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Al iniciar el examen morfolgico de la mdula sea destaca, en primer lugar, el predominio de los precursores granulopoyticos sobre los eritroblsticos. As, las clulas que
se ven con mayor frecuencia son mielocitos y metamielocitos neutrfilos, eritroblastos y
algn promielocito (fig.8-5). La eosinofilia medular es, en general, algo superior a la que
existe normalmente en sangre perifrica y se caracteriza por la presencia de un nmero
variable de mielocitos eosinfilos. Los elementos de la serie eritropoytica pertenecen en
su mayora a eritroblastos policromticos y ortocromticos; son menos abundantes los
eritroblastos basfilos y los proeritroblastos, caracterizados por su tamao y la inmadurez
nuclear as como por su elevada basofilia citoplasmtica (fig.8-6).
Al observar estas clulas, se debe consignar no solo su nmero, sino tambin la existencia de posibles alteraciones morfolgicas. As, al analizar los elementos de la serie
eritropoytica, es importante considerar las posibles alteraciones de la maduracin
(megaloblastosis) o la existencia de signos de diseritropoyesis (binuclearidad, puentes
internucleares o alteraciones de la cromatina) y/o un aumento del nmero de mitosis.
En la serie granulopoytica debe considerarse la posible existencia de clulas inmaduras (mieloblastos) y/o alteraciones de la granulacin (desgranulacin o hipergranulacin)
o de la segmentacin del ncleo (hipo- o hipersegmentacin).
Al analizar las restantes clulas, importa considerar la presencia de elementos atpicos
(generalmente blastos), clulas no hematolgicas (metstasis carcinomatosa), eosinofilia,
basofilia y el aumento de clulas cebadas (mastocitos) o de macrfagos y del nmero de
linfocitos o de clulas plasmticas.
Los megacariocitos normales son clulas poliploides que se caracterizan por su
gran tamao y la segmentacin nuclear (fig.8-7). Al realizar el examen morfolgico
de la mdula sea, debe observarse detenidamente el aspecto morfolgico de los
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FIGURA 8-4. Hoja-dictamen de un examen citolgico de mdula sea realizado a partir de un aspirado
medular.
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megacariocitos al objeto de poder hallar alteraciones tales como hipo- o hipersegmentacin nuclear, alteraciones de la madurez citoplasmtica o la presencia
de megacariocitos de tamao muy pequeo y escasa o nula segmentacin nuclear
(megacariocitos de aspecto hipoploide).
El recuento diferencial de los elementos celulares presentes en la mdula sea est
tambin indicado en el anlisis de la respuesta medular a citostticos, durante la fase
de recuperacin de una agranulocitosis o en ciertas formas de dishematopoyesis de
mecanismo oscuro.
49,2-65
0,2-1,5
2,1-4,1
8,2-15,7
9,6-24,6
9,5-15,3
6-12
1,2-5,3
0,2-1,3
0,4-2,2
0,2-2,4
0-1,3
0-0,2
18,4-33,8
0,2-1,3
0,2-1,3
17,9-29,9
0,4-4,6
11,1-23,1
0,4-3,9
0-0,8
0-0,4
0-0,9
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TABLA 8-2. Marcadores que pueden ser utilizados en la biopsia medular con la tcnica
de inclusin en parafina
Marcador
Dilucin
Reactividad
CD3
CD4
(1:30)
(1:5)
CD5
CD8
CD10 (CALLA)
(1:25)
(1:10)
(1:25)
CD15
CD20
CD21
CD23
CD30
CD34
CD56
CD68
CD79a
CD117 (C-kitt)
CD138
Bcl-2
Bcl-6
Cadena ligera k
Cadena ligera l
Cam 5.2
Ciclina O1
(1:25)
(1:100)
(1:100)
(1:10)
(1:10)
(1:20)
(1:5)
(1:6.000)
(1:20)
(1:100)
(1:5)
(1:50)
(1:1)
(1:64.000)
(1:64.000)
(1:100)
(1:10)
