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FACULTAD DE MEDICINA
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRA EN CIENCIAS MDICAS
PRESENTA:
Atentamente,
UNIVERSIDAD DE COLIMA
Centro Universitario de Investigaciones Biomdicas
____________________________________
Dra. Elena Margarita Castro Rodrguez
Investigador Titular A
Centro Universitario de Investigaciones Biomdicas
Universidad de Colima
DEDICATORIAS
A mis padres Felipe y Mary a quien amo y admiro, porque gracias a ellos hoy estoy aqu, por transmitirme la bondad,
constancia y dedicacin. Por su apoyo y confianza, sin ustedes no hubiera podido cumplir mis metas, esta tesis tambin es su
premio.
A Francisco Rico por ser mi fuerza y soporte, por su enorme comprensin y paciencia, pero sobre todo por quererme
incondicionalmente. Gracias amor por impulsar mis sueos.
A mis hermanos Edgar, Alejandra, Felipe y Hctor, por estar conmigo en todo momento y brindarme de su optimismo y
entusiasmo, hacindome ver siempre el lado positivo de las cosas.
A mi cuada y sobrinos con mucho cario, porque me motivaron a seguir adelante.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Ruth De Celis Carrillo por todo lo que me ha enseado y la confianza que ha depositado en m; sus
consejos, calidad humana, as como su dedicacin han sido fundamentales para dar forma a este trabajo.
A la Dra. Elena Margarita Castro por su disponibilidad y contribucin a lo largo de la maestra.
A mis asesores: Dra. Claudia Beltrn, Dr. Luis Felipe Jave, Dr. Alejandro Bravo y al Dr. Marco Gonzlez
gracias por su dedicacin y apoyo a este proyecto.
A Vernica Preciado Martnez por compartir conmigo no slo conocimientos sino experiencias de vida, pero sobre
todo por permitirme contar con su valiosa amistad todo este tiempo, muchas gracias por escucharme y estar
siempre a mi lado.
A Lupita, Elena y Paola por su oportuna participacin y entusiasmo en este proyecto al hacer ms ameno y
agradable el trabajo diario.
A mis profesores de la Maestra en Ciencias Mdicas por sus conocimientos y experiencias brindadas.
NDICE
ndice de cuadros y figuras
Abreviaturas
Resumen
Summary
Introduccin
Antecedentes
Polimorfismo y mutacin
Citocromo p450
Gen CYP1A1
Gen CYP1B1
Txicos
Cncer de mama
Signos y sntomas del cncer de mama
Epidemiologa del cncer de mama
Factores de riesgo para cncer de mama
Justificacin
Planteamiento del problema
Pregunta de investigacin
Hiptesis
Objetivos
Objetivo general
Objetivos particulares
Material y Mtodos
Diseo de estudio
Universo de trabajo
Tamao de la muestra
Descripcin de grupos de estudio
Criterios de seleccin
Criterios de inclusin
Criterios de exclusin
Variables
Operacionalizacin de variables
Descripcin de las tcnicas
Extraccin de ADN
Integridad y pureza
Deteccin de polimorfismos
Amplificacin por PCR
Descripcin de enzimas de restriccin
Anlisis Estadsticos
Consideraciones ticas
Resultados
Discusin
Conclusiones
Perspectivas
Anexos
Anexo I. Carta de consentimiento informado
Referencias Bibliogrficas
1
2
3
5
5
6
8
8
9
11
13
13
15
19
19
19
20
20
20
20
21
21
21
21
22
22
22
22
23
23
24
24
28
32
34
35
36
36
37
43
47
49
51
53
55
6
7
8
11
37
38
38
39
42
42
CUADROS
Cuadro 1. Clasificacin del carcinoma mamario de acuerdo a la OMS
Cuadro 2. Principales causas de muerte en Mxico 2005-2030
Cuadro 3. Factores que incrementan el riesgo de cncer de mama
Cuadro 4. Estrategias de deteccin de los genes de la familia CYP1
Cuadro 5. Condiciones de reaccin para la PCR
