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Director
Dr. Sc. JULIO CESAR CALVO
Director del Grupo de investigacin Proteoma Universidad Distrital
NOTA DE ACEPTACIN
Director
___________________________
Jurado
___________________________
Jurado
___________________________
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por brindarnos la fortaleza necesaria para afrontar las dificultades presentadas
en el camino.
A Nuestro Director de tesis el Doctor Julio Cesar Calvo Mozo, por el apoyo
incondicional durante esta investigacin.
Al profesor lvaro Granados, por su colaboracin.
Al grupo de extractos marinos de la Universidad Nacional de Colombia, especialmente
a Sandra Martnez.
Al profesor Cesar Segura, por sus enseanzas y su hospitalidad.
A todos aquellos que supieron brindar una palabra de aliento, de motivacin y de
esperanza en los momentos ms difciles.
DEDICATORIA
A mis padres: Flix Pez Manrique y Lucila Rincn Chacn, a quienes agradezco
infinitamente por brindarme la vida, todo el apoyo, cario y confianza necesarios para
poder soar y cumplir todas mis metas.
A mis hermanas, por respaldarme en todos y cada uno de los momentos difciles.
A mi sobrino, de quien espero mucho.
A Cristhel Moreno, por los momentos compartidos y sus palabras de aliento.
A mis padres Gonzalo Gonzlez y Mara Odalinda vila, a quienes les estoy
inmensamente agradecido por su apoyo incondicional para poder seguir adelante con la
realizacin de mis proyectos.
A Jessica, por su Amor incondicional.
A mi Hermano Gonzalo Gonzlez y a mi Hermana Cristina Gonzlez, por alentarme a
seguir adelante.
A Felipe Martnez Camacho, por brindarnos una sincera amistad.
CONTENIDO
Pg.
RESUMEN
14
INTRODUCCIN
15
17
2. JUSTIFICACIN
18
3. PREGUNTA PROBLEMA
19
4. OBJETIVOS
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20
20
5. MARCO TERICO
21
21
5.2. Pomplidos.
21
23
24
24
24
26
26
28
5.4.1. HPLC-RP.
28
28
28
28
29
29
30
30
30
31
6. MATERIALES Y MTODOS.
32
32
32
32
33
35
35
35
36
37
37
37
37
7. RESULTADOS.
38
38
39
41
41
43
46
46
8. DISCUSIN.
48
9. CONCLUSIONES.
53
10. SUGERENCIAS.
54
BIBLIOGRAFA.
ANEXO 1. Compuestos del anlisis LC/MS-MS, Software DataAnalysis in house
versin 5.3. Avispa - Pesis sp.
ANEXO 2. Base de datos pptidos reportados en Avispas (UniProt.org y EROPMoscow)
ANEXO 3. Tiempos de Retencion de Compuestos entre Ideal 45-85 minutos.
GLOSARIO
ACN: Acetonitrilo.
CI: Fuentes de ionizacin qumica.
CL/EM: Cromatografa lquida-espectrometra de masas.
DA: Dalton.
EI: Impacto de electrones.
EM: Espectrometra masa.
ESI: Ionizacin Electrospray.
ESI/MS: Ionizacin por electro nebulizacin.
FAB: Iones rpidos bombardeo.
FD: Fuentes de desorcin por campo.
FI: Fuentes de ionizacin por campo.
HPLC: Cromatografa liquida de alta resolucin.
ION TRAP: Trampa iones.
IT-MS: Analizador de trampa de iones.
KV: Kilo Voltios.
LC/MS-MS: Cromatografa liquida acoplada a masas en tndem.
MALDI: Desorcin lser asistida por matriz.
M/Z: Masa Carga.
NIST: Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa
PAM: Pptidos Anti Microbianos
PD: Desorcin por plasma.
PMTX: Pompilotoxina
RP: Fase reversa.
SIU: Centro de investigaciones universitaria.
NDICE DE TABLAS
Pg.
26
38
39
42
46
NDICE DE FIGURAS
Pg.
22
22
32
33
34
34
36
36
36
39
39
40
40
43
43
44
44
45
45
RESUMEN
El estudio del contenido peptdico del veneno de los himenpteros ha cobrado una
gran relevancia en las ltimas dcadas, se ha demostrado que dentro de dichos
complejos se pueden identificar diversas sustancias que tienen una actividad
biolgica importante; la gran mayora de investigaciones en el campo de la
bioqumica han mostrado que se puede reconocer un nmero importante de
sustancias activas entre las cuales se encuentran toxinas, antimicrobianos y
depresores del sistema nervioso.
