Universidad Nacional del Santa

Laboratorio de Bioprocesos

E.A.P. Ing. Agroindustrial

Pre Informe N 02

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL

SANTA

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FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL
DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
TITULO:
DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR
POR LOTES
PROFESOR:
AUGUSTO CASTILLO CALDERON

GRUPO:
B-3
CURSO:
LABORATORIO DE BIOPROCESOS
ALUMNOS:

ESCOBEDO FLORES ALEX

JESUS GUTIERREZ DIANA
LPEZ ZAMORA MARILEYLA
MORALES CHORRES CYNTHIA
VALVERDE LPEZ EDISON

NVO CHIMBOTE, MAYO2016

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CONTENIDO
1
I.

OBJETIVOS:...........................................................................................................3
1.1.

Objetivos Generales:

1.2.

Objetivos Especficos:

II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:.................................................................4

2.1)

SOLIDO DE MANTENCION

2.2) Medio Activacin:

2.3) Medio para fermentacin:

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:.......................................12

1.

Preparacin medio solido del de mantencin

12

3.

Medio de activacin

13

4.

Medio de fermentacin

14

IV. CRONOGRAMA...................................................................................................15
V.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:...............................................................16

VI. ANEXOS:...............................................................................................................17
1)
Referencias de composicin de medio de mantencin, activacin y cultivo para
Pichia Stipitis NRRL Y-7124 para la produccin de etanol.
17
2)

Clculo de la velocidad de aireacin especfica: vvm

17

3)

Clculo del flujo de aireacin recomendado

19

4)

Formato del plan de muestreo y registro de datos

20

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DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR

POR LOTES
I.

OBJETIVOS:

I.1.

Objetivos Generales:
Disear y realizar una experiencia de fermentacin en cultivo
celular por lote de Pichia stipitis NRRL Y-7124 en un medio
simulado de hidrolizado de cascarilla de arroz, a fin de producir
etanol en condiciones de micro aireacin, midiendo el coeficiente
volumtrico de transferencia de oxgeno a distintas condiciones
de aireacin y agitacin.

I.2.

Objetivos Especficos:

Identificar y describir las partes, accesorios y geometra del

fermentador de laboratorio, conocimiento de su operacin,

esterilizacin, carga y descarga y toma de muestras.

Identificar en el fermentador los instrumentos de medicin y

control automtico, as como la calibracin de los sensores.

Activacin celular y desarrollo del inoculo.
Puesta en marcha del cultivo por lote CL. En el cultivo por lote
determinar max y Y x/s. Asimismo determinar el Kla por el

mtodo dinmico de Humphry y correlacionar los resultados.

Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono, oxgeno
disuelto y pH despus del tiempo total de fermentacin en el
biorreactor.

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II.

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METODOLOGIA EXPERIMENTAL:

Tabla 1: Referencia de composicin de medios de mantencin,

activacin y cultivo para Pichia stipitis Y- 7124
TABLA N01
MEDIO
Solido de mantencin

Activacin

Fermentacin

NUTRIENTE
Extracto de levadura

CONCENTRACION (g/l)
3

Peptona

Extracto de malta

Agar
Glucosa

20
5

Extracto de levadura.

Extracto de malta

Solucin de sales

5 ml/L

N = 220 rpm
Glucosa

10

Xilosa

Extracto de levadura

KH2PO4

(NH4)2SO4

MgSO4.7H2O

1.1

Solucin de sales

5 ml/L

Tampn citrato

100ml/L

Ph 4.5 0.04M

2.1)

SOLIDO DE MANTENCION

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Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de composicin de

medios de cultivo de mantencin para Pichia stipitis Y- 7124.
Luego de acuerdo a la tabla N 1 se pesan las cantidades
requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado.

MEDIR

En una probeta graduada de 50

ml de agua destilada.

Adicionando agua destilada.

MEZCLAR

CALENTAR
Adicionar 6 ml de mezcla a cada
tubo
PREPARAR

COLOCAR

CALENTAR

AJUSTAR

Todos los componentes

en
un
matraz
Erlenmeyer
Con el mechero de bunsen la
mezcla disuelta en el matraz,
agitando con una varilla de vidrio,
hasta aparicin de la primera
burbuja, a partir de lo cual se
controla de a 1 a 2 min.
8 tubos de ensayo con tapa y en
caliente,
inmediatamente
taparlos.
Los tubos en un vaso precipitado, y
llevarlos a la olla a presin,
previamente aflojado las tapas,
para permitir el intercambio de
gases.
Hasta que la temperatura alcance
los 121C y a partir de ello
controlar de 15 a 20 minutos.
Finalizando la esterilizacin.
Las tapas de los tubos, luego
colocarlos en posicin inclinada y
dejarlos a temperatura ambiente.

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Luego preparamos nuestra rea de trabajo, desinfectando con alcohol.

para tener un rea estril prendemos el mechero cinco minutos antes de
realizar la resiembra con el Pichia stipitis Y- 7124

Los tubos de ensayo cerca del mechero de

bunsen,
flameando
para
evitar
la
contaminacin,
teniendo
la
aza
bacteriolgica calentando al rojo vivo.