Cuadro 6. Condiciones de reaccin para la digestin conenzimas
de restriccin
Cuadro 7. Frecuencias genotpicas de los polimorfismos Ile462Val
y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en grupo con
cncerde mama y de referencia
Cuadro 8. Frecuencias allicas de los polimorfismos Ile462Val y
Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en grupo
con cncer de mama y de referencia
Cuadro 9. Determinacin de equilibrio Hardy-Weinberg
Cuadro 10. Determinacin de Chi cuadrada y valor de P
12
14
17
31
32
40
40
41
41
ABREVIATURAS
C
A
ADN
AHH
Art
C
CIBO
CYP
dNTPs
EDTA
G
GST
gr
H
Ile
KCl
Leu
Lt
MgCl2
mg
mL
g
L
min
mM
M
ng
nm
NAT
NaCl
NH4Cl
NH4NCO3
O2
Pb
PCR
PAHs
RH
RFLPs
rpm
SDS
seg
T
Tris-HCl
TE
U
Val
Grados centgrados
Adenina
cido Desoxirribonucleico
Aryl hidrocarburos
Artculo
Citosina
Centro de Investigacin Biomdica de Occidente
Citocromo p450
Desoxinucletidos trifosfatados
cido etilendiaminotetraactico
Guanina
Glutatin-S-transferasas
Gramos
Horas
Isoleucina
Cloruro de Potasio
Leucina
Litros
Cloruro de Magnesio
Miligramo
Mililitros
Microgramo
Microlitros
Minutos
Milimolar
Molar
Nanogramos
Nabometros
N-acetiltransferasas
Cloruro de sodio
Cloruro de amonio
Bicarbonato de amonio
Oxgeno
Pares de bases
Reaccin en Cadena de la Polimerasa
Hidrocarburos aromticos policclicos
Sustrato orgnico
Fragmentos de restriccin polimrficos en longitud
Revoluciones por minuto
Dodecilsulfato sdico
Segundos
Timina
Tris-cido clorhdrico
Tris-EDTA
Unidades
Valina
RESUMEN
Introduccin. El citocromo p450 es responsable del metabolismo oxidativo de
los xenobiticos. Su expresin es regulada por variabilidad gentica,
fisiopatolgica
ambiental;
presenta
variabilidad
en
la
respuesta
SUMMARY
Background: Cytochrome p450 is responsible for the oxidative metabolism of
xenobiotics.
obtained from each patient, type was identified through polymorphism chain
reaction (PCR) using specific restriction enzymes CYP1A1 and CYP1B1 genes
and agarose gel electrophoresis.
Results. We studied a total of 151 peripheral blood samples (76 breast cancer
group, 75 control group). Chi square was used for statistical analysis. The
polymorphism Ile462Val presented was mainly the CYP1A1 gene in 51 samples
from breast cancer (67.1%) and 44 samples reference group (58.6%)
Leu432Val polymorphism unlike CYP1B1 gene, which was only present in 25
samples from breast cancer (32.9%) and 31 reference samples (41.3%).
Although the frequency of the variants of the genes studied was not
significantly different from that reported, we conclude that it was important to
identify because it may be feasible to consider in estimating the risk of
developing breast cancer and to contribute to the toxicity of certain information
substances.
Keywords:
Cytochrome
P450,
CYP1A1,
polymorphisms.
CYP1B1,
breast
cancer,
INTRODUCCIN
sistema
se
encuentra
compuesto
por
varias
subfamilias
ANTECEDENTES
Polimorfismo y mutacin
Citocromo p450
compaa de las enzimas fase II, entre las que se encuentran las glutation-Stransferasas (GST) y las N-acetiltransferasas (NAT). La mayor o menor
actividad de unas y otras tiene como consecuencia que las sustancias exgenas
que llegan a las clulas, resulten inocuas o tengan un efecto txico [2].
Por lo tanto, el citocromo p450 es el responsable de catalizar la
hidroxilacin de mltiples compuestos, as como del metabolismo de
xenobiticos entre los que se encuentran diversas drogas, alcaloides,
carcingenos, pesticidas e hidrocarburos aromticos policclicos (PAHs) [2, 18,
19].
