA

O sequenciamento de DNA um processo que determina a ordem exata dos pares de
bases (A, T, G e C) em um segmento de DNA. O conhecimento da sequncia de bases de um
gene fornece importantes informaes sobre sua estrutura, funo e relao evolutiva com
outros genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes). Existem vrios mtodos
disponveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens. Um dos mais utilizados o
chamado mtodo didesoxi conhecido tambm como mtodo de terminadores de cadeia ou
de Sanger; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma
humano. Sua estratgia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o
processo, o ltimo nucleotdeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os
produtos da reao devero tambm portar uma marca que permita detect-los na etapa de
anlise. Resumidamente, o processo realizado a partir de uma cadeia simples (no dupla)
do DNA a ser sequenciado, esta servir de molde para gerar a outra metade complementar
da dupla hlice, isto obtido pela desnaturao da molcula nativa.
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Curso de vero 2015

A reao de sntese se processa em condies inicas e de pH apropriadas, na

presena da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotdeos que compem a
cadeia, sob a forma de 3-desoxinucleotdeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e dTTP
sendo um deles marcado radioativamente com P ou 35S; um dos mais utilizados o dATP P.
Como a enzima utilizada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente, necessrio
tambm em reao um pequeno fragmento de DNA sinttico (XXX) complementar a uma
regio conhecida (YYY) na extremidade 3 do DNA molde, estas caractersticas permitiro
sua hibridao no local mencionado, e fornecero um ponto de partida para a replicao do
DNA (Figura 12).
Fato importante no processo que ele executado em quatro reaes separadas;
cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um (e apenas um) dos 4
tipos de cada dNTP sob a forma de anlogo, 2, 3-dideoxinucleotdeos trifosfatos (ddNTPs).

Figura 12: O fragmento XXX, denominado iniciador ou primer, quando marcado, poder ser utilizado
para rastrear o fragmento de DNA recm sintetizado no lugar do dNTP.

Como todos os nucleotdeos normais (dNTPs) esto presentes, o alongamento
da cadeia prosseguir at que a enzima DNA-polimerase insira um anlogo (ddNTP).
Consequentemente, haver parada imediata da reao de sntese no ponto em que
seu alongamento foi interrompido, na extremidade, e a molcula estar marcada com P
(Figura13).

Figura 13: Esquemas apresentando os anlogos conhecidos como terminadores, que quando
incorporados cadeia nascente (A), por no apresentarem 3OH (B) impedem a ligao de um prximo
dNTP a ser adicionado, bloqueando o processo.

Como todos os nucleotdeos normais (dNTPs) esto presentes, o alongamento
da cadeia prosseguir at que a enzima DNA-polimerase insira um anlogo (ddNTP).
Consequentemente, haver parada imediata da reao de sntese no ponto em que seu
alongamento foi interrompido, na extremidade, e a molcula estar marcada com P. Os
fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resduo final conhecido, pois se sabe
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Curso de vero 2015

em que tubo de reao o anlogo foi adicionado, so separados por tamanho em gel de
poliacrilamida individualmente: um canal de anlise para cada reao. O gel transferido
para um suporte de nitrocelulose (filtro).
O mtodo pode ser automatizado atravs de maquinaria apropriada, gerenciada por
computadores com softwares que lem sequencialmente e identificam os produtos (figura 16).
Isto permitir executar o processo em grande escala. Neste caso, utilizam-se simultaneamente
os 4 dideoxinucleotdeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescncia, como cada
reao (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a
eletroforese destes realizada em um nico canal do gel de sequenciamento (figura 16). O
sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, aps iluminao com um feixe de
laser, identificar os produtos baseado na diferena de comprimento de onda. A luz emitida
detectada por escaneamento do gel e gerado um eletroferograma (sequncia deduzida
por computador). Variveis mais modernas, consequentemente mais rpidas e poderosas,
incluem a robotizao total do processo, com a incluso das etapas de purificao e da reao
de sntese da cadeia do DNA.

Figura 14: Esquema de uma aplicao de uma reao de sequenciamento e a disposio dos
fragementos submetidos eletroforese, e a intensidade observada correspontente a cada um desses
fragmentos.

2.8 Conhecendo a plataforma de sequenciamento de nova gerao HiSeq 2500

(Illumina)
A plataforma HiSeq 2500 usa a tecnologia de sequenciamento por sntese (SBS),
esta metodologia, como sugere o nome, permite a leitura da sequncia de DNA conforme
a mesma sintetizada. Esse o tipo de tecnologia de sequenciamento de prxima gerao
mais bem sucedido e amplamente adotado em todo o mundo. A tecnologia SBS permite o
sequenciamento paralelo de larga escala utilizando um mtodo de marcao por fluorescncia
terminal reversvel, que permite a deteco de bases nicas conforme elas so incorporadas
em cadeias de DNA. O tipo de tecnologia SBS aplicado na plataforma HiSeq 2500 (Illumina)
o de amplificao por ponte (figura 15).

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Curso de vero 2015

2.9 Preparo de bibliotecas para a plataforma HiSeq 2500 (Illumina)

Na preparao de bibliotecas, o DNA alvo da amostra fragmentado, aleatriamente
por quebra enzimtica, em fragmentos de 250pb a 350pb. O preparo envolve o reparo das
extremidades 3`e 5` seguido da adio de uma cauda dA antes da ligao adaptadores
PE. O fragmento com adaptadores PE ento amplificado com primers contendo os indexes
(cdigo de barra) e os e as caudas P5 e P7 que iro se fixar na superfcie da flowcell para
serem sequenciadas (Figura 16).

Figura 15: Mecanismo de amplificao por ponte. O processo repetido at as fitas de DNA formem
concentraes densas. As regies em vermelho e verde representam os primers e seus reversos
complementares (com bolinhas pretas) que se encontram fixas superfcie onde ocorre as amplificaes.
Aps o trmino da amplificao as leituras poem ser realizadas em um dos dois sentidos.

Figura 16: Fragmento de DNA alvo e os demais adaptadores e primers que formam uma biblioteca
pair-end da Illumina.

A tecnologia SBS suporta tanto leituras nicas e leituras duplas de extremidade

(paired-end). Uma ampla gama de mtodos de preparao de bibliotecas permitem diversas
aplicaes, tais como sequenciamento de genomas completos e sequenciamento de regies
alvo candidatas, anlise de transcriptomas, estudo de microRNA, perfis de metilao, e anlise
de interaes protena - cido nucleico de todo o genoma.

Em nosso curso ser utilizado um kit de enriquecimento de 124 genes e respectivas
regies UTR, o Painel Cncer Gene GeneRead DNAseq (Qiagen). Este kit tem como base
um ensaio baseado em PCR multiplex para enriquecimento das regies alvo dos 124 genes
mais comumente mutados em cancr de mama, clon, fgado, pulmo, ovrios, prstata
e estmago e leucemia. Mutaes nestes oncogenes e genes supressores de tumor so
frequentemente relevantes para a classificao do tumor, e garante extensa investigao para
melhorar a compreenso da carcinognese. Pesquisas em cncer identificam continuamente
novos genes mutantes relacionados com processos de carcinognese, ou novas mutaes
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Curso de vero 2015

em genes oncognicos conhecidos, elucidando novos mecanismos de progresso de um

cncer ou a evaso ao tratamento. Um genoma de tumores pode tornar-se instvel durante
a progresso do tumor, aumentando a probabilidade de mutaes adicionais. Portanto, cada
tumor pode ter mutaes raras que no seriam identificadas em um painel de genes menor. Um
painel maior, incluindo os genes mutados comumente em vrios tipos de tumores aumentaria
as chances de identificao das principais mutaes em cada tumor, potencialmente
identificando mecanismos moleculares.

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Curso de vero 2015

3. Anlises computacionais
Esta seo se resume a citar os passos nas etapas de anlises realizadas em
computadores linux, o ideal que o usurio tenha conhecimento de alguns comandos Unix.
existem materiais e cursos disponveis gratuitamente na internet, como exemplos de materiais
para usurios novos podem ser citados:
1) http://www.ee.surrey.ac.uk/Teaching/Unix/
Curso bsico de Unix, para realiz-lo necessrio um computador com linux ou um mac.
Saber utilizar os sistemas operacionais com base em Unix atravs de linhas de comando
fundamental para aqueles que pretendem ser usurios de ferramentas de bioinformtica.
2) http://heather.cs.ucdavis.edu/~matloff/UnixAndC/Unix/UnixBareMn.pdf
Apostila com fundamentos bsicos de Unix.
Converso dos dados (CASAVA)
- Comando para acessar o servidor
$ ssh amenezes@13.250.0.13