14
INTRODUCCIN
El anlisis de los pptidos presentes en el veneno de los animales, sin duda ha sido
un gran campo para el desarrollo de tcnicas qumicas instrumentales en las cuales
se ha invertido mucho esfuerzo y dinero para realizar investigacin en bsqueda de
sustancias que por su actividad biolgica especifica puedan dar una utilidad al
hombre; inicialmente los estudios de composicin qumica de los venenos de
animales se centraban en la identificacin de las toxinas que contenan, para poder
reconocerlas y minimizar sus efectos; sin embargo, en esta bsqueda poco a poco
el hombre fue encontrando que adems de estas sustancias txicas, los venenos
eran ricos en diversos compuestos de actividad biolgica diversa. Es por ello que
en las ltimas dcadas se aumentan de manera estrepitosa los hallazgos de
pptidos con caractersticas interesantes desde el punto de vista mdico y
farmacolgico (Palma, 2006).
Una de las lneas de investigacin ms grande en esta materia, sin duda ha sido la
bsqueda de antimicrobianos, los cuales tienen una gran aplicabilidad
farmacolgica. Estos pptidos antimicrobianos se encuentran en todos los grupos
animales incluyendo a los humanos (Kastin, 2006), individuos como artrpodos e
insectos al no presentar sistemas inmunolgicos definidos, se caracterizan por
poseer una elevada cantidad de estos pptidos antimicrobianos de origen natural
(Cuadrado Cano, 2012; K. Konno et al., 2001; K. Konno et al., 2006; M. A. Mendes,
de Souza, & Palma, 2005; Montao-Prez & Vargas-Albores, 2002). Estos pptidos
en todos los insectos una vez fabricados son expresados en su cuerpo graso y son
repartidos a diversas zonas de su anatoma para protegerlos de ataques
bacterianos y de otros individuos (hongos, protozoos) (Raa, 1996).
El estudio del contenido peptdico del veneno de los himenpteros (abejas avispas y
hormigas), ha cobrado una gran relevancia en los ltimos aos; se ha demostrado
que dentro de dichos complejos se pueden identificar diversas sustancias que tienen
una actividad biolgica importante, principalmente sustancias con funcin
antimicrobiana (Monteiro, Romao, & Soares, 2009).
Las avispas solitarias han sido un grupo de individuos ampliamente analizado, tanto
en la bsqueda de pptidos con actividad biolgica como en potentes neurotoxinas.
Inicialmente se enfocaron las investigaciones en encontrar las sustancias del
veneno que eran capaces de paralizar por un tiempo extenso a las presas y se pudo
determinar que para la familia Pompilidae las sustancias responsables eran dos
toxinas las cuales se describieron como Pompilotoxina alfa y beta (Katsuhiro
Konno et al., 2000). Por otro lado, los estudios de purificacin por HPLC-RP
permitieron identificar pptidos antimicrobianos en familias como Scolidae,
Eumeninae, Polistinae y Pompilidae (Santos LD, 2011); la importancia de estos
pptidos antimicrobianos hallados radica en que han mostrado menor actividad de
hemolisis de eritrocitos en los estudios realizados en ratas. Dentro del grupo de los
insectos los pptidos antimicrobianos ms comunes son la Cabrolina y el
Mastoparn puesto que presentan un amplio espectro de accin frente a cientos de
15
cepas bacterianas; sin embargo, su actividad hemoltica era muy alta (K. Konno et
al., 2001) (K. Konno et al., 2006) logr demostrar que la Anoplina y Eumenitina
aisladas de avispas solitarias tienen una actividad de lisis de los eritrocitos mucho
menor e incluso Anoplina y Eumenitina mostraron una alta efectividad frente a
promastigotes de Leshmania (K. Konno et al., 2001) y Plasmodium sp. (Carter et al.,
2013).
Cabe resaltar que el veneno de las avispas solitarias es un gran complejo peptdico,
el cual posee actividades que permiten evitar que la presa de la avispa sea
colonizada por una gran variedad de bacterias y hongos, tambin se indica que
genera un aumento de la permeabilidad celular sin inducir la muerte celular a bajas
concentraciones y como conservantes a largo plazo de la presa, (Ji Hyeong Baek,
Ji, Shin, Lee, & Lee, 2011). Pptidos especficos como el Eumenitina de la avispa
eumenine puede desempear un papel en prevencin de la infeccin potencial por
microorganismos durante el consumo de presas por sus larvas (K. Konno et al.,
2006), investigaciones han demostrado que otros pptidos pueden conducir a
cambios de comportamiento de las presas como es el caso de la Avispa Ampulex
Compressa (Libersat, 2003). Hasta el momento la caracterizacin y purificacin de
pptidos de actividad biolgica especfica en diferentes individuos se desconoce, a
ciencia cierta el nmero de pptidos que estn presentes en el veneno de las
avispas solitarias en especial las pertenecientes a la familia Pompilidae (Yashad,
Dhananjaya, Rakesh Kumar, & Gopi, 2014).
