Unidad 5.

Tcnicas de aislamiento de microorganismos

Prctica 7. Tcnicas de aislamiento de

microorganismos.
Objetivos

Explicar el fundamento de diferentes medios de cultivo y condiciones de incubacin
para el aislamiento de microorganismos con caractersticas especficas.

Aplicar diferentes tcnicas para el aislamiento de microorganismos.

Obtener y comprobar la pureza de los cultivos aislados

Aplicar una tcnica de conservacin de corto o mediano plazo a los cultivos puros
obtenidos.

Introduccin
En todos los ambientes naturales habitan mltiples microorganismos de diversos tipos y
actividad fisiolgica. Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario
separarlo de la poblacin mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean tcnicas de
aislamiento que conduzcan a la obtencin de un cultivo puro.
De manera general los mtodos de aislamiento incluyen:
1. Separacin fsica de los microorganismos mediante:
a) Diluciones seriadas y siembra por vertido en placa
b) Siembra por agotamiento
2. Utilizacin de medios de cultivo selectivos y diferenciales.
3. Aprovechamiento de caractersticas particulares de los microorganismos, tales como
la formacin de esporas, el metabolismo anaerobio y/ o facultativo, la capacidad
para utilizar sustratos poco comunes, etc.
Para facilitar el proceso de aislamiento y obtener mejores resultados, frecuentemente se
emplean combinaciones de las tcnicas anteriores.

1 sesin
Materiales

Por equipo
1 tripie
1 charola de metal
1 vaso de precipitados de 250 mL
1 varilla de vidrio en L
2 mecheros
1 gradilla
1 microscopio
1 juego de colorantes de Gram

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Material por grupo

2 balanzas granatarias
2 jarras de anaerobiosis
2 paquetes de Gas Pack

Medios de cultivo:
1 caja de Petri con TSA
1 caja de Petri con agar EMB
1 caja de Preti con MSA
1 caja de Petri con agar YPDM
1 con agar Sabouraud Rosa de Bengala ms estreptomicina.
2 cajas de Petri con agar anaerbico de Brewer

Material que deben tener los alumnos:
Muestra: lodo de la columna de Winogradski
3 tubos de 16 x 150 con 9.0mL de SSI
2 pipetas de 1.0mL estriles

Metodologa
a) Dilucin de la muestra
1. Pesar 1 g de lodo de la columna de Winogradsky y en condiciones aspticas vaciar
en un tubo con 9mL de SSI estril (Dilucin1).
2. Homogeneizar y a partir de esta suspensin preparar una dilucin decimal en el otro
tubo con SSI estril (Dilucin 2). A partir de esta dilucin realizar una tincin de Gram y
una preparacin en fresco.
b) Siembra por agotamiento
1. A partir de la primera dilucin y con el asa bacteriolgica sembrar por la tcnica de
cuadrante radial en cada una de las cajas Petri con los medios TSA, agar EMB y MSA.
2. Asegurar cada una de las cajas con maskin tape.
3. Incubar a 37C durante 24 horas.
c) Siembra por extendido en placa
1. A partir de la segunda dilucin, inocular 0.1mL con una pipeta estril en cada una
de las cajas de agar YMPD y agar Sabouraud Rosa de Bengala ms estreptomicina.
2. Extender la muestra en la superficie con una varilla esterilizada con alcohol y flama.
3. Asegurar cada una de las cajas con maskin tape.
4. Incubar a 28C durante 5 a 7 das.
d) Aislamiento de bacilos esporulados
1. Colocar el tubo con la segunda dilucin en un bao de agua a ebullicin y
mantenerlo durante 15 minutos.
2. Inocular 0.1mL con una pipeta estril en cada una de las cajas de agar anaerbico
de Brewer y extender la muestra en la superficie con una varilla esterilizada con
alcohol y flama.
3. Asegurar cada una de las cajas con maskin tape.
4. Incubar a 37C durante 48 horas, una de las cajas en condiciones aerbicas y la otra
en condiciones anaerbicas utilizando una jarra de anaerobiosis.