Ema
Factor VIII
Glucoforina C
Granzima B
LMP-1
Lisozima
Mieloperoxidasa
PGM1
TdT
TIA-1
(1:100)
(1:400)
(1:200)
(1:50)
(1:100)
(1:4.000)
(1:4.000)
(1:1.000)
(1:2/1:4)
(1:100)
LEX
(1:250)
Linfocitos T
Subpoblacin de linfocitos T (colaboradores)
Monocitos/histiocitos
Linfocitos T y subpoblaciones de linfocitos B
Subpoblacin de linfocitos T (supresores)
Linfocitos B y T inmaduros, linfocitos B del centro
germinal y neutrfilos
Neutrfilos, clulas de Reed-Sternberg
Linfocitos B
Clula dendrtica
Clula dendrtica y linfocito B activado
Clulas linfoides activadas y clulas de Reed-Sternberg
Clula progenitora linfoide mieloide
Clula natural killer (NK) y clula plasmtica maligna
Serie monoctica
Linfocitos B
Serie mieloide inmadura y mastocitos
Clula plasmtica normal y mielomatosa
Sobreexpresa en linfoma reticular
Linfocitos B del centro germinal
Linfocitos B
Linfocitos B
Metstasis epitelial
Linfoma de clulas del manto y algunos mielomas
Tricoleucemia
Clula epitelial y clula plasmtica
Megacariocito
Serie eritroide inmadura
Grnulos citotxicos (indica fenotipo activado)
Virus Epstein-Barr
Lnea monoctica
Lnea mieloide
Lnea monoctica
Linfocito inmaduro
Grnulos citotxicos (linfocito T citotxico; linfocito
NK y neutrfilos)
Serie eritroide inmadura y megacariocito
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Biopsia sea
Introduccin
La biopsia de mdula sea o biopsia medular (BMO) constituye en la actualidad un
procedimiento de indudable inters diagnstico en hematologa y, en algunos casos,
decisivo para el establecimiento definitivo del mismo. As, por ejemplo, es la nica
exploracin que nos permite establecer el diagnstico de extensin de los linfomas
y conocer las caractersticas de su patrn invasivo, fundamental para iniciar o controlar la conducta teraputica adecuada. En la aplasia medular resulta imprescindible
para conocer su grado de extensin y determinar el pronstico. En el SIDA, el estudio de la biopsia de mdula sea puede tambin tener inters clnico cuando la
puncin medular ha resultado blanca (cuadro8-2). El hecho de que, para estudiar
la mdula sea hematopoytica, haya que abordar la profundidad del hueso y la
muestra extrada deba someterse a un proceso relativamente largo de preparacin
antes de poder ser observada al microscopio hace que su empleo sea algo ms
limitado que la simple puncin y el aspirado medular. No obstante, su utilidad
diagnstica se ha visto en los ltimos aos revalorizada debido sobre todo a tres
hechos fundamentales:
1. La mayor simplicidad y eficacia del instrumental empleado en la extraccin de
las muestras.
2. El perfeccionamiento de los procedimientos histolgicos que atenan el problema
de la descalcificacin. A este respecto cabe decir que hoy en da es posible utilizar
algunos marcadores monoclonales en las muestras de biopsia sea incluidas en
parafina. Este hecho permite ampliar considerablemente la utilidad diagnstica
de este procedimiento en la prctica clnica (v. tabla8-2).
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TABLA 8-3. Utilidad complementaria del aspirado y la biopsia de mdula sea (MO)
Caracterstica
Sencillez
Rapidez
Morfologa celular
Celularidad
Arquitectura celular
Fibrosis
Progenitores
Aspirado de MO (citologa)
Biopsia de MO (histologa)
+++
+++
+++
+
+
+
+
+++
+++
+++
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frente a huesos muy duros, como en casos de osteoesclerosis donde la extraccin del
cilindro seo puede ser muy difcil.