16
El veneno de los Pomplidos es una fuente rica de pptidos con variadas actividades
biolgicas, debido a la naturaleza y al uso que la avispa le da al momento de la caza
(Coello 2000; K. Konno et al., 2001). Las investigaciones sobre el contenido
peptdico del veneno de este tipo avispas se ha centrado en la identificacin de uno
o un grupo de pptidos para cada especie; Se han aislado antimicrobianos,
citotxinas, miotxinas, entre otros (Ji Hyeong Baek et al., 2011). Estos estudios han
permitido aportar en la construccin de conocimiento y bsqueda de nuevas
alternativas de defensa biolgica frente al ataque de nuevos organismos patgenos;
sin embargo, se desconoce la complejidad desde el punto de vista peptdico que
puedan presentar estos venenos, puesto que en nuestro pas no existen estudios
que determinen el grupo de sustancias que los compone.
17
2. JUSTIFICACIN
18
3. PREGUNTA PROBLEMA
19
4. OBJETIVOS
20
5. MARCO TERICO
5.2. Pomplidos.
Una de las tcnicas de caza de este tipo de avispas es dar saltos cortos y carreras
rpidas en el piso haciendo vibrar sus antenas, logrando con esto un avanzada
exploracin del terreno y posteriormente la atencin de la araa. Tomndola por la
base de la coxa, plegara su abdomen ventralmente y as podr aguijonear a su
presa. En este momento empieza el desarrollo de una nueva avispa por medio de
una ovoposicin in-situ. Paralizada y vencida la araa es alimento de la nueva larva
que nacer poco tiempo despus. El transporte de la presa puede ocurrir a un sitio
determinado o la madriguera del Pompilido, para facilitar el transporte la avispa
amputa las patas de la araa en un comportamiento singular (Coello 2000). Estas
avispas tienen prevalencia por las araas del tipo Theraphosidae las cuales
posteriormente son sepultadas y abandonadas por la avispa. Un claro ejemplo de la
caza de la avispa se muestra en la siguiente imagen (Ver Figura 1).
21
cinereus (Cambra-Torok et al., 2004). Tres das ms tarde del parasitismo nace la
larva, perfora el tegumento y comienza a depredar el interior de la araa, mientras la
larva crece la araa se debilita y posteriormente muere, es aqu donde los pptidos
antimicrobianos surten un efecto de preservacin de la presa en va de
descomposicin (Konno et al., 2006). La pupacin se produce al interior de la
cmara en un capullo sedoso. La mayora de las especies pasa el invierno como
larva (Cambra-Torok et al., 2004); sin embargo, Anoplius viaticus lo pasa como
adulto, algunas especies poseen una sola generacin anual mientras otras pueden
tener mltiples generaciones al ao siendo multivoltinas frecuentemente se solapan
unas con otras (Coello 2000). Esta caracterstica particular de pasar de un estado
nectarvoro a predador y de larva carnvora a adulto nectarvoro posiblemente
influir en la variacin de pptidos representativos de cada individuo, sin dejar de
lado la familia y especie especfica a la cual pertenece el individuo, el tipo de
alimentacin y la posicin geogrfica donde se encuentran distribuidas, adems de
la variacin de los venenos segn el tipo de presas que depredan (Ji Hyeong Baek,
Ji, Shin, Lee, & Lee, 2011; Copperi, Pompozzi, Barneche, & Ferretti, 2011).
Pptido obtenidos
Anoplina
Eumenitina
Decoralina
Especie
Anoplius
samariensis
Eumenes
rubronotatus
Oreumenes
decoratus
Secuencia
Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-LysThr-Leu-Leu-NH2
LeuAsnLeuLysGly
IlePheLysLysValAla
SerLeuLeuThr
Ser-Leu-Leu-Ser-Leu-Ile-ArgLys-Leu-Ile-Thr
apertura de poros en la misma, esta accin se potencia cuando la porcin carboxiterminal se encuentra amidada (Dos Santos Cabrera et al., 2008). El Anoplin se ha
considerado como una interesante biomolcula que podra llegar a usarse en
tratamientos farmacolgicos.
-Eumenitina- R
-Eumenitina- F
-Emp-ER
-Emp_EF.
Decoralina: Es un pptido linear catinico compuesto por 11 aminocidos, Ser-LeuLeu-Ser-Leu-Ile-Arg-Lys-Leu-Ile-Thr. Este pptido fue aislado del veneno de la
avispa Oreumenes decoratus esta vez en Japn lo que da cuenta de la gran
diversidad de estos individuos que han logrado colonizar prcticamente todos los
hbitats. Las caractersticas que diferencian este compuesto de los otros pptidos
aislados anteriormente; es que este pptido no mostro una amidacin en el grupo
carboxi-terminal (Konno et al., 2007) y debido a esta conformacin la accin
antibacteriana es muy mnima a comparacin a muchos PAM, pero al sintetizar este
pptido en fase slida y adicionndole un grupo NH2 terminal la actividad de esta
sustancia fue mucho ms amplia que la Anoplina incluso frente a promastigotes de
Leshmania (Konno et al., 2007).