- Comando para ir para a pasta da corrida:
$ cd /Illumina/140827_SN1054_0141_AC4N2RACXX/Data/Intensities/BaseCalls
- Comando para preparar a converso dos dados em arquivos Fastq
$ configureBclToFastq.pl -o ../../../Unnaligned_HPVsplicing --use-basesmask=Y101,I6n2,n8,Y101 --mismatches 1 --fastq-cluster-count 0
- Comando para disparar a converso
$ qsub pe orte 60 ../../../make_me.sh
Checar qualidade dos reads
- Comando para acessar o servidor
$ ssh usuarioN@10.46.57.240
- Comando para checar a qualidade de um read
$ fastqc ../<nome_do_arquivo> -o ./
- Em um novo terminal, digitar o comando para acessar o servidor da gentica por modo de
transferncia de arquivo
$ sftp usuarioN@10.46.57.240
- Realizar a transferncia do sevidor para o seu computador
$ get *.zip
No seu computador verificar a qualidade das leituras
- V para a pasta aonde foi realizada a transferncia do arquivo de qualidade
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- Descompacte o arquivo
- Abra o arquivo fastqc_report.html
- Voltar ao terminal com acesso ssh e executar o comando para filtrar as leituras por qualidade
$ perl prinseq-lite.pl -fastq R1.fastq -fastq2 R2.fastq -out_format 3 -no_qual_header -min_
len 30 -min_qual_mean 20 -ns_max_p 60 -trim_tail_right 5 -trim_tail_left 5 -trim_qual_step 1
-trim_ns_right 5 -trim_ns_left 5 -trim_qual_right 20 -trim_qual_left 20 -trim_qual_type mean
-trim_qual_rule lt -trim_qual_window 5 -out_bad null;
Alinhar Reads a uma referncia
$ bowtie2 -p 70 -x refgenoma/genoma_ensembl -1 R1_prinseq_good_*.fastq -2 R2_prinseq_
good_*.fastq -U paciente_singletons.fastq -S genhumano.sam;
- Em um novo terminal, digitar o comando para acessar o servidor da gentica por modo de
transferncia de arquivo
$ sftp usuarioN@10.46.57.240
- Realizar a transferncia do arquivo do mapa de leituras do sevidor para o seu computador
$ get *.sam
Abrir Mapas e buscar mutaes visualmente
- Clicar duas vezes no cone do programa IGV na rea de trabalho
Anlise pelo portal SabioSciences (Qiagen)
- Acessar o portal http://ngsdataanalysis.sabiosciences.com/NGS2/
- Realizar o login (o usurio e senha ser fornecido no dia)
- Clicar na aba File Upload
- Clicar no boto Add Files
- Indicar os arquivos fastq em seu computador
- Apertar o boto Start Upload
- Clicar na aba Variant Calling Job
- No campo GeneRead Catalog # digite o seguinte cdigo NGHS-501Z
- No campo Job Type indique a opo Single
- No campo Analysis Mode indique a opo Germline
- No campo Sample Info File clicar no boto Choose File, localizar o arquivo Sample_SR_
GeneRead.txt em seu computador e apertar o boto Upload
- Clicar no boto Create Jobs e aguardar que a anlise seja finalizada.
- Aps a anlise iremos discutir os resultados e as consequncias moleculares das possveis
mutaes encontradas.
Reservaremos um tempo ao final do curso para discusses e concluses.
Bom estudo a todos!!

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Curso de vero 2015

REFERNCIAS
Retinoblastoma
1. Lohmann DR. RB1 gene mutations in retinoblastoma. Hum Mutat 1999,14(4):283-8.
2. Lohmann DR, Gallie BL. Retinoblastoma GeneReview. In: Pagon RA, Bird TD, Dolan CB, Stephans
K, eds. GeneReviews [publicao na internet]. Seattle: University of Washington; 2013 [acesso em
10 out 2014]. Disponvel em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1452/
3. Richter S, Vandezande K, Chen N, Zhang K, Sutherland J, Anderson J, Han L, Panton R, Branco
P, Gallie B. Sensitive and efficient detection of RB1 gene mutations enhances care for families with
retinoblastoma. Am J Hum Genet 2003,72:25369.
4. Taylor M, Dehainault C, Desjardins L, Doz F, Levy C, Sastre X, Couturier J, Stoppa-Lyonnet
D, Houdayer C, Gauthier-Villars M. Genotype-phenotype correlations in hereditary familial
retinoblastoma. Hum Mutat 2007, 28(3):284-93.
5. Richter S, Vandezande K, Chen N, Zhang K, Sutherland J, Anderson J, Han L, Panton R, Branco
P, Gallie B. Sensitive and efficient detection of RB1 gene mutations enhances care for families with
retinoblastoma. Am J Hum Genet 2003,72:25369.

Extrao de DNA, quantificao e purificao de DNA, eletroforese

1. Azevedo MO, Felipe MSS, Brgido MM, Maranho AQ, De-Souza MT. 2003. Tcnicas bsicas de
Biologia Molecular. Brasllia: Ed. Universidade de Braslia.
2. Lewin B. 2004. Genes VIII. EUA: Pearson Prentice Hall.
3. Miller AS, Dykes DD, Polesky HF. 1988. A simple salting procedure for extracting DNA from human
nucleated cells. Nucleic Acid Research 16: 215.
4. NanoDrop Technologies 2007. Manual de instrues do espectrofotmetro NanoDrop ND-1000:
ND-1000 Spectrophotometer V3.5 Users Manual.
5. QIAGEN 2008. Manual de instrues do kit de purificao QIAquick PCR purification kit Spin
Handbook.
6. QIAGEN Sample and Assay Technologies. 2008. Manual do kit REPLI-g Mini/Midi Handbook - For
whole genome amplification from purified genomic DNA, blood, and cells.
7. Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning a laboratorial manual. 3 ed. Cold Sprong
Harbour, Nova York: Cold Spring Harbour Laboratory.

PCR
1. Sambrook J. and Russell D. W. 2001. In vitro amplification of DNA by the polymerase chain reaction
In: Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press) Cold
Spring Harbor, New York, vol. 2, pp. 8.18-8.24

Sequenciamento
1. Protocolo para reao de sequenciamento 2009. Protocolo desenvolvido por Kelly Souza e Leila Monnerat.
2. Sambrook, J. and Russell, D. W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. (Cold Spring
Harbor Laboratory Press) Cold Spring Harbor, New York, pp. 9.76-9.81
25

Curso de vero 2015

Referncias eletrnicas
1. www.flmnh.ufl.edu
2. http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf
3. www.eppendorf.com
4. www.mlpa.com
5. http://educacao.genesisdbm.com.br/sequenciamento.shtml
6. www.illumina.com
7. www.qiagen.com

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MINISTRIO DA SADE
INSTITUTO NACIONAL DE CNCER JOS ALENCAR GOMES DA SILVA (INCA)

VII CURSO DE VERO DE PESQUISA EM ONCOLOGIA

miRNAs no Cncer

RIO DE JANEIRO, RJ
INCA
2015

2015 Instituto Nacional de Cncer Jos Alencar Gomes da Silva/ Ministrio da Sade.
Esta obra disponibilizada nos termos da Licena Creative Commons
Atribuio No Comercial Compartilha igual 4.0 Internacional.
permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a
fonte.
Esta obra pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade Preveno e Controle
de Cncer (http://controlecancer.bvs.br/) e no Portal do INCA (http://www.inca.gov.br).
Tiragem: XXXX exemplares
Elaborao, distribuio e informaes
MINISTRIO DA SADE
Instituto Nacional de Cncer JOS ALENCAR
GOMES DA SILVA (INCA)
Coordenao de Pesquisa e Educao
Rua Andr Cavalcanti, 37
Centro Rio de Janeiro RJ
Cep 20231-050
www.inca.gov.br
Curso VII - miRNAs NO CNCER
Pesquisador responsvel
Eliana Abdelhay eabdelhay@inca.gov.br
Equipe
Thais Basili de Oliveira thabasili@gmail.com
Everton Cruz evertoncruzsantos@gmail.com
Colaboradora
Stephany Corra scorrea@biof.ufrj.br

Normalizao editorial
Coordenao de Preveno e Vigilncia
Servio de Edio e Informao TcnicoCientfica
Rua Marqus de Pombal, 125
Centro Rio de Janeiro RJ
Cep 20230-240
Tel.: (21) 3207-5500

SUMRIO
INTRODUO 5

1. Cncer de mama 5

2. MicroRNAs 7

3. Justificativa do estudo 10
REFERNCIAS 11
APNDICE I APRESENTAO DO PROJETO E DISCUSSO DA
ESTRATGIA METODOLGICA 12

Cultura de clulas 12

Extrao de miRNA - miRNeasy Mini kit 15

Quantificao do miRNA 16

Reao de transcrio reversa de miRNA 17
PCR array de miRNA 18
Anlise in silico 20
Normalizao 29
APNDICE II CRONOGRAMA 31