Material
En nuestro medio, dos son los trocares que han demostrado ser ms tiles:
1. Trocar de Tanzer.
2. Trocar de Jamshidi.
Ambos modelos consisten en una aguja hueca, con un extremo proximal en forma
de T, que permite sujetarlo fcilmente, y un extremo distal cortante; en su interior
se inserta un mandril punzante y los dos van provistos de un expulsor. El trocar de
Jamshidi se diferencia del de Tanzer en que su extremo distal es algo ms estrecho que el
resto del trocar, por lo que el cilindro seccionado no es comprimido en el interior de la
aguja (fig.8-10). La expulsin del cilindro se hace, en el trocar de Jamshidi, en sentido
distal-proximal. En los ltimos aos han ido apareciendo en el mercado modelos de
trocares inspirados en el original de Jamshidi que no han hecho sino mejorarlo, concretamente el extremo proximal, realizado con material de plstico y que posee, en general,
un diseo muy cuidado, a menudo ergonmico que hace ms idnea su adaptacin a la
mano del operador. El estilete o mandril es punzante, suele ser muy afilado y posee tres
o cuatro facetas que facilitan la penetracin y el ulterior anclaje en la cortical del hueso.
El extremo distal de la cnula o aguja es muy cortante (puede tener forma de corona o de
boca de pez), lo cual le confiere gran efectividad en el avance a travs del hueso medular.
Recientemente, la mayora de los suministradores de material para el diagnstico
in vitro han ido incorporando a sus equipos de biopsia sea un sistema capturador del
cilindro seo o atrapa muestras. El sistema puede formar parte inherente del propio
trocar o, lo que es ms frecuente, consiste en una pieza adicional. Segn el diseador
esta novedad mejora la calidad tcnica de la extraccin, ya que aumenta el porcentaje
de xitos en la obtencin de la muestra y evita en todos los casos los movimientos de
deflexin del trocar.
Mtodo
1. Normalmente, se elige como punto de eleccin la cresta ilaca, antero- o posterosuperior.
2. Tras asepsia cuidadosa de la piel de la zona y anestesia local, se procede a la puncin
con el trocar, provisto de su mandril. En los centros hospitalarios, dotados de
servicio de anestesia es posible mejorar la calidad de la extraccin de la biopsia sea
si se completa la anestesia local con sedacin endovenosa o con analgesia espinal;
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ambas tcnicas consiguen eliminar el dolor que provoca el avance del trocar en
la cavidad medular y que solo con anestesia local no se consigue anular. Los dos
procedimientos requieren la presencia de un anestesista. La sedacin endovenosa
se efecta con hipnticos tipo midazolam, propofol u opioides como alfentanilo
o remifentanilo (analgsicos m-receptores potentes de vida media corta). La
utilizacin de estos frmacos hace necesaria la monitorizacin del paciente.
La analgesia espinal se consigue mediante puncin lumbar, utilizando un anestsico local (bupivacan a en dosis analgsicas) asociado o no a un opioide liposoluble
tipo fentanilo o sufentanilo.
Se imprimen al trocar movimientos de rotacin y de presin hasta conseguir
perforar la cortical del hueso. En este momento, el trocar queda anclado en la
cresta ilaca.
Se extrae el mandril y se continan los movimientos de rotacin-presin, por
lo que el cilindro medular, que va cortndose por el extremo distal del trocar, se
introduce poco a poco en el interior del mismo. La aguja penetra hasta unos 3cm
de profundidad.
Antes de proceder a la retirada de la aguja, se imprimen a esta movimientos laterales
algo enrgicos (deflexin) con el fin de romper la base del cilindro medular que
lo mantiene unido al resto del hueso. Seguidamente, se hunde algo ms la aguja
con el fin de conseguir que el cilindro seo cortado quede bien introducido en el
trocar y luego se procede a su extraccin. En caso de utilizar los equipos con un
sistema de atrapa muestras (especialmente los de pieza adicional, que son los ms
usuales), una vez finalizado el corte del hueso, se introduce el capturador hasta el
fondo, y se imprimen al trocar un par de vueltas de 360 y acto seguido se procede
a la extraccin. Como los movimientos de deflexin se evitan en esta modalidad,
la tcnica gana en comodidad para el enfermo, as como en seguridad, puesto que
no es excepcional que en huesos muy duros la maniobra de deflexin comporte
el riesgo de rotura del trocar y la porcin enclavada quede insertada en la cresta
ilaca.