El gen CYP 1A1 codifica para una enzima con actividad aryl-hidrocarburohidrolasa (AHH), que es inducible por ligandos de los receptores de arylhidrocarburos en casi todos los tejidos estudiados, entre los que se encuentran:
linfocitos, tejido pulmonar, glndulas mamarias y placenta. Hasta la fecha han
sido identificados diecinueve polimorfismos de este gen; uno de los ms
comunes es: CYP 1A1*2 el cual consiste en la sustitucin de isoleucina en el
codn 462 por valina (Ile462Val); se asocia con el incremento del riesgo de
distintos tipos de cncer: pulmn, mama, prstata y crvico uterino [11].
Por otra parte, el gen CYP 1B1(Fig. 3) constituye tambin una fraccin
importante del CYP extraheptico con expresin en casi todos los tejidos, como
son: rin, prstata, glndulas mamarias y ovarios. Est localizado en el
Txicos
La mayora de los txicos de uso frecuente son capaces de mutar al ADN
y transformar a las clulas hasta entidades totalmente extraas para el
organismo, pueden ejercer efecto estrognico sobre rganos o tejidos y pueden
causar inmunosupresin en los organismos [4].
Existe una larga lista de sustancias txicas, las cuales son consideradas
potencialmente peligrosas para la salud humana como son los hidrocarburos
aromticos policclicos (PAHs) un grupo de ms de cien sustancias qumicas
diferentes, formadas durante la combustin incompleta del carbn, el aceite, el
gas, la basura u otros compuestos orgnicos [24].
Desde hace mas de cinco dcadas los PAHs han sido el grupo de
compuestos que mayor inters ha despertado porque son empleados en
mltiples actividades y productos, por esa razn tienen una amplia distribucin
en el planeta, algunos son extremadamente txicos y la mayora son
qumicamente muy estables por lo tanto persisten en el ambiente por largos
perodos de tiempo y son bioacumulables tanto en alimentos como en tejido
adiposo de humanos y animales, de ah la importancia de su estudio [25,
26][4].
La exposicin a sustancias qumicas se lleva a cabo por la actividad
laboral de las personas [27], por la utilizacin o desecho de algunos productos
tales como: combustibles, lacas, pinturas, plsticos, hules, conservadores,
fumigantes, insecticidas, productos de limpieza, cosmticos y alimentos, entre
otros [25, 28, 29], y son pocas las personas que tienden a percibir que esta
exposicin a txicos es perjudicial para su salud [7-9]. Las principales formas
de ingreso al organismo es por inhalacin del aire contaminado; por el consumo
de alimentos con pesticidas; por el uso de frmacos y cosmticos, por el agua
para beber o absorcin drmica [30-32].
Los efectos de la exposicin a cualquier sustancia txica dependen de la dosis,
la duracin, la manera en que las personas estn expuestas, sus hbitos y
caractersticas genticas, as como de la presencia de otras sustancias qumicas
[33].
10
Cncer de mama
Es una enfermedad multifactorial dependiente de hormonas con una
clara relacin positiva a las altas concentraciones endgenas de estrgeno[34].
Representa una proliferacin maligna de clulas epiteliales que revisten los
conductos o lobulillos mamarios [35].
Fig. 4. Mamografa
11
Invasor
Clasificacin
Carcinoma lobulillar in situ
Carcinoma ductal in situ
Carcinoma ductal invasor no especfico (NST)
Carcinoma ductal invasor con extenso componente intraductal
Carcinoma ductal invasor con enfermedad de Pager
Carcinoma lobulillar invasor
Carcinoma medular
Carcinoma muscinoso o coloide
Carcinoma papilar
Carcinoma tubular
Carcinoma adenoide qustico
Carcinoma secretor (juvenil)
Carcinoma apcrifo
Carcinoma con metaplasma
Tipo escamoso
Tipo clulas fusiformes
Tipo cartilaginoso y seo
Tipo mixto
Carcinoma inflamatorio
12
14
exposicin
laboral
txicos
contaminadas[50].