Costa Neto, Pino, & Ramos-Elorduy, 2006; Cuadrado Cano, 2012; Konno et al.,
2006). Se encuentra una variedad de pptidos similares en estructura y actividad
como los encontrados en Anoplius samariensis, Oreumenes decoratus, Eumenes
rubronotatus y Polybia paulista (Konno et al., 2001; Konno et al., 2006; Konno et al.,
2007; Ribeiro et al., 2004).
5.4.1. HPLC-RP.
29
Los iones de m/z circulan en una rbita estable dentro de la cavidad que est
rodeada por un anillo. Cuando el potencial de radiofrecuencia se aumenta, las
rbitas de los iones ms pesados llegan a estabilizarse, mientras que las de los
iones ms ligeros se desestabilizan, lo que causa colisiones. En un espectrmetro
de masas los iones quedan atrapados en el interior de la trampa mediante la
aplicacin de los voltajes y radiofrecuencias adecuados. Se sacando as los iones
que no interesan de la trampa y dejamos a estudio los iones que chocaran con el
He y as se hara se producira masas/masas (Corral, 2006).
Aplicaciones:
31
6. MATERIALES Y MTODOS
32
33
34
35
Para sistema de nano flujo nano HPLC se utiliz el chip de larga capacidad
150mm 300 A C18 chip w/ 160 nl de Agilent Tecnologies. (Ver Figura 9)
36
Se conform una listado con las masas moleculares de los pptidos reportados
para Avispas en las bases de datos online Uniprot.org y Erop- Moskow.
Posteriormente se realiz comparacin masa/masa entre los datos obtenidos y los
registrados en la base de datos.
Se determinaron los compuestos que tenan pesos moleculares entre 1000 y 3000
Dalton, los cuales posean una gran abundancia dentro del espectro, pero su masa
molecular no se relacionaba con ninguno de los pesos moleculares reportados en
avispas.
6.6. Masas obtenidas relacionadas con los pptidos reportados para la familia
Pompilidae.
Se identificaron las masas moleculares que tenan una alta concordancia con los
pesos moleculares de los pptidos reportados para la familia Pompilidae, con el fin
de establecer una relacin entre la composicin de sus venenos.
37
7. RESULTADOS
En base a las investigaciones de (K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010) se utiliz
el mismo gradiente lineal (Ver tabla 2), el rango de absorbancia utilizado fue el de
215 nanmetros el cual es el ideal para este tipo de anlisis (Andreu & Rivas,
1997b). Se realizaron varios ensayos y se pudo identificar un perfil cromatogrfico
(Ver figura 10) el cual se repeta en las diferentes corridas, este anlisis preliminar
del veneno de esta avispa en trminos generales muestra relacin con los datos
obtenidos en los estudios realizados para la identificacin de Decoralina y Anoplina.
Puesto que se puede observar que los picos de separacin importantes se
encuentran al iniciar cada corrida y al final de la misma, lo que indicara que la
separacin ocurre en un primer momento en el cual las condiciones de la fase mvil
son 95% de agua y 5% de acetonitrilo. El segundo grupo de picos aparece cuando
las condiciones de la fase mvil se acercan al final de gradiente es decir que su
separacin se da cuando hay una concentracin de acetonitrilo cercana al 65% y
35% de agua.
Este aspecto es muy importante puesto que los pptidos que se han aislado y
sintetizado tienen estas caractersticas y se han descrito sus tiempos de elucin
bajo estas condiciones (K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010).
Tiempo
H20+TFA
ACN
O min
95%
5%
5 min
95%
5%
15min
65%
35%
30min
35%
65%
38
Para este anlisis se estableci un mtodo para la separacin partiendo del mismo
gradiente que se us en el anlisis por cromatografa liquida en fase reversa, pero la
corrida se realiz de 120 minutos con el fin de permitir una mayor separacin y la
identificacin de masas.
Tiempo
H20+TFA
ACN
0
20
45
95%
95%
65%
5%
5%
35%
85
120
35%
5%
65%
95%
Los datos fueron analizados bajo los parmetros generales para pptidos que
establece el programa DataAnalysis y se analizaron masas de 200 a 2200 Dalton de
acuerdo al tipo de molcula y al marco de referencia de los pptidos reportados para
este tipo de organismos.
40
Los pptidos que tienen relacin con los datos obtenidos para el veneno son:
Anoplina, Eumenitina Fulvonina Bradiquinina Polistesquinina y pptido Polibia Cp. la
masa experimental registrada en cada una de estas sustancias tiene una alta
proximidad a nuestros datos; sin embargo, debido a que esta investigacin
constituye un anlisis preliminar al veneno de Pepsis sp. surge la imposibilidad de
purificar y secuenciar cada una de estas sustancias. Por tanto no podemos asegurar
que se trata directamente de estas sustancias hasta no realizar un anlisis ms
detallado de los compuestos que se presentan en el extracto del veneno.