El cilindro se obtiene mediante la introduccin del expulsor en el interior del
trocar, al ejercer una ligera presin (fig.8-11).
Procesamiento del cilindro seo:
(a) Se introduce la pieza en lquido fijador (Bouin-Holanda) durante 24h. Se
lava con H2O del grifo un mnimo de 5min. Si se introduce un fragmento
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Tiempo
Alcohol de 96
Alcohol de 96 (renovado cada vez)
Alcohol de 99
Alcohol de 99 (renovado cada vez)
Tolueno
Tolueno (renovado cada vez)
45min
45min
45min
45min
45min
1h
del cilindro seo en formaldehdo como lquido fijador es posible, sobre esa
muestra as fijada, efectuar tcnicas de biologa molecular.
(b) Se descalcifica la misma con cido ntrico al 10% durante 24h.
(c) Se lava durante 5-10min con agua del grifo y se sumerge el cilindro en lquido
con capacidad creciente de deshidratacin (tabla8-4). El cilindro, despus de
estos pasos, adopta un aspecto translcido. De no ser as, debe permanecer
en el ltimo paso por tolueno 1h ms.
(d) Se introduce el cilindro as preparado en un bloque de parafina (cuadro8-3),
que permitir la obtencin de cortes de la pieza mediante un micrtomo. El
grosor de los cortes debera ser de 1-2m (mm). Sin embargo, la inclusin en
material de plstico presenta algunas ventajas frente a la inclusin en parafina:
a) no requiere descalcificacin (de esta manera se evita la accin corrosiva
del cido ntrico y, por tanto, se conserva mejor el tejido medular), y b) la
retraccin del cilindro es mnima. En contrapartida, esta tcnica presenta
tambin algunos inconvenientes:
(i) Es relativamente prolongada y requiere gran meticulosidad en su rea
lizacin.
(ii) Una vez realizada la inclusin, no es posible retroceder para recuperar
el cilindro entero.
(iii) La polimerizacin que deben sufrir algunos tipos de plstico debido a
su carcter exotrmico (desprendimiento de calor) puede desnaturalizar
los componentes del cilindro seo.
(iv) Requiere un micrtomo especial capaz de cortar piezas muy duras,
por tanto, su coste suele ser elevado.
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Desparafinado
Se introduce el portaobjetos con los cortes en:
Xileno: 5min
Xileno: 5min
Xileno: 5min
Alcohol absoluto: 5min
Alcohol absoluto: 5min
Alcohol absoluto: 3min
Alcohol de 96: 3min
Alcohol de 96: 3min
Alcohol de 96: 3min
Se lava con agua corriente o agua bidestilada
Tincin de hematoxilina-eosina
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Solucin B
Cloruro de oro: 0,02g
Agua destilada: 10ml
Solucin C
cido oxlico: 0,5g
Agua destilada: 10ml
Solucin D
Alumbre de hierro: 0,2g
Agua destilada: 10ml
Solucin E
Tiosulfato sdico: 0,5g
Agua destilada: 10ml
Solucin F
Permanganato potsico: 0,5g. Agua destilada: 100ml
cido sulfrico al 3%
Se mezclan 47,5ml de la primera con 2,5de la segunda
Solucin G
Formol al 10%: 100ml
Mtodo
1.