Curso de vero 2015

INTRODUO

1. Cncer de mama

O cncer de mama (CM) considerado a maior causa de morte por cncer em mulheres
no mundo, embora nas ltimas duas dcadas a mortalidade tenha diminudo em cerca de
30%, e o ndice de sobrevida (5 anos) tenha aumentado (90% em pases desenvolvidos e
de 50% a 60% e pases em desenvolvimento). Em 2012, 1,67 milhes de novos casos foram
esperados para essa doena em todo o mundo, representando cerca de 25 % do nmero
total de cncer diagnosticados em mulheres. As maiores taxas de incidncia so encontradas
na Europa Ocidental (96/100 mil habitantes) e as menores na frica central e sia oriental
(27/100 mil habitantes). No Brasil o CM (sem considerar os tumores de pele no melanoma)
o mais frequente em mulheres da regio Sudeste, Sul, Centro Oeste, e Nordeste, sendo o
segundo em incidncia na regio norte. So esperados 57.120 novos casos de CM em 2014,
com risco de 56,09 casos a cada 100 mil mulheres.
O CM tem sido majoritariamente classificado em trs subtipos diferentes baseado na
presena ou ausncia de receptores encontrados em clulas cancerosas. As clulas tumorais
de CM podem expressar receptores hormonais, de estrgeno e/ou progesterona (ER/PR)
correspondendo cerca de 60% dos casos. Dessa forma so classificados em Luminal A e
apresentam um melhor prognstico. Em ~20 % dos casos de CM classificado em HER2 pois apresentam o receptor do fator de crescimento epidermal humano 2 (HER-2/neu)
superexpresso. Os outros ~20% dos casos so negativos para a expresso tanto de ER,PR
quanto HER-2/neu, conhecido tambm como CM triplo negativo, e se apresenta como
sendo o de pior prognstico. Embora existam outras tcnicas que classifiquem o CM em
outros subtipos baseando-se em outros parmetros, esses trs subtipos acima citados so
comumente usados e representam 70% dos casos, baseado na correlao com a expresso
de ER, PR e HER-2. (Fig1).

Curso de vero 2015

Figura1. Principais subtipos moleculares e correlao com grau histolgico, prognstico e resposta
terapia. (http://www.pathophys.org/breast-cancer/)

Na dcada de 90 foram descobertos genes para predisposio de cncer de mama
conhecidos como BRCA1 e BRCA2, que atuam como supressores tumorais. Mutaes
nesses genes so dominantes e aumentam o risco de desenvolvimento de cncer em
mulheres sendo responsvel por aproximadamente 20% dos casos de CM familial. Quando
as mutaes ocorrem em BRCA1, aumentam o risco de 65% a 85% e em BRCA2, entre
40% e 85%. A incidncia dessa mutao est associada com a idade de diagnstico do CM,
onde pacientes diagnosticados abaixo dos 35 anos apresentam uma maior frequncia nas
mutaes de BRCA1/2 (5,9% a 12,9% dos casos) do que pacientes diagnosticados entre 3645 anos (2,4% a 4,9% dos casos). Caso haja um parente de primeiro grau afetado, o risco de
desenvolver CM aumenta em cerca de 13%. Portadores dessas mutaes podem ter o risco
de desenvolver outros tipos de cncer aumentado, sendo, mutaes em BCRA1 associadas
a cncer de ovrio e prstata enquanto em BCRA2 aumentam o risco de desenvolvimento
de cncer de pncreas, estomago, ovrio, prstata e vias biliares. Para CM espordico (sem
fator hereditrio, que representa mais de 90% dos casos de CM no mundo) as mutaes em
ambos os genes so pouco frequentes. Nestes casos o risco est fortemente associado a
produo de esteroides sexuais, condies endcrinas, utilizao de estrgenos exgenos.
Alm desses fatores, o acmulo de mutaes adquiridas de genes em clulas somticas,
a ativao de oncogenes e a inativao de genes supressores tumorais contribuem para a
ocorrncia do CM espordico. Para mulheres com mutaes nos genes BRCA, as formas
de preveno incluem ressonncia magntica anual por volta dos 20 anos e mamografia
em torno dos 40 ou 50 anos, bem como mastectomia bilateral e/ou remoo de ovrios, ou
administrao de drogas quimiopreventivas como tamoxifen ou raloxifene. Segundo o Instituto
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Curso de vero 2015

Nacional de Cncer (INCA), no Brasil a mamografia bienal para mulheres entre 50 e 69 anos
para mulheres com risco padro, e 35 anos para mulheres com histrico familiar alm de
exame clinico das mamas a partir dos 40 anos, so recomendados para a deteco precoce
de CM que est associada a um melhor prognostico e maiores chances de cura.
A etiologia do cncer extremamente complexa e envolve inmeros fatores genticos,
vias oncognicas e tambm modificaes epigenticas. As modificaes epigenticas so
assinaturas moleculares de carter reversvel que alteram a expresso gnica, e embora
sejam herdveis, no modificam a sequncia de nucleotdeos da molcula de DNA. So
importantes mecanismos reguladores e esto presentes tambm no desenvolvimento
e progresso de muitos cnceres inclusive o CM. Dentre elas encontram-se: modificao
de histonas, metilao do DNA, remodelamento de cromatina e expresso de RNAs no
codificantes como long non-coding RNAs (lncRNAs) e microRNAs (miRNAs). De maneira
sucinta, as modificaes de histonas consistem na adio de grupos moleculares histonas
e como consequncia podem ativar ou reprimir a expresso de genes. J a metilao de DNA
converte bases citosinas em 5-metilcitosinas atravs da adio de grupos metil por enzimas
metiltransferases. Esto geralmente associadas ao silenciamento gnico e ocorrem nas ilhas
CpG de regies promotoras. Os RNAs no codificantes, podem se ligar ao DNA, RNA ou
mesmo protenas e com isso podem regular a expresso gnica de vrias maneiras, atuar na
modificao da cromatina ou agir como molculas sinalizadoras ou recrutadoras.

2. MicroRNAs


miRNAs so pequenos RNAs de fita simples no codificantes, aproximadamente 22
nucleotdeos, que atuam na regulao gnica ps-transcricional. Originalmente descritos
em 1993 em C. elegans, onde os miRNAs lin-4 and let-7 foram observados durante o
desenvolvimento larval, essas molculas so conservadas evolutivamente. Hoje, h mais de
2,500 miRNAs humanos descritos no banco de dados miRBase. Os miRNAs esto envolvidos
em diversos mecanismos biolgicos como regulao do ciclo celular, desenvolvimento,
diferenciao, proliferao, metabolismo e apoptose. pela complementaridade de bases
com um RNAm que os miRNAs atuam na regulao gnica. Sendo que um miRNA pode ser
regulado por diversos fatores e um mesmo miRNA pode regular diferentes RNAm. Por isso o
equilbrio desse complexo sistema que est intimamente ligado a maquinaria celular precisa
estar em excelente harmonia e a desregulao desse sistema resulta no desbalano de vias
e sinalizaes necessrias para o funcionamento da clula.

Os miRNAs so codificados a partir de regies intrnicas ou exnicas, codificantes
ou no. Atravs da enzima RNA Polimerase II (RNAPII) os miRNAs so transcritos, pela
via cannica, em longas molculas primrias chamadas pri-miRNAs. Os pri-miRNAs so
ento processados pela enzima RNase III Drosha, que age em conjunto com a protena
DiGeorge syndrome critical region 8 protein (DGCR8) e permanecem em forma de grampo,
agora denominados pre-miRNA (precursor miRNAs). Os pr-miRNAs tambm podem ser
resultado do spliceossomo de mrtrons, que so pequenos ntrons de genes codificadores de
protenas e que quando clivados apresentam as mesmas propriedades e caractersticas dos
miRNAs. Para que cheguem ao citoplasma, os pr-miRNAs so exportados do ncleo pela
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Curso de vero 2015

protena Exportina 5, onde so clivados pela RNase III Dicer-TRBP (transactivating response
RNAbinding protein) em um duplex miRNA/miRNA composto da sequncia madura e da
fita antisenso de ~20-pares de bases (pb). Uma das fitas, representando o miRNA maduro,
incorporada ao complexo silenciador induzido por miRNA (miRISC) contendo a protena
Argonauta enquanto a outra fita degradada (Fig.2).

Figura 2. Biognese do miRNA: miRNAs so transcritos pela RNAPII. Na via cannica os pri-miRNA
so processados pelo complexo Drosha-DGCR8 em pr-miRNA, enquanto na via no cannica os
pr-miRNA so derivados de um Spliceossomo. O pr-miRNA em formato de grampo reconhecido
e exportado do ncleo pela Exportina 5. No citoplasma os pr-miRNAs so clivados por Dicer-TRBP.
Quando processados por AGO2 uma das fitas de miRNA incorporada ao miRISC e a outra fita
degradada. (Krol J. et al. 2010)

O papel dos miRNAs na regulao gnica est diretamente associado ao pareamento
de sua fita simples sequncia do RNAm alvo e pode ser realizado atravs de diferentes

Curso de vero 2015

mecanismos (Fig.3). Caso haja uma complementaridade perfeita entre as sequncias do

miRNA e do seu alvo, a protena AGO associada ao miRNA maduro induz a clivagem do
RNAm, levando a uma rpida degradao. Entretanto ainda que no haja um pareamento
perfeito entre o miRNA e seu alvo, os miRNAs so capazes de cumprir suas funes
reguladoras com base numa complementaridade imperfeita. Ao realizar o pareamento parcial
com a regio 3 untranslated region (UTR) de seu alvo, o complexo CCR4-NOT pode ser
recrutado pelo miRISC, associado a protena GW182. Esse complexo tem a capacidade
de induzir a deadenilao da sequncia alvo que resultar na dissociao de PABPC e
consequentemente na degradao do RNAm ou reprimir a traduo ao bloquear o incio da
mesma. Mesmo depois de iniciada a traduo, o miRNA ainda consegue cumprir o seu papel
repressor atravs da ao de miRISC, que promove a soltura dos ribossomos ou estimula a
protelise do peptdeo em formao. Apesar da funo repressora bem estabelecida, tambm
j foi descrito que os miRNAs so capazes de induzir e aumentar a expresso de RNAm sob
determinadas condies, atravs de mecanismos que envolvem as protenas AGO e fragile X
mental retardation protein 1 (FMR1).