41
Especie de Avispa
Avispa Solitaria (Anopilis samariensis )
1240,2
1239,7 ESI
Polybia-CP pptido
1243,7
1243,8 MALDI-TOF
Fulvonina
1359,3
1359,3 MALDI-TOF
Bradiquinina
1386,1
1385,7 MALDI-TOF
1623,2
1623 MALDI-TOF
Eumenitina-R
Publicacion/Autor.
Anoplin, a novel antimicrobial peptide from the venom of the
solitary wasp Anoplis samariensis. Konno K.
Structural and functional characterization of two novel peptide
toxins isolated from the venom of the social wasp Polybia paulista.
Souza BM.
Bradykinin-related peptides in the venom of the solitary wasp
Cyphononyx fulvognathus. Picolo G.
Identification of three novel peptides isolated from the venom
of the neotropical social wasp Polistes major major. Cerovsk V.
Waspkinins of some Japanese wasps (Vespidae, Hymenoptera).
Nakajima T.
Chemical and biological characterization of four new linear
cationic alpha-helical peptides from the venoms of two solitary
eumenine wasps. Rangel M.
42
Figura 14. Espectro de masas 1153.9 Da. Masa Observada. Compuesto 103 Tiempo
de retencin 67.8 min.
2.
M/z= 1240.2 Da.
Masa experimental reportada = 1139.7 Da
Diferencia= 0.4 Da
Figura 15. Espectro de masas 1240.2 Da. Masa Observada. Compuesto 142
Tiempo de retencin 86.7 min.
43
3.
M/z= 1243.7 Da.
Masa experimental reportada = 1243.8 Da
Diferencia= 0.1 Da
Figura 16. Espectro de masas 1243.7 Da. Masa Observada. Compuesto 144
Tiempo de retencin 88.0 min.
4.
M/z= 1359.3 Da.
Masa experimental reportada = 1359.3 Da
Diferencia= 0.0Da
Figura 17. Espectro de masas 1359.3 Da. Masa Observada. Compuesto 175
Tiempo de retencin 99.5 min.
44
5.
M/z= 1386.1 Da.
Masa experimental reportada = 1385.7 Da
Diferencia= 0.4Da
Figura 18. Espectro de masas 1386.1 Da. Masa Observada. Compuesto 181
Tiempo de retencin 102.4 min.
6.
M/z= 1623.2Da.
Masa experimental reportada = 1623.0 Da
Diferencia= 0.2 Da
E03806
P0DL32
P83660
E02618
E02619
Peptido
[Thr6]-Bradiquinina
Pptido Cd-125
Anoplina
Fulvonina
Pptido Cd-146
Alfa-Pompilidotxina
Beta-Pompilidotxina
46
Peso Mol.
1074
1026
1153,5
1244
1693
1529,9
1557,9
47
8. DISCUSION
Gracias a los mtodos de separacin especficos para pptidos utilizados y los anlisis
de LC/MS-MS se lograron identificar 6 pesos moleculares presentes en el veneno de
Pepsis sp., las cuales tienen una alta similitud con masas reportadas para pptidos
con actividad biolgica demostrada. Los datos obtenidos permitieron comparar las
masas observadas vs los pesos moleculares que se encuentran publicados en artculos
cientficos y bases de datos, se encontr en el anlisis una diferencia mnima de 0,1 Da.
entre pesos moleculares observados y pesos moleculares descritos en bases de datos,
nos lleva a inferir que puede llegar a tratarse del mismo compuesto. Teniendo en
cuenta que nos referimos a pptidos la variacin en la secuencia de aminocidos
mostrara una diferencia considerable en las masas moleculares (Andreu & Rivas,
1997a).
2006; Picolo et al., 2010; Santos LD, 2011). Adicional a esto, existe relacin de las
masas halladas con dos pptidos de funcin anloga en el pptido quimiotactico de
polybia y eumenitinina-R, estos pptidos presentan una funcin anloga a la Anoplina
siendo Eumenitina-R mucho ms parecido a la Anoplina, tanto en su estructura como
en su mecanismo de accin (Santos LD, 2011); mientras que el pptido CP- polybia
acta como antimicrobiano, pero tambin desempea funciones de regulador de
hemotaxis.
Si bien, no podemos dar total certeza de las relaciones que hemos establecido entre
nuestros datos experimentales y el anlisis de LC-MS/MS. Nuestros resultados aportan
un rango de fiabilidad bastante alto, pero es de aclarar que hasta que no se realice un
estudio donde se incluya una purificacin del pico representativo de cada pptido por
medio de HPLC y un anlisis de secuenciacin peptdica no es imposible afirmar con
certeza que este sea la composicin y por tanto el pptido que aqu en esta discusin
se menciona.