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Diagrama de flujo

1 gramo
de lodo

Tincin de
Gram y
preparacin
en fresco

1 mL

Dilucin 2

Dilucin 1
Columna de
Winogradsky
Inocular
con asa

0.1mL
TSA

Agar EMB

MSA

Ebullir
durante
15
minutos.
Agar Sabouraud
Rosa de
Bengala ms
estreptomicina

Agar
YMPD

Agar anaerbico
de Brewer

Aerobiosis

0.1mL

Anaerobiosis

Disposicin de desechos
1. Esterilizar los tubos en los que prepararon las diluciones y posteriormente lavarlos.
Preparar nuevamente los tubos con 9mL de SSI y esterilizar. Guardar en gaveta.
2. Regresar las pipetas a su envoltura y esterilizarlas, ya estriles lavarlas, y nuevamente
prepararlas para esterilizar. Guardar en la gaveta.

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2 sesin
Materiales

Por equipo
2 mecheros
1 microscopio
1 juego de colorantes de Gram

Medios de cultivo
1 caja de Petri con TSA
1 caja de Petri con agar EMB
1 caja de Preti con MSA
1 caja de Petri con agar YPDM

Metodologa
a) Desarrollo colonial en los diferentes medios de cultivo enriquecidos, selectivos y
diferenciales para bacterias.
En las placas con TSA, agar EMB y MSA proceda a:
1. Comparar la diversidad de las colonias desarrolladas en las cajas sembradas.
2. Fotografiar o dibujar cada caja y registrar en una tabla los tipos diferentes de colonias
bacterianas en cada uno de los medios de cultivo. Ejemplo:
Medio TSA
Colonia
Descripcin macroscpica (fecha) Descripcin microscpica (fecha)
1
2
3
3. Realizar una tincin de Gram solo a aquellas colonias que indique el profesor ya que
sern las seleccionadas para el aislamiento.
b) Aislamiento de bacterias Gram positivas
1. A partir del medio de TSA seleccionar de dos a cuatro colonias diferentes y realizar
una tincin de Gram (en un mismo portaobjetos). Para realizar la tincin es muy
importante tomar como mximo solo una tercera parte de la colonia, el resto de la
colonia ser empleada si la colonia es seleccionada para el aislamiento.
2. Si una o varias de las colonias seleccionadas corresponden microscpicamente a
bacterias Gram positivas, resembrar a partir de la misma colonia en la caja con TSA
nueva. Seguir instrucciones del profesor en cada caso para la resiembra.
3. Etiquetar como 2 aislamiento Bacterias G+ (1G+, 2G+, etc.)
4. En caso de que las colonias seleccionadas no correspondan a las bacterias
requeridas, seleccionar otras colonias y realizar la tincin de Gram.
5. Asegurar la caja con maskin tape e incubar a 37C durante 24 horas.
6. La caja con TSA del primer aislamiento deber ser refrigerada a 4C.

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c) Aislamiento de bacterias Gram negativas