ABRIR

2 a 3 azadas y colocamos en el tubo

con agar, flameamos y cerramos el
tubo y as los 8 tubos con agar.

SACAR
2.2) Medio Activacin:

TABLA 02: Concentracin de Nutrientes para el medio de activacin

(15 ml y 100ml)
Nutriente

Concentracin

Peso

(g/L)

15ml

100ml

Glucosa

(gr)
0.075

(gr)
0.5

Extracto de levadura

0.045

0.3

Extracto de malta

0.075

0.5

Solucin de sales

5 ml/L

0.075

0.5

- Peso

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DIAAGRAMA N1 preparacin de medio de activacin

Todos los
nutrientes

Matraz Erlenmeyer de
125 ml

MEDIR
PESAR

En
cada
tubo
y
adicionar
agua
para
disolver

COLOCAR
ESTERELIZAR

EL pH 6.0

MEDIR

En un mechero de Bunsen
la mezcla para evitar
contaminacin
Constantemente
con
una
varilla
por
un
minuto (aparicin de la
primera burbuja)

CALENTAR
AGITAR

DIAGRAMA N 02 RESIEMBRA SOLIDO LIQUIDO

La
AGREGAMOS

INOCULAMOS
COLOCAMOS

En el matraz de 500ml
Tomamos una azada e
inoculamos en el matraz
con el medio de activacin
En el Shaker a T= 30 180 rpm

2.3) Medio para fermentacin:

TABLA 03: Concentracin de Nutrientes para el medio de fermentacin
(3000 ml)
nutriente
Glucosa

Concentracin 1L
10
8

Concentracin 3L
30

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Xilosa
Extracto de levadura
KH2PO4
(NH4)2SO4
MgSO4.7H2O
Solucin de sales
Tampn citrato

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3
3
2
3
1.1
5 ml/L
100ml/L

9
9
6
9
3.3
15
300

Condiciones de asepsia
Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la tcnica asptica se utiliza
para prevenir la introduccin de organismos adicionales al cultivo.
1 Rotular el matraz con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre
del grupo (A).
2 Desinfectar el rea de trabajo utilizando alcohol 96
3 Encender el mechero Bunsen.
4 Sostener los matraces. Si los matraces tienen un tapn de
algodn, aflojar un poco de manera que no est muy apretado.
5 Flamear en el mechero Bunsen.
6 Retirar una tapa con el meique, mientras sostienes los matraces.
Nunca poner las tapas sobre la mesa.
7 Flamear la boca de ambos matraces para matar cualquier
microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la
parte superior durante las manipulaciones.
8 Los matraces abiertos deben mantenerse en posicin inclinada
para que el riesgo de contaminacin sea mnimo.
9 Sembrar en el matraz estril el inoculo.
10 De nuevo flamea las bocas de los matraces y tpalos de nuevo.
Asegrate de mezclar muy bien el inoculo en los matraces que
contienen el caldo sembrado.
11 Flamea los tapones antes de que los coloques en los matraces.
Preparacin de medio de fermentacin, segn la Tabla N .03. Para el
cultivo de Pichia stipitis Y- 7124
Materiales
Matraces
Espectrofotmetro
Varilla de vidrio
9

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Instrumentos e Equipos
Balanza analtica.
Biostato
Reactivos
Extracto de levadura
Glucosa-xilosa
(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4.7H2O

DIAGRAMA N03 preparacin de medio de fermentacin

Los componentes

PESAR

DILUIMOS

REGULAR

ESTERELIZAR

Cada componente con agua

destilada
- Extracto de levadura en un
matraz de 2L con agua
destilada
- (NH4)2 SO4 , KH2 PO4 ,
(MgSO4).7H2O
en
un

El pH de 4.5

Las disoluciones
separado

por

ENFRIAR
10
MEZCLAR
COLOCAMOS

El extracto
extracto de
de levaura
yacon y
adicionar el inoculo del
medio
de activacin
En el Shaker
a T= 30 -

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DIAGRAMA N: 04- Procedimiento para el fermentador en el medio de

fermentacin
CULTIVAMOS

Los 2L de medio de
fermentacin en el biostat
- Aplus

APLICAMOS

El
mtodo
Dinmico
durante 30 horas al caldo
de cultivo

OBSERVAR

En las primeras 10 horas

su crecimiento (KLa)

TOMAR

GRAFICAR

11

Lecturas de de oxgeno
disuelto a cada intervalo
(fase gasificada y fase de
corte aire)
En una hoja de Excel para
las grficas de regresin y
correlacin

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III.
MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
1. Preparacin medio solido del de mantencin
Materiales

Pipetas de 10 ml.
Tubos de ensayo

con tapas
Varilla de vidrio
Matraz Erlenmeyer

12

Probeta graduada
Mechero Bunsen
Esptula
Guantes.
Capachos de papel
Vaso de precipitado

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Instrumentos e Equipos

Balanza analtica
Olla a presin

Reactivos

Extracto de levadura.
Peptona.
Extracto de malta.
Agar
Glucosa

2. Resiembra celular

Materiales

Aza bacteriolgica

Tubo de ensayo con medio slido donde se

encuentra el M.O.