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FIGURA 8-13. Los tres procedimientos bsicos de laboratorio para el diagnstico de las enfermedades de
la sangre: los frotis de sangre perifrica y mdula sea teidos con MGG, y la biopsia de mdula sea teida
con hematoxilina-eosina.
hipo- o hipercelular con desaparicin prcticamente total de las clulas grasas y sustitucin
por una densa trama de fibras de reticulina y colgeno que constituye una imagen muy
caracterstica (fig.8-15). La tincin de reticulina acaba de confirmar el diagnstico de
mielofibrosis (fig.8-16). La biopsia no solo tiene inters diagnstico en hematologa,
sino que constituye una herramienta extraordinariamente til para la valoracin inicial
de la enfermedad, como sucede en pacientes afectados de linfoma de Hodgkin y otros
tipos de linfomas no hodgkinianos o para el seguimiento del curso de la enfermedad, especialmente despus de iniciar el tratamiento. Un ejemplo de esta situacin lo
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Introduccin
Los cultivos in vitro de progenitores hematopoyticos, desarrollados a principios de los
aos setenta, han permitido mejorar considerablemente nuestro conocimiento sobre
la hematopoyesis humana. As, han contribuido a demostrar la existencia de una clula
madre pluripotencial (stem-cell) con capacidad de autorreplicacin que, en su proceso
de diferenciacin, se transforma en un progenitor hematopoytico comprometido hacia
una lnea celular determinada. Ello puede evidenciarse por su capacidad de producir
colonias.
Desde los primeros trabajos hasta hoy, ha habido un incremento en el nmero
de precursores hematopoyticos que puede detectarse en un laboratorio, si bien
se realizan, fundamentalmente, determinaciones de colonias granulomacrofgicas
(CFU-GM), eritroblsticas (CFU-E, BFU-E), mixtas (CFU-GEMM) y megacariocticas (CFU-Meg).
El procesamiento de un cultivo consta, bsicamente, de una fase inicial de separacin
celular y posterior suspensin de las clulas en un medio de cultivo semislido (metilcelulosa o agar, fundamentalmente), al que se aaden distintos factores estimuladores del
crecimiento en funcin de la lnea celular que se investiga. Tras un perodo de incubacin,
el examen al microscopio invertido nos permitir la caracterizacin e identificacin de
las colonias obtenidas.
Metodologa clsica
Material fungible
Matraces Erlenmeyer de 1 y 2 l.
Frascos de cristal de 100ml de boca ancha.
Placas de cultivo Greiner de 30mm de dimetro.
Placas de cultivo Greiner de 150mm de dimetro.
Tubos Falcon estriles de 13ml.
Tubos Falcon estriles de base cnica de 50ml.
Filtros Millipore, 0,22mm, de 25mm de dimetro.
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Reactivos
Metilcelulosa Fluka.
Medio Iscove en polvo (IMDM) (con glutamina, sin NaHCO3) Gibco.
Medio Iscove lquido (IMDM) (con glutamina) Gibco.
Medio Hanks sin Ca2+, ni Mg2+ ni rojo de fenol.
Ficoll-Hypaque, 1,077g/cm3.
Albmina bovina desionizada (BSA).
Suero fetal de ternera (FCS).
Bicarbonato sdico (NaHCO3).
Agua destilada estril para cultivos celulares Gibco.
2-mercaptoetanol.
Factor estimulador de colonias granulomonocticas recombinante humano:
GM-CSF rh.
Interleucina 3 recombinante humana: IL-3 rh.
Eritropoyetina recombinante humana: EPO rh.
Instrumental
Cabina de flujo laminar vertical.
Incubador de CO2.
Microscopio invertido.
Microscopio convencional.
Agitador de tubos Vrtex.
Bomba de vaco.
Cmara de Neubauer.
Pipetas automticas Gilson P-1000, P-200, P-20 y P-10.
Pipeteador automtico.
Agitador magntico y recogeagitador.
Preparacin de la metilcelulosa
1. Se pesan 20g de metilcelulosa en papel de aluminio y se deja toda la noche bajo
la luz ultravioleta.
2. A la maana siguiente, se toma un Erlenmeyer estril de 2 l de capacidad y se
aaden 500ml de agua bidestilada para cultivos celulares dentro de la cabina.
Se cubre con un tapn de algodn y gasa estril, y se hierve al bao mara (fuera
ya de la cabina).