Nuestros anlisis de HPLC-RP permitieron obtener el perfil completo del
fraccionamiento del contenido del saco de veneno de Pepsis sp. cuyo cromatograma es
bastante similar al que se reporta para muchos pptidos como lo es Anoplina,
Decoralina, Eumenitina donde se observan siempre dos grupos de picos similares. El
segundo grupo de picos podra decirse que es donde se reduce la polaridad y aparecen
siempre de forma plausible un pptido con actividad biolgica especfica (K. Konno et
al., 2001; K. Konno et al., 2006; K. Konno et al., 2007). En ese orden de ideas los
tiempos de retencin que mostraron las masas que relacionamos con pptidos
antimicrobianos y quininas tienen un comportamiento similar lo que aporta ms
sustento a nuestros planteamientos.
para la elucin de pptidos con caractersticas similares a los que se han descrito para
las diferentes especies de avispas solitarias. Los datos preliminares que hemos
obtenido por medio de esta investigacin se ofrece un perfil general del comportamiento
del veneno pero en el anlisis de cromatografa liquida acoplada a masas con base a la
complejidad que mostr el contenido de la bolsa de veneno, consideramos pertinente
indicar que se deberan repetir corridas bajo los mismos parmetros que hemos usado
en la cromatografa liquida en fase reversa. Recoger los extractos y una vez obtenidos
realizarle el anlisis LC-MS/MS puesto que esto brindara confirmacin ms certera de
la presencia de pptidos con actividad biolgica especfica dentro del extracto del
veneno. Consideramos que las futuras investigaciones deben profundizar en el campo
de la identificacin de las secuencias de los espectros de masas hallados.
52
9. CONCLUSIONES
Se pudo establecer un perfil cromatogrfico completo del veneno de la avispa solitaria
Pepsis sp., se identificaron 250 posibles compuestos peptdicos de los cuales solo el
2.4 % evidenci alta similitud con pptidos ya descritos para avispas y tan solo dos de
las masas moleculares identificadas mostraron estrecha relacin con pptidos descritos
para la familia Pompilidae. Como posibles pptidos presentes en esta avispa se
relacionan tres pptidos de accin antimicrobiana Anoplina, Eumenitina-R y el pptido
chemotactico de Polibya sp. El resto de compuestos que mostraron semejanza
correspondera a neuropptidos de tipo quininas denominadas Bradiquinina,
Polistequinina y un coadyudante de estos Fluvonin. Ya que la gran mayora de masas
identificadas no se pudo asociar con ningn pptido reportado, se asume que la
complejidad de la composicin peptdica del veneno de esta avispa exige anlisis ms
puntuales entre los cuales el ms recomendable seria el estudio de las masas de los
compuestos previamente purificados y aislados. Los pptidos antimicrobianos de
origen animal que se encuentran en los venenos de las Avispas establecen criterios
para inferir que el extracto de veneno de la avispa solitaria Pepsis sp., posee pptidos
con actividad biolgica importante y se demuestra claramente en este estudio preliminar
la posible presencia de estas sustancias partiendo que es muy difcil en este tipo de
estudios que los pesos comparados varen uno del otro teniendo una diferencia tan
escasa en su masa y el anlisis cromatogrfico a 215 nm muestre un cromatograma tan
bueno en la separacin de estas sustancias y picos de inters como se muestran en los
dems estudios que sustentan estos planteamientos.
Los pptidos antimicrobianos de origen animal que se encuentran en los venenos de las
Avispas establecen criterios para inferir que el extracto de veneno de la avispa solitaria
Pepsis sp., posee pptidos con actividad biolgica importante y se demuestra
claramente en este estudio preliminar la posible presencia de estas sustancias
partiendo que es muy difcil en este tipo de estudios que los pesos comparados varen
uno del otro teniendo una diferencia tan escasa en su masa y el anlisis cromatogrfico
a 215 nm muestre un cromatograma tan bueno en la separacin de estas sustancias y
picos de inters como se muestran en los dems estudios que ostentan esta temtica.
53
10. SUGERENCIAS
Teniendo en cuenta que los estudios de la composicin del veneno de himenopteros y
especialmente en individuos de la familia Pompilidae son muy escasos en Colombia; en
un buen nmero de instituciones existe el equipamiento tecnolgico necesario para el
desarrollo de este tipo de investigaciones; por tanto, establecemos nuestra investigacin
como un punto de partida para esta lnea de investigacin de alto inters biolgico,
farmacolgico y biomdico.
54
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ANEXO 1. Compuestos del anlisis LC/MS-MS, Software DataAnalysis in house versin 5.3. Avispa - Pesis sp.