15
residencia
en
reas
altamente
16
Factores confirmados
Edad incrementada
Regin geogrfica (EU y pases del Oeste)
Historia familiar de cncer de mama
Mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2
Mutaciones en otros genes de alta penetrancia (p53, ATM,
NBS1,LKB1)
Exposicin a radiacin ionizante (en la niez)
Historia de enfermedad de mama benigna
Edad tarda de menopausia (mayor de 54 aos)
Edad tarda de menopausia (mayor de 54 aos)
Edad temprana de menarca (menos de 12 aos)
Nuliparidad y edad avanzada en el primer embarazo a
trmino
Alta densidad en tejido mamario
Terapia de remplazo hormonal
Uso prolongado de anticonceptivos orales
Obesidad en mujeres post-menopusicas
Consumo de alcohol (una copa por da)
Estatura alta
Altos niveles de factor de crecimiento parecido a insulina 1
(IGF1)
Altos niveles de prolactina
Factores probables
Consumo de grasas altamente saturadas
Polimorfismos en genes de baja penetrancia
Alto status socioeconmico
Factores de riesgo de cncer de mama
Factores confirmados
Factores probables
17
Magnitud
de riesgo
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
+
+
+
++
+
+
+
+
Magnitud
de riesgo
++
++
++
++
++
++
++
++
++
+
JUSTIFICACIN
Si se considera que de los genes en p450 CYP 1A1 y CYP 1B1, codifican para
las enzimas involucradas en el metabolismo de ciertos txicos [2], resulta
importante conocer las frecuencias de los polimorfismos de estos genes en
mujeres con cncer de mama.
PREGUNTA DE INVESTIGACIN
Cul de lospolimorfismos que presentan los genes CYP 1A1 y 1B1 ser ms
frecuente en mujeres que han desarrollado cncer de mama?
19
HIPTESIS DE TRABAJO
Algunos de los polimorfismos que se presentan en los genes CYP 1A1 y 1B1,
entre ellos Ile462Val y Val432Leurespectivamente, estn asociados al cncer de
mama.
OBJETIVOS DE INVESTIGACIN
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVO PARTICULAR
Identificar y describir las frecuencias genotpicas y allicas para los
polimorfismos Ile462Val y Val432Leu, en los genes CYP 1A1 y CYP 1B1.
20
MATERIALES Y MTODOS
Diseo del estudio. Transversal.
Universo de trabajo
Mujeres con Cncer de Mama, que fueron pacientes de diferentes Hospitales o
Institutos, tales como la Unidad Mdica de Alta Especialidad No. 145 (UMAE);
Hospital de Especialidades; del Centro Mdico Nacional de Occidente del IMSS,
as como del Hospital Civil, Fray Antonio Alcalde en Guadalajara, Jalisco y del
Instituto de Ciruga Reconstructiva; ambos de la Secretara de Salud.
Tamao de Muestra
Se considero todas las muestras de sangre perifrica de pacientes con
diagnstico
de
cncer
de
mama
reciente
que
tuvieron
cncer,
21
poblacionales de los
CRITERIOS DE SELECCIN
Criterios de inclusin (pacientes)
Hospital
de
Gineco-obstetricia;
Instituto
de
Ciruga
Referencia:
Criterio de exclusin
Muestra de sangre insuficiente, sea perdida involuntariamente, se degrade o
contamine, antes o durante todos los procedimientos del anlisis molecular.
22
VARIABLES
Variable dependiente
Polimorfismos encontrados de los genes CYP1A1 Y CYP1B1.
Variable independiente
Como variable independiente se considerar el diagnstico de cncer de mama.
Cncer de mama: Proliferacin acelerada, desordenada y no controlada de
clulas con genes mutados, los cuales suprimen o estimulan la continuidad del
ciclo celular pertenecientes a distintos tejidos de una glndula mamaria.
Interrelacin
Naturaleza
Medicin
Anlisis
Nominal
Polimorfismos
Dependiente
Cualitativa
CYP1A1 (Ile462Val) y
Dicotmica
Chi
(ausente/presente)
cuadrada
CYP1B1 (Val432Leu)
Nominal
Cncer de mama
Independiente
Cualitativa
23
Dicotmica
Chi
(ausente/presente)
cuadrada
Macromtodo de Miller
Tipo de muestra: Sangre perifrica.
Reactivos Necesarios:
Solucin B
SDS
Proteinasa K
NaCl 6M
Etanol 100%
Etanol 70%
TE
24
Preparacin de reactivos
Solucin B Miller.
Sustancias. Mili
pH
Gramos
7.5
0.6055
moles
Tris base
10 mM
NaCl
40 mM
EDTA
2 mM
11.688
8.0
0.3722
SDS al 20%.