1. A partir del medio de agar EMB seleccionar una o dos colonias que presenten un color
magenta intenso (lactosa positiva) y una o dos colonias que presenten un color rosa
claro o translcidas (lactosa negativa), y realizar una tincin de Gram (en un mismo
portaobjetos). Para realizar la tincin es muy importante tomar como mximo solo
una tercera parte de la colonia, el resto de la colonia ser empleada si la colonia es
seleccionada para el aislamiento.
2. De aquellas colonias que microscpicamente correspondan a bacterias Gram
negativas, resembrar a partir de la misma colonia de la cual se realiz la tincin, una
bacteria lactosa positiva y una bacteria lactosa negativa en una caja de agar EMB
nueva. Seguir instrucciones del profesor en cada caso para la resiembra.
3. Etiquetar como 2 aislamiento Bacterias G- (G-Lac+ y G-Lac-).
4. Asegurar la caja con maskin tape e incubar a 37C durante 24 horas.
5. La caja con agar EMB del primer aislamiento deber ser refrigerada a 4C.
d) Aislamiento de bacterias halotolerantes (Staphylococcus)
1. A partir del medio de MSA seleccionar una o dos colonias que viren el indicador a
color amarillo (manitol positivo) y una o dos colonias que viren el indicador a un color
rosa intenso (manitol negativo), y realizar una tincin de Gram (en un mismo
portaobjetos). Las colonias de Staphylococcus son pequeas de un dimetro
aproximado de 3mm, convexas de color blanquecino a amarillas. Para realizar la
tincin es muy importante tomar como mximo solo una tercera parte de la colonia,
el resto de la colonia ser empleada si la colonia es seleccionada para el aislamiento.
2. De aquellas colonias que microscpicamente correspondan a bacterias cocoides
Gram positivas, resembrar a partir de la misma colonia de la cual se realiz la tincin,
una bacteria manitol positiva y una bacteria manitol negativa en una caja de MSA
nueva. Seguir instrucciones del profesor en cada caso para la resiembra.
3. Etiquetar como 2 aislamiento Halotolerantes (Man+ y Man-).
4. Asegurar la caja con maskin tape e incubar a 37C durante 24 horas.
5. La caja con MSA del primer aislamiento deber ser refrigerada a 4C.
e) Aislamiento de bacterias esporuladas (aerobias y anaerobias)
En las placas con agar anaerbico de Brewer proceda a:
1. Comparar la diversidad de las colonias desarrolladas en las cajas sembradas.
2. Fotografiar o dibujar cada caja y registrar en una tabla los tipos diferentes de colonias
bacterianas en cada una de las condiciones.
3. Asegurar las cajas con maskin tape e incubar a 37C durante 4 das ms para
comprobar la formacin de esporas.

Disposicin de desechos
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios.
2. Despus de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solucin
sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un
frasco con alcohol al 95 %.
3. En el caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel,
esterilizar el paquete en autoclave y despus desecharlos en el contenedor de vidrio
roto.

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3 sesin
Materiales

Por equipo
2 asas micolgicas
1 tripie
1 charola de metal
1 vaso de precipitados de 250 mL
2 mecheros
1 microscopio
1 juego de colorantes de Gram

Por mesa
2 frascos de verde de malaquita 5%
1 frasco de safranina 0.5%
1 frasco con azul de algodn lactofenol

Metodologa
a) Continuacin del aislamiento de bacterias
1. Revisar cada una de las cajas con los segundos aislamientos y registrar los resultados
para cada tipo de bacterias.
2. Verificar pureza mediante la observacin macroscpica.
3. Con la asesora del profesor seleccionar una colonia para cada uno de los grupos
buscados.
4. Realizar una tincin de Gram para confirmar la morfologa microscpica y la pureza.
5. Resembrar en una caja de TSA (3er aislamiento) las tres colonias bacterianas.
6. Asegurar la caja con maskin tape e incubar a 37C durante 24 horas.
7. Las cajas del segundo aislamiento debern ser refrigeradas a 4C.
b) Aislamiento de bacterias esporuladas (aerobias y anaerobias)
1. Seleccionar de cada una de las cajas de agar anaerbico de Brewer dos colonias de
morfologa distinta segn las instrucciones del profesor.
2. Preparar un frotis (dos por portaobjetos) y realizar una tincin de esporas. Registrar los
resultados en cada una de las condiciones.
3. Desechar las cajas con agar anaerbico de Brewer.
c) Aislamiento de actinomicetos
1. Observar las caractersticas macroscpicas de las colonias desarrolladas en el agar
YPMD.
2. Fotografiar o dibujar y registrar en una tabla los tipos diferentes de colonias
bacterianas.
3. Seleccionar dos colonias que correspondan claramente a las caractersticas
coloniales de los actinomicetos (colonias secas, planas, de aspecto polvoso,
blanquecinas o pigmentadas) y preparar un frotis.