Mecheros.

Alcohol.

Instrumentos e Equipos

Incubadora

3. Medio de activacin

Materiales

Matraz de 125 ml.

Guantes

2 tubos de ensayo con tapa

Capachos de papel aluminio

Varilla de vidrio

Pipetas de 1, 5, y 10 ml

Pinzas, esptula.

Algodn ,gasa

Mechero Bunsen, trpode y

rejilla.

13

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Instrumentos e Equipo

Shaker

pH metro

Balanza analtica

Olla a presin

Reactivos
o Glucosa

o MgSO4.7H2O (sigma).

o Extracto de levadura

pH 4,5

o Extraxto de malta

T 30C, N 220 rpm.

o
o
o
o
o
o
o
o
4. Medio de fermentacin
o
Materiales

Matraz de Erlenmeyer

Espectrofotmetro.

Matraces.

Varilla de vidrio.

Instrumentos e Equipos

14

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Biostato

15

Balanza analtica.

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IV.

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CRONOGRAMA

16

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V.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?
Mostrar=quimicos
http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKitsC.pdf.
http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.sht
ml

QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniera Bioqumica.

17

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VI.

ANEXOS:

1) Referencias de composicin de medio de mantencin, activacin y cultivo

para Pichia Stipitis NRRL Y-7124 para la produccin de etanol.

18

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Medio

Slido
de
manten
cin

Nutriente

Concentra
cin (g/L)
3
5
3
20

Extracto de
levadura
Peptona
Extracto de
malta
Agar

Activac
in

Glucosa
Extracto de
levadura
Extracto de
malta
Solucin de
sales

Glucosa
Xilosa
Extracto de
levadura

( NH 4 )2 SO 4

Ferme
ntacin

5
3
5
5 m/L

N: 220 rpm

KH 2 PO 4
MgSO4 .7 H 4 O
Solucin de
sales
Tampn
citrato
pH 4.5
0.04M

19

10
3
3
3
2
1.1
5 mL/L
100 /L

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Fuente: A. Castillo. 1994. Tesis Magster PUCV

2) Clculo de la velocidad de aireacin especfica: vvm

vvm=2,035 x 104

NA x T

Donde:

NA: Velocidad de Consumo de Oxigeno

T: Temperatura en K

: Eficiencia de Absorcin

Los valores tpicos de vvm: Laboratorio: 0,5 2.0 vvm

Y o2=Rendimiento de oxigenoen celula

(0.52.0 g cel .) / g O2

DATOS A TENER EN CUENTA:

Consideramos:
o

Y o2=1

gr
gr

= 0.1 (Eficiencia de absorcin)

o mx = 0.4984 h-1

20

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Para determinar la biomasa producida X:

x=Y x ( s )

Rendimiento:

Y x=
s

x c . en la glucosa
=
( F)
s c . en la clula

F= 0.25: Factor de aireacin para condiciones

microarebias.

Calculamos el rendimiento:
Y x=

c .en la glucosa
40
( F ) =
( 0.25 )
c .en la clula
46.57

Y x =0.21473 g /g

Sustrato en el hidrolizado de cascarilla de arroz

S = 10 g/L de glucosa + 03 g/L de Xilosa

S = 13 g/L de sustrato total

Por lo tanto, calculamos la Biomasa generada (x):

x=Y x ( s )
s

x=2.791497 g /L

21

g
0.21473 g /

x=

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Entonces reemplazamos datos para calcular la demanda de

oxigeno (NA):

N A=

x
Y o2

Valores:
o

mx = 0.4984 h-1
Y o2=1

X =2.791497 g /L

gr
gr

Entonces:

( 0.4984 )( 2.791497 )
1

N A=

N A =1.39128 g O2 / L. h

Velocidad de aeracin especifica ( vvm ):

T =30 C=303 K

Frmula:
vvm=2,035 x 104

vvm=2, 035 x 104

(1.39128)(303)
0.1

NA x T

vvm=0.85787 h1

3) Clculo del flujo de aireacin recomendado

vvm= Q=vvmV
L

VL

Dnde:

Vvm = 0.85787 min-1

Volumen de fermentacin VL= 2 L

22

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( 0.857872 )=1.71574 LO2 /h

Q=

En minutos:

Q=0.028596
L O2 /min

Formato del plan de muestreo y registro de datos

CULTIVO CELULAR POR LOTESY MEDICIN DEL KLA

Plan de Muestreos y Registro de Datos

Grupo: __________________________________

Da: ___ /___ /

___

Microorganismos: ___________________________

Fuente Carbono: ____________________________

vacio

nes

4
0
n
m
)

23

Obser

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