Pesar 5 gr. de SDS y disolver en 25mL de agua destilada.
25
Proteinasa K
Reactivo
Gramos
Proteinasa K
0.050
SDS
0.5
EDTA
0.0372
NaCl 6M
Pesar 35.1gr. de cloruro de sodio (NaCl) en 100 mL de agua destilada.
Etanol al 70%
Tomar 35 mL de etanol al 100% y aforar con 15 mL de agua destilada estril.
TE
Reactivo
Gramos
Tris base
0.0605
EDTA
0.0186
Pesar todo en ese orden, disolver y aforar a 50 mL con H2O destilada estril.
26
Equipo
Centrfuga refrigerada
Incubadora
Micro centrifuga
Congelador
Procedimiento
1.- Para obtener el botn se depositarn 10 mL de sangre perifrica con EDTA
ms solucin buffer de lisis hasta aforar los tubos a 35 mL.
2.-Refrigerar por 10 minutos.
3.-Centrifugar a 3900rpm durante 15 min. 4C.
4.-Decantar y lavar el botn con un poco de solucin de lisis con movimiento
circular, retirar el sobrenadante y
K,
Integridad y pureza
Mtodo Electroforesis en geles de Agarosa
Equipo y Materiales
Cmara para electroforesis horizontal
Cama o soporte para hacer geles
Plancha de calentamiento
Balanza Analtica
Fuente de poder
Peine para hanchura de pozos de 8 dientes
Matraz Erlenmeyer de 100 mL
Guantes
Reactivos
Agarosa
Bffer TBE 1X
Agua Bidestilada
Nota: El gel debe prepararse en el mismo bffer de corrimiento, para
proporcionar las mismas condiciones en el soporte (gel) y en la fase lquida. El
corrimiento se realiza a un voltaje moderado que puede ser de 65 V durante 30
min. (hasta que se separen los colorantes del bffer cargador o jugo azul) y 80
V durante 30 min, dependiendo tambin del tamao del fragmento y de la
cmara de electroforesis.
28
Procedimiento
1. Pesar 0.75 gr. de agarosa y agregar cuidadosamente a un matraz
Erlenmeyer de 150 mL con 50 mL de TBE 1X, a pH de 8.0. Se coloca
sobre la placa para calentar (o en el microondas), se espera a que
comience a hervir.
2. Se agita suavemente el matraz para diluir todos los residuos de
agarosa, hasta que la solucin quede cristalina.
3. Revisar el volumen de la agarosa disuelta y completar (aforar) a 100
mL con TBE 1X, mezclando suavemente por agitacin.
4. Lavar previamente el molde en que se vaciar el gel y la cmara de
electroforesis. Poner el molde en una tabla o mesa nivelada.
5. Esperar a que la temperatura llegue aproximadamente a 55 C para
as aplicar la agarosa en el molde, cuidando que no queden burbujas
en la matriz del gel.
6. Poner el peine y esperar a que gelifique completamente, para
despus remover el peine cuidando de no romper los bordes de los
pozos.
7. Colocar el gel en la cmara de electroforesis y adicionar TBE 1X a un
pH de 8.0 observando que el nivel del bffer este aproximadamente
0.5 1cm por encima de la superficie del gel.
8. Colocar las muestras de ADN (previamente mezcladas sobre un
parafilm con jugo azul) en los pozos del gel. La cantidad depender
del tamao de los pozos.
9. Conectar los cables de la fuente de poder. El voltaje debe estar en un
rango de 60 a 80 V. Recordar que el ADN tiene una migracin
andica: tiene carga negativa (-) y migrar hacia el ctodo (+) o polo
positivo.
Anotar condiciones de corrimiento para cada experimento particular.
29
(% [peso/volumen])
geles de agarosa
0.3
5-60
0.6
1-20
0.7
0.8-10
0.9
0.5-7
1.2
0.4-6
1.5
0.2-3
2.0
0.1-2
Reactivos
Solucin de bromuro de etidio
Agua bidestilada
Procedimiento
1. Colocar el gel en un envase plano (preferiblemente de vidrio) con 300
mL de solucin de bromuro de etidio en 300 mL de agua destilada por 515 min.