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4. Realizar una tincin de Gram y comprobar las caractersticas microscpicas

(bacterias filamentosas Gram positivas).
5. Seleccionar una de las colonias que correspondan a las caractersticas
macroscpicas y microscpicas de los actinomicetos y resembrar en otro medio de
agar YMPD. Etiquetar como 2 aislamiento de actinomicetos.
6. Asegurar la caja con masking tape e Incubar a 28C durante 48 horas.
7. La caja con agar YMPD del primer aislamiento deber ser refrigerada a 4C.
d) Aislamiento de hongos
1. Observar las caractersticas macroscpicas de las colonias desarrolladas en el agar
Sabouraud Rosa de Bengala ms estreptomicina.
2. Fotografiar o dibujar y registrar en una tabla los tipos diferentes de colonias.
Seleccionar dos colonias que correspondan a las caractersticas coloniales de los
hongos.
3. Realizar una impronta con azul de algodn lactofenol y comprobar las caractersticas
microscpicas. En caso de colonias de levaduras realizar una tincin de Gram.
4. Seleccionar dos de las colonias que correspondan a las caractersticas
macroscpicas y microscpicas de los hongos y resembrar en otros medio de agar
Sabouraud. Etiquetar como 2 aislamiento de hongos.
5. Asegurar la caja con masking tape e Incubar a 28C durante 48 horas.
6. La caja con agar Sabouraud Rosa de Bengala ms estreptomicina del primer
aislamiento deber ser refrigerada a 4C.

Disposicin de desechos
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios.
2. Despus de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solucin
sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un
frasco con alcohol al 95 %.
3. En el caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel,
esterilizar el paquete en autoclave y despus desecharlos en el contenedor de vidrio
roto.
4. Sellar con maskin tape las cajas de Petri que contengan los cultivos de bacterias
esporuladas y colocar en el contenedor.

4 sesin
Materiales

Por equipo:
2 mecheros
Microscopio
Reactivos para tincin de Gram
1 frasco con azul de algodn lactofenol
2 tubos de 13x100 con TSA inclinado

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Metodologa
a) Continuacin del aislamiento de bacterias
1. Revisar las cepas en el medio de TSA del 3er aislamiento. Corroborar la morfologa
colonial y verificar la pureza.
2. De ser necesario realizar una tincin de Gram para confirmar la morfologa
microscpica y la pureza.
b) Conservacin del cultivo puro
1. Una vez confirmada la pureza de las colonias, seleccionar dos cepas e inocular cada
una en un tubo con agar TSA inclinado y en los medios slidos en caja
proporcionados por el profesor. Incubar junto con los tubos a 37C durante 24 horas.
2. Al termino de la incubacin revisar el crecimiento y sellar los tubos con papel parafilm
y guardar en refrigeracin a 4C junto con las cajas del 3er aislamiento y los medios
slidos en placa de los cultivos puros seleccionados.
3. Los cultivos del primer y segundo aislamiento pueden ser entonces desechados.
c) Aislamiento de actinomicetos y de hongos
1. Revisar las morfologas macroscpicas y microscpicas de los aislamientos de
actinomicetos y hongos. Registrar los resultados.
2. De no haber crecimiento incubar nuevamente por tres das ms.
3. Desechar los medios del primer y segundo aislamiento.

Disposicin de desechos
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios.
2. Despus de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solucin
sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un
frasco con alcohol al 95 %.
3. En caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel,
esterilizar el paquete en autoclave y despus desecharlos en el contenedor de vidrio
roto.

Bibliografa complementaria

Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory manual.
7th edition. Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005

Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and
application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006.

Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition.
Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006

Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock Biologa de los microorganismos.
10 edicin, Prentice Hall Iberia. Espaa. QR41.2 B75318 2004.

Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6th edition.
McGraw-Hill. USA. QR41.2 P74 2005

Ramrez-Gama, R. M., B. Luna Milln, O. Velsquez Madrazo, L. Vierna Garca, A. Meja
Chvez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernndez Gmez, I. Mggenburg, A. Camacho Cruz y M
del C. Urza Hernndez. 2006. Manual de Prcticas de Microbiologa General. 5
edicin. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.

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Schaechter Moselio, Ingraham John L. and Neidhardt Frederick C. 2006. Microbe.

American Society for Microbiology. USA. QR41.2 S288

Tortora Gerard J., Funke Berdell R. and Case Christine L. 2007. Microbiology : an
introduction. 9th edition. Benjamin Cummings. USA. QR41.2 T67 2007

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