Alteraes genticas em regies associadas a miRNAs foram descritas em diferentes
condies patolgicas, entre elas o cncer. Alm das alteraes genticas, mecanismos
epigenticos como a metilao do DNA, podem ter como consequncia a expresso aberrante
de miRNA. Os miRNAs que se encontram diferencialmente expressos no cncer podem atuar
regulando genes supressores de tumor e oncogenes sendo assim denominados de OncomiRs
e anti-oncomiRs respectivamente e por isso tm sido correlacionados com a tumorignese,
angiognese e metstase. Com base no perfil de expresso de miRNAs nos tecidos tumoral
e saudvel, acredita-se no uso do miRNA como um biomarcador nos diferentes estgios de
evoluo do cncer, desde seu papel como indicador diagnstico e prognstico, at seu uso
como alvo teraputico e classificao especfica.

Curso de vero 2015

Figura 3. Regulao da expresso gnica por mltiplas vias: a | Pareamento perfeito - resulta na
clivagem pela AGO e consequente degradao do RNAm. b | Pareamento parcial com a regio 3
untranslated region (UTR) - Resulta na deadenilao do RNAm atravs do complexo CCR4NOT
e consequente degradao. c | Represso do incio da traduo por miRISC - bloqueia a iniciao
translacional atravs de CCR4NOT. d | Represso translacional por miRISC - Inibe a traduo j
iniciada atravs da soltura dos ribossomos ou protelise do peptdeo em formao. e | Aumento de
expresso do alvo - envolvendo AGO e FMR1. (Pasquinelli AE. 2012)

J foram descritos alguns miRNAs diferencialmente expressos associados ao cncer de

mama, por exemplo, nos subtipos luminal e basal e ainda classificando o status dos receptores
de hormnios. A famlia miR-200 foi descrita como associada ao subtipo luminal enquanto
miR-145 e miR-205 foram encontrados reduzidos no subtipo triplo negativo, sugerindo que a
mudana na expresso seja uma consequncia da evoluo da doena. A baixa expresso
de miR-340 est associada a migrao e invaso da clula tumoral e consequentemente a
um mau prognstico.

3. Justificativa do estudo
O papel dos miRNAs no desenvolvimento e progresso do cncer j foi confirmado,
entretanto, ainda necessrio desvendar o perfil de expresso dos miRNAs e estudar as vias
de atuao e interaes envolvendo seus alvos e reguladores, e conhecer seu envolvimento em
cada etapa do processo de tumorignese, desde o diagnstico precoce at seu uso teraputico.
Assim sendo, com o intuito de uma possvel caracterizao molecular dos subtipos
tumorais envolvidos na progresso do cncer de mama, este trabalho visa avaliar o perfil da
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Curso de vero 2015

expresso de miRNAs em linhagens que mimetizam os subtipos Luminal e HER-2+ no CM,

utilizando a tcnica de PCR Array, para uma identificao global dos miRNAs diferencialmente
expressos, e a partir dos dados obtidos, realizar a um screening inicial da expresso dos alvos
encontrados por anlise in silico atravs da tcnica de PCR em tempo real.

REFERNCIAS
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11

Curso de vero 2015

APNDICE I - APRESENTAO DO PROJETO E DISCUSSO DA ESTRATGIA

METODOLGICA

Neste curso os alunos analisaro o perfil de expresso de miRNAs em linhagens

celulares que mimetizam diferentes subtipos moleculares de cncer de mama.
Para isso sero utilizadas as seguintes linhagens: EFM-192B (HER-2), EVSA-T
(Luminal), e HMEC (controle). A partir do cultivo, sero extrados e quantificados os miRNAs
e RNAm de cada uma das linhagens. Atravs da transcrio reversa sero obtidos os cDNAs
desses RNAm e miRNAs, e estes sero utilizados no Human miRNome miScript miRNA PCR
Array, que permite a avaliao dos 1008 miRNAs mais abundantes e melhor caracterizados
no miRBase. A anlise da expresso dos miRNAs ser realizada na ferramenta online
miScript miRNA PCR Array Data Analysis (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/mirna/
arrayanalysis.php) e os miRNAs diferencialmente expressos sero analisados in silico quanto
sua funo/processos biolgicos no software MetaCore (Thompson Reuters). O screening
da expresso dos alvos encontrados ser realizado por PCR em tempo real.
Cultura de clulas

A cultura de clulas uma ferramenta in vitro muito til em mltiplas reas de investigao
das cincias da sade, pois possibilita o estudo direto de respostas celulares especficas,
ou seja, sem grandes interferncias dos inmeros sinais provenientes do organismo. As
caractersticas de clulas cultivadas so diretamente relacionadas com o ambiente em que
esto inseridas, como os gases presentes, a temperatura ambiente, o substrato, ou seja, o
local em que as clulas aderem, o meio de cultivo e tambm os suplementos adicionados.

Baseado na origem das clulas, as culturas podem ser classificadas em:
- Cultura primria: clulas retiradas diretamente de um organismo para utilizao em
experimentos.
- Linhagens celulares: Clulas transformadas retiradas de tumores ou imortalizadas atravs
de tratamentos fsicos, qumicos ou modificaes genticas, so muito utilizadas por poderem
ser mantidas indefinidamente em cultura, porm podem apresentar perda das caractersticas
do tecido de origem.

Inicialmente, as clulas em cultura possuem caractersticas semelhantes aos seus
tecidos de origem e assim clulas derivadas do sangue tendem a crescer em suspenso,
enquanto clulas derivadas de tecidos slidos (como por exemplo: pulmo e rim) tendem a
crescer em monocamadas aderentes, de forma a se espalhar pelo fundo da garrafa. Para as
clulas aderentes, as garrafas de cultura devem possuir uma carga negativa, que medeia a
produo de protenas de adeso da clula superfcie da garrafa.

Alm de sua origem, as clulas em cultura, baseadas em sua morfologia ou nas suas
caractersticas funcionais podem ser classificadas em trs grandes grupos:
- Epiteliais: clulas que aderem ao substrato e apresentam forma achatada e poligonal;
- Linfoblsticas: clulas que, normalmente, no aderem ao substrato, permanecendo em
suspenso com uma forma esfrica;
- Fibroblsticas: clulas que esto aderidas ao substrato e apresentam-se alongadas,
bipolares e frequentemente formam redemoinhos.
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Curso de vero 2015

Consideraes:
Pr-aquecer todas as solues em banho-maria a 37C, com exceo da tripsina que dever
estar a temperatura ambiente.
No abrir as solues e garrafas de cultivo fora do fluxo laminar para que as mesmas se
mantenham estreis
Reagentes:
RPMI-1640
Glutamina
Pen Strep (Penicilina Streptomicina)
SBF (Soro Fetal Bovino)
Tripsina 0,05%
PBS
Protocolo:
Complementao do meio e tripsina
Meio completo - Volume final = 100 ml
SBF ___________10 ml
Glutamina ______ 1 ml
Pen Strepto _____ 1 ml
Completar com RPMI-1640 para 100 ml
Meio de cultura
Para 1 garrafa 25 cm2

______ 5 ml
Para 1 garrafa 75 cm
______ 15 ml
2
Para 1 garrafa 150 cm ______ 30 ml
2

Tripsina [0,05%]
Para 1 garrafa 25 cm2 ______ 1 ml
Para 1 garrafa 75 cm2 ______ 3 ml
Para 1 garrafa 150 cm2 ______ 6 ml
Protocolo:
Troca de meio de cultura
1. No fluxo laminar, com o auxlio de uma pipeta graduada, retirar todo o meio de cultura
e desprezar em local apropriado. Descartar a pipeta.
2. Lavar a garrafa de cultura com PBS, e desprezar em local apropriado. Descartar a
pipeta.
3. Colocar o volume apropriado de meio de cultura de acordo com o tamanho da garrafa
e devolver a cultura estufa.
*Quando na estufa, a tampa da garrafa deve estar semiaberta para que haja a troca de
gases da garrafa para o meio.
4. Trocar o meio da cultura 2 vezes por semana, at as clulas ficarem confluentes.

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Tripsinizao
Quando a cultura atingir uma confluncia de ~80% as clulas precisam ser tripsinizadas
para que as clulas se soltem do fundo da garrafa e dessa forma seja possvel a expanso
das clulas ou extrao dos materiais necessrios.
1.
2.
3.
5.
6.