30
2. Pasar el gel a una charola con agua bidestilada por 1 2 min. Segn se
requiera.
3. Observar el gel con el ADN en el transiluminador de luz UV utilizando la
proteccin adecuada.
Procedimiento
1. Las
muestras
perfectamente
homogneas
se
bajan
en
la
microcentrfuga.
2. Encender en el espectro la lmpara de luz UV, si es computarizada
utilizar el programa para cidos nucleicos.
3. Ajustar con el blanco el espectro, midiendo 1000 L de agua bidestilada
o inyectable en la celdilla de cuarzo para el espectrofotmetro.
4. Rotular un tubo de 1.5 mL por cada muestra.
5. Colocar 995 L de agua MilliQ en cada tubo.
6. Adicionar 5 L de ADN a su tubo correspondiente.
7. Para cuantificar se coloca el contenido de cada tubo en la celdilla de
cuarzo, agitar perfectamente la solucin y leer la muestra.
31
Deteccin de polimorfismos
Para la deteccin de los polimorfismos se disearon protocolos de PCR/RFLP, la
descripcin de cada uno se muestra en el cuadro 3.
Gen
Polimorfismo
Iniciadores
T de
Producto
Enzima de
Corte de
alineamiento
amplificado
restriccin
Enzima
(C)
(pb)
(Ile462Val)
56
147
55
113
MspI
CGG
(Val432Leu)
AcuI
CTGAAG_N(16)
32
de
la
secuencia
GenBankhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank
para
obtenida
del
la
de
amplificacin
Concentracin
L por reaccin
500ng/L
Muestra DNA
1
Iniciador 1 (foward)
15 pmol/L
1.5
Iniciador 2 (reverse)
15 pmol/L
1.5
dNTPs
100nM
2
Bffer 10 x (Mg+)
1X
2.5
HO
cbp 25 L
16.5
Taq pol
0.5 U
0.2
Volumen total por
25
tubo
Cuadro 5. Condiciones de reaccin para la PCR.
*Mg+, mercurio
*Taq pol
Reactivos
Concentracin
L por reaccin
1X
Enzima de restriccin
1U
0.2
cbp 20 L
2.8
15
Agua
Producto amplificado
Volumen final
20
33
Condiciones
95 C/4min
95 C/10seg
60 C/30seg
72 C/1 1/2min
72 C/5min
Ciclos: 35
Paso 1.-Se preparar Mix1, en un tubo estril de 0.2 L (en hielo) de la
siguiente manera:
MIX1
Volmenes
cDNA
1.0 L
Primer 1
1.5 L
Primer 2
1.5 L
H2O
1.5 L
5.5 L
Paso 2.-Se preparar Mix2 cbp todas las relaciones del paso anterior en un tubo
de 2 ml estril (en hielo).
Paso 3.- Agregar 15.0 l de la Mix2 a cada tubo del paso 1 (trabajar en hielo)
Paso 4.-Homogenizar cada tubo y colocar en el termociclador.
34
MspI
Sitio de reconocimiento: C CGG
GCC G
Temperatura de reaccin: 37 C
Concentracin: 5 U/L46
AcuI
Sitio
de
reconocimiento:
CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN
35
...
...
Anlisis Estadstico
Se realiz conteo gnico para establecer frecuencias gnicas y
genotpicas y mediante la prueba de 2 de bondad de ajuste se calcul el
equilibrio
Hardy-Weinberg.
Las
frecuencias
de
los
genotipos
fueron
Consideraciones ticas
El protocolo de estudio fue elaborado de acuerdo con la Norma Oficial
Mexicana en materia de investigacin en humanos y de acuerdo con las normas
de biotica que establece al respecto en la Ley General de Salud de la
Repblica Mexicana haciendo hincapi en los artculos estipulados en el titulo
segundo captulo I (Art.13, 14, 15, 16). Conforme al artculo 17 el presente
proyecto se encuentra en la categora de investigacin con riesgo mnimo [55].
Durante todo el estudio, se observaran los lineamientos definidos en el tratado
de Helsinki y en las enmiendas realizadas a ste, en Tokio, en relacin con la
realizacin de investigacin en humanos [56].