3. Cuando el agua hierva, se retira del bao mara y se aade la metilcelulosa dentro
de la cabina. Se agita suavemente sin agitador hasta que no se aprecien grumos.
4. Se deja de nuevo al bao mara durante 1h.
5. Mientras la metilcelulosa hierve, se disuelve un frasco de medio de cultivo Iscove en polvo en 500ml de agua bidestilada especial para cultivos y se agita
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Las colonias de megacariocitos son de menor inters clnico y muestran una apariencia caracterstica (fig.8-24).
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231.e1
Autoevaluacin
1. El tejido donde se originan las clulas de la sangre es:
(a) El bazo.
(b) El timo.
(c) Los ganglios linfticos.
(d) La mdula sea.
(e) El hgado.
Respuesta correcta: d.
Respuesta razonada: la mdula sea es el tejido donde se originan los elementos formes de la
sangre. En el nio, la mdula sea ocupa la cavidad esponjosa de prcticamente todos sus huesos,
pero con el desarrollo, parte de ella es reemplazada por tejido graso, quedando finalmente
reducida a unas zonas concretas tales como el crneo, el esqueleto axial (columna vertebral) y
la epfisis de los huesos largos.
2. La diseritropoyesis es una forma de expresar la siguiente alteracin:
(a) Aumento de eritropoyesis.
(b) Eritropoyesis fetal.
(c) Maduracin anmala de los eritroblastos.
(d) Falta de factores de maduracin nuclear.
(e) Ninguna de las anteriores.
Respuesta correcta: c.
Respuesta razonada: existen ciertas formas de anemia arregenerativa, tales como las diseritropoyesis congnitas o adquiridas, en las que se observan alteraciones cualitativas de los eritroblastos
que afectan tanto al ncleo (binuclearidad, alteraciones de la cromatina, puentes internucleares)
como al citoplasma (aumento de tamao, hemoglobinizacin irregular, presencia de material
cromatnico o depsitos abundantes de ferritina).
3. La biopsia de mdula sea es un complemento diagnstico en hematologa, especialmente
para establecer el diagnstico diferencial entre:
(a) Sndrome inflamatorio crnico y sndrome mielodisplsico.
(b) Insuficiencia medular y leucemia aguda.
(c) Gammapata monoclonal y mielofibrosis idioptica.
(d) Aplasia de mdula sea y mielofibrosis idioptica.
(e) Ninguna de las anteriores.
Respuesta correcta: d.
Respuesta razonada: la biopsia de mdula sea, o biopsia medular (BM), constituye en la actualidad un procedimiento complementario de indudable inters diagnstico en hematologa y, en
algunos casos, decisivo para el establecimiento definitivo del mismo. As, por ejemplo, es la nica
exploracin que nos permite establecer el diagnstico de extensin de los linfomas y conocer las
caractersticas de su patrn invasivo, fundamental para iniciar la conducta teraputica adecuada.
4. Un aumento significativo de linfocitos en la mdula sea hipercelular es orientativo de:
(a) Leucemia linftica crnica.
(b) Aplasia de mdula sea.
(c) Enfermedad de Wilson.
(d) Infeccin por HIV.
(e) Todas las anteriores.
Respuesta correcta: a.
Respuesta razonada: la linfocitosis medular debe valorarse siempre en relacin a la clnica general
y a la celularidad global, ya que puede observarse en dos situaciones completamente diferentes.
5. La potencialidad regenerativa de una mdula sea depende del nmero y funcionalidad de
las clulas madre. Para poder conocer si el sistema hematopoytico responde correctamente
a los estmulos de las citocinas suele utilizarse el siguiente procedimiento:
(a) Anlisis citogentico del aspirado medular.
(b) Cultivos in vitro de progenitores hematopoyticos.
(c) Estudio inmunofenotpico del aspirado medular mediante anticuerpos monoclonales.
Descargado de ClinicalKey.es desde Complejo Hospitalario Dr Arnulfo Arias junio 29, 2016. Para uso personal exclusivamente. No se
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