Com uma pipeta graduada, retirar o sobrenadante.

Lavar de 2 a 3 vezes com PBS e descartar.
Adicionar o volume de tripsina apropriado para a garrafa utilizada.
Colocar a garrafa na estufa por 3 min (Com a tampa semiaberta).
No microscpio, observar se as clulas desgrudaram bater levemente na lateral da
garrafa e observar novamente a soltura das clulas.
7. Adicionar meio completo para neutralizar a tripsina (o dobro do volume inicial de
tripsina).
8. Recolher todo o meio e transferi-lo para um tubo Falcon.
9. Centrifugar 1500 rpm por 15 min a 20-25C.
10. Descartar o sobrenadante.
11. Ressuspender o pellet com 1 ml de meio completo.
12. Pipetar uma alquota de 10 l e contar as clulas na cmara de Neubauer.
13. Pipetar o volume com a concentrao necessria para a extrao de miRNA.
Cmara de Neubauer

Uma das formas mais comuns de se obter uma estimativa do nmero de clulas
atravs da contagem ao microscpio, utilizando-se uma Cmara de Neubauer. A Cmara de
Neubauer uma lmina grossa de uso microscpico, com formato retangular e normalmente
de vidro, com uma depresso no centro, utilizada para fazer contagem de clulas por unidade
de volume de uma suspenso.
A rea total compreendida pelos 9 quadrantes de 9 mm2 sendo dividida em quadrados de
1 mm2 de rea. Ao ser colocada a lamnula de vidro (especial para ser usada na cmara de
Neubauer) a distncia da lamnula at a lmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite
se obter um volume de 0,1 mm3 em cada quadrante.
0,1 mm3 0,0001 cm3 0,0001 ml ou 10-4 ml

A porcentagem ou o nmero de clulas determinado transferindo-se com uma pipeta,
10l da amostra para a cmara de Neubauer. feita a contagem das clulas nos 4 quadrantes
das extremidades (Fig. 4). Ao final soma-se os valores encontrados e divide-se por 4, ou
elimina o maior e o menor valor, soma-se os outros 2 e divide por 2. O valor encontrado ser
X.104 por ml.

14

Curso de vero 2015

Figura 4. Cmara de Neubauer.

Extrao de miRNA - miRNeasy Mini kit

Consideraes:
* Tripsinizar e ressuspender 3.106 cls. em um vial (Axygen) com 1 ml de PBS.
* O reagente de lise QIAzol, deve estar a 4C. As demais solues e reagentes devem
estar temperatura ambiente.
Protocolo:
1. Centrifugar o vial com o pellet de clulas e 1ml de PBS. Retirar o sobrenadante com
a pipeta, e deixar um pouco de PBS para facilitar a dissolver o pellet antes da adio
do QIAzol.
2. Adicionar 700 l de QIAzol ao pellet, pipetar bem e vortexar para homogeneizar e lisar
as clulas.
3. Adicionar 140 l de clorofrmio ao lisado e agitar o vial vigorosamente por 15 seg.
4. Incubar por 2-3 min temperatura ambiente.
5. Centrifugar 12.000 g por 15 min a 4C.
* Aumentar a temperatura da centrfuga para os prximos passos temperatura
ambiente (15-25C).
* Aps a centrifugao, a amostra estar dividida em 3 fases: Uma superior, aquosa
e transparente que contem RNA; uma interfase branca; e uma inferior rosada que
contm DNA.
6. Transferir a parte superior aquosa (RNA) para um novo vial e adicionar 1 volume de
Etanol 70% (normalmente 350 l). Vortexar e seguir imediatamente para o prximo
passo.
7. Pipetar 700 l da amostra, incluindo qualquer precipitado que possa ter se formado,
uma coluna de miRNeasy acoplada ao tubo de coleta de 2 ml fornecido pelo kit.
Centrifugar 8.000 g por 15 seg em temperatura ambiente. * Repetir at toda a
amostra ter sido pipetada.

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Curso de vero 2015

8. Transferir o eludo para um novo vial e descartar a coluna.

9. Adicionar 450 l de Etanol 100% (0,65 vol) e vortexar. Seguir imediatamente para o
prximo passo.
10. Transferir 700 l da amostra uma nova coluna. Centrifugar 8.000 g por 15 seg.
Descartar o eludo. * Repetir at toda a amostra ter sido pipetada.
11. Adicionar 700 l de Tampo RWT na coluna e centrifugar 8.000 g por 15 seg.
Descartar o eludo.
12. Pipetar 500 l de Tampo RPE na coluna e centrifugar 8.000 g por 15 seg. Descartar
o eludo.
13. Adicionar 500 l de etanol 80% e centrifugar 8.000 g por 2 min. Descartar o tubo com
eludo.
14. Colocar a coluna em um novo vial e, com as tampas abertas, centrifugar 8.000 g por
5 min.
15. Transferir a coluna para um novo vial e pipetar 14 l de gua RNAse-free. Centrifugar
8.000 g por 1 min.
* Repetir este passo usando os mesmos 14 l que passaram na coluna.
16. Armazenar -80C.
Quantificao do miRNA
Consideraes
*Os ensaios do Qubit foram desenhados para serem realizados temperatura ambiente.
*Volume final em cada tudo deve ser de 200 l.
PREPARAO DO miRNA Qubit
1. Preparar uma soluo uso comum aos padres e amostras, com uma diluio de 1:200 de
Qubit miRNA reagent/ Qubit miRNA buffer.
2. Padres:
Identificar 2 tubos como padro 1 e 2.
Adicionar 190 l de soluo uso em cada tubo.
Adicionar 10 l de cada padro Qubit miRNA Standard em seu respectivo tubo.
* Vortexar de 2-3seg, evitando bolhas e centrifugar rapidamente.
Incubar temperatura ambiente por 2 minutos.
3. Amostras:
Adicionar soluo uso em cada tubo de amostra (199 l).
Adicionar a amostra nos tubos, considerando o volume final (1 l).
* Vortexar de 2-3 seg, evitando bolhas e centrifugar rapidamente.
Incubar temperatura ambiente por 2 minutos.
LEITURA DA QUANTIFICAO DO miRNA Qubit
1. Ligar o Qubit e, na tela inicial, selecionar a opo miRNA. A calibrao estar disponvel
automaticamente.
2. Inserir o tubo Padro 1, fechar a tampa e selecionar Read.
3. Repetir o procedimento com o Padro 2.
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4. Inserir cada tubo de amostras, fechar a tampa e selecionar Read.

5. Anotar os resultados dados pelo Qubit e fazer o clculo de concentrao.
CLCULO DE CONCENTRAO DO miRNA - Qubit
*Os valores dados pelo Qubit correspondem concentrao ps-diluio das amostras.
Sendo assim, necessrio calcular a concentrao original da amostra.
Concentrao original da amostra = Valor do Qubit x 200/X
Onde Valor do Qubit o resultado da fluorescncia em ug/mL, e X o volume de amostra
pipetado.
Reao de transcrio reversa de miRNA
Consideraes:
* Calcular previamente o volume de miRNA e de gua a ser utilizado.
* Manter o miRNA no gelo.
* Manter o Tampo 5x miScript HiSpec, o Mix 10x miScript Nucleics e a RNase-free
water em temperatura ambiente.
* Preparar todas as reaes no gelo para minimizar o risco de degradao do miRNA.
* No vortexar o miRNA ou qualquer um dos componentes do miScript II RT Kit.
* miScript Reverse Transcriptase Mix deve ser retirada do -20C somente no
momento em que for utilizada e retornar ao freezer imediatamente.
Componentes

Volumes

5x miScript HiSpec Buffer

4 l

10x miScript Nucleics Mix

2 l

RNase-free water

Varivel

miScript Reverse Transcriptase Mix

2 l

Template miRNA

Varivel

Volume Final

20l

Protocolo:
1. Verter os tubos para homogeneizar e dar um spin.
2. Adicionar os componentes da reao a um tubo, com exceo miScript Reverse
Transcriptase Mix. Homogeneizar com a pipeta e manter no gelo.
3. Adicionar o miRNA reao. Homogeneizar gentilmente, centrifugar e manter no gelo.
4. Adicionar o miScript Reverse Transcriptase Mix. Homogeneizar gentilmente, centrifugar
e manter no gelo.
5. Incubar no termociclador 37C por 60 min e depois 95C por 5 min para inativar a
enzima e colocar no gelo.
6. Diluir o cDNA em RNase-free water e seguir para o PCR.
Se for armazenar a reao, transferir o cDNA no diludo ao -20C ou o cDNA diluido
em alquotas.
17