36
RESULTADOS
Poblacin estudiada
Se captaron un total de 151 muestras de sangre perifrica que se
clasificaron en 76 casos (con cncer de mama) y 75 individuos de referencia
(poblacin
general)
para
establecer
parmetros
poblacionales
de
los
polimorfismos.
Anlisis Molecular
147 pb
Figura 5. Producto amplificado del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1. Gel de
agarosa al 1.5% teido con bromuro de etidio. El producto amplificado observado en todos los
carriles es de 147 pb, M: escalera de 100 pb.
37
Figura 6. Producto digerido del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1. Gel de agarosa al 1.5%
teido con bromuro de etidio. Se observan dos bandas de 90 y 61 pb. Genotipos en nmeros negros:
genotipo 1, Ile/Ile (carriles 1,3,5,6,7), genotipo 2, Ile/Val (carriles 2,4,8,9,10,11,13) y genotipo 3, Val/Val
(carril 12).
Figura 7. Producto amplificado del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1. Gel de agarosa al
1.5% teido con bromuro de etidio. El producto amplificado observado en todos los carriles es de 113 pb,
M: escalera de 100 pb.
38
Figura 8. Producto digerido del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1. Gel de agarosa al 1.5%
teido con bromuro de etidio. Genotipos en nmeros negros: genotipo 1, Leu/Leu (carril 1), genotipo 2,
Leu/Val (carriles 4,5) y genotipo 3, Val/Val (carril 3).
Anlisis estadstico
Mediante conteo gnico se realiz la determinacin de la frecuencia de
los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 en
mujeres con cncer de mama. Se determin la frecuencia de los polimorfismos
mencionados en poblacin en general (referencia) para determinar si los
genotipos
se
encontraban
en
equilibrio
Hardy-Weinberg,
ya
que
los
Polimorfismo
Ile462Val
Leu432Val
Genotipos
Ca mama
Referencia
Casos (porcentaje)
Casos (porcentaje)
AA
10 (19.60)
13 (29.54)
AG
18 (35.29)
11 (25)
GG
23 (45.09)
20 (45.45)
Total
51
44
GG
7 (28)
10 (32.25)
GC
10 (40)
12 (38.70)
CC
8 (32)
9 (29.03)
Total
25
31
Polimorfismo
Ile462Val
Leu432Val
Alelos
Ca mama
Referencia
Casos (porcentaje)
Casos (porcentaje)
37 (36.27)
29 (32.95)
65 (63.72)
59 (67.04)
Total
102
88
17 (34)
42 (67.74)
33 (66)
20(32.25)
Total
50
62
Cuadro 8. Frecuencia allica de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1
y CYP1B1, en grupo con cncer de mama y de referencia.
40
Polimorfismo
Ca mama
Referencia
Ile462Val
2=2.5851
2= 0.4084
P= 0.0582
P=0.4152
Leu432Val
=1.1918
2=1.8476
P=0.5494
P=0.3970
Polimorfismo
Ca mama
%
Referencia
%
Ile462Val
67.10
58.66
Leu432Val
32.89
41.33
2 = 0.47870634
P = 0.7921
2 = 0.67709214
P = 0.2785
Cuadro 10. Determinacin de chi cuadrada y valor de p en los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val
de los genes CYP1A1 y CYP1B1.
41
Figura 9. Frecuencias genotpicas y allicas del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1 en
grupo con cncer de mama y de referencia
Figura 10. Frecuencias genotpicas y allicas del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 en
el grupo con cncer de mama y grupo de referencia
42
DISCUSIN
En mujeres, el cncer de mama es una de las principales causas de muerte. La
complicacin ms frecuente es la invasin, la cual puede presentarse por un
gran nmero de factores entre los cuales estn un diagnstico tardo o errneo,
antecedentes familiares y la susceptibilidad personal hacia la metstasis. En la
bibliografa internacional numerosos estudios describen y clasifican los genes
que intervienen o participan en el cncer de mama. El presente estudio analiza
los genes que se asocian al incremento del riesgo de cncer de mama mediante
la identificacin de genotipos particulares. Los polimorfismos Ile462Val y
Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 respectivamente, no han sido
analizados en poblacin Mexicana, nicamente se han estudiado en poblacin
Caucsica y China pero con asociacin a otro tipo de cncer como el de
pulmn.