Compuesto m/z
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Compuesto m/z
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
Tiempo Ret
1392,1 76.7
1116,9 77.1
1243,7 77.3
1259,5 78.2
1105,3 78.5
1191,3 78.8
1280,2 79.2
1180,2 79.5
1204 79.8
1080,9 79.8
1115,4 80.3
1099,8 81.0
1099,8 81.0
1182,3 82.2
1182,3 82.4
1154,2 82.9
1345,6 83.7
1687,4 84.2
1214,2 85.8
1319,9 86.2
E00048
E00343
E03806
P0C005
E05430
P0C1R1
P69437
E06083
P0C1R0
P0DL32
E06091
P85870
E00651
P12797
E00472
P83659
E00713
P42718
E00143
E00469
E08520
P85875
E00191
E00482
E00395
P17237
P85873
E08519
E00483
E00470
P17235
E00471
E07842
E07844
P0CJ38
P0CJ39
E00241
E00411
P01514
E00394
E02084
P0C022
E02618
E06111
P69036
E00242
E02619
P69392
E07822
E05432
E06110
P69436
P69035
P84388
P42717
E05431
Peptido
Pptido Quimiotctico P-10 [1-6]
Pptido Cd-125
Pptide de Veneno, Cd-125
[Thr6]-Bradiquinina
Bradiquinina [G1]
Bradiquinina [A1]
Pptido Antimicrobiano, Anoplina
Anoplina (As-183)
Quimiotctico Pptido P-10
Protonectina
Protonectina (Pptido Quimiotctico)
Pptido Polybia-Quimiotctico
Pptido Polybia-Quimiotctico
Fulvonina
Decoralina
Decoralina
Bradiquinina-lys-ala [T6]
Megascoliaquinina
Bradiquinina Polistesquinina C
Cyphoquinina
Pptido Quimiotctico
Pptido Quimiotctico
Bradiquinina Polistesquinina-R
Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8]
Pptido de Veneno PPM3
Pptido de Veneno PPM3
Bradiquinina Vespaquinina X
Pptido Quimiotctico I-CP
Pptido Quimiotctico T
Pptido Quimiotctico (I-CP)
Quinina PMM1
Bradiquinina
Pptido Quimiotctico X
Bradiquinina Polistesquinina J [R2]
Pptido Quimiotctico L (VESCP-L) (Ves-CP-L)
Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8]
Antimicrobiano Pptido VESP-V1
Mastoparan-V1
Mastoparan-ER (EMP-ER) Eumenine
Mastoparan-EF (EMP-EF) Eumenine
Mastoparan
Mastoparan M
Mastoparan-L
Mastoparan T
Mastoparan-AF
Mastoparan-AF (EMP-AF) (Af-113) Eumenine
Alpha-Pompilotoxina
Protoplybia MP III
Mastoparan-3 (Mastoparan III) (MP-III)
Mastoparan X
Beta-Pompilotoxina
Beta-Pompilotoxina (Beta-PMTX)
Mastoparan PDD-B
Agelaia-MP
Protoplybia MP II
Agelaia-Mastoparan (Agelaia-MP)
Mastoparan-2 (Mastoparan II) (MP-II)
Polybine-1 (Polybine-I)
Waspquinina
Pptido Quimiotctico P-8
Organismo
Avispa Social (Agelaia pallipes pallipes )
Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis)
Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis )
Avispa (Cyphononyx fulvognathus)
Avispa (Polistes annularis Linnaeus )
Avispa
Avispa Solitaria (Anopilis samariensis )
Avispa Solitaria (Anoplius samariensis )
Avispa Social Neotrpical (Agelaia pallipes pallipes)
Avispa Brasilera (Protonectarina sylveirae )
Avispa Social Neotrpical (Agelaia pallipes pallipes)
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista)
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista)
Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis)
Avispa Alfarera (Oreumenes decoratus)
Avispa Alfarera (Oreumenes decoratus)
Avispa Solitaria (Megascolia flavifrons)
Avispa Solitaria (Megascolia flavifrons )
Avispa (Polistes chinensis )
Avispa Caza Araas (Cyphononyx fulvognathus)
Avispa (Parapolybia indica )
Avispa del Papel (Parapolybia indica)
Avispa (Polistes rothneyi )
Avispa de Papel (Polistes jadwigae )
Avispa Social Neotrpical (Polistes major)
Avispa Social Neotrpical (Polistes major )
Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera )
Avispa (Icaria sp )
Avispa (Vespa tropica )
Avispa (Icaria sp)
Avispa Social Neotrpical (Polistes major)
Avispa Social Neotrpical (Polistes major)
Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera )
Avispa del Papel (Polistes jadwigae )
Avispa (Vespula flaviceps lewisii )
Avispa de Papel (Polistes jadwigae)
Avispa Hong Kong (Vespa bivolor )
Avispa Hong Kong (Vespa bivolor )
Avispa Solitaria (Eumenes rubrofemoratus )
Avispa Solitaria (Eumenes fraterculus)
Avispa Chaqueta Amarilla (Vespula lewisii )
Avispa (Vespa mandarinia )
Avispa Chaqueta Amarilla (Vespula flaviceps lewisii )
Avispa (Vespa tropica )
Avispa (Anterhynchum flavomarginatum )
Avispa Solitaria (Anterhynchium flavomarginatum )
Avispa Solitaria (Anopilis samariensis )
Avispa Social Neotrpical (Protopolybia exigua)
AvispaSocial Neotrpical (Protopolybia exigua)
Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera )
Avispa Solitaria (Anopilis samariensis )
Avispa Solitaria (Batozonellus maculifrons )
Avispa de Papel (Polistes dorsalis )
Avispa Social Neotrpical (Agelaia pallipes pallipes)
Avispa Social Neotrpical (Protopolybia exigua)
Avispa Social Neotrpical (Agelaia pallipes pallipes)
Avispa Social Neotrpical (Protopolybia exigua)
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista)
Avispa de Papel (Parapolybia indica)
Avispa Brazil (Protonectarins sylveira )
Peso Mol
627,56
1.026
1026,1
1074
1117,2
1131,2
1153,5
1.155
1209,6
1.211
1.211
1239,6
1.241
1.244
1256,8
1.257
1273,4
1.274
1275,4
1.290
1297,6
1.298
1301,4
1317,4
1317,8
1.320
1343,5
1351,7
1352,8
1.353
1.359
1359,3
1366,8
1372,5
1.384
1386,6
1420,6
1456,5
1.476
1.476
1478,9
1478,9
1.480
1512,9
1523
1.524
1529,9
1552,9
1.554
1555,9
1557,9
1.559
1565
1565,3
1567,8
1.568
1.569
1.570
1.573
1581,9
E06109
P0C1Q5
P69034
P85879
E05469
E07095
P84389
E00712
P42716
P0CJ36
E07823
E00328
E03675
P01517
E06656
P0C931
P0CJ37
E06082
P0C1Q4
E05470
E07096
E03790
P83660
P0C1Q9
E07821
P0C1Q8
E00699
P85880
E01412
E09498
P0C1M6
E09499
E07824
P0C1M7
P85874
E05924
P57672
E05922
E05920
E00047
E06658
P0DM71
Protoplybia MP I
Mastoparan (Protonectarina-MP)
Mastoparan-1 (Mastoparan I) (MP-I)
Pptido-I Tachyquinina (PllTkP-I)
Polybine-I
Pptido Inflamatorio 13a
Polybine-2 (Polybine-II)
Mastoparan
Mastoparan (MP)
Eumenitina-R
Mastoparan MP
Mastoparan
Polistes mastoparan
Mastoparan-J (Polistes mastoparan)
Pptido Antimicrobiano
Eumenitina (Er-12)
Eumenitina-F
Pptido Polybia-MPI
Mastoparan-1 (Mastoparan I) (MPI) (MP-1)
Polybine-II
Pptido Inflamatorio 13b
Pptido Veneno, Cd-146
Pptido Cd-146
Mastoparan-V2
Mastoparan PDD-A
Mastoparan-V1
Mastoparan V
Pptido-II Tachyquinina (PllTkP-II)
Pentadeca Pptido
Dominulina A
Dominulina-A
Dominulina B
Mastoparan PMM2
Dominulina-B
Pptido Mastoparan PMM2
Apidaecina 6
Vespulaquinina-1 [Cleaved into: Vespulaquinina-2]
Apidaecina 4
Apidaecina 2
Bradiquinina Polistesquinina
Pptido Protopolybiaquinina-II Bradiquinina-related
Protopolybiaquinina-2 (Protopolybiaquinina-II)
45,3
45,4
46,5
46,6
47
47
48,2
48,7
48,8
49,4
49,7
50,1
50,5
50,7
50,9
51
51,2
51,7
52,1
52,7
compuesto m/z
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
52,8
53,2
53,4
53,5
54,6
54,9
55,3
56
56,5
56,6
57
57,1
57,2
57,6
58,1
58,1
58,1
58,4
59,4
59,7
compuesto m/z
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
59,9
60,6
60,9
61,8
62,3
62,6
63,1
63,2
63,5
64
64
64,8
65,2
65,3
65,7
65,8
66,4
67,2
67,8
68,5
compuesto m/z
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
69
69,1
69,6
70,4
70,9
71,1
71,5
71,6
72,7
73
73,9
74,1
74,6
75,2
75,3
76,6
76,7
77,1
77,3
78,2
compuesto m/z
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
78,5
78,8
79,2
79,5
79,8
79,8
80,3
81
81
82,2
82,4
82,9
83,7
84,2
85,8
86,2
86,6
86,7
87,3
88