Curso de vero 2015

PCR array de miRNA

PCR Array uma ferramenta mais eficiente na anlise da expresso de mltiplos genes
de forma conjunta, podendo ser customizados para conter um painel especfico, voltado para
uma pesquisa mais focada na busca de genes relevantes a uma doena ou uma determinada
via. Neste mesmo sentido, porm baseado nos princpios de transcrio reversa, o PCR
Array de miRNA utiliza cDNA de miRNAs extrados da amostra de interesse para verificar sua
expresso.
O miScript PCR System (Quiagen) possibilita uma deteco sensvel e especfica, bem
como a quantificao de miRNA usando SYBR Green real-time PCR, podendo ser utilizado
tanto na busca de miRNAs especficos quanto na anlise de miRNoma. Possui eficincia
mesmo com a utilizao de quantidades mnimas de miRNA (1ng de RNA total ou 0,1ng
de miRNA enriquecido), sendo assim ideal para quantificar de forma eficiente miRNAs de
linhagens celulares, tecidos, FFPE (tecidos fixados em formalina ou embebidos em parafina)
ou fluidos corporais de interesse.
O miScript miRNA PCR Array System, um conjunto de doze rotores com cem poos
que compreendem 1008 primers especficos para avaliao dos miRNA maduros, disponveis
para vrias espcies. O cDNA preparado serve como template para um PCR em tempo real
que utiliza um Primer Universal (Universal master mix). Cada Array contm vrios ensaios
controles, como: C. elegans miR-39 miScript primer (para dados de normalizao alternativa),
3 ensaios de primers de miRNA maduros (primers de expresso constitutiva), 6 PCR controles
de miScript snoRNA/snRNA (small RNAs) para normalizao de dados usando delta-delta-Ct
para quantificao relativa e ainda um controle positivo para avaliar a performance da PCR.
Consideraes:
* O PCR deve ter uma incubao inicial de 15 min a 95C para ativar o HotStarTaq
DNA Polymerase (included in 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix).
* Certifique-se de que a reao de sntese de cDNA de 20l, foi diluda corretamente.
* O padro de volume de reao do miScript miRNA PCR 100-well Rotor-Disc 20 l.
* No vortexar o miRNA ou qualquer um dos componentes do miScript SYBR
Green PCR Kit.
Componentes

Volumes
originais

Volumes Ajustados
20%

2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix

1100 l

I. 1320 l

10x miScript Universal Primer

220 l

II. 264 l

RNase-free water

780 l

III. 1026 l

Template cDNA

100 l

IV. 30 l

Volume total

2200 l

V. 2640 l

Protocolo:
1. Manter o cDNA; 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix; 10x miScript Universal
Primer; e RNase-free water em temperatura ambiente. Homogeneizar e centrifugar
as solues.
18

Curso de vero 2015

2. Preparar o mix de reao conforme a tabela. Homogeneizar gentilmente.

*Devido ao Hot start, no necessrio manter a reao no gelo.
3. Levar o tubo de mix ao QIAgility, onde a reao ser pipetada automaticamente ao
Rotor-Disc do PCR Array.
4. Delicadamente remover o miScript miRNA PCR Array da embalagem e encaix-lo da
maneira apropriada ao suporte do equipamento.
* Evitar contato com a parte inferior do rotor, por onde realizada a leitura do
procedimento.
5. Acionar o equipamento para que 20l de mix sejam adicionados a cada poo do RotorDisc miScript miRNA PCR Array.
* Ligar o selador Gene-Disc Heat Sealer na opo Removable Seal para que o
equipamento seja aquecido.
6. Depois que o mix for pipetado, delicadamente retirar o Rotor do suporte do QIAgility e
encaix-lo no suporte do Rotor-Gene Q.
7. Sobre o rotor, aplicar e destacar o filme selador de forma a ficar somente a rea
referente ao rotor, sem o crculo interno
8. Levar o rotor acoplado ao suporte seladora e cuidadosamente encaix-lo na parte
inferior do equipamento.
9. Pressionar a base vermelha da seladora, destravar o pino, soltar a base e aguardar o
apito.
10. Assim que o equipamento indicar, pressionar novamente a base vermelha da seladora
e com cuidado retirar o suporte com o rotor selado.
11. Transferir o Rotor ao suporte do Rotor-Gene Q e cuidadosamente encaixar o aro de
segurana.
12. Acoplar do Rotor devidamente travado ao encaixe do Rotor-Gene Q, fechar o
equipamento e dar incio ao PCR.
Anlise de expresso dos miRNAs:

Para a anlise dos dados gerados pelo miScript miRNA PCR Array e
consequentemente avaliar a expresso dos miRNAs estudados, utilizado uma ferramenta
online miScript miRNA PCR Array Data Analysis, disponvel em http://www.sabiosciences.
com/mirnaArrayDataAnalysis.php. A partir deste site possvel no s acessar a forma online
do software como tambm fazer o download de um template no Excel, o miScript miRNA
PCR Array Data Analysis Excel, que permite realizar a anlise offline. Neste caso o template
selecionado dever ser o 12 Plates per miRNome Arrays (MIXX-2##_12Plate). A partir dos
valores do threshold inseridos, ambos vo automaticamente realizar a quantificao, usando
o mtodo delta-delta-Ct para quantificao relativa, e a interpretao dos ensaios controles.
Os resultados so apresentados de diferentes formas, como tabelar, scatter plot, perfil
tridimensional e vulcano plot (quando as replicas estiverem includas).
Obteno do Threshold
O threshold uma linha horizontal determinada matematicamente pelo programas
de anlise da qPCR no ponto onde existe o maior coeficiente de correlao da CP, que
geralmente ocorre na fase exponencial da amplificao. Alm disso, o threshold exclui o rudo
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Curso de vero 2015

da captao do sinal. O nmero do ciclo que cruza com o threshold chamado de Ct (cycle
threshold) e este ser o dado de entrada para todas as anlises de qPCR.

Para obter os valores de threshold necessrio abrir a corrida de interesse e selecionar
todas as amostras. Para o Rotor-Gene Q recomendado um valor de threshold de 0,02, e
uma vez definida a linha de threshold, os valores devem ser exportados em planilha.
Insero dos dados no miScript miRNA PCR Array Data Analysis Excel

Considerando que os dados so exportados em arquivo .csv, necessrio fazer a
converso para planilha do excel em formato .xls. Na planilha, preciso que haja uma coluna
com os nmeros dos poos e outra coluna com os valores de Ct. A partir dessa planilha j
possvel fazer o input dos dados no template do software.
1. Inserir o nmero de catlogo MIHS-216ZR na clula B1 da aba Gene Table.
2. Clicar no link Open Gene Table in Web Browser na clula C1.
3. Copiar a tabela de genes do miScript miRNA PCR utilizado e colar na coluna amarela
da aba Gene Table.
4. Selecionar o formato R na clula F3.
5. O Cutoff do Ct para o formato Rotor-Disc 33.
6. Copiar e colar os valores de Ct das amostras para a coluna amarela da aba Test
Sample Data.
7. Fazer o mesmo para os valores de Ct do controle na aba Control Sample Data.
8. Digite a posio dos poos dos genes housekeeping para normalizao na coluna
amarela C da aba Choose Housekeeping Genes. Neste caso usaremos os poos de
H03-H08 com os genes SNORD61; SNORD68; SNORD72; SNORD95; SNORD96A e
RNU6-2.
Os resultados estaro disponveis a partir da aba Results
Insero dos valores de fold change no Metacore
Para realizar a anlise in silico no software Metacore, necessrio preparar um input
dos dados numa planilha do Excel, contendo apenas 2 colunas. Uma coluna com a lista dos
miRNAs diferencialmente expressos com um cut off de 2 fold change, denominada miRBase
id e outra coluna denominada Fold Change com os valores encontrados na coluna J - Fold
Up- or Down-Regulation na aba Results do miScript miRNA PCR Array Data Analysis Excel
ANLISE IN SILICO
METACORE

uma plataforma online para anlises de biologia de sistemas que proporciona a
visualizao direta dos dados experimentais em um contexto de processos funcionais, vias
ou redes de interao, com base nas descries de processos moleculares j descritos na
literatura.
1. Entrar no portal: http://portal.genego.com/;
2. Efetuar login e senha;
3. Pagina inicial;
20

Curso de vero 2015

4. Adicionar sua lista ao programa;

5. Anlise dos resultados

21

Curso de vero 2015

SCREENING DOS RESULTADOS POR PCR EM TEMPO REAL

Com a proposta de avaliar os resultados da anlise in silico, com os dados obtidos
atravs do PCR Array, utilizaremos a tcnica de PCR Quantitativo em Tempo Real (qPCR, do
ingls, quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction). Para isso, seguiremos as etapas
descritas abaixo.
PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL

A tcnica de qPCR considerada uma das mais precisas e sensveis para avaliao
da expresso gnica. Enquanto o PCR convencional determina a presena e a ausncia
de um produto ao final da reao, o qPCR capaz de identificar pequenas diferenas de
expresso entre as amostras e a quantificao ocorre simultaneamente amplificao, por
isso, d-se o nome de tempo real. Alm da expresso gnica, a qPCR pode ser utilizada
para responder perguntas envolvendo SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), metilao
de promotores, carga viral, expresso de RNAs, e no nosso caso a expresso de miRNAs. Da
mesma forma, a qPCR indicada para validar resultados de metodologias em larga escala
(em ingls, high-throughput), que a proposta aplicada neste curso.