Existen varios factores que pueden alterar no slo la produccin, sino tambin
la exposicin a las hormonas endgenas, como la edad de la menarqua, edad
del primer embarazo a trmino, nmero de embarazos y la edad de la
menopausia, y muchos de estos factores tienen un efecto adicional en el riesgo
de desarrollar cncer de mama[5, 34, 57]. Por lo tanto, los genes implicados
en el metabolismo de las hormonas sexuales son candidatos a genes de
susceptibilidad para desarrollar cncer de mama.
Los genes que estn en la ruta de biosntesis de hormonas sexuales pueden
afectar la sntesis y el periodo de exposicin del estrgeno ms activo, el
estradiol. Los genes que se encuentran en esta va son los de la familia de
CYP.[45, 46]
En este estudio nosotros consideramos importante estudiar estos genes debido
a que muchos txicos ambientales tienen la capacidad de ingresar al organismo
y competir por el sitio activo del receptor a estrgeno con lo cual sin tener una
naturaleza de hormona, se comportan como tal y pueden ejercer algunas de las
43
funciones que se han descrito para las hormonas, en particular, para los
estrgenos, como son la capacidad de incrementar el ndice mittico en muchos
tipos de clulas, pero algunos txicos adicionalmente tambin pueden inducir
mutaciones e inmunosupresin[4, 58]. Por esta razn muchos hidrocarburos
han sido llamados xenoestrgenos y han sido asociados al incremento del
riesgo para desarrollar algunos tipos de tumores malignos, en especial aquellos
que son de tipo hormono-dependiente como es el cncer de mama o el de
prstata [29, 49, 58].
En particular la CYP1A1 es una enzima extraheptica. Su expresin
constitutiva es muy baja, pero es muy inducible por ligandos del receptor Ah
(hidrocarburos aromticos policclicos, dioxinas, humo del tabaco y otros
xenoestrgenos) por lo que la exposicin a estos compuestos aumenta de
forma significativa sus niveles en tejidos como el pulmn, la placenta, la
glndula mamaria o los linfocitos [10, 11, 59].
En otras poblaciones estudiadas anteriormente algunas de las variantes
polimrficas, se han relacionado con una mayor incidencia del cncer de
pulmn en algunos grupos de poblacin, sin embargo no haba evidencia de un
riesgo mayor de desarrollar cncer de mama entre las mujeres que
presentaban alguna de las variantes polimrficas de los genes CYP1A1 o
CYP1B1. [12, 20, 60]
Ningn reporte anterior demostr un aumento de riesgo de cncer de
mama asociado con algn polimorfismo en particular de estos genes. Sin
embargo, se public recientemente un meta-anlisis que inform de un OR de
0.91 (IC 95% 0.79, 1.04) asociado con la condicin de ser heterocigoto Asn/Ser
y un OR de 0.85 (95% IC 0,54, 1,34) asociado con la condicin de ser
homocigoto Ser/Ser para estos genes y un riesgo mayor para desarrollar cncer
de mama[23]. Esto es importante debido a algunas variantes polimrficas de
los genes CYP1A1 y CYP1B1 han mostrado ser funcionalmente ms eficientes
en su actividad cataltica para la conversin de estrgeno a 4-hidroxi-estrgeno
44
46
CONCLUSIONES
Los resultados del presente estudio indican una clara diferencia en la
frecuencia de los polimorfismos Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 casos de
mujeres con cncer de mama (67.1%) y en 44 muestras de la poblacin de
referencia (58.6%) a diferencia del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1
que se present slo en 25 casos de mujeres con cncer de mama (32.9%) y
en 31 de las muestras de referencia (41.3%). Siendo el polimorfismos del gen
CYP1A1 el que con mayor frecuencia se observ en el grupo con cncer de
mama, a diferencia del grupo tomado como referencia.
47
PERSPECTIVAS
La identificacin y estimacin de la frecuencia de los polimorfismos de los
genes de la familia CYP1, es importante
49
ANEXOS
____________________________
____________________________
_________________________
____________________________
______________________________
Investigador Responsable
Dra. Ruth De Celis Carrillo
53
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