Uma tpica amplificao de qPCR possui uma fase basal, uma exponencial e um plat
(Fig. 5). A fase basal aquela em que os reagentes esto em excesso e no h deteco
suficiente de fluorescncia para anlise. A fase exponencial a etapa da curva onde o produto
do PCR dobra a cada ciclo. E o plat definido como o momento em que no h produtos
sendo sintetizados devido escassez dos reagentes.

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Curso de vero 2015

Figura 5. Fases da reao de PCR: fase basal, fase exponencial e plat. O eixo das ordenadas
representa o sinal de fluorescncia adquirido. O eixo das abscissa representa o nmeros de ciclos da
reao.

Como mencionado, a qPCR quantifica dos produtos da PCR, enquanto a amplificao
acontece. Para isso, so necessrios reagentes fluorescentes, a fim de medir a quantidade
de produtos gerados ao final de cada ciclo, e um sistema ptico acoplado a um termociclador.
Os reagentes fluorescentes podem ser tanto especficos a uma sequncia ou no especficos
(agentes intercalantes). O reagente fluorescente intercalante mais comum o SYBR Green.
Durante a reao da PCR, os primers amplificaro as sequncias alvo e as molculas dos
agentes intercalantes ligaro dupla fita gerada e fluorescero a um comprimento de onda
() de 520 nm aps excitado a 480 nm (Fig. 6). A fluorescncia aumenta proporcionalmente
a cada ciclo, por acmulo de SYBR Green ligado a fita-dupla de DNA. Dessa forma, a
quantidade de sinal detectado pelo sensor diretamente proporcional massa de produtos
amplificados.

Figura 6. Os primers hibridizam em uma sequncia especfica e complementar fita de DNA. A

polimerase estende a partir dos primers e incia a sntese da nova fita de DNA. Ento, o SYBR Green
intercala dupla fita e emite fluorescncia em um comprimento de onda especfico aps ser excitado.
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Curso de vero 2015

Uma das vantagens que os agentes intercalantes possuem a possibilidade de
conferir a especificidade do produto da reao por uma curva de dissociao (melting curve),
onde deve-se observar somente um pico nico de dissociao (Fig. 7). Nela os produtos
finais da PCR so submetidos a um aumento gradativo de temperatura e o pico representa a
temperatura onde houve a dissociao entre a molcula intercalante e o DNA. Cada produto
da PCR ou amplicon, possui uma temperatura especfica para se dissociar de fita-dupla para
fita-simples de DNA. Assim, podemos identificar a presena de amplificaes indesejadas,
tais como produtos inespecficos, dmeros de primer, contaminaes entre primers, etc.

Figura 7: Curva de dissociao (melting) da qPCR mostrando um pico nico, condio ideal, e um pico
inespecfico presente na amostra sem cDNA.

CONTROLES PARA A REAO DE qPCR

Os controles negativos e positivos so importantes indicadores de qualidade da
experimento realizado. O controle negativo que aqui destaco, a utilizao de um branco
de reao, que no contm cDNA (NTC, do ingls, no template control), juntamente com os
outros reagentes de uma reao padro. Isso favorece a identificao de dmeros de primer e
contaminaes com cDNAs externos. O controle positivo mais importante a utilizao de um
gene endgeno, que no apresente grandes variaes entre as amostras e que seja expresso
constitutivamente. Alm disso, esse gene poder ser usado como um normalizador para o
clculo ps-qPCR, como ser comentado adiante.

Antes de realizar os clculos comparativos entre as amostras e os experimentos,
importante avaliar a reao atravs da (I) curva-padro (CP), (II) do clculo da eficincia e
fazer a (III) determinao do threshold (Fig. 8).
I. A curva padro (CP) dever ser feita a partir de diluies seriadas de uma amostra que
sabidamente expresse o gene de estudo. Cada diluio servir como um padro. So
indicadas no mnimo 4 diluies de 10 magnitudes entre um padro e outro, formando 4 logs10.
II. Realizar o clculo de eficincia nos programas de anlise da qPCR, a fim de se obter
um coeficiente de correlao (r2) prximo a 1,0 e uma eficincia entre 90 a 110%, como
exemplificado na figura 7. Uma eficincia de 100% indica que os produtos da reao
esto dobrando a cada ciclo.
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Curso de vero 2015

III. O threshold uma linha horizontal determinada matematicamente pelo programas de

anlise da qPCR no ponto onde existe o maior coeficiente de correlao da CP, que
geralmente ocorre na fase exponencial da amplificao. Alm disso, o threshold exclui
o rudo da captao do sinal. O nmero do ciclo que cruza com o threshold chamado
de Ct (cycle threshold) e este ser o dado de entrada para todas as anlises de qPCR.

Figura 8. Curva-padro de uma amostra diluda em 4 logs10 utilizando primers para o gene TWIST1,
onde foi alcanada uma eficincia de 102% e um coeficiente de correlao de 0,997.

DESENHO DE INICIADORES (PRIMERS)

Uma etapa crucial para o sucesso da reao da PCR (Polymerase Chain Reaction) ou
Reao Polimerase em Cadeia, o desenho eficiente de primers, que necessitam de cuidados
especiais quanto ao tamanho, composio, especificidade, temperatura de melting etc.

Primers so sequncias iniciadoras compostas de cadeias curtas de nucleotdeos,
sintetizadas artificialmente, complementares s sequncias de interesse no DNA. Os primers
flaqueiam-se na sequncia alvo (DNA template ou molde, desnaturada) por complementaridade
de bases na regio inicial (primer forward) e final (primer reverse). O processo de sntese
iniciado aps o estabelecimento da ligao ou anelamento, onde enzimas do tipo polimerase
ligam-se ao grupo OH da extremidade do carbono C3` (necessrio para que a polimerase
se acople j que a sntese ocorre exclusivamente no sentido 5`--> 3`) do primer iniciando o
processo de sntese da fita complementar a partir do DNA molde. Essa etapa conhecida
como etapa de extenso.

Anteriormente os primers eram desenhados manualmente, hoje existem programas
on-line que desenham os primers levando em considerao os critrios importantes para
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Curso de vero 2015

a obteno de um bom primer, bem como prevem seu comportamento na reao (Tab1).
Esses critrios so:
Temperatura de melting T - temperatura na qual metade dos primers est anelada a fita
m
de DNA molde e a outra metade livre na soluo. Os dois primers (forward e reverse)
devem possuir T igual ou muito prximo para evitar problemas na reao.
m
Especficidade de Primer - A sequncia do primer deve ser escolhida de tal modo que
seja especfica apenas regio de interesse no DNA molde resultando na amplificao
exclusiva dessa regio. Primers no especficos podem amplificar mais de uma regio que
no a de interesse podendo gerar resultados falsos.
Tamanho de Primer - O tamanho do primer pode influenciar em sua especificidade. Quanto
maior o primer maior a especificidade e maior a fora de ligao com o template (devido ao
maior nmero de pontes de hidrognio na ligao). No entanto influenciam na formao
de estruturas secundrias que devem ser evitadas como hairpin e homo e heterodmero
(estruturas formadas pelo pareamento de primers devido a complementaridade de bases
dos mesmos).
%CG- o contedo das bases Citosina (C) e Guanina (G) determina a temperatura na qual
a reao de pareamento vai acontecer, pois o pareamento CG (3 pontes de hidrognio)
precisa de mais energia para acontecer do que o pareamento de AT ( 2 pontes de
hidrognio). Assim quanto maior o nmero de C e G maior a energia de ligao entre
primer e template. interessante que uma base C ou G esteja na regio 3` do primer, j
que o pareamento C-G mais estvel, o incio de sntese pelo pareamento da polimerase
ser mais eficiente.

Tabela 1. Caractersticas importantes para o desenho de pares de primers indicados para qPCR

* Temperatura em que a sequncia escolhida capaz de formar estruturas secundrias, como grampos de cabelo
(em ingls, hairpin); ** energia livre de Gibbs, relacionada espontaneidade da reao.

Protocolo:
1. Obter a sequncia dos RNAm no Emsembl (http://www.ensembl.org), preferir as
regies prximas da extremidade 3;
2. Procurar primers manualmente ou com ferramentas de bioinformtica, como IDT
PrimerQuest (http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index), priorizando aqueles
que anelarem em xons distintos para evitar a contaminao com DNA genmico;
3. Avaliar parmetros da tabela 1 atravs da ferramenta IDT OligoAnalyzer 3.1 (http://
www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/);
4. A temperatura de melting entre os dois primers no dever ter mais de 4C de diferena;

26

Curso de vero 2015

5. O primer consenso dever ser o reverso complementar, que poder ser feito pela
ferramenta Reverse Complement (http://www.bioinformatics.org/ sms/rev_comp);
6. Conferir a especificidade dos primers escolhidos ao gene de interesse pelo BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), procurando
da seguinte forma: primer1nnnnnn...primer2(reverso complementar).
SNTESE DE cDNA
TRATAMENTO COM DNAse

Para assegurar que o resultado da qPCR sobre o DNA codificante (cDNA) e
no possui contaminao com o DNA endgeno da amostra, realizaremos uma etapa de
digesto com DNAse antes das etapas subsequentes. A DNase I digere tanto DNA fita
simples (sDNA) quanto DNA fita dupla (dsDNA).
Protocolo:
Tubo 0,2 ml Nuclease-free
Deoxyribonuclease I, Amplification Grade - DNAse I (Invitrogen)
gua Nuclease-free
EDTA 25 mM, pH 8,0 (Invitrogen)
10X DNase I Reaction Buffer
Recomendaes: sempre usar luvas durante o procedimento, j que nossa pele, unhas,
cabelo contm RNase. Alm disso, todos os materiais utilizados devem ser livres desta
enzima (RNAse-free).
1. Adicionar em um tubo 0.2 ml RNase-free :
- 2 l g RNA
- 1 l 10X DNase I Reaction Buffer
- 0,5 l DNase I, Amp Grade, 1U/l
- gua Nuclease-free q.s.p. 9 l
2. Incubar temperatura ambiente por 15 min;
3. Inativar a DNase pela adio de 1 l de EDTA 25 mM em cada tubo;
4. Incubar por 10 min a 65C (no deixar passar deste tempo);
5. Colocar os tubos imediatamente no gelo (4C) por pelo menos 1 min;
Agora o RNA j est pronto para seguir para a reao de transcrio reversa.
TRANSCRIO REVERSA

A transcrio reversa (RT, do ingls reverse transcriptase) consiste na sntese de
DNA a partir de um molde de RNA. O DNA gerado a partir dessa reao chamado de
cDNA. Para esta reao so necessrios: o RNA a ser convertido; dNTPs, para constiturem
os nucleotdeos da fita sintetizada; iniciadores (em ingls, primers); a soluo tampo e a
enzima transcriptase reversa. Para uma comparao mais exata, cada amostra dever conter
a mesma quantidade inicial de RNA na reao de RT. Neste procedimento, os primers tm
a finalidade de se ligar ao RNA e direcionar a sntese da fita de DNA. Os primers podem
ser randmicos ou oligo (dT). Utilizaremos o segundo caso, j que estes hibridizam com as
cadeias poli(A) do RNA mensageiro (RNAm), sendo mais especficos aos RNAs de regies
codificantes.
27

Curso de vero 2015

Protocolo:
Tubo 0,2 ml RNase-free
5X Improm-II Reaction Buffer (Promega)
Enzima ImProm-II Reverse Transcriptase (Promega)
dNTP mix 10 mM (Qiagen)
Primer Oligo dT 500 g/ml (IDT)
MgCl2 25 mM (Promega)
RNaseOUTTM Enzyme 40U/l (Invitrogen)
1. Descongelar o tampo e manter os reagentes, com exceo das enzimas, temperatura
ambiente;
2. Colocar os seguintes componentes em cada tubo 0,2 ml:

3. Homogeneizar pipetando e centrifugar a amostra brevemente em centrfuga de

bancada;
4. Incubar no termociclador:
25C por 5 min
42C por 60 min
70C por 15 min
5. Armazenar o cDNA no freezer a 20C;
6. Antes da reao de PCR, importante diluir a amostra na concentrao desejada.
Partindo do princpio de que todas as molculas RNA foram convertidas em cDNA,
ento, teremos o material a uma concentrao de 100 ng/L (2g/20L);
7. Diluir a amostra 5x para manter o estoque a 20 ng/L.
PROTOCOLO DE PCR EM TEMPO REAL
Antes da avaliao dos genes de interesse, importante determinar a eficincia e
o threshold atravs de uma curva-prado. As curvas-padro dos genes estudados sero
construdas atravs da amplificao de 4 pontos (4 logs10) e cada um deles ser corrido em
triplicata. Aps obter resultados que validem a curva-padro, poderemos investigar os genes
do nosso estudo, tambm utilizando o protocolo a seguir:
MATERIAIS E REAGENTES
SYBR Green (AppliedBiosystems)
Primers
Tubo 0,2 ml RNase-free
Todas as amostras sero analisadas em triplicatas. Cada reao ser feita em volume final
de 10 l, contendo:
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Curso de vero 2015

1. Adicionar em cada tubo:

- 5,0 l de SYBR Green.
- 2,5 l de Mix de primers 2 M (senso e antisenso);
- 2,5 l de cDNA 20 ng/l
2. A ciclagem consiste em 4 etapas:
incubao inicial a 95C por 10 min, para a ativao da enzima;
desnaturao: 95C 30 s
anelamento: 62C 30 s
extenso: 72C 30 s
3. Aps a ciclagem, ser realizada a curva de melting, pelo aumento de temperatura de
1C a partir de 70C at 95C.

A reao de RT-qPCR ser feita no termociclador Rotor-Gene Q (Qiagen), os resultados
sero coletados pelo programa Rotor-Gene 6000 series Software v.1.7. e analisados no Excel
v.9 (Microsoft).
PROTOCOLO DO CLCULO DA DIFERENA DE EXPRESSO

A expresso gnica quantificada pelos nmeros de ciclos necessrios para que o
sinal do produto da amplificao alcance o threshold. Dessa forma, quanto mais material
amplificado, mais cedo o sinal encontrar o threshold, ou seja, menor ser o Ct. Para comparar
duas amostras que amplificaram um gene alvo em Cts diferentes, podemos utilizar dois
mtodos: o clculo absoluto ou o clculo relativo. O mtodo absoluto indica quantas cpias
do gene foram gerados em cada uma das amostras, mas para isso, necessria uma CP
utilizando uma amostra onde o nmero exato de cpias seja conhecido, como plasmdeos ou
amplicons. O mtodo relativo mostra quantas vezes uma amostra expressa mais o gene alvo
em relao outra. Nesse caso no necessrio fazer uma curva com o nmero conhecido
produtos de PCR, mas fundamental que as amplificaes tenham a mesma eficincia.
Normalizao
A normalizao permite a comparao entre amostras, uma vez que utiliza um controle
endgeno de variao para cada amostra. Permitindo com que valores diferentes sejam
matematicamente comparveis. Genes constitutivos so os mais indicados para servirem
como normalizadores e a escolha desses genes vai depender da espcie estudada, da origem
do material, do tipo de tecido, dentre outros parmetros.

So indicados no mnimo dois genes de normalizao, ou genes de referncia, para
cada experimento. Os melhores normalizadores sero aqueles que pouco variarem em
diferentes experimentos e que amplificarem em todas as amostras. A tabela 2 exemplifica
alguns dos genes normalizadores mais utilizados para amostras humanas. Ns utilizaremos
os genes ACTB e GAPDH em nossos experimentos.

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Curso de vero 2015

Tabela 2. Lista de genes de normalizao mais utilizados em amostras humanas.

GENE ID

Descrio

18S

18S ribosomal RNA

ACTB

actin, beta

B2M

beta-2-microglobulin

GAPDH

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

RPL0

ribosomal protein, large, P0

GUSB

glucuronidase, beta

TFRC

transferrin receptor

HPRT1

hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1

Clculo de variao da expresso pelo mtodo do 2-Ct

Livak e Schmittgen, em 2001 desenvolveram um clculo matemtico para mensurar
as alteraes de expresso gnica que baseia-se no seguinte princpio: o Ct do gene de
interesse diretamente normalizado com o Ct do gene de referncia utilizando a mesma
amostra. Com o Ct normalizado, a comparao entre diferentes amostras pode ser feita.
Este o clculo mais utilizado pelo mtodo relativo e aquele que aplicaremos em nossos
resultados. Para execut-lo, necessrio seguir os seguintes passos:
1. Determinar o threshold e a eficncia atravs da CP;
2. Anotar o Ct de cada reao no threshold indicado na etapa anterior;
3. Calcular a mdia dos Cts de cada triplicata feita para o experimento e o controle;
4. Efetuar trs equaes para obter a razo entre as amostras:
Equao 1: Ct = mdia Ct (gene alvo) - mdia Ct (gene normalizador)
Equao 2: Ct = Ct (experimento) - Ct (controle)
Equao 3: R = 2 -Ct

O resultado final informa quantas vezes (em ingls, fold-change) uma amostra est
aumentada ou diminuda em relao ao controle.

30

Curso de vero 2015

APNDICE ii - Cronograma
Segunda-feira
(02.02)

Tera-feira
(03.02)

Quara-feira
(04.02)

Quinta-feira
(05.02)

Sexta-feira
(06.02)

Visita guiada aos

laboratrios

Cultura de
clulas

Transcrio
Reversa

Extrao dos
resultados

Preparo do mix
e
PCR Array_1

Preparo do mix
e
PCR Array_2
Preparo do mix
e
PCR Array_3

Apresentao do
Extrao e
curso prtico
quantificao de
miRNA

Anlise no
software
Metacore

Segunda-feira
(09.02)

Tera-feira
(10.02)

Quarta-feira
(11.02)

Quinta-feira
(12.12)

Sexta-feira
(13.12)

Desenho de
primers

PCR em tempo
real

Discusso dos
resultados

Apresentao
dos trabalhos

Apresentao
dos trabalhos
e

Sntese de cDNA

Anlise dos

Preparao da

resultados

apresentao

Encerramento

31